特開 2024-145959 降圧効果のあるイナゴマメ多糖類及びその製造方法並び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024145959

(43)【公開日】2024-10-15

(54)【発明の名称】降圧効果のあるイナゴマメ多糖類及びその製造方法並び使用

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20241004BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20241004BHJP

   A61K 31/715 20060101ALI20241004BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20241004BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20241004BHJP

   A23L 29/238 20160101ALI20241004BHJP

【ＦＩ】

C08B37/00

A61K36/48

A61K31/715

A61P9/12

A23L33/10

A23L29/238

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023058590

(22)【出願日】2023-03-31

(11)【特許番号】

(45)【特許公報発行日】2024-05-08

(71)【出願人】

【識別番号】523118886

【氏名又は名称】ナガヨシ製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】オウ・コウトウ

(72)【発明者】

【氏名】リュウ・キンキン

(72)【発明者】

【氏名】有賀 庸介

(72)【発明者】

【氏名】ジェームス・ウエイ

(72)【発明者】

【氏名】カン・ビカ

(72)【発明者】

【氏名】カン・ケンエイ

【テーマコード（参考）】

4B018

4B041

4C086

4C088

4C090

【Ｆターム（参考）】

4B018MD37

4B018ME04

4B018MF01

4B041LC10

4B041LD01

4B041LH07

4B041LK24

4B041LP03

4B041LP05

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA20

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA52

4C086MA55

4C086NA14

4C086ZA42

4C088AB59

4C088AC04

4C088BA08

4C088CA03

4C088CA12

4C088CA14

4C088MA52

4C088MA55

4C088NA14

4C088ZA42

4C090AA01

4C090BA61

4C090BB10

4C090BB12

4C090BB13

4C090BB15

4C090BB52

4C090BC11

4C090CA11

4C090CA13

4C090CA19

4C090DA23

4C090DA27

(57)【要約】

【課題】本発明は、降圧効果のあるイナゴマメ多糖類及びその製造方法並び使用に関するものである。
【解決手段】フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなり、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであるイナゴマメ多糖類。当該イナゴマメ多糖類は、少なくとも血圧を下げる作用を有する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなるイナゴマメ多糖類であって、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであることを特徴とするイナゴマメ多糖類。

【請求項2】

前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７であることを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項3】

前記イナゴマメ多糖類の分子量分布範囲が１０^４～１０^６であり、前記イナゴマメ多糖類の分子量が（４．６～５．０）×１０^６であってもよく、さらに、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量が４．８１１×１０^６であってもよく、及び／又は、
前記イナゴマメ多糖類の分子量分布の幅（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．４～１．６であり、１．５１９であってもよいことを特徴とする請求項１又は２に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項4】

粉砕された種抜きのイナゴマメの莢を取り、９０％～９５％のエタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かすこと、水を添加して抽出すること、抽出液を遠心分離させ、上清液を濃縮させ、エタノールの質量パーセント濃度が３５～４５％となるようにエタノールを添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集すること、及び得られた沈殿物を水で分散させ、Ｓｅｖａｇｅ法により除タンパクを行った後、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水で溶出させ、移動相組成を収集し、ＤＥＡＥ－５２セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液で溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一な溶出ピークを持つものを合併し、減圧して濃縮させ、冷凍乾燥させてイナゴマメ多糖類を得ることを含むことを特徴とするイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項5】

前記イナゴマメの莢を８０～３００メッシュとなるように粉砕し、及び／又は、
抽出時の固液比がｇ／ｍＬとして１：（２～５）であり、及び／又は、
抽出温度が４０～５０℃であることを特徴とする請求項４に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項6】

請求項４又は５に記載の方法から製造されたものであることを特徴とするイナゴマメ多糖類。

【請求項7】

請求項１～３、６のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類の医薬品としての使用であって、
血圧降下薬を製造するための前記イナゴマメ多糖類の使用であってもよい、前記使用。

【請求項8】

請求項１～３、６のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに薬学上許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項9】

請求項１～３、６のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに食品主原料および食品副原料を含むことを特徴とする食品。

【請求項10】

需要のある被験者又は患者に、経口又は非経口経路により請求項１～３、６のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類、請求項８に記載の医薬組成物、又は請求項９に記載の食品を有効量で投与することを含み、
前記疾患は高血圧を含んでもよいことを特徴とする疾患の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬分野に関するものであり、具体的には、降圧効果のあるイナゴマメ多糖類及びその製造方法並び使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

