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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024141484
(43)【公開日】2024-10-10
(54)【発明の名称】バイオフィルム除去剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/73 20060101AFI20241003BHJP
A61Q 11/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 31/721 20060101ALI20241003BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20241003BHJP
A23L 33/125 20160101ALI20241003BHJP
A23G 9/34 20060101ALN20241003BHJP
A23G 4/10 20060101ALN20241003BHJP
A23G 3/42 20060101ALN20241003BHJP
A23G 1/40 20060101ALN20241003BHJP
A21D 2/18 20060101ALN20241003BHJP
A21D 13/80 20170101ALN20241003BHJP
A23L 7/109 20160101ALN20241003BHJP
A23L 2/52 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
A61K8/73
A61Q11/00
A61K31/721
A61P1/02
A23L33/125
A23G9/34
A23G4/10
A23G3/42
A23G1/40
A21D2/18
A21D13/80
A23L7/109 A
A23L2/52
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023053169
(22)【出願日】2023-03-29
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】504147243
【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学
(71)【出願人】
【識別番号】323003023
【氏名又は名称】日新製糖株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000590
【氏名又は名称】弁理士法人 小野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】仲野 道代
(72)【発明者】
【氏名】中村 泰之
(72)【発明者】
【氏名】山本 美桜
【テーマコード（参考）】
4B014
4B018
4B032
4B046
4B117
4C083
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B014GB01
4B014GB06
4B014GB08
4B014GB11
4B014GB13
4B014GB18
4B014GL11
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB05
4B018LB07
4B018LB08
4B018MD20
4B018MD33
4B018ME09
4B032DB01
4B032DB08
4B032DB21
4B032DK14
4B032DK21
4B032DL20
4B046LA02
4B046LA04
4B046LC20
4B046LG15
4B046LG20
4B117LC05
4B117LK13
4B117LK15
4B117LL09
4C083AB172
4C083AB242
4C083AC122
4C083AC132
4C083AC692
4C083AC782
4C083AC862
4C083AD211
4C083AD212
4C083AD302
4C083AD352
4C083BB55
4C083CC41
4C083DD27
4C083EE32
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA35
4C086MA52
4C086MA57
4C086NA14
4C086ZA67
(57)【要約】
【課題】ＣＩはＧＴＦの活性を阻害するためバイオフィルムの形成を阻害できることは当業者に予測できるものの、すでに形成されているバイオフィルムについてはＣＩがどのような作用を示すかは当業者に全く予測できないため、それを明らかにすること。
【解決手段】サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするバイオフィルム除去剤。
【選択図】図９
【解決手段】サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするバイオフィルム除去剤。
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするバイオフィルム除去剤。
【請求項2】
バイオフィルムが歯の表面に形成されたものである請求項１記載のバイオフィルム除去剤。
【請求項3】
更に、う蝕の原因菌が資化可能な糖類を含有するものである請求項１または２記載のバイオフィルム除去剤。
【請求項4】
サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするグルカン結合タンパク質の活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオフィルム除去剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）は、グラム陽性通性嫌気性細菌であり、ヒト口腔内に存在する齲蝕の原因菌であり、その表層にはグルコシルトランスフェラーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＴＦ）、高分子タンパク抗原ｃ、グルカン結合タンパク（Ｇｌｕｃａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｇｂｐ）等の病原性に関与するタンパクが多数存在する。これらのタンパクが機能することにより、強固なバイオフィルムが形成され、齲蝕が発症する。
【0003】
齲蝕の予防法の一つとして、代用糖の利用が挙げられ、その一つである環状イソマルトオリゴ糖であるサイクロデキストラン（Ｃｙｃｌｏｉｓｏｍａｌｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＣＩ）は、７～１２個のグルコースがａ－１，６結合で環状に連結した構造を示すものである。ＣＩの一例として７個のグルコースがａ－１，６結合で環状に連結した構造のものを図１に示した。
【0004】
