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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024143793
(43)【公開日】2024-10-11
(54)【発明の名称】抗ブタノロウイルス抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20241003BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20241003BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241003BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241003BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241003BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
C12M1/34 F
A61K39/395 S
A61P31/14
G01N33/569 L
C12P21/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023056675
(22)【出願日】2023-03-30
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】熊谷 啓
(72)【発明者】
【氏名】東條 卓人
(72)【発明者】
【氏名】村上 泰平
【テーマコード（参考）】
4B029
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB13
4B029CC01
4B029FA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B064DA15
4C085AA14
4C085BA52
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA29
4H045EA53
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】特定の遺伝子型のノロウイルス粒子に対して特異的な結合活性を示す抗ブタノロウイルス抗体を提供する。
【解決手段】例えば、ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】例えば、ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項2】
ブタノロウイルス構造タンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
単一ドメイン抗体又はその多量体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項4】
単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項３記載の抗体。
【請求項5】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項6】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。
【請求項8】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ノロウイルスに結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のブタノロウイルスの検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項9】
請求項１～６のいずれか１項記載の抗体を含有するブタノロウイルス検出キット。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか１項記載の抗体を含有するブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は特定の遺伝子型のノロウイルス粒子に対して特異的な結合活性を示す抗ブタノロウイルス抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ノロウイルスはカリシウイルス科に属する，エンベロープを持たない直径約３０～４０ｎｍの球形ウイルスである。ノロウイルスはヒトに対して嘔吐、下痢などの急性胃腸炎症状を起こすが、ヒト以外にも様々な宿主に対して感染性を示すことが報告されている。ノロウイルスのゲノムは約７．６ｋｂの１本鎖（＋）ＲＮＡであり、近年ではゲノム相同性に基づき遺伝子群1（ＧＩ）、遺伝子群２（ＧＩＩ）、遺伝子群３（ＧＩＩＩ）、遺伝子群４（ＧＩＶ）、遺伝子群５（ＧＶ）、遺伝子群６（ＧＶＩ）及び遺伝子群７（ＧＶＩＩ）の７つの遺伝子群に分類されている。このうち、ＧＩがヒト、ＧＩＩがヒト、ブタ、ＧＩＩＩがウシ、ＧＩＶがヒト、ネコ、イヌ、ＧＶがマウス、ＧＶＩ及びＧＶＩＩがイヌへの感染性を示す（非特許文献１参照）。
【0003】
ノロウイルスの各遺伝子群には複数の遺伝子型が存在する。ノロウイルスの場合、各遺伝子型はそれぞれ異なる抗原性を示すが、同一遺伝子型は同じ抗原性を示すとされる。ノロウイルスのゲノムは変異速度が非常に速く、さらに異なる遺伝子型のウイルス間で組換えを起こすことが報告されており、新たな遺伝子型を示すノロウイルスの出現も確認されている。そのため、ノロウイルスを正確に分類することや遺伝子型を識別することは非常に重要である。
【0004】
現在までに、ヒトへの感染性を示すノロウイルス（以下、ヒトノロウイルスと呼ぶ）では、ＧＩノロウイルスとしてＧＩ.1～ＧＩ．９の遺伝子型、ＧＩＩノロウイルスとして少なくともＧＩＩ．１～ＧＩＩ．１０、ＧＩＩ．１２～ＧＩＩ．１７、ＧＩＩ．２０～ＧＩＩ．２２の遺伝子型が報告されている。ヒトノロウイルスは、日本国内においては例年秋から冬を中心に流行する感染性胃腸炎の主要な原因の１つである。ヒトノロウイルスは学校や、医療施設、食品取扱施設などの集団施設に持ち込まれると集団発生を引き起こし、食品を汚染すると食中毒の原因となる。そのため、ヒトノロウイルスの疫学情報は重要であり、国内では厚生労働省や国立感染症研究所などでノロウイルスの遺伝子群、遺伝子型を含めた疫学データの収集が行われている。
【0005】
一方、ヒトノロウイルスと同じＧＩＩに分類されるノロウイルスのうち、ＧＩＩ．１１、ＧＩＩ．１８、ＧＩＩ．１９はブタに感染することが報告されている（以下、ブタノロウイルスと呼ぶ）。これらブタノロウイルスは、ヒトノロウイルスの中でも流行性の高いＧＩＩノロウイルスと近縁であるとされる。現在までに、ブタノロウイルスのヒトへの感染は報告されていない。しかしながら、ＧＩＩノロウイルスにおいて、流行性の高いヒトノロウイルスに近い遺伝子型のブタノロウイルスが報告されている（非特許文献２、３参照）。そのため、ブタはノロウイルスのヒトへの感染源としてだけでなく、新たな組換え型発生のリザーバーとなる可能性としても公衆衛生的問題が懸念されている（非特許文献４参照）。そのため、ブタノロウイルスに関しても疫学調査が行われている。
【0006】
ブタノロウイルスを特異的に検出できることは、ブタノロウイルスの疫学調査を行う上でも重要となる。特に、ヒトノロウイルスとブタノロウイルスは同一の遺伝子群（ＧＩＩ）を形成することから、疫学的情報を得るためには、遺伝子型レベルの識別方法が必要となる。
【0007】
ウイルス由来のタンパク質の検出する方法では抗体が用いられ、例えばイムノクロマト法やＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法を測定原理とした抗原検査法がこれに該当する。ノロウイルスの場合、各遺伝子型はそれぞれ異なる抗原性を示すが、同一遺伝子型は同じ抗原性を示すとされる。また、ノロウイルスの構造タンパク質であるＶＰ１タンパク質には、遺伝子群毎にアミノ酸配列が保存されている領域がする。そのためノロウイルスに対しても、イムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法を測定原理とした抗原検査キットが市販されている。
【0008】
しかし、斯かる市販のキットでは、ＧＩ及びＧＩＩノロウイルスのカプシドタンパク質に幅広く結合するモノクローナル、又はポリクローナルＩｇＧ抗体が用いられているため、ＧＩＩノロウイルスにおいて、遺伝子型を判別できるものはない。また、現在までにブタノロウイルスであるＧＩＩ．１１、ＧＩＩ．１８、ＧＩＩ．１９に対して特異的な抗体として公開されているものはない。ブタノロウイルスに対して優れた結合活性と結合特異性を示す抗体は、ブタノロウイルスの迅速かつ簡便な検出及び識別において重要となるが、ゲノム変異の速度が速く、非常に多くの遺伝子型が報告されているノロウイルスにおいて、遺伝子型レベルの高い特異性を示す抗体を開発することは困難という課題がある。
【0009】
一方、市販されている抗原検査キットの殆どはマウスやウサギ等に由来するモノクローナル、又はポリクローナルＩｇＧ抗体が用いられている。ＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はラクダ科動物が有する重鎖抗体の可変部ドメインからのみなる単一ドメイン抗体の１つである。ＶＨＨはＩｇＧ抗体と同等の結合活性を示しながらも、（１）ＩｇＧ抗体と比較して分子量が１０分の１程度であり、従来の抗体では結合できない新規のエピトープが期待されること、（２）ＩｇＧ抗体とは異なり、可逆性の高いタンパク質構造をもち、熱や圧に対して優れた耐性を示すこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、酵母や細菌等の微生物を用いた生産が可能であること、等の特徴をもつ。さらに、（４）ＶＨＨは、ｃＤＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法等の試験管内の抗体選抜技術との親和性が非常に高く、マウスやウサギ等への免疫によって得られるＩｇＧ抗体と比較して、より短期間に開発することが可能である。そのため、ＶＨＨは医薬品や検査薬に用いられてきたＩｇＧ抗体やＩｇＡ抗体といった従来の免疫グロブリンに代わる抗体としてその利用が期待されている。
【0010】
抗原検査キットの開発においても、ＶＨＨの優位性は明らかである。特に、ＶＨＨが有する特性から、（１）ＶＨＨは粒子やニトロセルロース膜に高密度に固相化することが可能であり、より多くのパラトープを基材上に提示することができること、（２）ＶＨＨはタンパク質としての安定性に優れており、製品のより優れた保存安定性が期待できること、（３）ＶＨＨは微生物によって大量かつ安価に生産可能であるため、製造原価をより低減させることが出来ること、（４）ＶＨＨはイムノクロマト法において非特異的反応の原因となりうるＦｃ領域を有さないこと、がＩｇＧ抗体と比較して優位であると考えられる。
【0011】
このように、ＶＨＨは通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）と比較して性状面、生産面において多くの利点を有している。そのため、ノロウイルスを標的とする単一ドメイン抗体を用いた検出技術は、従来のＩｇＧ抗体を用いた技術よりも性能面、価格面において有利に提供できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus. J Clin Microbiol. 2015;53(2):373-81.
【非特許文献2】Frequent Detection of Noroviruses and Sapoviruses in Swine and High Genetic Diversity of Porcine Sapovirus in Japan during Fiscal Year 2008. J Clin Microbiol. 2010;48(4):1215-1222.
【非特許文献3】Prevalence of Porcine Noroviruses, Molecular haracterization of Emerging Porcine Sapoviruses from Finisher Swine in the United States, and Unified Classification Scheme for Sapoviruses. J Clin Microbiol. 2013;51(7):2344-2353.