イナゴマメは、地中海東部が原産地であり、現在は中国国内に人工的に導入されて栽培されており、非常に高い栄養価値及び薬用価値を持っている。イナゴマメの果実は、容易に得られ、生産量が高くて安価であり、その莢には多種の天然多糖類、ビタミン、ミネラル等の栄養素が含まれている。

【0003】

高血圧は、よく見られる慢性疾患の一つであり、冠動脈アテローム性動脈硬化症、脳卒中等の多種の心・脳血管疾患のリスクファクターでもある。近年では、高血圧の罹患率が増加し続け、発病年齢が徐々に低くなる傾向があるが、治療率や制御率は低く、主要な公衆衛生上問題の一つとなっている。

【0004】

今まで、高血圧には根治的治療法がなく、その治療方針として、患者の生活行為の改善、血圧制御標準に基づく個別化治療、及び複数の心血管リスクファクターの協調制御等が含まれる。ここで、医薬品による治療は、最も主要な対策であって、その選択可能な医薬品の種類が多く、異なる医薬品が奏する効果もそれぞれ相違するものである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の実施例では、イナゴマメの莢から分離されたイナゴマメ多糖類が提供され、当該イナゴマメ多糖類は少なくとも血圧を下げる作用を有する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様によれば、フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなるイナゴマメ多糖類であって、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであるイナゴマメ多糖類が提供される。

【0007】

本明細書において、Ｇｌｕはグルコースを示し、Ｇａｌはガラクトースを示し、Ｆｒｕはフルクトースを示し、Ｘｙｌはキシロースを示し、Ｍａｎはマンノースを示す。

【0008】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比は、６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７である。

【0009】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の分子量分布範囲は１０^４～１０^６である。

【0010】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の分子量は（１～８）×１０^４である。

【0011】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の分子量は（８～４０）×１０^４である。

【0012】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の分子量は（４～７）×１０^６である。

【0013】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量は（４．６～５．０）×１０^６である。

【0014】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量は４．８１１×１０^６である。

【0015】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類の分子量分布の幅（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．４～１．６であり、１．５１９であってもよい。

【0016】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類は、イナゴマメの莢から分離されたものである。

【0017】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメ多糖類は、少なくとも血圧を下げる作用を有する。

【0018】

本発明の別の態様によれば、本発明に記載のイナゴマメ多糖類の医薬品としての使用が提供される。

【0019】

本発明の別の態様によれば、血圧降下薬を製造するための本発明に記載のイナゴマメ多糖類の使用が提供される。

【0020】

本発明の別の態様によれば、さらに、疾患を治療するための有效量の上記のイナゴマメ多糖類が提供される。

【0021】

ここで、前記疾患は高血圧を含む。

【0022】

本発明の別の態様によれば、本発明に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに、薬学上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。

【0023】

本発明の別の態様によれば、本発明に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに、食品主原料および食品副原料を含む食品が提供される。

【0024】

本発明の一部の実施例において、前記食品は、機能性食品、サプリメントを含む。

【0025】

本発明の一部の実施例において、前記食品は、飲料、キャンディー、シロップ、甘味料、香料等の１種又は複数種であってもよい。

【0026】

本発明の別の態様によれば、さらに、需要のある被験者又は患者に、経口又は非経口経路により上記のイナゴマメ多糖類、上記の医薬組成物又は上記の食品を有効量で投与することを含む疾患の治療方法が提供される。ここで、前記疾患は高血圧を含む。

【0027】

本発明の別の態様によれば、さらに、下記のようなイナゴマメ多糖類の製造方法が提供され、当該製造方法によれば、本発明に記載のイナゴマメ多糖類を製造することができ、その純度は９７％以上に達することができる。

【0028】

粉砕された種抜きのイナゴマメの莢を取り、９０％～９５％のエタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かすこと、水を添加して抽出すること、抽出液を遠心分離させ、上清液を濃縮させ、エタノールの質量パーセント濃度が３５～４５％となるようにエタノールを添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集すること、及び得られた沈殿物を水で分散させ、Ｓｅｖａｇｅ法により除タンパクを行った後、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水で溶出させ、移動相組成を収集し、ＤＥＡＥ－５２セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液（例えば、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ）で溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一な溶出ピークを持つものを合併し、減圧して濃縮させ、冷凍乾燥させてイナゴマメ多糖類を得ることを含むことを特徴とするイナゴマメ多糖類の製造方法。

