(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024144118
(43)【公開日】2024-10-11
(54)【発明の名称】ＲＮＡ溶液の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20241003BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 110Z
C12Q1/6837 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024011423
(22)【出願日】2024-01-30
(31)【優先権主張番号】P 2023054577
(32)【優先日】2023-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】堀口 深雪
(72)【発明者】
【氏名】黒田 俊彦
(72)【発明者】
【氏名】宮野 敦子
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ52
4B063QR58
4B063QR90
4B063QS15
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】検出対象となるＲＮＡ溶液の製造方法を提供することによって、生物試料に含まれるＲＮＡの検出において、検出シグナルを安定させ、シグナル強度のばらつきを低減させることを目的とする。
【解決手段】生物試料からＲＮＡを抽出して粗抽出物溶液を単離回収する工程、単離回収した粗抽出物溶液中のＲＮＡを核酸結合性担体に吸着させる工程、当該担体をカオトロピック物質含有洗浄液、カオトロピック物質を含まない洗浄液で特定の回数洗浄する工程および当該担体からＲＮＡを溶出する工程を含み、得られたＲＮＡ溶液が一定量のカオトロピック物質を含むことを特徴とする、ＲＮＡ溶液の製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】生物試料からＲＮＡを抽出して粗抽出物溶液を単離回収する工程、単離回収した粗抽出物溶液中のＲＮＡを核酸結合性担体に吸着させる工程、当該担体をカオトロピック物質含有洗浄液、カオトロピック物質を含まない洗浄液で特定の回数洗浄する工程および当該担体からＲＮＡを溶出する工程を含み、得られたＲＮＡ溶液が一定量のカオトロピック物質を含むことを特徴とする、ＲＮＡ溶液の製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物試料に含まれるＲＮＡの検出において、当該検出の対象となるＲＮＡを含む溶液を、当該生物試料を精製工程に付すことによって製造する方法であって、当該精製工程が、
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、
単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、
当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及び
ＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、
を含み、
当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、方法。
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、
単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、
当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及び
ＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、
を含み、
当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、方法。
【請求項2】
前記カオトロピック物質がグアニジン塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記生物試料が生物の体液成分である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記体液成分が血清又は血漿である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記抽出工程が、前記生物試料にフェノールを含む抽出液を加えて混合し、得られた混合物からＲＮＡを含む水層を粗抽出物溶液として単離回収することによって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記カオトロピック物質含有洗浄液のカオトロピック物質濃度が０．２５Ｍ以上０．４Ｍ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
前記核酸結合性担体がシリカである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項9】
請求項１又は２に記載の方法で製造されたＲＮＡを含む溶液を用いることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法。
【請求項10】
前記検出が蛍光強度測定法又はマイクロアレイ法によるものである、請求項９に記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項11】
生物試料に含まれるＲＮＡの検出において当該検出の対象となる、当該生物試料を精製してなるＲＮＡを含む溶液であって、カオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴とする、ＲＮＡを含む溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡ溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡに書き込まれた遺伝情報は多種多様な組み合わせでＲＮＡに転写され、生物は複雑な表現型を示している。ＲＮＡは種類、発現量をもって生物の表現型に寄与していることが明らかとなっており、遺伝子発現分析のためには、様々な生物材料からＲＮＡを純度高く単離することが重要である。この目標を達成するために、これまで多くのＲＮＡ単離方法が開発されている。
【0003】
一般的なＲＮＡ単離の方法としては、抽出、固相抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、沈殿およびその組み合わせ等が挙げられる。例えば、シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Ｂｏｏｍらにより報告された（非特許文献１）。シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、カオトロピック剤存在下で核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、核酸以外の夾雑物及びカオトロピック剤を除去するために洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、水または低塩濃度の緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）からなる。しかし、フェノール、カオトロピック剤が単離されたＲＮＡに残存・残留した場合、単離されたＲＮＡの品質が悪く、ＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡシークエンスに影響する。そのため、血清からのｓｍａｌｌ ＲＮＡ抽出には、グアニジン濃度（ＵＶ２６０ｎｍ）低減のため、ｅｘｔｒａ ｓｐｉｎ ｓｔｅｐの追加、あるいはグリコーゲン添加等の工程の追加を行う技術が知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｒ．Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．３，ｐ．４９５－５０３（１９９０）
【非特許文献2】Ｓ．Ｋｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．Ｖｏｌ．８８ Ｎｏ.５１４４３（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
先行技術文献の内容を踏まえ、核酸結合性担体を用いて生物試料からＲＮＡを検出する方法において、吸着工程および洗浄工程で用いたカオトロピック塩を、洗浄によって除去してからＲＮＡを溶出する工程を経てＲＮＡを検出する方法を検討した。しかし、カオトロピック塩を除去することによって、ＲＮＡに由来するシグナル値が低下するという課題が生じた（比較例１、４）。
【0006】
そこで、生物試料からＲＮＡ溶液を製造する方法において、安定して高いＲＮＡ由来シグナルを得られるような、ＲＮＡ溶液を調製する方法を提供することを課題として、本発明者らは検討を行った。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、生物試料を精製する工程の、カオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数および精製後のＲＮＡを含む溶液中のカオトロピック物質濃度を規定することで、生物試料に含まれるＲＮＡの検出においてシグナルが安定し、ばらつきを低減する効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は次の（１）～（１１）から構成される。
（１）生物試料に含まれるＲＮＡの検出において、当該検出の対象となるＲＮＡを含む溶液を、当該生物試料を精製工程に付すことによって製造する方法であって、当該精製工程が、
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、
単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、
当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及び
ＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、
を含み、
当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、方法。
