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特開2024-142428角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024142428
(43)【公開日】2024-10-11
(54)【発明の名称】角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20241003BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023054564
(22)【出願日】2023-03-30
(71)【出願人】
【識別番号】591230619
【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品
(72)【発明者】
【氏名】森田 哲史
(72)【発明者】
【氏名】浅井 健史
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 裕太
(72)【発明者】
【氏名】齋藤（奥田） 奈緒美
(72)【発明者】
【氏名】川村 美夏帆
(72)【発明者】
【氏名】内海 貴夫
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS40
4B065AA90X
4B065AC12
4B065AC14
4B065BA21
4B065CA44
4B065CA50
(57)【要約】 （修正有）
【課題】角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を、肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明は、例えば下記手段を用いる。
〔１〕皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
〔２〕前期皮膚細胞が、皮膚から摘出した皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、細胞から再構築した3次元皮膚モデル、から選ばれる1種以上である〔１〕に記載のスクリーニング方法。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、例えば下記手段を用いる。
〔１〕皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
〔２〕前期皮膚細胞が、皮膚から摘出した皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、細胞から再構築した3次元皮膚モデル、から選ばれる1種以上である〔１〕に記載のスクリーニング方法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
【請求項2】
前記皮膚細胞が、皮膚から摘出した皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、細胞から再構築した３次元皮膚モデル、から選ばれる１種以上である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記細胞生存率の低下が、フェロトーシスの増加であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
前記細胞生存率の低下が、細胞内活性酸素種の増加、細胞内鉄の増加、シスチン取り込みの減少、細胞内鉄貯蔵タンパク質の増加、システイン合成関連因子の減少、シスチン取り込み関連因子の減少、から選択される１種以上を指標とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、角層構成成分が皮膚細胞に対して悪影響を及ぼす生理的作用を有するという新たな知見に基づく、角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
角層は皮膚の最表層に位置し、生体と外部環境の間の物理的・化学的バリアとして機能するほか、皮膚の質感や外観を調整し、健康的な生体や皮膚の維持にとって、健常な角層の維持は不可欠である。なお、「角層」の呼称は、角層全層だけでなく角層の一部分に対しても用いられている。
角層は、死んだ角層細胞の集合体を含め、角層細胞内もしくは周辺部に存在する角層細胞間脂質やタンパク質、脂質、NMF等により構成され、それら角層を構成する成分（角層構成成分）のうち、角層細胞間脂質がバリア機能（非特許文献１）、ＮＭＦ等が水分保持機能（非特許文献２）を担って健康的な生体や皮膚の維持に貢献していることが知られている。
一方で、正常な新陳代謝においては垢となって落屑されるべき角層細胞は、堅い、粗造な表面形態を呈する、光の透過を妨げる、などの性質を持つため、落屑せずに滞留した角層細胞は皮膚表面の物理的特性を変化させることにより皮膚のカサツキやくすみといった症状を引き起こす。このような皮膚の症状を改善する化粧料としては、従来、角層を剥離する作用を持つグリコール酸、乳酸、サリチル酸等のヒドロキシ酸（特許文献１）や尿素、アルカリ性溶液等を配合した皮膚外用剤や、角層の剥離を調節するトリプシン及びキモトリプシン様プロテアーゼの角層剥離効果を高める物質を含有する皮膚外用剤（特許文献２）があり、滞留した角層を除去することにより皮膚の物理的特性を変化させ、滑らかさを取り戻し、くすみを改善することができる。このように、角層を除去することにより皮膚表面の物理的特性の変化による皮膚の症状が改善することから、角層は物理的な作用として皮膚に悪い影響を及ぼす面を有することは明白である。
角層は、死んだ角層細胞の集合体を含め、角層細胞内もしくは周辺部に存在する角層細胞間脂質やタンパク質、脂質、NMF等により構成され、それら角層を構成する成分（角層構成成分）のうち、角層細胞間脂質がバリア機能（非特許文献１）、ＮＭＦ等が水分保持機能（非特許文献２）を担って健康的な生体や皮膚の維持に貢献していることが知られている。
一方で、正常な新陳代謝においては垢となって落屑されるべき角層細胞は、堅い、粗造な表面形態を呈する、光の透過を妨げる、などの性質を持つため、落屑せずに滞留した角層細胞は皮膚表面の物理的特性を変化させることにより皮膚のカサツキやくすみといった症状を引き起こす。このような皮膚の症状を改善する化粧料としては、従来、角層を剥離する作用を持つグリコール酸、乳酸、サリチル酸等のヒドロキシ酸（特許文献１）や尿素、アルカリ性溶液等を配合した皮膚外用剤や、角層の剥離を調節するトリプシン及びキモトリプシン様プロテアーゼの角層剥離効果を高める物質を含有する皮膚外用剤（特許文献２）があり、滞留した角層を除去することにより皮膚の物理的特性を変化させ、滑らかさを取り戻し、くすみを改善することができる。このように、角層を除去することにより皮膚表面の物理的特性の変化による皮膚の症状が改善することから、角層は物理的な作用として皮膚に悪い影響を及ぼす面を有することは明白である。
【0003】
しかし、角層構成成分が生きた皮膚細胞の生理的特性に影響を与えることやそのメカニズムについては注意が払われていなかった。ましてや、健康的な生体や皮膚の維持にとって不可欠な角層構成成分が生きた皮膚細胞の生理的特性に悪影響を与える可能性については全く考慮されていなかった。
【0004】
ここで、フェロトーシスは、近年新しく報告された細胞死機構であり、鉄に依存した脂質過酸化物の蓄積により引き起こされるプログラム細胞死の1つとして、アポトーシスとは異なる細胞死経路をたどることが明らかにされている細胞死である。フェロトーシスでは、膜リン脂質中の多価不飽和脂肪酸が酸化した脂質過酸化物の蓄積が生じることが報告されており、これには細胞内の鉄、活性酸素種、システイン、グルタチオンが関連することが知られている。皮膚においては、表皮細胞では紫外線によりフェロトーシスが誘導されること（非特許文献３）が報告されているが、皮膚におけるフェロトーシス誘導の原因や機能には未知の部分が多く、ましてや、角層構成成分とフェロトーシスの関連性については全く知られていなかった。
【0005】
上述の通り角層を除去する複数の方法が存在し、角層が物理的な作用として皮膚に悪い影響を及ぼす面には対処することができていた。しかしながら、生きた皮膚細胞の生理的特性を変化させる作用による皮膚への影響に対しては、その影響そのものが明らかにされておらず、対処の方法も全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開昭５８－８００７号公報
【特許文献2】特開２００２－２３４８４５号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】田上八朗, 角層と皮膚疾患（前編） －角層のバリア機能を中心としてー, 西日皮膚，６５（１）， ５８－６４，２００３
【非特許文献2】田上八朗, 角層と皮膚疾患（後編） －角層の水分保持機能を中心としてー, 西日皮膚，６５（２）， １６５－１７１，２００３