【0029】

本発明の一部の実施例において、イナゴマメの莢を８０～３００メッシュの微粉末となるように粉砕し、莢の細胞構造を破壊して細胞内の物質を溶出させるとともに、莢の粉末と抽出液の接触面積を大きくすることで抽出率を向上させる。本発明の一部の実施例において、超微粉砕技術により粉砕を行うことができる。

【0030】

本発明の一部の実施例において、脱脂に用いられるエタノールの重量は、種抜きのイナゴマメの莢の重量の２～５倍である。

【0031】

本発明の一部の実施例において、抽出温度は、４０～５０℃であり、例えば４５℃である。当該温度範囲内であれば、イナゴマメ多糖類を十分に溶出させるのに有利である。

【0032】

本発明の一部の実施例において、抽出を２～４回行い、一回に１～５ｈ抽出する。

【0033】

本発明の一部の実施例において、ろ過液（抽出液）を５０００ｒｐｍで超遠心分離により１０ｍｉｎ遠心分離させ、上清液を合併する。

【0034】

本発明の一部の実施例において、上清液を６０℃、１００Ｐａの条件下でねっとりとした濃縮液となるように減圧して濃縮させる。

【0035】

本発明の一部の実施例において、前記イナゴマメの莢は、マメ科イナゴマメ属植物イナゴマメ（ラテン語学名：Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ Ｌｉｎｎ．）の乾燥された莢である。

【0036】

実験により、本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓを用いた、高血圧自然発症ラットモデルへの影響についての実験結果として、本発明の実施例のイナゴマメ多糖類が血圧を影響したことから、異なる濃度のイナゴマメ多糖類が有意な降圧効果を有することが示された。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの分子量のクロマトグラムを示す図である。

【図2】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの赤外吸収スペクトルを示す図である。

【図3】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。

【図4】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓにおけるフルクトースのＨＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラムを示す図である。

【図5】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓのＧＣ－ＭＳトータルイオンクロマトグラムを示す図である。

【図6】本発明の実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓのメチル化後の赤外吸収スペクトルを示す図である。

【図7】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるグルコースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【図8】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるフルクトースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【図9】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるマンノースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【図10】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるマンノースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【図11】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるガラクトースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【図12】イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるキシロースのフラグメントイオンの同定スペクトルを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

【0039】

以下、イナゴマメの莢は、マメ科イナゴマメ属植物イナゴマメ（ラテン語学名：Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ Ｌｉｎｎ．）の干燥された莢であって、ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＡＩＭＩＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．から提供されたものである。

【0040】

以下に用いられたＤ１０１マクロポーラス樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００、及びＤＥＡＥ－５２セルロースは、いずれも市販品として購入されたものである。

【0041】

実施例１ イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの抽出分離
種抜きのイナゴマメの莢を取り、超微粉砕により粒子径８０メッシュの微粉末となるように粉砕し、その重量の３倍の９５％エタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かした。固液比が１：２．３（ｇ／ｍＬ）となるようにイオン交換水を添加し、４回抽出し、一回に２時間抽出し、抽出温度を４５℃とし、抽出液を合併した。抽出液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）させ、上清液を６０℃、１００Ｐａの条件下でねっとりとしたものとなるように減圧して濃縮させ、得られた濃縮液にエタノールの質量パーセント濃度が４０％となるようにエタノールをゆっくり添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集し、粗多糖類２５０ｇを得た。粗多糖類をその重量の２０倍の精製水で分散させた後、Ｓｅｖａｇｅ法により、即ち、多糖類溶液とクロロホルム・ｎ－ブタノール（４：１）とを体積比が４：１となるように混合し、２０ｍｉｎ振盪し、静置して層に分けて、上層溶液を取り、この操作を６回繰り返し、除タンパクを行った後、多糖類の収率が９０％であった。除タンパク後の多糖類をその重量の１０倍の水で分散させ、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水により２個のカラムの体積で溶出させ、移動相組成を収集し、ＤＥＡＥ－５２セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、順にカラム体積の２倍の０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ溶液で溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一なピークを持つ溶出液を合併し、透析、濃縮、及び凍結乾燥を行った後、イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓを得た。その多糖類の含有量は９７％であった。