【非特許文献4】森光俊晴ら著、「高知県内のブタにおけるノロウイルス調査」高知衛研報、２０１４年、６０巻、ｐ．２５－２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、特定の遺伝子型のノロウイルス粒子に対して特異的な結合活性を示す抗ブタノロウイルス抗体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らはブタノロウイルスとして報告されているＧＩＩ．１１、ＧＩＩ．１８、ＧＩＩ．１９ノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ、Ｖｉｒｕｓ－Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）に特異的な結合活性を示す単一ドメイン抗体を得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、当該標的分子に対して結合特異性の高いクローンを得ることに成功した。
【0015】
すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ノロウイルスに結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のブタノロウイルスの検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するブタノロウイルス検出キット。
５）１）の抗体を含有するブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ノロウイルスに結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のブタノロウイルスの検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するブタノロウイルス検出キット。
５）１）の抗体を含有するブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、ＧＩＩ．１１、ＧＩＩ．１８、ＧＩＩ．１９のノロウイルス粒子に対して反応性の高い単一ドメイン抗体を提供することができる。本発明の抗体はブタノロウイルス粒子に対して優れた特異性を示すことから、当該抗体を用いることにより、ブタノロウイルスの特異的な検出、すなわちブタノロウイルス感染症の迅速な検出が可能となる。また、ノロウイルス陽性検体に対して、当該抗体を用いてノロウイルスの検査を行い、反応しないことを確認することによって、当該検体に含まれるノロウイルスがブタノロウイルスであることを確認することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＳＤＳ―ＰＡＧＥによるブタノロウイルスＶＬＰの検出。
【図2】選抜後のＤＮＡライブラリ中に含まれる各ＶＨＨクローンの出現頻度。
【図3】ファージＥＬＩＳＡによるライブラリの力価確認。
【図4】ファージＥＬＩＳＡによるＶＨＨの選抜。
【図5】ＳＤＳ―ＰＡＧＥによるＨｉｓタグ付きＶＨＨの検出。
【図6】ＥＬＩＳＡによる抗ＧＩＩノロウイルスポリクローナル抗体の活性評価。
【図7】ラテラルフローアッセイで得られる呈色の判断基準。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明のノロウイルスに結合する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、抗ブタノロウイルス モノクローナル抗体である。
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＳＭＹＳＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＷＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＤＦＳＦＬＳＲＣＫＬＧＳＳＧＹＤＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＩＶＦＳＶＹＰＭＧ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＮＳＦＨＮＴＴ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＡＹＲＲＬＣＰＩＥＥＹＧＭＤＦ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＶＧ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＡＷＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＦＰＴＬＶＡＬＰＹＥＹＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＩＴＦＳＮＴＡＭＴ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＮＫＳＧＤＥＶＡ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＹＦＧＳ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＳＩＦＳＦＮＡＭＡ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＴＳＧＧＲＴＳ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＲＷＡＴＮＳＩＡＩＲＱＶＥＳＹＤＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【0019】
ブタノロウイルスは、カリシウイルス科に属する、エンベロープを持たない直径約３０～４０ｎｍの球形ウイルスであり、ブタノロウイルス感染症の原因となる。本発明の抗体は、ブタノロウイルス（ＧＩＩ．１１、ＧＩＩ．１８、ＧＩＩ．１９）に結合する抗体であるが、詳細には、当該ブタノロウイルスの構造タンパク質及びその複合体に結合する抗体である。この複合体には、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＶＰ１タンパク質およびその複合体が含まれる。
【0020】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0021】
なお、ノロウイルスに対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、表面プラズモン共鳴法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えばＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法等を用いた方法によっても評価できる。
【0022】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
ＦＲ１：
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号１６）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１７）
ＡＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＴＡＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳ（配列番号１８）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＱＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＩＶＳ（配列番号１９）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ（配列番号２０）
ＦＲ２：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号２１）
ＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＡ（配列番号２２）
ＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳ（配列番号２３）
ＷＹＲＱＶＰＧＫＱＲＥＦＩＡ（配列番号２４）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＳＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴ（配列番号２５）、
ＹＥＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＡＶＹＬＱＭＮＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２６）、
ＹＤＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２７）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＨＡ（配列番号２８）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＲＭＮＳＬＲＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２９）、
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３０）
ＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３１）
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
ＦＲ１：
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号１６）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１７）
ＡＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＴＡＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳ（配列番号１８）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＱＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＩＶＳ（配列番号１９）
ＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ（配列番号２０）
ＦＲ２：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号２１）
ＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＡ（配列番号２２）
ＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳ（配列番号２３）
ＷＹＲＱＶＰＧＫＱＲＥＦＩＡ（配列番号２４）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＳＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴ（配列番号２５）、
ＹＥＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＡＶＹＬＱＭＮＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２６）、
ＹＤＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２７）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＨＡ（配列番号２８）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＲＭＮＳＬＲＰＥＤＳＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２９）、
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３０）
ＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３１）
【0023】
配列番号１６～３１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0024】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0025】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３２）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３３）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３４）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３５）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３６）を有する抗体は、それぞれ、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ノロウイルスの構造タンパク質に対して反応性の高いクローン（配列番号３２がＮｏＶＨＨ２００、配列番号３３がＮｏＶＨＨ２０１、配列番号３４がＮｏＶＨＨ１９１Ｅ、配列番号３５がＮｏＶＨＨ５３、配列番号３６がＮｏＶＨＨ５４、である。）であり、好適な抗ブタノロウイルス モノクローナル抗体である。
【0026】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、単一ドメイン抗体（ナノボディーとも呼ばれる）や、単一ドメイン抗体が複数結合した多量体（例えば二量体）であり得る。多量体には、本発明の構造ドメインが複数連結した多量体の他、当該構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる他の構造ドメインの１又は複数が連結した多量体が含まれる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はブタの免疫系を回避する改変が加えられていてもよい。ブタの免疫系を回避する改変が加えられた抗体は、ブタに投与することが可能であるため、家畜用医薬として応用することができる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はブタの免疫系を回避する改変が加えられていてもよい。ブタの免疫系を回避する改変が加えられた抗体は、ブタに投与することが可能であるため、家畜用医薬として応用することができる。
【0027】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸をコドン最適化などの工程を経ることにより宿主細胞における目的の抗体の発現に最適化された人工遺伝子を設計し、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0028】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。 抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0029】
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0030】
本発明の抗体は、ブタノロウイルスの構造タンパク質に結合することから、これを、ブタノロウイルスを含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にブタノロウイルスが存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたブタノロウイルスの検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のブタノロウイルスとの結合体を形成させる工程と、前記結合体中のブタノロウイルスを検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ブタノロウイルス抗体（例えば血清抗体）に対して、ブタノロウイルスの構造タンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるブタノロウイルス抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたブタノロウイルスの検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のブタノロウイルスとの結合体を形成させる工程と、前記結合体中のブタノロウイルスを検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ブタノロウイルス抗体（例えば血清抗体）に対して、ブタノロウイルスの構造タンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるブタノロウイルス抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0031】
被験試料としては、特に限定されないが、生物学的試料（例えば、唾液、体液、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等）の他、ブタノロウイルスに汚染されている可能性のある溶液、固体表面等が挙げられる。
被験試料は、ＶＬＰへの結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のブタノロウイルスを検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ブタノロウイルス抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のブタノロウイルスを検出してもよい。
被験試料は、ＶＬＰへの結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のブタノロウイルスを検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ブタノロウイルス抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のブタノロウイルスを検出してもよい。
【0032】
また、本発明の抗体は、ブタノロウイルス検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ブタノロウイルス感染症の診断薬として、またブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ブタノロウイルス抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する抗ブタノロウイルス抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ブタノロウイルス抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する抗ブタノロウイルス抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0033】
