特開 2024-14222 多細胞構造体評価方法、プログラムおよび多細胞構造体評価装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024014222

(43)【公開日】2024-02-01

(54)【発明の名称】多細胞構造体評価方法、プログラムおよび多細胞構造体評価装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20240125BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022116893

(22)【出願日】2022-07-22

(71)【出願人】

【識別番号】000207551

【氏名又は名称】株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス

(74)【代理人】

【識別番号】100110847

【弁理士】

【氏名又は名称】松阪 正弘

(74)【代理人】

【識別番号】100136526

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 勉

(74)【代理人】

【識別番号】100136755

【弁理士】

【氏名又は名称】井田 正道

(72)【発明者】

【氏名】三浦 丈苗

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB11

4B029CC02

4B029FA03

4B029FA04

(57)【要約】

【課題】複数の多細胞構造体を非侵襲にて個別に評価する。
【解決手段】多細胞構造体を評価する多細胞構造体評価方法は、非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像を準備する工程（ステップＳ１１）と、対象画像において当該複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する工程（ステップＳ１２）と、対象画像において当該複数の多細胞構造体を抽出する工程（ステップＳ１３）と、複数のシンボルをそれぞれ当該複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程（ステップＳ１４）と、各多細胞構造体の評価を示す評価値を各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する工程（ステップＳ１５）と、を備える。これにより、１つの対象画像に含まれる複数の多細胞構造体を非侵襲にて個別に評価することができる。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多細胞構造体を評価する多細胞構造体評価方法であって、
ａ）非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像を準備する工程と、
ｂ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する工程と、
ｃ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する工程と、
ｄ）前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程と、
ｅ）各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する工程と、
を備えることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項2】

請求項１に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記各多細胞構造体はオルガノイドであることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記ｂ）工程における前記複数のシンボルの抽出、および、前記ｃ）工程における前記複数の多細胞構造体の抽出はそれぞれ、機械学習により生成された学習済みモデルを用いて行われることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項4】

請求項１または２に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記ｄ）工程は、
ｄ１）前記対象画像において、前記複数の多細胞構造体にそれぞれ対応する複数の部分領域を設定する工程と、
ｄ２）前記複数のシンボルの各シンボルについて、前記各シンボルを含む１つの部分領域を特定し、前記各シンボルを前記１つの部分領域に対応する多細胞構造体に関連付ける工程と、
を備えることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項5】

請求項４に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記ｄ１）工程において、前記複数の部分領域はそれぞれ、対応する多細胞構造体の全体を内部に含むように設定されることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項6】

請求項１または２に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記対象画像は、倒立顕微鏡により取得されたモノクロの明視野画像であることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項7】

請求項６に記載の多細胞構造体評価方法であって、
前記倒立顕微鏡による前記対象画像の取得の際に、前記複数の多細胞構造体に拡散光が照射されることを特徴とする多細胞構造体評価方法。

【請求項8】

多細胞構造体を評価するプログラムであって、
前記プログラムがコンピュータによって実行されることにより、
ａ）非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像を準備する工程と、
ｂ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する工程と、
ｃ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する工程と、
ｄ）前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程と、
ｅ）各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する工程と、
が行われることを特徴とするプログラム。

【請求項9】

多細胞構造体を評価する多細胞構造体評価装置であって、
非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像において、前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する第１抽出部と、
前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する第２抽出部と、
前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける関連付け部と、
各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する評価値算出部と、
を備えることを特徴とする多細胞構造体評価装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多細胞構造体を評価する技術に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、創薬や再生医療・細胞治療等の研究に、多細胞構造体の一種であるオルガノイドが用いられている。オルガノイドとは、複数種類の細胞が３次元的に凝集した多細胞構造体であり、生体内の臓器や器官に近い特徴を有する。オルガノイドは、通常、幹細胞やプライマリ（すなわち、患者や動物から摘出された細胞）を起点として、マイクロタイタープレートやシャーレ、スラントネック型フラスコ等の培養基材上で培養され、多くの工程を経て成長する。したがって、所望のオルガノイドを得るためには、培養途中段階におけるオルガノイドの成長度合いの観察定量や品質評価が重要である。

【0003】

現在、基礎研究や臨床応用等の研究フェーズにおいて、オルガノイドの成長の途中経過を観察する際や、オルガノイドの分化度合いをチェックする際には、培養基材上のオルガノイド群から数個のオルガノイドを抜き取って破壊検査や侵襲的検査を行っている。具体的には、抜き取ったオルガノイドに対して、内部構造の観察、蛍光染色によるマーカーの発現の有無、細胞外活動電位計測、代謝活性の評価、拍動検査等の様々な検査を行い、オルガノイドが所望の機能をどの程度保持しているかを評価する。