これまで本出願人らは、ＣＩがスクロースの存在下でＧＴＦの活性を阻害することにより、齲蝕の発生を抑制することを明らかにしている（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第５７７０８４５号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】ＦＵＮＡＮＥ Ｋａｚｕｍｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒａｎｓ ａｎｄ ａｔｔｅｍｐｔｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．， ５４， １０３－１０７ （２００７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、ＣＩはＧＴＦの活性を阻害するためバイオフィルムの形成を阻害できることは当業者に予測できるものの、すでに形成されているバイオフィルムについてはＣＩがどのような作用を示すかは当業者に全く予測できないため、それを明らかにすることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、意外にもＣＩはすでに形成されているバイオフィルムまでも除去できることを見出し、本発明を完成させた。
【0009】
また、上記バイオフィルムの除去はこれまで知られているＣＩのＧＴＦの活性の阻害だけでなく、新たにグルカン結合タンパク質の活性阻害が関連することを見出し、本発明を完成させた。
【0010】
すなわち、本発明は、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするバイオフィルム除去剤である。
【0011】
また、本発明は、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有することを特徴とするグルカン結合タンパク質の活性阻害剤である。
【発明の効果】
【0012】
本発明のバイオフィルム除去剤は、すでに形成されているバイオフィルムを除去することができる。
【0013】
また、本発明のグルカン結合タンパク質の活性阻害剤はグルカン結合タンパク質の分解等をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図9】ＣＩがバイオフィルムにどのように影響を与えるかを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明のバイオフィルム除去剤は、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を含有するものである。
【0016】
上記したサイクロデキストランは、例えば、４～３３個のグルコースがα－１,６グルコシド結合で環状に連結した公知の環状イソマルトオリゴ糖であり、例えば、特許第３０７５８７３号および特許第３１１７３２８号に記載のバチルス属の微生物の培養液や環状イソマルト糖合成酵素の反応液から得たものや、市販のものを使用することができる。また、通常、微生物や酵素を利用してサイクロデキストランを得た場合、分枝していないサイクロデキストラン（通常のサイクロデキストラン）と、分枝したサイクロデキストランの混合物として得られる。分枝していないサイクロデキストランと、分枝したサイクロデキストランは、ＯＤＳ等のカラム等で分離することができる（特開２０１２－１４０５２１号公報参照）。
【0017】
また、サイクロデキストランの誘導体としては、上記したサイクロデキストラン混合物からＯＤＳ等のカラム等で分離して得られる分岐したサイクロデキストランや、サイクロデキストリンで公知の誘導体において、それをサイクロデキストランや分岐したサイクロデキストランに置換したもの等が挙げられる。
【0018】
サイクロデキストランの誘導体の中でも１～数個のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストランが好ましい。この分枝サイクロデキストランにおいて、分枝するグルコースの重合度は９までであり、その中でも、特に１分子のグルコースがシクロデキストランにα－１，３－結合で枝分かれしたα－１，３－分枝シクロデキストランが好ましく用いられる。また、環状分枝イソマルトオリゴ糖の環状部分を構成するグルコース分子の数は４～３３であり、好ましくは４～１７、望ましくは４～１２であって、好ましい環状分枝イソマルトオリゴ糖を構成するグルコースの分子数は分子内総数で５～２０、望ましくは５～１３である。
【0019】
上記したサイクロデキストランおよびその誘導体の好ましいものとしては以下のものが挙げられる。
（ａ）サイクロデキストラン
（ｂ）１～数分子のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストラン
（ｃ）分枝していないサイクロデキストランと、１～数分子のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストランの混合物
（ｄ）７～１２個のグルコースがα－１,６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを含むもの
（ａ）サイクロデキストラン
（ｂ）１～数分子のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストラン
（ｃ）分枝していないサイクロデキストランと、１～数分子のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストランの混合物
（ｄ）７～１２個のグルコースがα－１,６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを含むもの
【0020】
上記の中でも（ｂ）の１～数個のグルコースがα－１，３－結合でサイクロデキストランに結合したα－１，３－分枝サイクロデキストランまたは（ｄ）７～１２個のグルコースがα－１,６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを含むものが好ましく、７～１２個のグルコースがα－１,６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを含むものがより好ましい。この（ｄ）は、例えば、日新製糖株式会社からＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ（７～１２個のグルコースがα－１．６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを１３質量％以上含む）の商品名で市販されているのでこれを利用してもよい。
【0021】
本発明のバイオフィルム除去剤における、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上の含有量は特に限定されないが、例えば、７～１２個のグルコースがα－１．６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを１０～２５質量％（以下、単に「％」という）を含むものの含有量として、０．０１％～５０％、好ましくは０．０１～１０％さらに好ましくは０．２５％～３％である。