斯かるブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0034】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体。
（ａ）（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞ブタノロウイルス構造タンパク質、好ましくはブタノロウイルスＶＰ１から成るウイルス構造タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞単一ドメイン抗体又はその多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、＜３＞の抗体。
＜５＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体、好ましくは二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ブタノロウイルスに結合する抗体。
（ａ）（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞ブタノロウイルス構造タンパク質、好ましくはブタノロウイルスＶＰ１から成るウイルス構造タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞単一ドメイン抗体又はその多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、＜３＞の抗体。
＜５＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体、好ましくは二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
【0035】
＜７＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１６、１７、１８、１９又は２０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２５、２６、２７、２８又は２９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号３０又は３１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３２）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３３）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３４）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３５）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体をコードする核酸。
＜１５＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ノロウイルスに結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のブタノロウイルスの検出方法。
（ａ）（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１６＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するブタノロウイルス検出キット。
＜１７＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１６、１７、１８、１９又は２０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２５、２６、２７、２８又は２９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号３０又は３１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３２）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３３）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３４）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３５）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３０で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞＜１＞～＜１３＞のいずれかの抗体をコードする核酸。
＜１５＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ノロウイルスに結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のブタノロウイルスの検出方法。
（ａ）（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１６＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するブタノロウイルス検出キット。
＜１７＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するブタノロウイルス感染症の予防又は治療薬。
【実施例0036】
（実施例１）ノロウイルスのウイルス様中空粒子の作製
１－１．使用細胞株、培地及びプライマー
本検討で用いた菌株、細胞株を表１に示す。ＤＨ５α及びＤＨ１０ｂａｃの培養には、ＬＢ培地（ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７～７．４、和光純薬）を用いた。寒天培地の場合は、１５ｇ／Ｌのアガロース（和光純薬）を含む。培養は３７℃で行い、必要に応じて振とうした（２００ｒｐｍ）。また、形質転換時には必要に応じて、抗生物質等を添加した。
Ｓｆ９の培養には、Ｓｆ－９００ＩＩＩ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。使用にあたっては、培地１Ｌ当たり１００００ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０ｍＬ添加した（以下、Ｓｆ９００培地と表記）。Ｈ５の培養には、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。使用にあたっては、培地１Ｌ当たり１００００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０ ｍＬ、２００ ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００ｍＬ添加した（以下、Ｈ５培地と表記）。Ｓｆ９、Ｈ５ともに、培養温度は２７℃で行った。細胞の継代培養は、Ｔフラスコ（ベクトンディッキンソン社製）を用いた静置培養系で行った。バキュロウイルスの増幅やＶＬＰ生産は、三角フラスコを用いた浮遊培養系で行った。
１－１．使用細胞株、培地及びプライマー
本検討で用いた菌株、細胞株を表１に示す。ＤＨ５α及びＤＨ１０ｂａｃの培養には、ＬＢ培地（ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７～７．４、和光純薬）を用いた。寒天培地の場合は、１５ｇ／Ｌのアガロース（和光純薬）を含む。培養は３７℃で行い、必要に応じて振とうした（２００ｒｐｍ）。また、形質転換時には必要に応じて、抗生物質等を添加した。
Ｓｆ９の培養には、Ｓｆ－９００ＩＩＩ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。使用にあたっては、培地１Ｌ当たり１００００ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０ｍＬ添加した（以下、Ｓｆ９００培地と表記）。Ｈ５の培養には、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。使用にあたっては、培地１Ｌ当たり１００００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０ ｍＬ、２００ ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００ｍＬ添加した（以下、Ｈ５培地と表記）。Ｓｆ９、Ｈ５ともに、培養温度は２７℃で行った。細胞の継代培養は、Ｔフラスコ（ベクトンディッキンソン社製）を用いた静置培養系で行った。バキュロウイルスの増幅やＶＬＰ生産は、三角フラスコを用いた浮遊培養系で行った。
【0037】
【表1】
【0038】
１－２．遺伝子の人工合成
公共の遺伝子データベースであるＮｏｒｏＮｅｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｖｍ．ｎｌ／ｅｎ／ｎｏｒｏｎｅｔ）または、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より、ノロウイルスカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２およびＯＲＦ３の配列を入手した。入手したウイルス遺伝子型の株名、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．等の一覧を表２に示す。配列を入手できた遺伝子型については、ＯＲＦ２／ＯＲＦ３配列の５‘側にＯＲＦ２上流の４塩基（ＧＩ型；ＧＴＡＡ、ＧＩＩ型；ＧＴＧＡ）、３’側にそれぞれの遺伝子型の３‘－非翻訳領域（ＵＴＲ、表３）を付加し、目的の遺伝子コンストラクトを設計した。設計した目的コンストラクトは、人工遺伝子合成によって取得した。ＧＩＩ．２とＧＩＩ．３についてはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成を依頼し、目的のコンストラクトが挿入されたｐＵＣ５７ベクターを得た。それ以外の遺伝子型についてはＦＡＳＭＡＣ社に合成を依頼し、目的のコンストラクトが挿入されたｐＵＣＦａベクターを得た。ＧＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４以外のコンストラクトについては、タンパク質発現用細胞であるＨ５のコドン頻度に対応するように配列の最適化を行った。
公共の遺伝子データベースであるＮｏｒｏＮｅｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｖｍ．ｎｌ／ｅｎ／ｎｏｒｏｎｅｔ）または、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より、ノロウイルスカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２およびＯＲＦ３の配列を入手した。入手したウイルス遺伝子型の株名、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．等の一覧を表２に示す。配列を入手できた遺伝子型については、ＯＲＦ２／ＯＲＦ３配列の５‘側にＯＲＦ２上流の４塩基（ＧＩ型；ＧＴＡＡ、ＧＩＩ型；ＧＴＧＡ）、３’側にそれぞれの遺伝子型の３‘－非翻訳領域（ＵＴＲ、表３）を付加し、目的の遺伝子コンストラクトを設計した。設計した目的コンストラクトは、人工遺伝子合成によって取得した。ＧＩＩ．２とＧＩＩ．３についてはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成を依頼し、目的のコンストラクトが挿入されたｐＵＣ５７ベクターを得た。それ以外の遺伝子型についてはＦＡＳＭＡＣ社に合成を依頼し、目的のコンストラクトが挿入されたｐＵＣＦａベクターを得た。ＧＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４以外のコンストラクトについては、タンパク質発現用細胞であるＨ５のコドン頻度に対応するように配列の最適化を行った。
【0039】
【表2】
【0040】
【表3】
【0041】
１－３．ＮｏＶ遺伝子のｐＤＥＳＴ８ベクターへの挿入
人工合成したコンストラクトを含むプラスミドベクターを鋳型に、表４のプライマーを用いてＰＣＲにより各ＮｏＶ遺伝子断片を増幅した。また、ｐＤＥＳＴ８ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を鋳型に、インバースＰＣＲ用プライマー（配列番号８７、配列番号８８）を用いて直鎖状のｐＤＥＳＴ８ベクターを得た。ＰＣＲ酵素にはＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。それぞれのＮｏＶ遺伝子断片は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＤＥＳＴ８ベクターに挿入した。表５のようにＮｏＶ遺伝子断片と直鎖状ｐＤＥＳＴ８ベクターと反応試薬を混合し、５０℃で１５分インキュベートさせ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を得た。
人工合成したコンストラクトを含むプラスミドベクターを鋳型に、表４のプライマーを用いてＰＣＲにより各ＮｏＶ遺伝子断片を増幅した。また、ｐＤＥＳＴ８ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を鋳型に、インバースＰＣＲ用プライマー（配列番号８７、配列番号８８）を用いて直鎖状のｐＤＥＳＴ８ベクターを得た。ＰＣＲ酵素にはＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。それぞれのＮｏＶ遺伝子断片は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＤＥＳＴ８ベクターに挿入した。表５のようにＮｏＶ遺伝子断片と直鎖状ｐＤＥＳＴ８ベクターと反応試薬を混合し、５０℃で１５分インキュベートさせ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を得た。
【0042】
【表4】
【0043】
【表5】
【0044】
１－４．ＤＨ５αの形質転換
氷上で融解したＤＨ５αのコンピテントセル１００μＬにＩｎｆｕｓｉｏｎ反応液を２．５μＬ添加し、穏やかに混合した。氷上で５分静置後、４２℃で４５秒間インキュベートし、氷上で２分静置した。ＬＢ培地を１ｍＬ添加し、適当に希釈した溶液をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーをピックアップし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて培養液からプラスミドを抽出し、目的コンストラクトが挿入されたｐＤＥＳＴ８ベクターを得た。
氷上で融解したＤＨ５αのコンピテントセル１００μＬにＩｎｆｕｓｉｏｎ反応液を２．５μＬ添加し、穏やかに混合した。氷上で５分静置後、４２℃で４５秒間インキュベートし、氷上で２分静置した。ＬＢ培地を１ｍＬ添加し、適当に希釈した溶液をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーをピックアップし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて培養液からプラスミドを抽出し、目的コンストラクトが挿入されたｐＤＥＳＴ８ベクターを得た。
【0045】
１－５．組み換えＢａｃｍｉｄ（ｒＢａｃｍｉｄ）の構築
氷上でＤＨ１０Ｂａｃのコンピテントセルを融解し、コンピテントセル５０μＬにｐＤＥＳＴ８ベクター溶液を１μＬ（終濃度１００ｎｇ）添加した。１－４と同様にヒートショックによりｐＤＥＳＴ８ベクターを導入した。ヒートショック後の菌体にＳＯＣ培地を９００μＬ添加し、３７℃、２００ｒｐｍで４時間回復培養を行った。適当に希釈した菌液を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μg／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４０μg／ｍＬ ＩＰＴＧ、１００μｇ／ｍＬ Ｘ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃で静置培養し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、7 μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μg／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に白色のコロニーをピックアップした。目的配列が含まれた形質転換体は、ＰＣＲにより選択した。目的の形質転換体を５０μg／ｍＬカナマイシン、７μg／ｍＬゲンタマイシン、１０μg/ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて培養液からｒＢａｃｍｉｄを抽出した。
氷上でＤＨ１０Ｂａｃのコンピテントセルを融解し、コンピテントセル５０μＬにｐＤＥＳＴ８ベクター溶液を１μＬ（終濃度１００ｎｇ）添加した。１－４と同様にヒートショックによりｐＤＥＳＴ８ベクターを導入した。ヒートショック後の菌体にＳＯＣ培地を９００μＬ添加し、３７℃、２００ｒｐｍで４時間回復培養を行った。適当に希釈した菌液を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μg／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４０μg／ｍＬ ＩＰＴＧ、１００μｇ／ｍＬ Ｘ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃で静置培養し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、7 μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μg／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に白色のコロニーをピックアップした。目的配列が含まれた形質転換体は、ＰＣＲにより選択した。目的の形質転換体を５０μg／ｍＬカナマイシン、７μg／ｍＬゲンタマイシン、１０μg/ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて培養液からｒＢａｃｍｉｄを抽出した。
【0046】
１－６．昆虫細胞へのｒＢａｃｍｉｄの導入
