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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024146252
(43)【公開日】2024-10-15
(54)【発明の名称】血球分析方法及び血球分析用試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 K
【審査請求】未請求
【請求項の数】31
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023059036
(22)【出願日】2023-03-31
(71)【出願人】
【識別番号】390014960
【氏名又は名称】シスメックス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100159385
【弁理士】
【氏名又は名称】甲斐 伸二
(74)【代理人】
【識別番号】100163407
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 裕輔
(74)【代理人】
【識別番号】100166936
【弁理士】
【氏名又は名称】稲本 潔
(74)【代理人】
【識別番号】100174883
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 雅己
(74)【代理人】
【識別番号】100189429
【弁理士】
【氏名又は名称】保田 英樹
(74)【代理人】
【識別番号】100213849
【弁理士】
【氏名又は名称】澄川 広司
(72)【発明者】
【氏名】多嘉良 千尋
(72)【発明者】
【氏名】小巻 尚紀
(72)【発明者】
【氏名】山内 将哉
(57)【要約】
【課題】溶血試薬を用いずに、検体中の有核赤血球の検出を可能とする手段を提供することを課題とする。
【解決手段】検体中の血球を蛍光色素で染色し、染色された血球に315 nm以上490 nm以下の波長の光及び610 nm以上750 nm以下の波長の光を照射することにより生じた蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を取得し、蛍光情報に基づいて有核細胞の集団を特定し、第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、有核細胞の集団から有核赤血球を特定することにより、上記の課題を解決する。
【選択図】図１７
【解決手段】検体中の血球を蛍光色素で染色し、染色された血球に315 nm以上490 nm以下の波長の光及び610 nm以上750 nm以下の波長の光を照射することにより生じた蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を取得し、蛍光情報に基づいて有核細胞の集団を特定し、第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、有核細胞の集団から有核赤血球を特定することにより、上記の課題を解決する。
【選択図】図１７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸に結合可能な蛍光色素で染色された粒子を含む測定試料に第１波長の光及び第２波長の光を照射することにより生じた蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を取得する工程と、
前記蛍光情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する工程と、
前記有核細胞の集団の前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて、前記有核細胞の集団から有核赤血球を特定する工程と、
を含み、
前記測定試料が、全血と前記蛍光色素とを混合することにより調製された試料であり、
前記蛍光色素が、前記第１波長の光又は前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、
前記第１波長が315 nm以上490 nm以下であり、前記第２波長が610 nm以上750 nm以下であり、
前記蛍光情報が、前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であり、
前記第１散乱光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報であり、
前記第２散乱光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報である、
血球分析方法。
前記蛍光情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する工程と、
前記有核細胞の集団の前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて、前記有核細胞の集団から有核赤血球を特定する工程と、
を含み、
前記測定試料が、全血と前記蛍光色素とを混合することにより調製された試料であり、
前記蛍光色素が、前記第１波長の光又は前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、
前記第１波長が315 nm以上490 nm以下であり、前記第２波長が610 nm以上750 nm以下であり、
前記蛍光情報が、前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であり、
前記第１散乱光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報であり、
前記第２散乱光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報である、
血球分析方法。
【請求項2】
前記測定試料が、溶血試薬を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記取得する工程の前に、前記全血と前記蛍光色素とを混合して前記測定試料を調製する工程をさらに含み、
前記測定試料に含まれる成熟赤血球を溶血する工程を含まない請求項１に記載の方法。
前記測定試料に含まれる成熟赤血球を溶血する工程を含まない請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記蛍光色素が、前記第１波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であるか、又は
前記蛍光色素が、前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である請求項１に記載の方法。
前記蛍光色素が、前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記蛍光情報が蛍光強度である請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記測定試料中の粒子を、蛍光強度に基づいて、第１の粒子集団と第２の粒子集団とに分類し、
前記第２の粒子集団が、前記第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す集団であり、
前記第２の粒子集団を、有核細胞の集団として特定する請求項５に記載の方法。
前記第２の粒子集団が、前記第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す集団であり、
前記第２の粒子集団を、有核細胞の集団として特定する請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の粒子集団を、成熟赤血球を含む集団として特定する請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記有核細胞の集団を特定する工程において、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、前記第２の粒子集団として特定する請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記有核細胞の集団を特定する工程において、蛍光強度及び粒子数に基づくヒストグラムを作成し、前記ヒストグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する請求項５に記載の方法。
【請求項10】
前記蛍光情報が蛍光強度であり、前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度又は第２側方散乱光強度であり、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記蛍光強度と、前記第１側方散乱光強度、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する請求項１に記載の方法。
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記蛍光強度と、前記第１側方散乱光強度、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記第1散乱光情報が側方散乱光情報である請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記有核赤血球を特定する工程において、前記第１散乱光情報と、前記第２散乱光情報とに基づいて、前記有核細胞の集団を、有核赤血球と白血球とに分類する請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度又は第２側方散乱光強度である請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記有核赤血球を特定する工程において、前記第１側方散乱光強度と、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づいて、前記有核細胞の集団を、第３の粒子集団と第４の粒子集団とに分類し、
前記第４の粒子集団が、前記第３の粒子集団より高い第１側方散乱光強度を示す集団であり、
前記第３の粒子集団を有核赤血球として特定し、前記第４の粒子集団を白血球として特定する請求項１３に記載の方法。
前記第４の粒子集団が、前記第３の粒子集団より高い第１側方散乱光強度を示す集団であり、
前記第３の粒子集団を有核赤血球として特定し、前記第４の粒子集団を白血球として特定する請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１側方散乱光強度と、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記有核細胞の集団を、前記第３の粒子集団と前記第４の粒子集団とに分類する請求項１４に記載の方法。
前記スキャッタグラムにおいて、前記有核細胞の集団を、前記第３の粒子集団と前記第４の粒子集団とに分類する請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記白血球を、リンパ球、単球及び顆粒球の３つの亜集団に分類する工程をさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
第１散乱光情報又は第２散乱光情報が、前方散乱光に関する情報を含み、