【0004】

このような抜き取り検査に使用されたオルガノイドは、試薬の添加等により侵襲されて死滅するため、抜き取り検査の回数を増やそうとすると、最終的に得られるオルガノイドの数（すなわち、最終収量）が少なくなる。当該問題点は、オルガノイド以外の多細胞構造体等の培養においても同様に存在する。

【0005】

特許文献１では、細胞療法等に使用される試験細胞の画像を、機械学習により生成された学習済みモデルを用いて解析し、当該細胞の機能を評価する技術が提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２０２１－５１５５８６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ところで、上述のような抜き取り検査は、同一環境下（例えば、培地成分や温度、湿度等が同一の状態）で培養されているオルガノイド群の成長度合いは均一である、という前提の元に行われている。しかしながら、実際には、同一の培養基材上で培養されているオルガノイド群においても、成長度合いには個体差が存在するため、抜き取り検査による評価の信頼性は高いとは言い難い。

【0008】

また、特許文献１の技術では、複数の試験細胞の解析を並行して個別に行うことは難しい。特に、１つの画像中に多数の試験細胞が存在する場合、当該多数の試験細胞の全数検査を個別に行うことは難しい。

【0009】

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、複数の多細胞構造体を非侵襲にて個別に評価することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の態様１は、多細胞構造体を評価する多細胞構造体評価方法であって、ａ）非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像を準備する工程と、ｂ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する工程と、ｃ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する工程と、ｄ）前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程と、ｅ）各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する工程と、を備える。

【0011】

本発明の態様２は、態様１の多細胞構造体評価方法であって、前記各多細胞構造体はオルガノイドである。

【0012】

本発明の態様３は、態様１または２の多細胞構造体評価方法であって、前記ｂ）工程における前記複数のシンボルの抽出、および、前記ｃ）工程における前記複数の多細胞構造体の抽出はそれぞれ、機械学習により生成された学習済みモデルを用いて行われる。

【0013】

本発明の態様４は、態様１または２（態様１ないし３のいずれか１つ、であってもよい。）の多細胞構造体評価方法であって、前記ｄ）工程は、ｄ１）前記対象画像において、前記複数の多細胞構造体にそれぞれ対応する複数の部分領域を設定する工程と、ｄ２）前記複数のシンボルの各シンボルについて、前記各シンボルを含む１つの部分領域を特定し、前記各シンボルを前記１つの部分領域に対応する多細胞構造体に関連付ける工程と、を備える。

【0014】

本発明の態様５は、態様４の多細胞構造体評価方法であって、前記ｄ１）工程において、前記複数の部分領域はそれぞれ、対応する多細胞構造体の全体を内部に含むように設定される。

【0015】

本発明の態様６は、態様１または２（態様１ないし５のいずれか１つ、であってもよい。）の多細胞構造体評価方法であって、前記対象画像は、倒立顕微鏡により取得されたモノクロの明視野画像である。

【0016】

本発明の態様７は、態様６の多細胞構造体評価方法であって、前記倒立顕微鏡による前記対象画像の取得の際に、前記複数の多細胞構造体に拡散光が照射される。

【0017】

本発明の態様８は、多細胞構造体を評価するプログラムであって、前記プログラムがコンピュータによって実行されることにより、ａ）非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像を準備する工程と、ｂ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する工程と、ｃ）前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する工程と、ｄ）前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程と、ｅ）各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する工程と、が行われる。

【0018】

本発明の態様９は、多細胞構造体を評価する多細胞構造体評価装置であって、非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像において、前記複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボルを抽出する第１抽出部と、前記対象画像において前記複数の多細胞構造体を抽出する第２抽出部と、前記複数のシンボルをそれぞれ前記複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける関連付け部と、各多細胞構造体の評価を示す評価値を前記各多細胞構造体に関連付けられたシンボルに基づいて算出する評価値算出部と、を備える。

【発明の効果】

【0019】

本発明では、複数の多細胞構造体を非侵襲にて個別に評価することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】一の実施の形態に係る多細胞構造体評価装置の構成を示す図である。

