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特開2024-140649新規酵素剤、酵素剤の製造方法およびコージオリゴ糖の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024140649
(43)【公開日】2024-10-10
(54)【発明の名称】新規酵素剤、酵素剤の製造方法およびコージオリゴ糖の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20241003BHJP
C12P 19/14 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12P19/14 Z
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023051901
(22)【出願日】2023-03-28
(71)【出願人】
【識別番号】000231453
【氏名又は名称】日本食品化工株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】竹地 紀昭
(72)【発明者】
【氏名】石倉 幹大
(72)【発明者】
【氏名】高木 宏基
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF03
4B064AF04
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA11
4B064DA20
(57)【要約】
【課題】コージビオースホスホリラーゼ活性を有する新規酵素剤、当該酵素剤の製造方法、および当該酵素剤を用いたコージビオースの製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明によれば、以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤が提供される。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【選択図】なし
【解決手段】本発明によれば、以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤が提供される。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項2】
脱リン酸化を伴う縮合反応がα－１，２グリコシド結合の形成反応である、請求項１に記載の酵素剤。
【請求項3】
コージオリゴ糖の製造に用いるための、請求項１に記載の酵素剤。
【請求項4】
請求項１に記載のタンパク質（１）から（３）のいずれかをコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞を培養する工程を含む、請求項１または２に記載の酵素剤の製造方法。
【請求項5】
糖基質に、請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含む、コージオリゴ糖の製造方法であって、
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法。
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法。
【請求項6】
糖質の加リン酸分解によりβ－グルコース－１－リン酸を生成させる工程をさらに含み、加リン酸分解に供される上記糖質がマルトース、トレハロースおよびコージビオースからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
前記加リン酸分解を、請求項１の（１）から（３）に記載のタンパク質以外のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記ホスホリラーゼが、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種または２種である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
請求項５に記載の方法を実施してコージオリゴ糖を得る工程、および食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤に関する。本発明は、前記酵素剤の製造方法に関する。また、本発明は、糖基質に、前記酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含むコージオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
α－１，２グリコシド結合を有するオリゴ糖、特にグルコース２分子がα－１，２結合で結合したコージビオースは低う蝕性または抗う蝕性を示し、腸内ビフィズス菌増殖作用を有することが報告されている（特許文献１）。コージビオースは麹汁、酒、蜂蜜、ビールなどに微量に存在する希少糖である。
【0003】
コージビオースはコージビオースホスホリラーゼの働きにより産生することができる。微生物を利用した方法では、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓを培養して得たオリゴ糖を加酢分解してコージビオースを単離する方法が従来知られているが、この方法は非常に煩雑であった。また、酵素を利用した方法として、例えば、サーモアナエロビウム属に属する微生物由来のコージビオースホスホリラーゼを利用したコージビオースの製造方法がある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許第２８３２０３７号
【特許文献2】特許第４１７１７６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
コージオリゴ糖は健康食品や医薬品への利用が期待されている有用な希少糖であるが、製造コストが高いという課題がある。また、工業的に利用可能なコージビオースホスホリラーゼの種類が少なく、基質特異性や生産能についての選択肢が少ないという課題がある。これらの背景から、異種タンパク質発現系における大量生成に適した酵素についての需要があった。
【0006】
よって、本発明は、コージビオースホスホリラーゼ活性を有する新規酵素剤、当該酵素剤の製造方法、および当該酵素剤を用いたコージビオースの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物の遺伝子がコージビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードしており、異種タンパク質発現に適していることを見出し、さらに研究を進めることで本発明を完成するに至った。本発明はこの知見に基づくものである。
【0008】
本発明によれば以下の発明が提供される。
＜１＞ 以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
＜２＞ 脱リン酸化を伴う縮合反応がα－１，２グリコシド結合の形成反応である、＜１＞に記載の酵素剤。
＜３＞ コージオリゴ糖の製造に用いるための、＜１＞または＜２＞に記載の酵素剤。
＜４＞ ＜１＞に記載のタンパク質（１）から（３）のいずれかをコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞を培養する工程を含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の酵素剤の製造方法。
＜５＞ 糖基質に、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含む、コージオリゴ糖の製造方法であって、
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法。
＜６＞ 糖質の加リン酸分解によりβ－グルコース－１－リン酸を生成させる工程をさらに含み、加リン酸分解に供される上記糖質がマルトース、トレハロースおよびコージビオースからなる群より選択される少なくとも一つである、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞ 前記加リン酸分解を、＜１＞の（１）から（３）に記載のタンパク質以外のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施する、＜６＞に記載の製造方法。
＜８＞ 前記ホスホリラーゼが、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種または２種である、＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞ ＜５＞に記載の方法を実施してコージオリゴ糖を得る工程、および食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
＜１＞ 以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
＜２＞ 脱リン酸化を伴う縮合反応がα－１，２グリコシド結合の形成反応である、＜１＞に記載の酵素剤。
＜３＞ コージオリゴ糖の製造に用いるための、＜１＞または＜２＞に記載の酵素剤。
＜４＞ ＜１＞に記載のタンパク質（１）から（３）のいずれかをコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞を培養する工程を含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の酵素剤の製造方法。