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記前方散乱光に関する情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記血小板を除く粒子集団の蛍光情報に基づいて、前記血小板を除く集団から前記有核細胞の細胞集団を特定する請求項１に記載の方法。
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記前方散乱光に関する情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記血小板を除く粒子集団の蛍光情報に基づいて、前記血小板を除く集団から前記有核細胞の細胞集団を特定する請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記前方散乱光に関する情報が、第１前方散乱光強度又は第２前方散乱光強度であり、
前記測定試料中の粒子を、前記前方散乱光強度に基づいて、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する請求項１７に記載の方法。
前記測定試料中の粒子を、前記前方散乱光強度に基づいて、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記第５の粒子集団を、血小板の集団としてとして特定する請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記前方散乱光に関する情報が、前記第２前方散乱光強度である請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、閾値以下の第２前方散乱光強度を示す粒子の集団を、前記第５の粒子集団として特定し、前記閾値より高い第２前方散乱光強度を示す粒子の集団を、前記第６の粒子集団として特定する請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記蛍光情報が蛍光強度であり、前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度及び第２側方散乱光強度であり、
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記第２前方散乱光強度と、前記蛍光強度、前記第１側方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記測定試料中の粒子を、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する請求項１に記載の方法。
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記第２前方散乱光強度と、前記蛍光強度、前記第１側方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記測定試料中の粒子を、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記蛍光色素が、アクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物、クマリン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記アクリジン系化合物が、以下の式(I)：
(式中、R1～R10は、独立して、水素原子、-NH2、-(CH2)n-NR11R12、-NH-R13-NR11R12、-O-R11、-COOH、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であり、ただし、R1、R4及びR7の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR11R12、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
R11及びR12は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R13は、炭素数１～６のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化1】
R11及びR12は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R13は、炭素数１～６のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記シアニン系化合物が、以下の式(II)：
(式中、R1及びR2は、同一又は異なって、炭素数１～18のアルキル基、炭素数３～20のアルケニル基、ヒドロキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、スルホ基を有する炭素数１～18のアルキル基、ハロゲン、-(CH2)p-NR5R6、-(CH2)q-O-R7又は置換基を有してもよいベンジル基であり、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
であり、
であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なって、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(III)：
(式中、R1、R2、R3、A1、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IV)：
(式中、R1、R2、A1、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(V)：
(式中、R1、R2、A2、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VI)：
(式中、R1、R2、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化2】
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
【化3】
【化4】
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なって、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(III)：
【化5】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IV)：
【化6】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(V)：
【化7】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VI)：
【化8】
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記スチリル系化合物が、以下の式(VII)：
(式中、R1は、炭素数１～18のアルキル基、炭素数３～20のアルケニル基、ヒドロキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、スルホ基を有する炭素数１～18のアルキル基、ハロゲン、-(CH2)p-NR5R6、-(CH2)q-O-R7又は置換基を有してもよいベンジル基であり、
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基であるか、あるいは、R2及び／又はR3は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
であり、
R4は、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VIII)：
(式中、R1、A及びＺ-は、上記のとおりであり、
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基である)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IX)：
(式中、R1、R2、R3、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化9】
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基であるか、あるいは、R2及び／又はR3は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
【化10】
R4は、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VIII)：
【化11】
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基である)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IX)：
【化12】
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記フェノキサジン系化合物が、以下の式(X)：
(式中、R1～R8のうち、R2及びR5の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR9R10、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化13】
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
前記フェノチアジン系化合物が、以下の式(XI)：
(式中、R1～R8のうち、R2及びR5の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR9R10、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化14】
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項29】
前記クマリン系化合物が、以下の式(XII)：
(式中、R1は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のハロアルキル基、又はヒドロキシ基を有する炭素数１～３のアルキル基であるか、あるいは、R1とR2とが互いに結合して環を形成し、
R2は、水素原子、ベンゾイミダゾール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ピリジン環、-COOR5、-SO3R6、-CN又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であるか、あるいは、R3及び／又はR4は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化15】
R2は、水素原子、ベンゾイミダゾール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ピリジン環、-COOR5、-SO3R6、-CN又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であるか、あるいは、R3及び／又はR4は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
前記アゾ(トリアジン)系化合物が、以下の式(XIII)：
(式中、R1及びR2は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は-NR5R6であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【化16】
