特開 2024-142249 ヘテロ二糖の製造に有用な酵素およびそれを用いたヘテロ二糖の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024142249

(43)【公開日】2024-10-10

(54)【発明の名称】ヘテロ二糖の製造に有用な酵素およびそれを用いたヘテロ二糖の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/42 20060101AFI20241003BHJP

   C12P 19/12 20060101ALI20241003BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C12N9/42 ZNA

C12P19/12

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023054359

(22)【出願日】2023-03-29

(71)【出願人】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(71)【出願人】

【識別番号】000231453

【氏名又は名称】日本食品化工株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110003421

【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】磯野 直人

(72)【発明者】

【氏名】神田 侑依

(72)【発明者】

【氏名】小川 恵莉

(72)【発明者】

【氏名】柳原 和典

(72)【発明者】

【氏名】石川 涼一

(72)【発明者】

【氏名】高木 宏基

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AF03

4B064AG01

4B064CA19

4B064CA21

4B064CB30

4B064CC24

4B064CD09

4B064DA20

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヘテロ二糖の製造に有用な新規酵素剤およびヘテロ二糖の新規な製造方法の提供。
【解決手段】本発明によれば特定のアミノ酸配列またはその配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含んでなる酵素剤と、該酵素剤の存在下で、キシロースと、キシロース以外の単糖とを縮合反応させ、キシロースと前記単糖（好ましくはヘキソース）とからなるヘテロ二糖を得ることを含む、ヘテロ二糖の製造方法が提供される。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質を含んでなる、酵素剤：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質。

【請求項2】

下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の特性を有するタンパク質を含んでなる酵素剤：
（Ａ）作用：プリメベロースに作用し、これを加水分解する
（Ｂ）分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が５５±５ｋＤａである
（Ｃ）至適ｐＨ：５．４～６．８の範囲である
（Ｄ）至適温度：２０～４５℃の範囲である
（Ｅ）基質特異性：ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシドを加水分解する
（Ｆ）基質特異性：ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルコピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－マンノピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－ガラクトピラノシド、ｐ－ニトロ－Ｎ－アセチル－β－ｄ－グルコサミニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルクロニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－フコピラノシドおよびｐ－ニトロフェニルα－ｌ－アラビノピラノシドを分解しない
（Ｇ）基質特異性：キシロビオース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、スクロースおよびラクトースを分解しない。

【請求項3】

前記タンパク質が、エバンセラ属（Evansella）に属する微生物に由来する、請求項２に記載の酵素剤。

【請求項4】

キシロースとキシロース以外の単糖とからなるヘテロ二糖の製造に用いるための、請求項１または２に記載の酵素剤。

【請求項5】

前記単糖が、グルコース、マンノースおよびフラクトースからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項４に記載の酵素剤。

【請求項6】

請求項１または２に記載の酵素剤の存在下で、キシロースと、キシロース以外の単糖とを縮合反応させ、キシロースと前記単糖とからなるヘテロ二糖を得ることを含む、ヘテロ二糖の製造方法。

【請求項7】

前記単糖が、グルコース、マンノースおよびフラクトースからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主を培養する工程を含んでなる、請求項１に記載の酵素剤の製造方法：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、および
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヘテロ二糖の製造に有用な新規酵素および該酵素を利用したヘテロ二糖の製造方法に関する。本発明はまた、ヘテロ二糖の製造に有用な新規酵素の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プリメベロース（primeverose）はキシロースとグルコースがβ－１，６結合したヘテロ二糖であり、医薬品や化粧品の保湿成分として利用可能であることが知られている（特許文献１、２）。プリメベロースは原料基質としてキシロビオースとグルコースを用いてペクチナーゼ存在下の酵素反応で製造できることが知られており（特許文献１、２）、また、原料基質としてキシロビオースとグルコースを用いてβ－キシロシダーゼの糖転移反応により製造できることも知られている（非特許文献１）。

【0003】

しかし、キシロビオースは高価であるため、これを原料として用いてプリメベロースを製造することは製造コストの観点から現実的ではない。また、キシロビオースに代えてキシロオリゴ糖を使用することもできるが、未反応のキシロオリゴ糖が反応系に残存するため、反応後にキシロオリゴ糖とプリメベロースとを分離する必要があり、製造手順が煩雑となる。このように、プリメベロースを安価にかつ効率的に製造できる方法はこれまで知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平１０－３１０５２７号公報