（２）前記カオトロピック物質がグアニジン塩である、（１）に記載の方法。
（３）前記生物試料が生物の体液成分である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記体液成分が血清又は血漿である、（３）に記載の方法。
（５）前記抽出工程が、前記生物試料にフェノールを含む抽出液を加えて混合し、得られた混合物からＲＮＡを含む水層を粗抽出物溶液として単離回収することによって行われる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記カオトロピック物質含有洗浄液のカオトロピック物質濃度が０．２５Ｍ以上０．４Ｍ以下である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記核酸結合性担体がシリカである、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造されたＲＮＡを含む溶液を用いることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法。
（１０）前記検出が蛍光強度測定法又はマイクロアレイ法によるものである、（９）に記載のＲＮＡの検出方法。
（１１）生物試料に含まれるＲＮＡの検出において当該検出の対象となる、当該生物試料を精製してなるＲＮＡを含む溶液であって、カオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴とする、ＲＮＡを含む溶液。
（１）生物試料に含まれるＲＮＡの検出において、当該検出の対象となるＲＮＡを含む溶液を、当該生物試料を精製工程に付すことによって製造する方法であって、当該精製工程が、
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、
単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、
当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及び
ＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、
を含み、
当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、方法。
（２）前記カオトロピック物質がグアニジン塩である、（１）に記載の方法。
（３）前記生物試料が生物の体液成分である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記体液成分が血清又は血漿である、（３）に記載の方法。
（５）前記抽出工程が、前記生物試料にフェノールを含む抽出液を加えて混合し、得られた混合物からＲＮＡを含む水層を粗抽出物溶液として単離回収することによって行われる、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記カオトロピック物質含有洗浄液のカオトロピック物質濃度が０．２５Ｍ以上０．４Ｍ以下である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記核酸結合性担体がシリカである、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造されたＲＮＡを含む溶液を用いることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法。
（１０）前記検出が蛍光強度測定法又はマイクロアレイ法によるものである、（９）に記載のＲＮＡの検出方法。
（１１）生物試料に含まれるＲＮＡの検出において当該検出の対象となる、当該生物試料を精製してなるＲＮＡを含む溶液であって、カオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴とする、ＲＮＡを含む溶液。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、生物試料を精製する工程の洗浄回数および精製工程を経て得られる検出対象となるＲＮＡを含む溶液中のカオトロピック物質濃度を一定範囲内にすることによって、生物試料に含まれるＲＮＡの検出においてシグナルが安定し、ばらつきを低減することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、生物試料に含まれるＲＮＡの検出において、当該検出の対象となるＲＮＡを含む溶液を、当該生物試料を精製工程に付すことによって製造する方法であって、当該精製工程が、
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及びＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、を含むこと、ならびに当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴としている。
生物試料からＲＮＡを抽出し、粗抽出物溶液として単離回収する抽出工程、単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる吸着工程、当該担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄する洗浄工程、及びＲＮＡが吸着した当該担体からＲＮＡを溶出してＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程、を含むこと、ならびに当該精製工程を経た後のＲＮＡを含む溶液のカオトロピック物質濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴としている。
【0011】
１．試料について
本発明における「生物試料」は、検出対象となるＲＮＡを含むと期待されるものであれば、特に制限されない。例えば、培養細胞、培養細胞の培養液、手術切片や生検サンプル等の生体組織、生体細胞、血液、血液成分（血清、血漿）、尿、唾液、涙等の体液が好ましい試料として挙げられるが、これらに限られず、検出対象となるＲＮＡの含まれる任意の試料を使用し得る。生物試料が細胞ペレットや組織片である場合には、ＰＢＳや水で希釈してもよいが、ＲＮＡの分解を避けるため、希釈する場合にはより好ましくは生物試料のホモジェネートを作成してから水やＰＢＳで希釈することが好ましい。さらに、上記の例示的な生物試料のいずれかから得られる溶解物、抽出物もしくは材料も試料という用語の範囲内である。好ましくは、生物試料は、細胞、組織、血液、血漿、血清、尿、髄液などの体液または生検である。特に、低侵襲的な方法で容易に採取できて、種々のＲＮＡを含んでおり、ＲＮＡの検出によって種々の情報を取得できることが期待される、血液、血漿または血清が好ましい生物試料である。
本発明における「生物試料」は、検出対象となるＲＮＡを含むと期待されるものであれば、特に制限されない。例えば、培養細胞、培養細胞の培養液、手術切片や生検サンプル等の生体組織、生体細胞、血液、血液成分（血清、血漿）、尿、唾液、涙等の体液が好ましい試料として挙げられるが、これらに限られず、検出対象となるＲＮＡの含まれる任意の試料を使用し得る。生物試料が細胞ペレットや組織片である場合には、ＰＢＳや水で希釈してもよいが、ＲＮＡの分解を避けるため、希釈する場合にはより好ましくは生物試料のホモジェネートを作成してから水やＰＢＳで希釈することが好ましい。さらに、上記の例示的な生物試料のいずれかから得られる溶解物、抽出物もしくは材料も試料という用語の範囲内である。好ましくは、生物試料は、細胞、組織、血液、血漿、血清、尿、髄液などの体液または生検である。特に、低侵襲的な方法で容易に採取できて、種々のＲＮＡを含んでおり、ＲＮＡの検出によって種々の情報を取得できることが期待される、血液、血漿または血清が好ましい生物試料である。
【0012】
ＲＮＡは、生物試料において細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、ウイルスのエンベロープ、エンドソーム、エクソソーム、マイクロベシクル等に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多い。このため、生物試料に対して、必要に応じて以下のような前処理をしてもよい。検出の対象となるＲＮＡをより収率よく回収するために、これらから遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
【0013】
具体的には、エクソソームが含まれている生物試料からの検出対象となるＲＮＡの回収効率を高めるために以下のような処理を行うことができる。例えば、エクソソームが含まれる生物試料に対して、市販されているMagCapture（商標）Exosome Isolation Kit PS Ver.2（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてエクソソームを回収して溶液とすることができる。このようにして得られたエクソソーム含有溶液を精製工程に付すことができる。
【0014】
また、生物試料に含まれるＲＮＡの分解を抑制するために、市販されているRNasin Plus Ribonuclease Inhibitor（プロメガ株式会社）、Ribonuclease Inhibitor（タカラバイオ株式会社）、RNase inhibitor（東洋紡株式会社）等をＲＮＡ分解酵素の阻害剤として生物試料に添加した後に、得られた溶液を精製工程に付すことができる。
【0015】
２．ＲＮＡについて
本発明における「ＲＮＡ」は、複数のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合したリボ核酸であって、その分子量、塩基数や由来によって限定されない。一般に、ＲＮＡは、機能分類上、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（低分子一過性ＲＮＡ）を含むｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｈｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連ＲＮＡ）等に分類されるが、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。また、本発明のＲＮＡは細胞外液ＲＮＡ、循環ＲＮＡのほか、生物試料中に存在し得る微生物、寄生生物またはＲＮＡウイルスから得られるＲＮＡも含む。これらのＲＮＡにおいては、化学構造的には分子量（塩基数）以外に差は知られておらず、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。さらに、本発明のＲＮＡには、生物試料中に加えられる合成核酸も含まれる。ここでいう合成核酸には、ヌクレオチド類似体を含有するものも含有しないものも含まれる。ここでいう合成核酸配列を「加える」操作には、少量加える操作も、過剰量加える、いわゆる「スパイクする」操作も含まれる。好ましくは、ＲＮＡは、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ群から選択される。より好ましくは、ＲＮＡはｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡから選択される。特に、ＲＮＡを含む溶液を調製する段階で分解しやすく、検出感度の低下に繋がりやすいｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）については、本発明によって安定して高いＲＮＡシグナルを得られるようになるという顕著な効果が得られる。