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は-NR5R6であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である)
で表される化合物である請求項２３に記載の方法。
【請求項31】
アクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物、クマリン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物からなる群より選択される蛍光色素を含み、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法に用いられる血球分析用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血球分析方法に関する。本発明は、この方法に用いられる血球分析用試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
有核赤血球は、骨髄中に存在する赤血球前駆細胞であり、赤芽球とも呼ばれる。有核赤血球は通常、末梢血中に存在しないが、急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血などの患者の末梢血には、有核赤血球が出現することがある。そのため、臨床検査分野では、有核赤血球の検出は非常に重要である。従来、血液検体中の血球を自動血球分析装置で分析することにより、有核赤血球を検出する方法が知られている。一方、被検者から採取した血液では通常、有核赤血球や白血球などの有核細胞の数に比べ、赤血球数の方が非常に多い。そのため、赤血球以外の血球を対象とする血球分析では、赤血球の影響を抑えるために、血液検体と溶血試薬とを混合して、赤血球を溶解させることが広く行われている。例えば、特許文献１には、血液検体を溶血試薬及び３種類の蛍光色素で処理して自動血球分析装置で分析することにより、有核赤血球を検出すると共に、網状赤血球断片の検出及び白血球の亜集団への分類を行ったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】米国特許出願第2022/0091127号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
溶血試薬を用いて調製された測定試料には、溶血した赤血球の残骸(赤血球ゴーストとも呼ばれる)が残る。この測定試料を自動血球分析装置で分析して有核赤血球を検出する場合、赤血球ゴーストの存在が有核赤血球の正確な検出を妨げる。また、溶血試薬は、有核赤血球のヘモグロビンを溶出させる。これにより、白血球との区別を可能にする有核赤血球の特徴が失われ、有核赤血球と白血球との弁別が難しくなる。そのため、従来、特許文献１に示されるように、有核赤血球を検出するための測定と、白血球を分類するための測定とが別個に行われている。本発明は、溶血試薬を用いずに有核赤血球の検出を可能とする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、検体中の血球を蛍光色素で染色し、染色された血球に315 nm以上490 nm以下の波長の光及び610 nm以上750 nm以下の波長の光を照射することにより生じた蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報に基づいて、有核赤血球を特定できることを見出して、以下の［１］～［３０］に記載の発明を完成した。
【0006】
［１］核酸に結合可能な蛍光色素で染色された粒子を含む測定試料に第１波長の光及び第２波長の光を照射することにより生じた蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を取得する工程と、
前記蛍光情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する工程と、
前記有核細胞の集団の前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて、前記有核細胞の集団から有核赤血球を特定する工程と、
を含み、
前記測定試料が、全血と前記蛍光色素とを混合することにより調製された試料であり、
前記蛍光色素が、前記第１波長の光又は前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、
前記第１波長が315 nm以上490 nm以下であり、前記第２波長が610 nm以上750 nm以下であり、
前記蛍光情報が、前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であり、
前記第１散乱光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報であり、
前記第２散乱光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報である、
血球分析方法。
前記蛍光情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する工程と、
前記有核細胞の集団の前記第１散乱光情報及び前記第２散乱光情報に基づいて、前記有核細胞の集団から有核赤血球を特定する工程と、
を含み、
前記測定試料が、全血と前記蛍光色素とを混合することにより調製された試料であり、
前記蛍光色素が、前記第１波長の光又は前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、
前記第１波長が315 nm以上490 nm以下であり、前記第２波長が610 nm以上750 nm以下であり、
前記蛍光情報が、前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であり、
前記第１散乱光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報であり、
前記第２散乱光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子から生じた散乱光に関する情報である、
血球分析方法。
【0007】
［２］前記測定試料が、溶血試薬を含まない、上記［１］に記載の方法。
【0008】
［３］前記取得する工程の前に、前記全血と前記蛍光色素とを混合して前記測定試料を調製する工程をさらに含み、
前記調製する工程が、前記測定試料に含まれる成熟赤血球を溶血する工程を含まない、上記［１］又は［２］に記載の方法。
前記調製する工程が、前記測定試料に含まれる成熟赤血球を溶血する工程を含まない、上記［１］又は［２］に記載の方法。
【0009】
［４］前記蛍光色素が、前記第１波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第１波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報であるか、又は
前記蛍光色素が、前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の方法。
前記蛍光色素が、前記第２波長の光により励起可能な蛍光色素であり、前記蛍光情報が、前記測定試料に前記第２波長の光を照射することにより前記粒子の前記蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の方法。
【0010】
［５］前記蛍光情報が蛍光強度である、上記［１］～［４］のいずれか１に記載の方法。
【0011】
［６］前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記測定試料中の粒子を、蛍光強度に基づいて、第１の粒子集団と第２の粒子集団とに分類し、
前記第２の粒子集団が、前記第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す集団であり、
前記第２の粒子集団を、有核細胞の集団として特定する、上記［５］に記載の方法。
前記第２の粒子集団が、前記第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す集団であり、
前記第２の粒子集団を、有核細胞の集団として特定する、上記［５］に記載の方法。
【0012】
［７］前記第１の粒子集団を、成熟赤血球を含む集団として特定する、上記［６］に記載の方法。
【0013】
［８］前記有核細胞の集団を特定する工程において、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、前記第２の粒子集団として特定する、上記［６］に記載の方法。
【0014】
［９］前記有核細胞の集団を特定する工程において、蛍光強度及び粒子数に基づくヒストグラムを作成し、前記ヒストグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する、上記［５］に記載の方法。
【0015】
［１０］前記蛍光情報が蛍光強度であり、前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度又は第２側方散乱光強度であり、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記蛍光強度と、前記第１側方散乱光強度、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する、上記［１］～［５］のいずれか１に記載の方法。
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記蛍光強度と、前記第１側方散乱光強度、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、閾値より高い蛍光強度を示す粒子の集団を、有核細胞の集団として特定する、上記［１］～［５］のいずれか１に記載の方法。
【0016】
［１１］前記第1散乱光情報が側方散乱光情報である上記［１］～［９］のいずれか１に記載の方法。
【0017】
［１２］前記有核赤血球を特定する工程において、前記第１散乱光情報と、前記第２散乱光情報とに基づいて、前記有核細胞の集団を、有核赤血球と白血球とに分類する、上記［１］～［１１］のいずれか１に記載の方法。
【0018】
［１３］前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度又は第２側方散乱光強度である、上記［１］～［１２］のいずれか１に記載の方法。
【0019】
［１４］前記有核赤血球を特定する工程において、前記第１側方散乱光強度と、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づいて、前記有核細胞の集団を、第３の粒子集団と第４の粒子集団とに分類し、
前記第４の粒子集団が、前記第３の粒子集団より高い第１側方散乱光強度を示す集団であり、
前記第３の粒子集団を有核赤血球として特定し、前記第４の粒子集団を白血球として特定する、上記［１３］に記載の方法。
前記第４の粒子集団が、前記第３の粒子集団より高い第１側方散乱光強度を示す集団であり、
前記第３の粒子集団を有核赤血球として特定し、前記第４の粒子集団を白血球として特定する、上記［１３］に記載の方法。
【0020】
［１５］前記第１側方散乱光強度と、前記第２前方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記有核細胞の集団を、前記第３の粒子集団と前記第４の粒子集団とに分類する、上記［１４］に記載の方法。