【特許文献2】特開平１１－４９６５６号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】J.Appl. Glycosci., Vol.46, No.4, p.431-437(1999)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ヘテロ二糖の製造に有用な新規酵素剤およびヘテロ二糖の新規な製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ヘテロ二糖の製造に有用な新規酵素の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質を含んでなる、酵素剤：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質。
［２］下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の特性を有するタンパク質を含んでなる酵素剤：
（Ａ）作用：プリメベロースに作用し、これを加水分解する
（Ｂ）分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が５５±５ｋＤａである
（Ｃ）至適ｐＨ：５．４～６．８の範囲である
（Ｄ）至適温度：２０～４５℃の範囲である
（Ｅ）基質特異性：ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシドを加水分解する
（Ｆ）基質特異性：ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルコピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－マンノピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－ガラクトピラノシド、ｐ－ニトロ－Ｎ－アセチル－β－ｄ－グルコサミニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルクロニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－フコピラノシドおよびｐ－ニトロフェニルα－ｌ－アラビノピラノシドを分解しない
（Ｇ）基質特異性：キシロビオース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、スクロースおよびラクトースを分解しない。
［３］前記タンパク質が、エバンセラ属（Evansella）に属する微生物に由来する、上記［２］に記載の酵素剤。
［４］キシロースとキシロース以外の単糖とからなるヘテロ二糖の製造に用いるための、上記［１］～［３］のいずれかに記載の酵素剤。
［５］前記単糖が、グルコース、マンノースおよびフラクトースからなる群から選択される１種または２種以上である、上記［４］に記載の酵素剤。
［６］上記［１］～［５］のいずれかに記載の酵素剤の存在下で、キシロースと、キシロース以外の単糖とを縮合反応させ、キシロースと前記単糖とからなるヘテロ二糖を得ることを含む、ヘテロ二糖の製造方法。
［７］前記単糖が、グルコース、マンノースおよびフラクトースからなる群から選択される１種または２種以上である、上記［６］に記載の製造方法。
［８］下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主を培養する工程を含んでなる、上記［１］に記載の酵素剤の製造方法：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、および
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プリメベラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。

【0008】

本発明によれば、キシロースおよびキシロース以外の単糖を原料基質としてヘテロ二糖を酵素法により製造できる。原料単糖と生成物のヘテロ二糖の分離は容易であるため、本発明はプリメベロースを含むヘテロ二糖の工業生産の途を拓く点で有利な発明である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】（Ａ）はＥｃＧＨ３０＿１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。（Ｂ）はＥｃＧＨ３０＿１をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。

【図2】図２は、精製したＥｃＧＨ３０＿１の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した結果を示す電気泳動写真である。

【図3】図３は、ＥｃＧＨ３０＿１のｐＮＰＸ分解反応における温度と活性の関係を示した図である。３５℃で反応させたときの活性を１００％として示した。

【図4】図４は、ＥｃＧＨ３０＿１のｐＮＰＸ分解反応における反応溶液のｐＨと活性の関係を示した図である。各ｐＨにおける活性は、反応溶液のｐＨが６．４（ＭＥＳ緩衝液を使用）のときの活性を１００％として示した。

【図5】図５は、ＥｃＧＨ３０＿１の（Ａ）プリメベロースおよび（Ｂ）キシロビオースに対する二糖加水分解能を評価したＴＬＣ分析結果を示した図である。「－」はＥｃＧＨ３０＿１を含まない反応を、「＋」はＥｃＧＨ３０＿１を含む反応をそれぞれ示す。

【図6】図６は、キシロースおよびグルコースを基質としたＥｃＧＨ３０＿１による縮合反応生成物をＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。矢印のピークは縮合反応によって生成した二糖（プリメベロース）を示す。

【図7】図７は、活性炭・セライトカラムクロマトグラフィーにより縮合反応生成物から二糖を精製および分析した結果を示す図である。

【図8】図８は、精製した二糖（プリメベロース）のＮＭＲスペクトルを示した図である。（Ａ）は^１Ｈスペクトルを、（Ｂ）は^１３Ｃスペクトルをそれぞれ示す。

【図9】図９は、キシロースとグルコースの縮合反応によるプリメベロースの合成反応式を示す図である。

【図10】図１０は、ＥｃＧＨ３０＿１による縮合反応に対する反応時間の影響を示した図である。縦軸は二糖（プリメベロース）の生成量である。

【図11】図１１は、ＥｃＧＨ３０＿１による縮合反応に対する反応温度の影響を示した図である。縦軸は二糖（プリメベロース）の生成量である。

【図12】図１２は、キシロースおよび種々の単糖を基質とした縮合反応生成物をＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。（Ａ）はキシロースとグルコースを基質とした反応生成物を、（Ｂ）はキシロースとマンノースを基質とした反応生成物を、（Ｃ）はキシロースとガラクトースを基質とした反応生成物を、（Ｄ）はキシロースとフルクトースを基質とした反応生成物を、それぞれ示す。矢印のピークは縮合反応によって生成した二糖を示す。

【発明の具体的説明】

【0010】

＜＜酵素剤＞＞
本発明の酵素剤はプリメベラーゼ活性を有するものである。本発明において「プリメベラーゼ」とは、βキシロシダーゼ活性を有する酵素であって、プリメベロース（β－１，６結合）に作用するが、キシロビオース（β－１，４結合）には作用しない酵素を意味し、「プリメベラーゼ活性を有する」とはこのような酵素活性を有することを意味する。すなわち、本発明の酵素剤はプリメベロースに選択的な酵素活性を有する酵素剤であることから、プリメベロースの選択的合成および選択的分解に有用な酵素剤である。なお、「βキシロシダーゼ」はβ－キシロシドを加水分解してキシロースを生じる酵素を意味する。

【0011】

本発明の酵素剤は、前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」ということがある）を含んでなるものである。

【0012】

本発明の酵素剤が前記（ａ）のタンパク質を含む場合、本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるものであっても、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0013】

前記（ｂ）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性の算出にあたっては、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの公に利用可能な相同性検索ソフトウェアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公に利用可能な相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。