本発明における「ＲＮＡ」は、複数のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合したリボ核酸であって、その分子量、塩基数や由来によって限定されない。一般に、ＲＮＡは、機能分類上、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（低分子一過性ＲＮＡ）を含むｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｈｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連ＲＮＡ）等に分類されるが、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。また、本発明のＲＮＡは細胞外液ＲＮＡ、循環ＲＮＡのほか、生物試料中に存在し得る微生物、寄生生物またはＲＮＡウイルスから得られるＲＮＡも含む。これらのＲＮＡにおいては、化学構造的には分子量（塩基数）以外に差は知られておらず、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。さらに、本発明のＲＮＡには、生物試料中に加えられる合成核酸も含まれる。ここでいう合成核酸には、ヌクレオチド類似体を含有するものも含有しないものも含まれる。ここでいう合成核酸配列を「加える」操作には、少量加える操作も、過剰量加える、いわゆる「スパイクする」操作も含まれる。好ましくは、ＲＮＡは、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ群から選択される。より好ましくは、ＲＮＡはｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡから選択される。特に、ＲＮＡを含む溶液を調製する段階で分解しやすく、検出感度の低下に繋がりやすいｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）については、本発明によって安定して高いＲＮＡシグナルを得られるようになるという顕著な効果が得られる。
【0016】
３．精製工程について
本発明における「精製工程」は、上記生物試料から、検出対象であるＲＮＡ以外の物質の一部を除去することで、カオトロピック物質濃度を０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度で含む、後述のＲＮＡの検出に直接用いるためのＲＮＡを含む溶液を取得する工程である。本発明の精製工程は、抽出工程、吸着工程、洗浄工程および溶出工程から成る。
本発明における「精製工程」は、上記生物試料から、検出対象であるＲＮＡ以外の物質の一部を除去することで、カオトロピック物質濃度を０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度で含む、後述のＲＮＡの検出に直接用いるためのＲＮＡを含む溶液を取得する工程である。本発明の精製工程は、抽出工程、吸着工程、洗浄工程および溶出工程から成る。
【0017】
３－１．抽出工程について
本発明の「抽出工程」は、固体、固体を含む懸濁液、分散液、コロイド等の不均一系又は溶液の形態を成している生物試料から、検出対象となるＲＮＡを含む溶液を取り出す操作を指す。
本発明の「抽出工程」は、固体、固体を含む懸濁液、分散液、コロイド等の不均一系又は溶液の形態を成している生物試料から、検出対象となるＲＮＡを含む溶液を取り出す操作を指す。
【0018】
本発明の「粗抽出物溶液」は、上記生物試料に含まれる、前記検出対象となるＲＮＡを含む成分を溶液中に抽出したものである。本発明における粗抽出物溶液は、例えば検出対象以外の核酸、タンパク質、脂質その他の物質が含まれていてもよい。当該その他の物質は、生物試料に元から入っていてもよく、あるいは生物試料から検出対象となるＲＮＡを抽出する際に単離されたものでもよい。
【0019】
本発明における「生物試料からＲＮＡを抽出」する方法としては、検出対象となるＲＮＡを溶液中に抽出できる方法であればよく、特に制限はない。
【0020】
抽出の方法としては、検出対象となるＲＮＡを含む溶液とそれ以外の生物試料を分けて、検出対象となるＲＮＡを含む溶液を生物試料と別の容器に移す、あるいは空間的に別にすることができれば、特に制限はない。例えば、生物試料に抽出液を添加し、生物試料を上下層に物理的に分けて、検出対象となるＲＮＡを含む層の粗抽出物溶液を、器具を用いて別の生物試料容器に移すことができる。上記操作は１回でもよく、複数回繰り返すこともできる。
【0021】
例えば、フェノール／クロロホルム法、及びその変法、ＰＣＩ（Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol）法、ＡＧＰＣ（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）法、グアニジンチオシアネートとフェノールをあらかじめ混合しておくＡＧＰＣ変法などにしたがって、生物試料から検出対象となるＲＮＡを抽出することができる。あるいは、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、TRIzol（登録商標）Reagent、QIAzol Lysis Reagent、ISOGEN、RNeasy Mini Kit、3D-Gene（登録商標）RNA extraction reagent from liquid sample kit等）を用いて生物試料から検出対象となるＲＮＡを抽出することができる。
【0022】
具体的には、3D-Gene（登録商標）RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ株式会社）を使用する場合は、同社の定めるプロトコールに従って、酸性条件下で実施することにより、ＲＮＡは水層、それ以外は中間層あるいは有機層に分離され、水層を単離回収することにより検出対象となるＲＮＡを含む粗抽出物溶液を得られる。
【0023】
具体的には、ＡＧＰＣ法を使用する場合は、生物試料に酸を添加して酸性にした後、フェノール、クロロホルム等の無極性溶媒を加えて、混和し、遠心分離あるいは静置することにより、ＲＮＡを水層に分離し、水層を単離回収することで検出対象となるＲＮＡを含む粗抽出物溶液を得られる。
【0024】
抽出工程においては、検出対象のＲＮＡと結合しているタンパク質を変性させ、当該ＲＮＡとの結合を解消させることによって抽出効率を向上させるために、生物試料に対して後述のカオトロピック物質を添加してから抽出を行ってもよい。この場合、後述の吸着工程、洗浄工程、溶出工程を経た後の、検出対象となるＲＮＡを含む溶液における当該カオトロピック物質の濃度は、０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下となっていればよい。
【0025】
一度抽出工程を経て粗抽出物溶液が得られた後は、当該溶液を濃縮して液体、固体、ゾル、ゲル、アモルファスなどの形態を経てから次の吸着工程を行ってもよい。
【0026】
３－２．吸着工程について
本発明の「吸着工程」は、単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる工程である。
本発明の「吸着工程」は、単離回収した当該粗抽出物溶液を、核酸結合性担体と接触させることで、粗抽出物溶液中のＲＮＡを当該担体に吸着させる工程である。
【0027】
本発明における「核酸結合性担体」は、検出対象となるＲＮＡを吸着させるための担体である。粗抽出物溶液中の検出対象となるＲＮＡが吸着できればよく、可逆的な物理的結合により保持することができる固体であればよい。例えば、ガラス、石英ウール、シリカ（シリカゲル、シリカメンブレン等）、酸化アルミニウム、ゼオライト等の無機材料、ポリマー、イオン交換樹脂等の有機材料、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものでもよく、磁性体、それらの複合体などが使用できる。化学的修飾により表面処理を施す場合は、粗抽出溶液中のＲＮＡとの可逆的な結合を妨げない程度に、適度な電荷を帯びさせてもよい。好ましくは、シリカ、イオン交換樹脂、ガラス膜、酸化アルミニウムあるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施した群から選択される。より好ましくは、シリカ、酸化アルミニウムあるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものから選択される。
【0028】
上記、核酸結合性担体の形態としては、粒子、ビーズ、フィルター、メンブレン（膜）、織布、繊維、中空糸等が挙げられるが特に制限はなく、容器（カートリッジ、チップ、カラムなど）等に充填または固定化されていてもよい。容器に充填または固定化されている形態の例としては、カラム、真空フィルターホルダー、シリンジフィルターなどが挙げられる。例えば、容器に充填または固定化される核酸結合性担体を使用する場合、当該容器は少なくとも２つの開口部を有し、断面形状は円形、円筒形、角形、角筒形、不均一形などがあるが、とくに制限はなく、より好ましくは円形、円筒形である。２つの開口部を有するカラムの態様としては、濾過液レシーバーとなる容器と組み合わせることでスピンカラムを構成したものも含まれる。カラムに粗抽出溶液をアプライする場合、一方方向に通過することが好ましい。具体的な担体の例には、ガラスやシリカゲルの粒子、シリカメンブレン、ガラス膜等が含まれる。
【0029】