前記スキャッタグラムにおいて、前記有核細胞の集団を、前記第３の粒子集団と前記第４の粒子集団とに分類する、上記［１４］に記載の方法。
【0021】
［１６］前記白血球を、リンパ球、単球及び顆粒球の３つの亜集団に分類する工程をさらに含む上記［１２］～［１５］のいずれか１に記載の方法。
【0022】
［１７］第１散乱光情報又は第２散乱光情報が、前方散乱光に関する情報を含み、
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記前方散乱光に関する情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記血小板を除く粒子集団の蛍光情報に基づいて、前記血小板を除く集団から前記有核細胞の細胞集団を特定する、上記［１］～［１６］のいずれか１に記載の方法。
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記前方散乱光に関する情報に基づいて、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記有核細胞の集団を特定する工程において、前記血小板を除く粒子集団の蛍光情報に基づいて、前記血小板を除く集団から前記有核細胞の細胞集団を特定する、上記［１］～［１６］のいずれか１に記載の方法。
【0023】
［１８］前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記前方散乱光に関する情報が、第１前方散乱光強度又は第２前方散乱光強度であり、
前記測定試料中の粒子を、前記前方散乱光強度に基づいて、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する、上記［１７］に記載の方法。
前記測定試料中の粒子を、前記前方散乱光強度に基づいて、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する、上記［１７］に記載の方法。
【0024】
［１９］前記第５の粒子集団を、血小板の集団としてとして特定する、上記［１８］に記載の方法。
【0025】
［２０］前記前方散乱光に関する情報が、前記第２前方散乱光強度である、上記［１８］に記載の方法。
【0026】
［２１］前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、閾値以下の第２前方散乱光強度を示す粒子の集団を、前記第５の粒子集団として特定し、前記閾値より高い第２前方散乱光強度を示す粒子の集団を、前記第６の粒子集団として特定する、上記［２０］に記載の方法。
【0027】
［２２］前記蛍光情報が蛍光強度であり、前記第１散乱光情報が第１側方散乱光強度であり、前記第２散乱光情報が、第２前方散乱光強度及び第２側方散乱光強度であり、
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記第２前方散乱光強度と、前記蛍光強度、前記第１側方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記測定試料中の粒子を、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する、上記［１］～［１６］に記載の方法。
前記取得する工程の後で且つ前記有核細胞の集団を特定する工程の前に、前記測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する工程をさらに含み、
前記血小板を除く粒子集団を特定する工程において、前記第２前方散乱光強度と、前記蛍光強度、前記第１側方散乱光強度又は前記第２側方散乱光強度とに基づくスキャッタグラムを作成し、
前記スキャッタグラムにおいて、前記測定試料中の粒子を、第５の粒子集団と第６の粒子集団とに分類し、
前記第６の粒子集団が、前記第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す集団であり、
前記第６の粒子集団を、血小板を除く細胞集団として特定する、上記［１］～［１６］に記載の方法。
【0028】
［２３］前記蛍光色素が、アクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物、クマリン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物からなる群より選択される、上記［１］～［２２］のいずれか１に記載の方法。
【0029】
［２４］前記アクリジン系化合物が、以下の式(I)：
(式中、R1～R10は、独立して、水素原子、-NH2、-(CH2)n-NR11R12、-NH-R13-NR11R12、-O-R11、-COOH、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であり、ただし、R1、R4及びR7の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR11R12、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
R11及びR12は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R13は、炭素数１～６のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］に記載の方法。
【化1】
R11及びR12は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R13は、炭素数１～６のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］に記載の方法。
【0030】
［２５］前記シアニン系化合物が、以下の式(II)：
(式中、R1及びR2は、同一又は異なって、炭素数１～18のアルキル基、炭素数３～20のアルケニル基、ヒドロキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、スルホ基を有する炭素数１～18のアルキル基、ハロゲン、-(CH2)p-NR5R6、-(CH2)q-O-R7又は置換基を有してもよいベンジル基であり、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
であり、
であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なって、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(III)：
(式中、R1、R2、R3、A1、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IV)：
(式中、R1、R2、A1、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(V)：
(式中、R1、R2、A2、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VI)：
(式中、R1、R2、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物である、上記［２３］又は［２４］に記載の方法。
【化2】
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
【化3】
【化4】
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なって、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(III)：
【化5】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IV)：
【化6】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(V)：
【化7】
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VI)：
【化8】
で表される化合物である、上記［２３］又は［２４］に記載の方法。
【0031】
［２６］前記スチリル系化合物が、以下の式(VII)：
(式中、R1は、炭素数１～18のアルキル基、炭素数３～20のアルケニル基、ヒドロキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１～18のアルキル基、スルホ基を有する炭素数１～18のアルキル基、ハロゲン、-(CH2)p-NR5R6、-(CH2)q-O-R7又は置換基を有してもよいベンジル基であり、
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基であるか、あるいは、R2及び／又はR3は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
であり、
R4は、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VIII)：
(式中、R1、A及びＺ-は、上記のとおりであり、
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基である)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IX)：
(式中、R1、R2、R3、ｎ及びＺ-は、上記のとおりである)
で表される化合物である、上記［２３］～［２５］のいずれか１に記載の方法。
【化9】
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基であるか、あるいは、R2及び／又はR3は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
ｎは、０～２の整数であり、ｐは、１～18の整数であり、ｑは、１～６の整数であり、
【化10】
R4は、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は-(CH2)q-O-R7であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
R7は、水素原子、炭素数１～18のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はCR8R9であり、
R8及びR9は、同一又は異なって、炭素数１～３のアルキル基であり、
Ｚ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(VIII)：
【化11】
R2及びR3は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン、炭素数１～18のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基又は炭素数１～６のアルコキシ基である)
で表される化合物であるか、又は、以下の式(IX)：
【化12】
で表される化合物である、上記［２３］～［２５］のいずれか１に記載の方法。
【0032】
［２７］前記フェノキサジン系化合物が、以下の式(X)：
(式中、R1～R8のうち、R2及びR5の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR9R10、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］～［２６］のいずれか１に記載の方法。
【化13】