【0014】

前記（ｂ）における同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％である。

【0015】

前記（ｃ）のタンパク質は、配列番号１のいずれかのアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入および付加からなる群から選択される１個または複数個の改変を有していてもよい。改変されるアミノ酸の個数は、例えば、１～１００個、１～９７個または１～７３個、好ましくは１～５０個または１～４８個、より好ましくは１～２４個または１～２０個、より一層好ましくは１～１５個または１～１０個、特に好ましくは１～数個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個または１個である。改変されるアミノ酸の個数はまた、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の変異数、あるいは、天然に生じる程度の変異数とすることができる。このため「改変」は変異を含む意味で用いられるものとする。前記アミノ酸配列において、前記改変は、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。前記改変はまた、複数の同種の改変（例えば、複数の置換）であってもよいし、複数の異種の改変（例えば、１個以上の欠失と１個以上の置換の組合せ）であってもよい。

【0016】

また、前記（ｃ）におけるアミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、アミノ酸の付加は、例えば、アミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端のいずれかへの付加であっても、Ｎ末端およびＣ末端の両末端への付加であってもよい。

【0017】

前記アミノ酸の改変は保存的改変（例えば、保存的変異）であってもよい。「保存的改変」または「保存的変異」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を改変し、または変異させることを意味する。前記アミノ酸の置換はまた、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

【0018】

前記（ｂ）および（ｃ）において、「プリメベラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かは、被験タンパク質の加水分解活性を指標に評価することができ、例えば、被験タンパク質をプリメベロースまたはキシロビオースに作用させ、反応液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析に供することにより評価することができる（実施例３参照）。

【0019】

本発明のタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列に基づいて定められた前記（ｂ）または前記（ｃ）のタンパク質である場合、該タンパク質はプリメベロースの加水分解活性について、温度２０～５０℃、ｐＨ５～９（好ましくは３５℃、ｐＨ６．５）の条件下で配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の約７０％以上の活性、約８０％以上の活性、約９０％以上の活性、約９５％以上の活性または約１００％以上の活性を有するものとすることができ、さらに、キシロビオースの加水分解活性について、上記と同様の条件下で分解活性が認められないものとすることができる。

【0020】

本発明の酵素剤はまた、前記特性（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）を有するタンパク質（以下、「本発明の酵素タンパク質」ということがある）を含んでなるものである。前記の本発明のタンパク質は、特性（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）のいずれかまたはすべてを有するものとすることができ、以下の本発明の酵素タンパク質の記載に従ってその内容を特定することができる。なお、本明細書においては、本発明のタンパク質および本発明の酵素タンパク質をあわせて、「本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質」ということがある。

【0021】

特性（Ａ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、プリメベロースに作用し、これを加水分解する加水分解酵素である。この加水分解酵素反応の逆反応により、キシロースとキシロース以外の単糖とを基質とし、プリメベロースを含むヘテロ二糖を生成する。後述するように、この加水分解反応の逆反応により、本発明の酵素剤を用いてヘテロ二糖を製造することができる。なお、キシロース以外の単糖としてはヘキソース（六炭糖）が挙げられ、例えば、ガラクトース以外のヘキソースであり、ヘキソースの非制限的な例としてはグルコース、マンノースおよびフラクトースが挙げられる。

【0022】

特性（Ｂ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定で５５±５ｋＤａの分子量を有する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量測定は、例えば、ポリアクリルアミドゲルのゲル濃度１０％、定電圧２００Ｖ、タンパク質量１μｇの条件で実施することができる。

【0023】

特性（Ｃ）に関し、本発明の酵素タンパク質の至適ｐＨは、５．４～６．８の範囲であり、好ましくはｐＨ５．８～６．４の範囲である。本発明の酵素タンパク質の至適ｐＨは、各種ｐＨ、３５℃、１０分間の条件で本発明の酵素タンパク質およびその基質を反応させた際に最大活性を示す本発明の酵素タンパク質の活性（例えば、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシドの加水分解活性）を１００％とした場合に、２０％以上の相対活性を示すｐＨとすることができ、好ましくは８０％以上の相対活性を示すｐＨとすることができる。

【0024】

特性（Ｄ）に関し、本発明の酵素タンパク質の至適温度は、２０～４５℃の範囲であり、好ましくは３０～３５℃の範囲である。本発明の酵素タンパク質の至適温度は、各種温度、ｐＨ６．４、１０分間の条件で本発明の酵素タンパク質およびその基質を反応させた際に最大活性を示す本発明の酵素タンパク質の活性（例えば、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシドの加水分解活性）を１００％とした場合に、２０％以上の相対活性を示す温度とすることができ、好ましくは８０％以上の相対活性を示す温度とすることができる。

【0025】

本発明のタンパク質および本発明の酵素タンパク質は、以下の（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）からなる群から選択される少なくとも一つの特性を有するものを用いることができ、好ましくは（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）すべての特性を有するものを用いることができる。

【0026】

特性（Ｅ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、基質特異性として、「ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシドを加水分解する」という性質を有する。この性質はβキシロシダーゼ活性に対応する。

【0027】

特性（Ｆ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、基質特異性として、「ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルコピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－マンノピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－ガラクトピラノシド、ｐ－ニトロ－Ｎ－アセチル－β－ｄ－グルコサミニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルクロニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－フコピラノシドおよびｐ－ニトロフェニルα－ｌ－アラビノピラノシドを分解しない」という性質を有する。

【0028】

特性（Ｇ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、基質特異性として、「キシロビオース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、スクロースおよびラクトースを分解しない」という性質を有する。