本発明における「接触」は、核酸結合性担体と粗抽出物溶液が直接的に触れることを指す。具体的には、前記容器を使用する場合、粗抽出物溶液を、核酸結合性担体を含むカラムに通液することを指し、粗抽出物溶液中に含まれる検出対象となるＲＮＡを核酸結合性担体に吸着し、それ以外の物質をフロースルー側に排出することを意図する。粗抽出物溶液と核酸結合性担体の接触時間、接触温度に特に制限はなく、粗抽出物溶液中に含まれる検出対象となるＲＮＡが核酸結合性担体に吸着できればよい。
【0030】
生物試料を前記担体が充填または固定化された容器に対して通過させる方法としては、２つの開口部のうちの一つに陽圧または陰圧をかける方法、生物試料にかかる重力を利用して、残渣である液体画分を落下させる方法、スピンカラムに対して遠心操作を行うことで残渣である液体画分を溶出させる方法等が挙げられる。陽圧又は陰圧をかける方法としては、ポンプによって圧力をかける方法や、カラムをシリンジの中に設けた形態であるシリンジカラムにおいてプランジャーを作動させる方法等が挙げられる。例えば、遠心力がスピンカラムに加えられた場合には、粗抽出溶液が遠心力の方向に通過し、ＲＮＡは当該担体に吸着し、残渣である液体画分がスピンカラムの底に排出される。
【0031】
複数のスピンカラムを並列に並べたカラムにあたるマルチウェルプレートは、複数の生物試料を一度の遠心操作で処理できることから、より好ましい。
【0032】
また、前記２つの開口部を有する容器に核酸結合性担体を充填または固定化したカラム又はフィルターを用いた場合は、当該容器の一方の開口部に接続した生物試料を含む溶液に陽圧をかける、又は溶出させる開口部に陰圧をかけることによって、当該溶液を当該担体に接触させることでＲＮＡを吸着させることができる。
【0033】
また、開口部を一つのみ有するチューブに、生物試料と、粒子状、ビーズ状等の核酸結合性担体を投入し、混合後に遠心処理を行うことで、ＲＮＡの結合した当該担体をチューブの底に沈殿させ、残渣である液体画分としての上清を除去することによっても吸着工程を行うことができる。 吸着工程を行う温度は特に限定されないが、５℃以上５０℃以下が好ましく、１０℃以上４０℃以下がさらに好ましく、２０℃以上３０℃以下が最も好ましい。
【0034】
３－３．洗浄工程について
本発明の「洗浄工程」は、前述の担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄することで行われる。
本発明の「洗浄工程」は、前述の担体を、カオトロピック物質含有洗浄液で１回、カオトロピック物質を含まない洗浄液で３回以上４回以下洗浄することで行われる。
【0035】
本発明における「カオトロピック物質含有洗浄液」は、後述のカオトロピック物質を含有する水溶液である。カオトロピック物質含有洗浄液は、アルコールを含有する水溶液であってもよい。アルコールとしては、分子生物学実験で一般的に用いられるエタノールが好ましい。カオトロピック物質含有洗浄液によって洗浄することにより、３－２．吸着工程において前述の核酸結合性担体に吸着した検出対象となるＲＮＡが、当該担体上に保持される。
【0036】
本発明のカオトロピック物質含有洗浄液には、カオトロピック物質を含む洗浄液中にカオトロピック物質と緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば、特に限定されないが、ｐＨ３以上ｐＨ６以下の範囲のいずれかのｐＨにおいて緩衝能を有するものが好ましい。例えば、酢酸ナトリウムと酢酸、クエン酸三ナトリウムとクエン酸等が挙げられ、使用濃度としては１以上５００ｍＭ以下、ｐＨ３以上ｐＨ６以下の範囲が好ましい。
【0037】
本発明における「カオトロピック物質」は、一般的にカオトロピック物質として知られているような疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しているものである。例えば、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩のようなグアニジン塩のほか、尿素、チオウレア、よう化ナトリウム、よう化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる。グアニジン塩は、ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼに対する阻害効果が高いため好ましく、さらに好ましくはグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩であり、最も好ましくはグアニジンチオシアン酸塩である。
【0038】
カオトロピック物質含有洗浄液におけるカオトロピック物質の濃度は、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合は、０．１Ｍ以上５．５Ｍ以下の範囲となるように使用するのが好ましい。より好ましくは、０．１Ｍ以上１Ｍ以下であり、さらに好ましくは０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下であり、特に好ましくは０．２５Ｍ以上０．４Ｍ以下である。
【0039】
カオトロピック物質含有洗浄液による洗浄回数は１回以上であれば制限はないが、カオトロピック物質が単離されるＲＮＡ溶液中に残存残留して、後工程のＲＮＡの検出に影響を与えることから１回が好ましい。
【0040】
本発明における「カオトロピック物質を含まない洗浄液」は、前述のカオトロピック物質を含まない水溶液である。カオトロピック物質を含まない洗浄液は、アルコールを含有する水溶液であってもよい。アルコールとしては、分子生物学実験で一般的に用いられるエタノールが好ましい。本発明のカオトロピック物質を含まない洗浄液は、核酸結合性担体とＲＮＡの結合を維持し、且つ、核酸結合性担体に結合した不純物を除去し、前述のとおり生物試料に添加したカオトロピック物質、吸着工程で添加したカオトロピック物質、またはカオトロピック物質含有洗浄液に由来するカオトロピック物質の残存量を低減できる溶液であり、エタノールを含む溶液が好ましい。エタノールの使用濃度としては、一般的に使用されている濃度であれば、特に限定されないが、７０％（ｖ／ｖ）以上９０％（ｖ／ｖ）以下の範囲が好ましい。より好ましくは、８０％（ｖ／ｖ）以上９０％（ｖ／ｖ）以下である。核酸結合性担体に結合した不純物を除去できる溶液としては、一般的に使用されるものであれば、特に限定されないが、ＤＮａｓｅフリー及び／又はＲＮａｓｅフリーの水、緩衝液、低塩濃度の溶液が好ましい。例えば、塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられ、緩衝液としては酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス－ＨＣｌなどが挙げられる。カオトロピック物質を含まない洗浄液の塩濃度は一般的に２０ｍＭ以上２００ｍＭ以下、緩衝液濃度は一般的に１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下の範囲が好ましい。
【0041】
本発明の洗浄回数については、ＲＮＡを吸着した核酸結合性担体に洗浄液を接触させ、使用済みの洗浄液を除去する一連の作業を以て「１回」と数えるものとする。
【0042】
前記カオトロピック物質を含まない洗浄液による洗浄回数は３回以上４回以下である。３回洗浄後にカオトロピック物質濃度が好ましい範囲よりも高い場合は、４回目の洗浄を行うことによって当該濃度を好ましい範囲とすることができる。
【0043】
本発明の洗浄工程における担体に対するカオトロピック物質含有洗浄液またはカオトロピック物質を含まない洗浄液の接触は、前述の吸着工程において担体と生物試料を接触させる方法と同様に行うことができる。すなわち、前記容器に充填または固定化される核酸結合性担体を使用する場合、洗浄液のアプライ後に、２つの開口部のうちの一つに陽圧又は陰圧をかける方法、重力によって洗浄液を落下させる方法、遠心操作による方法が使用できるほか、開口部を一つのみ有するチューブに入っている前記粒子状、ビーズ状等の核酸結合性担体に洗浄液を加え、混合後に遠心処理を行った後に上清を分離することで使用済みの洗浄液を除去することもできる。
【0044】
洗浄工程を行う温度は特に限定されないが、５℃以上５０℃以下が好ましく、１０℃以上４０℃以下がさらに好ましく、２０℃以上３０℃以下が最も好ましい。
【0045】
３－４．溶出工程について
本発明の「溶出工程」は、検出対象となるＲＮＡが吸着した担体から当該ＲＮＡを溶出して当該ＲＮＡを含む溶液を得る工程である。
本発明の「溶出工程」は、検出対象となるＲＮＡが吸着した担体から当該ＲＮＡを溶出して当該ＲＮＡを含む溶液を得る工程である。
【0046】
本発明における「ＲＮＡを含む溶液を得る溶出工程」で使用する溶出液は、核酸結合性担体からＲＮＡを溶出できればよく、一般的に使用されるものであれば、特に限定されないが、例えば、ＤＮａｓｅフリー及び／又はＲＮａｓｅフリーの水、さらに塩及び／又は緩衝液などが挙げられる。例えば、塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられ、緩衝液としてはトリス－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳなどが挙げられる。
【0047】
本発明の溶出工程における担体に対する溶出液の接触は、前述の吸着工程において担体と生物試料を接触させる方法と同様に行うことができる。すなわち、前記容器に充填または固定化される核酸結合性担体を使用する場合、溶出液のアプライ後に、２つの開口部のうちの一つに陽圧又は陰圧をかける方法、重力によって溶出液を落下させる方法、遠心操作による方法が使用できるほか、開口部を一つのみ有するチューブに入っている前記粒子状、ビーズ状等の核酸結合性担体に溶出液を加え、混合後に遠心処理を行った後に上清を分離することでＲＮＡを含む溶液を取得することもできる。
【0048】
溶出工程を行う温度は特に限定されないが、５℃以上５０℃以下が好ましく、１０℃以上４０℃以下がさらに好ましく、２０℃以上３０℃以下が最も好ましい。
【0049】
４．ＲＮＡを含む溶液におけるカオトロピック物質の濃度について
本発明における溶出工程で得られたＲＮＡ溶液中に含まれるカオトロピック物質濃度は、０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である。当該濃度は、好ましくは０．５ｍＭ以上３０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは０．５ｍＭ以上２０ｍＭ以下であり、最も好ましくは１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である。当該濃度は溶出工程を経て得られた検出対象となるＲＮＡを含む溶液におけるカオトロピック物質濃度が当該範囲にある場合、検出対象のＲＮＡを感度良く検出できるという効果が得られる。