＜５＞ 糖基質に、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含む、コージオリゴ糖の製造方法であって、
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法。
＜６＞ 糖質の加リン酸分解によりβ－グルコース－１－リン酸を生成させる工程をさらに含み、加リン酸分解に供される上記糖質がマルトース、トレハロースおよびコージビオースからなる群より選択される少なくとも一つである、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞ 前記加リン酸分解を、＜１＞の（１）から（３）に記載のタンパク質以外のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施する、＜６＞に記載の製造方法。
＜８＞ 前記ホスホリラーゼが、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種または２種である、＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞ ＜５＞に記載の方法を実施してコージオリゴ糖を得る工程、および食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、コージオリゴ糖の製造に用いることができる新規酵素剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書について、糖質の記載は特に明記しない場合はＤ体を表す。また、「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。
【0012】
本発明の酵素による反応液（反応生成物）の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
【0013】
本明細書中「糖縮合反応」または「縮合反応」は、簡単な構造の分子（例えば水やリン酸）が脱離して複数の分子が結びつく反応を指し、特に２つの糖分子からリン酸（Ｈ3ＰＯ4）が脱離して１つの糖分子ができる反応を指す。
【0014】
本明細書中、「オリゴ糖」は、単糖分子が２～１０個結合した糖質を意味し、「多糖類」は、単糖分子が多数個、具体的には１０個より多く重合した糖質を意味する。
【0015】
本明細書において「コージオリゴ糖」は、少なくとも一つのα－１，２グリコシド結合を有するオリゴ糖を指し、主にグルコースがα－１，２結合で結合した糖質であるが、α－１，２結合のほかに、α－１，４結合など他のグリコシド結合や構成糖としてグルコース以外の糖を含む糖質も含む用語として使用する。本明細書中「コージオリゴ糖」は、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオース、コージオクタオース、α－１,２結合で結合したグルコシルキシロース、コージビオシルグルコース（Ｇｌｃ（α１－２）Ｇｌｃ（α１－４）Ｇｌｃ）、コージビオシルフラクトシド（Ｇｌｃ（α１－２）Ｇｌｃ（α１－２β）Ｆｒｕ）などを含む。
【0016】
（酵素剤）
本発明は、以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤を提供する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
本発明の一実施態様では、脱リン酸化を伴う縮合反応が、α－１，２グリコシド結合の形成反応である。
なお、本明細書中において、上記タンパク質（１）から（３）を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本発明のタンパク質と記載する場合がある。
本発明は、以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む、脱リン酸化を伴う糖縮合反応触媒用の酵素剤を提供する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
本発明の一実施態様では、脱リン酸化を伴う縮合反応が、α－１，２グリコシド結合の形成反応である。
なお、本明細書中において、上記タンパク質（１）から（３）を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本発明のタンパク質と記載する場合がある。
【0017】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）のゲノム情報から取得したアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）である。ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、糖ヒドロラーゼ／ホスホリラーゼとアノテーションされているものの、タンパク質として発現させた場合の具体的性質は、本願出願時において知られていなかった。
【0018】
本発明者らは、アノキシバチルス・フラビサーマス由来の上記タンパク質を、枯草菌を宿主とする異種発現系において発現させ、その酵素活性を解析したところ、当該タンパク質は、ドナー基質として、少なくともβ－グルコース－１－リン酸を認識し、アクセプター基質として、少なくともグルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオースおよびトレハロースを認識し、リン酸を脱離して、コージオリゴ糖を生成することを発見した。すなわち、本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が、脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有することを見出した。タンパク質が脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有することは、被験タンパク質を基質であるβ－グルコース－１－リン酸およびグルコースに作用させ、二糖やリン酸の生成を検出することにより判定することができる。
【0019】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質による触媒反応は可逆的であり、例えばグルコースとβ－グルコース－１－リン酸の脱リン酸反応を触媒してコージビオースを生成することができ、さらにその逆方向に進む反応で、コージビオースの加リン酸分解反応を触媒してグルコースとβ－グルコース－１－リン酸を生成することができる。従って、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、コージビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３０）活性を有するといえる。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、「アノキシバチルスＫＰ」と記載することがある。アノキシバチルスＫＰは、脱リン酸化を伴う糖縮合反応の際、グルコースと炭素２－４位の水酸基の向きが同じ単糖をアクセプター基質として認識し、二糖以上については立体構造によるが、基本的には、β－グルコース－１－リン酸が結合する箇所がグルコースである場合にアクセプター基質として認識すると考えられる。
【0020】
「コージビオースホスホリラーゼ活性」は、リン酸の存在下、コージビオースを加リン酸分解し、β－グルコース－１－リン酸とグルコースを生成する酵素活性である。この加リン酸分解反応の逆反応（糖転移反応、合成反応）では、β－グルコース－１－リン酸と、グルコースおよび／またはその他糖質とを基質として、コージオリゴ糖を生成することができる。なお、ホスホリラーゼ活性を有するタンパク質は、一般的に加リン酸分解反応と共に逆反応を触媒することが知られている。後記する実施例では、アノキシバチルスＫＰが加リン酸分解反応と脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒することを確認している。
【0021】
「コージビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かは、例えば、被験タンパク質を基質であるβ－グルコース－１－リン酸およびグルコースに作用させ、α－１，２グリコシド結合により結合した二糖や無機リン酸が生成するか否かにより判定することができる。すなわち、加リン酸分解の逆反応（脱リン酸化を伴う糖縮合反応）を触媒する活性を有するタンパク質であるか否かにより、「コージビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かを判定することができる。α－１，２グリコシド結合により結合した糖の生成の程度は、例えば、無機リン酸量や重合糖を定量することにより測定することができる。
【0022】