残りのRは、独立して、水素原子、酸素原子、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］～［２６］のいずれか１に記載の方法。
【0033】
［２８］前記フェノチアジン系化合物が、以下の式(XI)：
(式中、R1～R8のうち、R2及びR5の少なくとも１つは、独立して、-NH2、-(CH2)n-NR9R10、又は-NH2で置換されたフェニル基であり、
残りのRは、独立して、水素原子、=O、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］～［２７］のいずれか１に記載の方法。
【化14】
残りのRは、独立して、水素原子、=O、-O-R9、-COOH、-NO2、ハロゲン、置換基を有してもよいフェニル基、炭素数１～18のアルキル基又はアミノアシル基であるか、あるいは、R1とR8とが互いに結合してベンゼン環を形成し、且つ／又は、R6とR7とが互いに結合してベンゼン環を形成し、
R9及びR10は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～18のアルキル基であり、
ｎは、０～６の整数であり、
Ｘ-は、カウンターイオンである)
で表される化合物である、上記［２３］～［２７］のいずれか１に記載の方法。
【0034】
［２９］前記クマリン系化合物が、以下の式(XII)：
(式中、R1は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のハロアルキル基、又はヒドロキシ基を有する炭素数１～３のアルキル基であるか、あるいは、R1とR2とが互いに結合して環を形成し、
R2は、水素原子、ベンゾイミダゾール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ピリジン環、-COOR5、-SO3R6、-CN又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であるか、あるいは、R3及び／又はR4は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である)
で表される化合物である、上記［２３］～［２８］のいずれか１に記載の方法。
【化15】
R2は、水素原子、ベンゾイミダゾール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ピリジン環、-COOR5、-SO3R6、-CN又は置換基を有してもよいフェニル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であるか、あるいは、R3及び／又はR4は、Ｎが結合しているベンゼン環と共に、前記Ｎを含む複素環を形成し、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基である)
で表される化合物である、上記［２３］～［２８］のいずれか１に記載の方法。
【0035】
［３０］前記アゾ(トリアジン)系化合物が、以下の式(XIII)：
(式中、R1及びR2は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は-NR5R6であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である)
で表される化合物である、上記［２３］～［２９］のいずれか１に記載の方法。
【化16】
R3及びR4は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は-NR5R6であり、
R5及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基である)
で表される化合物である、上記［２３］～［２９］のいずれか１に記載の方法。
【0036】
［３１］アクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物、クマリン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物からなる群より選択される蛍光色素を含み、上記［１］～［３０］のいずれか１に記載の方法に用いられる血球分析用試薬。
【発明の効果】
【0037】
本発明によれば、溶血試薬を用いずに有核赤血球の検出を可能にする血球分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】本実施形態の血球分析方法に適した分析システムを示す斜視図である。
【図2】測定ユニットにおける検体吸引部、試料調製部及びフローサイトメータ(ＦＣＭ)検出部を含む流体回路を示す図である。
【図3】測定ユニットの構成を示すブロック図である。
【図4】ＦＣＭ検出部の光学系の構成の一例を示す概略図である。
【図5】フローセルを通過する粒子に光を照射したときに発せされる各種の光が、ＦＣＭ検出部の光学系に受光されることを示す模式図である。
【図6】分析ユニットの構成を示すブロック図である。
【図7】分析システムの動作の流れを示すフローチャートである。
【図8】測定処理の手順を示すフローチャートである。
【図9】本実施形態の血球分析用試薬の一例を示す図である。
【図10A】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図10B】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図11】横軸に第１側方散乱光(SSC-1)強度をとり、縦軸に第１蛍光強度の対数(SFL-1(log))をとった第１スキャッタグラムにおいて、第１の粒子集団及び第２の粒子集団が出現する位置を例示する模式図である。図中、「NRBC」は有核赤血球であり、「WBC」は白血球であり、「RBC」は成熟赤血球であり、「PLT」は血小板である。
【図12】横軸に第１側方散乱光強度の対数(SSC-1(log))をとり、縦軸に第２前方散乱光(FSC-2)強度をとった第２スキャッタグラムにおいて、第３の粒子集団及び第４の粒子集団が出現する位置を例示する模式図である。
【図13】横軸にSSC-1(log)をとり、縦軸にFSC-2強度をとった第２スキャッタグラムにおいて、有核赤血球の集団及び白血球の各亜集団が出現する位置を例示する模式図である。図中、「Gran」は顆粒球であり、「Mono」は単球であり、「Lym」はリンパ球である。
【図14】実施形態２の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図15】横軸に第２側方散乱光強度の対数(SSC-2(log))をとり、縦軸にFSC-2強度をとった第３スキャッタグラムにおいて、第５の粒子集団及び第６の粒子集団が出現する位置を例示する模式図である。
【図16】実施例１の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。図中、「V-SSC」及び「V-SFL」はそれぞれ、測定試料中の粒子に第１波長の光(青紫色レーザ)を照射して得られた側方散乱光強度及び蛍光強度である。
【図17】実施例１の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。図中、「R-FSC」は、測定試料中の粒子に第２波長の光(赤色レーザ)を照射して得られた前方散乱光強度である。
【図18】実施例１の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。図中、「R-SSC」は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた側方散乱光強度である。
【図19】実施例２の正常検体及び異常検体についての蛍光強度のヒストグラムである。図中、「Count」は粒子数である。
【図20】実施例２の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図21】実施例３の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図22】実施例３の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図23】実施例３の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図24】実施例３の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図25】実施例４の正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムである。
【図26】実施例４の正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムである。
【図27】実施例４の正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムである。
【図28】実施例４の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図29】実施例４の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図30】実施例４の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図31】実施例４の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図32】実施例４の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図33】実施例４の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図34】実施例５の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図35】実施例５の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図36】実施例６の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図37】実施例６の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図38】比較例の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。図中、「V-FSC」は、測定試料中の粒子に青紫色レーザを照射して得られた前方散乱光強度である。
【図39】比較例の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図40】実施例７の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図41】実施例７の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図42】実施例８の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図43】実施例８の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【図44】実施例９の正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムである。
【図45】実施例９の正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0039】
(分析システム)