【0042】

本実施例のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの多糖類の含有量の測定方法は下記の通りである。

【0043】

イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓ ９．６ｍｇを精密に量り、精製水で溶解させて濃度０．２５ｍｇ／ｍＬの溶液とした。被験液１．０ｍＬに対して、フェノール硫酸法によりグルコース標準曲線を作製し、回帰方程式により、被験液における多糖類の質量濃度を算出した。

【0044】

グルコースの標準曲線：ｙ＝１．３４２１ｘ＋０．２２５５（Ｒ^２＝０．９９９２）

【0045】

式中、ｘは多糖類の濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、ｙは吸光度である。

【0046】

多糖類の含有量（％）＝（質量濃度（μｇ／ｍＬ）×希釈倍数×体積（ｍＬ））／（多糖類の乾燥重量（ｇ）×１０００）

【0047】

実験例１ イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓ（実施例１で製造されたもの）の構造解析
１）イナゴマメ多糖類Ｃｈｒｙｓｏｓ分子量の測定：
イナゴマメ多糖類Ｃｈｒｙｓｏｓ １０．０ｍｇを精密に量り、濃度２ｍｇ／ｍＬの溶液とした。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、示差屈折率検出器、及び光散乱検出器を用いた測定を行い、移動相を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＮＯ_３溶液とし、流速を０．７ｍＬ／ｍｉｎとした。

【0048】

イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの分子量の測定結果について、ＧＰＣによる多糖類の分子量の測定結果を図１に示した。解析・計算したところ、得られたサンプル曲線図において、Ｍｗ＝４．８１１×１０^６であり、当該図においてピークの形が良好であり、分布の幅ＰＤＩ（Ｍｗ／Ｍｎ）＝１．５１９であり、分布が狭いことが明らかとなった。このことから、多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの純度が高いことが確認された。図１では、横軸は保持時間を示し、縦軸は屈折率を示す。ＧＰＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙはＧＰＣクロマトグラムを示し、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ(ｍＶ)は屈折率を示し、Ｒｉｇｈｔ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ(ｍＶ)は直角光散乱を示し、Ｌｏｗ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ(ｍＶ)は低角度光散乱を示す。

【0049】

２）イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの赤外吸収スペクトル（ＩＲ）解析：
イナゴマメ多糖類Ｃｈｒｙｓｏｓサンプル５ｍｇを量り、適量な乾燥ＫＢｒを添加し、研磨して均一で透明な錠剤とし、４０００ｃｍ^－１～４００ｃｍ^－１の範囲でフーリエ変換型赤外分光器で走査して解析を行った。

【0050】

イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの赤外吸収スペクトルを図２に示した。図２によれば、３４２９ｃｍ^－１において－ＯＨの伸縮振動による吸収ピークが示され、２９３４ｃｍ^－１において－ＣＨ_２の伸縮振動による吸収ピークが示され、１０１８ｃｍ^－１において強い吸収ピークを有し、Ｃ－Ｏの伸縮振動による吸収ピークが示された。図２の縦軸は透過率（％）である。

【0051】

３）イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成の解析：
イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓサンプル５ｍｇを量り、２ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３ｍＬを添加し、栓付き試験管に仕込み、１１０℃で加熱して６ｈ加水分解した。分解後のサンプルである、加水分解サンプル溶液を得た。減圧してＴＦＡを蒸発させて除去し、メタノールとともに３回蒸留し、一回に１ｍｌのメタノールで残ったＴＦＡを除去し、蒸発させて乾かした。適量な水を添加して溶液とした。誘導体化後、ＨＰＬＣインジェクション解析に供した。その結果は図３に示した。図３では、横軸は時間を示し、縦軸のＡｂｓｏｒｂａｎｃｅ(ｍＡＵ)は吸光度を示し、ｓｏｌｖｅｎｔは溶剤ピークを示し、ＰＭＰは誘導体化試薬（１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン）を示し、Ｍａｎはマンノースを示し、Ｇａｌはガラクトースを示し、Ｇｌｕはグルコースを示し、Ｘｙｌｏはキシロースを示す。ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤで測定したｃｈｒｙｓｏｓにおけるフルクトースの含有量を図４に示した。クロマトグラム解析及び標準曲線により、含まれた単糖類の量の比を計算したところ、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースは、６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７であった。