本発明における溶出工程で得られたＲＮＡ溶液中に含まれるカオトロピック物質濃度は、０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である。当該濃度は、好ましくは０．５ｍＭ以上３０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは０．５ｍＭ以上２０ｍＭ以下であり、最も好ましくは１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である。当該濃度は溶出工程を経て得られた検出対象となるＲＮＡを含む溶液におけるカオトロピック物質濃度が当該範囲にある場合、検出対象のＲＮＡを感度良く検出できるという効果が得られる。
【0050】
グアニジン塩の定量は、通常用いられている難溶性重金属塩、ピクレート法に代表されるような沈殿法、ニトロプルシドソーダ・フェリシアン化カリ試薬を用いた比色定量法、さらにこれらにイオン交換樹脂を組み合わせた方法、イオンクロマトグラフィー等により行える。溶液中に２３０ｎｍの吸収をもつ物質がなければ、２３０ｎｍにおける吸光度を測定することでグアニジン塩濃度を定量できる。例えば、イオンクロマトグラフィーで定量する場合、Thermo Fisher Scientific製INTEGRIONを用いて、IONPac CS14の分離カラムで、メタンスルホン酸の溶離液を分析時間に比例して濃度勾配をかけることで、得られた電気信号を電気伝導度計で測定することで定性・定量できる。
【0051】
５．ＲＮＡの検出について
本発明における「ＲＮＡの検出」の例としては、吸光度測定、蛍光強度測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析、これらを組み合わせた解析などが挙げられる。好ましくは、吸光度測定、蛍光強度測定、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ等である。より好ましくは、蛍光強度測定、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ解析から選択される。ＲＴ－ＰＣＲはＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣｒ、ＲＴ－ｑＰＣＲは、定量的逆転写ＰＣＲ等とも呼ばれ、ＰＣＲによる増幅を経時的に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡの定性と定量を行える。すなわち、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲでｃＤＮＡを増幅し、増幅反応を評価することで、特定の微量ＲＮＡまたはＤＮＡを高感度に定量的に解析する。定量は、反応液の中に蛍光標識プローブまたは蛍光色素等を添加し検出することでできる。増幅反応の評価は、Ｃｑ値、Ｔｍ値、非特異増幅の有無等の値に基づいて行うことができ、これらの値は１種類を単独で評価に用いてもよく、２種類以上を組み合わせて評価に用いてもよい。Ｃｑ値はＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）と同義であり、一定の増幅産物量になるＰＣＲサイクル数を意味する。Ｃｑ値が小さいことは鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡが多いことを示し、Ｃｑ値が大きいことは鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡが少ないことを示す。ＤＮＡアレイあるいはＲＮＡアレイには、ＤＮＡマクロアレイあるいはＲＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイあるいはＲＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではチップといった場合、これらのＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイを含むものとする。ＤＮＡチップとしては3D-Gene（登録商標）Human miRNA Oligo chip（東レ株式会社）を用いることができるが、これに限られない。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。
本発明における「ＲＮＡの検出」の例としては、吸光度測定、蛍光強度測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析、これらを組み合わせた解析などが挙げられる。好ましくは、吸光度測定、蛍光強度測定、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ等である。より好ましくは、蛍光強度測定、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、ＲＮＡアレイ解析から選択される。ＲＴ－ＰＣＲはＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣｒ、ＲＴ－ｑＰＣＲは、定量的逆転写ＰＣＲ等とも呼ばれ、ＰＣＲによる増幅を経時的に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡの定性と定量を行える。すなわち、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲでｃＤＮＡを増幅し、増幅反応を評価することで、特定の微量ＲＮＡまたはＤＮＡを高感度に定量的に解析する。定量は、反応液の中に蛍光標識プローブまたは蛍光色素等を添加し検出することでできる。増幅反応の評価は、Ｃｑ値、Ｔｍ値、非特異増幅の有無等の値に基づいて行うことができ、これらの値は１種類を単独で評価に用いてもよく、２種類以上を組み合わせて評価に用いてもよい。Ｃｑ値はＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）と同義であり、一定の増幅産物量になるＰＣＲサイクル数を意味する。Ｃｑ値が小さいことは鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡが多いことを示し、Ｃｑ値が大きいことは鋳型となるＲＮＡまたはＤＮＡが少ないことを示す。ＤＮＡアレイあるいはＲＮＡアレイには、ＤＮＡマクロアレイあるいはＲＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイあるいはＲＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではチップといった場合、これらのＤＮＡアレイまたはＲＮＡアレイを含むものとする。ＤＮＡチップとしては3D-Gene（登録商標）Human miRNA Oligo chip（東レ株式会社）を用いることができるが、これに限られない。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。
【0052】
６．ＲＮＡの検出方法、ＲＮＡを含む溶液について
本発明は、前述の方法で製造されたＲＮＡを含む溶液を用いることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法をも含む。当該検出の工程は、前述の「ＲＮＡの検出」に用いることのできる検出方法で行えばよい。
本発明は、前述の方法で製造されたＲＮＡを含む溶液を用いることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法をも含む。当該検出の工程は、前述の「ＲＮＡの検出」に用いることのできる検出方法で行えばよい。
【0053】
また、本発明は、前述の検出における検出の対象となる、当該生物試料を精製してなるＲＮＡを含む溶液であって、グアニジン塩濃度が０．５ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることを特徴とする、ＲＮＡを含む溶液をも含む。当該ＲＮＡを含む溶液は、例えば生物試料を前述の精製工程に付すことによって得ることができる。
【実施例0054】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0055】
＜材料＞
グアニジンチオシアナートは東京化成工業株式会社から、Quant-it（商標） RiboGreen RNA Assay Kit（商標）はThermo Fisher Scientificから購入した。
グアニジンチオシアナートは東京化成工業株式会社から、Quant-it（商標） RiboGreen RNA Assay Kit（商標）はThermo Fisher Scientificから購入した。
【0056】
＜検体の採取＞
インフォームドコンセントを得た健常体からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いて血清を採取した。
インフォームドコンセントを得た健常体からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いて血清を採取した。
【0057】
＜ＲＮＡを含む溶液の製造＞
以下の実施例１～２０および比較例１～９においては、ＲＮＡを含む溶液の製造は以下のＡ．～Ｄ．の工程からなる方法で行った。
以下の実施例１～２０および比較例１～９においては、ＲＮＡを含む溶液の製造は以下のＡ．～Ｄ．の工程からなる方法で行った。
【0058】
Ａ．抽出工程
検出対象のＲＮＡと結合しているタンパク質を変性させ、当該結合を解消させるために、表１または表２に記載の濃度になるようにグアニジンチオシアン酸塩を血清３００μＬに添加してから、3D-Gene（登録商標）RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従って水層からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを含む粗抽出物溶液３００μＬを得た。
検出対象のＲＮＡと結合しているタンパク質を変性させ、当該結合を解消させるために、表１または表２に記載の濃度になるようにグアニジンチオシアン酸塩を血清３００μＬに添加してから、3D-Gene（登録商標）RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従って水層からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを含む粗抽出物溶液３００μＬを得た。
