特開 2024-144441 ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体及び疾患の治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024144441

(43)【公開日】2024-10-11

(54)【発明の名称】ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体及び疾患の治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20241003BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 T

A61P35/00

A61K39/395 E

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K16/28

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024114173

(22)【出願日】2024-07-17

(62)【分割の表示】P 2021536006の分割

【原出願日】2019-12-20

(31)【優先権主張番号】18214478.2

(32)【優先日】2018-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】510340757

【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンデル・ベルトルト・ヘンドリック・バッケル

(72)【発明者】

【氏名】コルネリス・ヤーコプ・ヨハンネス・ゲオルギ・ボル

(72)【発明者】

【氏名】ピーテル・フォッコ・ファン・ロー

(72)【発明者】

【氏名】レオナルド・アンドレス・シリュルニク

(72)【発明者】

【氏名】エルネスト・アイザック・ワッサーマン

(57)【要約】

【課題】ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の対象を治療する手段及び方法を提供する。
【解決手段】いくつかの実施形態において、本方法は、それを必要とする対象を、ＣＤＳ及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与で治療することを含み、第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与のそれぞれにおいて、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌治療法が、間隔をあけての投与レジメンにて提供され、該治療法により、造血幹細胞区画を温存し、正常なＣＬＥＣ１２Ａ陽性造血細胞の回復を可能にする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の対象を治療する方法であって、それを必要とする前記対象を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与で治療することを含み、第１の投与において、前記二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与において、二重特異性抗体の量は、前記第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の分野、特に療法用抗体の分野に関する。抗体はヒトの治療に使用することができる。より具体的には、本発明は、癌の治療のための抗体、好ましくは二重特異性抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、世界で３番目に多い白血病であるが、過去４０年間、疾患の転帰における進展はほとんど見られなかった（Ａｒｒｉｇｈｉ，Ｓｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｗｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ヨーロッパの成人におけるＡＭＬの年間発生率は、１０万人当たり５～８人である。米国では、毎年１０万人当たり４～５人がＡＭＬと新たに診断され、毎年１万人がＡＭＬで死亡している。若年成人の５年生存率は約４０％であるが、これは年齢と共に大幅に低下し、高齢の患者では２５％未満になる。導入化学療法後に形態学的完全寛解を達成した患者の大多数は、その後３年以内に再発する（Ｊｕｌｉｕｓｓｏｎ，Ｌａｚａｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｏｒａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｄｏｒｆ ２０１２）。したがって、これらの患者は、より効果的な作用機序を持つ新しい薬剤の開発を緊急に必要としている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ａｒｒｉｇｈｉ，Ｓｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ．２００３

【非特許文献2】Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．２００９

【非特許文献3】Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｗｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１

【非特許文献4】Ｊｕｌｉｕｓｓｏｎ，Ｌａｚａｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２

【非特許文献5】Ｏｒａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｄｏｒｆ ２０１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、ＡＭＬ芽球及び白血病幹細胞（ＬＳＣ）上で特異的に発現する抗原に重点的に取り組む。この抗原は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ又はＣＬＥＣ１２Ａ（ヒト骨髄阻害性Ｃ型レクチン、ｈＭＩＣＬ、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＬＬ－１、又はＣＤ３７１とも呼ばれる）である（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４，ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７）。ＣＬＥＣ１２Ａは、サブタイプに関係なく、ｄｅ ｎｏｖｏ又は再発性ＡＭＬのいずれかの症例の９０～９５％で白血病細胞に発現する骨髄分化抗原である（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｚｈａｏ，Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｌａｒｓｅｎ，Ｒｏｕｇ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ＣＬＥＣ１２Ａは、ＣＤ３４ＰＯＳＣＤ３８ＮＥＧ ＬＳＣで選択的に発現するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのエビデンスに基づくと、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）、赤血球前駆体、又は巨核球では発現しない（ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｋｉｋｕｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｍｏｔｏ ２０１３）。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明において、ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体は、効率的なＴ細胞媒介性ＣＬＥＣ１２Ａ標的化を誘導し、正常なＨＳＣに影響を与えることなく白血病細胞（白血病幹細胞を含む）を選択的に根絶することにより、治療後に正常な造血を迅速に再開し、それによって、血液毒性を制限できることが示されている。

【0006】

Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットの多くは、血清半減期の短さ、免疫原性、製造面の難しさなどの問題に直面している（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ２０１７）。本発明のＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体は、良好な血清半減期を有する。本発明の手段及び方法は、治療剤に対する免疫応答を著しく誘導しない。

【0007】

本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の対象を治療する方法を提供する。該方法は、それを必要とする対象を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与で治療することを含み、第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与のそれぞれにおいて、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。

【0008】

本発明はまた、対象におけるＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療方法で使用するためのＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を提供する。当該治療は、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与を含み、第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与のそれぞれにおいて、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。

【0009】

一態様では、本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性造血細胞、好ましくはＣＬＥＣ１２Ａ陽性悪性細胞を対象からパージし、当該対象の造血系に正常細胞を再集団化させる方法を提供する。該方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、間隔をあけて投与し、それによりＣＬＥＣ１２Ａ陽性悪性細胞を死滅させることと、当該対象の造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を刺激して、当該造血系に、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を含む新たに形成された造血幹細胞由来細胞を再集団化させることと、を含む。造血幹細胞は骨髄に存在する。有害なＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞の存在は、健康な細胞の栄養素を奪い、区画を塞ぎ、それによって顆粒球、マクロファージ幹細胞の正常な成長と発達が制限される。マクロファージ幹細胞自体は、好塩基球、好中球、好酸球及び単球を生じさせる。本明細書に記載の二重特異性抗体の投与法によって、骨髄区画から有害なＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を除去することにより、健康な造血幹細胞の補充は、栄養素の利用可能性及び骨髄区画のスペースの増加よって刺激され、それらの成長、生存、並びに下流のＣＬＥＣ１２Ａ陽性及びＣＬＥＣ１２Ａ陰性の健康な細胞、例えば好塩基球、好中球、好酸球及び単球への分化が行われる。

【0010】

対象は、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄線維症、又は骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）を有すると診断された対象である。

【0011】

ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療を受けている対象のために自己骨髄細胞移植片を調製する方法も提供される。該方法は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を死滅させるのに好適な条件下で、当該対象の骨髄細胞調製物を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体と共にインキュベートすることと、続いて、骨髄細胞を当該インキュベーションから収集することと、を含む。

【0012】

本発明は、対象におけるＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌を治療する方法を更に提供する。該方法は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を死滅させるのに好適な条件下で、当該対象の骨髄細胞調製物を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体と共にインキュベートすることと、対象を造血系切除療法で治療することと、当該対象に、インキュベートされた骨髄細胞を含む骨髄細胞移植片を提供することと、を含む。

【0013】

対象に、造血幹細胞を温存する癌治療を提供する方法が更に提供される。該方法は、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。対象は、好ましくは、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌を有する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ及びＣＤ３^ＰＯＳ標的細胞に特異的に結合する。ＣＬＥＣ１２Ａ及びＣＤ３へのＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体の結合は、フローサイトメトリーによって腫瘍細胞株のパネル上で測定された。ＨＬ６０：ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ前骨髄性細胞株；ＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＨＯ－Ｋ１：ヒトＣＬＥＣ１２Ａを安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（参照抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体で検証、データは示さず）；ＣＨＯ－Ｋ１：ＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧ親ＣＨＯ－Ｋ１細胞株；Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１：ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞株；Ｊ．ＲＴ－Ｔ３．５：ＣＤ３^ＮＥＧＴ細胞株。

【図1B】ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ及びＣＤ３^ＰＯＳ標的細胞に特異的に結合する。フローサイトメトリーによる正常な末梢血におけるＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体結合プロファイル。分析されたサブセットのゲーティングストラテジーは、ＣＤ４Ｔ細胞：ＣＤ４^ＰＯＳ；ＣＤ８Ｔ細胞：ＣＤ８^ＰＯＳ；ＮＫ細胞：ＣＤ３^ＮＥＧＣＤ５６^ＰＯＳ；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３^ＰＯＳＣＤ５６^ＰＯＳ；Ｂ細胞：ＣＤ１９^ＰＯＳ；骨髄樹状細胞（ＤＣ）：ＢＤＣＡ１^ＰＯＳＣＤ１９^ＮＥＧ；顆粒球：ＳＳＣ－ＦＳＣに基づく；単球：ＣＤ１４^ＰＯＳＣＤ３３^ＰＯＳであった。

【図1C】ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ及びＣＤ３^ＰＯＳ標的細胞に特異的に結合する。フローサイトメトリーによる正常骨髄のＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞区画内で結合するＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体。ＨＳＣ：造血幹細胞；ＭＰＰ：多能性前駆細胞；ＣＭＰ：共通骨髄性前駆細胞；ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞；ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞；ＣＬＰ：共通リンパ球前駆細胞。最終的なＦｃフォーマット（サイレンシングされたＦｃエフェクター機能）でフォーマットされた、抗体ＭＦ４３２７及びＭＦ５１９６並びにアイソタイプ対照ＩｇＧについて示されているデータ。

【図2A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化を媒介し、これらのＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。健康なドナーに由来する休止Ｔ細胞をネガティブ選択により精製し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、対照ＩｇＧ又はＰＢＳの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。細胞を、１０００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度で、示されたＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）と一緒に、５：１のＥ：Ｔ比にて共インキュベートした。ＷＴＦｃエフェクター機能を有する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６プロトタイプが、Ｔ細胞活性化を誘導する能力を、ＰＢＳ条件と比較してフローサイトメトリーによって２４／４８／７２時間後に定量化した。試験された１０人超のうちの代表的な２人の健康なドナーについて示されたデータ。

【図2B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化を媒介し、これらのＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。健康なドナーに由来する休止Ｔ細胞をネガティブ選択により精製し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、対照ＩｇＧ又はＰＢＳの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。細胞を、１０００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度で、示されたＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）と一緒に、５：１のＥ：Ｔ比にて共インキュベートした。ＷＴＦｃエフェクター機能を有する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６プロトタイプが、標的細胞溶解を誘導する能力を、ＰＢＳ条件と比較してフローサイトメトリーによって２４／４８／７２時間後に定量化した。試験された１０人超のうちの代表的な２人の健康なドナーについて示されたデータ。

【図2C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化を媒介し、これらのＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。健康なドナーに由来する休止Ｔ細胞をネガティブ選択により精製し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、対照ＩｇＧ又はＰＢＳの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。細胞を、一連のＩｇＧ濃度で、示されたＩｇＧ（全てサイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）と共に、５：１のＥ：Ｔ比にて共インキュベートした。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６（サイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）が、ＣＤ４の活性化を誘導する能力を、ＰＢＳ条件と比較してフローサイトメトリーによって４８時間後に定量化した。示されているデータは代表的なドナーからのものであり、合計６人のドナーが３つの独立したアッセイで試験された。

【図2D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化を媒介し、これらのＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。健康なドナーに由来する休止Ｔ細胞をネガティブ選択により精製し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、対照ＩｇＧ又はＰＢＳの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。細胞を、一連のＩｇＧ濃度で、示されたＩｇＧ（全てサイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）と共に、５：１のＥ：Ｔ比にて共インキュベートした。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６（サイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）が、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を誘導する能力を、ＰＢＳ条件と比較してフローサイトメトリーによって４８時間後に定量化した。示されているデータは代表的なドナーからのものであり、合計６人のドナーが３つの独立したアッセイで試験された。

【図2E】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化を媒介し、これらのＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。健康なドナーに由来する休止Ｔ細胞をネガティブ選択により精製し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、対照ＩｇＧ又はＰＢＳの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。細胞を、一連のＩｇＧ濃度で、示されたＩｇＧ（全てサイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）と共に、５：１のＥ：Ｔ比にて共インキュベートした。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６（サイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する）が、標的細胞溶解を誘導する能力を、ＰＢＳ条件と比較してフローサイトメトリーによって４８時間後に定量化した。示されているデータは代表的なドナーからのものであり、合計６人のドナーが３つの独立したアッセイで試験された。

【図3A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解、及び炎症性サイトカイン放出を誘導し、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有する。健康なドナー由来のＰＢＭＣサンプルを、示された濃度範囲の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３抗体と共培養し、ＰＢＳ条件と比較した。Ｔ細胞活性化を、フローサイトメトリーを使用して４８時間後に評価した。示されているデータは、１人のドナーからのものであり、複数の独立した実験からの４人の独立したドナーを代表している。

【図3B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解、及び炎症性サイトカイン放出を誘導し、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有する。健康なドナー由来のＰＢＭＣサンプルを、示された濃度範囲の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３抗体と共培養し、ＰＢＳ条件と比較した。自己Ｔ細胞による単球溶解を、フローサイトメトリーを使用して４８時間後に評価した。示されているデータは、１人のドナーからのものであり、複数の独立した実験からの４人の独立したドナーを代表している。

【図3C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解、及び炎症性サイトカイン放出を誘導し、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有する。健康なドナー由来のＰＢＭＣサンプルを、示された濃度範囲の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３抗体と共培養し、ＰＢＳ条件と比較した。Ｂ細胞溶解を、フローサイトメトリーを使用して４８時間後に評価した。示されているデータは、１人のドナーからのものであり、複数の独立した実験からの４人の独立したドナーを代表している。

【図3D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解、及び炎症性サイトカイン放出を誘導し、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有する。健康なドナーに由来する単球を、ネガティブ選択によって精製し、ＣＦＳＥ標識休止自己Ｔ細胞と、５：１のＥ：Ｔ比にて、１，０００ｎｇ／ｍＬの抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６及びＭｏｃｋｘＣＤ３抗体（抗ＣＤ３ＩｇＧはＷＴＦｃエフェクター機能でフォーマットされた）と共に、５日間共培養した。Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ陽性Ｔ細胞の減少によって実証された。示されているデータは、１人のドナーからのものであり、複数の独立した実験からの４人の独立したドナーを代表している。

【図3E】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解、及び炎症性サイトカイン放出を誘導し、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有する。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、１，０００ｎｇ／ｍＬの抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は抗ＣＤ３（ＣＤ３）抗体と共に４８時間培養した。続いて、上清を回収し、ヒト１０－ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ設定を使用して、これらの上清中のヒトサイトカインレベルを測定した。示されている６つのサイトカインについてサイトカインレベルが検出可能であった。示されているデータは、２人の代表的な健康なＰＢＭＣドナーからのものであり、各ドナーについて重複しており、８人の健康なドナーからのＰＢＭＣを試験した。

【図4A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な骨髄前駆細胞が完全な骨髄系及び赤血球系を発達させる潜在力を温存する。健康なドナー骨髄からのＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞を、自己前活性化Ｔ細胞と、２００ｎｇ／ｍＬ抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３の存在下で、１０：１のＥ：Ｔ比にて１６時間共培養した。定量化されたフローサイトメトリーの設定を使用して、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性溶解を、示された細胞分画の非ＩｇＧ条件と比較して測定した。各データ点は、３回試験された独立した骨髄ドナーの平均値を表す（ｎ＝４）。ゲーティングストラテジーを図１０に示す。

【図4B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な骨髄前駆細胞が完全な骨髄系及び赤血球系を発達させる潜在力を温存する。健康なドナー骨髄からのＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞を、自己前活性化Ｔ細胞と、２００ｎｇ／ｍＬ抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３の存在下で、１０：１のＥ：Ｔ比にて１６時間共培養した。１６時間の細胞傷害アッセイ後の異なるＣＤ３４^ＰＯＳ骨髄集団に対する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響の分析であり、３人のドナーの絶対数を示している。ＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞のゲーティングを図１１に示す。異なる試験条件での絶対数の定量化は、フローカウント蛍光球で測定された総ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞の頻度及び絶対数の積分によって計算された。データは、重複測定の平均を示している。

【図4C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な骨髄前駆細胞が完全な骨髄系及び赤血球系を発達させる潜在力を温存する。健康なドナー骨髄からのＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞を、自己前活性化Ｔ細胞と、２００ｎｇ／ｍＬ抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３の存在下で、１０：１のＥ：Ｔ比にて１６時間共培養した。ＣＤ３４^ＰＯＳＬＩＮ^ＮＥＧ細胞でゲーティングされた、示された条件での１６時間の細胞傷害アッセイ後の、ＣＬＥＣ１２Ａ及び／又はＣＤ１２３発現サブセットに対する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を示す散乱プロット。２人のうち１人の代表的なドナーが示されている。

【図4D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な骨髄前駆細胞が完全な骨髄系及び赤血球系を発達させる潜在力を温存する。健康なドナー骨髄からのＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞を、自己前活性化Ｔ細胞と、２００ｎｇ／ｍＬ抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３の存在下で、１０：１のＥ：Ｔ比にて１６時間共培養した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６を用いた１６時間の細胞傷害アッセイでのＣＤ３４^ＰＯＳ細胞が、顆粒球マクロファージコロニー（ＣＦＵ－ＧＭ）、バースト形成単位赤血球（ＢＦＵ－Ｅ）及び巨核球コロニー（ＣＦＵ－Ｍｋ）を生じさせる能力を、４人の異なるドナーからの半固形培地で２週間培養した後、定量化した。対照培養物は、ＩｇＧで処理されていない共培養物又は単独で接種されたＣＤ３４^ＰＯＳ細胞のいずれかである。各データ点は、ドナー毎の３回の培養（ＣＦＵ－ＧＭ及びＢＦＵ－Ｅ）又は４回の培養（ＣＦＵ－Ｍｋ）の平均値を表す。

