特開 2024-144146 三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024144146

(43)【公開日】2024-10-11

(54)【発明の名称】三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20241003BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20241003BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20241003BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20241003BHJP

【ＦＩ】

G01N33/48 M

G01N33/483 C

G01N33/48 P

C12Q1/06

C12M1/34 B

C12N1/20 A

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024022630

(22)【出願日】2024-02-19

(31)【優先権主張番号】10-2023-0040438

(32)【優先日】2023-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】517065149

【氏名又は名称】トモキューブ， インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔｏｍｏｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】Ｆｌ． ４， １５５， Ｓｉｎｓｅｏｎｇｒｏ， Ｙｕｓｅｏｎｇ ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ， ３４１０９ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ト・ジェピル

(72)【発明者】

【氏名】イ・スミン

(72)【発明者】

【氏名】キム・ヒェジン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045CB21

2G045FA19

2G045FB12

4B029AA07

4B029BB02

4B029FA01

4B029FA11

4B029FA15

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ06

4B063QR75

4B063QS40

4B065AA37X

4B065AC09

4B065AC12

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置を提供する。
【解決手段】一実施形態に係るマイコプラズマ検出方法は、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、前記試料に対する三次元定量位相画像を生成する段階、および前記生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階を含む。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置のマイコプラズマ検出方法であって、
少なくとも１つのプロセッサにより、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、前記試料に対する三次元定量的位相画像を生成する段階、および
前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階
を含む、マイコプラズマ検出方法。

【請求項2】

前記形態学的特徴は、前記試料が含む細胞の屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）、サイズ（ｓｉｚｅ）、および表面積比（ｓｐｈｅｒｉｃｉｔｙ）のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載のマイコプラズマ検出方法。

【請求項3】

前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、
前記生成された三次元定量位相画像において前記試料が含む対象細胞株に対して、前記形態学的特徴に基づいて顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）の数に対する分布を計算する段階、
前記対象細胞株と同じ種類の未感染の比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得する段階、および
前記対象細胞株の顆粒の数に対する分布と前記比較細胞株の顆粒の数に対する分布を比較して、前記対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階
を含むことを特徴とする、請求項１に記載のマイコプラズマ検出方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記比較細胞株に対して、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）の数に対するデータベースを構築する段階
をさらに含み、
前記比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得する段階は、
前記データベースから前記比較細胞株の顆粒の数を取得し、前記取得した顆粒の数に対する分布を計算することを特徴とする、請求項３に記載のマイコプラズマ検出方法。

【請求項5】

前記対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、
前記対象細胞株の顆粒の数の平均値または中間値と前記比較細胞株の顆粒の数の平均値または中間値が予め設定された標準偏差以上の差を示す場合、前記対象細胞株がマイコプラズマに感染していると決定することを特徴とする、請求項３に記載のマイコプラズマ検出方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記試料に対して、直接染色法に基づいて三次元蛍光画像を生成する段階
をさらに含み、
前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、
前記三次元定量位相画像および前記三次元蛍光画像をオーバーレイした画像の分析結果をさらに利用して前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定することを特徴とする、請求項１に記載のマイコプラズマ検出方法。

【請求項7】

コンピュータ装置と結合して請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の方法をコンピュータ装置に実行させるためにコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録される、コンピュータプログラム。

【請求項8】

請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の方法をコンピュータ装置に実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。

【請求項9】

コンピュータ装置で読み取り可能な命令を実行するように実現された少なくとも１つのプロセッサ
を含み、
前記少なくとも１つのプロセッサにより、
試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、前記試料に対する三次元定量位相画像を生成し、
前記生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定すること
を特徴とする、コンピュータ装置。

【請求項10】

前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定するために、前記少なくとも１つのプロセッサにより、
前記生成された三次元定量位相画像において前記試料が含む対象細胞株に対して、前記形態学的特徴に基づいて顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）の数に対する分布を計算し、
前記対象細胞株と同じ種類の未感染の比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得し、
前記対象細胞株の顆粒の数に対する分布と前記比較細胞株の顆粒の数に対する分布を比較して、前記対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定すること
を特徴とする、請求項９に記載のコンピュータ装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態は、三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置に関する。