【0022】
本発明のバイオフィルム除去剤には、サイクロデキストランおよびその誘導体の効果を損なわないため、更に、後記するう蝕の原因菌が資化可能な糖類を含有させることができる。このような糖類としては、例えば、フルクトース、グルコース、スクロース等が挙げられる、これら糖類は１種以上を用いることができる。
【0023】
更に、本発明のバイオフィルム除去剤には、サイクロデキストランおよびその誘導体の効果を損なわない限り、例えば、ホップ抽出物等のポリフェノール類、後記するオーラルケア食品、菓子、一般食品、飲料、ペットフード、オーラルケア用品、洗剤等に用いられる成分を含有させることができる。
【0024】
本発明のバイオフィルム除去剤の形態は、特に限定されず、例えば、ガム、タブレット等のオーラルケア食品、アメ、グミ、ゼリー、チョコレート、アイスクリーム、ビスケット、パウンドケーキ等の菓子、パン、うどん、そば、ヨーグルト、飲料、魚介練り製品等の一般食品、歯磨き粉、洗口剤、うがい薬、入れ歯洗浄剤、入れ歯安定剤等のオーラルケア用品、ペットフード、風呂用、トイレ用等の洗剤等が挙げられる。これらの形態の中でもオーラルケア食品およびオーラルケア用品が好ましい。本発明のバイオフィルム除去剤は、糖類の一部または全部に代えてサイクロデキストランおよびその誘導体を用いる以外は上記形態において従来公知の製造方法で製造することができる。
【0025】
以上説明した本発明のバイオフィルム除去剤は、バイオフィルムを除去することができる。本発明のバイオフィルム除去剤を用いてバイオフィルムを除去する際には、例えば、オーラルケア食品、菓子、一般食品、ペットフードであれば、１日１～３回程度摂取すればよい。また、オーラルケア用品であれば、例えば、飲食前後、就寝前後等に適宜使用すればよい。更に、洗剤であれば、例えば、掃除の前に適宜使用すればよい。
【0026】
また、本発明のバイオフィルム除去剤が除去できるバイオフィルムは特に限定されないが、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、アグレガチバクター・アクチノマイセテムコイタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｉｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）等のう蝕の原因菌により歯の表面に形成されるバイオフィルム、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）等に属する細菌により浴槽等に形成されるバイオフィルム、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）等が形成するバイオフィルム等挙げられる。これらのバイオフィルムの中でもすでに形成されているバイオフィルムが好ましく、歯の表面に形成されるバイオフィルムがより好ましく、特にストレプトコッカス・ミュータンスにより歯の表面に形成されるバイオフィルムが好ましい。
【0027】
本発明のバイオフィルム除去剤は、従来サイクロデキストランに知られていたＧＴＦの活性の阻害だけでなく、新たにグルカン結合タンパク質の活性を阻害することにより見出されたものである。そのため、本発明のバイオフィルム除去剤は、グルカン結合タンパク質を有するバイオフィルムであれば幅広く除去することができる。ここでグルカン結合タンパク質の活性を阻害するとはグルカン結合タンパク質を分解すること、何かしらの相互作用でグルカン結合タンパク質の働きを弱めること等を含む。
【0028】
そのため、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上は、これを含有させることによりグルカン結合タンパク質の活性阻害剤となる。
【0029】
グルカン結合タンパク質は、糖結合タンパク質で細胞壁などの構成成分であるため、本発明のグルカン結合タンパク質の活性阻害剤は、例えば、抗生物質等の有用物質の開発（細菌や真菌の細胞壁を壊して、有用物質を採取する等）、食品加工（繊維を柔らかくする等）、バイオエネルギー生産（バイオマスから糖を生成する等）、土壌の環境保全（土壌中の有機物の分解をする等）等に利用可能である。また、グルカン結合タンパク質は様々な疾患に関連しているため、本発明のグルカン結合タンパク質の活性阻害剤は炎症性疾患の治療（グルカン結合タンパク質は炎症性疾患の発生に関与するため）、がん治療（グルカン結合タンパク質はがん細胞の増殖や転移に関与するため）、感染症の治療（グルカン結合タンパク質は細菌や真菌の細胞壁に存在するため）、糖尿病治療（グルカン結合タンパク質はインスリンの作用を妨げることがあるため）等にも利用可能である。
【0030】
本発明のグルカン結合タンパク質の活性阻害剤は、サイクロデキストランおよびその誘導体から選ばれる１種以上を有効成分とする以外は、上記したバイオフィルム除去剤と同様の組成、形態、製造方法あるいは上記用途に用いられる公知の技術と同様の組成、形態、製造方法でよい。
【実施例0031】
以下、本発明の実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【0032】
実 施 例 １
バイオフィルムの除去試験：
（１）バイオフィルム形成量への影響
Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ液体培地 （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ：以下、「ＴＨ培地」という）にストレプトコッカス・ミュータンスＭＴ８１４８株（大阪大学で所有する日本人小児より分離された株：基準株）を接種した後、３７℃で１８時間、静置培養して菌液を調製した。１％スクロース含有化学合成培地〔Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＭ）；５８ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；ナカライテスク、京都，１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，３５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，１００μＭ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４），２０ｍＭ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ，５０ｍＭ Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ＨＣｌ，５ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ，０．