【図2】対象画像を示す図である。

【図3】コンピュータの構成を示す図である。

【図4】コンピュータによって実現される機能を示すブロック図である。

【図5】オルガノイドの評価の流れを示す図である。

【図6】オルガノイドの評価の流れを示す図である。

【図7】対象画像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

図１は、本発明の一の実施の形態に係る多細胞構造体評価装置１（以下、単に「評価装置１」とも呼ぶ。）の構成を示す図である。評価装置１は、複数の細胞が凝集した構造体である多細胞構造体を評価する装置である。以下では、評価装置１により評価される多細胞構造体はオルガノイドであるものとして説明する。オルガノイドとは、複数種類の多数の細胞が３次元的に凝集した多細胞構造体であり、生体内の臓器や器官に近い特徴を有するものである。

【0022】

評価装置１は、画像取得部２と、コンピュータ３とを備える。画像取得部２は、培養基材上の複数のオルガノイドを拡大しつつ撮像することにより、複数のオルガノイドを含む画像（以下、「対象画像」とも呼ぶ。）を、当該複数のオルガノイドを侵襲することなく取得する。画像取得部２としては、例えば、光学顕微鏡が利用可能である。画像取得部２では、例えば、明視野観察法によりモノクロの明視野画像が取得される。

【0023】

図１に示す例では、画像取得部２は倒立顕微鏡である。画像取得部２は、ステージ２１と、光照射部２２と、観察光学系２３と、カメラ２４とを備える。ステージ２１は、観察対象物である複数のオルガノイドを保持する培養基材等を支持する。光照射部２２は、ステージ２１の上方に配置され、ステージ２１上の複数のオルガノイドに光を照射する。光照射部２２から複数のオルガノイドに照射される光は、例えば拡散光である。観察光学系２３は、ステージ２１の下方に配置され、複数のオルガノイドを透過した光をカメラ２４へと導く。カメラ２４は、観察光学系２３により導かれた光を受けて、複数のオルガノイドを含む対象画像を取得する。カメラ２４は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）またはＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）を有する顕微鏡用デジタルカメラである。

【0024】

図２は、画像取得部２により取得された対象画像９の一例を示す図である。対象画像９には、複数の多細胞構造体９１（以下、「オルガノイド９１」と呼ぶ。）が含まれている。図２に示す例では、対象画像９は３つのオルガノイド９１を含む。対象画像９が示す複数のオルガノイド９１は、同じ種類のオルガノイド９１である。当該複数のオルガノイド９１は、略同一の生育環境下（例えば、培地成分や温度、湿度等が略同一の状態）で培養されている。例えば、当該複数のオルガノイド９１は、１つの培養基材上にて培養されている。図２に示す例では、各オルガノイド９１は脳オルガノイドである。なお、対象画像９中の複数のオルガノイド９１は、上述のように、非侵襲で撮像されており、当該複数のオルガノイド９１は撮像により損傷したり死滅したりはしない。

【0025】

オルガノイド９１には、当該オルガノイド９１の成長度合い（すなわち、生育の程度）を示す１つまたは複数のシンボル９２が含まれる。図２に示す例では、脳オルガノイドであるオルガノイド９１の表面に形成される神経原基が、シンボル９２である。脳オルガノイドの成長度合いは、神経原基の大きさ、数、表面被覆率（すなわち、脳オルガノイド表面のうち神経原基に被覆される領域の割合）等に基づいて評価される。図２に示す例では、各オルガノイド９１には複数のシンボル９２が含まれる。

【0026】

なお、オルガノイド９１は、脳オルガノイド以外のオルガノイドであってもよい。例えば、オルガノイド９１は、腸管上皮オルガノイドであってもよい。この場合、腸管上皮オルガノイドの内部に形成された空洞内壁のクリプト構造が、オルガノイド９１の成長度合いを示すシンボル９２とされる。

【0027】

図１に示す画像取得部２により取得された対象画像９はコンピュータ３へと送られる。画像取得部２からコンピュータ３への対象画像９の送信は、無線により行われてもよく、有線により行われてもよい。

【0028】

図３は、コンピュータ３の構成を示す図である。コンピュータ３は、プロセッサ３１と、メモリ３２と、入出力部３３と、バス３４とを備える通常のコンピュータである。バス３４は、プロセッサ３１、メモリ３２および入出力部３３を接続する信号回路である。メモリ３２は、各種情報を記憶する。メモリ３２は、例えば、記憶媒体３０に予め記憶されているプログラムプロダクトであるプログラム３９を読み出して記憶する。記憶媒体３０は、例えば、ＵＳＢメモリやＣＤ－ＲＯＭである。プロセッサ３１は、メモリ３２に記憶される上記プログラム３９等に従って、メモリ３２等を利用しつつ様々な処理（例えば、数値計算）を実行する。入出力部３３は、オペレータからの入力を受け付けるキーボード３５およびマウス３６、並びに、プロセッサ３１からの出力等を表示するディスプレイ３７を備える。入出力部３３は、プロセッサ３１からの出力等を送信する送信部３８も備える。