【背景技術】

【0002】

定量的位相イメージングは、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化する。

【0003】

マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）は、マイコプラズマとマイコプラズマ属に属する細菌を総称したものであって、そのサイズは２～５μｍ水準で多様であり、細胞壁をもたず、不規則な形態を帯びている。マイコプラズマは、人間や動物に感染し、人工培地で増殖能力を有する最小の細菌の一つであり、細胞培養時に使用される動物由来の原料や試薬、または製造環境によって汚染されることもあるが、微小な生物であるため肉眼で検出されることはほぼない。マイコプラズマには、マイコプラズマ・ニューモニア、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ボビス、マイコプラズマ・ガリセプチカムなどのような多様な亜型がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】韓国登録特許第１０－１５５５１４７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置のマイコプラズマ検出方法であって、前記少なくとも１つのプロセッサにより、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、前記試料に対する三次元定量位相画像を生成する段階、および前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階を含む、マイコプラズマ検出方法を提供する。

【0007】

一側によると、前記形態学的特徴は、前記試料が含む細胞の屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）、サイズ（ｓｉｚｅ）、および表面積比（ｓｐｈｅｒｉｃｉｔｙ）のうちの少なくとも１つを含むことを特徴としてよい。

【0008】

他の側面によると、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、前記生成された三次元定量的位相画像において前記試料が含む対象細胞株に対して、前記形態学的特徴に基づいて顆粒の数に対する分布を計算する段階、前記対象細胞株と同じ種類の感染されていない比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得する段階、および前記対象細胞株の顆粒の数に対する分布と前記比較細胞株の顆粒の数に対する分布を比較して、前記対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階を含むことを特徴としてよい。

【0009】

また他の側面によると、前記マイコプラズマ検出方法は、前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記比較細胞株に対して顆粒の数に対するデータベースを構築する段階をさらに含み、前記比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得する段階は、前記データベースから前記比較細胞株の顆粒の数を取得し、前記取得した顆粒の数に対する分布を計算することを特徴としてよい。

【0010】

また他の側面によると、前記対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、前記対象細胞株の顆粒の数の平均または中間値と前記比較細胞株の顆粒の数の平均または中間値が予め設定された標準偏差以上の差を示す場合、前記対象細胞株がマイコプラズマに感染していると決定することを特徴としてよい。

【0011】

さらに他の側面によると、前記マイコプラズマ検出方法は、前記少なくとも１つのプロセッサにより、前記試料に対して直接染色法に基づいて三次元蛍光画像を生成する段階をさらに含み、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する段階は、前記三次元定量位相画像と前記三次元蛍光画像をオーバーレイした画像の分析結果をさらに利用して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定することを特徴としてよい。

【0012】

コンピュータ装置と結合して前記方法をコンピュータ装置に実行させるためにコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録される、コンピュータプログラムを提供する。

【0013】

前記方法をコンピュータ装置に実行させるためのプログラムが記録されている、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。

【0014】

コンピュータ装置で読み取り可能な命令を実行するように実現される少なくとも１つのプロセッサを含み、前記少なくとも１つのプロセッサにより、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、前記試料に対する三次元定量位相画像を生成し、前記生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、前記試料のマイコプラズマの感染の有無を決定することを特徴とする、コンピュータ装置を提供する。

【発明の効果】

【0015】

三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

本発明に対する理解を助けるために詳細な説明の一部として含まれる添付の図面は、本発明に対する実施形態を提供し、詳細な説明とともに本発明の技術的思想を説明する。

【図1】本発明の一実施形態における、コンピュータ装置の一例を示したブロック図である。

【図2】本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成の一例を示した図である。

【図3】本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出方法の一例を示したフローチャートである。

【図4】本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成の他の例を示した図である。

【図5】本発明の一実施形態における、三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する一例を示したフローチャートである。

【図6】本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成のさらに他の例を示した図である。

【図7】本発明の一実施形態における、三次元定量位相画像と直接染色法画像を同時に使用してマイコプラズマを検出する一例を示した図である。

【図8】本発明の実施形態における、三次元定量位相画像、三次元蛍光画像、または三次元定量位相画像と三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の一例を示した図である。

【図9】本発明の実施形態における、三次元定量位相画像、三次元蛍光画像、または三次元定量位相画像と三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の一例を示した図である。

【図10】本発明の実施形態における、三次元定量位相画像、三次元蛍光画像、または三次元定量位相画像と三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の一例を示した図である。