【非特許文献3】Ｋａｖｉｔａ Ｖａｔｓ ｅｔ． ａｌ．， Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｄｅａｔｈ ｂｙ ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ＵＶＢ ｅｘｐｏｓｕｒｅ, Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．， ４７, Ａｒｔｉｃｌｅ １０２１４３， ２０２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記課題に鑑み、本発明は、角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、角層構成成分が有する皮膚細胞の生理的特性を変化させる作用を明らかにするため、ボランティアから採取した角層構成成分を皮膚細胞に共存させて皮膚細胞の遺伝子発現プロファイルを解析し、タンパク質の発現や生体反応の解析を加えて、角層構成成分が有する皮膚細胞の生理的特性を変化させる作用の有無とそのメカニズムを徹底的に追求した。その結果、角層構成成分は皮膚細胞に対して、細胞内の活性酸素濃度を増加させること、細胞内の鉄濃度を増加させること、細胞内の過酸化脂質を増加させることを見出した。さらには、細胞ではフェロトーシスが生じ、細胞生存率に関連することを発見した。
【0010】
これらの結果から、皮膚の最表層にあって健康的な生体や皮膚の維持にとって不可欠であるにも関わらず、角層構成成分は生きた皮膚細胞の生理的特性に悪影響を与えるという驚くべき知見を得た。また、該悪影響の中でも細胞生存率に関わる影響は深刻で、角層構成成分を皮膚細胞に共存させた場合に、肌荒れの原因として知られている細胞生存率の低下が生じるという事実は、正常な新陳代謝で共存しうる以上の角層構成成分と皮膚細胞が共存した場合に、角層構成成分が肌荒れの原因として作用することを示す。以上の知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させた。
【0011】
より具体的には下記の発明に関する：
〔１〕皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
〔２〕前記皮膚細胞が、皮膚から摘出した皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、細胞から再構築した3次元皮膚モデル、から選ばれる1種以上である〔１〕に記載のスクリーニング方法。
〔３〕前記細胞生存率の低下が、フェロトーシスの増加であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
〔４〕前記細胞生存率の低下が、細胞内活性酸素種の増加、細胞内鉄の増加、シスチン取り込みの減少、細胞内鉄貯蔵タンパク質の増加、システイン合成関連因子の減少、シスチン取り込み関連因子の減少、から選択される１種以上を指標とする〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
〔１〕皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法。
〔２〕前記皮膚細胞が、皮膚から摘出した皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、細胞から再構築した3次元皮膚モデル、から選ばれる1種以上である〔１〕に記載のスクリーニング方法。
〔３〕前記細胞生存率の低下が、フェロトーシスの増加であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
〔４〕前記細胞生存率の低下が、細胞内活性酸素種の増加、細胞内鉄の増加、シスチン取り込みの減少、細胞内鉄貯蔵タンパク質の増加、システイン合成関連因子の減少、シスチン取り込み関連因子の減少、から選択される１種以上を指標とする〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
【0012】
本発明には、皮膚細胞に角層構成成分を共存させ、角層構成成分を共存させない場合を基準として、角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の実質的な細胞生存率の低下を評価する工程、および皮膚細胞に角層構成成分を共存させ、被験物質を共存させた場合に、角層構成成分の共存による細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定する工程を含みうる。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する物質を、高い精度で選定することができる。また、本発明の角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を含む皮膚外用剤を塗布することにより、肌荒れを改善する効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】角層構成成分を共存させた場合と共存させていない場合で培養した３次元皮膚モデルの細胞内の活性酸素種レベルを示す図である。
【図2】角層構成成分を共存させた場合と共存させていない場合で培養した３次元皮膚モデルの細胞内の鉄濃度を示す図である。
【図3】角層構成成分を共存させた場合と共存させていない場合で培養した３次元皮膚モデルにおける4-ヒドロキシ2-ノネナールの免疫染色観察画像である。
【図4】３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させた場合の細胞生存率の低下の指標を活性酸素レベルとして被験物質をスクリーニングした結果である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明について実施の形態を例示して詳細に説明する。なお、本発明の範囲はここで説明する実施態様に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で任意の変更を加えて実施することができる。
【0016】
本発明で用いられる角層構成成分は、皮膚の表層から抽出される成分、採取した角層、もしくは採取した角層から抽出される成分のことを示す。具体的には、角層細胞周辺部に存在する角層細胞間脂質、角層細胞内もしくは周辺部に存在するタンパク質や脂質、アミノ酸、有機物、無機物等の物質、採取した角層の角層細胞（角質細胞と呼ばれることもある）やそれらの混合物を角層構成成分として用いることができる。角層構成成分として、ヒトから採取した角層をそのまま用いることができるが、皮膚の表層や採取した角層から任意の溶媒やさらにはボルテックスミキサー、ビーズミル、超音波等の任意の外力負荷方法にて抽出される抽出物を角層構成成分としてもよく、角層細胞そのものを必ず含めなくてもよい。ここで、角層から抽出される成分を得る際に用いられる溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。抽出の温度および抽出時間は、その後適用する皮膚細胞への作用が損なわれない範囲であれば特に制限されず、低温下から加温下で数分～数日で抽出される。
上記の如く得られた抽出物は、抽出後の抽出液をそのまま用いることができるが、目的に応じて活性炭又は活性白土、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤（ＨＰ－２０：三菱化成社製）やオクタデシルシラン処理シリカ（ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＯＤＳ：富士シリシア化学製）等により精製することができる。場合によっては、抽出物や精製分画物の溶媒を留去して液体の状態で用いてもよいが、スプレードライ法、凍結乾燥法等、常法に従って固体化し、さらに必要に応じて粉砕して粉末状とした上で用いてもよい。
当然のことながら、これらの抽出物だけではなく、抽出後の角層残渣を角層構成成分として用いることもでき、上記の如く処理を施して用いてもよい。
上記の如く得られた抽出物は、抽出後の抽出液をそのまま用いることができるが、目的に応じて活性炭又は活性白土、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤（ＨＰ－２０：三菱化成社製）やオクタデシルシラン処理シリカ（ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＯＤＳ：富士シリシア化学製）等により精製することができる。場合によっては、抽出物や精製分画物の溶媒を留去して液体の状態で用いてもよいが、スプレードライ法、凍結乾燥法等、常法に従って固体化し、さらに必要に応じて粉砕して粉末状とした上で用いてもよい。
当然のことながら、これらの抽出物だけではなく、抽出後の角層残渣を角層構成成分として用いることもでき、上記の如く処理を施して用いてもよい。
【0017】
本発明で用いられる角層構成成分を得るための角層は、ヒトに由来するものであれば特に限定されない。顔面、首、腕、手、胸部、腹部、背部、脚部、足、頭部等の身体の任意の部位の皮膚から採取されたものでもよいが、顔面や腕を用いると角層が採取しやすい。対象となるヒトの年齢は特に限定されず、皮膚を深く侵襲しない程度であれば乳幼児から老齢のヒトまでが対象となる。さらには、ヒト摘出皮膚を用いてもよいし、ヒト由来細胞を用いて分化させて角層を形成した皮膚モデルから角層を採取してもよい。
所望の深さにある角層を採取できるように、皮膚上層の角層を取り除いた後で角層を採取してもよい。