【図4E】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な骨髄前駆細胞が完全な骨髄系及び赤血球系を発達させる潜在力を温存する。健康なドナー骨髄からのＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞を、自己前活性化Ｔ細胞と、２００ｎｇ／ｍＬ抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３の存在下で、１０：１のＥ：Ｔ比にて１６時間共培養した。図４Ｄに記載されている２週間のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培養物のＣＤ１５^ＰＯＳＣＤ３３^ＰＯＳ及びＣＤ１４^ＰＯＳＣＤ３６^ＰＯＳＣＤ３３^ＰＯＳ細胞含有量のフローサイトメトリー分析。データは、３人の異なるドナーの全ＣＤ３３^ＰＯＳ細胞のうち単球及び骨髄球細胞の頻度を示している。ＨＳＣ：造血幹細胞；ＭＰＰ：多能性前駆細胞；ＣＭＰ：共通骨髄性前駆細胞；ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞；ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞；ＣＬＰ：共通リンパ球前駆細胞。ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側）を使用して、統計解析を行った。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図5A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球のリダイレクトされた溶解を効率的に誘導する。臨床的寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血から単離された休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＡＭＬ診断時に収集されたＣＦＳＥ標識ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ自己初代ＡＭＬ芽球と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は５：１で、ＩｇＧは、１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度：抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）で添加した。ＰＢＳ条件と比較して各ＩｇＧによって誘導されたＡＭＬ芽球溶解の程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＡＭＬ芽球サンプル及び自己Ｔ細胞が得られたＡＭＬの段階を示す図。

【図5B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球のリダイレクトされた溶解を効率的に誘導する。臨床的寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血から単離された休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＡＭＬ診断時に収集されたＣＦＳＥ標識ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ自己初代ＡＭＬ芽球と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は５：１で、ＩｇＧは、１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度：抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）で添加した。ＰＢＳ条件と比較して各ＩｇＧによって誘導されたＡＭＬ芽球溶解の程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。初代ＡＭＬ芽球サンプル（ＣＤ４５^±ＳＳＣ±として定義されるＡＭＬ芽球）でのＣＬＥＣ１２Ａ抗原の発現。ヒストグラムは、各患者サンプルの抗ＣＬＥＣ１２ＡＩｇＧ結合を示しており、リンパ球は灰色で示され、ＡＭＬ芽球は黒色で示されている。ＣＬＥＣ１２Ａ陽性のゲートは、ＣＬＥＣ１２Ａ陰性リンパ球分画に基づいて設定された。ＣＬＥＣ１２Ａ陽性芽球の割合が示されている。

【図5C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球のリダイレクトされた溶解を効率的に誘導する。臨床的寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血から単離された休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＡＭＬ診断時に収集されたＣＦＳＥ標識ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ自己初代ＡＭＬ芽球と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は５：１で、ＩｇＧは、１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度：抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）で添加した。ＰＢＳ条件と比較して各ＩｇＧによって誘導されたＡＭＬ芽球溶解の程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＡＭＬ患者のＣＤ４^ＰＯＳの活性化状態。

【図5D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球のリダイレクトされた溶解を効率的に誘導する。臨床的寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血から単離された休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＡＭＬ診断時に収集されたＣＦＳＥ標識ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ自己初代ＡＭＬ芽球と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は５：１で、ＩｇＧは、１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度：抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）で添加した。ＰＢＳ条件と比較して各ＩｇＧによって誘導されたＡＭＬ芽球溶解の程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。ＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞の活性化状態。

【図5E】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球のリダイレクトされた溶解を効率的に誘導する。臨床的寛解期にあるＡＭＬ患者の末梢血から単離された休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＡＭＬ診断時に収集されたＣＦＳＥ標識ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ自己初代ＡＭＬ芽球と４８時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は５：１で、ＩｇＧは、１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度：抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）で添加した。ＰＢＳ条件と比較して各ＩｇＧによって誘導されたＡＭＬ芽球溶解の程度を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。示されたＩｇＧ（ＰＢＳと比較して）とインキュベートした場合の自己初代Ｔ細胞によって媒介されるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球の細胞傷害。示されているデータは、３回試験された３つのＡＭＬ患者サンプル（患者７～９、表ＩＩＩを参照）の平均±ＳＥである。データは、ＰＢＳと比較してＡＮＯＶＡによって分析した：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図6】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、初代ＡＭＬサンプルにおいてＡＭＬ芽球の死滅を誘導する。ＡＭＬ診断時に得られた初代ＡＭＬ患者サンプルを、サイトカインカクテルを補充した培地で１０日間培養して、ＡＭＬ芽球の生存をサポートした。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又はＭｏｃｋｘＣＤ３抗体を２００ｎｇ／ｍＬで追加した。各患者について、ＣＤ４５ｘＣＤ３３プロットは、０日目及び１０日目の各ＩｇＧのライブゲートを示している。Ｔ細胞は赤色で示され、ＡＭＬ芽球は青色で示され（ＣＤ４５^±ＳＳＣ^±として定義）、Ｔ細胞及びＡＭＬ芽球の割合が示されている。０日目のヒストグラムは、各患者のＡＭＬ芽球細胞のＣＬＥＣ１２Ａ発現レベルを示している。抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体を使用した染色は黒色で示され、アイソタイプ対照抗体を使用した染色は灰色で示されている。

【図7】フローサイトメトリーによってＨＬ６０標的細胞の溶解を定量化するために使用されるゲーティングストラテジー。固定量の細胞をフローサイトメトリーで測定した。生存細胞をＦＳＣ－ＳＳＣプロファイル（左側のプロット）に基づいてゲーティングした。次に、ライブゲート内で、ＣＦＳＥ^ＰＯＳＨＬ６０細胞をゲーティングした（右側のプロット）。そのゲート内のＣＦＳＥ^ＰＯＳ生存ＨＬ６０標的細胞の絶対数を使用して、材料及び方法の項で説明されているように、ＨＬ６０標的細胞溶解の割合を計算した。上のプロットは、細胞傷害のないＰＢＳ条件を示し、下のプロットは、ＨＬ６０細胞傷害が観察された抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６条件を示している。

【図8-1】ＰＢＭＣベースの単球細胞傷害アッセイにおける細胞傷害を定量化するために使用されるゲーティングストラテジー。単球（ＣＤ１４^ＰＯＳ）、ＣＤ４（ＣＤ４^ＰＯＳＣＤ３^ＰＯＳ）及びＣＤ８（ＣＤ８^ＰＯＳＣＤ３^ＰＯＳ）Ｔ細胞、及びＢ細胞（ＣＤ１９^ＰＯＳ）を、示されているようにゲートアウトした。材料及び方法の項に記載されるように、ＰＢＳ対照条件（図８－１）と比較して、試験ＩｇＧ条件（図８－２）によって誘導された細胞傷害の割合を計算するために、固定量のアッセイ培地で測定された単球及びＢ細胞の絶対数を定量化して使用した。ＣＤ４^ＰＯＳ及びＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞サブセットをＴ細胞集団内で同定し、活性化マーカーＣＤ６９を使用して、ＰＢＳ対照条件と比較して、それらの活性化状態を求めた。

【図8-2】ＰＢＭＣベースの単球細胞傷害アッセイにおける細胞傷害を定量化するために使用されるゲーティングストラテジー。単球（ＣＤ１４^ＰＯＳ）、ＣＤ４（ＣＤ４^ＰＯＳＣＤ３^ＰＯＳ）及びＣＤ８（ＣＤ８^ＰＯＳＣＤ３^ＰＯＳ）Ｔ細胞、及びＢ細胞（ＣＤ１９^ＰＯＳ）を、示されているようにゲートアウトした。材料及び方法の項に記載されるように、ＰＢＳ対照条件（上図８－１）と比較して、試験ＩｇＧ条件（図８－２）によって誘導された細胞傷害の割合を計算するために、固定量のアッセイ培地で測定された単球及びＢ細胞の絶対数を定量化して使用した。ＣＤ４^ＰＯＳ及びＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞サブセットをＴ細胞集団内で同定し、活性化マーカーＣＤ６９を使用して、ＰＢＳ対照条件と比較して、それらの活性化状態を求めた。

【図9】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６二重特異性ＩｇＧの活性は、Ｅ：Ｔ比に依存する。健康なドナー由来の休止Ｔ細胞を、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、又は対照ＩｇＧの存在下でＣＦＳＥ標識ＨＬ６０細胞と共培養した。１，０００ｎｇ／ｍＬＩｇＧでのＨＬ６０標的細胞溶解に対するＥ：Ｔ比を増加させることの影響を、４８時間の共培養後に測定した。

【図10A】健康なドナー骨髄ＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞の回復を定量化するために使用されるゲーティングストラテジー。示されているように、総ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧＣＤ１０^ＮＥＧ、及びＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧＣＤ１０^ＮＥＧ細胞をゲーティングした。ＦＳＣ及びＳＳＣのエリア及び幅に基づいて最初の単細胞をゲーティングし、次にＦＳＣ－ＳＳＣプロファイル及び７ＡＡＤ陰性に基づいて生存細胞を定義した。生存細胞内で、ＣＤ３４及びＣＤ５を使用して、共培養されたＴ細胞からＣＤ３４^ＰＯＳ細胞をゲーティングした。全ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞内で、細胞をＣＬＥＣ１２Ａ及びＣＤ１０の発現に基づいて３つの集団に分割した。ＣＤ３４^ＰＯＳ集団の定量化のために、既知濃度のフローカウント蛍光球の固定量を、取得前に各サンプルに追加した。１ｍＬ当たりの細胞の絶対数を、蛍光球と細胞の比に基づいて計算した。

【図10B】健康なドナー骨髄ＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞の回復を定量化するために使用されるゲーティングストラテジー。１人の代表的なドナーの全ての試験条件における様々なＣＤ３４^ＰＯＳ集団を示す散乱プロット。

【図11-1】異なるＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞の同一性及び相対比を判定するために使用されるゲーティングストラテジー。ＦＳＣ及びＳＳＣのエリア及び幅に基づいて最初の単細胞をゲーティングし、次にＦＳＣ－ＳＳＣプロファイル及び７ＡＡＤ陰性に基づいて生存細胞を定義した。生存細胞内で、系統陰性のＣＤ３４^ＰＯＳ細胞をゲーティングし、続いてＦＳＣ－ＳＳＣバックゲートを行った。その後、細胞をＣＤ３８^ＰＯＳ区画及びＣＤ３８^ＮＥＧ区画に分割した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＰＯＳ区画内で、ＣＬＰをＣＤ１０発現に基づいてゲーティングした。ＣＤ１０の発現を欠く細胞を、ＣＤ１２３及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づいて、ＣＭＰ、ＭＥＰ、及びＧＭＰに更に分離した。一部のドナーについては、これら３つの集団を定義するために、ＣＤ１２３の代わりにＣＤ１３５を使用した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ区画内で、ＨＳＣ及びＭＰＰを、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡの発現に従って定義した。蛍光色素を１つ除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）対照で、ゲートを確認した。ＨＳＣ：造血幹細胞；ＭＰＰ：多能性前駆細胞；ＣＭＰ：共通骨髄性前駆細胞；ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞；ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞；ＣＬＰ：共通リンパ球前駆細胞。

【図11-2】異なるＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞の同一性及び相対比を判定するために使用されるゲーティングストラテジー。ＦＳＣ及びＳＳＣのエリア及び幅に基づいて最初の単細胞をゲーティングし、次にＦＳＣ－ＳＳＣプロファイル及び７ＡＡＤ陰性に基づいて生存細胞を定義した。生存細胞内で、系統陰性のＣＤ３４^ＰＯＳ細胞をゲーティングし、続いてＦＳＣ－ＳＳＣバックゲートを行った。その後、細胞をＣＤ３８^ＰＯＳ区画及びＣＤ３８^ＮＥＧ区画に分割した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＰＯＳ区画内で、ＣＬＰをＣＤ１０発現に基づいてゲーティングした。ＣＤ１０の発現を欠く細胞を、ＣＤ１２３及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づいて、ＣＭＰ、ＭＥＰ、及びＧＭＰに更に分離した。一部のドナーについては、これら３つの集団を定義するために、ＣＤ１２３の代わりにＣＤ１３５を使用した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ区画内で、ＨＳＣ及びＭＰＰを、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡの発現に従って定義した。蛍光色素を１つ除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）対照で、ゲートを確認した。ＨＳＣ：造血幹細胞；ＭＰＰ：多能性前駆細胞；ＣＭＰ：共通骨髄性前駆細胞；ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞；ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞；ＣＬＰ：共通リンパ球前駆細胞。

【図11-3】異なるＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞の同一性及び相対比を判定するために使用されるゲーティングストラテジー。ＦＳＣ及びＳＳＣのエリア及び幅に基づいて最初の単細胞をゲーティングし、次にＦＳＣ－ＳＳＣプロファイル及び７ＡＡＤ陰性に基づいて生存細胞を定義した。生存細胞内で、系統陰性のＣＤ３４^ＰＯＳ細胞をゲーティングし、続いてＦＳＣ－ＳＳＣバックゲートを行った。その後、細胞をＣＤ３８^ＰＯＳ区画及びＣＤ３８^ＮＥＧ区画に分割した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＰＯＳ区画内で、ＣＬＰをＣＤ１０発現に基づいてゲーティングした。ＣＤ１０の発現を欠く細胞を、ＣＤ１２３及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づいて、ＣＭＰ、ＭＥＰ、及びＧＭＰに更に分離した。一部のドナーについては、これら３つの集団を定義するために、ＣＤ１２３の代わりにＣＤ１３５を使用した。ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ区画内で、ＨＳＣ及びＭＰＰを、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡの発現に従って定義した。蛍光色素を１つ除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）対照で、ゲートを確認した。ＨＳＣ：造血幹細胞；ＭＰＰ：多能性前駆細胞；ＣＭＰ：共通骨髄性前駆細胞；ＧＭＰ：顆粒球－マクロファージ前駆細胞；ＭＥＰ：巨核球－赤血球前駆細胞；ＣＬＰ：共通リンパ球前駆細胞。

【図12】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＡＭＬ患者Ｔ細胞及び健康なドナーＴ細胞をリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＡＭＬ細胞株を同等の効率で特異的に溶解する。休止ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、６人の健康なドナー又は臨床的寛解期にある６人のＡＭＬ患者（患者１～６；患者の特徴については表ＩＩＩを参照されたい）の末梢血から単離した。単離されたＴ細胞を、ＣＦＳＥ標識ＨＬ６０標的細胞と、１，０００ｎｇ／ｍＬの抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３ＩｇＧ、又は対照ＩｇＧ（全てＷＴＦｃエフェクター機能を有する）の存在下で４８時間、５：１のＥ：Ｔ比にて共培養した。（Ａ－Ｂ）その後ＨＬ６０標的細胞溶解に使用される、健康なドナー（ＨＤ）又はＡＭＬ患者から得られたＴ細胞のＣＤ３^ＰＯＳ分画内のＣＤ４^ＰＯＳＴ細胞（Ａ）及びＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞（Ｂ）のサブセット組成を分析するためのフローサイトメトリー。Ｔ_ＣＭ：セントラルメモリーＴ細胞；Ｔ_{Ｎａiｖｅ}：ナイーブＴ細胞；Ｔ_{ＥＭＲＡ＋}：再取得されたＣＤ４５ＲＡを有するエフェクターメモリー細胞。Ｔ_ＥＭ：エフェクターメモリーＴ細胞。（Ｃ－Ｅ）フローサイトメトリーによって分析され、かつ示されたＩｇＧ及びＴ細胞源についてＰＢＳ条件と比較された、ＣＤ４^ＰＯＳＴ細胞（Ｃ）及びＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞（Ｄ）の活性化、並びにＨＬ６０標的細胞溶解（Ｅ）。各円は、３回試験された単一のＴ細胞ドナーの平均値を表す。データは、ＡＮＯＶＡによりＰＢＳと比較して分析した：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図13】ＳＳＣ^ｌｏｗＣＤ４５^ｄｉｍＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＬＥＣ１２Ａ^±細胞の二次平板培養で生成された、細胞の形態及びＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異状態。再平板培養されたＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞のＭａｙ－Ｇｉｅｍｓａ染色を行い、個々のコロニーを採取し、ＪＡＫ２ドライバー変異について試験した。

【図14A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－６レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に１ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に２５ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図14B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－８レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に１ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に２５ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図14C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＴＮＦαレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に１ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に２５ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図14D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＦＮγレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に１ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に２５ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図15A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－６レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に４０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図15B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－８レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に４０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図15C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＴＮＦαレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に４０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図15D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＦＮγレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に４０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図16A】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－６レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に６０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図16B】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＬ－８レベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に６０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図16C】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＴＮＦαレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に６０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【図16D】抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で治療された患者のＩＦＮγレベル。ＰＧ／ｍｌで、投与前、注入終了後４時間及び２４時間で測定した。投与は、１日目、４日目、８日目、及び２２日目に行われた。１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に６０ｍｇの全用量を患者に投与した。また、治療サイクルの終了時（２８日目）にサイトカインレベルも測定した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

療法用モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の投与は、多くの場合、体の大きさに基づく。これは、体の大きさに基づく投与が薬物曝露における対象間のばらつきを低減するという考えによるものである。しかしながら、ほとんどのｍＡｂは、標的特異的であり、治療ウィンドウが比較的大きく、概して薬物動態の変動に対する体の大きさの寄与は小さい。一方、抗体の種類、抗体の標的特異性、及びその他の要因によっては、抗体は、重篤なオン／オフターゲット副作用を示す可能性がある。それらのより深刻なもののいくつかは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と総称される症状である。サイトカイン放出症候群は、いくつかの疾患又は感染症の合併症として発生する全身性炎症反応症候群の一種であり、いくつかの抗体薬及び養子Ｔ細胞療法の有害作用として発生することが知られている。重篤な症例は「サイトカインストーム」とも呼ばれている。

【0016】

ＣＲＳを引き起こす最初のモノクローナル抗体薬であるムロモナブ－ＣＤ３の承認以来、ＣＲＳは抗体治療の潜在的な有害作用として知られている。しかし、この問題は、アゴニストＣＤ２８結合抗体ＴＧＮ１４１２を用いた２００６年の第Ｉ相臨床試験後に、重篤なものとして認識されるようになった。６人の健康なボランティア全員が、重篤なＣＲＳを示し、深刻な病状になった。

【0017】

最近では、ＣＤ３抗体との関連で、ＣＤ３／ＣＤ１９及びＣＤ３／ＣＤ１２３二重特異性抗体を用いた臨床試験が延期されたことを強調している（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．Ｏｃｔ ９，２０１８ ａｎｄ Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ，２０１６）。