目的コンストラクトを持つ組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得るため、トランスフェクションによりｒＢａｃｍｉｄをＳｆ９細胞に導入した。６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社製）に、８．５ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるようにＳｆ９を播種しプレート底面に定着させた。細胞が定着する間に、以下の手順でトランスフェクション試薬を調製した。８μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と１００μＬのＧｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ， Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合した。この溶液に、Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ， Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄで２５μｇ／ｍＬとなるように調製したｒＢａｃｍｉｄ溶液を１００μＬ加え、ピペッティングで穏やかに混合したのち、室温で１５分インキュベートした。顕微鏡で細胞が定着したことを確認し、培地を除去した。プレーティング培地（１．５ｍＬ Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ、８．５ ｍＬ Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を２．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。調製したトランスフェクション試薬を全量ウェルに添加し、２７℃で３～５時間インキュベートした。上清を除去し、Ｓｆ９００培地を２ｍＬ添加した。培養液の蒸発を防ぐためラップで包み、アルミホイルで遮光して、２７℃で１週間静置培養した。回収した培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清をＰ０ ｒＢＶシードとした。
目的コンストラクトを持つ組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得るため、トランスフェクションによりｒＢａｃｍｉｄをＳｆ９細胞に導入した。６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社製）に、８．５ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるようにＳｆ９を播種しプレート底面に定着させた。細胞が定着する間に、以下の手順でトランスフェクション試薬を調製した。８μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と１００μＬのＧｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ， Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合した。この溶液に、Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ， Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄで２５μｇ／ｍＬとなるように調製したｒＢａｃｍｉｄ溶液を１００μＬ加え、ピペッティングで穏やかに混合したのち、室温で１５分インキュベートした。顕微鏡で細胞が定着したことを確認し、培地を除去した。プレーティング培地（１．５ｍＬ Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ、８．５ ｍＬ Ｇｒａｃｅ’ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ Ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を２．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。調製したトランスフェクション試薬を全量ウェルに添加し、２７℃で３～５時間インキュベートした。上清を除去し、Ｓｆ９００培地を２ｍＬ添加した。培養液の蒸発を防ぐためラップで包み、アルミホイルで遮光して、２７℃で１週間静置培養した。回収した培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清をＰ０ ｒＢＶシードとした。
【0047】
１－７．ｒＢＶシードの増幅
２５０ｍＬ容三角フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ社製）に４ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＳｆ９細胞液を３０ｍＬ添加した。そこに、Ｐ０ ｒＢＶシード溶液を１ｍＬ添加し、２７℃、１２５ｒｐｍで1週間、旋回条件にて振とう培養した。培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、回収した上清をＰ１ ｒＢＶシードとした。ｒＢＶシードの感染力価はプラークアッセイによって測定した。取得したｒＢＶシードは、１ｍＬずつ分注し、－８０℃で凍結保存した。ｒＢＶシードの感染力価が不十分な場合は、必要に応じて同様の手順でさらに増幅を行った。
２５０ｍＬ容三角フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ社製）に４ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＳｆ９細胞液を３０ｍＬ添加した。そこに、Ｐ０ ｒＢＶシード溶液を１ｍＬ添加し、２７℃、１２５ｒｐｍで1週間、旋回条件にて振とう培養した。培養液を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、回収した上清をＰ１ ｒＢＶシードとした。ｒＢＶシードの感染力価はプラークアッセイによって測定した。取得したｒＢＶシードは、１ｍＬずつ分注し、－８０℃で凍結保存した。ｒＢＶシードの感染力価が不十分な場合は、必要に応じて同様の手順でさらに増幅を行った。
【0048】
１－８．プラークアッセイ－１
６ウェルプレートに、２．４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるようにＳｆ９を播種した。室温で静置し細胞を定着させた後、上清を除去し、新しいＳｆ９００培地を９００μＬ添加した。Ｓｆ９００培地で１０倍ずつ希釈したｒＢＶシード溶液を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。アルミホイルで遮光し、１５分ごとに穏やかに攪拌しながら２７℃で１時間インキュベートした。上清を除去し、表６のように調製したＯｖｅｒｌａｙ１培地を３ｍＬずつ各ウェルに添加した。固化するまで室温で静置したのち、プレートをラップとアルミホイルで包み、プレートを上下反転させて２７℃で４日間静置培養した。
６ウェルプレートに、２．４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるようにＳｆ９を播種した。室温で静置し細胞を定着させた後、上清を除去し、新しいＳｆ９００培地を９００μＬ添加した。Ｓｆ９００培地で１０倍ずつ希釈したｒＢＶシード溶液を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。アルミホイルで遮光し、１５分ごとに穏やかに攪拌しながら２７℃で１時間インキュベートした。上清を除去し、表６のように調製したＯｖｅｒｌａｙ１培地を３ｍＬずつ各ウェルに添加した。固化するまで室温で静置したのち、プレートをラップとアルミホイルで包み、プレートを上下反転させて２７℃で４日間静置培養した。
【0049】
【表6】
【0050】
１－９．プラークアッセイ－２
表７のように試薬を混合し、Ｏｖｅｒｌａｙ２培地を調製した。Ｏｖｅｒｌａｙ２培地培地を各ウェルに２ｍＬずつ重層し、室温で静置して固化させた。プレートをラップとアルミホイルで包み、プレートを上下反転させて２７℃で２日間静置培養した。プラークを目視で確認できるようになったら、プレートの底から白色光を当てて、適当な希釈倍率のウェルのプラークをカウントした。２ウェルのプラーク数の平均値に希釈倍率をかけ、さらに１０倍を掛けた値をｒＢＶシードの感染力価（ｐｆｕ／ｍＬ）とした。
表７のように試薬を混合し、Ｏｖｅｒｌａｙ２培地を調製した。Ｏｖｅｒｌａｙ２培地培地を各ウェルに２ｍＬずつ重層し、室温で静置して固化させた。プレートをラップとアルミホイルで包み、プレートを上下反転させて２７℃で２日間静置培養した。プラークを目視で確認できるようになったら、プレートの底から白色光を当てて、適当な希釈倍率のウェルのプラークをカウントした。２ウェルのプラーク数の平均値に希釈倍率をかけ、さらに１０倍を掛けた値をｒＢＶシードの感染力価（ｐｆｕ／ｍＬ）とした。
【0051】
【表7】
【0052】
１－１０．ＶＬＰの生産
ＶＬＰ生産は、２５０ｍＬ容三角フラスコを用いた浮遊培養系で行った。終濃度が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨ５培地で調製したＨ５細胞液とｒＢＶシードを２５０ｍＬ容三角フラスコに添加し、４０ｍＬの培養液量でＶＬＰ生産を行った。ｒＢＶシードは、ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１以上となるように培養液に加えた。フラスコをアルミホイルで遮光し、２７℃、１２５ｒｐｍの条件で1週間振とう培養した。培養開始から二日後にプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加した。プロテアーゼインヒビターは、Ｈ５培地１ｍＬに対して１錠を溶解し、培地１０ｍＬあたり１００μＬ添加した。
ＶＬＰ生産は、２５０ｍＬ容三角フラスコを用いた浮遊培養系で行った。終濃度が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨ５培地で調製したＨ５細胞液とｒＢＶシードを２５０ｍＬ容三角フラスコに添加し、４０ｍＬの培養液量でＶＬＰ生産を行った。ｒＢＶシードは、ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１以上となるように培養液に加えた。フラスコをアルミホイルで遮光し、２７℃、１２５ｒｐｍの条件で1週間振とう培養した。培養開始から二日後にプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加した。プロテアーゼインヒビターは、Ｈ５培地１ｍＬに対して１錠を溶解し、培地１０ｍＬあたり１００μＬ添加した。
【0053】
１－１１．ＶＬＰの精製
培養液全量を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、大まかに細胞を取り除いた。さらに、１１０００ｒｐｍ、１ｈ、４℃で遠心し、上清を新しい遠心管に回収した。この上清を遠心チューブ（ベックマンコールター社製）に移し、Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００（ベックマンコールター社製）とＳＷ３２－Ｔｉローターを用いて３２０００ｒｐｍ、２ｈ、４℃の条件で超遠心を行い、ＶＬＰを含むタンパク質を沈殿させた。上清を捨て、新しいＨ５培地を１ｍＬ添加して４℃で数時間静置し、ペレットを膨潤させた。膨潤したペレットを沈殿物がなくなるまでピペッティングでよく懸濁した。チューブあたり１．８ｇのＣｓＣｌ（富士フィルム和光純薬社製）を量り取り、２ｍＬのＨ５培地に溶解させ、ペレットの懸濁液と混合した。混合液を遠心チューブ（ベックマンコールター社製）に入れ、ＳＷ５５－Ｔｉローターを用いて、４０，０００ｒｐｍ、２０ｈ、４℃の条件で超遠心を行った。遠心後、チューブ上方から白色光を当て、ＶＬＰ由来のバンド部分のみをピペットマンで回収した。回収した溶液は、ペレットダウン用遠心チューブに移した。１ｘＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でメスアップをして、３２０００ｒｐｍ、２ｈ、４℃の条件で超遠心を行い、ＶＬＰを沈殿させた。上清を捨て、新しいＨ５培地を添加して４℃で一晩静置し、ペレットを膨潤させた。膨潤したペレットをピペッティングでよく懸濁し、精製ＶＬＰ溶液を得た。
培養液全量を８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、大まかに細胞を取り除いた。さらに、１１０００ｒｐｍ、１ｈ、４℃で遠心し、上清を新しい遠心管に回収した。この上清を遠心チューブ（ベックマンコールター社製）に移し、Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００（ベックマンコールター社製）とＳＷ３２－Ｔｉローターを用いて３２０００ｒｐｍ、２ｈ、４℃の条件で超遠心を行い、ＶＬＰを含むタンパク質を沈殿させた。上清を捨て、新しいＨ５培地を１ｍＬ添加して４℃で数時間静置し、ペレットを膨潤させた。膨潤したペレットを沈殿物がなくなるまでピペッティングでよく懸濁した。チューブあたり１．８ｇのＣｓＣｌ（富士フィルム和光純薬社製）を量り取り、２ｍＬのＨ５培地に溶解させ、ペレットの懸濁液と混合した。混合液を遠心チューブ（ベックマンコールター社製）に入れ、ＳＷ５５－Ｔｉローターを用いて、４０，０００ｒｐｍ、２０ｈ、４℃の条件で超遠心を行った。遠心後、チューブ上方から白色光を当て、ＶＬＰ由来のバンド部分のみをピペットマンで回収した。回収した溶液は、ペレットダウン用遠心チューブに移した。１ｘＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でメスアップをして、３２０００ｒｐｍ、２ｈ、４℃の条件で超遠心を行い、ＶＬＰを沈殿させた。上清を捨て、新しいＨ５培地を添加して４℃で一晩静置し、ペレットを膨潤させた。膨潤したペレットをピペッティングでよく懸濁し、精製ＶＬＰ溶液を得た。
【0054】
１－１２．ＶＬＰの定量
ブラッドフォード法により、ＶＬＰ濃度を定量した。０．５ｍｇ／ｍＬから０．０６７ ｍｇ／ｍＬまで２倍希釈したＢＳＡを標準物質とした。８００μLのイオン交換水に２００μLの染色液（バイオラッド社製）を添加し、適当に希釈したサンプルを２０μL加えてよく混合した。室温で５分静置し、分光光度計で６００ｎｍの吸光度を測定した。
ブラッドフォード法により、ＶＬＰ濃度を定量した。０．５ｍｇ／ｍＬから０．０６７ ｍｇ／ｍＬまで２倍希釈したＢＳＡを標準物質とした。８００μLのイオン交換水に２００μLの染色液（バイオラッド社製）を添加し、適当に希釈したサンプルを２０μL加えてよく混合した。室温で５分静置し、分光光度計で６００ｎｍの吸光度を測定した。
【0055】
１－１３．ＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析
ＶＬＰの取得は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＶＰ１タンパク質の検出により確認した。1 μgが泳動されるように調製したサンプル６．５μＬと２．５μＬの４ｘＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）、１μＬの１０ｘＳａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）を混合し、１００℃で５分間熱処理した。ＮｕＰＡＧＥ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）を用いて、定圧２００Ｖ、４０ｍｉｎの条件で泳動を行った。泳動後、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）でゲルを染色した。水道水で脱色後、スキャナー（ＥＰＳＯＮ社製、ＧＴ－９３００ＵＦ）でゲル画像を取り込んだ（図１）。その結果、目的となるノロウイルスＶＰ１タンパク質の合成が確認された。
ＶＬＰの取得は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＶＰ１タンパク質の検出により確認した。1 μgが泳動されるように調製したサンプル６．５μＬと２．５μＬの４ｘＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）、１μＬの１０ｘＳａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）を混合し、１００℃で５分間熱処理した。ＮｕＰＡＧＥ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）を用いて、定圧２００Ｖ、４０ｍｉｎの条件で泳動を行った。泳動後、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）でゲルを染色した。水道水で脱色後、スキャナー（ＥＰＳＯＮ社製、ＧＴ－９３００ＵＦ）でゲル画像を取り込んだ（図１）。その結果、目的となるノロウイルスＶＰ１タンパク質の合成が確認された。
【0056】
（実施例２）ｃＤＮＡディスプレイ法によるＶＨＨの選抜
２－１．ＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ調整用のｃＤＮＡ作製
完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されている２種類のアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリ遺伝子であるＳヒンジ及びＬヒンジを鋳型として、ＳヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号１２６、１２７）及びＬヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号１２６、１２８）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号１２９、１３０）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリを作製した。
２－１．ＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ調整用のｃＤＮＡ作製
完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されている２種類のアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリ遺伝子であるＳヒンジ及びＬヒンジを鋳型として、ＳヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号１２６、１２７）及びＬヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号１２６、１２８）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号１２９、１３０）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリを作製した。
【0057】
２－２．ｃＤＮＡディスプレイの作製
それぞれのｃＤＮＡディスプレイを以下の２－３～２－７の手順に従い、調製した。使用するバッファーは表８に記載した。
それぞれのｃＤＮＡディスプレイを以下の２－３～２－７の手順に従い、調製した。使用するバッファーは表８に記載した。
【0058】
【表8】
【0059】
２－３．転写