所望の深さにある角層を採取できるように、皮膚上層の角層を取り除いた後で角層を採取してもよい。
【0018】
角層の採取方法は特に限定されず、例えば粘着剤を皮膚に貼り付けて剥がすことによって皮膚の角層を採取するテープストリッピング法や、スクレイパー等の器具により角層を皮膚表面からこすり落として採取する方法、コットンや綿棒等の器具を用いて皮膚の擦過等により採取する方法、など公知の角層採取方法で採取できる。特には、低侵襲であるテープストリッピングや擦過等の簡便に角層を得られる方法が好ましい。採取時に毛髪など、角層以外が含まれていた場合であっても、測定に影響がない範囲であれば問題ない。
粘着剤は、角層を接着し剥離する接着力を有するものであれば特に限定されず、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。
角層を皮膚表面からこすり落としたり擦過等により採取するための器具を用いる場合、器具の素材は角層を採取するために有効であれば特に限定されず、天然のものであっても合成のものであってもよく、またこれらが混在したものであってもよい。具体的には、綿、絹、羊毛、麻、パルプ、リヨセル、キュプラ、レーヨン、アセテート、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリアミド、ニトリルゴム、ポリビニルアルコール等が挙げられる。担体の大きさ、形状等は、採取する皮膚の面積や扱いやすさ等を考慮して、適宜設計すればよい。
粘着剤は、角層を接着し剥離する接着力を有するものであれば特に限定されず、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。
角層を皮膚表面からこすり落としたり擦過等により採取するための器具を用いる場合、器具の素材は角層を採取するために有効であれば特に限定されず、天然のものであっても合成のものであってもよく、またこれらが混在したものであってもよい。具体的には、綿、絹、羊毛、麻、パルプ、リヨセル、キュプラ、レーヨン、アセテート、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリアミド、ニトリルゴム、ポリビニルアルコール等が挙げられる。担体の大きさ、形状等は、採取する皮膚の面積や扱いやすさ等を考慮して、適宜設計すればよい。
【0019】
角層の採取の際には、角層採取用の溶液を用いることができる。具体的な例として、角層採取用溶液を含浸させたコットンで皮膚表面を擦過することにより実施できる。溶液としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の緩衝液、アルコール類、グリコール類、アセトン等の有機溶媒、界面活性剤を含む水性溶媒等を用いることができ、これらの混合物でも問題ない。
【0020】
角層の採取においては、試験に供する角層構成成分の量を得ることができれば、採取する範囲は特に限定されない。広い範囲から採取してもよく、範囲を限定した箇所から角層を採取することもできる。十分な量の角層を得るために、１～数回の採取作業で角層を採取してもよい。当然ながら、角層採取に用いるテープ、粘着剤、コットン等の採取器具は採取の間同一のものを用いて採取してもよいが、適宜交換しながら複数回採取してもよい。
上記手順による角層の採取の前に、角層を採取する皮膚部位から皮脂、汚れ等を取り除いておくことが好ましい。
上記手順による角層の採取の前に、角層を採取する皮膚部位から皮脂、汚れ等を取り除いておくことが好ましい。
【0021】
必要であれば採取した角層を収集する目的で適宜種々の処理をすることができる。テープストリッピングにより採取した角層であれば、粘着剤を除去後に収集することができる。また、コットン等を用いて擦過により角層を採取した場合では、コットン等に付着した乾燥した角層を振り落とすことで回収して収集することができ、もしくは水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の緩衝液、アルコール類、グリコール類、アセトン等の有機溶媒、界面活性剤を含む水性溶媒等、またはこれらの混合液に角層採取後のコットンを浸漬し、振とうや超音波等によりコットンから角層を剥離、懸濁した後に遠心分離等で収集することができる。
【0022】
角層構成成分は、その後適用する細胞への作用が損なわれない範囲で必要に応じて滅菌処理、殺菌処理、除菌処理を施してもよい。処理方法は特に限定されないが、角層構成成分をアルコールに浸漬させてからアルコールを留去する、加熱する、フィルターでろ過する、紫外線やガンマ線を照射する、抗生物質や次亜塩素酸ナトリウム等に一定時間浸漬する、等々の方法が挙げられる。当然のことながら、滅菌処理を施さずに角層構成成分を皮膚細胞に共存させても問題はない。
【0023】
また、角層構成成分は、１人から得られた角層構成成分でもよいが、複数人から得られた角層構成成分を集合させてから用いてもよい。同様に、培養皮膚組織や皮膚モデルから角層を採取して角層構成成分とする場合は、１つの組織から得られた角層構成成分を用いてもよいが、複数の組織から得られた角層構成成分を集合させてから用いてもよい。
【0024】
角層構成成分を共存させる皮膚細胞は、主たる由来がヒトであればよく、摘出皮膚、皮膚から摘出した皮膚組織、あるいはそこから得られる培養皮膚組織、摘出した皮膚組織から分離した皮膚細胞、皮膚細胞から再構築した3次元皮膚モデルなどを用いることができる。皮膚細胞は、公知の方法により皮膚から採取されたものを用いることもできるが、ＪＣＲＢ細胞バンクや理研ＢＲＣ細胞材料開発室 ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ等の細胞バンクで分譲されている皮膚細胞、もしくはクラボウ社、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社等により市販されている皮膚細胞を用いることもできる。
角層構成成分を共存させる皮膚細胞を構成する細胞種としては、表皮角化細胞や線維芽細胞が挙げられ、さらには皮膚に存在するランゲルハンス細胞、メラニン細胞、肥満細胞、内皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭細胞、毛母基細胞などが混在していても問題ない。また、角層構成成分を共存させることにより上記皮膚細胞と同等の挙動を示すと判断できるのであれば特性を理解した上でヒト皮膚由来の細胞を株化した皮膚細胞を用いてもよい。
さらに、皮膚細胞を分化させた皮膚モデルを構築し、１種類の皮膚細胞により構成される皮膚モデルを用いてもよいし、前述の複数の細胞が混在した皮膚モデルを用いてもよい。皮膚モデルは公知の方法により作製することもできるが、クラボウ社やジャパン・ティッシュエンジニアリング社等により市販されている皮膚モデルを用いることもできる。
なお、再構築した３次元皮膚モデルを構成する細胞は、公知の方法により皮膚から採取されたものを用いることもできるが、上述の分譲もしくは市販されている皮膚細胞を用いることもできる。
さらには、皮膚老化や光老化等の、ダメージを想定した皮膚への影響を評価するために、皮膚細胞にはあらかじめ老化処理やダメージ処理を施しておいてもよい。
角層構成成分を共存させる皮膚細胞を構成する細胞種としては、表皮角化細胞や線維芽細胞が挙げられ、さらには皮膚に存在するランゲルハンス細胞、メラニン細胞、肥満細胞、内皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭細胞、毛母基細胞などが混在していても問題ない。また、角層構成成分を共存させることにより上記皮膚細胞と同等の挙動を示すと判断できるのであれば特性を理解した上でヒト皮膚由来の細胞を株化した皮膚細胞を用いてもよい。
さらに、皮膚細胞を分化させた皮膚モデルを構築し、１種類の皮膚細胞により構成される皮膚モデルを用いてもよいし、前述の複数の細胞が混在した皮膚モデルを用いてもよい。皮膚モデルは公知の方法により作製することもできるが、クラボウ社やジャパン・ティッシュエンジニアリング社等により市販されている皮膚モデルを用いることもできる。
なお、再構築した３次元皮膚モデルを構成する細胞は、公知の方法により皮膚から採取されたものを用いることもできるが、上述の分譲もしくは市販されている皮膚細胞を用いることもできる。
さらには、皮膚老化や光老化等の、ダメージを想定した皮膚への影響を評価するために、皮膚細胞にはあらかじめ老化処理やダメージ処理を施しておいてもよい。
【0025】
角層構成成分の皮膚細胞への共存はいかなる方法によってでもよく、例えば、角層構成成分を皮膚細胞の培養液に添加する方法、皮膚細胞の表層に角層構成成分を重層させる方法などが挙げられる。また、角層構成成分を皮膚細胞に共存させる際には、例えば角層構成成分そのままを皮膚細胞に共存させることができるが、必要に応じて水等で湿潤させて用いることもできる。角層構成成分の形態はどのような形態であってもよく、乾燥や粉砕を行って粉末状にして用いることができるが、共存させる皮膚細胞に影響が出ない範囲で適当な溶媒に分散や溶解したものを用いてもよい。皮膚細胞に均一に共存させるために、角層構成成分を添加したのちにメッシュ等を上から乗せる等の処置を施してもよい。
【0026】