【0018】

本発明において、第１の投与として投与するプライミング用量、それに続く全用量のＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗体が有効であり、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療を受けた対象によって十分に許容されることが見出された。理論に束縛されるものではないが、１回以上のステップで全用量に漸増する低用量でのプライミングが、これに役立つと考えられている。プライミング用量は、典型的には１回投与であるが、２回投与することもでき、あるいはそれ以上の投与回数で投与することができる。プライミング用量に続いて、全用量に達するまで、用量を段階的に増加させてステップアップ用量とすることができる。抗体の第１の量は、好ましくはプライミング用量である。抗体用量は、典型的には、定期的な間隔で投与される。プライミング投与と後続のプライミング又はステップアップ投与との間の間隔は、１日を超える場合、１～７日の間で変動する可能性があるが、典型的には１日又は３日である。ステップアップ用量の後続の投与における間隔は、１日を超える場合、３～７日の間で変動する可能性があるが、典型的には３日である。全用量の投与の間隔は、典型的には、１週間である。第１のプライミング投与と後続のステップアップ投与との間の間隔は、あったとしても、典型的には３日である。最後のステップアップ投与と後続の全用量投与との間の間隔は、あったとしても、３～７日の間で変動する可能性があるが、典型的には３日である。第１の投与と後続の全用量の投与との間の間隔は、典型的には、７日である。用量の投与は、典型的には、１日当たりに計算される。プライミング用量、ステップアップ用量又は全用量は、１日に投与される量である。実際の投与には、ある程度時間がかかる場合がある。これは、典型的には、１時間以上にわたる注入である必要はない。

【0019】

従来技術では、有効量を迅速に見つけ、治療量以下の用量への患者の不必要な曝露を回避するための臨床試験で用量漸増研究が主に行われている（Ｔｏｕｒｎｅａｕ，Ｍｉｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２００９）。本発明では、治療量を迅速に見つけ、治療量以下の用量への患者の曝露を回避するためには、プライミング用量は投与されない。その代わりに、全用量に達したときに、治療された集団における副作用の発生率及び／又は程度を同時に低減しながら、対象を治療するように設計された投与レジメンの一部として対象に投与される。

【0020】

本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の対象を治療する方法を提供する。該方法は、それを必要とする対象を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与で治療することを含み、第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与において、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。当該２回以上の投与における第２の投与される二重特異性抗体の量は、好ましくは、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多く、２回を超える投与の場合、第２の投与がステップアップ用量を伴う場合、当該２回以上の投与における第３の二重特異性抗体の量よりも少ない。第２の投与が全用量である場合、第２及び第３の投与で投与される二重特異性抗体の量は等しい。好ましくは、当該２回以上の投与における第３の投与される二重特異性抗体の量は、当該２回以上の投与における第２の二重特異性抗体の量よりも多く、第３の投与がステップアップ用量を伴う場合、当該２回以上の投与における第４の量よりも少ない。当該二重特異性抗体の漸増量の投与後、すなわち、プライミング及びステップアップ期の後、二重特異性抗体は、好ましくは、後続の投与のそれぞれにおいて、本質的に一定の用量で投与される。本質的に一定の用量は、全用量とも呼ばれる。

【0021】

後続の投与のそれぞれにおける本質的に一定の用量は、好ましくは、当該二重特異性抗体の少なくとも１５ｍｇである。本質的に一定の用量は、好ましくは、後続の投与１回当たりの当該二重特異性抗体の、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５ｍｇ、好ましくは６０～６００ｍｇ、例えば６０～１２０；６０～１８０；６０～２００；６０～２４０；６０～４８０；１２０～２４０；１２０～４８０；２４０～４８０；又は２４０～６００ｍｇである。

【0022】

二重特異性抗体の第１の量は、好ましくは９ｍｇ以下、例えば１～９ｍｇ又は１～５ｍｇ、好ましくは３ｍｇ以下、例えば１～３ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ、更により好ましくは約３ｍｇ、最も好ましくは約５ｍｇである。

【0023】

漸増量の抗体の投与は、好ましくは、投与間で３～４日の間隔で行われる。本質的に一定量の抗体の投与日の間隔は、好ましくは６～８日、好ましくは７日である。

【0024】

二重特異性抗体の第１の量は、好ましくは、二重特異性抗体の治療量以下の量である。二重特異性抗体の治療量以下の量は、１週間に１回の投与で投与された場合、典型的には治療効果をもたらさない抗体の量である。

【0025】

一実施形態では、１～９ｍｇの第１の量の二重特異性抗体が、治療の１日目に投与される。治療の３、４、又は５日目に、３～２０ｍｇ、好ましくは１０～２０ｍｇの第１のステップアップ用量が投与される。治療の７、８、又は９日目に、１５～３０ｍｇ、好ましくは２０～３０ｍｇの第２のステップアップ用量が投与され、そして、治療の１４、１５又は１６日目に、２５～６００ｍｇの全用量が投与される。

【0026】

一実施形態では、１ｍｇの第１の量の二重特異性抗体が、治療の１日目に投与される。３ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。１５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、２５ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0027】

一実施形態では、３ｍｇの第１の量の二重特異性抗体が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇのステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。そして、２５ｍｇの全用量が、治療の８日目に投与される。

【0028】

一実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇのステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。そして、２５ｍｇの全用量が、治療の８日目に投与される。

【0029】

一実施形態では、３ｍｇの第１の量の二重特異性抗体が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0030】

一実施形態では、３ｍｇの第１の量の二重特異性抗体が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0031】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0032】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0033】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、６０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0034】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、６０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0035】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、６０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0036】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与される。そして、６０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0037】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、１２０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0038】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、１２０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0039】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、１２０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0040】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、１２０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0041】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、２４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0042】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、２４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0043】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、２４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0044】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、２４０ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0045】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、４００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0046】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、４００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0047】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、４００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0048】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、４００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0049】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、６００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0050】

別の実施形態では、３ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、６００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0051】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１０ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、６００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0052】

別の実施形態では、５ｍｇの二重特異性抗体の第１の量が、治療の１日目に投与される。１５ｍｇの第１のステップアップ用量が、治療の４日目に投与される。２５ｍｇの第２のステップアップ用量が、治療の８日目に投与され、６００ｍｇの全用量が、治療の１５日目に投与される。

【0053】

ある用量から別の用量、例えば２５ｍｇから２４０ｍｇへのステップがＣＲＳ症候群を引き起こすと思われる場合、投与レジメンは、例えば１２０ｍｇの１回以上の更なるステップアップ用量を含むように適合させることができる。また、ステップアップ用量及び／又は全用量の間隔の延長を決めることもできる。これらの原則は、本明細書に開示される投与レジメンのいずれにも適用することができる。

【0054】

本発明は、好ましくは別々の時間間隔で、特定の投与方法を使用する。投与レジメンは、効果的で安全な全用量を投与するように設計されている。一態様では、安全な用量は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の重症度及び発生率を予防及び最小化することを目的としている。

【0055】

好ましい投与レジメンは、１回以上の投与でプライミング用量を投与することと、１回以上のステップアップ用量を投与することと、を含み、用量は、全用量に達するまで用量の増分と共に増加する。増分は、好ましくは段階的である。一態様では、増分は、全用量又は維持用量に達するまで、等しい増分である。しかしながら、低い若しくは非常に低いプライミング用量及び／又は第１のステップアップ用量で開始することと比較して、より高いプライミング用量及び／又はより高い第１のステップアップ用量で開始することにより、全用量で、例えばサイトカイン放出などの副作用がそれほど重篤ではなくなることが見出された。言い換えれば、より高いプライミング用量で開始すると、より低いプライミング用量で開始するよりも、サイトカイン放出がより効果的に軽減される。例示的なより高いプライミング用量は、例えば、３又は５ｍｇである。より低いプライミング用量は、例えば、１ｍｇである。

【0056】

全用量は、典型的には、治療期間にわたって固定されるが、対象の個々の治療反応及び／又は副作用反応に応じて、上下に調整することができる。

【0057】

１回以上のステップアップ用量は、好ましくは、第１の投与の１週間又は２週間で投与される。一実施形態では、第１のプライミング用量及びステップアップ用量が３日に１回（Ｄ１－Ｄ４－Ｄ８）に投与され、その後、７日に１回（１週間に１回）に全用量が投与される。８日目（Ｄ８）の用量は、全用量と等しくすることができる。全用量は、ステップアップ投与の回数に応じて、８～１５日目から開始することが好ましい。

【0058】

本発明の一態様では、抗体の１回以上の投与は、アセトアミノフェン及び抗ヒスタミンによる前及び／又は同時治療を伴う。抗ヒスタミンは、好ましくは、Ｈ１拮抗薬である。Ｈ１拮抗薬は、Ｈ_１受容体でのヒスタミンの作用を阻害する。アセトアミノフェン及び抗ヒスタミンによる治療は、好ましくは、抗体投与と同じ日に、好ましくは抗体投与の前に行われる。アセトアミノフェン及び抗ヒスタミンによる治療は、好ましくは、各抗体投与と共に行われる。

【0059】

対象におけるＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療方法で使用するためのＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体が提供される。当該治療は、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の２回以上の投与を含み、第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与のそれぞれにおいて、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。本発明は、対象におけるＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療のための医薬品の製造のためのＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の使用を更に提供する。第１の投与において、二重特異性抗体の第１の量が投与され、後続の投与のそれぞれにおいて、二重特異性抗体の量は、第１の投与における二重特異性抗体の量よりも多い。

【0060】

対象からＣＬＥＣ１２Ａ陽性造血細胞をパージし、当該対象の当該造血系に正常なＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を再集団化させる方法が更に提供される。該方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、間隔をあけて投与し、それにより当該対象の造血幹細胞を刺激して、当該造血系に、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を含む新たに形成された造血幹細胞由来細胞を再集団化させることを含む。対象は、好ましくは、ＡＭＬ、骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）、骨髄線維症（ＭＦ）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する対象である。好ましい実施形態では、対象は、骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）、骨髄線維症（ＭＦ）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する。正常な造血幹細胞は、主にＣＬＥＣ１２Ａ陰性であることが判明した。前駆細胞分画では、ＣＬＥＣ１２Ａの発現は、顆粒球－マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）細胞と、共通骨髄性前駆細胞（ＣＭＰ）及び巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）細胞の分画に限定される。ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞のパージ後、パージされていないＣＭＰ及びＭＥＰは、ＧＭＰ及びＢＦＵ－Ｅ（赤血球）及びＣＦＵ－Ｍｋ（巨核球）をなお生じさせる可能性がある。本明細書に記載のＣＤ３ｘＣＬＥＣ１２Ａ二重特異性抗体による治療は、造血幹細胞及び前駆細胞の潜在力をそのまま維持しながら、悪性細胞を除去することができる。これらは、本明細書に記載の抗体で治療すると刺激されて、造血系に、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を含む新しい健康な細胞を再集団化させる。刺激された細胞はまた、新たに分化したＣＬＥＣ１２Ａ陰性細胞を産生する。これは、抗体による治療で達成でき、その結果、ＣＤ１９又はＣＤ１２３又は他の標的を使用するＣＤ３エンゲージャーアプローチと比較した場合、造血系からＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を除去することによる免疫学的影響を少なくとも軽減する。再集団化時間は、ＣＤ１９及びＣＤ１２３などの他のＣＤ３エンゲージャーアプローチよりも少なくとも短くなる。更に、本発明の治療においてＣＦＵ－Ｍｋ及びＢＦＵ－Ｅ前駆細胞が温存されるので、他のＣＤ３エンゲージャーフォーマットと比較した場合に、造血系の血小板産生能及び赤血球産生能もまた温存される。

【0061】

ＣＬＥＣ１２Ａ陽性造血細胞を対象からパージし、当該対象の造血系に正常なＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を再集団化させる方法も提供される。該方法は、それを必要とする対象に、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、間隔をあけて投与し、それにより当該対象の造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を誘導して、当該造血系に、新たに形成された造血幹細胞由来のＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を再集団化させることを含む。

【0062】

対象における顆粒球及び単球の発達を刺激するための方法が更に提供される。当該方法は、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、それを必要とする対象に間隔をあけて投与し、それによってＣＬＥＣ１２Ａ陰性造血幹細胞又は前駆細胞から顆粒球及び単球の発達を誘導することを含む。間隔をあけての投与は、好ましくは、本明細書で上述したとおりの間隔に従う。投与スケジュールは、好ましくは本明細書に記載されるとおりである。

【0063】

対象は、好ましくは、ＡＭＬ、骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）、骨髄線維症（ＭＦ）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する対象である。好ましい実施形態では、対象は、骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）、骨髄線維症（ＭＦ）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する。

【0064】

ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌の治療を受けている対象のために自己骨髄細胞移植片を調製する方法も提供される。該方法は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を死滅させるのに好適な条件下で、当該対象の骨髄細胞調製物を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体と共にインキュベートすることと、続いて、骨髄細胞を当該インキュベーションから収集することと、を含む。対象におけるＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌を治療する方法が更に提供される。該方法は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を死滅させるのに好適な条件下で、当該対象の骨髄細胞調製物を、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体と共にインキュベートすることと、対象を造血系切除療法で治療することと、当該対象に、当該インキュベートされた骨髄細胞を含む骨髄細胞移植片を提供することと、を含む。骨髄又は移植片内の血液に由来する自己移植片のＴ細胞は、自己移植片からＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を排除するために再標的化される。本明細書に開示されるＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａ二重特異性抗体は、エフェクター標的細胞比が低い場合であっても、例えば１：３～１：９７の範囲、及び図６と表ＩＩに反映されるレベルであっても有効である。本明細書で言及されるようなＣＬＥＣ１２Ａ陽性細胞を死滅させるのに好適な条件は、自己Ｔ細胞又は前活性化Ｔ細胞などのＴ細胞の存在を伴う。このような細胞は通常、かなりの量の血液が存在する結果としての骨髄調製物に存在し、これは現在の多くの骨髄採取法でも典型的に収集される。切除療法は、療法の結果として細胞の破壊をもたらす治療法である。多くの化学療法及び他の抗腫瘍療法も正常細胞を死滅させる。より損傷を受けやすい器官の１つは骨髄である。本発明の文脈における造血系切除療法は、追加的作用又は副作用を有する療法（又は治療）であり、「正常な」又は「健康な」造血系の大部分が療法又は治療によって死滅する。多くの場合、骨髄を収集した後に、患者を造血系切除療法で治療する。この骨髄は、療法の完了後に対象に移植されて、対象の造血系の再集団化を刺激する。また異常細胞も移植されるのを防ぐために、このような骨髄調製物は、典型的には、異常細胞のためにパージされる。ＣＤ３４陽性細胞の選別は、異常細胞がＣＤ３４陽性でない場合の方法の１つである。このようなパージする方法により、多くの場合、必要以上に多くの細胞が除去され、対象の造血系の起こり得る再集団化よりも遅くなる。本発明をパージする方法は、骨髄調製物から異常細胞を効率的に除去し、より迅速な再集団化を可能にする。

【0065】

本発明の実施形態において、対象に、造血幹細胞を温存する癌治療を提供する方法が提供される。該方法は、ＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、ＣＬＥＣ１２Ａ陽性癌を有する。

【0066】

本明細書に開示される二重特異性抗体は、好ましくは、静脈内注入として投与される。注入は、典型的には約２～４時間を要するが、より長い、及びより短い投与も可能である。注入は、通常１２時間を超える期間にわたって延長されない。

【0067】

投与１回当たりの本質的な一定量に達するまでの抗体の量の増分は、単一の患者内の用量漸増レジメン、又は患者内用量漸増とも呼ばれる。

【0068】

本明細書をより容易に理解できるようにするために、特定の用語が最初に定義される。詳細な説明を通して、追加の定義が記載される。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有し、免疫学、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法が採用される。

【0069】

本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。

【0070】

本明細書で使用される場合、用語「ＣＬＥＣ１２Ａ」は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡを指す。ＣＬＥＣ１２Ａは、Ｃ型レクチンタンパク質ＣＬＬ－１；ＭＩＣＬ、樹状細胞関連レクチン２、Ｃ型レクチンスーパーファミリー、骨髄阻害性Ｃ型レクチン様受容体、Ｃ型レクチン様分子－１、ＤＣＡＬ２；ＣＬＬ１；Ｃ型レクチン様分子１、ＤＣＡＬ－２、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＬ、メンバー１（Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｅｃｔｉｎ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｌ，ｍｅｍｂｅｒ １、ＫＬＲＬ１）、ＣＤ３７１（分化のクラスター３７１）とも呼ばれる（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセス番号：ＡＹ５４７２９６；Ｚｈａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセス番号：ＡＦ２４７７８８；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｗｉｌｌｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００４；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセス番号：ＡＹ４９８５５０；Ｈａｎ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｃｈｅｎ，Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．２００６．ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセス番号：ＡＹ４２６７５９；Ｃｈｅｎ，Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｉｄｓ；ＨＧＮＣ：３１７１３；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１６０３６４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７２３２２；ＯＭＩＭ：６１２０８８；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＱＧＺ９）。

【0071】

ＣＬＥＣ１２Ａは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における、白血病芽球細胞及び白血病幹細胞、例えば、ＣＤ３４陰性又はＣＤ３４低発現白血病幹細胞（側集団）に発現する抗原であり（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４；ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｍｏｓｈａｖｅｒ，ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８）、並びに骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）におけるものである（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４，ａｎｄ Ｔｏｆｔ－Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｄｅｒｂｙ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＣＬＥＣ１２Ａの発現は、その他の点では、造血系列の細胞に、特に末梢血及び骨髄中の骨髄系列、すなわち顆粒球、単球、及び樹状細胞前駆体に制限されると考えられている。より重要なことに、ＣＬＥＣ１２Ａは、正常な造血幹細胞には存在しない。本明細書において、ＣＬＥＣ１２Ａ（配列番号１）について言及される場合、特に明記されない限り、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを指す。

【0072】

用語「ＣＬＥＣ１２Ａ」は、本明細書で参照される全ての変異体（スプライス及び変異など）及びそのアイソフォームを意味し、骨髄発現プロファイル（表面発現レベル及びｍＲＮＡレベルの両方）を保持しており、Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｗｉｌｌｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００４に記載されているようなものが含まれる。登録番号は主に、更なる同定方法として提供されるが、タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかの癌などで発生するものなどのコード遺伝子の変異のために変化する可能性がある。