【0029】

図４は、コンピュータ３によって上記プログラム３９が実行されることにより実現される機能を示すブロック図である。評価装置１は、コンピュータ３により実現される機能として、記憶部４０と、第１抽出部４１と、第２抽出部４２と、関連付け部４３と、評価値算出部４４と、評価部４５とを備える。記憶部４０は、主にメモリ３２により実現され、画像取得部２から送られる対象画像９等を格納する。第１抽出部４１、第２抽出部４２、関連付け部４３、評価値算出部４４および評価部４５は、主にプロセッサ３１により実現される。

【0030】

第１抽出部４１は、対象画像９から複数のシンボル９２を抽出する。第２抽出部４２は、対象画像９から複数のオルガノイド９１を抽出する。関連付け部４３は、第１抽出部４１により抽出された複数のシンボル９２をそれぞれ、第２抽出部４２により抽出された複数のオルガノイド９１のいずれか１つに関連付ける。換言すれば、関連付け部４３は、第１抽出部４１により抽出された各シンボル９２が、どのオルガノイド９１に含まれるシンボル９２であるかを決定する。評価値算出部４４は、各オルガノイド９１の成長度合いに関する評価を示す評価値を、各オルガノイド９１に関連付けられた１つまたは複数のシンボル９２に基づいて算出する。

【0031】

第１抽出部４１によるシンボル９２の抽出は、例えば、機械学習の一種であるディープラーニングにより生成されたシンボル抽出用の学習済みモデルを用いて行われる。シンボル抽出用の学習済みモデルは、例えば、評価装置１以外の装置により予め生成され、評価装置１の記憶部４０に予め記憶される。シンボル抽出用の学習済みモデルの生成は、様々な成長状態のシンボル９２を撮像して得られた多数の学習用データ（すなわち、学習用画像）を用いたディープラーニングにより、シンボル９２の形状等を初期モデルに学習させることにより行われる。当該学習用データは、例えば、シンボル９２を撮像して得られた画像を回転させたものや反転させたもの等を含む。なお、シンボル抽出用の学習済みモデルは、ディープラーニング以外の機械学習により生成されてもよい。

【0032】

評価装置１は、図４に示すように、コンピュータ３によりプログラム３９（図３参照）が実行されることにより実現される機能として、シンボル抽出用の学習済みモデルを生成する第１学習部４６をさらに備えていてもよい。第１学習部４６は、主にプロセッサ３１により実現される。第１学習部４６は、様々な状態のシンボル９２を撮像して得られた多数の学習用データを用いて、初期モデルに対してディープラーニング等の機械学習を行うことにより、シンボル抽出用の学習済みモデルを生成する。当該機械学習に用いられる学習用データは、例えば、画像取得部２を用いて予め取得され、コンピュータ３の記憶部４０に格納される。

【0033】

第１抽出部４１では、シンボル９２の抽出は、機械学習による学習済みモデルを用いる方法以外の様々な方法により行われてもよい。例えば、株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス製の「Cell3iMager専用ソフトウエア」等の公知の画像処理手段により、対象画像９におけるシンボル９２とシンボル９２以外の領域との濃度差に基づいて、対象画像９からシンボル９２の輪郭線（すなわち、シンボル９２の外形を規定する輪郭）が抽出されてもよい。

【0034】

第２抽出部４２によるオルガノイド９１の抽出は、例えば、機械学習の一種であるディープラーニングにより生成されたオルガノイド抽出用の学習済みモデルを用いて行われる。オルガノイド抽出用の学習済みモデルは、例えば、評価装置１以外の装置により予め生成され、評価装置１の記憶部４０に予め記憶される。オルガノイド抽出用の学習済みモデルの生成は、様々な状態のオルガノイド９１を撮像して得られた多数の学習用データ（すなわち、学習用画像）を用いたディープラーニングにより、オルガノイド９１の形状等を初期モデルに学習させることにより行われる。当該学習用データは、例えば、オルガノイド９１を撮像して得られた画像を回転させたものや反転させたもの等を含む。なお、オルガノイド抽出用の学習済みモデルは、ディープラーニング以外の機械学習により生成されてもよい。