２－１で作製した全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリを、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って転写した。使用したＤＮＡ量は６．６μｇとした。その後のセレクション毎のＤＮＡ量は、２ｎｄラウンド以降は０．１～１μｇとした。得られた転写産物は、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製産物はＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ社製）により濃度定量した。
２－１で作製した全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリを、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って転写した。使用したＤＮＡ量は６．６μｇとした。その後のセレクション毎のＤＮＡ量は、２ｎｄラウンド以降は０．１～１μｇとした。得られた転写産物は、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製産物はＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ社製）により濃度定量した。
【0060】
２－４．ライゲーション
精製した２０ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌ ピューロマイシン・リンカーであるｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ リンカー（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に、ＮａＣｌ（終濃度０．２Ｍ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、終濃度 ０．０５Ｍ）を加え、９０ ℃で１分間インキュベートした。その後、０．１℃／秒の速度で７０℃まで降温させ、７０℃で１分間インキュベートした。次いで、０．１℃／秒の速度で２５℃まで降温させ、２℃／秒の速度で１０℃まで降温させ、ｃｎｖＫリンカーをｍＲＮＡの３’末端側にハイブリダイズさせた。その後、ＵＶＰ ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｅｒ（ＣＬ―３０００）、３６５ｎｍ，１００―１１５Ｖ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ社製）を使用して、３６５ｎｍのＵＶを４０６０ｍＪ／ｃｍ２照射し、ｃｎｖＫリンカーとｍＲＮＡを光架橋させ、ｍＲＮＡ－リンカー複合体を得た。
精製した２０ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌ ピューロマイシン・リンカーであるｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ リンカー（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に、ＮａＣｌ（終濃度０．２Ｍ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、終濃度 ０．０５Ｍ）を加え、９０ ℃で１分間インキュベートした。その後、０．１℃／秒の速度で７０℃まで降温させ、７０℃で１分間インキュベートした。次いで、０．１℃／秒の速度で２５℃まで降温させ、２℃／秒の速度で１０℃まで降温させ、ｃｎｖＫリンカーをｍＲＮＡの３’末端側にハイブリダイズさせた。その後、ＵＶＰ ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｅｒ（ＣＬ―３０００）、３６５ｎｍ，１００―１１５Ｖ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ社製）を使用して、３６５ｎｍのＵＶを４０６０ｍＪ／ｃｍ２照射し、ｃｎｖＫリンカーとｍＲＮＡを光架橋させ、ｍＲＮＡ－リンカー複合体を得た。
【0061】
２－５．ｍＲＮＡディスプレイの調製
６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－リンカー複合体を、５０μＬスケールの無細胞翻訳系（Ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｒｅａｔｅｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭｇＣＬ２及びＫＣＬをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加えて３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡ－リンカー上のピューロマイシンにｍＲＮＡに対応するペプチドをディスプレイした。次いで、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度７０ｍＭ になるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡディスプレイを調製した。
６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－リンカー複合体を、５０μＬスケールの無細胞翻訳系（Ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｒｅａｔｅｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭｇＣＬ２及びＫＣＬをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加えて３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡ－リンカー上のピューロマイシンにｍＲＮＡに対応するペプチドをディスプレイした。次いで、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度７０ｍＭ になるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡディスプレイを調製した。
【0062】
２－６．ｃＤＮＡディスプレイの調製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｂｉｎｄ Ｔｕｂｅに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を６０μＬ入れ、２００μＬの結合バッファーで洗浄した後、上記２－５の方法で調製したｍＲＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬの結合バッファーで洗浄し後、表７に示す組成の反応液中にて４２℃，３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行い、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体を調製した。２００μＬの結合バッファーで洗浄後、３９μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーと、１μＬの１，０００Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ Ｔ１とを加え３７℃１５分撹拌することによってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体（以下、ｃＤＮＡディスプレイと呼ぶ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（ベリタス社製）から溶出した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｂｉｎｄ Ｔｕｂｅに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を６０μＬ入れ、２００μＬの結合バッファーで洗浄した後、上記２－５の方法で調製したｍＲＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬの結合バッファーで洗浄し後、表７に示す組成の反応液中にて４２℃，３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行い、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体を調製した。２００μＬの結合バッファーで洗浄後、３９μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーと、１μＬの１，０００Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ Ｔ１とを加え３７℃１５分撹拌することによってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体（以下、ｃＤＮＡディスプレイと呼ぶ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（ベリタス社製）から溶出した。
【0063】
【表9】
【0064】
２－７．ｃＤＮＡディスプレイの精製
エッペンドルフチューブにＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社製）を３０μＬ入れ、２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄した後、２－１から２－６の方法で調製したｃＤＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄後、３０μＬのＨｉｓタグ溶出バッファーを加え３７℃で１５分撹拌することによってｃＤＮＡディスプレイを溶出した。
エッペンドルフチューブにＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社製）を３０μＬ入れ、２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄した後、２－１から２－６の方法で調製したｃＤＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄後、３０μＬのＨｉｓタグ溶出バッファーを加え３７℃で１５分撹拌することによってｃＤＮＡディスプレイを溶出した。
【0065】
２－８．試験管内淘汰実験
２－７で取得したライブラリから調製したｃＤＮＡディスプレイを用いて、セレクションを行った。各セレクションラウンドで使用したｃＤＮＡディスプレイの合成スケールを表１０に示す。
２－７で取得したライブラリから調製したｃＤＮＡディスプレイを用いて、セレクションを行った。各セレクションラウンドで使用したｃＤＮＡディスプレイの合成スケールを表１０に示す。
【0066】
【表10】
【0067】
２－９．セレクションサイクル１（Ｒ１）のスクリーニング手順
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１０μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰ、又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ１ライブラリと呼ぶ）をＲ２セレクションに供した。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１０μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰ、又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ１ライブラリと呼ぶ）をＲ２セレクションに供した。
【0068】
２－１０．セレクションサイクル２（Ｒ２）のスクリーニング手順
Ｒ１ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰ、又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ １１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２４サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ２ライブラリ）をＲ３セレクションに供した。
Ｒ１ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰ、又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ １１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２４サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ２ライブラリ）をＲ３セレクションに供した。
【0069】
２－１１．セレクションサイクル（Ｒ３、Ｒ４）のスクリーニング手順
Ｒ２ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。以降、２－１０の方法に従いＲ４までのスクリーニングを実施した。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ４ライブラリ）をＲ５セレクションに供した。
Ｒ２ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。以降、２－１０の方法に従いＲ４までのスクリーニングを実施した。得られた精製済みＤＮＡライブラリ（以下、Ｒ４ライブラリ）をＲ５セレクションに供した。
【0070】
２－１２．セレクションサイクル５（Ｒ５）のスクリーニング手順
Ｒ４ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの０．１μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ １１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２４サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。これにより、Ｒ５ライブラリを得た。
Ｒ４ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製した。Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの０．１μｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１１型ＶＬＰ又はＧＩＩ．１９型ＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＨＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＨＢＳＴを用いて調整したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリを取り除いた。
２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間静置した後、取り除いた。この洗浄操作は６回行った。洗浄後の各ウェルに対して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ １１）を１００μＬずつ添加し、丁寧にピペッティングした後、３７℃で１０分間静置することにより固相化したＶＬＰに対して結合したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。溶出液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号１３１）とＴ７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号１３２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)、１．５μＬの１０μＭ ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａプライマー、１．５μＬの１０μＭ Ｔ７ ｏｍｅｇａｎｅｗプライマー、１２．５μＬのＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ、９．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調整した。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２４サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた。これにより、Ｒ５ライブラリを得た。
【0071】
２－１３．次世代シーケンサー解析
Ｒ４ライブラリ又はＲ５ライブラリの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサーを利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、イルミナ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、ＮＧＳ Ｆｗ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３３）、ＮＧＳ Ｒｖ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３４）をプライマーとして用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）の説明書に従って精製した後、イルミナ社の説明書に従いＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ社製）により濃度定量し、イルミナ社の説明書に従いＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）及びＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ ｋｉｔ ｖ２（５００サイクル）を用いて配列解析を実施した。
Ｒ４ライブラリ又はＲ５ライブラリの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサーを利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、イルミナ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、ＮＧＳ Ｆｗ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３３）、ＮＧＳ Ｒｖ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３４）をプライマーとして用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）の説明書に従って精製した後、イルミナ社の説明書に従いＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ社製）により濃度定量し、イルミナ社の説明書に従いＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）及びＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ ｋｉｔ ｖ２（５００サイクル）を用いて配列解析を実施した。