【図11】本発明の実施形態における、三次元定量位相画像、三次元蛍光画像、または三次元定量位相画像と三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の一例を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書および特許請求の範囲で使用する用語や単語は、通常的あるいは辞書的な意味に限定して解釈されてはならず、発明者は自身の発明を最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に立脚して、本発明の技術思想に符号する意味や概念として解釈されなければならない。したがって、本明細書に記載された実施形態と図面に示した構成は、本発明の最も好ましい１つの実施形態に過ぎず、本発明の技術的思想をすべて代弁するものではないため、本出願時点にこれを代替することが可能な多様な均等物や変形例が存在し得るということを理解しなければならない。

【0018】

マイコプラズマ検出は、次のような多様な環境で使用される。

【0019】

生物医学研究：マイコプラズマ汚染は、実験結果に影響を与え、研究データの信頼性の低下につながる。したがって、マイコプラズマ検出は、研究結果の有効性を保障するために極めて重要となる。

【0020】

バイオ医薬品生産：マイコプラズマは最終製品の安全性と効能に影響を与える恐れがあるため、マイコプラズマ汚染はバイオ医薬品生産において深刻な問題となり得る。したがって、バイオ医薬品生産の品質管理プロセスの一環としてマイコプラズマ否定試験が必要とされている。

【0021】

臨床診断：マイコプラズマ菌種は人間や動物の多様な疾病を誘発することから、マイコプラズマ検出は、このような感染を診断するために使用される。

【0022】

獣医学：マイコプラズマは動物にも感染するため、家畜に感染した場合、生産性の低下、疾病、および経済的損失を招来する恐れがある。マイコプラズマ検出は、このような感染を診断して制御するために使用される。

【0023】

全般的に、マイコプラズマ検出は、生物学的製品の安全性と効能を保障し、人間と動物の健康を保護するために重要なものであると言える。

【0024】

マイコプラズマは細胞壁をもたず、細胞壁を標的とする既存の多くの抗生剤に影響を受けないバクテリアである。このバクテリアは人間や動物に多様な疾病を引き起こす恐れがあり、研究に使用される細胞培養でよく発見される。

【0025】

細胞培養でマイコプラズマ汚染を検出する方法としては、次のようなものが挙げられる。

【0026】

直接顕微鏡検査：マイコプラズマ細胞はサイズが小さいため、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡で観察しなければならない。この方法は特殊な染色作業を必要とし、他の方法ほど感度が高くないこともある。

【0027】

酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）：この方法は、マイコプラズマタンパク質に特異的な抗体を使用してバクテリアを検出する。サンプルの細胞を溶解させた後、マイコプラズマタンパク質が抗体に結合すれば比色または蛍光信号を示し、この信号を検出して判別する。

【0028】

ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）：ＰＣＲは、サンプルから極少量のマイコプラズマＤＮＡを検出することができる高感度の方法である。ＰＣＲプライマーはマイコプラズマゲノムの特定の領域を標的にするように設計されており、増幅したＤＮＡは、ゲル電気泳動またはその他の方法によって検出することができる。

【0029】

間接的方法：間接的方法は、マイコプラズマ細胞やＤＮＡを直接検出するのではなく、マイコプラズマ汚染による細胞培養の変化を感知する方法である。このような間接的方法では、細胞形態、代謝、または遺伝子発現の変化だけでなく、細胞培養培地のｐＨまたはその他の化学的特性の変化を感知することも含まれる。

【0030】

このような方法にはそれぞれメリットとデメリットがあり、研究者または研究室の特定のニーズによって方法の選択が異なる。研究結果の信頼性を保障するために、細胞培養にマイコプラズマ汚染があるかどうかを定期的にテストすることが望ましい。

【0031】

以下の表１は、多様なマイコプラズマ検出方法の感度、メリットおよびデメリットを示している。

【0032】

【表1】

【0033】

表１の検出方法の例において直接ＤＮＡ染色（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｓｔａｉｎ）方法（以下、「直接染色法」とする）が最も迅速で低価な方法であるが、感度が低いという欠点がある。

【0034】

マイコプラズマ検出のためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料を使用する直接染色法は、蛍光顕微鏡を基盤とする方法であって、マイコプラズマ細胞を蛍光染料で染色して顕微鏡で観察する方法である。この方法は迅速で簡単に実行することが可能ではあるが、次のような欠点もある。