【0035】

評価装置１は、図４に示すように、コンピュータ３によりプログラム３９（図３参照）が実行されることにより実現される機能として、オルガノイド抽出用の学習済みモデルを生成する第２学習部４７をさらに備えていてもよい。第２学習部４７は、主にプロセッサ３１により実現される。第２学習部４７は、様々な状態のオルガノイド９１を撮像して得られた多数の学習用データを用いて、初期モデルに対してディープラーニング等の機械学習を行うことにより、オルガノイド抽出用の学習済みモデルを生成する。当該機械学習に用いられる学習用データは、例えば、画像取得部２を用いて予め取得され、コンピュータ３の記憶部４０に格納される。

【0036】

第２抽出部４２では、オルガノイド９１の抽出は、機械学習による学習済みモデルを用いる方法以外の様々な方法により行われてもよい。例えば、上述の「Cell3iMager専用ソフトウエア」等の公知の画像処理手段により、対象画像９におけるオルガノイド９１とオルガノイド９１以外の領域との濃度差に基づいて、対象画像９からオルガノイド９１の輪郭線（すなわち、オルガノイド９１の外形を規定する輪郭）が抽出されてもよい。

【0037】

次に、評価装置１によるオルガノイド９１の評価の流れについて、図５および図６を参照しつつ説明する。オルガノイド９１の評価が行われる際には、まず、複数のオルガノイド９１を示す対象画像９が画像取得部２により取得され、記憶部４０に格納されることにより準備される（ステップＳ１１）。なお、ステップＳ１１では、評価装置１以外の装置により取得された対象画像９が、記憶部４０に格納されて準備されてもよい。

【0038】

続いて、対象画像９において、第１抽出部４１により複数のシンボル９２が抽出される（ステップＳ１２）。本実施の形態では、複数のシンボル９２の抽出は、ディープラーニングにより生成された上述のシンボル抽出用の学習済みモデルを用いて行われる。ステップＳ１２では、例えば、対象画像９に含まれる全てのシンボル９２がそれぞれ抽出され、対象画像９中のシンボル９２の数が求められる。また、ステップＳ１２では、対象画像９上に設定された所定位置（例えば、対象画像９の左下の角）を原点とする絶対座標系において、各シンボル９２の重心位置の座標、および、各シンボル９２の輪郭線上の各位置の座標が求められる。さらに、ステップＳ１２では、各シンボル９２の対象画像９上における面積も求められる。

【0039】

次に、対象画像９において、第２抽出部４２により複数のオルガノイド９１が抽出される（ステップＳ１３）。本実施の形態では、複数のオルガノイド９１の抽出は、ディープラーニングにより生成された上述のオルガノイド抽出用の学習済みモデルを用いて行われる。ステップＳ１３では、例えば、対象画像９に含まれる全てのオルガノイド９１がそれぞれ抽出され、対象画像９中のオルガノイド９１の数が求められる。また、ステップＳ１３では、上記絶対座標系における各オルガノイド９１の重心位置の座標、および、各オルガノイド９１の輪郭線上の各位置の座標が求められる。さらに、ステップＳ１３では、各オルガノイド９１の対象画像９上における面積、および、対象画像９上における換算直径も求められる。オルガノイド９１の換算直径とは、オルガノイド９１がステップＳ１３で求められた面積を有する円であると仮定した場合の当該オルガノイド９１の直径である。なお、ステップＳ１３は、ステップＳ１２と独立して行われる処理であり、ステップＳ１２よりも前に行われてもよく、ステップＳ１２と並行して行われてもよい。

【0040】

評価装置１では、ステップＳ１３において求められた各オルガノイド９１の重心位置、輪郭線の位置、面積および換算直径は、親オブジェクトである各オルガノイド９１に関連付けられて記憶部４０に記憶される。また、ステップＳ１２において求められた各シンボル９２の重心位置、輪郭線の位置および面積は、子オブジェクトである各シンボル９２に関連付けられて記憶部４０に記憶される。なお、ステップＳ１２では、各シンボル９２の上記以外のパラメータが取得されてもよい。ステップＳ１３においても同様に、各オルガノイド９１の上記以外のパラメータが取得されてもよい。

【0041】

ステップＳ１２およびステップＳ１３が終了すると、ステップＳ１２において抽出された複数のシンボル９２がそれぞれ、ステップＳ１３において抽出された複数のオルガノイド９１のうちいずれか１つに、関連付け部４３により関連付けられる（ステップＳ１４）。ステップＳ１４における関連付けは様々な方法により行われてよいが、本実施の形態では、図６に示すステップＳ１４１～Ｓ１４２により行われる。