まず、図１を参照して、本実施形態の血球分析方法に適した分析システムについて説明する。分析システム５００は、測定装置である測定ユニット４００と、分析装置である分析ユニット３００とを備える。分析ユニット３００は、例えば、測定対象となる検体を分析するためのソフトウェアが組み込まれたパーソナルコンピュータである。分析ユニット３００は、測定ユニット４００の動作制御も実行する。分析システム５００は、測定ユニット４００内に分析ユニット３００が設けられた構成であってもよい。
まず、図１を参照して、本実施形態の血球分析方法に適した分析システムについて説明する。分析システム５００は、測定装置である測定ユニット４００と、分析装置である分析ユニット３００とを備える。分析ユニット３００は、例えば、測定対象となる検体を分析するためのソフトウェアが組み込まれたパーソナルコンピュータである。分析ユニット３００は、測定ユニット４００の動作制御も実行する。分析システム５００は、測定ユニット４００内に分析ユニット３００が設けられた構成であってもよい。
【0040】
測定ユニット４００は、検体を測定するためのユニットであり、フローサイトメータを含んでいる。測定ユニット４００では、検体と試薬とを混合して測定試料を調製する。測定試料の調製には、試薬として、染色試薬及び希釈試薬が用いられる。染色試薬は、粒子を染色するための蛍光色素を含む。希釈試薬は、緩衝剤と溶媒とを含む。検体、染色試薬及び希釈試薬の詳細については後述する。この分析システムによる検体中の粒子の分析では、蛍光色素によって染色された測定試料中の粒子を分析する。「測定試料中の粒子」とは、後述のＦＣＭ検出部４６０により個々に測定され得る、測定試料に含まれる有形成分をいう。測定試料中の粒子としては、検体に含まれる細胞、赤血球ゴースト、血小板凝集、脂質粒子、真菌、細菌などが挙げられる。「細胞」との用語には、各種の血球及び血小板が包含される。赤血球ゴーストは、溶血試薬以外による溶血、例えば採血管への物理的衝撃、測定試料の低いpH及び低い浸透圧によっても生じ得る。
【0041】
測定試料は、測定ユニット４００のＦＣＭ検出部４６０で測定される。測定試料中の染色された粒子の蛍光色素から発せられる蛍光に関する光学的信号と、当該粒子から発せられる散乱光に関する光学的信号が取得される。「粒子の蛍光色素」とは、染色により粒子と結合した蛍光色素をいう。粒子と蛍光色素との結合の態様は、粒子と蛍光色素とが一体となってフローサイトメータで測定されるかぎり特に限定されない。取得された光学的信号はＡ／Ｄ変換されて、デジタルデータが取得される。分析ユニット３００は、測定ユニット４００で取得されたデジタルデータを分析して、測定試料中の粒子を特定及び／又は分類する。
【0042】
図２を参照して、測定ユニット４００における流体系の構成について説明する。測定ユニット４００は、試料調製部４４０と、検体吸引部４５０と、ＦＣＭ検出部４６０とを備える。試料調製部４４０は、試薬容器４１０と、試薬容器４１１と、反応チャンバ４２０と、廃液チャンバ４３０とを含む。例えば、試薬容器４１０は希釈試薬を収容し、試薬容器４１１は染色試薬を収容する。試薬容器４１０及び試薬容器４１１はそれぞれ送液管により反応チャンバ４２０に接続される。試料調製部４４０は、各送液管を通じて希釈試薬及び染色試薬を反応チャンバ４２０に注入する。検体吸引部４５０は吸引管２００を含む。吸引管２００は、採血管１００に収容された検体を吸引し、反応チャンバ４２０に吐出する。反応チャンバ４２０は、送液管によりＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３と接続される。
【0043】
反応チャンバ４２０は、測定試料を調製するための容器である。反応チャンバ４２０内で、検体と、蛍光色素を含む染色試薬と、希釈試薬とが混合されて測定試料が調製される。反応チャンバ４２０内の測定試料は、送液管を介してＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３に供給されて測定される。ＦＣＭ検出部４６０は、測定試料中の個々の粒子から発せられる各種の光学的信号を取得する。ＦＣＭ検出部４６０による測定が完了した後、反応チャンバ４２０に残った測定試料は廃液チャンバ４３０に廃棄される。反応チャンバ４２０は、次の測定試料が調製される前に、図示しない洗浄機構によって洗浄される。
【0044】
図３を参照して、測定ユニット４００における各部の電気的接続について説明する。試料調製部４４０及び検体吸引部４５０は、インターフェース(ＩＦ)部４８８を介してＦＣＭ検出部４６０に接続される。ＦＣＭ検出部４６０は、アナログ処理部４８１及びＡ／Ｄ変換部４８２に接続される。アナログ処理部４８１は、ＦＣＭ検出部４６０から出力されるアナログ信号を処理し、Ａ／Ｄ変換部４８２は、アナログ処理部４８１から出力されるアナログ信号をデジタル信号に変換する。また、測定ユニット４００は、ＩＦ部４８９を介して、分析ユニット３００と接続される。ＩＦ部４８４、ＩＦ部４８８及びＩＦ部４８９はバス４８５に接続される。
【0045】
図４を参照して、ＦＣＭ検出部４６０、アナログ処理部４８１及びＡ／Ｄ変換部４８２について説明する。ＦＣＭ検出部４６０は、第１光源４１１ａ、第２光源４１１ｂと、フローセル４１３と、ダイクロイックミラー４１８ａ、４１８ｂ、４１８ｃと、側方散乱光受光素子４１２ａ、４１２ｂと、前方散乱光受光素子４１６と、側方蛍光受光素子４２２ａ、４２２ｂとを備える。第１光源４１１ａ及び第２光源４１１ｂは、互いに異なる波長の光を射出する。例えば、第１光源４１１ａは、第１波長の光を射出し、第２光源４１１ｂは、第２波長の光を射出する。第１波長は、好適にはヘモグロビンが吸収する波長である。そのような波長は、例えば315 nm以上490 nm以下であり、好ましくは400 nm以上450 nm以下であり、より好ましくは400 nm以上410 nm以下である。後述のとおり、上記の波長域の光を有核赤血球に照射すると、当該光は有核赤血球中のヘモグロビンにより吸収されるため、有核赤血球から生じる散乱光の強度(ピーク値)、パルス幅、パルス面積などのパラメータは、ヘモグロビンを含まない白血球に比べて小さくなる傾向がある。第２波長は、第１波長とは異なる波長であり、好適にはヘモグロビンが吸収しない波長である。そのような波長は、例えば610 nm以上750 nm以下であり、好ましくは620 nm以上700 nm以下であり、より好ましくは633 nm以上643 nm以下である。ヘモグロビンが吸収する波長域の光とヘモグロビンが吸収しない波長域の光の両方を用いることによって、有核赤血球と白血球とを明確に弁別することができる。第１及び第２光源として、例えば半導体レーザ光源を使用できる。
【0046】
反応チャンバ４２０で調製された測定試料は、ＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３に流される。図４の例では、紙面に対して垂直方向に測定試料が流される。フローセル４１３に測定試料が流れている状態で、第１光源４１１ａから照射された光は、ダイクロイックミラー４１８ａによって反射され、フローセル４１３内を流れる測定試料中の個々の粒子に照射される。第２光源４１１ｂから発せられた光は、ダイクロイックミラー４１８ａを透過して、フローセル４１３内を流れる測定試料中の個々の粒子に照射される。
【0047】
図４の例では、前方散乱光受光素子４１６は、第２光源４１１ｂから照射された光に基づいて粒子から発せられる前方散乱光を受光するように配置される。あるいは、受光素子４１６は、第１光源４１１ａから照射された光に基づいて粒子から発せられる前方散乱光を受光するように配置されてもよい。あるいは、第１光源４１１ａから照射された光に基づいて粒子から発せられる前方散乱光を受光するために、別の受光素子をさらに配置してもよい。前方散乱光は、例えば、受光角度が０度から約20度の散乱光である。前方散乱光受光素子４１６は、例えばフォトダイオードである。第１光源４１１ａから照射された光に対応する側方散乱光(第１側方散乱光)は、ダイクロイックミラー４１８ｂによって反射され、側方散乱光受光素子４１２ａによって受光される。第２光源４１１ｂから照射された光に対応する側方散乱光(第２側方散乱光)は、ダイクロイックミラー４１８ｃによって反射され、側方散乱光受光素子４１２ｂによって受光される。側方散乱光は、例えば、受光角度が約20度から約90度の散乱光である。側方散乱光受光素子４１２ａ及び４１２ｂは、例えばフォトダイオードである。
【0048】
第１波長により励起される蛍光色素を用いた場合、当該蛍光色素が励起されて生じた光に対応する側方蛍光(第１側方蛍光)は、ダイクロイックミラー４１８ｂを透過して側方蛍光受光素子４２２ａによって受光される。第２波長により励起される蛍光色素を用いた場合、当該蛍光色素が励起されて生じた光に対応する側方蛍光(第２側方蛍光)は、ダイクロイックミラー４１８ｃを透過して側方蛍光受光素子４２２ｂによって受光される。側方蛍光受光素子４２２ａ及び４２２ｂは、例えばアバランシェフォトダイオードである。
【0049】
図５を参照して、フローセル４１３中を通過する粒子Ｐに光を照射したときに発せされる各種の光と、ＦＣＭ検出部４６０の光学系との関係について説明する。図５では、第１光源４１１ａから照射された光は、第１波長の光Ｌ１であり、第２光源４１１ｂから照射された光は、第２波長の光Ｌ２である。フローセル４１３中を通過する粒子Ｐに光Ｌ１及びＬ２が照射されると、光の進行方向に対して前方に、第１波長の光及び第２波長の光のそれぞれに対応する前方散乱光が生じる。図５の例では、受光素子４１６は、第２波長の光に対応する前方散乱光を受光するので、第２波長の光に対応する第２前方散乱光(FSC-2)のみを示し、第１波長の光に対応する第１前方散乱光(FSC-1)は省略した。図５を参照して、光の進行方向に対して側方に、第１波長の光に対応する第１側方散乱光(SSC-1)と、第２波長の光に対応する第２側方散乱光(SSC-2)とが生じる。また、粒子Ｐが、第１波長により励起される蛍光色素で染色されているとき、光の進行方向に対して側方に、第１波長の光によって励起された第１側方蛍光(SFL-1)が生じる。あるいは、粒子Ｐが、第２波長により励起される蛍光色素で染色されているとき、光の進行方向に対して側方に、第２波長の光によって励起された第２側方蛍光(SFL-2)が生じる。本実施形態の血球分析方法では、蛍光色素の種類に応じてSFL-1及びSFL-2のいずれか１つを用いるが、図５の例では説明のため、粒子ＰからSFL-1及びSFL-2の両方が生じた状態を示している。
【0050】
上記のとおり、FSC-2、SSC-1、SFL-1、SSC-2及びSFL-2は、それぞれ受光素子４１６、４１２ａ、４２２ａ、４１２ｂ及び４２２ｂに受光される。各受光素子は、受光強度に応じたパルスを含む波形状の電気信号(アナログ信号ともいう)を出力する。以下、FSC-2に対応するアナログ信号を「第２前方散乱光信号」、SSC-1に対応するアナログ信号を「第１側方散乱光信号」、SFL-1に対応するアナログ信号を「第１蛍光信号」、SSC-2に対応するアナログ信号を「第２側方散乱光信号」、SFL-2に対応するアナログ信号を「第２蛍光信号」ともいう。FSC-1を受光している場合は、FSC-1に対応するアナログ信号を「第１前方散乱光信号」ともいう。各アナログ信号の１つのパルスが、１つの粒子(例えば１つの細胞)に対応する。
【0051】