【0029】

本発明の酵素タンパク質は、エバンセラ属（Evansella）に属する微生物由来のものを用いることができ、好ましくはEvansella cellulosilyticaに属する微生物由来のものを用いることができる。本発明の酵素タンパク質はまた、後述するように天然微生物あるいは組換え微生物から発現させたものを使用することができる。

【0030】

本発明の酵素剤は、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質そのものでもよく、あるいは本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質に加えて他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、賦形剤、安定化剤、塩類などが挙げられる。また、その形態も特に制限はなく、液状でもよく、粉末状でもよく、担体に担持させた形態であってもよい。

【0031】

＜＜ヘテロ二糖の製造方法＞＞
本発明によれば、本発明の酵素剤の存在下で、キシロースと、キシロース以外の単糖とを縮合反応させ、キシロースと前記単糖からなるヘテロ二糖を得ることを含む、ヘテロ二糖の製造方法が提供される。

【0032】

本発明の製造方法では、キシロースとキシロース以外の単糖とからヘテロ二糖を選択的に合成できる本発明の酵素剤を使用するため、原料基質と縮合生成物との分離が容易である点で有利である。

【0033】

本発明の製造方法において原料となる糖質は、キシロースとキシロース以外の単糖である。キシロース以外の単糖としては、グルコース、マンノースおよびフラクトースが挙げられ、これらのうち１種を基質として用いても、これらを組み合わせて基質として用いてもよい。

【0034】

原料としてキシロースとグルコースを用いた場合、得られるヘテロ二糖は、キシロースとグルコースがβ－１，６結合したプリメベロースである。

【0035】

本発明の製造方法において、原料となるキシロースおよびキシロース以外の単糖は水溶液（シラップ）を用いることができ、その反応効率を考慮すると固形分濃度５０質量％以上の濃度の水溶液とすることが好ましく、より好ましくは固形分濃度６６質量％以上の水溶液である。原料のキシロースおよびキシロース以外の単糖は純品でもよいが、コストや入手し易さを考慮すると他の糖質が混合した糖組成物でもよく、グルコースについては、例えば、液状ブドウ糖（＃９８６５、日本食品化工）等を原料として用いることができる。

【0036】

本発明の製造方法において、酵素を基質に作用させる条件は特に制限はなく、酵素の特性に合わせて適宜調整すればよいが、例えば、ｐＨ５～８、温度３０～６０℃の条件で、２４～２４０時間反応させることができる。

【0037】

本発明の製造方法においては、所望のヘテロ二糖が得られた後、必要に応じて酵素の失活処理、濾過・脱色・脱臭・脱塩などの精製処理および／または濃縮処理を行うことができる。これらの処理は常法に従って実施することができる。また、得られたヘテロ二糖は、適宜濃縮して液状品としてもよく、噴霧乾燥などにより粉末品としてもよい。さらに、膜分画、樹脂分画などの分画処理や、微生物による資化処理などによって残存した原料や副産物を除去したり、特定重合度のものを分取したりすることにより、ヘテロ二糖の含量をより高めることができる。

【0038】

＜＜本発明の酵素剤の製造方法＞＞
本発明の酵素剤は、本発明のタンパク質の産生能を有する天然微生物あるいは後述の組換え微生物を培養することにより製造することができる。

【0039】

すなわち、本発明の別の側面によれば、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」ということがある）または該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物を培養する工程を含んでなる、本発明の酵素剤の製造方法が提供される。本発明の製造方法は、培養工程の後、培養して得られた宿主微生物および／または培養物から発現産物を採取し、場合によっては酵素剤を単離または精製する工程をさらに含んでいてもよい。

【0040】

本発明において「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、さらには、これらの修飾体や人工核酸が含まれるが、好ましくはＤＮＡである。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。

【0041】

前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、特定のアミノ酸配列が与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を、対応するコドンに置き換えることによって塩基配列を特定することができ、具体例としては、配列番号２の塩基配列が挙げられる。

【0042】

前記（ｉｉ）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで、「同一性」は、前記（ｂ）について述べたのと同様に、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性の算出にあたっては、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983））。アライメントや同一性の算出は、前記（ｂ）についての記載内容に従って実施することができる。

【0043】

前記（ｉｉ）における同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上である。

【0044】

前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、欠失、置換、挿入および付加からなる群から選択される１個または複数個の改変を有していてもよい。改変される塩基の個数は、例えば、１～１００個、１～９７個または１～７３個、好ましくは１～５０個または１～４８個、より好ましくは１～２４個または１～２０個、より一層好ましくは１～１５個または１～１０個、特に好ましくは１～数個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個または１個である。改変される塩基の個数はまた、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の変異数、あるいは、天然に生じる程度の変異数とすることができる。このため「改変」は変異を含む意味で用いられるものとする。前記欠失、挿入および／または付加された塩基配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。前記欠失、挿入および／または付加される塩基は、例えば、連続する３つの塩基からなるコドンが好ましく、このようなコドンの数は、例えば、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～６個、特に好ましくは１～数個、１～３個、１～２個または１個である。前記塩基配列において、前記改変は、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。前記改変はまた、複数の同種の改変（例えば、複数の置換）であってもよいし、複数の異種の改変（例えば、１個以上の欠失と１個以上の置換の組合せ）であってもよい。

【0045】

また、前記（ｉｉｉ）における塩基の挿入としては、例えば、塩基配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、塩基の付加は、例えば、塩基配列の５’末端および３’末端のいずれかへの付加であっても、５’末端および３’末端の両末端への付加であってもよい。