【0052】

４）多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類の結合位置の測定：
均一な多糖類サンプルを約２０ｍｇ量り、６ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、多糖類サンプルが十分に溶解するまでに４０℃で１５時間磁気撹拌した。イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓは、メチル化、加水分解及びアセチル化された後、ＧＣ－ＭＳで同定し、そのトータルイオンクロマトグラムを図５に示した。図５の横軸のＴｉｍｅは、ピーク検出時間を示し、縦軸のＲｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅは相対強度を示す。

【0053】

マススペクトルのフラグメントイオンのスペクトルを分析したところ、イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓは、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであることが明らかとなった。Ｇｌｕはグルコースを示し、Ｇａｌはガラクトースを示し、Ｆｒｕはフルクトースを示し、Ｘｙｌはキシロースを示し、Ｍａｎはマンノースを示す。メチル化の場合の分析結果を表１に示した。メチル化後の赤外吸収スペクトルを図６に示した。

【0054】

【表1】

【0055】

スペクトルライブラリで分析したところ、下記のことを見出した。

【0056】

イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類の結合方式に基づくフラグメントイオンは、図７～１２に示した。図７はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるグルコースのフラグメントイオンを示すものである。Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ，２，３，４，６－ｔｅｔｒａ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－の同定スペクトルにおいて、ｔ＝２１．１１ｍｉｎである。図８はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるフルクトースのフラグメントイオンを示すものである。Ｄ－Ｆｒｕａｔｏｓｅ，１，３，４，５，６－ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅの同定スペクトルにおいて、ｔ＝３０．９５ｍｉｎである。図９はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるマンノースのフラグメントイオンを示すものである。Ｍａｎｎｉｔｏｌ，１，３，４－ｔｒｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－の同定スペクトルにおいて、ｔ＝３７．６５ｍｉｎである。図１０はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるマンノースのフラグメントイオンを示すものである。Ｍａｎｎｉｔｏｌ，１，４－ｄｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－の同定スペクトルにおいて、ｔ＝３７．９１ｍｉｎである。図１１はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるガラクトースのフラグメントイオンを示すものである。Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ,２，３，４－ｔｒｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－の同定スペクトルにおいて、ｔ＝４０．８５ｍｉｎである。図１２はイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓの単糖類組成であるキシロースのフラグメントイオンを示すものである。２，４：３，５－Ｄｉｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ－ｌ－ｘｙｌｉｔｏｌの同定スペクトルにおいて、ｔ＝４２．６ｍｉｎである。

【0057】

図７では、（ｍａｉｎｌｉｂ）ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ，２，３，４，６－ｔｅｔｒａ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－は（メインライブラリ）２，３，４，６－テトラ－Ｏ－メチル－Ｄ－グルコースを示す。図８では、（ｍａｉｎｌｉｂ）Ｄ－Ｆｒｕａｔｏｓｅ，１，３，４，５，６－ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅは（メインライブラリ）１，３，４，５，６－ペンタアセテート－Ｄ－フルクトースを示す。図９では、（ｍａｉｎｌｉｂ）Ｍａｎｎｉｔｏｌ，１，３，４－ｔｒｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－，ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ，Ｄ－は（メインライブラリ）１，３，４－トリ－Ｏ－メチルトリアセテート－マンノースを示す。図１０では、（ｍａｉｎｌｉｂ）Ｍａｎｎｉｔｏｌ，１，４－ｄｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅは（メインライブラリ）１，４－ジ－Ｏ－メチル－テトラアセテートマンノースを示す。図１１では、（ｍａｉｎｌｉｂ）Ｄ－Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ，２，３，４－ｔｒｉ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－，ｔｒｉａｃｅｔａｔｅは（メインライブラリ）２，３，４－トリ－Ｏ－メチル－トリアセテート－Ｄ－ガラクトースを示す。図１２では、（ｍａｉｎｌｉｂ）２，４：３，５－Ｄｉｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ－ｌ－ｘｙｌｉｔｏｌは（メインライブラリ）２，４：３，５－ジエチリデン－キシロースを示す。