【0072】
２－１４．シーケンスデータ解析
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨがコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。その結果、ＮｏＶＨＨ２００（配列番号３２）、ＮｏＶＨＨ２０１（配列番号３３）、ＮｏＶＨＨ５３（配列番号３５）、ＮｏＶＨＨ５４（配列番号３６）の出現頻度が高く、抗原との親和性が高い抗体として選抜された。
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨがコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。その結果、ＮｏＶＨＨ２００（配列番号３２）、ＮｏＶＨＨ２０１（配列番号３３）、ＮｏＶＨＨ５３（配列番号３５）、ＮｏＶＨＨ５４（配列番号３６）の出現頻度が高く、抗原との親和性が高い抗体として選抜された。
【0073】
ＮｏＶＨＨ２００（配列番号３２）のアミノ酸配列において、１～２６番目がＦＲ１（配列番号１６）、２７～３６番目がＣＤＲ１(配列番号１)、３７～５０番目がＦＲ２（配列番号２１）、５１～６０番目がＣＤＲ２（配列番号２）、６１～９９番目がＦＲ３（配列番号２５）、１００～１１６番目がＣＤＲ３（配列番号３）、１１７～１２７番目がＦＲ４（配列番号３０）である。
【0074】
ＮｏＶＨＨ２０１（配列番号３３）のアミノ酸配列において、１～２６番目がＦＲ１（配列番号１７）、２７～３６番目がＣＤＲ１(配列番号４)、３７～５０番目がＦＲ２（配列番号２２）、５１～５９番目がＣＤＲ２（配列番号５）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２６）、９９～１１４番目がＣＤＲ３（配列番号６）、１１５～１２５番目がＦＲ４（配列番号３１）である。
【0075】
ＮｏＶＨＨ５３（配列番号３５）のアミノ酸配列において、１～２６番目がＦＲ１（配列番号１９）、２７～３６番目がＣＤＲ１(配列番号１０)、３７～５０番目がＦＲ２（配列番号２３）、５１～６０番目がＣＤＲ２（配列番号１１）、６１～９９番目がＦＲ３（配列番号２８）、１００～１０４番目がＣＤＲ３（配列番号１２）、１０５～１１５番目がＦＲ４（配列番号３０）である。
【0076】
ＮｏＶＨＨ５４（配列番号３６）のアミノ酸配列において、１～２６番目がＦＲ１（配列番号２０）、２７～３６番目がＣＤＲ１(配列番号１３)、３７～５０番目がＦＲ２（配列番号２４）、５１～５９番目がＣＤＲ２（配列番号１４）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２９）、９９～１１６番目がＣＤＲ３（配列番号１５）、１０９～１２７番目がＦＲ４（配列番号３０）である。
【0077】
（実施例３）ファージディスプレイ法によるＶＨＨの選抜
３－１．
２－１０において、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰを標的分子とした選抜によって得られたＲ２ライブラリを鋳型にＡｌｐ＿ＶＨＨ＿ｐｈａｇｅｍｉｄ＿Ｆ（配列番号１３５： ＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＳＡＧＫＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ）、Ａｌｐ＿ＶＨＨ＿ｐｈａｇｅｍｉｄ＿Ｒ（配列番号１３６：ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣ）をプライマーとして用いて、 アニーリング温度５５℃、伸長反応６０秒の条件でＰＣＲを行いファージミドベクターとのライゲーション用 の制限酵素認識配列を付加し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマンコールター社製）で精製した。 ファージミド及びＤＮＡライブラリにＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え３７℃、１時間反応し、その Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ ＳｆｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え５０℃、１時間反応させた。制限酵素処理したファージミドベクター及びＤＮＡライブラリを１×Ｇｅｌ ｇｒｅｅｎ（富士フイルム和光純薬社製）入りの１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した後に、Ｆａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って抽出、精製した。精製したファージミドベクターはＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Scientific社製）を加えて３７℃で６０分間反応させ脱リン酸化した後に、７５℃で５分間反応させて酵素を失活した。
上記で作製したファージミドベクターに対してＤＮＡライブラリを５倍量から１０倍量(モル比) で混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（東洋紡社製）を加え、１６°Cで一晩反応させた。得られたファージミドベクターをエタノール沈殿で濃縮後、エレクトロポレーションで大腸菌 ＴＧ－１（ファージディスプレイ用コンピテントセル、Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換し、２ＹＴＡＧ寒天培地プレートで３０℃、一晩培養した。コロニーをすべて２ＹＴＡＧ液体培地に回収し、Ｏ．Ｄ．６００が０．５～１になるまで３０°Cで培養した。その後、ヘルパーファージを大腸菌の２０倍量加えてヘルパーファージを大腸菌に感染させ、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地（アンピシリン１００ｍｇ／ｍＬ、カナマイシン５０ｍｇ／ｍＬを含む）で３０℃、一晩培養した。培養された大腸菌を含む培養液を、 ４，０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を回収した。 上清に、２．５ＭのＮａＣ１を含有する２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール)溶液を添加し、転倒混和後、１時間氷上にて冷却後、遠心分離して上清を除去した。沈殿物に１０％グリセロールを含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を加え溶解し、ファージライブラリ溶液（以下、Ｆ－Ｒ０ライブラリと呼ぶ）とした。
３－１．
２－１０において、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰを標的分子とした選抜によって得られたＲ２ライブラリを鋳型にＡｌｐ＿ＶＨＨ＿ｐｈａｇｅｍｉｄ＿Ｆ（配列番号１３５： ＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＳＡＧＫＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ）、Ａｌｐ＿ＶＨＨ＿ｐｈａｇｅｍｉｄ＿Ｒ（配列番号１３６：ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣ）をプライマーとして用いて、 アニーリング温度５５℃、伸長反応６０秒の条件でＰＣＲを行いファージミドベクターとのライゲーション用 の制限酵素認識配列を付加し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマンコールター社製）で精製した。 ファージミド及びＤＮＡライブラリにＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え３７℃、１時間反応し、その Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ ＳｆｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え５０℃、１時間反応させた。制限酵素処理したファージミドベクター及びＤＮＡライブラリを１×Ｇｅｌ ｇｒｅｅｎ（富士フイルム和光純薬社製）入りの１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した後に、Ｆａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って抽出、精製した。精製したファージミドベクターはＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Scientific社製）を加えて３７℃で６０分間反応させ脱リン酸化した後に、７５℃で５分間反応させて酵素を失活した。
上記で作製したファージミドベクターに対してＤＮＡライブラリを５倍量から１０倍量(モル比) で混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（東洋紡社製）を加え、１６°Cで一晩反応させた。得られたファージミドベクターをエタノール沈殿で濃縮後、エレクトロポレーションで大腸菌 ＴＧ－１（ファージディスプレイ用コンピテントセル、Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換し、２ＹＴＡＧ寒天培地プレートで３０℃、一晩培養した。コロニーをすべて２ＹＴＡＧ液体培地に回収し、Ｏ．Ｄ．６００が０．５～１になるまで３０°Cで培養した。その後、ヘルパーファージを大腸菌の２０倍量加えてヘルパーファージを大腸菌に感染させ、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地（アンピシリン１００ｍｇ／ｍＬ、カナマイシン５０ｍｇ／ｍＬを含む）で３０℃、一晩培養した。培養された大腸菌を含む培養液を、 ４，０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を回収した。 上清に、２．５ＭのＮａＣ１を含有する２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール)溶液を添加し、転倒混和後、１時間氷上にて冷却後、遠心分離して上清を除去した。沈殿物に１０％グリセロールを含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を加え溶解し、ファージライブラリ溶液（以下、Ｆ－Ｒ０ライブラリと呼ぶ）とした。
【0078】
３－２．ＥＬＩＳＡプレートを用いたバイオパニング
ＧＩＩ．１８型ＶＬＰをＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈しＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を調製した。１００μＬのＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｌｅａｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ＿Ｃ８＿ＭａｘｉＳｏｒｐ：ｃａｔｓｈａ－ｐｕ４４５１0１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルに加え、４℃にて一晩固定化した。ＰＢＳをネガティブコントロールとして同様の作業を行った。各ウェルはＰＢＳで3回洗浄後、２００μＬの３％スキムミルク含有ＰＢＳを加え、室温、１時間静置することでブロッキングを行った。その後、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。１ｍＬの３％スキムミルク及び ５％ＢＳＡ含有ＰＢＳに３－１で作製したＦ－Ｒ０ライブラリを５０μＬ混合した後、各ウェルに１００μＬ添加し、室温にて１時間反応させた。
２００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄を行ない、さらに２００μＬのＰＢＳＴを加え、５分間振とうして洗浄した。これらの洗浄を２回行った。 洗浄後、１００ｍＭトリメチルアミン溶液１００μＬを各ウェルに加えて回収、さらに１００ｍＭトリメチルアミン溶液 １００μＬを各ウェルに加えて室温で１０分間、静置し、ＧＩＩ．１８型VLPと結合しているＶＨＨ提示ファージを溶出した。溶出液は直ちに１００μＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１バッファー（ｐＨ６．８）で中和した。溶出液を１２００μＬの大腸菌ＴＧ－１と混合させ、３０°Cに１時間静置した。１０μＬの混合液を２ＹＴＡＧ寒天培地（１０ｃｍ ディッシュ)にまいた。混合液の残りを遠心分離し、１００μＬの沈殿物（大腸菌 ＴＧ－１）を２ＹＴＡＧ寒天培地（１５ｃｍディッシュ）にまいた。
各寒天培地は３０℃で一晩培養した。各寒天培地上に出現したコロニーをすべて、 ５００ｍＬ三角フラスコ中の２ＹＴＡＧ液体培地に回収し、Ｏ．Ｄ．６００が０．５～１になるまで３０℃で培養した。その後、ヘルパーファージを大腸菌の２０倍量加えてヘルパーファージを大腸菌に感染させ、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地で３０℃、一晩培養した。 培養された大腸菌を含む培養液を４，０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を回収した。 上清に、２．５ＭのＮａＣｌを含有する ２０％ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を添加し、転倒混和後１時間氷上にて冷却後、遠心分離して上清を除去した。 沈殿物に１０％グリセロールを含むＰＢＳを加え溶解し、Ｆ－Ｒ１ライブラリを作成し、同様の方法で再度バイオパニングを行った（これにより得られたファージライブラリをＦ－Ｒ２ライブラリと呼ぶ）。
ＧＩＩ．１８型ＶＬＰをＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈しＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を調製した。１００μＬのＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｌｅａｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ＿Ｃ８＿ＭａｘｉＳｏｒｐ：ｃａｔｓｈａ－ｐｕ４４５１0１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルに加え、４℃にて一晩固定化した。ＰＢＳをネガティブコントロールとして同様の作業を行った。各ウェルはＰＢＳで3回洗浄後、２００μＬの３％スキムミルク含有ＰＢＳを加え、室温、１時間静置することでブロッキングを行った。その後、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。１ｍＬの３％スキムミルク及び ５％ＢＳＡ含有ＰＢＳに３－１で作製したＦ－Ｒ０ライブラリを５０μＬ混合した後、各ウェルに１００μＬ添加し、室温にて１時間反応させた。
２００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄を行ない、さらに２００μＬのＰＢＳＴを加え、５分間振とうして洗浄した。これらの洗浄を２回行った。 洗浄後、１００ｍＭトリメチルアミン溶液１００μＬを各ウェルに加えて回収、さらに１００ｍＭトリメチルアミン溶液 １００μＬを各ウェルに加えて室温で１０分間、静置し、ＧＩＩ．１８型VLPと結合しているＶＨＨ提示ファージを溶出した。溶出液は直ちに１００μＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１バッファー（ｐＨ６．８）で中和した。溶出液を１２００μＬの大腸菌ＴＧ－１と混合させ、３０°Cに１時間静置した。１０μＬの混合液を２ＹＴＡＧ寒天培地（１０ｃｍ ディッシュ)にまいた。混合液の残りを遠心分離し、１００μＬの沈殿物（大腸菌 ＴＧ－１）を２ＹＴＡＧ寒天培地（１５ｃｍディッシュ）にまいた。
各寒天培地は３０℃で一晩培養した。各寒天培地上に出現したコロニーをすべて、 ５００ｍＬ三角フラスコ中の２ＹＴＡＧ液体培地に回収し、Ｏ．Ｄ．６００が０．５～１になるまで３０℃で培養した。その後、ヘルパーファージを大腸菌の２０倍量加えてヘルパーファージを大腸菌に感染させ、２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ培地で３０℃、一晩培養した。 培養された大腸菌を含む培養液を４，０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を回収した。 上清に、２．５ＭのＮａＣｌを含有する ２０％ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を添加し、転倒混和後１時間氷上にて冷却後、遠心分離して上清を除去した。 沈殿物に１０％グリセロールを含むＰＢＳを加え溶解し、Ｆ－Ｒ１ライブラリを作成し、同様の方法で再度バイオパニングを行った（これにより得られたファージライブラリをＦ－Ｒ２ライブラリと呼ぶ）。
【0079】
３－３．ファージＥＬＩＳＡ
ライブラリ中にＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するＶＨＨが濃縮しているか否かを確かめるために、ファージＥＬＩＳＡを行った。ＧＩＩ．１８型ＶＬＰをＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈しＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を調製した。１００μＬのＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃にて、一晩で固定化した。各ウェルはＰＢＳで３回洗浄後、２００μLの３％スキムミルク含有ＰＢＳを加え、室温、１時間静置することでブロッキングを行った。 その後、 各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。５０μＬのＦ－Ｒ０ライブラリ、Ｆ－Ｒ１ライブラリ又はＦ－Ｒ２ライブラリを５０μLの１０％ＢＳＡ含有ＰＢＳと混合後、 混合液を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。その後、各ウェルを２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄した。Ａｎｔｉ－Ｍ１３－ｍＡｂ－ＨＲＰ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ社製）をＰＢＳＴで３０００倍に希釈した溶液を各ウェルに５０μL加え、室温で1 時間反応させた。その後、各ウェルを２００μLのＰＢＳＴで６回洗浄した。洗浄後、ＯＰＤタブレット（富士フイルム和光純薬社製)を、１０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４水溶液で溶解し、 各ウェルに溶解液を１００μLずつ添加し、遮光下で５分 間インキュベートした。インキュベート後、１００μLの１Ｍ硫酸を添加し、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ Ｍ ＰＬＥＸ（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した。その結果、バイオパンニングによりＦ－Ｒ１ライブラリ及びＦ－Ｒ２ライブラリのＧＩＩ．１８型ＶＬＰに対する力価が向上したことが確認された。