アノキシバチルスＫＰのアミノ酸配列（配列番号１）は、既知のコージビオースホスホリラーゼ（以下、ＫＰと記載する場合がある）であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ由来ＫＰ（特許第４１７１７６１号）に対して３０．３％一次アミノ酸配列同一性を有している（同一性はＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３：２９４７－２９４８）を用いて評価した）。従来のＫＰと比較してアミノ酸配列の同一性が低いため、本発明のアノキシバチルス由来の酵素がコージビオースホスホリラーゼ活性を有する確証は無く、ましてや産業上利用可能な諸性質（耐熱性や酵素活性を有するｐＨ域等）を持つことは全く予想できなかった。本発明のアノキシバチルス由来の酵素の機能未確認のタンパク質をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得た結果、高いコージビオースホスホリラーゼ活性を有し、枯草菌による発現系においても良好にタンパク質が得られることが確認され、産業上非常に有用な酵素であることが見出された。特に、後記する実施例に記載された、枯草菌を宿主とした異種タンパク質発現では、酵素は菌体外に分泌されるため、精製の必要がないか、または簡単な手順で単離精製することができる。ＫＰは基本的に菌体内酵素であるため、枯草菌発現系の場合でも菌体内に発現する。後記する実施例で使用している枯草菌発現ベクターにはタンパク質を菌体外に発現させるためのシグナルペプチド配列が含まれており、その配列をＫＰと連結させることで良好に菌体外に発現させることができる。また、菌体外発現用シグナルペプチド配列を有するものであれば、必ず菌体外発現するというものではないため、本発明のアノキシバチルスＫＰとの相性が良く菌体外への発現が良好であったと考えられる。枯草菌での異種タンパク質発現に適したアノキシバチルスＫＰはこの点においても有用であるといえる。
【0023】
本発明の酵素アノキシバチルスＫＰは、ｐＨ５～９の範囲、好ましくはｐＨ５．５～７．５の範囲で上述の加リン酸分解および／または脱リン酸反応の活性を示す。
【0024】
本発明の酵素アノキシバチルスＫＰは、２５～６５℃の範囲、好ましくは５０～６０℃の範囲で上述の加リン酸分解および／または脱リン酸反応の活性を示す。アノキシバチルスＫＰは耐熱性を有し、幅広い温度域で安定的に使用できる。正確な温度管理が難しい工業的規模での利用にも適している。後記する実施例では、本発明の酵素アノキシバチルスＫＰが５８℃のアッセイにおいてコージオリゴ糖を成功裏に合成することが示されている。
【0025】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。一実施態様では、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。
【0026】
アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【0027】
さらには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。「配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加された」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列が置換、挿入、欠失および／または付加により変異されたことを意味する。前記置換などにより変異されるアミノ酸の個数は、例えば、１～８０個、１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、または１～３個程度であり得る。前記アミノ酸配列において、前記変異は連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。アミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、アミノ酸の付加は、例えば、アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端への付加であっても、Ｎ末端およびＣ末端の両末端への付加であってもよい。アミノ酸の置換は、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に変えないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【0028】
本発明の酵素剤は、コージオリゴ糖の製造に用いることができる。コージビオースをはじめとするコージオリゴ糖の工業的規模での製造は従来酵素の活性や合成効率が十分ではない点から制限があった。本発明の酵素剤は、異種発現系により酵素を高発現させて用いることができるので、工業的規模での使用に適している。
【0029】
本発明の酵素剤は、有効成分である上記（１）から（３）のタンパク質そのものでもよい。本発明の酵素剤は、上記タンパク質（１）から（３）のいずれかを有効成分として含む酵素組成物であってもよく、脱リン酸化を伴う糖縮合反応を阻害しないものであれば、さらなる成分を含むことができる。これらは、例えば、緩衝液、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる成分であってもよい。このようなさらなる成分は、先行技術より公知であり、また当業者によく知られている。また、本発明の酵素剤は、その形状も特に制限は無く、固体（たとえば、粉末状）や液体であり得る。本発明の酵素剤は、例えば、固体や液体のものを、糖基質の溶液に添加することにより使用することができる。
【0030】
本発明の酵素剤は、例えば、本発明のタンパク質が固定化担体に固定された酵素剤として提供することができる。固定化された酵素剤とすることで、例えば、高基質濃度および高温において、コージオリゴ糖の製造を行うことができ、また、バイオリアクター方式によるコージオリゴ糖の製造を行うこともできる。
【0031】
上記固定化担体は、特に制限されず、例えば、有効成分であるタンパク質が吸着または架橋結合され、タンパク質の活性が保持されるものであれば使用できる。
【0032】
上記固定化担体は、例えば、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性担体等が挙げられる。上記固定化担体の具体例は、例えば、イオン交換ゲルである。上記イオン交換ゲルは、例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ、ダイヤイオン（登録商標）ＰＫ２１２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５、ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５５５等のダイヤイオン（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；セパビーズ（登録商標）ＳＰ－２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ－８５０等のセパビーズ（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＰＷＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１等のデュオライトシリーズ（住化ケムテックス社製）等が挙げられる。
【0033】
（本発明酵素剤の製造方法）
【0034】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は野生株より精製してもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。
【0035】
一実施形態では、本発明は、以下のタンパク質（１）から（３）のいずれかをコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞を培養する工程を含む、酵素剤の製造方法に関する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～８０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脱リン酸化を伴う糖縮合反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【0036】
上記タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主での発現を最適化するように使用コドンを選択することができる。宿主が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）から入手可能である。宿主用コドンの選択は、枯草菌のコドン頻度（https://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423）あるいは大腸菌のコドン頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=37762）などを参考に実施することができる。
【0037】
上記タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号２に記載の塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号２に記載の塩基配列は、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）のゲノム情報から取得したアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）をコードする塩基配列である。配列番号２に記載の塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
【0038】
本発明の一実施形態では、上記タンパク質をコードするＤＮＡの５′末端および３′末端に発現ベクター連結用の配列を付加することができる。
【0039】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに作動可能に挿入し、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞を得ることができる。本発明におけるＤＮＡ分子の作製は、Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook, J., Fritsch, E. R., & Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）に記載の方法に準じて行なうことができる。