【0058】

実験例２ 高血圧自然発症ラットモデルへのイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓ（実施例１で製造されたもの）による影響についての実験
高血圧自然発症ラットモデル５０匹を、３日適応的に飼育し、血圧を量り、血圧が１６０ｍｍＨｇ以上の安定なものを選択し、無作為に五つのグループに分けた（一つのグループに１０匹）。正常対照群も１０匹とした。具体的には、下記のようなグループに分けられた：通常の餌で飼育した正常対照群である第１のグループ、通常の餌で飼育した高血圧モデル対照群である第２のグループ、エナラプリル錠剤（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＮＥＷ ＡＳＩＡＴＩＣ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＭＩＮＨＡＮＧ ＣＯ．，ＬＴＤ．、承認番号Ｈ２００８３５３４）を０．３ｍｇ／ｋｇで投与した陽性対照群である第３のグループ、少量のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓを投与した高血圧投与群（０．１ｇ／ｋｇ）である第４のグループ、中等量のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓを投与した高血圧投与群（０．２ｇ／ｋｇ)である第５のグループ、及び大量のイナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓを投与した高血圧投与群（０．４ｇ／ｋｇ）である第６のグループ。グループ分けの状況に応じて２１日継続的に投与し、１４日目及び２１日目に、血圧計の要求に応じて動物に目を覚ませ、安静状態下の血圧、心拍数を測定した。その結果を表２に示した。

【0059】

【表2】

【0060】

上記の結果により、通常の餌はラットの血圧に影響を及ぼすものではないが、陽性対照群、少量、中等量、大量の投与群では、胃内強制経口投与後の各段階におけるラットの血圧が基礎血圧に比べてそれぞれ異なる程度で低くなったことから、イナゴマメ多糖類ｃｈｒｙｓｏｓは、有意な降圧効果を有することが明らかとなった。

【0061】

上記において、一般的な説明及び具体的な実施形態で本発明を詳しく説明したが、本発明に基づき、いくつかの修正や改善を行い得ることは、当業者にとって明らかである。従って、本発明の趣旨から逸脱しない範疇で行ったこれらの修正や改善は、いずれも本発明の保護しようとする範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなるイナゴマメ多糖類であって、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであることを特徴とするイナゴマメ多糖類。

【請求項2】

前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７であることを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項3】

前記イナゴマメ多糖類の分子量分布範囲が１０^４～１０^６であり、前記イナゴマメ多糖類の分子量が（４．６～５．０）×１０^６であってもよく、さらに、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量が４．８１１×１０^６であってもよく、及び／又は、
前記イナゴマメ多糖類の分子量分布の幅（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．４～１．６であり、１．５１９であってもよいことを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項4】

粉砕された種抜きのイナゴマメの莢を取り、９０％～９５％のエタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かすこと、水を添加して抽出すること、抽出液を遠心分離させ、上清液を濃縮させ、エタノールの質量パーセント濃度が３５～４５％となるようにエタノールを添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集すること、及び得られた沈殿物を水で分散させ、Ｓｅｖａｇｅ法により除タンパクを行った後、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水で溶出させ、移動相組成を収集し、ＤＥＡＥ－５２セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液で溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一な溶出ピークを持つものを合併し、減圧して濃縮させ、冷凍乾燥させてイナゴマメ多糖類を得ることを含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項5】

前記イナゴマメの莢を８０～３００メッシュとなるように粉砕し、及び／又は、
抽出時の固液比がｇ／ｍＬとして１：（２～５）であり、及び／又は、
抽出温度が４０～５０℃であることを特徴とする請求項４に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類の医薬品としての使用であって、
血圧降下薬を製造するための前記イナゴマメ多糖類の使用であってもよい、前記使用。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに薬学上許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項8】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに食品主原料および食品副原料を含むことを特徴とする食品。

【請求項9】

需要のある被験者又は患者に、経口又は非経口経路により請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を有効量で投与することを含み、
前記疾患は高血圧を含んでもよいことを特徴とする疾患の治療方法。

【手続補正書】

【提出日】2023-12-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなるイナゴマメ多糖類であって、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであることを特徴とするイナゴマメ多糖類。

【請求項2】

前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７であることを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項3】