５ｍＭ Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ，０．１５ｍＭ Ｔｈｉａｍｉｎ ＨＣｌ，０．０１５ｍＭ Ｄ－ｂｉｏｔｉｎ，５０ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，１２．５ｍＭ Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ ＨＣｌ，１６．２５ｍＭ Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ，１．２５ｍＭ Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；和光純薬、大阪〕に前記菌液の１００μｌを接種し、これを分けてそれぞれに０～１０％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ：７～１２個のグルコースがα－１．６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを１３％以上含む）を添加した試験液を調製した。これらの試験液をプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養した。培養後、クリスタルバイオレッドで試験液を染色し、ＯＤ５７０の吸光度を測定した。その結果を図２に示した。
バイオフィルムの除去試験：
（１）バイオフィルム形成量への影響
Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ液体培地 （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ：以下、「ＴＨ培地」という）にストレプトコッカス・ミュータンスＭＴ８１４８株（大阪大学で所有する日本人小児より分離された株：基準株）を接種した後、３７℃で１８時間、静置培養して菌液を調製した。１％スクロース含有化学合成培地〔Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＭ）；５８ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；ナカライテスク、京都，１５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，３５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，１００μＭ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４），２０ｍＭ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ，５０ｍＭ Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ＨＣｌ，５ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ，０．５ｍＭ Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ，０．１５ｍＭ Ｔｈｉａｍｉｎ ＨＣｌ，０．０１５ｍＭ Ｄ－ｂｉｏｔｉｎ，５０ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，１２．５ｍＭ Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ ＨＣｌ，１６．２５ｍＭ Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ，１．２５ｍＭ Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；和光純薬、大阪〕に前記菌液の１００μｌを接種し、これを分けてそれぞれに０～１０％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ：７～１２個のグルコースがα－１．６グルコシド結合で環状に連結したサイクロデキストランを１３％以上含む）を添加した試験液を調製した。これらの試験液をプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養した。培養後、クリスタルバイオレッドで試験液を染色し、ＯＤ５７０の吸光度を測定した。その結果を図２に示した。
【0033】
バイオフィルム形成量はＣＩ濃度依存的に減少しており、ＣＩを添加しない場合と比較して、１０％添加した場合では約７０％減少していた。これらのことは、スクロースの存在はＣＩによるバイフォイルム形成阻害効果にはなんら影響しないことが示唆される。
【0034】
（２）バイオフィルムの構造への影響
（１）と同様にしてストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株の菌液を調製した後、３，０００×ｇ、１５分で遠心分離して菌体を分離した。その後、菌体をＨｅｘｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅにて染色した。次に、この染色した菌体を１％スクロース含有化学合成培地にＯＤ５７０の吸光度が０．１になるように調整して接種した。これを分けてそれぞれに０～１０％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した試験液を調製した。これらの試験液をチャンバースライドウエルの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養した。培養後、共焦点走査型レーザー顕微鏡ＬＳＭ７８０（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．２，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ Ｃｏ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてバイオフィルムの構造と断面（厚み）を観察した。その結果を図３に示した。また、この観察からバイオフィルムの密度も求めた。その結果を図４に示した。