【0035】

低感度：Ｈｏｅｃｈｓｔ染料はマイコプラズマＤＮＡと宿主細胞ＤＮＡの両方を染色するため、マイコプラズマ細胞と宿主細胞の区別が難しいことがある。このため偽陰性率が高く、低い水準のマイコプラズマ汚染を感知し難い場合もある。

【0036】

制限された特異性：Ｈｏｅｃｈｓｔ染料はサンプルのすべてのＤＮＡを染色するため、非特異的染色につながり、偽陽性率を高めることがある。このため結果解釈に混乱をきたす恐れがあり、より具体的な方法による追加確認を必要とすることがある。

【0037】

制限された情報：直接染色法は、サンプル中のマイコプラズマ細胞の数や位置などのマイコプラズマ汚染に関する制限された情報を提供する。したがって、汚染の程度や深刻性を把握して、これを制御するための適切な処置をとるのが難しい場合がある。

【0038】

全般的に、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料を使用する直接染色法は、マイコプラズマ検出のための迅速かつ簡単な方法ではあるが、感度、特異性、汚染に関する詳細な情報を提供する能力に影響を与える限界がいくつか存在する。例えば、直接染色法は、代表的に核染色試薬を使用するときに、染色ノイズ（ａｒｔｉｆａｃｔ、非特異的染色）により、実際にマイコプラズマのＤＮＡかどうかを判断するのが難しい。したがって、マイコプラズマ汚染を正確に検出して定量化するためには、ＰＣＲやＥＬＩＳＡのようなより具体的で感度の高い方法を使用するのが好ましいが、ＰＣＲやＥＬＩＳＡも表１のようなデメリットを抱えている。

【0039】

本発明の実施形態に係るマイコプラズマ検出方法およびシステムは、三次元定量位相画像を利用してマイコプラズマを検出することができる。例えば、一実施形態に係るマイコプラズマ検出方法およびシステムは、細胞株に対する三次元定量位相画像における形態学的特徴（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｆｅａｔｕｒｅ）を利用してマイコプラズマの感染の有無を判断することによって、マイコプラズマを検出することができる。ここで、形態学的特徴は、屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）、サイズ（ｓｉｚｅ）、表面積比（ｓｐｈｅｒｉｃｉｔｙ）などを含んでよい。例えば、マイコプラズマに感染した細胞の屈折率は他の細胞小器官の屈折率よりも相対的に高いという点に基づいて、マイコプラズマの感染の有無を判断してよい。

【0040】

本発明の実施形態に係るマイコプラズマ検出システムは、少なくとも１つのコンピュータ装置によって実現されてよい。このとき、コンピュータ装置においては、本発明の一実施形態に係るコンピュータプログラムがインストールされて実行されてよく、コンピュータ装置は、実行されたコンピュータプログラムの制御にしたがって本発明の実施形態に係るマイコプラズマ検出方法を実行してよい。前記コンピュータプログラムは、コンピュータ装置と結合してマイコプラズマ検出方法をコンピュータに実行させるためにコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されてよい。

【0041】

図１は、本発明の一実施形態における、コンピュータ装置の一例を示したブロック図である。コンピュータ装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）１００は、図１に示すように、メモリ（Ｍｅｍｏｒｙ）１１０、プロセッサ（Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）１２０、通信インタフェース（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）１３０、および入力／出力インタフェース（Ｉ／Ｏ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）１４０を含んでよい。メモリ１１０は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、ＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）、およびディスクドライブのような永続的大容量記録装置（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｅｖｉｃｅ）を含んでよい。ここで、ＲＯＭやディスクドライブのような永続的大容量記録装置は、メモリ１１０とは区分される別の永続的記録装置としてコンピュータ装置１００に含まれてもよい。また、メモリ１１０には、オペレーティングシステムと、少なくとも１つのプログラムコードが記録されてよい。このようなソフトウェア構成要素は、メモリ１１０とは別のコンピュータ読み取り可能な記録媒体からメモリ１１０にロードされてよい。このような別のコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、フロッピー（登録商標）ドライブ、ディスク、テープ、ＤＶＤ／ＣＤ－ＲＯＭドライブ、メモリカードなどのコンピュータ読み取り可能な記録媒体を含んでよい。他の実施形態において、ソフトウェア構成要素は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体ではない通信インタフェース１３０を通じてメモリ１１０にロードされてもよい。例えば、ソフトウェア構成要素は、ネットワーク（Ｎｅｔｗｏｒｋ）１６０を介して受信されるファイルによってインストールされるコンピュータプログラムに基づいてコンピュータ装置１００のメモリ１１０にロードされてよい。