【0046】

前記（ｉｖ）において、「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。「ハイブリダイズ」は、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイなどの公知の方法が挙げられる。

【0047】

前記（ｉｖ）において、「ハイブリダイズ」あるいは「ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で実施することができ、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄緩衝液で洗浄することにより実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチド間で特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、ある塩基配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定することができる。例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号２の塩基配列）を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照）。ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液（例えば、ＳＳＣ溶液）中で、塩基配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０～１０℃低い温度、Ｔｍよりも０～５℃低い温度あるいはＴｍよりも０～２℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を非特異的なハイブリッド形成をした二本鎖ポリヌクレオチドに対して厳しい条件（例えば、高温低塩濃度溶液）で実施することが挙げられる。

【0048】

前記（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、「プリメベラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かは、被験タンパク質の加水分解活性を指標に評価することができ、例えば、被験タンパク質をプリメベロースまたはキシロビオースに作用させ、反応液をＴＬＣ分析に供することにより評価することができる（実施例３参照）。

【0049】

本発明のポリヌクレオチドが配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて定められた前記（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の塩基配列からなる場合、該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はプリメベロースの加水分解活性について、温度２０～５０℃、ｐＨ５～９（好ましくは３５℃、ｐＨ６．５）の条件下で配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の約７０％以上の活性、約８０％以上の活性、約９０％以上の活性、約９５％以上の活性または約１００％以上の活性を有するものとすることができ、さらに、キシロビオースの加水分解活性について、上記と同様の条件下で分解活性が認められないものとすることができる。

【0050】

本発明の酵素剤を、本発明のタンパク質の産生能を有する組換え微生物を用いて製造する場合、該組換え微生物としては、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物が挙げられる。前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌や枯草菌などの宿主微生物への導入に適したベクターを選択することができ、ｐＥＴ－２３ａ、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ３２ａ、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＪＥＸＯＰＴ２（特開２００９－１７８４１号公報参照）、ｐＨＴ０１、ｐＨＴ４３などのプラスミドベクターが挙げられる。これらのうち、本発明のタンパク質を大腸菌で発現させる場合には、ｐＥＴ－２３ａ、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ３２ａ、ｐＣｏｌｄＩおよびｐＧＥＸ－４Ｔが好ましく、枯草菌で発現させる場合には、ｐＪＥＸＯＰＴ２、ｐＨＴ０１およびｐＨＴ４３が好ましい。また、発現ベクターへのポリヌクレオチドの連結は、常法に従って実施することができる。

【0051】

このようにして得られた発現ベクターは、大腸菌、枯草菌をはじめとする宿主微生物に導入し、組換え微生物（すなわち、形質転換体）を得ることができる。宿主微生物への導入は、常法に従って実施することができる。また、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などによりベクターを使用せずに宿主微生物に導入し、組換え微生物を得ることもできる。

【0052】

本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を生成する組換え微生物および天然微生物は、当該微生物の培養に適した培地において培養することができる。使用する培地は、微生物が生育でき、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を産生しうる栄養培地であれば特に限定されず、合成培地および天然培地のいずれでもよい。また、時間、温度などの培養条件は、培養する微生物に適した条件を適宜選択することができる。

【0053】

本発明の酵素剤の製造方法では、組換え微生物または天然微生物を培養した後、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を採取する工程を含んでいてもよい。本発明の酵素剤の製造方法では、例えば、天然微生物あるいは組換え微生物を培養した後、溶菌剤、界面活性剤、超音波破砕またはビーズショッカーなどを用いて菌体細胞を破砕し、そのままもしくは不溶性画分を分離したものを粗酵素液とすることができる。本発明においては、粗酵素液をそのまま用いても、濃縮してから用いてもよい。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、平膜、中空膜法などを採用することができる。

【0054】

本発明の酵素剤は、上記のように、粗酵素液をそのまままたは濃縮して用いることができるものの、必要に応じてカラムクロマトグラフィーなどにより分離・精製したものを利用することができる。例えば、培養液の上清または破砕処理物についてアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素として得ることができる。

【0055】

本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質が組換えタンパク質である場合には、組換え微生物の種類によっては酵素が菌体内に蓄積したり、培養液に蓄積したりすることがある。このような場合にも、前記のように、菌体またはその培養物をそのまま使用してもよいが、必要に応じて、細胞を破砕したものを用いてもよい。

【実施例0056】

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【0057】

実施例１：発現用プラスミドの作製
種々の微生物について新規酵素探索を行った。具体的には既知酵素であるハロバチルス・ハロフィラス（Halobacillus halophilus）由来β－１，６－グルコシダーゼのアミノ酸配列を起点に相同性検索を行い、当該酵素との類似性をもつ仮想タンパク質配列を取得した。次に、当該仮想タンパク質間のアミノ酸配列のアラインメントから、活性部位を構成すると推定されるアミノ酸残基が、起点酵素（Halobacillus halophilus由来）と異なる新規配列の選抜を行った。本発明者らは、これら新規配列に対応するタンパク質を遺伝子組換え微生物で生産させ、機能解析を行ったところ、その一つがグルコシド結合を切断しないが、キシロシド結合を切断する酵素活性を有する酵素であることを見出した。本発明者らはそのアミノ酸配列を実施例２以降において遺伝子組換え微生物で生産させ、さらに機能解析を行った。本発明者らが特定したアミノ酸配列は、Evansella cellulosilytica由来のアミノ酸配列（以下、ＥｃＧＨ３０＿１、データベース：GenBank、アクセッション番号：ＡＤＵ２９１０１．１）であり、このアミノ酸配列（配列番号１）およびそれをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）をそれぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。