（１）と同様にしてストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株の菌液を調製した後、３，０００×ｇ、１５分で遠心分離して菌体を分離した。その後、菌体をＨｅｘｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅにて染色した。次に、この染色した菌体を１％スクロース含有化学合成培地にＯＤ５７０の吸光度が０．１になるように調整して接種した。これを分けてそれぞれに０～１０％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した試験液を調製した。これらの試験液をチャンバースライドウエルの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養した。培養後、共焦点走査型レーザー顕微鏡ＬＳＭ７８０（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．２，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ Ｃｏ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてバイオフィルムの構造と断面（厚み）を観察した。その結果を図３に示した。また、この観察からバイオフィルムの密度も求めた。その結果を図４に示した。
【0035】
バイオフィルムの構造は、ＣＩの濃度が上昇するにつれて密度は２８％の低下が認められ、厚みは５５％減少していた。ＣＩを添加していない場合に比較してＣＩを１０％添加した場合では，厚みは５５％減少していた。密度はＣＩの濃度が上昇するにつれて疎になり、ＣＩを添加しない場合と１０％添加した場合とを比較すると、１０％添加した場合には約６５％の密度の低下が認められた。
【0036】
（３）バイオフィルムの破砕への影響
ＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を最終濃度が０～１％になるよう添加した１％スクロース含有ＴＨ培地に、ストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株を接種した。これらを６穴細胞培養用マイクロテストプレートのウェルに１０ｍｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養した。培養後、２分間ウェル内の菌液に超音波を当てバイオフィルムを破砕した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、残存したバイオフィルムをセルスクレーパーにて剥がし、生理食塩水にて段階希釈した。これらをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ 寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ）に接種し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養した。超音波処理前と超音波処理後のコロニー数を計測し、以下の式で残存菌数の割合を求めた。その結果を図５に示した。
ＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を最終濃度が０～１％になるよう添加した１％スクロース含有ＴＨ培地に、ストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株を接種した。これらを６穴細胞培養用マイクロテストプレートのウェルに１０ｍｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養した。培養後、２分間ウェル内の菌液に超音波を当てバイオフィルムを破砕した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、残存したバイオフィルムをセルスクレーパーにて剥がし、生理食塩水にて段階希釈した。これらをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ 寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ）に接種し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養した。超音波処理前と超音波処理後のコロニー数を計測し、以下の式で残存菌数の割合を求めた。その結果を図５に示した。
【0037】
【数1】
【0038】
ＣＩの濃度が上昇するにつれバイオフィルム中の菌数は減少した。ＣＩを添加しない場合と１％添加した場合を比較すると、１％添加した場合ではバイオフィルム中の菌数は約６５％減少していた。
【0039】
実 施 例 ２
形成されたバイオフィルムの除去試験：
（１）形成されたバイオフィルム形成量への影響
ＴＨ液体培地にストレプトコッカス・ミュータンスＭＴ８１４８株を接種した後、３７℃で１８時間、嫌気下で培養して菌液を調製した。１％スクロース含有化学合成培地に前記菌液の１００μｌを接種し、これをプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養してバイオフィルムを形成した。各ウエルのそれぞれに最終濃度が０～１％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した後、３７℃で３、６または１２時間、嫌気下で培養した。培養後、クリスタルバイオレッドで試験液を染色し、ＯＤ５７０の吸光度を測定した。その結果を図６に示した。
形成されたバイオフィルムの除去試験：
（１）形成されたバイオフィルム形成量への影響
ＴＨ液体培地にストレプトコッカス・ミュータンスＭＴ８１４８株を接種した後、３７℃で１８時間、嫌気下で培養して菌液を調製した。１％スクロース含有化学合成培地に前記菌液の１００μｌを接種し、これをプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で４８時間、嫌気下で培養してバイオフィルムを形成した。各ウエルのそれぞれに最終濃度が０～１％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した後、３７℃で３、６または１２時間、嫌気下で培養した。培養後、クリスタルバイオレッドで試験液を染色し、ＯＤ５７０の吸光度を測定した。その結果を図６に示した。
【0040】
すでに形成されたバイオフィルムに対するＣＩの影響を観察したところ、バイオフィルムの形成量はＣＩを添加しない場合と比較して濃度依存的に減少しており、ＣＩを１％ 添加した場合では３時間後は約４０％、６時間後は約３０％、１２時間後は約４０％のバイオフィルム形成量の減少が認められた。
【0041】
（２）形成されたバイオフィルムの構造への影響
（１）と同様にしてストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株の菌液を調製した後、３，０００×ｇ、１５分で遠心分離して菌体を分離した。その後、菌体をＨｅｘｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅにて染色した。次に、この染色した菌体を１％スクロース含有化学合成培地にＯＤ５７０の吸光度が０．１になるように調整して接種した。これをチャンバースライドウエルの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養してバイオフィルムを形成した。各ウエルのそれぞれに０～１％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した後、３７℃で２４時間培養した。培養後、共焦点走査型レーザー顕微鏡にてバイオフィルムの構造と断面（厚み）を観察した。その結果を図７に示した。また、この観察からバイオフィルムの密度も求めた。その結果を図８に示した。