【0040】
本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特許５１２６８７９号を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ４系（特開平４－２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに限定されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに限定されない。
【0041】
さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに限定されない。シグナルペプチドの付与は、目的酵素が培養上清中に分泌され、精製が容易になるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ－ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる。ＤＮＡはエレクトロポレーション法、リポフェクション法などによりベクターを使用せずに宿主細胞に導入することもできる。
【0042】
形質転換細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１～４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５～３７℃、酵母では２５～３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【0043】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、リゾープス・デルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、および高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いることが好ましい。バチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特に大腸菌やバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【0044】
本発明の一実施形態において、酵素剤の製造方法は、形質転換細胞が産生したタンパク質の単離および／または精製する工程をさらに含む。
形質転換細胞が産生したタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ－ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した精製方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
形質転換細胞が産生したタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ－ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した精製方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【0045】
（コージオリゴ糖の製造方法）
本発明は、糖基質に、上記酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含む、コージオリゴ糖の製造方法であって、
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法を提供する。
本発明は、糖基質に、上記酵素剤を作用させてコージオリゴ糖を得る工程を含む、コージオリゴ糖の製造方法であって、
糖基質が
(i) β－グルコース－１－リン酸、並びに、
(ii) グルコース、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つ
を含む、方法を提供する。
【0046】
本発明においては、例えば、１０ｍＭ～１Ｍ β－グルコース－１－リン酸および１０ｍＭ～１Ｍ グルコースを含む反応水溶液（ｐＨ５～９）を作製し、反応溶液に対し終濃度が基質固形分１ｇ当たり０．１～５０Ｕの本発明の酵素剤を添加し、２５～６５℃で１～１００時間保持することでコージオリゴ糖を生成することができる。
【0047】
本発明のコージオリゴ糖の製造方法においては、本発明の酵素剤をβ－グルコース－１－リン酸とグルコースおよび／またはその他糖質とを含む糖質水溶液に作用させてもよい。該糖質水溶液はグルコース以外の糖質を含んでいてもよく、例えば、キシロース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロースおよび澱粉分解物からなる群より選択される少なくとも一つを含んでいてもよい。澱粉分解物は、例えば一般的な澱粉（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、小麦澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉等）を酸又は酵素（例えば、α－アミラーゼ等）を用いて処理した液化液であってもよい。澱粉分解物はオリゴ糖を含むことが好ましい。また、後述する本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼの基質であるマルトース、トレハロース、コージビオースなどの糖質を含んでいてもよい。
【0048】
一実施形態では、本発明のコージオリゴ糖の製造方法は、糖質の加リン酸分解によりβ－グルコース－１－リン酸を生成させる工程をさらに含み、加リン酸分解に供される上記糖質がマルトース、トレハロースおよびコージビオースからなる群より選択される少なくとも一つである。
【0049】
一実施形態では、本発明のコージオリゴ糖の製造方法は、本発明の酵素剤以外（コージビオースホスホリラーゼ以外）のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施することができる。特定の実施形態では、本発明の酵素剤以外（コージビオースホスホリラーゼ以外）のホスホリラーゼが、マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．８）およびトレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３１）からなる群から選択される１種または２種である。
【0050】
本発明のコージオリゴ糖の製造方法においては、糖質の加リン酸分解によりβ－グルコース－１－リン酸を生成させる工程をさらに含んでいてもよい。上記加リン酸分解反応は、本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼにより実施することができる。本発明のコージオリゴ糖の製造方法において、本発明の酵素剤に加えて本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼを使用した場合、本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼの加リン酸分解反応によりβ－グルコース－１－リン酸が供給され、生成したβ－グルコース－１－リン酸と、グルコース（あるいは、当該反応中に生成したコージオリゴ糖）に対して本発明の酵素剤が作用して、コージオリゴ糖を製造することができる。この態様では、原料としてβ－グルコース－１－リン酸を添加することなく、反応系においてβ－グルコース－１－リン酸を供給しつつコージオリゴ糖を製造することができる点で有利である。
【0051】
上記加リン酸分解反応を触媒するホスホリラーゼとしては、例えば、マルトースを基質とするマルトースホスホリラーゼ、トレハロースを基質とするトレハロースホスホリラーゼが挙げられ、ホスホリラーゼ活性を有する酵素製剤を用いることができ、市販の酵素製剤も用いることができる。酵素製剤としては、特に制限ないが、例えばパエニバチルス属の種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＳＨ－５５由来の酵素（特許５３４５７６６号）を用いることができる。この酵素は耐熱性マルトースホスホリラーゼであるので、同様に耐熱性である本発明の酵素剤とともに、高温（例えば５８℃）での反応に用いることができる。また、上記ホスホリラーゼの基質として用いられるマルトース、トレハロースなどの糖質についても特に制限はなく、純品や各種混合物を用いることができる。β－グルコース－１－リン酸の入手性やコストを考慮すると、安価で安定かつ大量に入手可能なβ－グルコース－１－リン酸供給用基質およびグルコースや澱粉分解物といった糖質を原料としてコージオリゴ糖を製造する本発明の製造方法は、工業生産上大きなメリットを有するといえる。
【0052】
本発明の酵素剤とマルトースホスホリラーゼを併用する場合の製造条件は使用する酵素の性質などに基づいて適宜調整することができる。例えば、マルトース０．０１～１Ｍおよびリン酸二水素カリウムなどのリン酸塩０．５～５０ｍＭを含む反応水溶液（ｐＨ５～９）を作製し、マルトース1ｇ当たり０．１～５０Ｕ（終濃度）の本発明の酵素剤およびマルトース1ｇ当たり０．１～５０Ｕ（終濃度）のマルトースホスホリラーゼを添加し、２５～６５℃で１～１００時間保持することでコージオリゴ糖を製造することができる。所望のコージオリゴ糖（コージオリゴ糖含有組成物）が得られた後、必要に応じて酵素を失活させ、更に常法により濾過、脱色、脱臭、脱塩などの精製処理や濃縮処理を行うことができる。得られたコージオリゴ糖は、前記と同様の処理を行うことができる。