【0042】

プロセッサ１２０は、基本的な算術、ロジック、および入出力演算を実行することにより、コンピュータプログラムの命令を処理するように構成されてよい。命令は、メモリ１１０または通信インタフェース１３０によって、プロセッサ１２０に提供されてよい。例えば、プロセッサ１２０は、メモリ１１０のような記録装置に記録されたプログラムコードにしたがって受信される命令を実行するように構成されてよい。

【0043】

通信インタフェース１３０は、ネットワーク１６０を介してコンピュータ装置１００が他の装置と互いに通信するための機能を提供してよい。一例として、コンピュータ装置１００のプロセッサ１２０がメモリ１１０のような記録装置に記録されたプログラムコードにしたがって生成した要求や命令、データ、ファイルなどが、通信インタフェース１３０の制御にしたがってネットワーク１６０を介して他の装置に伝達されてよい。これとは逆に、他の装置からの信号や命令、データ、ファイルなどが、ネットワーク１６０を経てコンピュータ装置１００の通信インタフェース１３０を通じてコンピュータ装置１００に受信されてよい。通信インタフェース１３０を通じて受信された信号や命令、データなどは、プロセッサ１２０やメモリ１１０に伝達されてよく、ファイルなどは、コンピュータ装置１００がさらに含むことのできる記録媒体（上述した永続的記録装置）に記録されてよい。

【0044】

入力／出力インタフェース１４０は、入力／出力装置（Ｉ／Ｏ ｄｅｖｉｃｅ）１５０とのインタフェースのための手段であってよい。例えば、入力装置は、マイク、キーボード、またはマウスなどの装置を、出力装置は、ディスプレイ、スピーカのような装置を含んでよい。他の例として、入力／出力インタフェース１４０は、タッチスクリーンのように入力と出力のための機能が１つに統合された装置とのインタフェースのための手段であってもよい。入力／出力装置１５０は、コンピュータ装置１００と１つの装置で構成されてもよい。

【0045】

また、他の実施形態において、コンピュータ装置１００は、図１の構成要素よりも少ないか多くの構成要素を含んでもよい。しかし、大部分の従来技術的構成要素を明確に図に示す必要はない。例えば、コンピュータ装置１００は、上述した入力／出力装置１５０のうちの少なくとも一部を含むように実現されてもよいし、トランシーバ、データベースなどのような他の構成要素をさらに含んでもよい。

【0046】

図２は、本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成の一例を示した図であり、図３は、本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出方法の一例を示したフローチャートである。本実施形態に係るマイコプラズマ検出装置２００は、上述したコンピュータ装置１００によって実現されてよく、三次元定量位相画像生成部２１０および三次元定量位相画像分析部２２０を含んでよい。このとき、コンピュータ装置１００のプロセッサ１２０は、メモリ１１０が含むオペレーティングシステムのコードと、少なくとも１つのコンピュータプログラムのコードとによる制御命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を実行するように実現されてよい。ここで、プロセッサ１２０は、コンピュータ装置１００に記録されたコードが提供する制御命令にしたがって、コンピュータ装置１００が図３の方法に含まれる段階３１０～３２０を実行するようにコンピュータ装置１００を制御してよい。この場合、三次元定量位相画像生成部２１０および三次元定量位相画像分析部２２０は、コンピュータ装置１００が含むプロセッサ１２０の機能的表現（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ）であってよい。例えば、三次元定量位相画像生成部２１０は、プロセッサ１２０がメモリ１１０にロードされたコードにしたがって三次元定量位相画像を生成するようにコンピュータ装置１００を制御する機能の論理的表現であってよい。