各種の光に対応するアナログ信号は、それぞれアナログ処理部４８１に入力されて、ノイズ除去、平滑化等の処理が行われる。Ａ／Ｄ変換部４８２は、所定のサンプリングレート(例えば、10ナノ秒間隔で1024ポイントのサンプリング、80ナノ秒間隔で128ポイントのサンプリング、又は160ナノ秒間隔で64ポイントのサンプリング等)で、アナログ処理部４８１から出力されるアナログ信号をサンプリングする。Ａ／Ｄ変換部４８２は、サンプリングしたアナログ信号をデジタル化して、波形データを生成する。Ａ／Ｄ変換部４８２は、フローセル４１３を流れる個々の細胞に対応する５種類のアナログ信号をサンプリング及びデジタル化して、第２前方散乱光信号、第１側方散乱光信号、第１蛍光信号、第２側方散乱光信号及び第２蛍光信号の波形データを生成する。FSC-1を受光している場合は、第１前方散乱光信号の波形データも生成される。さらに、Ａ／Ｄ変換部４８２は、各信号の波形データから個々の細胞の形態的特徴を表す特徴パラメータを計算する。そのような特徴パラメータとしては、例えばピーク値(パルスのピークの高さ)、パルス幅、パルス面積、透過率、ストークスシフト、比率、経時変化及びそれらに相関する値などが挙げられる。
【0052】
光学的情報は、上記の特徴パラメータであり得る。光学的情報は、蛍光情報、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を含む。蛍光情報は、第１蛍光情報又は第２蛍光情報であり得る。蛍光色素として、第１波長の光により励起可能な蛍光色素を用いた場合、第１蛍光情報が取得される。蛍光色素として、第２波長の光により励起可能な蛍光色素を用いた場合、第２蛍光情報が取得される。第１蛍光情報は、測定試料に第１波長の光を照射することにより、染色された粒子の蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である。第２蛍光情報は、測定試料に第２波長の光を照射することにより、染色された粒子の蛍光色素から生じた蛍光に関する情報である。蛍光情報は、有核細胞中の核酸を染色した蛍光色素の量を反映する情報であれば特に限定されない。第１及び第２蛍光情報としては、それぞれ第１蛍光信号のピーク値(以下、「第１蛍光強度」ともいう)及び第２蛍光信号のピーク値(以下、「第２蛍光強度」ともいう)が好ましい。
【0053】
第１散乱光情報は、測定試料に第１波長の光を照射することにより粒子から生じた散乱光に関する情報である。第２散乱光情報は、測定試料に第２波長の光を照射することにより粒子から生じた散乱光に関する情報である。第１散乱光情報は、第１前方散乱光情報及び第１側方散乱光情報を含み、第２散乱光情報は、第２前方散乱光情報及び第２側方散乱光情報を含む。前方散乱光情報は、粒子の大きさを反映する情報であれば特に限定されない。第１及び第２前方散乱光情報としては、それぞれ第１前方散乱光信号のピーク値(以下、「第１前方散乱光強度」とも呼ぶ)及び第２前方散乱光信号のピーク値(以下、「第２前方散乱光強度」とも呼ぶ)が好ましい。側方散乱光情報は、細胞構造の複雑性、顆粒特性、核構造、分葉度などの内部情報を反映する情報であれば特に限定されない。第１及び第２側方散乱光情報としては、それぞれ第１側方散乱光信号のピーク値(以下、「第１側方散乱光強度」ともいう)及び第２側方散乱光信号のピーク値(以下、「第２側方散乱光強度」ともいう)が好ましい。
【0054】
図６を参照して、分析ユニット３００における各部の電気的接続について説明する。分析ユニット３００は、インターフェース部３０４を介して測定ユニット４００と電気的に接続される。インターフェース部３０４は、例えばＵＳＢインターフェースである。分析ユニット３００は、制御部３０１、バス３０２、記憶部３０３、インターフェース部３０４、表示部３０５及び操作部３０６を備える。分析ユニット３００は、例えば、パーソナルコンピュータ(図１の分析ユニット３００を参照)によって構成されており、記憶部３０３に格納されたプログラムを実行することで、分析システム５００の測定ユニット４００を制御する。分析ユニット３００は、測定ユニット４００で取得された光学的情報を含むデータを分析して、分析結果を表示部３０５に表示する。分析ユニット３００は、光学的情報に基づいて、細胞の分類を行ってもよい。
【0055】
記憶部３０３には、例えば、測定ユニット４００を制御するためのプログラム、測定ユニット４００が取得したデータを分析するためのプログラムなどが記憶されている。表示部３０５には、例えば、測定ユニット４００で取得されたデータの分析結果が表示される。操作部３０６は、キーボード、マウス又はタッチパネルを含むポインティングデバイスを備える。
【0056】
図７を参照して、分析システム５００の動作の例を説明するが、この例に限定されない。ステップＳ１１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、ユーザからの測定開始の指示を、操作部３０６を介して受け付ける。制御部３０１は、測定開始の指示を受け付けると、測定開始を指示する指示データを測定ユニット４００に送信する。測定ユニット４００は、当該指示データを受信して、ステップＳ１２において測定処理を実行する。
【0057】
本実施形態の血球分析方法には、例えば、次の実施形態１及び２が包含される。「実施形態１」では、検体から調製した測定試料を測定し、当該測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する。そして、有核細胞の集団から有核赤血球を特定し、且つ白血球を亜集団に分類する。「実施形態２」では、検体から調製した測定試料を測定し、当該測定試料中の粒子から、血小板を除く粒子集団を特定する。次いで、血小板を除く粒子集団から有核細胞の集団を特定する。そして、実施形態１と同様にして、有核細胞の集団から、有核赤血球を特定し、且つ白血球を亜集団に分類する。
【0058】
(測定処理)
図７のステップＳ１２に関して、実施形態１及び２の測定処理の例について、図８を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ２１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に、検体から測定試料を調製させる。具体的には、測定ユニット４００は、検体と染色試薬と希釈試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ２２において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させ、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。これにより、測定ユニット４００は、測定試料中の個々の粒子について光学的情報、例えばSSC-1、SSC-2、FSC-2(又はFSC-1)及びSFL-1(又はSFL-2)の波形データを検出する。ステップＳ２３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。各実施形態の分析処理の例については、後述する。
図７のステップＳ１２に関して、実施形態１及び２の測定処理の例について、図８を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ２１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に、検体から測定試料を調製させる。具体的には、測定ユニット４００は、検体と染色試薬と希釈試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ２２において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させ、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。これにより、測定ユニット４００は、測定試料中の個々の粒子について光学的情報、例えばSSC-1、SSC-2、FSC-2(又はFSC-1)及びSFL-1(又はSFL-2)の波形データを検出する。ステップＳ２３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。各実施形態の分析処理の例については、後述する。
【0059】
(検体)
検体は、血液検体である。血液検体は、例えば全血、全血の希釈物などが挙げられる。全血は、例えば、被検者から採取した末梢血である。血液検体には、抗凝固剤が含まれてもよい。そのような抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTA塩(例えばEDTA・2K、EDTA・2Naなど)、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ワーファリンなどが挙げられる。全血の希釈物は、例えば、適切な水性溶媒、好ましくは後述の希釈試薬により全血を希釈することにより得られる。水性溶媒としては、例えば水、生理食塩水、緩衝剤の水溶液などが挙げられる。
検体は、血液検体である。血液検体は、例えば全血、全血の希釈物などが挙げられる。全血は、例えば、被検者から採取した末梢血である。血液検体には、抗凝固剤が含まれてもよい。そのような抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTA塩(例えばEDTA・2K、EDTA・2Naなど)、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ワーファリンなどが挙げられる。全血の希釈物は、例えば、適切な水性溶媒、好ましくは後述の希釈試薬により全血を希釈することにより得られる。水性溶媒としては、例えば水、生理食塩水、緩衝剤の水溶液などが挙げられる。
【0060】
本明細書において「血液成分」は、血液中に含まれることが知られた有形成分と、異常細胞とを包含する。血液中に含まれることが知られた有形成分は、例えば、健常人の末梢血に通常含まれる血球である。そのような血球としては、例えば白血球、成熟赤血球及び血小板が挙げられる。「成熟赤血球」は、核及び核酸を有さない最終分化した赤血球であり、臨床検査分野で用いられる「赤血球」との用語と同義である。本明細書では「成熟赤血球」との用語は、有核赤血球との区別のために用いられる。「異常細胞」とは、血液又は体液中に通常は出現しない有形成分をいう。血液における異常細胞としては、例えば有核赤血球が挙げられる。「有核赤血球」は、NRBC又は赤芽球とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。異常細胞には、非細胞の粒子及び微生物も含まれる。非細胞の粒子としては、例えば赤血球ゴースト、脂質粒子、血小板凝集が挙げられる。血小板凝集は、採血時の組織液の混入、混和の不十分又はEDTAの作用により、採血管中に生じる。微生物としては、例えば細菌、真菌などが挙げられる。
【0061】
(希釈試薬)
測定試料の調製に用いられる希釈試薬について説明する。希釈試薬は、緩衝剤と溶媒とを含む。好ましくは、希釈試薬は、緩衝剤の溶液を含む。溶媒としては、例えば水、生理食塩水などが挙げられ、水が特に好ましい。緩衝剤は、pHが６以上11以下の範囲で緩衝作用を有することが好ましい。そのような緩衝剤は、例えばカルボン酸塩、リン酸塩、グッドバッファー、タウリン、トリエタノールアミンなどから選択できる。希釈試薬のpHは、例えば６以上11以下であり、好ましくは７以上10以下であり、より好ましく８以上9.5以下である。希釈試薬のpHが６以上であると、測定試料中で成熟赤血球が溶血しにくくなる。これにより、赤血球ゴーストの発生を抑制できる。また、希釈試薬のpHが11以下であると、蛍光色素による成熟赤血球及び赤血球ゴーストの非特異的染色を低減できる。好ましい希釈試薬は、pH６以上11以下である、上記の緩衝剤の水溶液である。