【0059】
Ｂ．吸着工程
得られた粗抽出物溶液３００μＬにエタノール４５０μＬを添加し、混和後、Whatman（商標）96-well Deep Well Polypropylene UniPlate（商標）Microplates(Cytiva)に全量アプライし、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心した。これにより、アプライされた溶液を、プレートに固定されたシリカメンブレンに対して通過させ、溶液中のＲＮＡを当該メンブレンに吸着させ、溶出液は除去した。
得られた粗抽出物溶液３００μＬにエタノール４５０μＬを添加し、混和後、Whatman（商標）96-well Deep Well Polypropylene UniPlate（商標）Microplates(Cytiva)に全量アプライし、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心した。これにより、アプライされた溶液を、プレートに固定されたシリカメンブレンに対して通過させ、溶液中のＲＮＡを当該メンブレンに吸着させ、溶出液は除去した。
【0060】
Ｃ．洗浄工程
Ｂ．吸着工程において前記メンブレンに吸着した検出対象となるＲＮＡを、当該メンブレン上に保持させるために、カオトロピック物質含有洗浄液（［グアニジンチオシアン酸塩濃度３７．５９％（ｗ／ｗ）＋クエン酸濃度０．６７％（ｗ／ｗ）］水溶液：９９．５％エタノール＝１：２で混合した溶液）７００μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心することで当該メンブレンに前記洗浄液を通過させて洗浄し、溶出液を除去した。カオトロピック物質を含まない洗浄液（トリス－ＨＣｌ（Sigma-Aldrich）濃度０．６１％（ｗ／ｗ）水溶液：９９．５％エタノール＝１：４で混合した溶液）５００μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心することで当該メンブレンに前記洗浄液を通過させて洗浄し、溶出液を除去した。カオトロピック物質を含まない洗浄液による洗浄操作を全部で表１に記載の回数繰り返した。
Ｂ．吸着工程において前記メンブレンに吸着した検出対象となるＲＮＡを、当該メンブレン上に保持させるために、カオトロピック物質含有洗浄液（［グアニジンチオシアン酸塩濃度３７．５９％（ｗ／ｗ）＋クエン酸濃度０．６７％（ｗ／ｗ）］水溶液：９９．５％エタノール＝１：２で混合した溶液）７００μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心することで当該メンブレンに前記洗浄液を通過させて洗浄し、溶出液を除去した。カオトロピック物質を含まない洗浄液（トリス－ＨＣｌ（Sigma-Aldrich）濃度０．６１％（ｗ／ｗ）水溶液：９９．５％エタノール＝１：４で混合した溶液）５００μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、３分間遠心することで当該メンブレンに前記洗浄液を通過させて洗浄し、溶出液を除去した。カオトロピック物質を含まない洗浄液による洗浄操作を全部で表１に記載の回数繰り返した。
【0061】
Ｄ．溶出工程
１５００Ｇ、２５℃、２分間遠心した。ＲＮａｓｅフリー水（Thermo Fisher Scientific）８０μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、２分間遠心することで、ＲＮＡ溶液を得た。得られたＲＮＡを含む溶液８０μＬを乾固し、ＲＮａｓｅフリー水５μＬに再溶解した。
１５００Ｇ、２５℃、２分間遠心した。ＲＮａｓｅフリー水（Thermo Fisher Scientific）８０μＬを添加し、１５００Ｇ、２５℃、２分間遠心することで、ＲＮＡ溶液を得た。得られたＲＮＡを含む溶液８０μＬを乾固し、ＲＮａｓｅフリー水５μＬに再溶解した。
【0062】
＜ＲＮＡ濃度の測定（ＲＮＡの検出）＞
以下の実施例１～６および比較例１、２においては、以下のとおり蛍光強度測定による方法でＲＮＡ濃度を測定した。
以下の実施例１～６および比較例１、２においては、以下のとおり蛍光強度測定による方法でＲＮＡ濃度を測定した。
【0063】
血清３００μＬから得たＲＮＡ溶液に対して、Quant-it（商標）RiboGreen RNA Assay Kit（商標）（Thermo Fisher Scientific）を用いて同社が定めるプロトコールに基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。検量線を作製するため、Quant-it（商標）RiboGreen RNA Assay Kit（商標）に同封されている濃度既知のｒＲＮＡを同社が定めるプロトコールに基づいて蛍光標識した。蛍光標識したｍｉＲＮＡ及びｒＲＮＡの蛍光強度をNanoDrop（商標）3300蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific）のRiboGreen RNA メソッドを用いて測定した。濃度既知のｒＲＮＡの蛍光強度から検量線を作成し、得られたｍｉＲＮＡの蛍光強度を比較してＲＮＡ濃度を算出した。
【0064】
＜遺伝子発現量の測定＞
以下の実施例７～１１および比較例３においては、以下のとおりＤＮＡアレイ（ハイブリダイゼーション）による方法でｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐの発現量を測定した。
以下の実施例７～１１および比較例３においては、以下のとおりＤＮＡアレイ（ハイブリダイゼーション）による方法でｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐの発現量を測定した。
【0065】
血清３００μＬから得たＲＮＡ溶液に対して、3D-Gene（登録商標）miRNA Labeling kit（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコール（ｖｅｒ２．２０）に基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、miRBase release 22に登録されているｍｉＲＮＡの中で、２，６３２種のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した3D-Gene（登録商標）Human miRNA Oligo chip（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを3D-Gene（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して3D-Gene（登録商標）Extraction（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行った。その結果、血清３００μＬに対する、網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。数値化されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を用いた計算及び統計解析は、Ｒ言語４．０．３（R Development Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, URL https://www.r-project.org/）を用いて実施した。
【0066】
以下の実施例１２～１４および比較例４、５においては、ＲＴ－ＰＣＲによってｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐの発現量を測定した。同様に、実施例１５～１７および比較例６、７においてはＲＴ－ＰＣＲによってｈｓａ－ｍｉＲ－４８４の発現量を、実施例１８～２０および比較例８、９においてはＲＴ－ＰＣＲによってｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐの発現量を測定した。
【0067】
血清３００μＬから得たＲＮＡ溶液に対して、TaqMan（登録商標）Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher SCIENTIFIC,Inc.)を用いて、同社が定めるプロトコールに基づいてｔｏｔａｌ ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを取得後、得られたｃＤＮＡに対して、増幅反応を行った。増幅されたｃＤＮＡに対して、TaqMan（登録商標）Fast Advanced Master Mix for qPCR (Thermo Fisher SCIENTIFIC,Inc.)およびTaqMan（登録商標）Advanced miRNA Assays (Thermo Fisher SCIENTIFIC,Inc.)を用い、同社が定めるプロトコールに基づいて、リアルタイムＰＣＲシステム(CFX96、Bio-Rad Laboratories,Inc.)によるリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲ反応終了後、解析ソフトウェアCFXマネージャーソフトウェア(Bio-Rad Laboratories,Inc.)を使用してＣｑ値を算出した。Taqman（登録商標）Advanced miRNA Assays (Thermo Fisher SCIENTIFIC,Inc.)には、配列番号１～３の各塩基配列に対するTaqman（登録商標）Advanced miRNA Assays (Thermo Fisher SCIENTIFIC,Inc.)を用いた。すなわち、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ（配列番号３）である。
【0068】
＜グアニジウムイオン濃度の測定＞
以下の実施例１～１１および比較例１～３においては、グアニジウムイオン濃度を、イオンクロマトグラフィー(Thermo Fisher Scientific)により以下の条件により測定した。
装置：INTEGRION ICS-6000(Thermo Fisher Scientific)
カラム：Dionex（商標）IonPac（商標）CS14 ICカラム(Thermo Fisher Scientific)
溶離液：メタンスルホン酸（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度。