【0047】

段階３１０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像生成部２１０は、試料を通過する光から誘導された位相のずれを定量化して試料を特性化することによって、試料に対する三次元定量位相画像を生成してよい。一例として、コンピュータ装置１００は、光学回折断層撮影法や光学投影断層撮影法を使用して光源から出た光を細胞に入射させ、細胞で回折した透過光を干渉計を利用して測定することによって、そのホログラムを測定してよい。このとき、細胞に入射する角度を回転（スキャン）させながら測定された複数枚の２次元ホログラムを利用して、細胞の三次元屈折率分布を測定してよい。光学回折断層撮影法と光学投影断層撮影法の違いは、試料での光の回折の有無を考慮する復元アルゴリズムの有無にある。実施形態によって、図１を参照しながら説明した入力／出力装置１５０は、光学回折断層撮影法や光学投影断層撮影法のための撮影装置をさらに含んでよい。例えば、撮影装置は、光源を含み、光源から出た光を細胞に入射させ、細胞で回折した透過光の入力を受け取る。この場合、回折した透過光はコンピュータ装置１００に入力されてよく、コンピュータ装置１００は、干渉計および／または復元アルゴリズムなどを利用して三次元定量位相画像を生成してよい。他の実施形態として、コンピュータ装置１００が三次元定量位相画像を生成するということは、コンピュータ装置１００が撮影装置を制御し、撮影装置が生成した三次元定量位相画像の入力を受け取ることを意味してもよい。

【0048】

段階３２０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像分析部２２０は、生成された三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して、試料のマイコプラズマの感染の有無を決定してよい。上述したように、形態学的特徴は、試料が含む細胞の屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）、サイズ（ｓｉｚｅ）、および表面積比（ｓｐｈｅｒｉｃｉｔｙ）のうちの少なくとも１つを含んでよい。この場合、コンピュータ装置１００は、試料が含む対象細胞の形態学的特徴と未感染の比較細胞の形態学的特徴を比較することによって、試料のマイコプラズマの感染の有無を決定してよい。

【0049】

図４は、本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成の他の一例を示した図であり、図５は、本発明の一実施形態における、三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析して試料のマイコプラズマの感染の有無を決定する一例を示したフローチャートである。本実施形態に係る段階５１０は、図３の段階３２０の前に実行されてよく、残りの段階５２０～５４０は、図３の段階３２０に含まれて実行されてよい。

【0050】

段階５１０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像分析部２２０は、対象細胞株と同じ種類の未感染の比較細胞株に対して、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）の数に対するデータベース４１０を構築してよい。顆粒の数は、三次元定量位相画像の形態学的特徴を分析することによって得ることができる。図４の実施形態に係るマイコプラズマ検出装置４００は、図２を参照しながら説明した三次元定量位相画像生成部２１０および三次元定量位相画像分析部２２０の他に、段階５１０で構築されたデータベース４１０をさらに含む例を示している。

【0051】

段階５２０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像分析部２２０は、生成された三次元定量位相画像において試料が含む対象細胞株に対して、形態学的特徴に基づいて顆粒の数に対する分布を計算してよい。

【0052】

段階５３０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像分析部２２０は、比較細胞株の顆粒の数に対する分布を取得してよい。この場合、コンピュータ装置１００は、段階５１０で構築されたデータベース４１０から比較細胞株の顆粒の数を取得して、この分布を計算してよい。

【0053】

段階５４０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元定量位相画像分析部２２０は、対象細胞株の顆粒の数に対する分布と比較細胞株の顆粒の数に対する分布を比較して、対象細胞株のマイコプラズマの感染の有無を決定してよい。分布間の比較は、多様な統計学的差によってなされてよい。例えば、コンピュータ装置１００は、対象細胞株の顆粒の数の平均または中間値と比較細胞株の顆粒の数の平均または中間値が予め設定された標準偏差以上の差を示す場合、対象細胞株がマイコプラズマに感染していると決定してよい。より具体的な例として、対象細胞株の顆粒の数の平均または中間値と比較細胞株の顆粒の数の平均または中間値が２ｘＳＤ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ） ｏｒ ２．５ＳＤ以上の差を有するとき、統計的な有意差を有すると判断し、この対象細胞株はマイコプラズマに感染していると決定してよい。

【0054】

また、本発明の他の実施形態に係るマイコプラズマ検出方法およびシステムは、三次元定量位相画像と直接染色法画像を同時に使用することで、迅速かつ低価であると同時に、普通以上の高い感度でマイコプラズマを検出することができる。