皮膚細胞に共存させる角層構成成分の量は特に限定されず、共存させない場合に比べて共存させた場合に、細胞生存率の低下が確認できる程度の量であれば問題なく、用いる皮膚細胞の量、もしくは皮膚組織や皮膚モデルであれば大きさ等に応じて共存させる量を選択することができる。例えば、皮膚細胞としてヒト正常表皮角化細胞により再構築された３次元皮膚モデルを用いて皮膚細胞の表層に角層構成成分を重層させる場合には、皮膚モデルの表層の全範囲が均一に角層構成成分で覆われるように量を調節して共存させることが好ましい。また、ここで言う「量」は、皮膚細胞とそこに共存させる角層構成成分の相対的な量を把握できる値であればよく、たとえば、皮膚細胞を構成する細胞数あたりの角層構成成分質量や、皮膚細胞である皮膚モデルの表層の面積あたりの一定濃度の角層構成成分溶液の体積などである。
【0027】
皮膚細胞の培養時間は特に限定されず、皮膚細胞に角層構成成分を共存させない場合に比べて共存させた場合に、細胞生存率の低下が確認できる程度の時間であれば問題ない。例えば、皮膚細胞としてヒト正常表皮角化細胞により再構築された３次元皮膚モデルを用いて皮膚細胞の表層に角層構成成分を適用する場合には、２４時間～１２０時間が適当であり、４８時間～７２時間が好ましい。
比較の対照となる角層構成成分を共存させない皮膚細胞は、角層構成成分を共存させる前の皮膚細胞でもよいし、角層構成成分を共存させないこと以外は同様の処理を行った皮膚細胞であってもよい。また、角層構成成分の代わりに同じ重量や体積の実質的に生理的に不活性な物質を共存させたものとすることもできる。
比較の対照となる角層構成成分を共存させない皮膚細胞は、角層構成成分を共存させる前の皮膚細胞でもよいし、角層構成成分を共存させないこと以外は同様の処理を行った皮膚細胞であってもよい。また、角層構成成分の代わりに同じ重量や体積の実質的に生理的に不活性な物質を共存させたものとすることもできる。
【0028】
本発明における『皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率の低下』とは、皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合と共存させない場合とを比較し、皮膚細胞における細胞生存率と正の相関関係にある指標の低下または負の相関関係にある指標の増加であれば特に限定されず、皮膚細胞における細胞生存率と正の相関関係にある指標としては、細胞の増殖の活性化能力や細胞死に関わる因子、皮膚細胞における細胞生存率と負の相関関係にある指標としては、細胞内活性酸素種、細胞内鉄、細胞内鉄貯蔵タンパク質、システイン合成関連因子、シスチン取り込みなどが例示される。
なお、指標を測定する場合は、量として検出してもよいが、溶液や液体に含まれる指標の対象物の量の割合を濃度として検出してもよく、例えば質量パーセント濃度、容量パーセント濃度（体積百分率）、モル濃度、規定度等で表してもよい。また、測定した量を基に、細胞数や細胞タンパク質量を用いて比率を算出し、量や濃度等の単位には表さずにレベルとして表して評価に用いてもよい。
なお、指標を測定する場合は、量として検出してもよいが、溶液や液体に含まれる指標の対象物の量の割合を濃度として検出してもよく、例えば質量パーセント濃度、容量パーセント濃度（体積百分率）、モル濃度、規定度等で表してもよい。また、測定した量を基に、細胞数や細胞タンパク質量を用いて比率を算出し、量や濃度等の単位には表さずにレベルとして表して評価に用いてもよい。
【0029】
細胞の増殖の活性化能力や細胞死に関わる因子は、例えば、細胞の増殖の活性化能力であれば、細胞数や細胞賦活を測定することにより細胞生存率や細胞増殖率、もしくは細胞致死率等を算出して評価することができ、また、細胞死であれば、フェロトーシス発生の程度等を評価することができる。
【0030】
本発明の細胞生存率の低下を定量的に測定する方法は、公知の測定方法を用いることができる。例えば、細胞の増殖の活性化能力や細胞死に対しては、細胞数を直接カウントする方法、または細胞核を染色して細胞数をカウントする方法、ＢｒｄＵ等を用いて細胞のＤＮＡ合成を測定する方法、ＷＳＴやＭＴＴ等の代謝還元色素を用いて細胞の代謝活性を測定する方法、ルミノアッセイにて細胞内ＡＴＰを測定する方法等、公知の方法を用いて細胞の増殖の活性化能力を測定することができる。
また、細胞死に対しては、例えばフェロトーシス発生の程度では、特異的に直接的に測定する方法がないものの、脂質過酸化物の蓄積、細胞内の鉄、活性酸素種、システイン、グルタチオンが関連することが知られていることから、これらもしくはこれらに関連する因子を測定することにより間接的にフェロトーシス発生の程度を測定することができる。さらには、フェロトーシス感受性の亢進に寄与するとされている酸化酵素 アラキドン酸-15-リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ１５）、過酸化脂質消去酵素として機能するグルタチオンペルオキシダーゼ ４（ＧＰＸ４）の検出量をフェロトーシス発生の程度の指標として用いてもよい。これらの測定には、市販の試薬や検出キットを用いて測定することができ、例えば過酸化脂質濃度の測定にはＬｉｐｅｒｆｌｕｏ（同仁化学社）、細胞内鉄（鉄イオン）濃度の測定にはＦｅｒｒｏＯｒａｎｇｅ（同仁化学社）、活性酸素種濃度の測定にはＲＯＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ －Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＣＦＨ－ＤＡ－（同仁化学社）、還元によりシステインに変換されるシスチンの取り込み能力の測定にはＣｙｓｔｉｎｅ Ｕｐｔａｋｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（同仁化学社）などを用いることができるが、言うまでもなくその他の公知の方法を用いて測定してもよい。また、ＡＬＯＸ１５やＧＰＸ４の測定には酵素活性を検出量に代えて測定することも可能であり、さらには遺伝子発現量やタンパク質発現量を測定することで評価することもできる。
また、細胞死に対しては、例えばフェロトーシス発生の程度では、特異的に直接的に測定する方法がないものの、脂質過酸化物の蓄積、細胞内の鉄、活性酸素種、システイン、グルタチオンが関連することが知られていることから、これらもしくはこれらに関連する因子を測定することにより間接的にフェロトーシス発生の程度を測定することができる。さらには、フェロトーシス感受性の亢進に寄与するとされている酸化酵素 アラキドン酸-15-リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ１５）、過酸化脂質消去酵素として機能するグルタチオンペルオキシダーゼ ４（ＧＰＸ４）の検出量をフェロトーシス発生の程度の指標として用いてもよい。これらの測定には、市販の試薬や検出キットを用いて測定することができ、例えば過酸化脂質濃度の測定にはＬｉｐｅｒｆｌｕｏ（同仁化学社）、細胞内鉄（鉄イオン）濃度の測定にはＦｅｒｒｏＯｒａｎｇｅ（同仁化学社）、活性酸素種濃度の測定にはＲＯＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ －Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＣＦＨ－ＤＡ－（同仁化学社）、還元によりシステインに変換されるシスチンの取り込み能力の測定にはＣｙｓｔｉｎｅ Ｕｐｔａｋｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（同仁化学社）などを用いることができるが、言うまでもなくその他の公知の方法を用いて測定してもよい。また、ＡＬＯＸ１５やＧＰＸ４の測定には酵素活性を検出量に代えて測定することも可能であり、さらには遺伝子発現量やタンパク質発現量を測定することで評価することもできる。
【0031】
細胞内の活性酸素種は、活性酸素種であれば限定されないが、過酸化水素、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化脂質等が挙げられる。また、これら活性酸素種そのものだけでなく、活性酸素種が作用することにより形状や性質が変化した物質、つまりは反応物や代謝物も対象となりえる。
【0032】
活性酸素種の量を測定する方法は、公知の測定方法を用いることができ、例えば、電子スピン共鳴装置 （Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＥＳＲ） を用いたスピントラップ法、ルミノール、ルシゲニン、ウミホタルルシフェリン誘導体、などを用いる発光法、蛍光発生プローブを用いる蛍光法などがあり、市販されているＯｘｉＳｅｌｅｃｔＴＭ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社） や２’,７’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて測定することができる。また、活性酸素種との反応物や代謝物である酸化ストレスマーカーを介して間接的に測定する方法であってもよく、例えば過酸化脂質のラジカル連鎖反応により生成した４-ヒドロキシ２-ノネナールを標識する抗体を用いて免疫蛍光観察し、画像解析から過酸化脂質の代謝物量を指標として測定してもよい。４-ヒドロキシ２-ノネナールは、脂質の酸化により二次的に生成する物質で、その量は、複数種存在し、かつ、不安定である過酸化脂質の量の変化を総合的に評価するのに有用な指標である。さらには、測定した活性酸素種の量を基に、細胞数や細胞タンパク質量を用いて比率を算出し、活性酸素種レベルに換算して評価に用いてもよい。