【0073】

用語「ＣＤ３」（分化群３）は、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０４２３４）、ＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０７７６６）、及びＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ２０９６３）から構成されるタンパク質複合体を指す。ＣＤ３イプシロンは、様々な別名の下で既知であり、そのうちのいくつかは、「ＣＤ３ｅ分子、イプシロン（ＣＤ３－ＴＣＲ複合体）」、「ＣＤ３ｅ抗原、イプシロンポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）」；Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４イプシロン鎖；Ｔ３Ｅ；Ｔ細胞抗原受容体複合体、Ｔ３のイプシロンサブユニット；ＣＤ３ｅ抗原；ＣＤ３－イプシロン３；ＩＭＤ１８；ＴＣＲＥである。ＣＤ３Ｅ遺伝子についてのＩｄは、ＨＧＮＣ：１６７４；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：９１６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９８８５１；ＯＭＩＭ：１８６８３０、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７７６６である。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、一緒にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３はＴ細胞上に発現する。本明細書において、ＣＤ３について言及される場合、特に明記されない限り、ヒトＣＤ３（配列番号２～５）を指す。

【0074】

本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又は配列相同性を共有する。抗体は、典型的には、基本的な構造単位で構成されており、それぞれに２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する。治療用の抗体は、好ましくは、可能な限り治療される対象の天然抗体（例えば、ヒト対象のヒト抗体）に近いものである。本発明による抗体は、任意の特定のフォーマット又はそれを産生する方法に限定されない。

【0075】

「二重特異性抗体」は、抗体の１つのドメインが第１の抗原に結合する一方で、抗体の第２のドメインが第２の抗原に結合し、当該第１及び第２の抗原が同一ではない、本明細書に記載の抗体である。用語「二重特異性抗体」はまた、１つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせが抗原上の第１のエピトープに結合し、第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせが第２のエピトープに結合する抗体を包含する。この用語は更に、ＶＨが、第１の抗原を特異的に認識することができ、免疫グロブリン可変領域においてＶＨと対合しているＶＬが、第２の抗原を特異的に認識することができる抗体を含む。得られたＶＨ／ＶＬ対は、抗原１又は抗原２のいずれかに結合する。このようないわゆる「ツーインワン抗体」は、例えば、国際公開第２００８／０２７２３６号、同第２０１０／１０８１２７号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１１に記載されている。本発明による二重特異性抗体は、任意の特定の二重特異性フォーマット又はそれを産生する方法に限定されない。

【0076】

本明細書で使用される「共通軽鎖」という用語は、二重特異性抗体における２つの軽鎖（又はそのＶＬ部分）を指す。全長抗体の結合特異性は影響を受けないが、２つの軽鎖（又はそのＶＬ部分）は、同一であってもよく、いくつかのアミノ酸配列の違いを有してもよい。「共通」とは、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指す。当該軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に影響を与えない変異（欠失、置換、挿入及び／又は付加）が存在する。本発明の軽鎖はまた、本明細書で上記に特定された、０～１０、好ましくは０～５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する軽鎖であり得る。例えば、保存的アミノ酸の変化、重鎖と対合するときに結合特異性に寄与しない又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入し試験することによって、同一ではないが依然として機能的に同等である軽鎖を調製又は見出すことは、本明細書に使用される共通軽鎖の定義の範囲内である。

【0077】

本発明による「全長ＩｇＧ」又は「全長抗体」という用語は、本質的に完全なＩｇＧを含むものとして定義されるが、必ずしも完全なＩｇＧの全ての機能を有するわけではない。誤解を避けるために、全長ＩｇＧは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含有し、これはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ及びＣＬ、ＶＬと表示されるドメインに分解することができる。ＩｇＧ抗体は、Ｆａｂ部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメイン、主にＦｃ部分を介して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。本発明による全長抗体は、所望の特性を提供する変異が存在し得るＩｇＧ分子を包含する。全長ＩｇＧは、領域のうちのいずれの実質的な部分の欠失も有さない必要がある。しかしながら、得られるＩｇＧ分子の結合特性を本質的に変えることなく、１つ又はいくつかのアミノ酸残基が欠失しているＩｇＧ分子は、用語「全長ＩｇＧ」に含まれる。例えば、かかるＩｇＧ分子は、好ましくは非ＣＤＲ領域において、１～１０アミノ酸残基の欠失を有することができ、該欠失されたアミノ酸は、ＩｇＧの結合特異性にとっては必須ではない。

【0078】

本明細書でアミノ酸配列に言及される「パーセント（％）同一性」は、最適な比較目的のために配列をアラインメントした後、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。かかるアラインメントは、比較される配列の全長にわたって実施することができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／ベース又はアミノ酸にわたって実施されてもよい。配列同一性は、報告されたアラインメント領域にわたる２つの配列間における同一一致の割合である。

【0079】

配列の比較、及び２つの配列間の配列同一性の割合の測定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者であれば、２つの配列を整列させ、２つの配列間の同一性を求めるために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．，１９８３）。２つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して求めることができる。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装される。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用することができる（バージョン２．８．０以降、Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００；（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスに使用される。使用される任意選択のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。

【0080】

上述のようなＮＥＥＤＬＥプログラムによるアラインメント後、クエリ配列と本発明の配列間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：アラインメントのギャップの総数を差し引いた後、両方の配列の同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示すアラインメントの対応する位置の数を、アラインメントの全長で除算する。

【0081】

抗体は、典型的には、抗原の一部を認識し、このようなエピトープは他の化合物中に同様に存在してもよく、抗原を「特異的に認識する」本発明による抗体、例えば、ＣＬＥＣ１２Ａ又はＣＤ３は、このような他の化合物が同じ種類のエピトープを含有する場合にも、他の化合物も同様に認識し得る。したがって、抗原及び抗体の相互作用に関して「特異的に認識する」という用語は、同じ種類のエピトープを含有する他の化合物への抗体の結合を除外するものではない。

【0082】

「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の３次フォールディング（いわゆる直鎖及びコンフォメーション的エピトープ）によって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続的な直鎖アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されて保持される一方で、３次フォールディングにより形成されるエピトープは、コンフォメーションが、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的コンフォメーションにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含んでもよい。エピトープの空間的コンフォメーションを判定する方法は、当業者に知られており、当該技術分野の技術、例えば、エピトープの性質に応じて、Ｘ線結晶構造解析、ＨＤＸ－ＭＳ及び２次元核磁気共鳴、ペプスキャン、並びにアラニンスキャンが挙げられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓ Ｇ．Ｅ．，１９９６を参照されたい）。

【0083】

本明細書で使用される「異常細胞」という用語は、腫瘍細胞、より具体的には、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を引き起こす細胞などの前白血病細胞、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）腫瘍細胞又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞などの白血病細胞はじめとする血液学的起源の腫瘍細胞を含む。

【0084】

本明細書において使用する場合、用語「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」は、標的細胞の生存力に影響を及ぼすように活性化され得る、哺乳類免疫系内の細胞の自然なレパートリー内の細胞を指す。免疫エフェクター細胞は、リンパ系細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、又はＢ細胞を含み、かつ骨髄系列細胞、例えば、単球又はマクロファージ、樹状細胞、及び好中球顆粒球を含む。したがって、該エフェクター細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は好中球顆粒球である。エフェクター細胞の異常細胞への動員とは、免疫エフェクター細胞を異常標的細胞に近接させ、エフェクター細胞により、異常細胞の直接的な死滅又は間接的な死滅を開始できることを意味する。

【0085】

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、同義で用いられ、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物（例えば、ヒトの患者など、癌を患っている患者）を指す。

【0086】

本明細書で使用するとき、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患に関連する症状、合併症、条件又は生化学的兆候の進行、発達、重症度又は再発を、逆転、緩和、回復、阻害、又は減速若しくは予防することを目的とする、実施される任意の種類の介入若しくは処理、又は活性剤若しくは活性剤の組み合わせを対象に投与することを指す。

【0087】

本明細書で使用される場合、「有効治療」又は「陽性治療反応」は、有益な効果、例えば、癌などの疾患又は障害の少なくとも１つの症状の回復をもたらす治療を指す。有益な効果により、本方法による療法の開始前に行われた測定又は観察を超える改善などの、ベースラインを超える改善された状態を得ることができる。例えば、疾患の臨床的若しくは診断的症状の減少若しくは排除、又は癌のマーカーの減少若しくは排除によって証明されるように、有益な効果により、任意の臨床段階での対象における癌の進行を減速、安定化、停止、又は逆転させる状態を得ることができる。有効治療により、例えば、腫瘍サイズを減少、循環腫瘍細胞の存在を減少、腫瘍の転移を低減若しくは防止、腫瘍成長を減速若しくは阻止、及び／又は腫瘍の再発若しくは再燃を防止若しくは遅延させることができる。

【0088】

「治療量」という用語は、所望の生物学的、治療的、及び／又は予防的結果を提供する薬剤又は薬剤の組み合わせの量を指す。その結果は、疾患の１つ以上の徴候、症状、又は原因の低減、回復、緩解、減少、遅延、及び／又は緩和、あるいは生態系における他の所望の変化であり得る。いくつかの実施形態では、治療量は、腫瘍の発達を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の再発を防止又は遅延させるのに十分な量である。治療量は、１回以上の投与で投与することができる。薬物又は組成物の治療量は、（ｉ）癌細胞の数を低減する；（ｉｉ）腫瘍のサイズを低減する；（ｉｉｉ）末梢器官への癌細胞浸潤を、ある程度阻害、阻止、減速し、停止させ得る；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する；（ｖ）腫瘍成長を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生及び／又は再発を防止又は遅延させる；及び／又は（ｖｉｉ）癌に関連する１つ以上の症状をある程度和らげることができる。一例では、「治療量」は、癌の減少（例えば、癌細胞数の減少）、又は急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、若しくは慢性骨髄性白血病などの癌の進行の減速をもたらすＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の量である。

【0089】

本明細書に開示されるように、本明細書に提供される方法で使用するための二重特異性抗体としては、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する１つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせと、ＣＤ３に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせと、を含む二重特異性抗体が挙げられる。

【0090】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体で使用するのに好適なＣＬＥＣ１２Ａ重鎖可変（ＶＨ）領域としては、ＣＬＥＣ１２Ａに結合するものが挙げられる。好ましい実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＬＥＣ１２ＡＶＨ領域は、腫瘍細胞上に発現したＣＬＥＣ１２Ａに結合する。ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体で使用するための例示的なＣＬＥＣ１２ＡＶＨ領域は、例えば、国際公開第２０１７／０１０８７４号、同第２０１４／０５１４３３号、及び同第２００５／０００８９４号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0091】

いくつかの実施形態において、腫瘍細胞上のＣＬＥＣ１２Ａに対するＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性は、ＣＤ３への結合の親和性よりも少なくとも２倍、４倍、６倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍又は５０倍高い。特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対するＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＬＥＣ１２Ａ結合親和性は、約１ｘ１０ｅ－６Ｍ～１ｘ１０ｅ－１０Ｍ、約１ｘ１０ｅ－７Ｍ～１ｘ１０ｅ－１０Ｍ、又は約１ｘ１０ｅ－８～１ｘ１０ｅ－１０である。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対するＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＬＥＣ１２Ａ結合親和性は、少なくとも１ｘ１０－ｅ８Ｍ、好ましくは少なくとも１ｘ１０－ｅ９Ｍである。特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対するＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性は、約１ｘ１０ｅ－８Ｍ～１ｘ１０ｅ－９Ｍ、例えば、約２ｘ１０ｅ－９Ｍ、約３ｘ１０ｅ－９Ｍ、約４ｘ１０ｅ－９Ｍ、約５ｘ１０ｅ－９Ｍ、約６ｘ１０ｅ－９Ｍ、約７ｘ１０ｅ－９Ｍ、８ｘ１０ｅ－９Ｍ又は約９ｘ１０ｅ－９Ｍなどであり、ＣＤ３に対するＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性は、少なくとも３０倍低い、少なくとも４０倍低い、又は少なくとも５０倍低い。

【0092】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３ＶＨ領域は、マウス抗ＣＤ３抗体、ｍＯＫＴ３の親和性よりも著しく低い親和性（ＫＤ）で、ヒトＴ細胞株上の細胞表面発現ＣＤ３／ＴＣＲに結合する。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３ＶＨ領域は、少なくとも１ｘ１０－ｅ６Ｍの結合親和性でＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のＣＤ３結合親和性は、約１ｘ１０ｅ－６Ｍ～１ｘ１０ｅ－１０Ｍである。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のＣＤ３ＶＨ領域のＣＤ３結合親和性は、約１ｘ１０ｅ－７Ｍ～１ｘ１０ｅ－８Ｍである。

【0093】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号９）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＮＰＳＧＧＳ（配列番号１０）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＴＴＧＤＷＦＤＹ（配列番号１１）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｂ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＮＰＳＧＧＳ（配列番号１４）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＮＹＧＤＥＦＤＹを含む重鎖ＣＤＲ３（配列番号１５）；又は
（ｃ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＳＧＧ（配列番号１８）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＤＧＹＦＡＤＡＦＤＹ（配列番号１９）を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む。

【0094】

列挙されたＣＤＲ配列からの１、２、又は３アミノ酸残基の保存的変異は、種類として同じ結合活性（本質的に同等なのであって、その量は必ずしも同等ではない）を保持させつつ可能である。したがって、当該重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、好ましくは、列挙されたＣＤＲ配列から３つ以下、好ましくは２つ以下、より好ましくは１つ以下のアミノ酸を逸脱する配列を含有する。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、列挙されたＣＤＲ配列と同一である。

【0095】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号１２、１６又は２０に示されるＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号１２、１６又は２０に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0097】

例えば、いくつかの実施形態において、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する二重特異性抗体の重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ配列の外側の重鎖可変領域の配列において、０～１０、好ましくは０～５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

【0098】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号１２、１６及び２０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0099】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体での使用に好適なＣＤ３重鎖可変（ＶＨ）領域としては、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、又はＣＤ３δ／ＣＤ３ε若しくはＣＤ３γ／ＣＤ３εの組み合わせに結合できるものが挙げられる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のＣＤ３ＶＨ領域は、ＣＤ３ε鎖に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ＶＨ領域は、ヒトＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ＶＨ領域は、ヒトＣＤ３ε鎖に結合する。

【0100】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体で使用するための例示的なＣＤ３結合領域は、国際公開第２０１７／０１０８７４号、同第２０１４／０５１４３３号、及び同第２００５／１１８６３５号に開示されている（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0101】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、
（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＧＲＫＱ（配列番号２２）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｂ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＳＧＳＫＫＮ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｃ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＨＧＲＫＱ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＨＡＲＫＱ（配列番号３４）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｅ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＡＲＫＱ（配列番号３６）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｇ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＴＲＫＱ（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｈ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＤＧＫＮＴ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＹＤＧＳＲＴ（配列番号４９）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；又は
（ｊ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＨＤＧＲＫＴ（配列番号５１）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む。

【0102】

アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含むＣＤＲ１は、ＩＭＧＴに従って定義される。ＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔに従って定義されるアミノ酸配列ＳＹＧＭＨ（配列番号６０）を含み得る。

【0103】

列挙されたＣＤＲ配列からの１つ、２つ、又は３つのアミノ酸残基の変異は、種類として同じ結合活性（本質的に同等なのであって、その量は必ずしも同等ではない）を保持させつつ可能である。したがって、当該重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、好ましくは、列挙されたＣＤＲ配列から３つ以下、好ましくは２つ以下、より好ましくは１つ以下のアミノ酸を逸脱する配列を含有する。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、列挙されたＣＤＲ配列と同一である。

【0104】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号２４～２９、３１、３３、３５、３７～４４、４６、４８、５０及び５２に示されるＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号２４～２９、３１、３３、３５、３７～４４、４６、４８、５０及び５２に記載のＶＨ領域配列の１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一のものを含む。

【0106】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号３７～４４に記載の配列ＶＨ領域の１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一のものを含む。

【0107】

例えば、いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体の重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ配列の外側の重鎖可変領域の配列において、０～１０、好ましくは０～５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

【0108】

ＣＬＥＣ１２Ａ又はＣＤ３結合を保持する開示されたアミノ酸配列の更なる変異体は、例えば、再構成ヒトＩＧＫＶ１－３９／ＩＧＫＪ１ＶＬ領域（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ，Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）を含有するファージディスプレイライブラリー、及び、前述の本明細書に開示されるＣＬＥＣ１２Ａ又はＣＤ３ＶＨ領域のアミノ酸配列にアミノ酸置換を組み込んだＶＨ領域の集合（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６８９８８号）から得ることができる。ＣＬＥＣ１２Ａ又はＣＤ３に結合するＦａｂ領域をコードするファージを選択し、フローサイトメトリーで分析し、配列決定して、抗原結合を保持するアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は付加を伴う変異体を同定することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６８９８８号に記載されているように、ＣＤ３ＶＨ領域は、位置Ａ５０で置換されてもよく、Ｓ、Ｙ、Ｍ又はＱで修飾されてもよく；Ｄ５９は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、又はＥ、好ましくはＹ又はＥで置換されてよく；Ａ６１は、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｋ、Ｖで置換されてよく；Ｆ１０５は、Ｙ又はＭで置換されてよい。許容されるアミノ酸置換は容易に見出され得る。

【0109】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号２４～２９、３１、３３、３５、３７～４４、４６、４８、５０又は５２から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0110】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号３７～４４から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0111】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域であって、該第１のＶＨ領域が、配列番号１２、１６及び２０に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、第１の重鎖可変領域と；ヒトＣＤ３に結合する第２の重鎖可変領域であって、該第２のＶＨ領域が、配列番号３７～４４に記載のＶＨ領域配列のうちの１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、第２の重鎖可変領域と；を含む。