【0058】

以後の実施例では、配列番号１のアミノ酸配列のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Evansella cellulosilyticaＤＳＭ ２５２２株のゲノムＤＮＡを用いた。Evansella cellulosilyticaＤＳＭ ２５２２株のゲノムＤＮＡはＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）から購入した。E. cellulosilyticaのゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（BcGH30_1-007-1S；5’-AAGGAGATATACATATGAAAGCAAAACAAATCACTACCTATTCCG-3’、配列番号３）およびリバースプライマー（BcGH30_1-007-2A；5’-GTGCGGCCGCAAGCTTTGACATTACTACTGTACTGATGGTTT-3’、配列番号４）並びにPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行い、遺伝子ＥｃＧＨ３０＿１の増幅断片（１．５ｋｂｐ）を得た。なお、本発明者らはEvansella cellulosilyticaがBacillus cellulosilyticaから名称変更されたことを確認している（Gupta, R. S. et al., International journal of systematic and evolutionary microbiology, (2020) 70(11), pp5753-5798.）。

【0059】

また、プラスミドｐＥＴ－２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型とし、フォワードプライマー（pET-23a-HindIII；5’- AGCTTGCGGCCGCACTCGAG-3’、配列番号５）およびリバースプライマー（pET-23a-NdeI；5’- TATGTATATCTCCTTCTTAAAG-3’、配列番号６）並びにPrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いてＰＣＲを行い、３．７ｋｂｐの増幅断片を得た。

【0060】

これらの２種類の増幅断片の相同配列をNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs）を用いて融合し、プラスミドｐＥＯ－２を作製した。プラスミドのヌクレオチド配列はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）とABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Bioscience）を用いて確認した。

【0061】

実施例２：組換え酵素ＥｃＧＨ３０＿１の生産と精製
ｐＥＯ－２を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｍｅｒｃｋ）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＯ－２を作製した。１０ｍＬのＬＢ／Ａｐ培地［１０ｇ／Ｌトリプトン（ナカライテスク）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン］を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＯ－２を前培養（３７℃、２００ｒｐｍ、一晩）した。この前培養のうち４ｍＬを４００ｍＬのＬＢ／Ａｐ培地に加え、振とう培養（２５℃、２００ｒｐｍ）した。培養液のＯＤ_６００が０．６～０．８に達したときに、終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加した後、さらに振とう培養（２５℃、２００ｒｐｍ、１６時間）を行った。培養後、遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、細胞を回収した。細胞は使用するまで－２０℃で保存した。

【0062】

回収した細胞に４０ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５］と１．７ｍＬの緩衝液Ｂ［２０ｍＭ ＭＯＰＳ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５］を加えて懸濁した後、超音波破砕機を用いて破砕した。その後、遠心分離（３６，０００×ｇ、１５分、４℃）し、得られた上清を粗抽出液とした。

【0063】

緩衝液Ｃ［２０ｍＭ ＭＯＰＳ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５］で平衡化したニッケル結合済みのＮｉ－ＮＴＡ カートリッジ（５ｍＬ、富士フイルム和光純薬）に粗抽出液を供した。試料添加後、イミダゾール濃度を２０ｍＭとした緩衝液Ｃでカラムを十分洗浄した後、２０－１２５ｍＭイミダゾールの直線濃度勾配（２００ｍＬ）によりタンパク質を溶出した。タンパク質濃度の高い画分を回収し、Amicon Ultra-15 （Millipore）を用いて濃縮した。PD-10 Desalting Column（Cytiva）を用いて溶媒を２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）に交換した後、終濃度が各１ｍＭになるようにＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）とＤＴＴを添加し、４℃で保存した。これを精製ＥｃＧＨ３０＿１と定義し、純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２）。また、精製ＥｃＧＨ３０＿１の濃度はＡ_２８０の測定値とモル吸光係数（８６，７５０ｃｍ^－１・Ｍ^－１）を用いて決定し、４００ｍＬの培養液から約３０ｍｇの精製ＥｃＧＨ３０＿１を得た。

【0064】

実施例３：ＥｃＧＨ３０＿１の特性解析
（１）ＥｃＧＨ３０＿１の活性測定
５μＬの１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、４０μＬの２．５ｍＭ ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－キシロピラノシド（ｐＮＰＸ）を混合した。３５℃で１０分予備保温した後、５μＬの９０μｇ／ｍＬ ＥｃＧＨ３０＿１を添加し、３５℃で１０分保持して酵素反応を進行させた。この反応液に対して、１００μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止させた。このうち１４０μＬの混合液をマイクロプレートのウェルに加え、マイクロプレートリーダーでＡ_４０５を測定した。この際、既知濃度のｐ－ニトロフェノール溶液を５ｍＭ ｐＮＰＸの代わりに、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を酵素液の代わりに用いて検量線を作成した。ｐＮＰＸ以外のｐ－ニトロフェニル配糖体を用いた活性測定も同様に行った。