【0033】
細胞内鉄の量の測定においては、既知の分析方法により定量してもよいが、市販の測定キットを用いて簡便に定量的測定をしてもよい。例えば、細胞内鉄の量であれば、市販されているメタロアッセイ 鉄 測定 ＬＳ（フェロジン法）（Ｍｅｔａｌｌｏｇｅｎｉｃｓ社）やＦｅｒｒｏＯｒａｎｇｅ（同仁化学社）を用いて測定することができる。
【0034】
シスチン取り込みは、細胞内へのシスチンの量を既知の測定方法により定量して評価してもよいが、市販の測定キットを用いてシスチンの取り込み能力を測定することにより評価してもよい。例えば、シスチンの取り込み能力の測定には、市販のＣｙｓｔｉｎｅ Ｕｐｔａｋｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（同仁化学社）を用いることができる。
【0035】
細胞内鉄貯蔵タンパク質、システイン合成関連因子、シスチン取り込み関連因子の測定に関しては、その因子の遺伝子発現量やタンパク質量を用いて測定することができる。例えば、細胞内鉄貯蔵タンパク質であればフェリチン、システイン合成関連因子であればメチオニンからシステインを生合成する経路上の必須酵素シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）やシスタチオニンγ-リアーゼ（ＣＴＨ）、シスチン取り込み関連因子であれば還元によりシステインに変換されるシスチンを細胞内に取り込むトランスポーターであるＳＬＣ７Ａ１１（Ｓｏｌｕｔｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｆａｍｉｌｙ ７ Ｍｅｍｂｅｒ １１）などが例示される。
【0036】
［００３５］に記載の遺伝子の発現量は、測定する細胞内鉄貯蔵タンパク質、システイン合成関連因子、シスチン取り込み関連因子をコードする遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用い、アガロース電気泳動やリアルタイムＰＣＲ法にて定量的な検出を行うことで測定することができる。なお、公開されている遺伝子配列の情報を基に適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。そのほか、次世代シーケンサーを用いて全転写産物の塩基配列を決定する方法、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、クロスハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いて測定することもできる。
【0037】
タンパク質の発現を定量的に測定する場合は、免疫染色、電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、質量分析等により測定することができるほか、当該タンパク質の代謝産物を測定することで間接的に当該タンパク質量を測定することもできる。
【0038】
『皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定する』とは、以下のことを意味する。
角層構成成分を共存させない場合を基準として、角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率を測定し、実質的な低下を評価する。細胞生存率の低下は、［００２８］に記載の如く、細胞生存率の低下と正の相関関係にある指標の低下または負の相関関係にある指標の増加である。
ここで、抑制すべき細胞生存率の低下は、角層構成成分を共存させた場合に細胞生存率の低下と相関関係にある指標の増加であるか減少であるかは測定する指標の性質に応じて判断され、例えば、細胞生存率の低下において、細胞の増殖の活性化能力、細胞数、細胞賦活、細胞生存率、細胞増殖率等であれば減少であるが、細胞致死率であれば増加である。また、細胞死のフェロトーシス発生の程度であれば、増加である。また、細胞内活性酸素種量や活性酸素種レベル、活性酸素種による活性酸素種との反応物や代謝物である酸化ストレスマーカーの量であれば増加であるが、活性酸素種と反応する対象は反応により反応物の濃度は増加するが反応対象は減少する場合がある。さらには、ＡＬＯＸ１５等の脂質過酸化に関わる酵素の量や活性の場合は増加である。細胞内鉄の場合は、細胞内鉄量もしくは鉄イオン量、細胞内鉄貯蔵タンパク質であれば増加であるが、細胞内鉄濃度を調整する鉄排出トランスポーターであれば減少である。システインに関連する因子の場合、ＣＢＳやＣＴＨ等のシステイン合成関連因子、さらにはシスチン取り込み、シスチン取り込み関連因子であるシスチントランスポーターＳＬＣ７Ａ１１であれば減少である。本発明の細胞生存率の低下は、絶対値の低下のほか、角層構成成分を共存させないヒト皮膚細胞における指標を示す値に対する共存させた皮膚細胞における指標を示す値の割合などが利用できる。また、ここで言う細胞生存率の実質的な低下は、当業者が知見に照らして細胞生存率の低下であると判定できる程度の低下であり、文献や経験に照らして判定される低下のほか、複数の実験例の統計的解析に基づく有意な低下でありうる。例えば、細胞内鉄貯蔵タンパク質のタンパク質の発現量であれば、１０％程度の増加であれば細胞生存率の低下であると判定できる。
さらに、皮膚細胞に角層構成成分を共存させ、被験物質を共存させた場合に、角層構成成分の共存による細胞生存率の低下を抑制する、つまりは、角層構成成分を共存させなかった場合と同等に抑制する被験物質を角層構成成分が引き起こす『皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質』として選定することができる。なお、ここで言う抑制とは、変化することを防ぐことを意味するが、変化した後に変化する以前の状態に戻ることも含みうる。
角層構成成分を共存させない場合を基準として、角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率を測定し、実質的な低下を評価する。細胞生存率の低下は、［００２８］に記載の如く、細胞生存率の低下と正の相関関係にある指標の低下または負の相関関係にある指標の増加である。
ここで、抑制すべき細胞生存率の低下は、角層構成成分を共存させた場合に細胞生存率の低下と相関関係にある指標の増加であるか減少であるかは測定する指標の性質に応じて判断され、例えば、細胞生存率の低下において、細胞の増殖の活性化能力、細胞数、細胞賦活、細胞生存率、細胞増殖率等であれば減少であるが、細胞致死率であれば増加である。また、細胞死のフェロトーシス発生の程度であれば、増加である。また、細胞内活性酸素種量や活性酸素種レベル、活性酸素種による活性酸素種との反応物や代謝物である酸化ストレスマーカーの量であれば増加であるが、活性酸素種と反応する対象は反応により反応物の濃度は増加するが反応対象は減少する場合がある。さらには、ＡＬＯＸ１５等の脂質過酸化に関わる酵素の量や活性の場合は増加である。細胞内鉄の場合は、細胞内鉄量もしくは鉄イオン量、細胞内鉄貯蔵タンパク質であれば増加であるが、細胞内鉄濃度を調整する鉄排出トランスポーターであれば減少である。システインに関連する因子の場合、ＣＢＳやＣＴＨ等のシステイン合成関連因子、さらにはシスチン取り込み、シスチン取り込み関連因子であるシスチントランスポーターＳＬＣ７Ａ１１であれば減少である。本発明の細胞生存率の低下は、絶対値の低下のほか、角層構成成分を共存させないヒト皮膚細胞における指標を示す値に対する共存させた皮膚細胞における指標を示す値の割合などが利用できる。また、ここで言う細胞生存率の実質的な低下は、当業者が知見に照らして細胞生存率の低下であると判定できる程度の低下であり、文献や経験に照らして判定される低下のほか、複数の実験例の統計的解析に基づく有意な低下でありうる。例えば、細胞内鉄貯蔵タンパク質のタンパク質の発現量であれば、１０％程度の増加であれば細胞生存率の低下であると判定できる。
さらに、皮膚細胞に角層構成成分を共存させ、被験物質を共存させた場合に、角層構成成分の共存による細胞生存率の低下を抑制する、つまりは、角層構成成分を共存させなかった場合と同等に抑制する被験物質を角層構成成分が引き起こす『皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質』として選定することができる。なお、ここで言う抑制とは、変化することを防ぐことを意味するが、変化した後に変化する以前の状態に戻ることも含みうる。
【0039】
被験物質を共存させる場合は、被験物質の作用を皮膚細胞に発揮させることができれば、共存させるタイミングや共存させる量は特に限定されない。共存させるタイミングは、例えば、角層構成成分を皮膚細胞に共存させるタイミングと同時期でもよく、もしくは角層構成成分を皮膚細胞に共存させる以前であっても以後であってもよい。角層構成成分を皮膚細胞に共存させる以前もしくは以後である場合に被験物質を共存させ始める時期は、1日から数日であってもよいし、数時間であってもよい。共存させる被験物質の量も特に限定されないが、共存させる皮膚細胞のすべてに均一に共存させることができる量を用いることが好ましい。また、共存させる被験物質の量については特に限定されないが、皮膚細胞に毒性を示さない範囲であることが望ましい。また、ここで言う「量」は、皮膚細胞またはそこに共存させる角層構成成分と被験物質の相対的な量を把握できる値であればよく、たとえば、皮膚細胞を構成する細胞数あたりの被験物質質量や、皮膚細胞である皮膚モデルの表層の面積あたりの一定濃度の被験物質またはその溶液の体積、角層構成成分溶液の単位体積あたりの被験物質の質量などである。