【0112】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域、及びヒトＣＤ３に結合する第２の重鎖可変領域を含み、
（ａ）第１の重鎖可変領域は：
（ｉ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号９）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＮＰＳＧＧＳ（配列番号１０）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＴＴＧＤＷＦＤＹ（配列番号１１）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＮＰＳＧＧＳ（配列番号１４）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＮＹＧＤＥＦＤＹ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ３；又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＳＧＧ（配列番号１８）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＤＧＹＦＡＤＡＦＤＹ（配列番号１９）を含む重鎖ＣＤＲ３；を含み、及び
（ｂ）第２の重鎖可変領域は、
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＧＲＫＱ（配列番号２２）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＳＧＳＫＫＮ（配列番号３０）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＨＧＲＫＱ（配列番号３２）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉｖ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＨＡＲＫＱ（配列番号３４）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｖ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＡＲＫＱ（配列番号３６）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＴＲＫＱ（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＤＧＫＮＴ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＹＤＧＳＲＴ（配列番号４９）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；又は
（ｉｘ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＨＤＧＲＫＴ（配列番号５１）を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３；を含む。

【0113】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域であって、該第１のＶＨ領域が、アミノ酸配列ＳＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号９）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＮＰＳＧＧＳ（配列番号１０）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＴＴＧＤＷＦＤＹ（配列番号１１）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、第１の重鎖可変領域と；第２のＶＨ領域が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号２１）を含む重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＷＹＮＡＲＫＱ（配列番号３６）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＧＴＧＹＮＷＦＤＰ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、第２の重鎖可変領域と；を含む。

【0114】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域であって、該第１のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号１２、１６及び２０から選択される、第１の重鎖可変領域と；ヒトＣＤ３に結合する第２の重鎖可変領域であって、該第２のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号２４～２９、３１、３３、３５、３７～４４、４６、４８、５０及び５２から選択される、第２の重鎖可変領域と；を含む。

【0115】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域であって、該第１のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号１２である、第１の重鎖可変領域と；ヒトＣＤ３に結合する第２の重鎖可変領域であって、該第２のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号３７～４４から選択される、第２の重鎖可変領域と；を含む。

【0116】

一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する第１の重鎖可変領域であって、該第１のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号１２に記載されている、第１の重鎖可変領域と；ヒトに結合する第２の重鎖可変領域であって、該第２のＶＨ領域のアミノ酸配列が、配列番号３７に記載されている、第２の重鎖可変領域と；を含む。

【0117】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ ＣＬＥＣ１２Ａ結合領域及びＣＤ３結合領域のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、親ＣＬＥＣ１２Ａ単一特異性抗体のＶＬ領域及び／又は親ＣＤ３単一特異性抗体のＶＬ領域と同じであってもよく、又は代替ＶＬ領域は、二重特異性抗体がＣＬＥＣ１２Ａ及びＣＤ３抗原の両方への結合を保持している限り、一方又は両方のＶＨ／ＶＬ領域の組み合わせに使用されてもよい。

【0118】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ ＣＬＥＣ１２Ａ結合領域のＶＬ領域は、ＶＨ／ＶＬ ＣＤ３結合領域のＶＬ領域と類似している。特定の実施形態では、第１及び第２のＶＨ／ＶＬ領域の組み合わせにおけるＶＬ領域は同一である。

【0119】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、共通軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の共通軽鎖可変領域は、生殖細胞系列Ｏ１２可変領域Ｖセグメントを含む。特定の実施形態では、一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＶセグメントＩｇＶκ１－３９^＊０１を含む。ＩｇＶκ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９、ＩＧＫＶ１３９、ＩＧＫＶ１－３９、Ｏ１２ａ、又はＯ１２としても知られる。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。Ｖ領域のアミノ酸配列は、配列番号５６に提供されている。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。好ましいＪ領域はｊｋ１及びｊｋ５であり、接合された配列はＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５として示される。代替名は、ＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。特定の実施形態において、一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０５（それぞれ配列番号５７及び配列番号５８）を含む。

【0120】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳを含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３（すなわち、ＩＭＧＴによるＩＧＫＶ１－３９のＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号５３）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＬＱＳ（配列番号５４）を含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ３を含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ結合領域の一方又は両方は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ結合領域の一方又は両方は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0122】

例えば、いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の可変軽鎖は、配列番号５７又は配列番号５８に対して、０～１０、好ましくは０～５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

【0123】

他の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の一方又は両方のＶＨ／ＶＬ結合領域の軽鎖可変領域は、配列番号５７又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の両方のＶＨ／ＶＬ結合領域は、同一のＶＬ領域を含む。一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ結合領域の両方のＶＬは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＶＨ／ＶＬ結合領域の両方のＶＬは、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0124】

本明細書に開示される方法で使用するためのＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、多数のフォーマットで提供することができる。二重特異性抗体の多くの異なるフォーマットが当技術分野で知られており、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，２０１５、２０１８、及びＳｐｉｅｓｓ，Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ，２０１５によりレビューされており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つのＶＨ／ＶＬの組み合わせを有する従来の抗体ではない二重特異性抗体フォーマットは、少なくとも、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む可変ドメインを有する。この可変ドメインは、一本鎖Ｆｖフラグメント、モノボディ、ＶＨ、及び２番目の結合活性を提供するＦａｂフラグメントに連結されている場合がある。

【0125】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用されるＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、概して、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のものである。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。半減期が有利で免疫原性が低いため、全長ＩｇＧ抗体が好ましい。したがって、特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、全長ＩｇＧ分子である。一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、全長ＩｇＧ１分子である。

【0126】

したがって、特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、結晶化可能なフラグメント（Ｆｃ）を含む。ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＦｃは、好ましくは、ヒト定常領域から構成される。ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の定常領域又はＦｃは、１個以上の、好ましくは１０個以下の、好ましくは５個以下の、天然に存在するヒト抗体の定常領域とは異なるアミノ酸を含有することができる。例えば、特定の実施形態において、二重特異性抗体の各Ｆａｂアームは、二重特異性抗体の形成を促進する修飾、Ｆｃ媒介エフェクター機能に影響を与える修飾、及び／又は本明細書に記載の他の特徴を含むＦｃ領域を更に含み得る。

【0127】

好ましい実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性全長ＩｇＧ抗体は、当該二重特異性ＩｇＧ抗体とＦｃガンマ（Ｆｃγ）受容体との相互作用が低減するように、変異した下部ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインを有する。本明細書で使用される場合、「当該二重特異性ＩｇＧ抗体とＦｃガンマ受容体との相互作用が低減するように」という用語は、このようなＦｃガンマ受容体が抗体の近くに存在する場合、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体とＦｃガンマ受容体との相互作用が低減することを意味する。特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体とＦｃ受容体との相互作用は、本質的に消失する。Ｆｃγ受容体結合が低下した二重特異性抗体は、以前に記載されている（米国特許第２０１４／０１２００９６号、参照により本明細書に組み入れられる）。

【0128】

特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸位置２３５及び／又は２３６（ＥＵ番号付け）に少なくとも１つの置換を有する変異した下部ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、アミノ酸位置２３５及び２３６の両方が置換される。米国特許出願公開第２０１４／０１２００９６号に記載されているように、これらの部位での置換は、抗体と腫瘍細胞又はエフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体との間の相互作用を本質的に防ぐことができる。したがって、特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｌ２３５Ｇ及び／又はＧ２３６Ｒ置換を含む変異ＣＨ２及び／又は下部ヒンジドメインを含む。好ましくは、Ｌ２３５Ｇ及びＧ２３６Ｒの両方が置換される。あるいは、当業者は、置換２３４Ｆ、２３５Ｅ及び／又は３３１Ｓを含む下部ヒンジ及び／又はＣＨ２ドメイン変異を導入することができる（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．２００８）。好ましくは、３つ全ての置換がこの代替で導入される。

【0129】

二重特異性抗体は、典型的には、抗体をコードする核酸を発現する細胞によって産生される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される二重特異性ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３抗体は、二重特異性ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域及び定常領域をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供することによって産生される。細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。好適な細胞は、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を含むことができ、好ましくは産生することができる任意の細胞である。

【0130】

抗体産生に好適な細胞は、当技術分野で知られており、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ－Ｃ６細胞が含まれる。様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。特に好ましい実施形態では、該細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスＥ１領域又はその機能的等価物によって形質転換される細胞。このような細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株又はその等価物である。特に好ましい実施形態では、当該細胞は、ＣＨＯ細胞又はその変異体である。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）ベクター系を利用する変異体。好ましい一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0131】

いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を構成する異なる軽鎖及び重鎖を発現する。特定の実施形態では、細胞は、２つの異なる重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を発現する。１つの好ましい実施形態において、細胞は、異なる抗体種（異なる重鎖及び軽鎖の組み合わせ）の数を低減するために、本明細書に記載されるような「共通軽鎖」を発現する。例えば、それぞれのＶＨ領域は、二重特異性ＩｇＧ（国際公開第２０１３／１５７９５４号；参照により本明細書に組み込まれる）の産生のための当技術分野で知られている方法を使用して、再構成ヒトＩＧＫＶ１３９／ＩＧＫＪ１（ｈｕＶκ１３９）軽鎖と併せて、発現ベクターにクローン化される。ｈｕＶκ１３９は、複数の重鎖と対合して、それによって多様な特異性を持つ抗体を生じさせ、二重特異性分子の生成を促進することが以前に示されていた（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ，Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９；国際公開第２００９／１５７７７１号）。

【0132】

共通軽鎖及び等量の２つの重鎖を発現する抗体産生細胞は、典型的には、５０％の二重特異性抗体と、各々２５％の単一特異性抗体を産生する（すなわち、同一の重軽鎖の組み合わせを有する）。それぞれの単一特異性抗体の産生よりも、二重特異性抗体の産生に有利であるいくつかの方法が公開されている。このようなものは、典型的には、重鎖の定常領域を、これらがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化（すなわち、他の重鎖／軽鎖の組み合わせの重鎖と二量体化）に有利になるように修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。様々な適合性ヘテロ二量体化ドメインが、当該技術分野において記載されている。この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。

【0133】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を産生するための好ましい方法の１つは、米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号に開示されている。具体的には、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを産生するための好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付け）（「ＫＫ－変異体」重鎖）、及び第２のドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ－変異体」重鎖）、又はその逆である。前述のように、ＤＥ－変異体及びＫＫ－変異体は、優先的に対合して、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成する。ＤＥ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３－ＣＨ３界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。

【0134】

したがって、一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＤＥ変異体を含む。この実施形態では、ＣＤ３に結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＫＫ変異体を含む。

【0135】

候補ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３ＩｇＧ二重特異性抗体は、任意の好適なアッセイを使用して結合について試験することができる。例えば、ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞上の膜発現ＣＤ３への結合は、フローサイトメトリーによって（国際公開第２０１４／０５１４３３号に以前に記載されたＦＡＣＳ手順に従って）評価することができる。一実施形態では、ＨＰＢ ＡＬＬ細胞上のＣＤ３への候補ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の結合は、当技術分野で知られている標準的な手順に従って実施されるフローサイトメトリーによって実証される。細胞発現ＣＤ３への結合は、ＣＤ３δ／ε又はＣＤ３γ／εでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用して確認される。ＣＬＥＣ１２Ａへの候補二重特異性ＩｇＧ１の結合は、ＣＬＥＣ１２Ａ発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用して判定される。ＣＤ３単一特異性抗体及びＣＬＥＣ１２Ａ単一特異性抗体、並びに無関係なＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂは、対照としてアッセイに含まれる（例えば、ＣＤ３及び破傷風毒素（ＴＴ）などの別の抗原に結合する抗体）。

【0136】

標的に対する候補ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３及びＣＬＥＣ１２ＡＦａｂの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定できる。簡単に説明すると、抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ｃａｔ．Ｎｒ．５５５７８４）は、遊離アミン化学（ＮＨＳ／ＥＤＣ）を使用して、ＣＭ５センサーチップの表面に結合される。次に、ｂｓＡｂがセンサー表面に捕捉される。続いて、組換え精製抗原ヒトＣＬＥＣ１２Ａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ，ｃａｔ．Ｎｒ．１１８９６－Ｈ０７Ｈ）及びヒトＣＤ３δε－Ｆｃタンパク質を、オン／オフレートを測定するための濃度範囲でセンサー表面上に流す。各サイクルの後、センサー表面をＨＣｌのパルスによって再生し、ｂｓＡｂを再び捕捉する。得られたセンサーグラムから、オン／オフレート、並びにヒトＣＤ３及びＣＬＥＣ１２Ａに結合するための親和性値が、以前に記載されたように（例えば、米国特許第２０１６／０３６８９８８号）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して測定される。

【0137】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞刺激能は、国際公開第２０１４／０５１４３３号及び米国特許出願公開第２０１６／０３６８９８８号に記載されている手順に従って得られた、健康なドナーの休止Ｔ細胞を使用したアッセイで測定できる。例えば、候補ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、２日間、１０：１又は５：１のエフェクター：標的細胞比にて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は１０％正常ヒト血清（ＨＳ）中の白血病由来ＨＬ６０細胞株の細胞とインキュベートした、精製された健康なドナーの休止Ｔ細胞で試験される。結果は、ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Ｔ細胞集団内のＣＤ６９陽性又はＣＤ２５陽性細胞の割合として表される。

【0138】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体が標的細胞溶解を誘導する能力は、国際公開第２０１４／０５１４３３号及び米国特許出願公開第２０１６／０３６８９８８号に記載されている手順に従って、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識され、健康なドナーからのＴ細胞と共培養された白血病細胞（ＨＬ－６０細胞など）を使用したアッセイで試験できる。生き残ったＣＦＳＥ陽性細胞はフローサイトメトリーによって定量化され、結果は、ＰＢＳ対照条件に対する特定の溶解の割合として表される。

【0139】

一態様では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、動物、特にヒトで使用するために、政府規制機関によって承認されるか、又は米国薬局方又は他の総合的に認められている薬局方に列挙されていることを意味し、生理学的に適合性がある任意の及び全ての溶媒、塩、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。用語「担体」は、化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、水及び油などの無菌液体であり得、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸などが含まれる。水又は生理食塩水、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液を、特に注射可能な溶液の担体として使用することができる。非経口投与用の液体組成物は、注射又は連続注入による投与のために製剤化することができる。注射又は注入による投与経路としては、膀胱内、腫瘍内、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、及び皮下が挙げられる。投与経路（例えば、静脈内、皮下、関節内など）に応じて、活性化合物を、化合物を不活性化する可能性のある酸及び他の天然条件の作用から保護するために、材料でコーティングすることができる。

【0140】

ヒト患者への投与に好適な医薬組成物は、典型的には、例えば液体担体中の非経口投与用に製剤化され、又は静脈内投与用の液体溶液若しくは懸濁液への再構成に好適である。組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位形態で製剤化することができる。

【0141】

また、使用直前に経口投与又は非経口投与用の液体調剤に変換することを目的とした固体調剤も含まれる。このような液体形態としては、液剤、懸濁剤、及び乳剤が挙げられる。

【0142】

本明細書で提供される組成物及び方法は、患者のＴ細胞又は複数のＴ細胞を活性化するために特に有用である。患者は癌を患っているか、癌を患うリスクがある。後者は、癌が寛解しており、癌の再発、再燃、又は転移のリスクがある患者である。したがって、組成物及び方法は、骨髄由来の骨髄性白血病及び前白血病疾患などの、様々な骨髄性悪性腫瘍の治療に使用することができる。したがって、本明細書で提供される方法に従って治療することができる疾患としては、骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）、又は前白血病疾患、例えば骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（及びＡＭＬへの進行）、骨髄線維症（ＭＦ）、又は骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）が挙げられる。

【0143】

本明細書で使用される場合、二重特異性抗体であるＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、別の治療用分子と組み合わせることができる。このような併用投与（同時投与）としては、同じ若しくは異なる投与形態でのＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分の同時の投与、別個の投与、又は連続の投与が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、対象におけるＴ細胞を活性化するための方法において使用することができ、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩＬ－１５部分と同時に、別々に、又は連続して投与される。他の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、対象における癌の治療に使用することができ、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩＬ－１５部分と同時に、別々に、又は連続して投与することができる。

【0144】

他の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、対象のＴ細胞を活性化するための医薬品の製造に使用することができ、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩＬ－１５部分と同時に、別々に、又は連続して投与される。ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分を含む製品は、対象のＴ細胞を活性化する際に同時に、別々に、又は連続して使用するための組み合わせた調剤であり得る。他の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、対象の癌を治療するための医薬品の製造に使用することができ、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＩＬ－１５部分と同時に、別々に、又は連続して投与することができる。ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分を含む製品は、対象の癌を治療する際に同時に、別々に、又は連続して使用するための組み合わせた調剤であり得る。

【0145】

ＩＬ－１５部分は、好適な投与量、経路（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内又は皮下）に従って投与することができる。

【0146】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分は、単一の製剤で同時に投与できる。あるいは、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分は、別個の投与のために製剤化することができ、同時に又は連続して投与される。

【0147】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５部分及びＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、同時に投与される。

【0148】

一実施形態では、対象は、単回用量のＩＬ－１５部分及び単回用量のＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を投与される。いくつかの実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分は、治療の過程にわたって繰り返し投与される。例えば、特定の実施形態において、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上）の用量のＩＬ－１５部分、及び複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上）の用量のＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体が、治療を必要とする対象に投与される。

【0149】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５部分及びＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、１週間に１回行われてもよく、そのレジメンにおいて、同じ日に（例えば、同時に）、又は逐次（例えば、１分以上、数時間、又は数日前後）投与されてもよい。別個に投与される場合、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体及びＩＬ－１５部分は、同じ投与（すなわち、用量）プロトコルに従って投与され得るが、必ずしもそのプロトコルに従って投与されるというわけではない。治療有効量のＩＬ－１５部分は、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体よりも多い又は少ない頻度で投与され得る。特定の実施形態において、各用量のＩＬ－１５部分及びＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体は、同じ日に投与されてもよく、あるいは、ＩＬ－１５部分は、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３抗体の前又は後に１日以上投与されてもよい。