前記イナゴマメ多糖類の分子量分布範囲が１０^４～１０^６であり、前記イナゴマメ多糖類の分子量が（４．６～５．０）×１０^６であってもよく、さらに、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量が４．８１１×１０^６であってもよく、及び／又は、
前記イナゴマメ多糖類の分子量分布の幅（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．４～１．６であり、１．５１９であってもよいことを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項4】

粉砕された種抜きのイナゴマメの莢を取り、９０％～９５％のエタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かすこと、水を添加して抽出すること、抽出液を遠心分離させ、上清液を濃縮させ、エタノールの質量パーセント濃度が３５～４５％となるようにエタノールを添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集すること、及び得られた沈殿物を水で分散させ、Ｓｅｖａｇｅ法により除タンパクを行った後、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水で溶出させ、移動相組成を収集し、セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液で溶出させ、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一な溶出ピークを持つものを合併し、減圧して濃縮させ、冷凍乾燥させてイナゴマメ多糖類を得ることを含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項5】

前記イナゴマメの莢を８０～３００メッシュとなるように粉砕し、及び／又は、
抽出時の固液比がｇ／ｍＬとして１：（２～５）であり、及び／又は、
抽出温度が４０～５０℃であることを特徴とする請求項４に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類の医薬品としての使用であって、
血圧降下薬を製造するための前記イナゴマメ多糖類の使用であってもよい、前記使用。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに薬学上許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項8】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに食品主原料および食品副原料を含むことを特徴とする食品。

【手続補正書】

【提出日】2024-02-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フルクトース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びマンノースの５種類の単糖類からなるイナゴマメ多糖類であって、前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が（６０～７０）：（１０～１５）：（１０～１５）：（５～１０）：（１～３）であり、グリコシド結合として、（１→）－Ｇｌｕ、（２→）－Ｆｒｕ、（１→２）－Ｆｒｕ、（１→６）－Ｇａｌ、（１→３）－Ｘｙｌ、（２→６）－Ｍａｎ、（２→３，６）－Ｍａｎを介して結合して組み合わせてなるものであることを特徴とするイナゴマメ多糖類。

【請求項2】

前記イナゴマメ多糖類において、フルクトース：ガラクトース：グルコース：キシロース：マンノースのモル比が６４．４５：１１．２４：１２．８３：９．７１：１．７７であることを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項3】

前記イナゴマメ多糖類の分子量分布範囲が１０^４～１０^６であり、前記イナゴマメ多糖類の分子量が（４．６～５．０）×１０^６であってもよく、さらに、前記イナゴマメ多糖類の平均分子量が４．８１１×１０^６であってもよく、及び／又は、
前記イナゴマメ多糖類の分子量分布の幅（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．４～１．６であり、１．５１９であってもよいことを特徴とする請求項１に記載のイナゴマメ多糖類。

【請求項4】

粉砕された種抜きのイナゴマメの莢を取り、９０％～９５％のエタノールで脱脂を行い、脱脂後の微粉末を乾かすこと、水を添加して抽出すること、抽出液を遠心分離させ、上清液を濃縮させ、エタノールの質量パーセント濃度が３５～４５％となるようにエタノールを添加し、遠心分離させ、沈殿物を収集すること、及び得られた沈殿物を水で分散させ、Ｓｅｖａｇｅ法により除タンパクを行った後、マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１による吸着を行い、蒸留水で溶出させ、移動相組成を収集し、ＤＥＡＥ（商標）－５２セルロースカラムクロマトグラフィーを行い、ＮａＣｌ溶液で溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標） Ｇ－１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、移動相をイオン交換水とし、溶出液を収集し、同一な溶出ピークを持つものを合併し、減圧して濃縮させ、冷凍乾燥させてイナゴマメ多糖類を得ることを含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項5】

前記イナゴマメの莢を８０～３００メッシュとなるように粉砕し、及び／又は、
抽出時の固液比がｇ／ｍＬとして１：（２～５）であり、及び／又は、
抽出温度が４０～５０℃であることを特徴とする請求項４に記載のイナゴマメ多糖類の製造方法。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類の医薬品としての使用であって、
血圧降下薬を製造するための前記イナゴマメ多糖類の使用。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに薬学上許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項8】

請求項１～３のいずれか１項に記載のイナゴマメ多糖類を含み、さらに食品主原料および食品副原料を含むことを特徴とする食品。