ライブラリ中にＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するＶＨＨが濃縮しているか否かを確かめるために、ファージＥＬＩＳＡを行った。ＧＩＩ．１８型ＶＬＰをＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈しＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を調製した。１００μＬのＧＩＩ．１８型ＶＬＰ固定化溶液を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃にて、一晩で固定化した。各ウェルはＰＢＳで３回洗浄後、２００μLの３％スキムミルク含有ＰＢＳを加え、室温、１時間静置することでブロッキングを行った。 その後、 各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。５０μＬのＦ－Ｒ０ライブラリ、Ｆ－Ｒ１ライブラリ又はＦ－Ｒ２ライブラリを５０μLの１０％ＢＳＡ含有ＰＢＳと混合後、 混合液を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。その後、各ウェルを２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄した。Ａｎｔｉ－Ｍ１３－ｍＡｂ－ＨＲＰ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ社製）をＰＢＳＴで３０００倍に希釈した溶液を各ウェルに５０μL加え、室温で1 時間反応させた。その後、各ウェルを２００μLのＰＢＳＴで６回洗浄した。洗浄後、ＯＰＤタブレット（富士フイルム和光純薬社製)を、１０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４水溶液で溶解し、 各ウェルに溶解液を１００μLずつ添加し、遮光下で５分 間インキュベートした。インキュベート後、１００μLの１Ｍ硫酸を添加し、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ Ｍ ＰＬＥＸ（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した。その結果、バイオパンニングによりＦ－Ｒ１ライブラリ及びＦ－Ｒ２ライブラリのＧＩＩ．１８型ＶＬＰに対する力価が向上したことが確認された。
【0080】
３－４．モノクローナルファージＥＬＩＳＡ
Ｆ－Ｒ２ライブラリ中のＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するＶＨＨのアミノ酸配列を特定するためにモノクローナルでのファージＥＬＩＳＡを行った。３－２で得られたＦ－Ｒ２ライブラリを大腸菌ＴＧ－１と混合させ、３０℃に１時間静置した。混合液を遠心分離し、 沈殿物（大腸菌ＴＧ－１）を ２ＹＴＡＧに溶解後、２ＹＴＡＧ寒天培地（１５ｃｍ ディッシュ）にまいた。寒天培地上のコロニーをランダムに１６個選抜し、３－１と同様の手法で各ファージディスプレイを作製した。ファージＥＬＩＳＡは３－３と同様の手法で行った。その結果、１２クローンで吸光度０．１以上の明確なレスポンスが得られた（図４）。レスポンスが得られたクローンについてはファージミドを大腸菌から抽出し、ＶＨＨに相当する塩基配列についてユーロフィンジェノミクス社によるＤＮＡ配列解析を行った。その結果、図４の＃１、＃２、＃６、＃８、＃１０、＃１１、＃１４及び＃１５のファージに提示されているＶＨＨは同一のアミノ酸配列からなることが確認され、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するクローンとして、ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号３４）を同定した。
Ｆ－Ｒ２ライブラリ中のＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するＶＨＨのアミノ酸配列を特定するためにモノクローナルでのファージＥＬＩＳＡを行った。３－２で得られたＦ－Ｒ２ライブラリを大腸菌ＴＧ－１と混合させ、３０℃に１時間静置した。混合液を遠心分離し、 沈殿物（大腸菌ＴＧ－１）を ２ＹＴＡＧに溶解後、２ＹＴＡＧ寒天培地（１５ｃｍ ディッシュ）にまいた。寒天培地上のコロニーをランダムに１６個選抜し、３－１と同様の手法で各ファージディスプレイを作製した。ファージＥＬＩＳＡは３－３と同様の手法で行った。その結果、１２クローンで吸光度０．１以上の明確なレスポンスが得られた（図４）。レスポンスが得られたクローンについてはファージミドを大腸菌から抽出し、ＶＨＨに相当する塩基配列についてユーロフィンジェノミクス社によるＤＮＡ配列解析を行った。その結果、図４の＃１、＃２、＃６、＃８、＃１０、＃１１、＃１４及び＃１５のファージに提示されているＶＨＨは同一のアミノ酸配列からなることが確認され、ＧＩＩ．１８型ＶＬＰに結合するクローンとして、ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号３４）を同定した。
【0081】
ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号３４）のアミノ酸配列において、１～２６番目がＦＲ１（配列番号１８）、２７～３６番目がＣＤＲ１(配列番号７)、３７～５０番目がＦＲ２（配列番号２１）、５１～５７番目がＣＤＲ２（配列番号８）、５８～９６番目がＦＲ３（配列番号２７）、９７～１１０番目がＣＤＲ３（配列番号９）、１１１～１２１番目がＦＲ４（配列番号３０）である。
【0082】
（実施例４）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
４－１．遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、ＮｏＶＨＨ２００（配列番号３２）、ＮｏＶＨＨ２０１（配列番号３３）、ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号３４）、ＮｏＶＨＨ５３（配列番号３５）又はＮｏＶＨＨ５４（配列番号３６）のＶＨＨのアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介してＨｉｓタグを付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２００（配列番号１３７）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２０１（配列番号１３８）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号１３９）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３（配列番号１４０）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４（配列番号１４１）と呼ぶ。尚、これら配列番号１３９～１４３で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２００用人工合成遺伝子（配列番号１４２）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２０１用人工合成遺伝子（配列番号１４３）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ１９１Ｅ用人工合成遺伝子（配列番号１４４）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３用人工合成遺伝子（配列番号１４５）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４用人工合成遺伝子（配列番号１４６）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の遺伝子合成受託サービスを利用して合成し、実験に供した。
４－１．遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、ＮｏＶＨＨ２００（配列番号３２）、ＮｏＶＨＨ２０１（配列番号３３）、ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号３４）、ＮｏＶＨＨ５３（配列番号３５）又はＮｏＶＨＨ５４（配列番号３６）のＶＨＨのアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介してＨｉｓタグを付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２００（配列番号１３７）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２０１（配列番号１３８）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ１９１Ｅ（配列番号１３９）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３（配列番号１４０）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４（配列番号１４１）と呼ぶ。尚、これら配列番号１３９～１４３で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２００用人工合成遺伝子（配列番号１４２）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ２０１用人工合成遺伝子（配列番号１４３）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ１９１Ｅ用人工合成遺伝子（配列番号１４４）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３用人工合成遺伝子（配列番号１４５）、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４用人工合成遺伝子（配列番号１４６）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の遺伝子合成受託サービスを利用して合成し、実験に供した。
【0083】
４－２．Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号１４７）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１４８）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号１４９）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号１５０）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１５１）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１５２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号１４７）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１４８）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号１４９）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号１５０）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１５１）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１５２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
【0084】
４－３．組換え枯草菌の作製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒＸ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（シグマアルドリッチ社製）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒＸ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（シグマアルドリッチ社製）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0085】
４－４．ＶＨＨ産生
４－３．で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬社製）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質は３０ｍＭ イミダゾール含有ＰＢＳに溶解した。
４－３．で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬社製）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質は３０ｍＭ イミダゾール含有ＰＢＳに溶解した。
【0086】
４－５．ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる確認
４－４で回収したサンプルとＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した。その結果、目的とするＨｉｓタグ付きＶＨＨが合成されていることが確認された（図５）。
４－４で回収したサンプルとＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した。その結果、目的とするＨｉｓタグ付きＶＨＨが合成されていることが確認された（図５）。
【0087】
（実施例５）ＥＬＩＳＡ法による結合特異性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１０μｇ／ｍＬ 各ノロウイルスＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＰＢＳＴを用いて調整した１００μＬの２μｇ／ｍＬ 各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨを添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨを取り除いた。２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＯＧＨｉｓ）（ＭＥＤＩＣＡＬ＆ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し, 室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し, ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体の検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（東京化成工業社製）を用いた。ＰＢＳＴによりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１／５，０００に希釈し, 各ウェルに１００μＬずつ添加した後, 室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを取り除いた後, ２００μＬのＰＢＳＴを添加し, ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し, 遮光下で３０分間インキュベートした後, 直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。得られた値をもとに、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比 を算出した。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの１０μｇ／ｍＬ 各ノロウイルスＶＬＰを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったノロウイルスＶＬＰ分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬの５％スキムミルク溶液（ＰＢＳＴ溶媒）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に５％スキムミルク溶液を取り除いた。２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＬＰを固相化した各ウェルに対して、ＰＢＳＴを用いて調整した１００μＬの２μｇ／ｍＬ 各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨを添加し、室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に未反応のＶＨＨを取り除いた。２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＯＧＨｉｓ）（ＭＥＤＩＣＡＬ＆ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し, 室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し, ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体の検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（東京化成工業社製）を用いた。ＰＢＳＴによりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１／５，０００に希釈し, 各ウェルに１００μＬずつ添加した後, 室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを取り除いた後, ２００μＬのＰＢＳＴを添加し, ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し, 遮光下で３０分間インキュベートした後, 直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。得られた値をもとに、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比 を算出した。
【0088】