【0150】

便宜上、必要に応じて、１日の合計投与量を分割し、１日の間に分割して投与することができる。断続的な治療（例えば、３週間のうち１週間又は４週間のうち３週間）も使用することができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用されるＩＬ－１５部分は、組換えヒトＩＬ－１５（ｒｈＩＬ－１５）である。特定の実施形態において、ｒｈＩＬ－１５は、約０．１２５μｇ／ｋｇ／日～２．０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ｒｈＩＬ－１５は、０．１２５、０．２５、０．５、１．０又は２．０μｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、ｒｈＩＬ－１５は、静脈内ボーラス投与によって投与される。他の実施形態では、ｒｈＩＬ－１５は、持続静脈内注入（ＣＩＶ）によって投与される。特定の実施形態では、ｒｈＩＬ－１５は、ＣＩＶによって２～１０日、５～１０日、又は７～１０日間投与される。一実施形態では、ｒｈＩＬ－１５は、ＣＩＶによって１０日間投与される。関連する実施形態において、ｒｈＩＬ－１５は、約３０～６０日間の治療サイクルで投与され、この場合、ｒｈＩＬ－１５は、各サイクルの最初の５～１０日間、ＣＩＶによって投与される。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法に従って投与されるＩＬ－１５部分は、可溶性ＩＬ－１５受容体又は受容体フラグメント（ｓＩＬ－１５Ｒａ）である。他の実施形態では、ＩＬ－１５部分は、例えば、米国特許第９，２５５，１４１号及び同第９，３２８，１５９号に記載されているように、ＩＬ－１５及びｓＩＬ－１５Ｒａを含む複合体である。特定の実施形態において、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、約０．１μｇ／ｋｇ～約２０μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約２０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ～約４０μｇ／ｋｇ、又は約２５μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇの用量で、対象に投与される。

【0153】

特定の実施形態において、ＩＬ－１５部分は、皮下投与されるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、１日に１回、２日に１回、３、４、５、６又は７日に１回の頻度で投与される。特定の実施形態において、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａは、１週間に１、２、３、４、５、６又は７日間投与される。特定の実施形態において、第１のサイクル及び後続の各サイクルの用量は、０．１μｇ／ｋｇ～１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～５μｇ／ｋｇ、又は５μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇである。別の実施形態において、第１のサイクル及び後続の各サイクルの第１の用量は、０．１μｇ／ｋｇ～０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～２μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ～５μｇ／ｋｇ、又は２μｇ／ｋｇ～４μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、第１のサイクル及び後続の各サイクルの用量は、０．１μｇ／ｋｇ、０．２５μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１．２５μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、１．７５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、２．２５μｇ／ｋｇ、２．５μｇ／ｋｇ、２．７５μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、３．２５μｇ／ｋｇ、３．５μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、４．２５μｇ／ｋｇ、４．５μｇ／ｋｇ、４．７５μｇ／ｋｇ、又は５μｇ／ｋｇである。一実施形態では、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体が２週間連続して週に３回皮下投与される２８日サイクルに従って投与される。

【0154】

更に他の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用されるＩＬ－１５部分は、長時間作用型のＩＬ－１５、例えば、ＩＬ－１５と水溶性ポリマーとのコンジュゲートであり、例えば、国際公開第２０１５８１５３７３号に記載されているようなものである。当業者は、ＩＬ－１５受容体（「ＩＬ－１５Ｒ」）で臨床的に関連するアゴニスト活性を提供するのに十分な、長時間作用型ＩＬ－１５アゴニストの量を測定することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５ポリマーコンジュゲートは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００１～約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ＩＬ－１５ポリマーコンジュゲートは、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ＩＬ－１５ポリマーコンジュゲートは、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、又は約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ＩＬ－１５ポリマーコンジュゲートは、約０．００２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0155】

本明細書に記載の治療方法は、典型的には、患者のケアを監督する臨床医が、治療方法が有効である、すなわち、患者が治療に応答しているとみなす限り継続される。治療方法が有効であることを示す非限定的なパラメータとしては、以下のうちの１つ以上を挙げることができる：腫瘍細胞の減少；腫瘍細胞増殖の阻害；腫瘍細胞の排除；無増悪生存期間；好適な腫瘍マーカーによる適切な反応（該当する場合）；ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞数の増加；ＣＬＥＣ１２Ａ特異的Ｔ細胞数の増加；及びＣＬＥＣ１２Ａ特異的メモリーＴ細胞数の増加。

【0156】

ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を投与する頻度に関して、当業者は適切な頻度を決定することができるであろう。例えば、臨床医は、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体を比較的低い頻度で（例えば、２週間に１回）投与し、患者が許容するように投与期間を徐々に短縮することを決定することができる。ＩＬ－１５部分が投与される場合、これらの薬剤の頻度は、同様の方法で決定することができる。特許請求の方法による治療の過程に関連する例示的な時間の長さとしては、以下のものが挙げられる：約１週間、２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月、約３年、約４年、約５年、無期限（例：継続的な維持療法）。前述の期間は、１回又は複数回の治療ラウンド／サイクルに関連し得る。

【0157】

本明細書で提供される治療方法の有効性は、任意の好適な手段を用いて評価することができる。一実施形態では、併用治療の臨床的有効性は、客観的応答基準として骨髄におけるＡＭＬ芽球減少を用いて分析される。本明細書に開示される方法に従って治療される患者、例えばヒトは、好ましくは、癌の少なくとも１つの徴候の改善を経験する。いくつかの実施形態では、以下のうちの１つ以上が起こり得る：癌細胞の数を低減することができる；癌の再発を予防又は遅延する；癌に関連する１つ以上の症状をある程度和らげることができる。更に、（国際公開第２０１７／０１０８７４号に記載されているように）Ｔ細胞媒介標的細胞溶解を判定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、対象から単離されたＡＭＬ腫瘍芽球を用いて行うことができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、本明細書に記載される治療の後、もはや検出できない。いくつかの実施形態では、対象は、部分的に又は完全に寛解している。特定の実施形態において、対象は、増加した全生存期間、生存率中央値、及び／又は無増悪生存期間を有する。

【0159】

本発明の治療（例えば、ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＤ３二重特異性抗体）又はＩＬ－１５部分との併用治療はまた、治療されている癌に対するそれらの特定の有用性のために選択される他の周知の治療と併せて使用され得る。あるいは、本発明の組み合わせは、適切な場合、既知の薬学的に許容される薬剤と共に連続して使用され得る。

【0160】

化学療法剤の安全かつ有効な投与のための方法は、当業者に知られている。更に、それらの投与は、標準的な文献に記載されている。例えば、化学療法剤の多くの投与は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）、例えば１９９６年版（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．０７６４５－１７４２，ＵＳＡ）に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0161】

化学療法剤の投与及び／又は放射線療法は、治療されている疾患、並びにその疾患に対する化学療法剤及び／又は放射線療法の既知の効果に応じて変化し得ることが当業者には明らかであろう。また、当業者の知識に従って、患者に対する投与された治療剤の観察された効果を考慮し、そして投与された治療剤への疾患の観察された応答を考慮して、治療プロトコル（例えば、投与量及び投与時間）を変えることができる。

【0162】

本明細書に記載されているＧｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開された特許出願、並びにウェブサイトを含む全ての文書及び参考文献は、本文書に全て又は一部が記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0163】

ここで、本発明は、以下の実施例を参照することによって説明されるが、これは例示的なものにすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。本発明を詳細に説明し、その特定の実施形態を参照して説明したが、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。

【0164】

明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。

【実施例0165】

実施例１
材料及び方法
フローサイトメトリー
Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００、Ｃｙａｎ－ＡＤＰ，Ｇａｌｌｉｏｓ又はＮＡＶＩＯＳ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーを実行した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ）又はＫａｌｕｚａソフトウェア（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、データを分析した。ＣＤ４５／ＳＳＣ及びＣＤ３（Ｔ細胞について）に基づいて、リンパ球を除くＳＳＣ±ＣＤ４５ＤＩＭ及び／又はＣＤ４５^ＰＯＳ細胞として、芽球を定義した。

【0166】

１． 細胞株上の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６対アイソタイプ対照ＩｇＧの特異的結合パターンを、抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ抗体で視覚化された非コンジュゲート抗体で評価した。

【0167】

２． 健康なドナー由来の末梢血サンプルにおける抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６二重特異性抗体対アイソタイプ対照ＩｇＧの特異的結合パターンを、ａ）ＣＤ１ｃ－ＰＥ、ＣＤ１９－ＥＣＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ５、ＣＤ５６－ＰＥＣＹ７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ４－Ｐａｃｉｆｉｃブルー、ＣＤ４５－Ｋｒｏｍｅオレンジ；又はｂ）ＣＤ３０３－ＰＥ、ＣＤ３０４－ＰＥ、ＣＤ１４－ＥＣＤ、ＣＤ３３－ＰＥＣＹ５、ＣＤ１６－ＰＥＣＹ７、及びＣＤ４５－Ｋｒｏｍｅオレンジと組み合わせたＯｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎコンジュゲートＩｇＧバッチを使用して試験した。

【0168】

３． 健康なドナー由来の骨髄サンプルのＣＤ３４^ＰＯＳ分画における抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６二重特異性抗体対アイソタイプ対照ＩｇＧの特異的結合パターンを、系列（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）－ＦＩＴＣ、ＣＤ３８－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３４－ＰＥＣＹ７、ＣＤ１０－ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＦ７００、ＣＤ１３５ａ－ＢＶ４２１、ＣＤ９０－ＢＶ５１０、及びＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせたＰＥコンジュゲートＩｇＧバッチを使用して試験した。

【0169】

４． ＣＤ２５－ＰＥ、７ＡＡＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ６９－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＦ７００、及びＣＤ４－ＢＶ４２１を使用して、ＨＬ６０細胞を用いる細胞傷害アッセイにおけるＴ細胞活性化を求めた。

【0170】

５． ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＤ１６－ＰＥ、ＣＤ１９－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ６９－ＡＰＣ、及びＣＤ８－ＡＦ７００を使用して、単球の細胞傷害を定量化した。

【0171】

６． Ｔ細胞の増殖を定量化するために、７ＡＡＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ８－ＡＦ７００、及びＣＤ４－ＢＶ４２１を用いて、Ｔ細胞を視覚化した。

【0172】

７． ａ）ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、７ＡＡＤ、ＣＤ３４－ＰＥＣＹ７、ＣＤ１０－ＡＰＣ－ＡＦ７５０、及びＣＤ５－ＢＶ４２１と；ｂ）ＣＤ９０－ＦＩＴＣ、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）／ＩｇＧ２ａ－ＰＥ、ＣＤ３８－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３４－ＰＥＣＹ７、ＣＤ１０－ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＦ７００、ＣＤ１２３－ＢＶ４２１、又はＣＤ１３５ａ－ＢＶ４２１、及び系列（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）－ＢＶ５１０とを使用して、ＣＤ３４^ＰＯＳ骨髄前駆細胞の細胞傷害を定量化した。

【0173】

８． ＡＭＬ芽球及び精製Ｔ細胞を用いた細胞傷害アッセイに使用されるＡＭＬ芽球上のＣＬＥＣ１２Ａ発現を、ａ）ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ１４－ＥＣＤ、ＣＤ３３－ＰＥＣＹ５、ＣＤ３８－ＰＥＣＹ７、ＣＤ１１７－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＡＦ７００、ＣＤ３４－ＢＶ４２１、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジ；又はｂ）ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ１９－ＥＣＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ５、ＣＤ５６－ＰＥＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ４－ＢＶ４２１、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジを使用して、定量化した。

【0174】

９． ＡＭＬ芽球及び精製Ｔ細胞を使用した細胞傷害アッセイにおける抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の有効性を、ａ）ＣＤ１９７－ＡＦ４８８、ＣＤ４－ＰＥ、ＣＤ４５ＲＯ－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ８－ＡＦ７００、及びＣＤ４５ＲＡ－Ｐａｃｉｆｉｃブルーと；ｂ）ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ４－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ１１７－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ３４－ＢＶ４２１、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジとを使用して定量化した。

【0175】

１０． ＡＭＬ芽球でのＣＬＥＣ１２Ａ発現を、ａ）（１，０００ｎｇ／ｍＬの条件）ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）／ＩｇＧ２ｂ－ＰＥ、ＣＤ３４－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ４－ＢＶ４２１、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジ；又はｂ）（２００ｎｇ／ｍＬの条件）ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ３４－ＥＣＤ、ＣＤ４－ＰＥＣＹ５．５、ＣＤ１１７－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ３３－ＡＰＣ ＡＦ７５０、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジを使用して判定した。

【0176】

１１． 初代ＡＭＬ芽球サンプルにおける抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の有効性を、ａ）（１，０００ｎｇ／ｍＬの条件）ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＤ３４－ＥＣＤ、７ＡＡＤ、ＣＤ３３－ＰＥＣＹ７、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＦ７００、ＣＤ４－ＢＶ４２１、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジ；又はｂ）（２００ｎｇ／ｍＬの条件）ＣＤ３－ＦＩＴＣ、７ＡＡＤ、ＣＤ４－ＰＥＣＹ７、ＣＤ８－ＡＦ６４７、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＦ７００、ＣＤ３３－ＡＰＣ ＡＦ７５０、及びＣＤ４５－ｋｒｏｍｅオレンジを使用して評価した。

【0177】

二重特異性抗体
実施例で使用される抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６及び実施例で参照される図は、配列表の概要において、配列番号５６のＩｇＶｋ１－３９^＊０１の共通軽鎖可変領域を有する、ＣＬＥＣ１２Ａ及びＣＤ３に特異的な全長ヒトＩｇＧ１二重特異性抗体である。これには、配列表の概要に示されているＭＦ４３２７の重鎖可変領域及びＭＦ５１９６の重鎖可変領域がある。抗体の定常部分は、示されているように、エフェクター機能がサイレンシングされている、又はされていない場合がある。陰性対照抗体は、破傷風毒素に対するｃＬＣ単一特異性抗体（ＴＴｘＴＴＩｇＧ、アイソタイプ対照（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ，Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９））、並びに破傷風毒素及びＣＤ３に対するｃＬＣ二重特異性抗体（ＭｏｃｋｘＣＤ３又はＴＴｘＣＤ３ＩｇＧ、抗体ＭＦ４３２７ＸＭＦ５１９６においてと同じＣＤ３Ｆａｂを使用）であり；陽性対照抗体は、ＣＤ３に対する二価のｃＬＣ単一特異性抗体（ＣＤ３ｘＣＤ３、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６においてと同じＣＤ３Ｆａｂを使用）であった。二重特異性抗体の初期バッチでは、静電的に操作された重鎖を一過性の産生に使用し、９５％を超える純度の二重特異性ＩｇＧ１を得た（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｐｅｎｔｏｎｙ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＨ３界面の荷電残基を伴う独自の変異が導入された重鎖Ｆｃ操作を使用して、その後のバッチを生成した（Ｄｅ Ｎａｒｄｉｓ，Ｈｅｎｄｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．２０１７）。特に明記されていない限り、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６、ＭｏｃｋｘＣＤ３、及びＴＴｘＴＴＩｇＧのＩｇＧバッチは、ＣＨ２領域に変化を導入した際、Ｆｃエフェクター機能を欠損している。

【0178】

親和性測定
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６を、マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介してＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。続いて、組換え精製ＣＬＥＣ１２Ａ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）又は組換えＣＤ３δε－Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面に流した。

【0179】

Ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態試験
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに、１ｍｇ／ｋｇの抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の単回静脈内投与を行った。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６血清レベルを、抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ）を使用して様々な時点で定量化した。

【0180】

細胞株
ＨＬ６０細胞（ＤＳＭＺ）を、２ｍＭのｌ－グルタミン及び１０％ＦＢＳ（Ｉｎｔｅｇｒｏ）を含有するＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２１９８０－０６５）中で培養した。ＣＨＯ－Ｋ１（ＤＳＭＺ）、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ＬＧＣ）、及びＪ．ＲＴ－Ｔ３．５（ＬＧＣ）細胞株を、２ｍＭのｌ－グルタミン及び１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１３２０－０３３）で維持した。ヒトＣＬＥＣ１２ＡをコードするｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の安定な組み込みによって、ＣＬＥＣ１２Ａ－ＣＨＯ－Ｋ１細胞株を生成した。

【0181】

臨床サンプル
ＡＭＬ患者サンプル（表ＩＩＩ）及び健康なドナーの骨髄を、ヘルシンキ宣言並びにＲＵＭＣ施設のガイドライン及び規制に従って取得した。液体窒素で保存するために、７％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｗ３８７５０９）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｉｎｔｅｇｒｏ）を含有するＩＭＤＭ培地で、細胞を再懸濁した。解凍後、２５０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ，１１２８４９３２００１）及び１．２５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する１０％ヒト血清（ＨＳ，ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、細胞を１０分間インキュベートした。続いて、過剰量の培地で、細胞を洗浄した。

【0182】

精製Ｔ細胞を用いた細胞傷害アッセイ
健康なドナー又はＡＭＬ患者から収集された末梢血（ＰＢ）から、密度勾配遠心分離によって、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した（患者の特徴については表ＩＩＩを参照）。磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－０９６－５３５）を使用したネガティブ選択により、新たに単離又は凍結保存されたＰＢＭＣから、ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を精製した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ（商標），ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１０％ＡＢ＋ＨＳ（Ｓａｎｑｕｉｎ）を補充したＩＭＤＭで、細胞傷害アッセイを行った。特に指定のない限り、１０^５個のＴ細胞を使用した。ＣＦＳＥ標識ＨＬ６０又は初代ＡＭＬ芽球標的細胞を使用した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１１－５７）。ＣＦＳＥ標識の前に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，１１３４３１２５）、１００ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，１１３４３３２５）、及び２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，１１３４３３０５）を補充したアッセイ培地で、ＡＭＬ芽球を一晩前培養した。続いて、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又は対照ＩｇＧの存在下で同じサイトカインを補充したアッセイ培地で、Ｔ細胞及び標的細胞を共培養した。２４～７２時間後、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞活性化及び残りのＣＦＳＥ^ＰＯＳ標的細胞の数を定量した（ゲーティングストラテジーについては図７を参照）。特異的溶解の割合を次のように計算した：特異的溶解（％）＝１００－［（１００ｘＩｇＧを含む条件の標的細胞数）／（ＩｇＧを含まない条件の平均標的細胞数）］。