【0055】

図６は、本発明の一実施形態における、マイコプラズマ検出装置の内部構成のさらに他の一例を示した図であり、図７は、本発明の一実施形態における、三次元定量位相画像と直接染色法画像を同時に使用してマイコプラズマを検出する一例を示した図である。本実施形態に係るマイコプラズマ検出装置６００は、図３を参照しながら説明した三次元定量位相画像生成部２１０および三次元定量位相画像分析部２２０の他に、三次元蛍光画像生成部６１０をさらに含んでよい。また、本実施形態では、段階７１０が、図３の段階３１０の後かつ段階３２０の前に実行される例を示しているが、実施形態によっては図３の段階３１０の前に実行されてもよい。

【0056】

段階７１０で、コンピュータ装置１００、マイコプラズマ検出装置２００、または三次元蛍光画像生成部６１０は、試料に対して、直接染色法に基づいて三次元蛍光画像を生成してよい。この場合、コンピュータ装置１００は、段階３２０で、三次元定量位相画像の形態学的特徴の他にも、三次元定量位相画像および前記三次元蛍光画像をオーバーレイした映像の分析結果をさらに利用して試料のマイコプラズマの感染の有無を決定してよい。例えば、三次元定量位相画像において、マイコプラズマの屈折率は他の細胞内小器官よりも比較的に高いため、マイコプラズマの検出が容易である。しかし、特定の条件、例えば明視野（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）イメージでは、マイコプラズマを区別することが難しい。これにより、実施形態では、三次元定量位相画像および前記三次元蛍光画像をオーバーレイした画像の分析結果をさらに利用して試料のマイコプラズマの感染の有無を決定することにより、明視野イメージのような特定の条件でもマイコプラズマの検出感度を高めることができる。すなわち、本実施形態に係るマイコプラズマ検出方法は、直接染色法画像と三次元定量位相画像を同時に使用することで、互いの欠点を補完することができる。

【0057】

図８～１１は、本発明の実施形態における、三次元定量位相画像、三次元蛍光画像、または三次元定量位相画像と三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の一例を示した図である。

【0058】

図８では、正常（Ｎｏｒｍａｌ）線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とマイコプラズマに感染した線維芽細胞に対する三次元定量位相画像（Ｈｏｌｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＨＴ）、三次元蛍光画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、さらに三次元定量位相画像と三次元蛍光画像のオーバーラップ画像（ＨＴ＋Ｈｏｅｃｈｓｔ）をそれぞれ示している。

【0059】

また、図９では、正常線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とマイコプラズマに感染した線維芽細胞に対する三次元定量位相画像（ＨＴ）、三次元蛍光画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、さらに三次元定量位相画像と三次元蛍光画像のオーバーラップ画像（ＨＴ＋Ｈｏｅｃｈｓｔ）をそれぞれ示している。

【0060】

図８および図９の画像に示されるように、汚染されていない正常細胞では、細胞の核だけが染色され、細胞質内には染色がなされない。しかし、汚染された細胞では、マイコプラズマのＤＮＡが染色されると同時に、染色された部分に三次元定量位相画像の高い屈折率の粒子が観察される。

【0061】

図１０は、正常線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とマイコプラズマに感染した線維芽細胞に対する三次元定量位相画像（Ｈｏｌｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、さらに三次元定量位相画像と三次元蛍光画像のオーバーラップ画像（Ｈｏｌｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｈｏｅｃｈｓｔ）をそれぞれ示している。

【0062】

また、図１１では、マイコプラズマに感染した線維芽細胞に対する明視野画像、三次元定量位相画像（Ｈｏｌｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、さらに三次元定量位相画像と三次元蛍光画像のオーバーラップ画像（Ｈｏｌｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｈｏｅｃｈｓｔ）をそれぞれ示している。

【0063】

図１０および図１１の画像に示されるように、明視野画像ではマイコプラズマを区別することが難しいが、三次元定量位相画像および前記三次元蛍光画像をオーバーラップした画像の分析結果をさらに利用して試料のマイコプラズマの感染の有無を決定することにより、明視野画像のような特定の条件でもマイコプラズマの検出感度を高めることができる。すなわち、直接染色法画像と三次元定量位相画像を同時に使用することで、互いの欠点を補完することができる。