【0053】
本発明においては、所望のコージオリゴ糖が得られた後、必要に応じて酵素の失活処理、濾過・脱色・脱臭・脱塩などの精製処理および／または濃縮処理を行うことができる。これらの処理は常法に従って実施することができる。得られたコージオリゴ糖は、適宜濃縮して液状品としてもよく、噴霧乾燥などにより粉末品としてもよい。さらに、膜分画・樹脂分画などの分画処理や微生物による資化処理などによって残存した原料・副産物を除去したり特定重合度のものを分取したりしてもよい。
【0054】
本発明は、上記コージオリゴ糖の製造方法を実施してコージオリゴ糖を得る工程、および食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法を提供する。
【0055】
コージオリゴ糖の製造方法を実施して得られたコージオリゴ糖を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、コージオリゴ糖を原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはコージオリゴ糖そのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
【0056】
本発明の方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、もち）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、もち類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、各種調味料（醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
【0057】
本発明の方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどである。
【0058】
本発明の方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、化粧水、クリームおよびエマルジョンなどである。
【0059】
本発明の方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤、整腸剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などである。
【実施例0060】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0061】
略号の説明
β－Ｇ１Ｐ： β－グルコース－１－リン酸
Ｇｌｃ： グルコース
Ｔｒｅ： トレハロース
Ｋｏｊ： コージビオース
Ｎｉｇ： ニゲロース
Ｍａｌ： マルトース
Ｇｌｃ： グルコース
αＭＤＧ： メチルα－Ｄ－グルコピラノシド
Ｘｙｌ： キシロース
Ａｒａ： アラビノース
Ｃｅｌ： セロビオース
Ｓｕｃ： スクロース
グルコース、キシロース、フルクトースはＤ体を使用し、アラビノースはＬ体を使用した。
β－Ｇ１Ｐ： β－グルコース－１－リン酸
Ｇｌｃ： グルコース
Ｔｒｅ： トレハロース
Ｋｏｊ： コージビオース
Ｎｉｇ： ニゲロース
Ｍａｌ： マルトース
Ｇｌｃ： グルコース
αＭＤＧ： メチルα－Ｄ－グルコピラノシド
Ｘｙｌ： キシロース
Ａｒａ： アラビノース
Ｃｅｌ： セロビオース
Ｓｕｃ： スクロース
グルコース、キシロース、フルクトースはＤ体を使用し、アラビノースはＬ体を使用した。
【0062】
実施例１：酵素の準備
従来知られているホスホリラーゼの配列を基に相同性検索を行った。相同性検索により得られた多数について機能スクリーニングを行い、コージビオースホスホリラーゼ活性を有する可能性がある遺伝子を９つ選び、遺伝子組換えにより枯草菌を宿主とする異種タンパク質発現系で発現させた。９つのうち、コージビオースホスホリラーゼ活性を有していたものは４つであった。４つのタンパク質についてコージビオースホスホリラーゼ活性の発現条件を解析し、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）由来タンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）を選抜した。このタンパク質は、解析した４つの中でも、枯草菌宿主での発現が高く、コージビオースホスホリラーゼ活性の発現が良好であり、かつ活性発現の温度条件が比較的高温であり（例えば、５０℃）、ｐＨ条件が中性である点が優れている。
従来知られているホスホリラーゼの配列を基に相同性検索を行った。相同性検索により得られた多数について機能スクリーニングを行い、コージビオースホスホリラーゼ活性を有する可能性がある遺伝子を９つ選び、遺伝子組換えにより枯草菌を宿主とする異種タンパク質発現系で発現させた。９つのうち、コージビオースホスホリラーゼ活性を有していたものは４つであった。４つのタンパク質についてコージビオースホスホリラーゼ活性の発現条件を解析し、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）由来タンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）を選抜した。このタンパク質は、解析した４つの中でも、枯草菌宿主での発現が高く、コージビオースホスホリラーゼ活性の発現が良好であり、かつ活性発現の温度条件が比較的高温であり（例えば、５０℃）、ｐＨ条件が中性である点が優れている。
【0063】
１．コージビオースホスホリラーゼ活性を有する酵素
本実施例では、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）から糖ヒドロラーゼ／ホスホリラーゼと推定される機能未確認のタンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得た。
このアミノ酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子１）から開始コドンを除いた塩基配列（配列番号２）を図１に示す。配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列から開始コドンと推定されるメチオニン残基を削り、さらにＨｉｓタグを付加した配列である。配列番号４に記載の塩基配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の５′末端および３′末端に発現ベクター連結用の配列を含む。配列番号２に記載の塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
本実施例では、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）から糖ヒドロラーゼ／ホスホリラーゼと推定される機能未確認のタンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＣＪ３４３８４．１）をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得た。
このアミノ酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子１）から開始コドンを除いた塩基配列（配列番号２）を図１に示す。配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列から開始コドンと推定されるメチオニン残基を削り、さらにＨｉｓタグを付加した配列である。配列番号４に記載の塩基配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の５′末端および３′末端に発現ベクター連結用の配列を含む。配列番号２に記載の塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
【0064】
目的遺伝子１を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７ベクターに配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡが挿入されたプラスミドを鋳型として、プライマー１（5′-ACTGCCACTGCTCTTGGATC-3′（配列番号５））および、プライマー２（5′-GGTAAGTGCAAAGTTGAAGC-3′（配列番号６））を用いて目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【0065】
ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ） ２５μＬ
５０μＭ センス鎖増幅プライマー１ ０．１５μＬ
５０μＭ アンチセンス鎖増幅プライマー２ ０．１５μＬ
４０ｎｇ／μＬ テンプレート ０．５μＬ
Ｈ2Ｏ ２４．２μＬ
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ） ２５μＬ
５０μＭ センス鎖増幅プライマー１ ０．１５μＬ
５０μＭ アンチセンス鎖増幅プライマー２ ０．１５μＬ
４０ｎｇ／μＬ テンプレート ０．５μＬ
Ｈ2Ｏ ２４．２μＬ
【0066】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に２分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で２０秒間を１サイクルとして３０サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２４６６ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。