【0183】

ＰＢＭＣベースの単球細胞傷害アッセイ
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又は対照ＩｇＧの存在下で、１０％ＡＢ＋ＨＳを含むＩＭＤＭ中で、ＰＢＭＣ（２×１０^５）を４８時間インキュベートした。採取する前に、アッセイプレートを遠心分離（５００ｇ、５分）して、サイトカイン定量用の上清を収集した。続いて２～８℃で１時間インキュベートした後、細胞を洗浄せずにアッセイ培地で染色した。単球、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の特異的溶解を、各アッセイウェルから収集した固定量でフローサイトメトリーによって定量化した（図８）。

【0184】

Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＦＳＥ標識ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞を、ＣＤ１４^ＰＯＳＭＡＣＳ精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－０５０－２０１）自己単球と共に、試験ＩｇＧを含む又は含まない１０％ＡＢ＋ＨＳを用いてＩＭＤＭ中で、５：１のＥ：Ｔ比にて、共培養した。５日後、増殖しているＴ細胞の分画を、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥ^ＬＯＷＴ細胞として視覚化した。

【0185】

サイトカイン分析
培養上清中のＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）プラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＨＣ０００１）を使用して測定した。

【0186】

健康なドナーの骨髄細胞を用いた細胞傷害アッセイ
ＣＤ３^ＰＯＳＴ細胞及びＣＤ３４^ＰＯＳ細胞を、ＭＡＣＳ（それぞれ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－０４６－７０２及び１３０－０５０－１０１）を使用したポジティブ選択により、健康なドナーの骨髄単核細胞（整形外科患者から入手又はＬｏｎｚａ，２Ｍ－１２５Ｃから購入）から単離した。１０％ＨＳ Ａ＋（Ｓａｎｑｕｉｎ血液バンク）及び３０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））を補充したＩＭＤＭにおいて、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５５３２９）及び抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５５７２５）でプレコートされたプレートで、精製Ｔ細胞を６日間活性化することにより、前活性化Ｔ細胞を生成し、続いて３０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有するプレートに一晩静置した。翌日、前活性化Ｔ細胞を、自己ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞と共に、１０：１のＥ：Ｔ比にて、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の存在下又は対照条件での９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，３７９９）中の１０％Ａ＋ＨＳを補充したＩＭＤＭにおいて、共培養した。１６時間後、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を、以下に説明するように、様々なＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞集団及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのフローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリーによる定量化には、フローカウント蛍光球（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，７５４７０５３）を使用した。ゲーティングストラテジーについては、図１０及び１１を参照されたい。

【0187】

コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
赤血球及び単骨髄球コロニーの成長を分析するためのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ Ｈ８４４３５（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８４４３５）、並びに巨核球コロニーの形成を分析するためのＭｅｇａＣｕｌｔ（商標）－Ｃ（サイトカイン（０４９７１）と、ヒト低密度リポタンパク質（４０μｇ／ｍＬ、０２６９８）が添加された完全キット、両方ともＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）中で、製造元の指示に従って洗浄した際、Ｔ細胞及びＣＤ３４^ＰＯＳ細胞の共培養物を接種した。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ及びＭｅｇａＣｕｌｔ（商標）－Ｃアッセイの両方で、非ＩｇＧ条件でのＣＤ３４^ＰＯＳ細胞数に基づいて、２つの異なる濃度で共培養物を接種し、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６と対照ＩｇＧとで処理した共培養物の、等量の細胞を接種した。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔアッセイでは、非ＩｇＧ条件の１×１０^３及び５×１０^２ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞を、３５ｍｍ培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，４３０１６５）に３回接種し、ＭｅｇａＣｕｌｔ－Ｃアッセイでは、ダブルチャンバ培養スライドと条件毎に準備された２つのスライドのチャンバ毎に、７．５×１０^３及び２．５×１０^３ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞を接種した。赤血球、単骨髄球及び巨核球のコロニー数を１３～１５日間の培養後に記録し、続いてＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培養物を採取し、フローサイトメトリーで単球及び骨髄球のマーカーを分析した。

【0188】

初代ＡＭＬサンプルを用いた細胞傷害アッセイ
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６又は対照二重特異性ＩｇＧの存在下で、１０％ＡＢ＋ＨＳ、２．５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、１２．５ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ）、６．２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ，１１３４００３５）、３．０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、及び２．５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌを含有するＩＭＤＭで、初代ＡＭＬ患者サンプル（５×１０^５細胞）を培養した。２４時間後、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－０９５－７６６）を培養物に添加した。１０日後、ＡＭＬ芽球溶解とＴ細胞増殖をフローサイトメトリーで定量した。

【0189】

ヒトＡＭＬ患者における抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６投与レジメン。
ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６抗体は、３～６人の患者のコホートで用量漸増を用いて、第１のヒト試験において単一の薬剤として検討される。有効かつ安全な用量を提供するように設計された投与レジメンで抗体を患者に投与した。抗体を、２～４時間の注入で投与した。治療を時間間隔で計画した。投与レジメンを、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の重症度と発生率を予防及び最小化するように設計した。

【0190】

治療レジメンには、第１のサイクル（最初の２８日間）に適用される構成要素がある。プライミング用量（Ｃ１Ｄ１）；ステップアップ及び固定全用量（Ｃ１Ｄ４、Ｃ１Ｄ８、Ｃ１Ｄ１５）、並びに予備薬剤の使用。プライミング用量：第１の投与（Ｃ１Ｄ１）は低用量（１ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ）で投与される。ステップアップ用量：Ｃ１Ｄ１後の後続の用量は、計画された全用量が投与されるまで、用量を段階的に増やして投与される。ステップアップ用量には、第１の週の間により頻繁な投与が含まれる。第１の週では、治療は３日に１回行われ（Ｄ１－Ｄ４－Ｄ８）、その後治療は７日に１回（１週間に１回）行われる。固定全用量：全用量は１５日目に投与され、そこから治療は固定全用量で投与される。予備薬剤：各ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６抗体投与の前に投与されるものには、アセトアミノフェン及び抗ヒスタミン薬（抗Ｈ１）が含まれる。

【0191】

第１のサイクルの後、治療は、１週間に１回のレジメン（１－８－１５－２２日目）で投与される全用量で継続する。注入は、常に予備薬剤を用いて２～４時間で投与される。

【0192】

１つのコホートでは、１日目に１ｍｇのプライミング用量を投与し、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、及び１５日目に２５ｍｇの全用量を患者に投与した。

【0193】

別のコホートでは、１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、及び１５日目に４０ｍｇの全用量を患者に投与した。

【0194】

更なるコホートでは、１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、及び１５日目に６０ｍｇの全用量を患者に投与した。

【0195】

各投与前、及び注入終了後４時間及び２４時間のサイトカインレベルの分析を含め、治療に対する患者の反応を追跡した。

【0196】

結果
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常な造血区画内のＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ及びＣＤ３^ＰＯＳ細胞に特異的に結合する。
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＡＭＬに存在するものなど、ＣＬＥＣ１２ａ陽性癌細胞を治療するために開発されたＴ細胞標的二重特異性抗体である。それは、Ｔ細胞上のＣＤ３とＡＭＬ芽球及びＬＳＣ上のＣＬＥＣ１２Ａとに結合する。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、共通軽鎖（ｃＬＣ）二重特異性ＩｇＧフォーマットに基づくヒト全長ＩｇＧ１二重特異性抗体である。腫瘍細胞株を使用したフローサイトメトリーは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６がＣＬＥＣ１２Ａ及びＣＤ３に特異的に結合することを示した（図１Ａ）。それは、そのＣＬＥＣ１２Ａアームを介して、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞、並びにヒトＣＬＥＣ１２ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合したが、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞には結合しなかった。それは、そのＣＤ３アームを介して、ＣＤ３^ＰＯＳＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞に結合したが、ＣＤ３ＮＥＧＪｕｒｋａｔ Ｊ．ＲＴ－Ｔ３．５細胞には結合しなかった。その標的タンパク質に対する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の親和性は、組換えタンパク質を使用した表面プラズモン共鳴技術によって判定されたように、ＣＬＥＣ１２Ａについては３ｎＭ、ＣＤ３については１７７ｎＭであった。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の操作されたＦｃ領域が薬物動態（ＰＫ）に潜在的な影響を与えるかどうかを調査するために、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで測定し、２２６時間（９．４日）であることが見出された。この半減期は、げっ歯類におけるヒトＩｇＧ１抗体で典型的に観察されるｉｎ ｖｉｖｏ半減期の範囲内であり、ヒトｃＬＣ二重特異性抗体の特異的設計がＩｇＧの非特異的除去経路に影響を与えないことを示している。正常な末梢血における抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の結合プロファイルの分析は、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６がＣＤ３発現ＣＤ４^ＰＯＳ及びＣＤ８^ＰＯＳＴ細胞、並びにＣＤ３^ＰＯＳＣＤ５６^ＰＯＳＮＫ Ｔ（ＮＫＴ）細胞に結合することを示した（図１Ｂ）。以前に報告されたＣＬＥＣ１２Ａの発現プロファイル（Ｂａｋｋｅｒ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｄｅｎｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｗｉｌｌｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｌａｈｏｕｄ，Ｐｒｏｉｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．２００９）に従って、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、単球、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、及び顆粒球にも結合したが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＢ細胞には結合しなかった（図１Ｂ、データは示されていない）。正常な骨髄では、ＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞区画内の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の結合プロファイル（図１Ｃ）も、報告されているＣＬＥＣ１２Ａ発現プロファイル（ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７）に類似していた。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、顆粒球－マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）細胞に均一に結合したのに対して、共通骨髄性前駆細胞（ＣＭＰ）及び巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）サブセットのごく一部にしか結合しなかった。特に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の結合は、ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ区画内で観察されず、これは、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）及び多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。

【0197】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＬＥＣ１２Ａ特異的Ｔ細胞活性化及びＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する。
次に、細胞傷害アッセイにおいて、ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性ＩｇＧ抗体が、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的Ｔ細胞活性化及びＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ標的細胞の溶解を誘導する能力を測定した。エフェクター細胞は健康なドナー由来の休止Ｔ細胞であり、標的細胞はＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞であった。このアッセイでは、野生型（ＷＴ）Ｆｃ領域（完全なＦｃエフェクター機能）を持つＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６二重特異性抗体を、ＷＴＦｃ領域でフォーマットされたＭｏｃｋｘＣＤ３対照ＩｇＧと比較した。ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６二重特異性抗体は、２４時間後及び４８時間後にＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞上でＣＤ６９（図２Ａ）及びＣＤ２５（データは示さず）のアップレギュレーションを誘導した。ＨＬ６０細胞のＴ細胞媒介性溶解は、２４時間後に既に明らかであり、９５％超のＨＬ６０細胞の細胞傷害が、４８時間後に測定された（図２Ｂ）。標的細胞の溶解は、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）と相関し、Ｅ：Ｔ比が５：１以上で最大溶解が見られる（図９）。特に、ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３誘導性の溶解活性は、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原媒介性のものであった（図２Ａ、図２Ｂ）；後の時点でのみ、一部のＴ細胞活性化及びＨＬ６０標的細胞溶解が、ＭｏｃｋｘＣＤ３対照について観察された。それにもかかわらず、このことにより、ＷＴＦｃを用いた二重特異性ＩｇＧフォーマットが、ＣＬＥＣ１２Ａ結合を必要とせずにＦｃγ受容体媒介性Ｔ細胞活性化を誘導できることが明らかになった（図２Ａ及び図２Ｂ、７２時間）。

【0198】

サイレンシングされたＦｃエフェクター機能を有する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＡＭＬ細胞株の特異的溶解を誘導する。
二重特異性抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が非特異的Ｆｃγ受容体媒介性の細胞溶解を誘導するのを防ぐために、両方のＩｇＧ１重鎖のＣＨ２領域に変化を導入することにより、Ｆｃエフェクター機能を欠く二重特異性ＩｇＧフォーマットを生成した。Ｆｃエフェクター機能を軽減する様々な手段が、当技術分野で知られている。ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣ１ｑへの結合、並びに２００倍超まで減少したＣＤ６４への結合を、ＣＨ２ドメインの残基を修飾するＦｃ操作を介して達成した。正常な休止Ｔ細胞及びＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞を使用した細胞傷害アッセイでは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞でＣＤ６９（図２Ｃ）及びＣＤ２５（図２Ｄ）のアップレギュレーションを誘導した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性活性の最も感度の高い読み取り値は、４４ｎｇ／ｍＬの平均半値最大有効濃度（ＥＣ_５０）を有するＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションであった（表Ｉ）。更に重要なことに、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で８０％超の溶解、６８ｎｇ／ｍＬの平均ＥＣ_５０を有する、ＨＬ６０細胞のＴ細胞媒介性溶解を誘導した（図２Ｅ、表Ｉ）。野生型Ｆｃエフェクター機能を有するＭｏｃｋｘＣＤ３抗体によるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化は、２日目に既に見られたが（図２Ａ、１０００ｎｇ／ｍＬ）、４８時間後にＦｃγ受容体サイレンシングＭｏｃｋｘＣＤ３抗体ではＴ細胞活性化は観察されず、更に８０００ｎｇ／ｍＬであっても観察されなかった（図２Ｃ～図２Ｄ）。まとめると、これは、Ｆｃγ受容体サイレンシング抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６（図２Ｃ～図２Ｅ）によって誘導されるＴ細胞の細胞傷害が、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原特異的であることを示している。まとめると、これらのデータは、Ｆｃエフェクター機能が低下した抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＬＥＣ１２Ａ特異的Ｔ細胞活性化を媒介し、これらのＴ細胞を効果的にリダイレクトして、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＨＬ６０細胞の溶解を誘導する能力を実証する。

【0199】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞による、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ単球の特異的溶解を誘導する。
抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、休止自己Ｔ細胞によりＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ単球のリダイレクトされた溶解を誘導する能力を、ＰＢＭＣ培養物中で求めた。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化（図３Ａ）、及び単球の溶解（１００ｎｇ／ｍＬから、図３Ｂ）を誘導した。重要なことに、ＭｏｃｋｘＣＤ３対照は、１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で観察可能なＴ細胞活性化又は単球溶解を誘導しなかったため、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性活性はＣＬＥＣ１２Ａ特異的であった（図３Ａ～図Ｂ）。更に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で活性化された細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、試験された最も高い抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６濃度であっても、Ｂ細胞及びＮＫ細胞分画に影響を与えなかったため、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原発現細胞に対して選択的であった（図３Ｃ、データは示されていない）。

【0200】

これらのデータは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、自己Ｔ細胞のリダイレクト及び活性化を介して、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ単球のＣＬＥＣ１２Ａ制限リダイレクト溶解を効率的に誘導できることを実証する。

【0201】

サイトカイン放出及びＴ細胞増殖のＣＬＥＣ１２Ａ特異的誘導。
次に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、Ｔ細胞増殖を誘導する能力を、単球と自己休止Ｔ細胞との共インキュベーションで試験した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、１００及び１，０００ｎｇ／ｍＬでＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方のＣＬＥＣ１２Ａ特異的増殖を効率的に誘導した（図３Ｄ）。５日間の共培養後、ＭｏｃｋｘＣＤ３対照は、Ｔ細胞増殖を全く誘導せず、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の機能が、ＣＬＥＣ１２Ａ特異的であることをもう一度証明した。次に、１，０００ｎｇ／ｍＬで抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６に４８時間曝露した後、これらのＰＢＭＣ培養物中でサイトカインのレベルを測定した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０の放出を１０～２００ｐｇ／ｍＬの範囲で、ＩＬ－８の放出を１０，０００～３０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲で誘導した（図３Ｅ）。概して、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性サイトカインレベルは、抗ＣＤ３二価単一特異性抗体による刺激後に得られたものよりも低かった。ＭｏｃｋｘＣＤ３対照の存在下でのサイトカイン放出が、存在しない又は制限されていたため、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性サイトカイン放出は、ＣＬＥＣ１２Ａ特異的であった。これらのデータは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ単球との共インキュベーション時に、自己Ｔ細胞を誘導してサイトカインを増殖及び放出できることを実証する。

【0202】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性の正常なＣＤ３４＋細胞の標的化は、赤血球と巨核球の分化を温存し、単骨髄球系を発達させる潜在力を保持する。
ＣＬＥＣ１２Ａは、正常なＣＤ３４^ＰＯＳ区画内の単骨髄性前駆細胞区画で発現するため、正常な造血に対する抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を評価することを目的とした。この目的のために、健康なドナーの骨髄由来ＣＤ３４^ＰＯＳ細胞及び前活性化自己Ｔ細胞を用いた細胞傷害アッセイを実施した。前活性化Ｔ細胞を使用して、アッセイの結果に対するＣＤ３４^ＰＯＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の影響を最小限に抑える、短い１６時間の細胞傷害アッセイウィンドウを得た。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＣＤ３４^ＰＯＳ細胞の８６％超を特異的に溶解し、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧＣＤ１０^ＰＯＳ又はＣＤ１０^ＮＥＧ細胞分画は、影響を受けないことが観察された（図４Ａ）。様々なＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞分画の詳細な分析により、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するＧＭＰを標的とすることが明らかになった（３倍減少、図４Ｂ）。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＭＰ及びＭＥＰ）を部分的に発現する細胞分画にも、ＣＬＥＣ１２Ａ陰性のＨＳＣ、ＭＰＰ、及び共通リンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）にも有意な影響を与えなかった。興味深いことに、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＤ１２３^ＰＯＳ細胞の分画のみを溶解し、これは、ＣＤ１２３^ＰＯＳＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧ細胞の大きなサブセットが、ＣＭＰを含むサブセットである抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を受けないことを示している（図４Ｃ）。