【0065】

活性測定の結果、ＥｃＧＨ３０＿１はｐＮＰＸを加水分解し、ｐ－ニトロフェノールを生成した。比活性は５．９μｍｏｌ／分／ｍｇであった。一方、ｐＮＰＸに代えて、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルコピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－マンノピラノシド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－ガラクトピラノシド、ｐ－ニトロ－Ｎ－アセチル－β－ｄ－グルコサミニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－グルクロニド、ｐ－ニトロフェニルβ－ｄ－フコピラノシド、ｐ－ニトロフェニルα－ｌ－アラビノピラノシドのｐ－ニトロフェニル配糖体を基質として加えた場合にはこれらの基質はほとんど分解されなかった（ｐＮＰＸに対する活性の０～１％）。

【0066】

次に、ＥｃＧＨ３０＿１の至適温度および至適ｐＨを評価した。至適温度については、温度条件を２０℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃の各温度に設定した以外は、上記酵素反応と同様にｐＮＰＸを基質とする酵素反応を行った。また、至適ｐＨについては、１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に代えて、１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、６．５または７．０）あるいは１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５、７．０または７．５）を用いた以外は、上記酵素反応と同様にｐＮＰＸを基質とする酵素反応を行った。至適温度および至適ｐＨはそれぞれ図３および図４に示される通りであった。

【0067】

（２）ＥｃＧＨ３０＿１の二糖加水分解能力の確認
５μＬの０．２Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、４μＬの２５ｍＭ二糖、１μＬの１．７ｍｇ／ｍＬＥｃＧＨ３０＿１からなる混合液（合計１０μＬ）を３５℃で１時間保持した後、ＴＬＣで分析した。シリカゲル６０ ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ）に２μＬの試料をアプライした。酢酸エチル－酢酸－水（２：２：１）を用いて展開した。その後、ドライヤーでプレートを乾燥し、メタノール－硫酸（１９：１）に１０秒浸した。これを乾燥した後、１００℃で５分加熱し、糖のスポットを可視化した。

【0068】

ＴＬＣ分析の結果、ＥｃＧＨ３０＿１はプリメベロースを加水分解してグルコースとキシロースを生成した（図５Ａ）。一方、キシロビオースには作用しなかった（図５Ｂ）。また、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、スクロース、ラクトースにも作用しなかった。

【0069】

実施例４：縮合反応生成物の精製と構造解析
キシロースとグルコースを基質として、ＥｃＧＨ３０＿１による酵素反応を行った後、反応試料を分析した。具体的には、４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、３００ｇ／Ｌキシロース、３６０ｇ／Ｌグルコース、０．４４ｍｇ／ｍＬＥｃＧＨ３０＿１の混合液を３０℃で９６時間反応させた。得られた試料をＨＰＬＣで分析すると二糖と思われるひとつの明瞭なピークが観察された。クロマトグラムの一例を図６に示す。当該縮合生成物の精製および構造解析を下記の通り実施した。

【0070】

２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶かした３０ｍＬの８００ｇ／Ｌキシロースと３０ｍＬの８００ｇ／Ｌグルコースに対して、６．７ｍＬの４．４ｍｇ／ｍＬ ＥｃＧＨ３０＿１を加えて、５０℃で１４０時間保持した。９０℃で３０分加熱して酵素を失活させた後、室温で放置し、遠心分離（１１，０００×ｇ、１５分）した。得られた上清に１．６Ｌの純水を加えて活性炭・セライトカラムクロマトグラフィーの試料とした。

【0071】

純水で平衡化した活性炭－セライト［活性炭素（富士フイルム和光純薬）とセライト－５４５（関東化学）を等量混合］カラム（内径５．０ｃｍ×５０ｃｍ）に試料を添加した。画分Ｎｏ．３００までは十分量の純水を送液して単糖を除去した。その後、５％（ｖ／ｖ）エタノールを送液して二糖を溶出した。操作は全て流速２．０ｍＬ／分で行い２０ｍＬずつ分画した。各画分についてジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）を用いた還元糖の定量と、ＨＰＬＣによる試料の成分分析を行った（図７）。目的の二糖を含む画分Ｎｏ．４３５－５２５を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮した後、試料を凍結乾燥したところ、約１．６ｇの試料が得られた。試料は－２０℃で保存した。

【0072】

約１０ｍｇの試料を０．６ｍＬの重水に溶解し、ＮＭＲ装置（日本電子、ＪＮＭ－ＥＣＺ５００Ｒ）を用いて分析に供した結果、精製試料の^１Ｈおよび^１３ＣのＮＭＲスペクトルは既報（J. Appl. Glycosci., 46, 431-437, 1999）のプリメベロースのスペクトルとほぼ同様であった（図８）。

【0073】

純水に溶解した１０ｍｇ／ｍＬの試料をＥＳＩ－ＭＳ装置（ＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ、島津製作所）を用いてＭＳスペクトル分析に供した結果、ポジティブモードで［Ｍ＋Ｎａ］^＋：３１２＋２３＝３３５ｍ／ｚのイオンピークが検出された。これはプリメベロースの質量（３１２Ｄａ）と矛盾しなかった。

【0074】

以上のことから、キシロースとグルコースを基質とした縮合物はプリメベロース（キシロースとグルコースがβ－１，６結合したヘテロ二糖）であることが確認された。キシロースとグルコースの縮合反応によるプリメベロースの合成の反応式を図９に示す。