【0067】
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの作製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、プライマー３（5'-AACTTTGCACTTACCTGACG-3'（配列番号７））およびプライマー４（5'-AAGAGCAGTGGCAGTTGTTG-3'（配列番号８））を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子１の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に２分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で６０秒間を１サイクルとして３０サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（６９０３ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することにより行った。
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子１の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に２分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で６０秒間を１サイクルとして３０サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（６９０３ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することにより行った。
【0068】
連結反応液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａTM ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）によりプラスミドＤＮＡを作製した。得られたプラスミドを「本酵素発現用プラスミド」とした。上記の本酵素発現用プラスミドを用いて、常法により枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）を形質転換し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＤＭ３再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン０．００１％メチオニン、０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、前培養を経た後、本培養を７２時間培養した（特許５１２６８７９号に記載の通り培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（５，８００×ｇ、４℃、１５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過し、酵素液１を得た。
【0069】
２．マルトースホスホリラーゼの作製
マルトースホスホリラーゼは、特許５３４５７６６号に開示されているマルトースホスホリラーゼ変異体を用いた。この変異体は、パエニバチルス属の種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＳＨ－５５由来の野生型マルトースホスホリラーゼにアミノ酸置換を導入したものである。このマルトースホスホリラーゼ変異体のアミノ酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子２）の塩基配列（配列番号１０）を図１ＥおよびＦに示す。配列番号１０に記載の塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
マルトースホスホリラーゼは、特許５３４５７６６号に開示されているマルトースホスホリラーゼ変異体を用いた。この変異体は、パエニバチルス属の種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＳＨ－５５由来の野生型マルトースホスホリラーゼにアミノ酸置換を導入したものである。このマルトースホスホリラーゼ変異体のアミノ酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子２）の塩基配列（配列番号１０）を図１ＥおよびＦに示す。配列番号１０に記載の塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
【0070】
目的遺伝子２を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７－Ｍｉｎｉベクターに配列番号１０が挿入されたプラスミドを鋳型として、プライマー５（5'-TCCCCAGCACAAGCAATGAAGCAGTATCTGAAGCT-3'（配列番号１１））および、プライマー６（5'-CTGCAGGTCGACTTACTTGCTCGCCGCGGTAATCT-3'（配列番号１２））を用いて目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【0071】
ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ） ２５μＬ
５０μＭ センス鎖増幅プライマー５ ０．２０μＬ
５０μＭ アンチセンス鎖増幅プライマー６ ０．２０μＬ
４０ｎｇ／μＬ テンプレート ０．１μＬ
Ｈ2Ｏ ２３．６μＬ
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ） ２５μＬ
５０μＭ センス鎖増幅プライマー５ ０．２０μＬ
５０μＭ アンチセンス鎖増幅プライマー６ ０．２０μＬ
４０ｎｇ／μＬ テンプレート ０．１μＬ
Ｈ2Ｏ ２３．６μＬ
【0072】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で１５秒間→７２℃で１５秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２３３４ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。
【0073】
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの作製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、プライマー７（5'-TGCTTGTGCTGGGGATCCAAGAGCAGTGGCAG-3'（配列番号１３））およびプライマー８（5'-TAAGTCGACCTGCAGATCTCTAGAA-3'（配列番号１４））を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子２の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に２分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で１５秒間→７２℃で６０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片(６９５１ｂｐ)に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することにより行った。
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子２の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に２分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で１５秒間→７２℃で６０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片(６９５１ｂｐ)に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することにより行った。
【0074】
連結反応液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａTM ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ）によりプラスミドＤＮＡを作製した。得られたプラスミドを「本酵素発現用プラスミド」とした。上記の本酵素発現用プラスミドを用いて、常法により枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）を形質転換し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＤＭ３再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン０．００１％メチオニン、０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、前培養を経た後、本培養を７２時間培養した（特許５１２６８７９号に記載の通り培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（５，８００×ｇ、４℃、１５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過し、酵素液２を得た。