【0042】

ステップＳ１４では、まず、対象画像９において、図７に示すように、複数のオルガノイド９１にそれぞれ対応する複数の部分領域９３が設定される（ステップＳ１４１）。具体的には、例えば、ステップＳ１３において抽出された封数のオルガノイド９１から一のオルガノイド９１が選択される。そして、選択されたオルガノイド９１の重心９４を中心として、当該オルガノイド９１の換算直径に基づいて決定された半径ｒを有する円形の１つの部分領域９３が設定される。半径ｒは、例えば、当該換算直径に所定の倍率を乗算して決定される。その後、上記複数のオルガノイド９１から一のオルガノイド９１を選択し、当該オルガノイド９１に対応する１つの部分領域９３を設定する処理が、対象画像９中の全てのオルガノイド９１に対して順次行われる。ステップＳ１４１では、各部分領域９３について、各部分領域９３の中心を原点とするローカル座標系（ｒ，θ座標系）が設定される。

【0043】

ステップＳ１４１が終了すると、対象画像９中の各シンボル９２について、各シンボル９２を含む１つの部分領域９３が特定され、各シンボル９２が当該１つの部分領域９３に対応する１つのオルガノイド９１に関連付けられる（ステップＳ１４２）。具体的には、例えば、ステップＳ１２において抽出された複数のシンボル９２から一のシンボル９２が選択される。続いて、選択されたシンボル９２の重心位置や輪郭線の位置等に基づいて、当該シンボル９２が含まれる１つの部分領域９３が特定される。例えば、選択されたシンボル９２の重心位置を内包する１つの部分領域９３が、当該シンボル９２を含む部分領域９３として特定される。また、例えば、選択されたシンボル９２の重心位置を内包する部分領域９３が複数存在する場合、当該複数の部分領域９３のうち、選択されたシンボル９２の重心位置と最も近接した位置に中心が存在する１つの部分領域９３が、当該シンボル９２を含む部分領域９３として特定される。なお、当該１つの部分領域９３の特定は、他の方法により行われてもよい。そして、選択されたシンボル９２は、当該１つの部分領域９３に対応する１つのオルガノイド９１に関連付けられる。その後、上記複数のシンボル９２から新たな一のシンボル９２を選択し、当該シンボル９２を１つのオルガノイド９１に関連付ける処理が、対象画像９中の全てのシンボル９２に対して順次行われる。

【0044】

ステップＳ１４２では、対象画像９におけるオルガノイド９１の形状が円形から大きく離れた形状である場合、いずれの部分領域９３にも含まれないシンボル９２が存在する可能性がある。例えば、対象画像９におけるオルガノイド９１が細長い略楕円形である場合、オルガノイド９１の長径の端部近傍に存在するシンボル９２は、当該オルガノイド９１に対応する上述の部分領域９３には含まれない可能性がある。この場合、ステップＳ１４１では、オルガノイド９１に対応する部分領域９３の半径を大きくしてもよい。例えば、部分領域９３の半径は、上述の方法により求められた値に所定のオフセット値を加えたものとされてもよい。あるいは、部分領域９３の半径は、オルガノイド９１が略楕円形である場合、オルガノイド９１の長径と同じ長さとされてもよい。対象画像９中の全てのシンボル９２がいずれかの部分領域９３に含まれるように部分領域９３を設定するという観点からは、ステップＳ１４１において、各部分領域９３は、対応するオルガノイド９１の全体を内部に含むように設定されることが好ましい。

【0045】

ステップＳ１４２では、選択されたシンボル９２が含まれる部分領域９３の特定は、上記以外の方法により行われてもよい。例えば、選択されたシンボル９２の輪郭線の位置に基づいて、当該輪郭線の全体を内包する１つの部分領域９３が、当該シンボル９２を含む部分領域９３として特定されてもよい。シンボル９２を含む部分領域９３が特定できない場合は、上記と同様に、複数の部分領域９３の直径がそれぞれ変更され、各部分領域９３が、対応するオルガノイド９１の全体を内部に含むように設定されてもよい。

【0046】

ステップＳ１４において、各シンボル９２（すなわち、子オブジェクト）がいずれか１つのオルガノイド９１（すなわち、親オブジェクト）に関連付けられると、各オルガノイド９１に関連付けられた１つまたは複数のシンボル９２に基づいて、各オルガノイド９１の評価値が評価値算出部４４により算出される（ステップＳ１５）。