（１）と同様にしてストレプトコッカス・ミュータンス８１４８株の菌液を調製した後、３，０００×ｇ、１５分で遠心分離して菌体を分離した。その後、菌体をＨｅｘｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅにて染色した。次に、この染色した菌体を１％スクロース含有化学合成培地にＯＤ５７０の吸光度が０．１になるように調整して接種した。これをチャンバースライドウエルの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で２４時間、嫌気下で培養してバイオフィルムを形成した。各ウエルのそれぞれに０～１％でＣＩとしてサイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）を添加した後、３７℃で２４時間培養した。培養後、共焦点走査型レーザー顕微鏡にてバイオフィルムの構造と断面（厚み）を観察した。その結果を図７に示した。また、この観察からバイオフィルムの密度も求めた。その結果を図８に示した。
【0042】
ＣＩを３時間反応させた場合のバイオフィルムの構造は、厚みが減少しており、密度は疎であった。さらにＣＩを添加しない場合と１０％添加した場合とを比較して、厚みは約５０％減少しており、密度は約５５％減少していた。
【0043】
（３）ＣＩの形成されたバイオフィルムへの影響についての検討
実施例１および２の結果を基にＣＩが形成されたバイオフィルムにどのように影響を与えるかは図９のように考えられる。すなわち、ＣＩは不溶性グルカンを生成する酵素であるＧＴＦの働きを阻害すると共にグルカン結合タンパク質の活性を阻害し、形成されたバイオフィルムの結合を脆弱化してバイオフィルムを破壊する。
実施例１および２の結果を基にＣＩが形成されたバイオフィルムにどのように影響を与えるかは図９のように考えられる。すなわち、ＣＩは不溶性グルカンを生成する酵素であるＧＴＦの働きを阻害すると共にグルカン結合タンパク質の活性を阻害し、形成されたバイオフィルムの結合を脆弱化してバイオフィルムを破壊する。
【0044】
実 施 例 ３
バイオフィルム除去剤（歯磨き粉）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ０．２％
プロピレングリコール ３．０％
アルギン酸ナトリウム ０．６％
キサンタンガム ０．７％
ソルビット液（７０％） ４５．０％
無水ケイ酸 ２０．０％
酸化チタン ０．４％
フッ化ナトリウム ０．２１％
サッカリンナトリウム ０．１５％
ラウリル硫酸ナトリウム ０．８％
香料 適量
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
バイオフィルム除去剤（歯磨き粉）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ０．２％
プロピレングリコール ３．０％
アルギン酸ナトリウム ０．６％
キサンタンガム ０．７％
ソルビット液（７０％） ４５．０％
無水ケイ酸 ２０．０％
酸化チタン ０．４％
フッ化ナトリウム ０．２１％
サッカリンナトリウム ０．１５％
ラウリル硫酸ナトリウム ０．８％
香料 適量
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
【0045】
実 施 例 ４
バイオフィルム除去剤（マウスウオッシュ）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ３．０％
塩化ベンザルコニウム ０．２％
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
バイオフィルム除去剤（マウスウオッシュ）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ３．０％
塩化ベンザルコニウム ０．２％
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
【0046】
実 施 例 ５
バイオフィルム除去剤（飲料）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ０．１２％
ビタミンミックス ０．２５％
クエン酸 ０．１２５％
Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム ０．０５％
レモン果汁 ０．５０％
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
バイオフィルム除去剤（飲料）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ０．１２％
ビタミンミックス ０．２５％
クエン酸 ０．１２５％
Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム ０．０５％
レモン果汁 ０．５０％
水 残部
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
【0047】
実 施 例 ６
バイオフィルム除去剤（タブレット）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ２．００％
ソルビトール ９２．０５％
ペパーミントフレーバー ４．９５％
ショ糖脂肪酸エステル １．００％
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
バイオフィルム除去剤（タブレット）：
以下の成分を混合してバイオフィルム除去剤を製造した。
ＣＩ＊ ２．００％
ソルビトール ９２．０５％
ペパーミントフレーバー ４．９５％
ショ糖脂肪酸エステル １．００％
＊：サイクロデキストラン（日新製糖製：ＣＩ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｘ）
【0048】
実 施 例 ７
グルカン結合タンパク質の活性阻害剤：
実施例３～６のバイオフィルム除去剤と同様にしてグルカン結合タンパク質の活性阻害剤を製造した。
グルカン結合タンパク質の活性阻害剤：
実施例３～６のバイオフィルム除去剤と同様にしてグルカン結合タンパク質の活性阻害剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【0049】
本発明のバイオフィルム除去剤は、バイオフィルムの除去に利用可能である。
【0050】
また、本発明のグルカン結合タンパク質の活性阻害剤は、グルカン結合タンパク質の分解等に利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