【0075】
実施例２：活性測定
・コージビオースホスホリラーゼ活性の測定方法
酵素液１を用いて、脱リン酸反応によりβ－Ｇ１Ｐから遊離するリン酸量を測定した。リン酸の測定法については、基質溶液１ １８μＬ（１００ｍＭ β－Ｇ１Ｐ ２μＬ、１００ｍＭ グルコース ２μＬ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．０）４μＬ、超純水１０μＬ）に希釈酵素液１ ２μＬを添加し、５０℃、１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理を行った。失活後の反応液にモリブデン試薬２００μＬと、１０％アスコルビン酸５０μＬを添加し、３０℃、１０分間発色させた。この溶液２００μＬを９６ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、酵素液添加直後に失活処理をしたものをブランクとして用いた。遊離リン酸検量線の作製には０～１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4溶液を用いた。この条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を遊離するのに必要な酵素量を１単位として定義した。
・コージビオースホスホリラーゼ活性の測定方法
酵素液１を用いて、脱リン酸反応によりβ－Ｇ１Ｐから遊離するリン酸量を測定した。リン酸の測定法については、基質溶液１ １８μＬ（１００ｍＭ β－Ｇ１Ｐ ２μＬ、１００ｍＭ グルコース ２μＬ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．０）４μＬ、超純水１０μＬ）に希釈酵素液１ ２μＬを添加し、５０℃、１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理を行った。失活後の反応液にモリブデン試薬２００μＬと、１０％アスコルビン酸５０μＬを添加し、３０℃、１０分間発色させた。この溶液２００μＬを９６ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、酵素液添加直後に失活処理をしたものをブランクとして用いた。遊離リン酸検量線の作製には０～１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4溶液を用いた。この条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を遊離するのに必要な酵素量を１単位として定義した。
【0076】
・マルトースホスホリラーゼ活性の測定方法
酵素液２を用いて、基質となるマルトースの加リン酸分解により遊離するグルコース量を測定した。基質溶液２ １８μＬ（１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ２μＬ、１００ｍＭ 二糖基質 ２μＬ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８．０）４μＬ、超純水１０μＬ）に希釈酵素液２ ２μＬを添加し、５０℃、１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理を行った。用いた二糖基質は、Ｔｒｅ、Ｋｏｊ、Ｎｉｇ、Ｍａｌである。失活後の反応液にグルコースＣII－テストワコー（富士フィルム和光純薬）２００μＬを添加し、３７℃、１０分間発色させた。この溶液２００μＬを９６ ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。なお、酵素液添加直後に失活処理をしたものをブランクとして用いた。Ｇｌｃ検量線の作製には０～１．１ｍＭのＧｌｃ溶液を用いた。この条件において１分間に１μｍｏｌの二糖を加リン酸分解するのに必要な酵素量を１単位として定義した。
酵素液２を用いて、基質となるマルトースの加リン酸分解により遊離するグルコース量を測定した。基質溶液２ １８μＬ（１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ２μＬ、１００ｍＭ 二糖基質 ２μＬ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８．０）４μＬ、超純水１０μＬ）に希釈酵素液２ ２μＬを添加し、５０℃、１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理を行った。用いた二糖基質は、Ｔｒｅ、Ｋｏｊ、Ｎｉｇ、Ｍａｌである。失活後の反応液にグルコースＣII－テストワコー（富士フィルム和光純薬）２００μＬを添加し、３７℃、１０分間発色させた。この溶液２００μＬを９６ ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。なお、酵素液添加直後に失活処理をしたものをブランクとして用いた。Ｇｌｃ検量線の作製には０～１．１ｍＭのＧｌｃ溶液を用いた。この条件において１分間に１μｍｏｌの二糖を加リン酸分解するのに必要な酵素量を１単位として定義した。
【0077】
実施例３：加リン酸分解試験
実施例１で作製した酵素（酵素液１）がコージビオースホスホリラーゼ活性を有することを確認すべく、α－グルコ二糖を用いて加リン酸分解活性を評価した。
各１０ｍＭのα－１，１結合、α１，２結合、α１，３結合、またはα１，４結合で結合した二糖基質（Ｔｒｅ、Ｋｏｊ、Ｎｉｇ、Ｍａｌ）と１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１８μＬに実施例１で作製した酵素液１を２０倍希釈し２μＬ添加し（０．０２４単位）、３０℃で１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理をおこなった。失活後の反応液に、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液３０μＬとグルコースＣII－テストワコー２００μＬを添加し、３７℃、１０分間呈色した。この溶液２００μＬを採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定することで、遊離したグルコースの量を測定した。結果を表１および図２に示す。
その結果、実施例１で作製した異種発現タンパク質（酵素液１）が、α１，２結合の二糖であるコージビオースを特異的に加リン酸分解することが明らかとなり、コージビオースホスホリラーゼ活性を有することを確認した。
実施例１で作製した酵素（酵素液１）がコージビオースホスホリラーゼ活性を有することを確認すべく、α－グルコ二糖を用いて加リン酸分解活性を評価した。
各１０ｍＭのα－１，１結合、α１，２結合、α１，３結合、またはα１，４結合で結合した二糖基質（Ｔｒｅ、Ｋｏｊ、Ｎｉｇ、Ｍａｌ）と１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１８μＬに実施例１で作製した酵素液１を２０倍希釈し２μＬ添加し（０．０２４単位）、３０℃で１０分間反応後、９５℃、５分間失活処理をおこなった。失活後の反応液に、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液３０μＬとグルコースＣII－テストワコー２００μＬを添加し、３７℃、１０分間呈色した。この溶液２００μＬを採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定することで、遊離したグルコースの量を測定した。結果を表１および図２に示す。
【表1】
【0078】
実施例４：脱リン酸反応試験
実施例１で作製した酵素（酵素液１）が加リン酸分解反応の逆反応を触媒するかについて確認すべく、β－Ｇ１Ｐと各糖質（アクセプター）の脱リン酸反応について検討した。１．３％のアクセプターと２．０％のβ－Ｇ１Ｐを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）２０μＬに、実施例１で作製した酵素液１を２５０倍希釈し２０μＬを添加し（０．００２単位）、３７℃で１０分間反応した。この反応液から２０μＬ採取し、ホスファＣ－テストワコーの発色液２００μＬを混合度、３０℃、１０分間呈色した。この溶液１００μＬを採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定することで、遊離したリン酸の量を測定した。本試験ではアクセプター基質を超純水に置き換えたものをブランクとし、サンプル吸光度との差を算出した。結果を表２および図３に示す。
結果、実施例１で作製した酵素は、調べた糖の中では、グルコース、メチルα－Ｄ－グルコピラノシド、キシロース、マルトース、トレハロース、セロビオースおよびスクロースをアクセプターとすることが明らかとなった。一方、アラビノースはアクセプターとして認識されなかった。
以下、実施例１で作製したコージビオースホスホリラーゼ活性を有する異種発現タンパク質を、アノキシバチルスＫＰと記載する。
実施例１で作製した酵素（酵素液１）が加リン酸分解反応の逆反応を触媒するかについて確認すべく、β－Ｇ１Ｐと各糖質（アクセプター）の脱リン酸反応について検討した。１．３％のアクセプターと２．０％のβ－Ｇ１Ｐを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）２０μＬに、実施例１で作製した酵素液１を２５０倍希釈し２０μＬを添加し（０．００２単位）、３７℃で１０分間反応した。この反応液から２０μＬ採取し、ホスファＣ－テストワコーの発色液２００μＬを混合度、３０℃、１０分間呈色した。この溶液１００μＬを採取し、Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０、ＴＥＣＡＮ）を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定することで、遊離したリン酸の量を測定した。本試験ではアクセプター基質を超純水に置き換えたものをブランクとし、サンプル吸光度との差を算出した。結果を表２および図３に示す。