【0047】

ステップＳ１５では、まず、対象画像９中の複数のオルガノイド９１のうち一のオルガノイド９１が選択される。続いて、ステップＳ１４において当該オルガノイド９１に関連付けられた１つまたは複数のシンボル９２について、上述の絶対座標系から当該オルガノイド９１に対応する上述のローカル座標系への座標変換が行われる。そして、当該ローカル座標系における各シンボル９２の位置等に基づいて、オルガノイド９１の成長度合いに関する評価を示す評価値が算出される。当該評価値の算出は、例えば、オルガノイド９１に含まれるシンボル９２の数、オルガノイド９１に含まれる各シンボル９２の大きさ、オルガノイド９１におけるシンボル９２による表面被覆率（すなわち、対象画像９中におけるオルガノイド９１の占有面積のうちシンボル９２に被覆されている領域の割合）、および／または、ローカル座標系の周方向において隣接するシンボル９２の内積（ｃｏｓ）等に基づいて行われる。当該評価値の算出には、上記以外の様々なパラメータが用いられてよい。

【0048】

その後、上記複数のオルガノイド９１から新たな一のオルガノイド９１を選択し、当該オルガノイド９１の評価値を算出する処理が、対象画像９中の全てのオルガノイド９１に対して順次行われる。なお、ステップＳ１５では、シンボル９２が関連付けられていないオルガノイド９１（すなわち、関連付けられるシンボル９２の数が０であるオルガノイド９１）については、成長度合いが最も低い（すなわち、シンボル９２が確認できる程度まで成長していない）ことを示す評価値が付与される。

【0049】

ステップＳ１５が終了すると、各オルガノイド９１の成長度合いの評価が、ステップＳ１５において求められた各オルガノイド９１の評価値に基づいて評価部４５により行われる（ステップＳ１６）。ステップＳ１６では、例えば、各オルガノイド９１の上記評価値が、記憶部４０に予め記憶されている所定の閾値と比較され、当該比較結果に基づいて各オルガノイド９１の成長度合いが評価される。これにより、対象画像９中の全てのオルガノイド９１について、各オルガノイド９１の成長度合いの評価（すなわち、全数検査）が非侵襲にて行われる。なお、ステップＳ１６は、ステップＳ１５と並行して行われ、複数のオルガノイド９１のそれぞれについて、上述の評価値算出および評価が順次行われてもよい。

【0050】

以上に説明したように、多細胞構造体（上記例では、オルガノイド９１）を評価する多細胞構造体評価方法は、非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像９を準備する工程（ステップＳ１１）と、対象画像９において当該複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボル９２を抽出する工程（ステップＳ１２）と、対象画像９において当該複数の多細胞構造体を抽出する工程（ステップＳ１３）と、複数のシンボル９２をそれぞれ当該複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程（ステップＳ１４）と、各多細胞構造体の評価を示す評価値を各多細胞構造体に関連付けられたシンボル９２に基づいて算出する工程（ステップＳ１５）と、を備える。

【0051】

当該多細胞構造体評価方法によれば、１つの対象画像９に含まれる複数の多細胞構造体の成長度合いを、非侵襲にて個別に評価することができる。その結果、各多細胞構造体の成長度合いを、抜き取り検査に比べて精度良く評価することができる。また、多細胞構造体の侵襲を避けることにより、抜き取り検査に比べて多細胞構造体の最終収量の減少を抑制しつつ、所望の頻度にて多細胞構造体の成長度合いの評価を行うことができる。

【0052】

上述のように、各多細胞構造体はオルガノイド９１であることが好ましい。これにより、１つの対象画像９に含まれる複数のオルガノイド９１の成長度合いを、非侵襲にて個別に評価することができる。その結果、各オルガノイド９１の成長度合いを精度良く評価することができるとともに、オルガノイド９１の成長度合いの評価を、最終収量の減少を抑制しつつ所望の頻度にて行うことができる。

【0053】

上述のように、ステップＳ１２における複数のシンボル９２の抽出、および、ステップＳ１３における複数の多細胞構造体の抽出はそれぞれ、機械学習により生成された学習済みモデルを用いて行われることが好ましい。これにより、シンボル９２および多細胞構造体の抽出作業を精度良く行うことができる。シンボル９２および多細胞構造体の抽出作業の更なる精度向上という観点からは、上記学習済みモデルはディープラーニングにより生成されることが好ましい。

【0054】

上述のように、ステップＳ１４は、対象画像９において複数の多細胞構造体にそれぞれ対応する複数の部分領域９３を設定する工程（ステップＳ１４１）と、複数のシンボル９２の各シンボル９２について、各シンボル９２を含む１つの部分領域９３を特定し、各シンボル９２を当該１つの部分領域９３に対応する多細胞構造体に関連付ける工程（ステップＳ１４２）と、を備えることが好ましい。これにより、対象画像９中における多細胞構造体とシンボル９２との関連付けを容易に行うことができる。