【0075】

実施例５：縮合反応の条件検討
縮合反応によりプリメベロースを効率的に合成する条件（反応温度、反応時間、基質濃度比）を下記の通り検討し、反応後の試料をＨＰＬＣに供して、生成物の濃度を測定した。

【0076】

反応時間の影響は、キシロース、グルコースおよびＥｃＧＨ３０＿１をそれぞれ３００ｍｇ／ｍＬ、３６０ｍｇ／ｍＬ、０．４４ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を３０℃で２１７時間まで反応させた後、ＨＰＬＣ分析により調べた。

【0077】

反応温度の影響は、キシロース、グルコースおよびＥｃＧＨ３０＿１をそれぞれ３００ｍｇ／ｍＬ、３６０ｍｇ／ｍＬ、０．４４ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を様々な温度で７２時間反応させた後、ＨＰＬＣ分析により調べた。

【0078】

基質濃度比（キシロース－グルコース比）の影響は、単糖（キシロースおよびグルコース）およびＥｃＧＨ３０＿１をそれぞれ７２０ｍｇ／ｍＬ、０．４４ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する１８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を５０℃で７２時間反応させた後、ＨＰＬＣ分析により調べた。

【0079】

反応後の試料のＨＰＬＣ分析は下記の通り行った。適当な倍率に純水で希釈した５μＬの試料をカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ Ｓｕｇａｒ－Ｄ（内径４．６×２５０ｍｍ、ナカライテスク）に供し、示差屈折検出器によって検出した。溶離液として、アセトニトリル－純水（約３：１）を使用し、流速を１．０ｍＬ／分とした。カラム温度を３０℃、検出器温度を４０℃とした。ＨＰＬＣシステムとしてＡｇｉｌｅｎｔ１１００（Agilent technologies）を使用した。試料中のプリメベロース濃度はピーク面積から算出し、検量線の作成には５０ｍＭの精製プリメベロースを標準試料として使用した。

【0080】

３００ｇ／Ｌ（２Ｍ）キシロースと３６０ｇ／Ｌ（２Ｍ）グルコースを基質として３０℃で２００時間以上反応を行ったところ、反応時間が長くなるにつれて二糖の生成量が多くなり、最大で１１０ｍＭ程度となった（図１０）。

【0081】

また、同濃度の基質を用いて３０～６０℃で７２時間の縮合反応を行ったところ、５０℃で二糖の生成量が最大（１００ｍＭ）となった（図１１）。

【0082】

基質であるキシロースとグルコースの濃度比と、二糖の生成量の関係について調べた。具体的には、７２０ｇ／Ｌの単糖（キシロースおよびグルコース）と０．４４ｍｇ／ｍＬのＥｃＧＨ３０＿１とを含む混合液を５０℃で７２時間反応させた後、ＨＰＬＣで解析した。結果は表１に示す通りである。すなわち、キシロースおよびグルコースの合計濃度を７２０ｇ／Ｌとして濃度比を１：５から５：１まで変化させたところ、等濃度のときの二糖生成量が最大であった。なお、キシロースのみの反応では二糖は生成しなかった。

【0083】

【表1】

【0084】

実施例６：種々の単糖を用いた縮合反応
ＥｃＧＨ３０＿１の縮合反応によりグルコース以外の単糖を含む二糖が合成可能であるか検証すべく、キシロースとマンノース、キシロースとガラクトース、あるいはキシロースとフルクトースを基質として反応を行った。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶かした６００ｍｇ／ｍＬのキシロースと６００ｍｇ／ｍＬの様々な単糖（マンノース、ガラクトースまたはフルクトース）を合計１８μＬとなるように混合し、さらに２μＬの４．４ｍｇ／ｍＬ ＥｃＧＨ３０＿１を加えた混合液を、５０℃で４８時間保持し、反応後の試料をＨＰＬＣに供した。

【0085】

キシロースとマンノース、あるいはキシロースとフルクトースを基質として反応を行った後の試料を、実施例５に記載された手順に従ってＨＰＬＣ分析を行ったところ、プリメベロースとは異なる保持時間のピークが観察された（図１２（Ｂ）および（Ｄ））。結合様式は不明であるが、キシロシルマンノースとキシロシルフルクトースが生成したと考えられる。一方、キシロースとガラクトースを基質とした反応では、縮合反応による生成物は観察されなかった（図１２（Ｃ））。

【0086】

次に、上記ＨＰＬＣ分析においてカラムからの溶出液を、フラクションコレクターを用いて分画し（０．５ｍＬ／画分）、図１２（Ｂ）および（Ｄ）の矢印のピークを含む画分をそのままＥＳＩ－ＭＳ装置（ＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ、島津製作所）を用いてＭＳスペクトル分析に供した。その結果、キシロースおよびマンノースを基質とした生成物と、キシロースとフルクトースを基質とした生成物はいずれもポジティブモードで［Ｍ＋Ｎａ］^＋：３１２＋２３＝３３５ｍ／ｚのイオンピークが検出された。このイオンピークはプリメベロース（Ｘｙｌ－Ｇｌｃ）と同一であり、ペントースとヘキソースが縮合してできた二糖の値と矛盾しなかった。従って、キシロースおよびマンノースを基質とした生成物と、キシロースとフルクトースを基質とした生成物はそれぞれキシロースとマンノースが結合したヘテロ二糖（キシロシルマンノース）、キシロースとフルクトースが結合したヘテロ二糖（キシロシルフルクトース）であることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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