【0064】

このように、本発明の実施形態によると、三次元定量位相画像測定を利用したマイコプラズマ検出方法および装置を提供することができる。

【0065】

上述したシステムまたは装置は、ハードウェア構成要素、またはハードウェア構成要素とソフトウェア構成要素との組み合わせによって実現されてよい。例えば、実施形態で説明された装置および構成要素は、例えば、プロセッサ、コントローラ、ＡＬＵ（ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｌｏｇｉｃ ｕｎｉｔ）、デジタル信号プロセッサ、マイクロコンピュータ、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇａｔｅ ａｒｒａｙ）、ＰＬＵ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｌｏｇｉｃ ｕｎｉｔ）、マイクロプロセッサ、または命令を実行して応答することができる様々な装置のように、１つ以上の汎用コンピュータまたは特殊目的コンピュータを利用して実現されてよい。処理装置は、オペレーティングシステム（ＯＳ）およびＯＳ上で実行される１つ以上のソフトウェアアプリケーションを実行してよい。また、処理装置は、ソフトウェアの実行に応答し、データにアクセスし、データを記録、操作、処理、および生成してもよい。理解の便宜のために、１つの処理装置が使用されるとして説明される場合もあるが、当業者であれば、処理装置が複数個の処理要素および／または複数種類の処理要素を含んでもよいことが理解できるであろう。例えば、処理装置は、複数個のプロセッサまたは１つのプロセッサおよび１つのコントローラを含んでよい。また、並列プロセッサのような、他の処理構成も可能である。

【0066】

ソフトウェアは、コンピュータプログラム、コード、命令、またはこれらのうちの１つ以上の組み合わせを含んでもよく、思うままに動作するように処理装置を構成したり、独立的または集合的に処理装置に命令したりしてよい。ソフトウェアおよび／またはデータは、処理装置に基づいて解釈されたり、処理装置に命令またはデータを提供したりするために、いかなる種類の機械、コンポーネント、物理装置、仮想装置（ｖｉｒｔｕａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）、コンピュータ記録媒体または装置に具現化されてよい。ソフトウェアは、ネットワークによって接続されたコンピュータシステム上に分散され、分散された状態で記録されても実行されてもよい。ソフトウェアおよびデータは、１つ以上のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されてよい。

【0067】

実施形態に係る方法は、多様なコンピュータ手段によって実行可能なプログラム命令の形態で実現されてコンピュータ読み取り可能な媒体に記録されてよい。前記コンピュータ読み取り可能な媒体は、プログラム命令、データファイル、データ構造などを単独でまたは組み合わせて含んでよい。媒体は、コンピュータで実行可能なプログラムを継続して記録するものであっても、実行またはダウンロードのために一時的に記録するものであってもよい。また、媒体は、単一または複数のハードウェアが結合した形態の多様な記録手段または格納手段であってよく、あるコンピュータシステムに直接接続する媒体はもちろん、ネットワーク上に分散して存在するものであってもよい。媒体の例としては、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および磁気テープのような磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤのような光媒体、フロプティカルディスク（ｆｌｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｓｋ）のような光磁気媒体、およびＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリなどのようなプログラム命令が記録されるように構成されたものであってよい。また、他の媒体の例として、アプリケーションを流通するアプリストアや、その他の多様なソフトウェアを供給したり流通したりするサイト、サーバなどで管理する記録媒体や格納媒体も含まれる。プログラム命令の例としては、コンパイラによって生成されるもののような機械語コードだけではなく、インタプリタなどを使用してコンピュータによって実行される高級言語コードを含む。

【0068】

以上のように、実施形態を、限定された実施形態および図面に基づいて説明したが、当業者であれば、上述した記載から多様な修正および変形が可能であろう。例えば、説明された技術が、説明された方法とは異なる順序で実行されたり、かつ／あるいは、説明されたシステム、構造、装置、回路などの構成要素が、説明された方法とは異なる形態で結合されたりまたは組み合わされたり、他の構成要素または均等物によって対置されたり置換されたとしても、適切な結果を達成することができる。

【0069】

したがって、異なる実施形態であっても、特許請求の範囲と均等なものであれば、添付の特許請求の範囲に属する。

【符号の説明】

【0070】

２００：マイコプラズマ検出システム
２１０：三次元定量位相画像生成部
２２０：三次元定量位相画像分析部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】