【0055】

上述のように、ステップＳ１４１において、複数の部分領域９３はそれぞれ、対応する多細胞構造体の全体を内部に含むように設定されることが好ましい。これにより、対象画像９中における多細胞構造体とシンボル９２との関連付けを精度良く行うことができる。

【0056】

上述のように、対象画像９は、倒立顕微鏡により取得されたモノクロの明視野画像であることが好ましい。これにより、実体顕微鏡では観察することが難しい比較的小さい多細胞構造体から、ある程度大きく成長した多細胞構造体まで、好適に観察して評価することができる。また、当該倒立顕微鏡による対象画像９の取得の際には、複数の多細胞構造体に拡散光が照射されることが好ましい。これにより、倒立顕微鏡による対象画像９の取得を好適に行うことができる。

【0057】

上述のように、コンピュータ３によってプログラム３９が実行されることにより、非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像９を準備する工程（ステップＳ１１）と、対象画像９において当該複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボル９２を抽出する工程（ステップＳ１２）と、対象画像９において当該複数の多細胞構造体を抽出する工程（ステップＳ１３）と、複数のシンボル９２をそれぞれ当該複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける工程（ステップＳ１４）と、各多細胞構造体の評価を示す評価値を各多細胞構造体に関連付けられたシンボル９２に基づいて算出する工程（ステップＳ１５）と、が行われる。これにより、上記と同様に、１つの対象画像９に含まれる複数の多細胞構造体の成長度合いを、非侵襲にて個別に評価することができる。

【0058】

上述の評価装置１は、第１抽出部４１と、第２抽出部４２と、関連付け部４３と、評価値算出部４４とを備える。第１抽出部４１は、非侵襲で撮像された複数の多細胞構造体を示す対象画像９において、当該複数の多細胞構造体の成長度合いを示す複数のシンボル９２を抽出する。第２抽出部４２は、対象画像９において複数の多細胞構造体を抽出する。関連付け部４３は、複数のシンボル９２をそれぞれ当該複数の多細胞構造体のいずれか１つに関連付ける。評価値算出部４４は、各多細胞構造体の評価を示す評価値を各多細胞構造体に関連付けられたシンボル９２に基づいて算出する。これにより、上記と同様に、１つの対象画像９に含まれる複数の多細胞構造体の成長度合いを、非侵襲にて個別に評価することができる。

【0059】

上述の多細胞構造体評価方法、プログラム３９および評価装置１では、様々な変更が可能である。

【0060】

例えば、対象画像９の取得の際に複数の多細胞構造体に照射される光は、拡散光以外の光であってもよい。また、対象画像９を取得する画像取得部２は、必ずしも倒立顕微鏡である必要はなく、他の構造を有する顕微鏡、または、顕微鏡以外の構成であってもよい。対象画像９は、カラー画像であってもよく、明視野画像以外の画像であってもよい。

【0061】

ステップＳ１４１において設定される各部分領域９３は、必ずしも、対応する多細胞構造体の全体を内部に含むように設定される必要はなく、例えば、対応する多細胞構造体を部分的に内部に含むように設定されてもよい。また、部分領域９３の形状は円形には限定されず、様々に変更されてよい。

【0062】

また、ステップＳ１４におけるシンボル９２と多細胞構造体との関連付けは、上述のステップＳ１４１～Ｓ１４２以外の様々な方法により行われてよい。例えば、部分領域９３の設定は、ステップＳ１４から省略されてもよい。

【0063】

上述の多細胞構造体評価方法により評価される多細胞構造体は、オルガノイドには限定されず、他の多細胞構造体であってもよい。当該他の多細胞構造体としては、例えば、スフェロイド（すなわち、多数の細胞が単に３次元的に集合した単純なクラスタ）や、多数の細胞が単に２次元的に集合したもの等が挙げられる。

【0064】

上記実施の形態および各変形例における構成は、相互に矛盾しない限り適宜組み合わされてよい。

【符号の説明】

【0065】

１ 評価装置
２ 画像取得部
３ コンピュータ
９ 対象画像
３９ プログラム
４１ 第１抽出部
４２ 第２抽出部
４３ 関連付け部
４４ 評価値算出部
９１ オルガノイド
９２ シンボル
９３ 部分領域
Ｓ１１～Ｓ１６，Ｓ１４１～Ｓ１４２ ステップ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】