各ＶＨＨを供したＥＬＩＳＡにて得られた最もＳ／Ｎ比の値に対して、１０分の１以上のＳ／Ｎ比を示したものを陽性（〇と表記）、１０分の１未満のＳ／Ｎ比を示したものを陰性（×と表記）と判断した。各遺伝子型ＶＬＰに対するＨｉｓタグ付きＶＨＨの結合活性を表９に示す。ＮｏＶＨＨ２００とＮｏＶＨＨ２０１はＧＩＩ．１１型ＶＬＰ、ＮｏＶＨＨ１９１ＥはＧＩＩ．１８型ＶＬＰ、ＮｏＶＨＨ５３はＧＩＩ．１１型ＶＬＰとＧＩＩ．１９型ＶＬＰ、ＮｏＶＨＨ５４はＧＩＩ．１９型ＶＬＰに対して特異的に結合活性を示すことが確認された。即ち、ＮｏＶＨＨ２００、ＮｏＶＨＨ２０１、ＮｏＶＨＨ１９１Ｅ、ＮｏＶＨＨ５３、ＮｏＶＨＨ５４を用いることでブタノロウイルスを特異的に検出することが出来ることがわかった。
【0089】
【表11】
【0090】
（実施例６）抗ＧＩＩ型ノロウイルスポリクローナル抗体の作成
６－１．抗ＧＩＩ型ノロウイルス結合ポリクローナル抗体の作成
ＧＩＩ型ノロウイルスの各遺伝子型ＶＬＰ（ＧＩＩ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１７、１８、１９、２１、２２）を混合したものを抗原とし、抗ＧＩＩ型ノロウイルス結合ウサギポリクローナル抗体を作製した。抗原をユーロフィンジェノミクス株式会社に送付し、全採血抗血清を得た。抗血清５０μＬに対し、Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌ ＩｇＧ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて夾雑物を除去し、ＩｇＧ抗体を含む溶液５００μＬを得た。操作は、キット付属のプロトコルに従って行った。精製後の溶液の抗体濃度は、１－１２と同様にＢＳＡを標準物質としたブラッドフォード法により定量した。これにより得られた抗体を抗ＧＩＩ ｐＡｂと呼ぶ。
６－１．抗ＧＩＩ型ノロウイルス結合ポリクローナル抗体の作成
ＧＩＩ型ノロウイルスの各遺伝子型ＶＬＰ（ＧＩＩ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１７、１８、１９、２１、２２）を混合したものを抗原とし、抗ＧＩＩ型ノロウイルス結合ウサギポリクローナル抗体を作製した。抗原をユーロフィンジェノミクス株式会社に送付し、全採血抗血清を得た。抗血清５０μＬに対し、Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌ ＩｇＧ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて夾雑物を除去し、ＩｇＧ抗体を含む溶液５００μＬを得た。操作は、キット付属のプロトコルに従って行った。精製後の溶液の抗体濃度は、１－１２と同様にＢＳＡを標準物質としたブラッドフォード法により定量した。これにより得られた抗体を抗ＧＩＩ ｐＡｂと呼ぶ。
【0091】
６－２．ノロウイルスＶＬＰに対する結合活性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの２５μｇ／ｍＬ各ノロウイルスＶＬＰ溶液を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェル中の溶液を取り除いた後、２００μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－（コスモバイオ社製）を添加し、プレート上面をシールして室温で２時間静置した。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－を用いて２μｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＧＩＩ ｐＡｂを１００μＬウェルに添加し、室温で５０分間インキュベートした。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は４回行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－を用いて１／１０００に希釈した２次抗体（Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１００μＬウェルに添加し、室温で５０分間インキュベートした。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は４回行った。発色基質には、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｈｉｇｈｅｓｔ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（Ａｂｃａｍ社製）を用いた。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２５分間インキュベートした。０．５Ｍ硫酸（富士フイルム和光純薬社製）を１００μＬ添加し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０、モレキュラーデバイス社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図６）。その結果、抗ＧＩＩ ｐＡｂは、ＧＩＩノロウイルスＶＬＰに対して幅広く結合活性を示すことが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルにＰＢＳを用いて調整した１００μＬの２５μｇ／ｍＬ各ノロウイルスＶＬＰ溶液を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェル中の溶液を取り除いた後、２００μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－（コスモバイオ社製）を添加し、プレート上面をシールして室温で２時間静置した。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－を用いて２μｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＧＩＩ ｐＡｂを１００μＬウェルに添加し、室温で５０分間インキュベートした。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は４回行った。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ－Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ－を用いて１／１０００に希釈した２次抗体（Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１００μＬウェルに添加し、室温で５０分間インキュベートした。ウェル中の溶液を除去した後、２５０μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は４回行った。発色基質には、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｈｉｇｈｅｓｔ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（Ａｂｃａｍ社製）を用いた。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２５分間インキュベートした。０．５Ｍ硫酸（富士フイルム和光純薬社製）を１００μＬ添加し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０、モレキュラーデバイス社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図６）。その結果、抗ＧＩＩ ｐＡｂは、ＧＩＩノロウイルスＶＬＰに対して幅広く結合活性を示すことが確認された。
【0092】
（実施例７）ラテラルフローイムノアッセイによるノロウイルスＶＬＰの検出
７－１．標識抗体の色素粒子への感作
色素粒子として着色セルロース粒子ＮａｎｏＡｃｔ（化学結合型、旭化成社製）を用いた。添付のプロトコルに沿って、検出抗体の感作を行った。１５ｍＬ遠沈管に６０μＬのＮａｎｏＡｃｔを分注し、そこに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を５４０μＬ、４ｗｔ％のＥＤＣ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を７．５μＬ、４ｗｔ％のＮＨＳを１５μＬ加え、室温で１５分静置してカルボキシル基のエステル化を行った。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。検出抗体として６０μｇのＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３又はＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４を加えたのちボルテックスし、３７℃で１２０分間インキュベートした。次に、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１００ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，ｐＨ８．５） を７．２ｍＬ加えたのちボルテックスし、３７℃で６０分間インキュベートした。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。再度１３，０００×ｇで１５分間遠心して上清を除去し、保存液（３３ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，０．２ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１５ｗｔ％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ９．２）を１．３ｍＬ加えて超音波処理し、使用時まで４℃で保存した（以下、感作済み粒子と呼ぶ。）。
７－１．標識抗体の色素粒子への感作
色素粒子として着色セルロース粒子ＮａｎｏＡｃｔ（化学結合型、旭化成社製）を用いた。添付のプロトコルに沿って、検出抗体の感作を行った。１５ｍＬ遠沈管に６０μＬのＮａｎｏＡｃｔを分注し、そこに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を５４０μＬ、４ｗｔ％のＥＤＣ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を７．５μＬ、４ｗｔ％のＮＨＳを１５μＬ加え、室温で１５分静置してカルボキシル基のエステル化を行った。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。検出抗体として６０μｇのＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３又はＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４を加えたのちボルテックスし、３７℃で１２０分間インキュベートした。次に、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１００ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，ｐＨ８．５） を７．２ｍＬ加えたのちボルテックスし、３７℃で６０分間インキュベートした。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。再度１３，０００×ｇで１５分間遠心して上清を除去し、保存液（３３ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，０．２ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１５ｗｔ％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ９．２）を１．３ｍＬ加えて超音波処理し、使用時まで４℃で保存した（以下、感作済み粒子と呼ぶ。）。
【0093】
７－２．ハーフストリップの組み立て
ニトロセルロースメンブレンには、５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したＦＦ１２０ＨＰ Ｐｌｕｓ又はＦＦ８０ ＨＰ Ｐｌｕｓ（Ｃｙｔｉｖａ社製）をとして用いた。５ｍｍ×２０ｍｍに裁断したＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ社製）を吸水パッドとして用いた。ニトロセルロースメンブレンと吸水パッドが１０ｍｍ重なり合うように張り合わせ、バッキングシート（ＧＬ－５７８８８，Ｌｏｈｍａｎｎ社製）で接着させることで、ハーフストリップを組み立てた。
ニトロセルロースメンブレンには、５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したＦＦ１２０ＨＰ Ｐｌｕｓ又はＦＦ８０ ＨＰ Ｐｌｕｓ（Ｃｙｔｉｖａ社製）をとして用いた。５ｍｍ×２０ｍｍに裁断したＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ社製）を吸水パッドとして用いた。ニトロセルロースメンブレンと吸水パッドが１０ｍｍ重なり合うように張り合わせ、バッキングシート（ＧＬ－５７８８８，Ｌｏｈｍａｎｎ社製）で接着させることで、ハーフストリップを組み立てた。
【0094】
７－３．捕捉抗体のニトロセルロースメンブレン膜への固定化
捕捉抗体として、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３又はＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４を用いた。ビオチン化試薬としてＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨにビオチンを付与した。ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＨＨを調整した。ＶＨＨ溶液に対して、ＶＨＨの２０倍の分子数となるように１０ｍＭのビオチン化試薬を添加後、４℃で一晩静置した。その後、ＺｅｂａＴＭ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ、７Ｋ ＭＷＣＯ、０．５ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＰＢＳに置換することで未反応のビオチン化試薬を除去した。ＰＢＳを用いて１ｍｇ/ｍＬになるように調製したビオチン化ＶＨＨと２０ｍｇ／ｍＬになるように調製したストレプトアビジン（ＳＡ）（富士フイルム和光純薬社製）を混合（ビオチン化ＶＨＨ（μＬ）：ＳＡ（μＬ）＝２５：１）した後、室温で５分静置した。これにより、ＶＨＨ－ＳＡ複合体を形成させた。６－２で組み立てたストリップの下端から２ｃｍの箇所に、ＶＨＨ－ＳＡ複合体をピペットで１μＬスポットした。比較対象として１ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＧＩＩ ｐＡｂを用いた。その後、３７℃３０分間乾燥することで固定化を行った。以下では、捕捉抗体を固定化した部位をテストスポットと表記する。
捕捉抗体として、Ｈｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５３又はＨｉｓタグ付きＮｏＶＨＨ５４を用いた。ビオチン化試薬としてＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨにビオチンを付与した。ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きＶＨＨを調整した。ＶＨＨ溶液に対して、ＶＨＨの２０倍の分子数となるように１０ｍＭのビオチン化試薬を添加後、４℃で一晩静置した。その後、ＺｅｂａＴＭ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ、７Ｋ ＭＷＣＯ、０．５ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＰＢＳに置換することで未反応のビオチン化試薬を除去した。ＰＢＳを用いて１ｍｇ/ｍＬになるように調製したビオチン化ＶＨＨと２０ｍｇ／ｍＬになるように調製したストレプトアビジン（ＳＡ）（富士フイルム和光純薬社製）を混合（ビオチン化ＶＨＨ（μＬ）：ＳＡ（μＬ）＝２５：１）した後、室温で５分静置した。これにより、ＶＨＨ－ＳＡ複合体を形成させた。６－２で組み立てたストリップの下端から２ｃｍの箇所に、ＶＨＨ－ＳＡ複合体をピペットで１μＬスポットした。比較対象として１ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＧＩＩ ｐＡｂを用いた。その後、３７℃３０分間乾燥することで固定化を行った。以下では、捕捉抗体を固定化した部位をテストスポットと表記する。
【0095】
７－４．ディップスティック型のラテラルフローアッセイによる評価
展開液にはホウ酸バッファー（１００ｍＭ ホウ酸、１％カゼイン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）を用いた。展開液を用いて、０．５～５０００ｎｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１９型ＶＬＰ分散液を調整した（以下、陽性検体と呼ぶ）。ＧＩＩ．１９型ＶＬＰを含まない条件には、展開液となるホウ酸バッファーを用いた（以下、陰性検体と呼ぶ）。９６穴プレートの１ウェルに、１００μＬの陽性検体又は陰性検体と２０μＬの６－１で調製した感作済み粒子を添加し、ピペッティングでよく混合した。その後、６－３で調製したハーフストリップをウェルに立てかけることで浸漬させ、展開液が流れ切るまで静置した。その後、テストスポットにおける呈色の有無を目視により判断した。呈色の有無の判断基準は図７に示す通りである。ラテラルフローアッセイの結果を表９に示す。その結果、ＮｏＶＨＨ５３とＮｏＶＨＨ５４を用いたラテラルフローアッセイにより、ＧＩＩ．１９型ＶＬＰを高感度に検出できることがわかった。この結果は、当該抗体がラテラルフローアッセイに適用可能であることを示している。
展開液にはホウ酸バッファー（１００ｍＭ ホウ酸、１％カゼイン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）を用いた。展開液を用いて、０．５～５０００ｎｇ／ｍＬ ＧＩＩ．１９型ＶＬＰ分散液を調整した（以下、陽性検体と呼ぶ）。ＧＩＩ．１９型ＶＬＰを含まない条件には、展開液となるホウ酸バッファーを用いた（以下、陰性検体と呼ぶ）。９６穴プレートの１ウェルに、１００μＬの陽性検体又は陰性検体と２０μＬの６－１で調製した感作済み粒子を添加し、ピペッティングでよく混合した。その後、６－３で調製したハーフストリップをウェルに立てかけることで浸漬させ、展開液が流れ切るまで静置した。その後、テストスポットにおける呈色の有無を目視により判断した。呈色の有無の判断基準は図７に示す通りである。ラテラルフローアッセイの結果を表９に示す。その結果、ＮｏＶＨＨ５３とＮｏＶＨＨ５４を用いたラテラルフローアッセイにより、ＧＩＩ．１９型ＶＬＰを高感度に検出できることがわかった。この結果は、当該抗体がラテラルフローアッセイに適用可能であることを示している。
【0096】
【表12】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】