【表2】
以下、実施例１で作製したコージビオースホスホリラーゼ活性を有する異種発現タンパク質を、アノキシバチルスＫＰと記載する。
【0079】
実施例５：β－グルコース－１－リン酸とグルコースを原料とした、アノキシバチルスＫＰによるオリゴ糖の合成
以下の条件で、グルコースがα－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
グルコースを１％とβ－Ｇ１Ｐを１％含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に、アノキシバチルスＫＰをグルコース１ｇ当たり５単位になるように加え、５０℃で８２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
以下の条件で、グルコースがα－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
グルコースを１％とβ－Ｇ１Ｐを１％含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に、アノキシバチルスＫＰをグルコース１ｇ当たり５単位になるように加え、５０℃で８２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
【0080】
図４に、反応開始前、反応開始１５時間後、４０時間後、８２時間後のクロマトグラムを示す。結果、本反応液は少なくとも重合度２～４であるオリゴ糖を含有することが確認された。
反応開始前（０時間）の２４．６１９分のピークがβ－Ｇ１Ｐ、４４．８０７分のピークがグルコースである。
反応開示８２時間後（反応終了時）の２４．７１８分のピークがβ－Ｇ１Ｐ、４４．７３１分がグルコースである、３０．３６８分のピークは重合度３（ＤＰ３）の糖に相当すると考えられる。標品との比較により、３５．１９６分のピークはコージビオース（ＤＰ２）であると考えられる。
表３および図５に、反応開始前と反応開始８２時間後の糖組成を比較した表およびグラスを示す。
反応液中の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。基質であるβ－Ｇ１Ｐとグルコースが減少し、ＤＰ２（コージビオース）、ＤＰ３およびＤＰ４以上のオリゴ糖が生成した。
反応開始前（０時間）の２４．６１９分のピークがβ－Ｇ１Ｐ、４４．８０７分のピークがグルコースである。
反応開示８２時間後（反応終了時）の２４．７１８分のピークがβ－Ｇ１Ｐ、４４．７３１分がグルコースである、３０．３６８分のピークは重合度３（ＤＰ３）の糖に相当すると考えられる。標品との比較により、３５．１９６分のピークはコージビオース（ＤＰ２）であると考えられる。
表３および図５に、反応開始前と反応開始８２時間後の糖組成を比較した表およびグラスを示す。
【表3】
【0081】
実施例６：アノキシバチルスＫＰとマルトースホスホリラーゼを併用したオリゴ糖の合成１
以下の条件で、マルトースを原料とし、グルコースがα－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを８３３ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５０℃で４９時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、１Ｎの塩酸でｐＨ４．８に調整し、グルコアミラーゼであるＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅ Ｐｅａｋ（ノボザイムズ社）を２μＬ添加し、６０℃で４時間反応させ残存するマルトースを分解した。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
以下の条件で、マルトースを原料とし、グルコースがα－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを８３３ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５０℃で４９時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、１Ｎの塩酸でｐＨ４．８に調整し、グルコアミラーゼであるＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅ Ｐｅａｋ（ノボザイムズ社）を２μＬ添加し、６０℃で４時間反応させ残存するマルトースを分解した。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
【0082】
結果を表４および図６に示す。
４９時間反応させた本反応液は、ＤＰ２を８．１％、ＤＰ３を３９．２％、およびＤＰ４以上を４．６％含有していた。ＤＰ２は標品との比較により、コージビオースであることを確認した。原料のマルトースとリン酸からマルトースホスホリラーゼの働きにより、β‐Ｇ１Ｐとグルコースが生成され、さらにアノキシバチルスＫＰの働きにより、コージビオース（とリン酸）が生成されたと考えられる。
ＤＰ３には、コージトリオースやコージビオシルグルコース（Ｇｌｃ（α１－２）Ｇｌｃ（α１－４）Ｇｌｃ）が含まれると考えられる。ＤＰ４はコージオリゴ糖であると考えられる。
【表4】
ＤＰ３には、コージトリオースやコージビオシルグルコース（Ｇｌｃ（α１－２）Ｇｌｃ（α１－４）Ｇｌｃ）が含まれると考えられる。ＤＰ４はコージオリゴ糖であると考えられる。
【0083】
実施例７：アノキシバチルスＫＰとマルトースホスホリラーゼを併用したオリゴ糖の合成２
以下の条件で、マルトースとキシロースを原料とし、α－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを５００ｍＭとキシロースを７５０ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５８℃で７２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
以下の条件で、マルトースとキシロースを原料とし、α－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを５００ｍＭとキシロースを７５０ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５８℃で７２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
【0084】
結果を表５および図７に示す。
反応７２時間後の反応液はＤＰ２を３５．１％含有するとともに、ＤＰ３以上を８．４％含有することが確認された。反応７２時間後に増加したＤＰ２は、キシロース基質が減少していることから、α-１,２結合で結合したグルコシルキシロースであると考えられる。原料のマルトースがリン酸の存在下でマルトースホスホリラーゼの働きにより、グルコースとβ－Ｇ１Ｐに変化し、さらにアノキシバチルスＫＰの働きにより、グルコシルキシロースが産生されたと考えられる。
【表5】
【0085】
実施例８：アノキシバチルスＫＰとマルトースホスホリラーゼを併用したオリゴ糖の合成３
以下の条件で、マルトースとスクロースを原料とし、α－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを４００ｍＭとスクロースを６００ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５８℃で７２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
以下の条件で、マルトースとスクロースを原料とし、α－１，２グリコシド結合により結合した二糖および／または重合度３以上のオリゴ糖を合成した。
マルトースを４００ｍＭとスクロースを６００ｍＭとＫＨ2ＰＯ4を１０ｍＭ含む溶液（ｐＨ調整なし）に、アノキシバチルスＫＰをマルトース１ｇ当たり２０単位と実施例１で作製したマルトースホスホリラーゼ（酵素液２）をマルトース１ｇ当たり１０単位になるように加え、５８℃で７２時間反応させた。その反応液を沸騰水で１０分間処理し、酵素を失活させた後、イオン交換樹脂により脱塩し、糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ－８０Ｎ・Ｌ（二本連結）、溶離液：水、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：５０℃、検出器：示差屈折検出器とした。
【0086】
結果を表６および図８に示す。
反応７２時間後の反応液はＤＰ３を１６．１％含有するとともに、ＤＰ４以上を３．６％含有することが確認された。ＤＰ３は、保持時間を基にコージトリオースではないと考えられた。ＤＰ３は、コージビオシルフラクトシド（Ｇｌｃ（α１－２）Ｇｌｃ（α１－２β）Ｆｒｕ）であると考えられる。原料のマルトースがリン酸の存在下でマルトースホスホリラーゼの働きによりグルコースとβ－Ｇ１Ｐに変化し、さらにアノキシバチルスＫＰにより、コージビオシルフラクトシドが産生されたと考えられる。
【表6】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】