以下の実施例１～１１および比較例１～３においては、グアニジウムイオン濃度を、イオンクロマトグラフィー(Thermo Fisher Scientific)により以下の条件により測定した。
装置：INTEGRION ICS-6000(Thermo Fisher Scientific)
カラム：Dionex（商標）IonPac（商標）CS14 ICカラム(Thermo Fisher Scientific)
溶離液：メタンスルホン酸（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度。
【0069】
（実施例１） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
表１に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。各ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を前記ＲＮＡ濃度の測定方法で、ＲＮＡ溶液に含まれるＲＮＡ由来の蛍光強度を元にＲＮＡ濃度を算出した。結果を表１（ａ）に示す。
表１に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。各ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を前記ＲＮＡ濃度の測定方法で、ＲＮＡ溶液に含まれるＲＮＡ由来の蛍光強度を元にＲＮＡ濃度を算出した。結果を表１（ａ）に示す。
【0070】
（実施例２） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから５０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｂ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから５０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｂ）に示す。
【0071】
（実施例３） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１００ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は１０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｃ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１００ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は１０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｃ）に示す。
【0072】
（実施例４） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を２０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから２００ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｄ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから２００ｍＭに変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｄ）に示す。
【0073】
（実施例５） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を３０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから３００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は３０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｅ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから３００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は３０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｅ）に示す。
【0074】
（実施例６） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１０００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は５０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｆ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１０００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は５０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｆ）に示す。
【0075】
（比較例１） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を０．２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｇ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｇ）に示す。
【0076】
（比較例２） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１００ｍＭ含むＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１０００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は１００ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｈ）に示す。
実施例１において、Ａ．抽出工程において血清に添加したグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を１０ｍＭから１０００ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は１００ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度算出結果を、表１（ｈ）に示す。
【0077】
【表1】
【0078】
（実施例７） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を０．５ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
表２に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加することなく、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が０．５ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ由来の蛍光強度を元に算出した。結果を表２（ａ）に示す。
表２に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加することなく、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が０．５ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ由来の蛍光強度を元に算出した。結果を表２（ａ）に示す。
【0079】
（実施例８） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が１００ｍＭとなるように添加したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度が２ｍＭであった。蛍光強度に基づく各ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量算出結果を、表２（ｂ）に示す。
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が１００ｍＭとなるように添加したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度が２ｍＭであった。蛍光強度に基づく各ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量算出結果を、表２（ｂ）に示す。
【0080】
（実施例９） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が２００ｍＭとなるように添加したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量算出結果を、表２（ｃ）に示す。
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が２００ｍＭとなるように添加したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量算出結果を、表２（ｃ）に示す。
【0081】
（実施例１０） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を２０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が２００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｄ）に示す。
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が２００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、２０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｄ）に示す。
【0082】
（実施例１１） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が５００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｅ）に示す。