【0040】
本発明において共存させる被験物質は、特に制限されない。動植物由来の抽出物、細胞由来の抽出物、菌類の培養物またはこれらの酵素処理物、化合物またはその誘導体等を用いることができ、これらの混合物も用いることができる。また性状は、液状の他、粉末状、ジェル状、シート状等であっても細胞生存率の低下の測定に影響しないのであれば差し支えない。さらに、被験物質の各原体からの抽出方法や添加濃度も特に限定されない。なお、被験物質を皮膚細胞に共存させる際には、適当な溶媒に分散もしくは溶解させることができ、皮膚細胞に作用しない範囲で水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の緩衝液、アルコール類、グリコール類、アセトン等の有機溶媒、界面活性剤を含む水性溶媒等、またはこれらの混合液などを用いることができる。
【0041】
本発明の１例として、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは角層構成成分を共存させない３次元皮膚モデルに対してシスタチオニンγ-リアーゼのタンパク質の発現量が１０％程度低下した場合、シスタチオニンγ-リアーゼのタンパク質発現量が細胞生存率と正の相関関係にあることから、角層構成成分の共存により皮膚細胞の細胞生存率が低下したと判断する。角層構成成分を共存させ、さらに被験物質を共存させた３次元皮膚モデルにおいてシスタチオニンγ-リアーゼのタンパク質の発現量が角層構成成分を共存させない３次元皮膚モデルと同等の発現量であった場合には、この被験物質を角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定することができる。
【実施例0042】
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。
【0043】
＜実験方法＞
１．角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響の把握
角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響を把握するために、以下の実験を実施した。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得た健常者１８名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて角層構成成分試料とした。この角層構成成分３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。対照としては、角層構成成分を共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ） を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次に、３次元皮膚モデルから抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡについて、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った（株式会社Ｒｈｅｌｉｘａ）。
１．角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響の把握
角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響を把握するために、以下の実験を実施した。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得た健常者１８名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて角層構成成分試料とした。この角層構成成分３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。対照としては、角層構成成分を共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ） を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次に、３次元皮膚モデルから抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡについて、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った（株式会社Ｒｈｅｌｉｘａ）。
【0044】
角層構成成分を３次元皮膚モデルに３日間共存させた遺伝子発現解析において、対照と比較して２倍以上あるいは１／２倍以下（有意確率ｐ＜０．０５）に発現量が変化した遺伝子について、オンラインのソフトウェアであるＤＡＶＩＤ（Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａ ｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）解析を行った。ＧＯ解析では、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）について解析した。さらに、解析ソフトＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＩＰＡ）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、発現量が有意に変動した遺伝子について、発現量データおよび既存情報をもとに、角層構成成分が皮膚細胞への影響に寄与している経路を予測した。
【0045】
角層構成成分を３次元皮膚モデルに３日間共存させた後の細胞生存率は、共存させない場合と比較して８５．５％であった。また、角層構成成分を３次元皮膚モデルに３日間共存させた後の遺伝子発現解析では、対照と比較して２倍以上あるいは１／２倍以下（有意確率ｐ＜０．０５）に発現量が変化した遺伝子はそれぞれ６７７個及び４５９個であった。これらの遺伝子についてＧＯ解析の結果、発現上昇した遺伝子の機能ではＰｅｐｔｉｄｅ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇやＫｅｒａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔを含む生物学的過程におけるＧＯ ｔｅｒｍが有意に抽出された。これらは表皮分化、角層形成に関与する機能をもつＧＯ ｔｅｒｍであるため、角層構成成分共存３日目では角層形成に関与する遺伝子群の発現が増加していることが示唆された。一方で発現減少した遺伝子の機能ではＳｅｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓやＣｙｓｔｅｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓなどシステイン合成に関与するＧｏ ｔｅｒｍが有意に抽出され、加えて、Ｔｙｐｅ1 ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙやｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓなどのＧＯ ｔｅｒｍも抽出されたため、角層構成成分の共存によりシステイン合成に関連する遺伝子群だけでなく免疫反応に関与する遺伝子群も減少していることが示唆された。
【0046】
続いて、ＩＰＡ解析を行ったところ、角層構成成分の皮膚細胞への影響に寄与している経路として、フェロトーシス、酸化ストレス、表皮過形成・過角化、表皮細胞の分化が挙げられた。また、特にシステイン・セリンのアミノ酸の生合成、細胞増殖・分化が不活性化する影響であることが予測された。
【0047】
２．角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響の確認
角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響を確認するために、以下の実験を実施した。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得たのべ健常者６９名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて角層構成成分試料とした。この角層構成成分 ３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ （ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。対照としては、培養を開始する前の角層構成成分を共存させていない３次元皮膚モデルを０日目の対照とし、また、角層構成成分を共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