【0203】

次に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性のリダイレクト溶解時に、正常なＣＤ３４^ＰＯＳ細胞分画が、単球、顆粒球、赤血球、巨核球を生じさせる能力を、ＣＦＵアッセイを使用して機能レベルで評価した。骨髄ＣＤ３４^ＰＯＳ造血前駆細胞からの赤血球（ＢＦＵ－Ｅ；バースト形成単位－赤血球）又は巨核球（ＣＦＵ－Ｍｋ；コロニー形成単位－巨核球）コロニーの成長は、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を受けなかった（図４Ｄ）。特に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性のリダイレクト溶解が、ＧＭＰの大幅な減少を引き起こしたにもかかわらず、顆粒球マクロファージコロニー（ＣＦＵ－ＧＭ）の成長における２４％のわずかな減少のみが機能レベルで観察された。興味深いことに、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の影響を受けないＧＭ前駆細胞は、ＣＦＵ－ＧＭコロニーのフローサイトメトリー分析によって測定されるように、ＣＤ１４^ＰＯＳＣＤ３６^ＰＯＳＣＤ３３^ＰＯＳ単球細胞とＣＤ１５^ＰＯＳＣＤ３３^ＰＯＳ骨髄球細胞の両方を発達させる能力を保持していた（図４Ｅ）。

【0204】

これらのデータを総合すると、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が赤血球巨核球の発達に影響を与えないことが示されている。更に、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞を効率的に根絶する一方で、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６治療により、顆粒球及び単球の発達能が保持される。

【0205】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、自己Ｔ細胞による初代ＡＭＬ芽球のリダイレクト溶解を誘導する。
次に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＡＭＬ患者由来のＴ細胞を誘導してＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ標的細胞を溶解する能力を測定した。形態学的臨床寛解期のＡＭＬ患者のＴ細胞区画は、ナイーブ、セントラルメモリー（ＣＭ）、エフェクターメモリー（ＥＭ）、及び再獲得ＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ＋）を伴うエフェクターメモリー細胞の正常な組成を示した（図１２Ａ、図１２Ｂ及び表ＩＩＩ、患者１～６）。ＡＭＬ患者Ｔ細胞が、ＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ標的細胞の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６細胞傷害を媒介する能力を分析することにより、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６媒介性のＴ細胞活性化及びＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ細胞の溶解を誘導するＡＭＬ患者由来Ｔ細胞の能力と、健康なドナー由来Ｔ細胞の能力との間に差がないことを明らかになった（図１２Ｃ～図１２Ｅ）。

【0206】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、後の時点で同じＡＭＬ患者から収集した休止自己Ｔ細胞により初代ＡＭＬ芽球のＣＬＥＣ１２Ａ特異的溶解を誘導する能力を測定した（図５Ａ、表ＩＩＩに記載の患者、患者７～９）。診断時に得られた初代ＡＭＬ芽球サンプルは、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する芽球の高い割合（８０％超）を含有していた（図５Ｂ）。ＡＭＬ芽球を、臨床的寛解中に得られた自己休止Ｔ細胞と、５：１のＥ：Ｔ比にて４８時間共培養した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の強力なＣＬＥＣ１２Ａ特異的活性化、並びに７０％超のＡＭＬ芽球溶解を誘導した（図５Ｃ～図５Ｅ）。これらのデータは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、自己Ｔ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ初代ＡＭＬ芽球の溶解を効率的に誘導できることを明らかにしている。

【0207】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、低いＥ：Ｔ比を有する診断サンプルにおける初代ＡＭＬ芽球の溶解をリダイレクトする。
次に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、診断時に収集された初代ＡＭＬサンプル中の自己Ｔ細胞によるＡＭＬ芽球の溶解を誘導する能力を測定した。試験した初代ＡＭＬサンプル（表ＩＩＩに列挙、患者１０～１９）では、Ｔ細胞の数は、ＡＭＬ芽球の数と比較して相対的に少なく、有効なＥ：Ｔ比（１：３～１：９７、表ＩＩ）が低くなった。ＦＡＣＳ分析により、ＣＬＥＣ１２Ａ発現に関して患者の不均一性が明らかになった（表ＩＩ）。初代ＡＭＬサンプルをサイトカインカクテルの存在下で１０日間培養し、アッセイ中のＡＭＬ芽球及びＴ細胞の生存をサポートした。培養の１０日後、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の非存在下でのＡＭＬ芽球回復の中央値は、４１～１５９１％であった。培養開始時に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６及びＭｏｃｋｘＣＤ３対照ＩｇＧを、一度に添加した。Ｔ細胞増殖及びＡＭＬ芽球溶解を、７日目及び１０日目にフローサイトメトリーによって定量化した。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＣＬＥＣ１２Ａ媒介性Ｔ細胞増殖（増殖倍率の範囲６～１５７）を効率的に誘導しただけでなく、７日目及び１０日目にＡＭＬ芽球溶解も誘導した（図６）。１０日目に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、１０／１１の患者サンプルでＡＭＬ芽球溶解を効率的に誘導した（２３～９８％）。ＭｏｃｋｘＣＤ３対照抗体も一部のサンプルで腫瘍細胞の数を低減したが、それらのサンプルでは、Ｔ細胞活性化のレベルは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で観察されたものよりもはるかに低かった（抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６対ＭｏｃｋｘＣＤ３に基づいて中央値４８対２倍のＴ細胞増殖）。特に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、エフェクター対標的比が非常に低いＡＭＬサンプルであっても活性があった（図６及び表ＩＩ）。芽球溶解が観察されなかった１つのＡＭＬサンプル（患者１６）の場合、Ｔ細胞増殖のレベルも、１０の抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６応答性サンプルで観察された中央値４８倍のＴ細胞増殖と比較して、わずか１５倍であった。結論として、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＡＭＬ患者の骨髄サンプルに存在するＴ細胞によるＡＭＬ芽球のＣＬＥＣ１２Ａ媒介性溶解を、非常に低いＥ：Ｔ比であっても、効率的に誘導し、活発なＴ細胞増殖も引き起こした。

【0208】

ヒトＡＭＬ患者における抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６投与レジメンは、サイトカインレベルの軽減につながる。
患者のサイトカインレベルは、抗体ＭＦ４３７ｘＭＦ５１９６による治療の際に測定された。

【0209】

図１４は、１日目に１ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に３ｍｇ及び８日目に１５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に２５ｍｇの全用量を投与した患者から得られたデータを示している。

【0210】

図１５は、１日目に３ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１０ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に４０ｍｇの全用量を投与した患者から得られたデータを示している。

【0211】

図１６は、１日目に５ｍｇのプライミング用量、続いて４日目に１５ｍｇ及び８日目に２５ｍｇのステップアップ用量、そして１５日目に６０ｍｇの全用量を投与した患者から得られたデータを示している。

【0212】

全体として、データは、選択された患者において、プライミング用量及びステップ用量用量の投与が、全用量が投与されたときのサイトカイン放出を軽減することを示している。様々なコホートの特定の患者では、プライミング、ステップアップ、及び全用量を通じて、限られたサイトカイン放出が観察された（データは示されていない）。

【0213】

議論
実施例で言及される抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、全長抗体である。ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃエフェクターサイレンシングバージョンは、ＡＭＬ芽球及び白血病幹細胞（ＬＳＣ）上でＣＬＥＣ１２Ａを標的とすることにより、ＡＭＬの全てのサブタイプを治療できることが示されている。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、Ｔ細胞を効率的に活性化及びリダイレクトして、ＡＭＬ細胞などのＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞を溶解する強力な二重特異性抗体である。１０／１１の初代ＡＭＬ患者サンプルにおいて、このＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３Ｔ細胞エンゲージャーは、常在の自己Ｔ細胞をリダイレクトすることにより、ＣＬＥＣ１２Ａ媒介性のＡＭＬ芽球の溶解を効率的に誘導した。このｅｘ ｖｉｖｏサイトカインサポートシステムでは、ＡＭＬサンプルを抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の存在下で７～１０日間培養した。このアッセイは、２つの方法で抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の有効性を確証する。すなわち、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、これらのサンプルでＡＭＬ患者Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を有していることを明らかにし、それらの抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６リダイレクトＴ細胞が、細胞溶解を介してＡＭＬ芽球に細胞溶解活性をリダイレクトできることを示す。（表ＩＩに示されている）。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、低い初期Ｅ：Ｔ比（１：４５～１：９７）又は比較的低レベルのＣＬＥＣ１２Ａ発現を有するＡＭＬサンプルであっても、有意なＴ細胞増殖及び芽球溶解を誘導することができた。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおける抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６対ＭｏｃｋｘＣＤ３の条件の比較により、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性活性が、ＣＬＥＣ１２Ａ抗原媒介性のものであることが明らかになり；９／１０の初代ＡＭＬサンプルにおけるＭｏｃｋｘＣＤ３の最小活性と比較して、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の活発なＴ細胞増殖及びＡＭＬ芽球溶解が観察された。ＡＭＬ芽球溶解及び活発な抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性Ｔ細胞増殖の両方を欠いた１つの非応答性サンプル（患者１６）は、重篤なＴ細胞機能不全を有している可能性が高い。

【0214】

健康なドナーＴ細胞を多くの初期実験で使用したが、細胞傷害アッセイはまた、ＡＭＬ患者由来Ｔ細胞を使用して実行され、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が疾患設定でＴ細胞をリダイレクトする能力を試験した。免疫シナプス形成の障害及びＴ細胞共刺激能の低下など、ＡＭＬＴ細胞について特定の欠陥が報告されている（Ｗｅｎｄｅｌｂｏ，Ｎｅｓｔｈｕｓ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｌｅ Ｄｉｅｕ，Ｔａｕｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。ここでは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、健康なドナー由来Ｔ細胞をリダイレクトしてＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ腫瘍細胞のＣＬＥＣ１２Ａ特異的溶解を誘導するのと同じ程に効率的に、形態学的臨床寛解（ｎ＝６）で得られたＡＭＬ患者由来Ｔ細胞をリダイレクトできることが示されている。更に、１０／１１のＡＭＬサンプルでは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、初代ｄｅ ｎｏｖｏ ＡＭＬサンプルの自己Ｔ細胞を効果的にリダイレクトしてＡＭＬ芽球を溶解できることが見出された。ここでは、ＡＭＬ患者由来Ｔ細胞が、全長ＩｇＧ ＣＤ３エンゲージ二重特異性ＩｇＧによって機能的に活性化され得、これにより、ＨＳＣ温存法及び低Ｅ：Ｔ比にて、Ｔ細胞活性化及び増殖をもたらすことが実証されている。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６を介した自己Ｔ細胞のこのような機能的活性化は、エフェクターＴ細胞区画を効果的に拡大し、したがって、患者のＡＭＬ芽球及びＬＳＣの効率的な根絶に対する、より有利なＥ：Ｔ比を促進する。

【0215】

正常な骨髄では、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の結合は、骨髄区画に限定される。これは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、ＣＬＥＣ１２Ａ特異的標的化により、骨髄の他の領域を温存することが可能であるためである。ここでは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６が、骨髄内のＧＭＰ細胞に均一に結合するのに対し、ＣＭＰ及びＭＥＰサブセットのごく一部の分画にしか結合しないことが示されている。更に重要なことに、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、多能性ＨＳＣを含むＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ区画に結合しない。ＣＭＰ及びＭＥＰ分画での微量のＣＬＥＣ１２Ａ発現と同様に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏＣＦＵアッセイで赤血球又は巨核球系の発達に影響を与えないことが示されている。更に、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイでＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳＧＭＰ細胞の数を低減したが、追跡調査のＣＦＵアッセイでは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６治療時に、残りのＣＤ３４^ＰＯＳ骨髄細胞により、単球及び骨髄球系の両方を生じさせることができたことが観察され、このことは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の治療によって観察可能な影響を受けないＨＳＣ及びＭＰＰを含むＣＤ３４^ＰＯＳＣＬＥＣ１２Ａ^ＮＥＧ前駆細胞から生じる単骨髄球成長を可能にする（ｖａｎ Ｒｈｅｎｅｎ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｏｔｔａ，Ｚａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｂｉｌｌ，ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ Ｎｉｅｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

【0216】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６を患者に投与した後の血液毒性は、好中球減少症及び単球数の減少に限定される得ることが予想される。本結果は、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６リダイレクト溶解時に、好中球及び単球が、残りのＣＤ３４^ＰＯＳ細胞から宿主に再集団化できることを実証している。抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６による治療後の造血細胞が再集団化する潜在力は、ＣＤ３３又はＣＤ１２３を標的とする治療の可能性の高い状況と対照的である（Ａｉｇｎｅｒ，Ｆｅｕｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ａｌ－Ｈｕｓｓａｉｎｉ，Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．２０１６）。ＣＬＥＣ１２Ａと比較して、ＣＤ３３及びＣＤ１２３は、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及び多能性ＨＳＣを含む正常なＣＤ３４^ＰＯＳ前駆細胞でより広く発現している（Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．２００５）。本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化が、ＣＤ１２３ダイレクト療法の標的である正常なＣＤ１２３^ＰＯＳＣＭＰを温存することを示している。ヒト化マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形質導入Ｔ細胞を標的とするＣＤ３３及びＣＤ１２３が、ＣＤ３４^ＰＯＳＣＤ３８^ＮＥＧ幹細胞分画で溶解を誘導することが示されている（Ｐｉｚｚｉｔｏｌａ，Ａｎｊｏｓ－Ａｆｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ，Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１５）。結果として、ＣＤ３３及びＣＤ１２３を標的とする療法について、血液毒性の懸念が提起されてきた。すなわち、これらの療法は、正常な造血区画の効率的な再開を妨げるＨＳＣ根絶のリスクに加えて、血小板減少症、好中球減少症、及び貧血を誘導する可能性がある。

【0217】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ受容体への結合に影響を与えることなく、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合を防ぐように修飾されている。単球アッセイの結果は、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６誘導性のＴ細胞活性化及び関連するサイトカイン放出が、ＣＬＥＣ１２Ａ発現細胞に限定されていることを実際に示した。Ｆｃサイレンシングは、ＣＤ３^ＰＯＳ及び／又はＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ細胞の典型的な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＣ１ｑ媒介性の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を抑える。本データは、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６で活性化されたＴ細胞がＣＬＥＣ１２Ａ^ＰＯＳ細胞を選択的に溶解することを示している（例えば、Ｂ細胞及びＮＫ細胞はＰＢＭＣ培養では影響を受けなかった）。

【0218】

マウスでの試験により、全長ＩｇＧ１である抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の、正常なＦｃＲｎ媒介性のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、９～１０日であることが確認された。これは、他のＴ細胞エンゲージャーの概念とは異なり、患者における抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６の効果的な全身レベルが、１週間に１回の静脈内投与によって達成できることを意味する。

【0219】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、正常なＨＳＣを温存しながら、骨髄芽球を選択的に標的とする。残存ＬＳＣを根絶する潜在力に基づいて、抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６は、ＡＭＬにおける最小残存疾患（ＭＲＤ）の管理のために考慮されている。

【0220】

実施例２
骨髄増殖性腫瘍芽球期（ＭＰＮ－ＢＰ）の患者からのＣＬＥＣ１２Ａ陰性及びＣＬＥＣ１２Ａ陽性のＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞の試験。

【0221】

ＭＰＮ－ＢＰ患者の骨髄から細胞を採取した。前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＬＥＣ１２Ａの発現に基づいて、ＣＤ３４＋細胞を選別した。低ＳＳＣを有し、ＣＤ４５^ｄｉｍ、ＣＤ３４^＋、ＣＤ３８^－であった細胞を、ＣＬＥＣ１２Ａ発現に基づいて２つの分画に選別した。ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＥＰＯ、Ｇ－ＣＳＦ、及びＧＭ－ＣＳＦを補充したＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４４３５ Ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を平板培養し、１２～１４日間インキュベートした。コロニーを採取し、ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＥＰＯ、Ｇ－ＣＳＦ、及びＧＭ－ＣＳＦを補充したＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４４３５ Ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再平板培養し、１２～１４日間再インキュベートした。１回目の平板培養の結果、ＣＬＥＣ１２Ａ陰性分画は、１５００個の平板培養された細胞当たり、２０個の大きなコロニー（４０細胞以上）及び１０個の小さなコロニー（コロニー１個当たり４０細胞未満）を有していた。ＣＬＥＣ１２Ａ陽性分画は、１５００個の平板培養された細胞当たり、大きなコロニーを有しておらず、３２個の小さなコロニーを有していた。ＣＬＥＣ１２Ａ陰性分画のプレートのコロニーは、再平板培養実験で二次コロニーを生成できず、１５００個の接種された細胞当たり、大きなコロニー又は小さなコロニーはゼロであった。一方、ＣＬＥＣ１２Ａの１回目の平板培養からの細胞を再平板培養すると、１５００個の細胞当たり４４個の小さなコロニーが生じ、これらの約８０％がＪＡＫ２ドライバー変異に陽性であった（図１３を参照されたい。）

【0222】

まとめ
ＭＰＮ－ＢＰ患者からのＣＤ３４^ｐｏｓＣＤ３８－ＣＬＥＣ１２Ａ－細胞は、主にＣＦＵ－ＧＭである初代培養でのみ造血コロニー（ＣＦＵ－ＧＭ）を生成することができる。対照的に、ＣＬＥＣ１２Ａを発現しているＭＰＮ－ＰＢ患者のＣＤ３４－ＣＤ３８－幹細胞は、連続的に再平板培養され得る芽球コロニーを生成することができるため、白血病開始能を含む。

【0223】

差次的ＣＬＥＣ１２Ａ発現は、ＭＰＮ－ＢＰの患者から白血病開始細胞（ＬＩＣ）を同定、根絶、及び／又は単離するために使用できる。本明細書に開示されるＣＤ３－ＣＬＥＣ１２Ａ二重特異性抗体を使用して、ＭＰＮ－ＰＢ中のこれらのＬＩＣを根絶し、ＭＰＮ芽球期細胞の数を低減し、それによってＭＰＮ－ＢＰ患者の疾患を緩和することができる

【0224】

引用技術
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【0225】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0226】

【表2】

【0227】

抗体ＭＦ４３２７ｘＭＦ５１９６ＥＣ_５０値を、ＨＬ６０細胞傷害アッセイにおいて求めた。データは６人の健康なドナーからのものである。

【0228】

【表3】

【0229】

【表4-1】

【表4-2】

【0230】

【表5】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【配列表】

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