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が５００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計３回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５０ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｅ）に示す。
【0083】
（比較例３） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１００ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が１０００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１００ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｆ）に示す。
実施例７において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度が１０００ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例７と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１００ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ量測定結果を、表２（ｆ）に示す。
【0084】
【表2】
【0085】
（実施例１２） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量
表３に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表３（ａ）に示す。
表３に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表３（ａ）に示す。
【0086】
（実施例１３） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量算出結果を、表３（ｂ）に示す。
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量算出結果を、表３（ｂ）に示す。
【0087】
（実施例１４） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１×１０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｃ）に示す。
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｃ）に示す。
【0088】
（比較例４） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を０．２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｄ）に示す。
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｄ）に示す。
【0089】
（比較例５） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１×１０２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｅ）に示す。
実施例１２において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１２と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ量測定結果を、表３（ｅ）に示す。
【0090】
【表3】
【0091】
（実施例１５） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量
表４に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表４（ａ）に示す。
表４に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表４（ａ）に示す。
【0092】
（実施例１６） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量算出結果を、表４（ｂ）に示す。
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量算出結果を、表４（ｂ）に示す。
【0093】
（実施例１７） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１×１０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更し、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｃ）に示す。
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更し、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｃ）に示す。
【0094】
（比較例６） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を０．２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｄ）に示す。
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｄ）に示す。
【0095】
（比較例７） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１×１０２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｅ）に示す。
実施例１５において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を、添加後濃度を１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１５と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４量測定結果を、表４（ｅ）に示す。
【0096】
【表4】
【0097】
（実施例１８） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量
表５に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表５（ａ）に示す。
表５に記載の通り、Ａ．抽出工程において前記検体の採取方法で採取した血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加後濃度が１×１０ｍＭとなるように添加し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回として、ＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジウムイオン濃度を前記グアニジウムイオン濃度の測定方法で測定した結果、グアニジンチオシアン酸塩濃度が１ｍＭであった。ＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量を、前記遺伝子発現量の測定方法に基づき、Ｃｑ値を発現量とみなした。結果を表５（ａ）に示す。
【0098】
（実施例１９） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を５ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量算出結果を、表５（ｂ）に示す。
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから５×１０ｍＭに変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、５ｍＭであった。蛍光強度に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量算出結果を、表５（ｂ）に示す。
【0099】
（実施例２０） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１×１０ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｃ）に示す。
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから１×１０２ｍＭに変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｃ）に示す。
【0100】
（比較例８） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を０．２ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｄ）に示す。
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩を添加しなかったこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は０．２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｄ）に示す。
【0101】
（比較例９） ＲＮＡ溶液中にグアニジンチオシアン酸塩を１００ｍＭ含むＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｅ）に示す。
実施例１８において、Ａ．抽出工程において血清にグアニジンチオシアン酸塩の添加後濃度を、１×１０ｍＭから１×１０３ｍＭに変更し、Ｃ．洗浄工程においてカオトロピック物質を含まない洗浄液での洗浄回数を合計４回から合計２回に変更したこと以外は、実施例１８と同様の条件でＲＮＡ溶液を得た。Ｄ．溶出工程によって得られたＲＮＡ溶液中のグアニジンチオシアン酸塩濃度は、１×１０２ｍＭであった。Ｃｑ値に基づくＲＮＡ溶液のｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ量測定結果を、表５（ｅ）に示す。
【0102】
【表5】
【配列表】