角層構成成分を皮膚細胞に共存させた際の影響を確認するために、以下の実験を実施した。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得たのべ健常者６９名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて角層構成成分試料とした。この角層構成成分 ３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ （ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。対照としては、培養を開始する前の角層構成成分を共存させていない３次元皮膚モデルを０日目の対照とし、また、角層構成成分を共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
【0048】
＜実施例１＞
それぞれの時間を培養後、蒸留水で洗浄して共存させた角層構成成分を取り除き、１０％ 分のＷＳＴ－８（同仁化学研究所）を含む培地を０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数１に従って細胞生存率を算出した。
それぞれの時間を培養後、蒸留水で洗浄して共存させた角層構成成分を取り除き、１０％ 分のＷＳＴ－８（同仁化学研究所）を含む培地を０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数１に従って細胞生存率を算出した。
【0049】
【数1】
【0050】
表１に示すように、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは細胞生存率が大きく減少しており、角層構成成分の共存により細胞増殖が減少する、もしくは細胞死が促進することが確認され、細胞生存率が低下することが確認された。
【0051】
【表1】
【0052】
＜実施例２＞
３次元皮膚モデルの細胞内活性酸素種濃度は以下のように測定した。
市販の活性酸素種測定キットであるＯｘｉＳｅｌｅｃｔｔｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ） （ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルにおける細胞内の活性酸素種を定量解析した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本キットは蛍光プローブを用いて活性酸素種を測定するキットであり、活性酸素量を２‘, ７’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （ＤＣＦ）当量として測定することができる。本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、ＤＣＦ／タンパク質量を活性酸素種レベルとして算出した。
３次元皮膚モデルの細胞内活性酸素種濃度は以下のように測定した。
市販の活性酸素種測定キットであるＯｘｉＳｅｌｅｃｔｔｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ） （ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルにおける細胞内の活性酸素種を定量解析した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本キットは蛍光プローブを用いて活性酸素種を測定するキットであり、活性酸素量を２‘, ７’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （ＤＣＦ）当量として測定することができる。本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、ＤＣＦ／タンパク質量を活性酸素種レベルとして算出した。
【0053】
図１に示すように、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは細胞内の活性酸素種レベルが有意に上昇することが確認された。
【0054】
＜実施例３＞ 細胞内鉄濃度
市販の鉄濃度測定キットであるメタロアッセイ 鉄 測定 ＬＳ（フェロジン法）（Ｍｅｔａｌｌｏｇｅｎｉｃ社）を用いて、３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルにおける細胞内の鉄濃度を測定した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、鉄濃度／タンパク質量を算出した
市販の鉄濃度測定キットであるメタロアッセイ 鉄 測定 ＬＳ（フェロジン法）（Ｍｅｔａｌｌｏｇｅｎｉｃ社）を用いて、３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルにおける細胞内の鉄濃度を測定した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、鉄濃度／タンパク質量を算出した
【0055】
図２に示すように、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは細胞内の鉄濃度が有意に上昇することが確認された。
【0056】
＜実施例４＞
３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ） を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、メチオニンからシステインを生合成する経路上の酵素であるシスタチオニンγ-リアーゼ（ＣＴＨ）、シスチン取り込み関連因子であれば還元によりシステインに変換されるシスチンを細胞内に取り込むトランスポーターであるＳＬＣ７Ａ１１、細胞内鉄貯蔵タンパク質であればフェリチン（ＦＴＬ）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて各種遺伝子の発現量を測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、角層構成成分共存による各種遺伝子発現量の変化は、角層構成成分を共存させずに３日間培養した３次元皮膚モデルのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
３次元皮膚モデルに角層構成成分を共存させ、培養後に洗浄して共存させた角層構成成分を取り除いた３次元皮膚モデルから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ） を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、メチオニンからシステインを生合成する経路上の酵素であるシスタチオニンγ-リアーゼ（ＣＴＨ）、シスチン取り込み関連因子であれば還元によりシステインに変換されるシスチンを細胞内に取り込むトランスポーターであるＳＬＣ７Ａ１１、細胞内鉄貯蔵タンパク質であればフェリチン（ＦＴＬ）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて各種遺伝子の発現量を測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、角層構成成分共存による各種遺伝子発現量の変化は、角層構成成分を共存させずに３日間培養した３次元皮膚モデルのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0057】
表２に示すように、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは、角層構成成分を共存させていない対照に対して、システインの生合成に関わるＣＴＨの発現減少および還元によりシステインに変換されるシスチンを細胞内に取り込むトランスポーターであるＳＬＣ７Ａ１１の発現が減少したことから、活性酸素種の消去に重要な役割を果たすシステインが細胞内で減少すると考えられ、一方で細胞内で鉄を貯蔵するＦＴＬの発現が増加したことから細胞内での鉄の貯蔵が促進されると考えられ、角層構成成分が皮膚細胞のフェロトーシスに関与していることが考えられた。
【0058】
【表2】
【0059】
＜実施例５＞
角層構成成分を共存させて３日間培養した３次元皮膚モデルをメスで組織を分離し、ティシュー・テック Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン） 中に包埋し凍結した。クリオスタット （Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ） を使用して５μｍ厚の切片を作成し、一次抗体にＡｎｔｉ－４ Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ａｂｃａｍ社）、二次抗体にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した（倍率２０倍）。
角層構成成分を共存させて３日間培養した３次元皮膚モデルをメスで組織を分離し、ティシュー・テック Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン） 中に包埋し凍結した。クリオスタット （Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ） を使用して５μｍ厚の切片を作成し、一次抗体にＡｎｔｉ－４ Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ａｂｃａｍ社）、二次抗体にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した（倍率２０倍）。
【0060】
図３に示すように、角層構成成分を共存させた３次元皮膚モデルでは、角層構成成分を共存させていない対照に対して、過酸化脂質由来の低分子アルデヒドである４-ヒドロキシ２-ノネナールの量は増加した。このことは、細胞内における活性酸素種である過酸化脂質が増加していることを示しており、過酸化脂質がフェロトーシスで重要な役割を果たすことから、細胞生存率が低下することが確認された。
【0061】
＜皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質のスクリーニング例＞
上記の研究結果に基づき、発明者らは、皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率の低下を指標とし、被験物質を共存させた場合の皮膚細胞における細胞生存率の低下と被験物質を共存させない場合の皮膚細胞における細胞生存率の低下を測定し比較することで、肌荒れ改善効果が期待できる物質をスクリーニングする方法を確立した。以下に一例を示す。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得た健常者６９名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて、これを角層構成成分試料とした。この角層構成成分３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ （ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、さらに被験物質を共存させて、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。被験物質を共存させない場合として、角層構成成分を共存させつつ被験物質を共存させずに培養した。なお、対照としては、角層構成成分を共存させず被験物質も共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
被験物質としては、被験物質である植物（植物Ａ～Ｄ）の乾燥重量に対して１０倍量の水を加え、４時間６０℃に加熱して抽出し、滅菌濾過したものを、抽出物中の乾燥残分が１００ｐｐｍになるように使用した。
培養後に３次元皮膚モデルをＰＢＳ（－）で洗浄し、１０％ 分のＷＳＴ－８（同仁化学研究所）を含む培地を０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式１に従って細胞生存率を算出した。また、活性酸素種測定キットであるＯｘｉＳｅｌｅｃｔｔｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ） （ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、細胞内の活性酸素種濃度を測定した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本キットは蛍光プローブを用いて活性酸素種を測定するキットであり、活性酸素量を２‘, ７’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （ＤＣＦ）当量として測定し、本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、ＤＣＦ当量／タンパク質量を活性酸素種レベルとして算出した。表３と図４にスクリーニングの結果例を示す。細胞生存率の低下を抑制し、活性酸素種レベルの増加を抑制した植物Ａは、角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定することができる。
上記の研究結果に基づき、発明者らは、皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率の低下を指標とし、被験物質を共存させた場合の皮膚細胞における細胞生存率の低下と被験物質を共存させない場合の皮膚細胞における細胞生存率の低下を測定し比較することで、肌荒れ改善効果が期待できる物質をスクリーニングする方法を確立した。以下に一例を示す。
健常者の前腕内側部を洗浄剤で洗浄後、綿棒を５０％エタノール溶液に浸し、前腕内側領域を綿棒で往復擦過することにより角層を採取した。綿棒に付着した角層は、５０％エタノール溶液中で撹拌することで回収し、その後５０％エタノール溶液を留去することで角層を収集した。このようにして、インフォームドコンセントを得た健常者６９名から角層を収集し、収集した角層は１カ所に集合させて、これを角層構成成分試料とした。この角層構成成分３ｍｇを３次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ （ジャパン・ティッシュエンジニアリング）に共存させ、さらに被験物質を共存させて、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。被験物質を共存させない場合として、角層構成成分を共存させつつ被験物質を共存させずに培養した。なお、対照としては、角層構成成分を共存させず被験物質も共存させずに同様に３日間培養した３次元皮膚モデルを３日目の対照として用いた。
被験物質としては、被験物質である植物（植物Ａ～Ｄ）の乾燥重量に対して１０倍量の水を加え、４時間６０℃に加熱して抽出し、滅菌濾過したものを、抽出物中の乾燥残分が１００ｐｐｍになるように使用した。
培養後に３次元皮膚モデルをＰＢＳ（－）で洗浄し、１０％ 分のＷＳＴ－８（同仁化学研究所）を含む培地を０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式１に従って細胞生存率を算出した。また、活性酸素種測定キットであるＯｘｉＳｅｌｅｃｔｔｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＲＯＳ／ＲＮＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ） （ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いて、細胞内の活性酸素種濃度を測定した。操作手順はキットに付属のマニュアルに従った。本キットは蛍光プローブを用いて活性酸素種を測定するキットであり、活性酸素量を２‘, ７’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （ＤＣＦ）当量として測定し、本試験においては、ＢＣＡアッセイにより３次元皮膚モデルのタンパク質量も測定し、ＤＣＦ当量／タンパク質量を活性酸素種レベルとして算出した。表３と図４にスクリーニングの結果例を示す。細胞生存率の低下を抑制し、活性酸素種レベルの増加を抑制した植物Ａは、角層構成成分が引き起こす皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定することができる。
【0062】
【表3】
【0063】
以上の結果から、皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に、皮膚細胞の細胞生存率が低下することが明らかになった。本発明で明らかにした、皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合の皮膚細胞の細胞生存率の低下を指標として用いることにより、角層構成成分を共存させた場合に生じる皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を選定することが可能になり、延いてはこの被験物質を皮膚細胞に角層構成成分を共存させた場合に生じる肌荒れ改善効果が期待できる物質として選定するスクリーニング方法を提供できる。
【0064】
上記の実施例は、本発明の元となる原理・現象を証拠付けるデータの取得のための実験の例を説明するものであり、当業者であれば、これらの実験例に記載された情報、及び、前述した実施形態に関する記載を基に、容易に本発明を実施可能であることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【0065】
以上の結果から、角層構成成分を皮膚細胞に共存させた場合に生じる皮膚細胞の細胞生存率の低下を指標にすることで、角層構成成分が皮膚細胞に及ぼす生理的特性への悪影響を抑制する被験物質を見出すことができる。また、本発明の角層構成成分が皮膚細胞の細胞生存率の低下を抑制する被験物質を含む皮膚外用剤を塗布することにより肌荒れを改善する効果が期待できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