測定試料の調製に用いられる希釈試薬について説明する。希釈試薬は、緩衝剤と溶媒とを含む。好ましくは、希釈試薬は、緩衝剤の溶液を含む。溶媒としては、例えば水、生理食塩水などが挙げられ、水が特に好ましい。緩衝剤は、pHが６以上11以下の範囲で緩衝作用を有することが好ましい。そのような緩衝剤は、例えばカルボン酸塩、リン酸塩、グッドバッファー、タウリン、トリエタノールアミンなどから選択できる。希釈試薬のpHは、例えば６以上11以下であり、好ましくは７以上10以下であり、より好ましく８以上9.5以下である。希釈試薬のpHが６以上であると、測定試料中で成熟赤血球が溶血しにくくなる。これにより、赤血球ゴーストの発生を抑制できる。また、希釈試薬のpHが11以下であると、蛍光色素による成熟赤血球及び赤血球ゴーストの非特異的染色を低減できる。好ましい希釈試薬は、pH６以上11以下である、上記の緩衝剤の水溶液である。
【0062】
希釈試薬は、上記の緩衝剤の他に、浸透圧補償剤、染色促進剤、多価アニオン、防腐剤などの成分をさらに含み得る。浸透圧補償剤は、希釈試薬の浸透圧を適切な範囲に維持できる物質である。浸透圧補償剤としては、例えば、プロピオン酸のような有機酸のアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類、塩化ナトリウムのようなアルカリ金属ハロゲン化物、塩化マグネシウムのようなアルカリ土類金属ハロゲン化物が挙げられる。浸透圧補償剤は、１種又は２種以上を用いることができる。浸透圧補償剤を用いる場合、浸透圧補償剤は、好ましくは希釈試薬の浸透圧が150 mOsm/kg以上600 mOsm/kg以下、より好ましくは200 mOsm/kg以上300 mOsm/kg以下となるように希釈試薬に添加される。
【0063】
染色促進剤は、蛍光色素の血球への透過性を促進できる物質である。染色促進剤としては、例えば界面活性剤が挙げられ、好ましくはカチオン性界面活性剤である。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩型界面活性剤が特に好ましく、例えばデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド(LTAC)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられる。これらのカチオン性界面活性剤は、１種又は２種以上を用いてもよい。
【0064】
希釈試薬における上記のカチオン性界面活性剤の濃度は、成熟赤血球の溶血を抑制できれば特に限定されない。例えば50 ppm以上20000 ppm以下の範囲から適宜決定できる。具体的には、DTABを用いる場合、希釈試薬におけるDTABの濃度は500 ppm以上3000 ppm以下が好ましい。LTACを用いる場合、希釈試薬におけるLTACの濃度は100 ppm以上500 ppm以下が好ましい。そのような濃度でカチオン性界面活性剤が希釈試薬に含まれることにより、成熟赤血球の溶血を抑制し、蛍光色素による血球の染色を促進できる。
【0065】
多価アニオンは、蛍光色素による成熟赤血球の非特異的染色を抑制するために希釈試薬に添加される。多価アニオンとしては、例えば硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、多価カルボン酸イオンなどが挙げられる。これらのイオンを供給し得る化合物としては、例えばクエン酸、硫酸、リン酸、EDTA及びこれらのアルカリ金属塩が挙げられる。多価アニオンは、１種又は２種以上を用いてもよい。
【0066】
希釈試薬に含まれる防腐剤としては、例えば2-ピリジルチオ-1-オキシドナトリウム、β-フェネチルアルコールなどが挙げられる。
【0067】
本実施形態の血球分析方法では、市販の希釈試薬を用いてもよい。市販の希釈試薬としては、例えばセルパック(登録商標)DFL、セルパックDCL、セルパックDST(いずれもシスメックス株式会社)などが挙げられる。
【0068】
(染色試薬及び蛍光色素)
測定試料の調製に用いられる染色試薬について説明する。染色試薬に適する蛍光色素は、第１波長又は第２波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素である。そのような蛍光色素自体は公知である。第１波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素は、例えばアクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、及びクマリン系化合物から選択できる。第２波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素は、例えばシアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物から選択できる。蛍光色素が核酸に結合することにより、成熟赤血球や血小板などの無核の細胞と、有核赤血球や白血球などの有核細胞とを弁別可能にする。
測定試料の調製に用いられる染色試薬について説明する。染色試薬に適する蛍光色素は、第１波長又は第２波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素である。そのような蛍光色素自体は公知である。第１波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素は、例えばアクリジン系化合物、シアニン系化合物、スチリル系化合物、及びクマリン系化合物から選択できる。第２波長によって励起可能であり、且つ核酸に結合可能な蛍光色素は、例えばシアニン系化合物、スチリル系化合物、フェノキサジン系化合物、フェノチアジン系化合物及びアゾ(トリアジン)系化合物から選択できる。蛍光色素が核酸に結合することにより、成熟赤血球や血小板などの無核の細胞と、有核赤血球や白血球などの有核細胞とを弁別可能にする。
【0069】
アクリジン系化合物の蛍光色素としては、例えば、上記の式(I)で表される蛍光色素が挙げられる。上記の式(I)で表される蛍光色素は、第１波長の光によって励起可能な蛍光色素であり得る。「アルキル基」は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。式(I)中のR1～R12に関して、炭素数１～18のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、t-ブチル、n-ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、t-ペンチル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルなどが挙げられる。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～10であり、より好ましくは１～６であり、特に好ましくは１～３である。アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、t-ブチル、n-ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、t-ペンチル、イソヘキシルなどが挙げられる。式(I)中のR13に関して、アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。
【0070】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素である。「ハロアルキル基」は、少なくとも１の水素がハロゲンに置換されたアルキル基である。ハロアルキル基が２以上のハロゲンを含む場合、それらのハロゲンは、同一でもよいし、複数種類を含んでもよい。「アミノアシル基」は、アミノ酸のカルボキシ基(-COOH)からOHが除かれた基である。アミノアシル基としては、例えばアラニル基、アルギニル基、アスパラギル基、アスパラチル酸基、システイニル基、シスチル基、グルタミル酸基、グルタミル基、グリシル基、ヒスチジル基、ヒドロキシリシル基、ヒドロキシプロリル基、イソロイシル基、ロイシル基、リシル基、メチオニル基、フェニルアラニル基、プロリル基、セリル基、スレオニル基、トリプトフィル基、チロシル基、バリル基、β-アラニル基、β-リシル基、N,N-ジメチルグリシル基、2-アミノブチリル基、4-ヒドロキシフェニルグリシル基、フェニルグリシル基、2,4-ジアミノブチリル基、オルニチル基、ホモセリル基などが挙げられる。アミノアシル基は、D-形及びL-形のいずれであってもよい。
【0071】
フェニル基の置換基としては、例えば-NH2、ハロゲン、-OH、-SH、-CN、-NO2、-COOH、及び炭素数１～６のアルキル基が挙げられる。式(I)中のカウンターイオンＸ-は、例えばＦ-、Cl-、Br-、Ｉ-、1/2SO4
2-、NO3
-などが挙げられる。Ｘ-がCl-、1/2SO4
2-又はNO3
-である場合、それらのイオンを供給可能な酸、例えばHCl、H2SO4又はHNO3が蛍光色素に添加されてもよい。また、カウンターイオンＸ-として、乳酸が蛍光色素に添加されてもよい。
【0072】
シアニン系化合物の蛍光色素としては、例えば上記の式(II)～(VI)で表される蛍光色素が挙げられる。これらの式で表される蛍光色素は、第１波長又は第２波長の光によって励起可能な蛍光色素であり得る。本実施形態の血球分析方法では、第１波長の光及び第２波長の光を照射するので、上記の式(II)～(VI)のいずれの蛍光色素からも蛍光が生じ得る。
【0073】
上記の式(II)～(VI)中のアルキル基については、式(I)について述べたことと同様である。上記の式(II)～(VI)中のR1及びR2に関して、炭素数３～20のアルケニル基としては、例えばアリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、オクタデセニル、イコセニルなどが挙げられる。アルケニル基の炭素数は、好ましくは３～14であり、より好ましくは３～10であり、特に好ましくは３～６である。
【0074】
上記の式(II)～(VI)中のフェニル基の置換基については、式(I)について述べたことと同様である。上記の式(II)～(VI)中のベンジル基の置換基としては、例えば-CN、-COOH、-NH2、-NO2、-OH、-SH、炭素数１～18のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアルキルアミノ基、炭素数１～６のアシルアミノ基、ハロゲン及び炭素数１～６のハロアルキル基が挙げられる。上記の式(II)～(VI)中のカウンターイオンＺ-は、例えばＦ-、Cl-、Br-、Ｉ-、CF3SO3
-、BF4
-、ClO4
-などが挙げられる。
【0075】
スチリル系化合物の蛍光色素としては、例えば、上記の式(VII)～(IX)で表される蛍光色素が挙げられる。これらの式で表される蛍光色素は、第１波長又は第２波長の光によって励起可能な蛍光色素であり得る。本実施形態の血球分析方法では、第１波長の光及び第２波長の光を照射するので、上記の式(VII)～(IX)のいずれの蛍光色素からも蛍光が生じ得る。
【0076】
上記の式(VII)～(IX)中のアルキル基及びフェニル基の置換基については、式(I)について述べたことと同様である。また、アルケニル基及びベンジル基の置換基については、上記の式(II)～(VI)について述べたことと同様である。上記の式(VII)及び(IX)において、R2及び／又はR3が、Ｎが結合しているベンゼン環と共に形成する複素環は、五員環でもよいし、六員環でもよい。また、当該複素環は、置換基を有してもよい。置換基としては、炭素数１～３のアルキル基が挙げられる。上記の式(VII)～(IX)中のカウンターイオンＺ-は、例えばＦ-、Cl-、Br-、Ｉ-、CF3SO3
-、BF4
-、ClO4
-などが挙げられる。
【0077】
フェノキサジン系化合物の蛍光色素としては、例えば、上記の式(X)で表される蛍光色素が挙げられる。また、フェノチアジン系化合物のとしては、例えば、上記の式(XI)で表される蛍光色素が挙げられる。上記の式(X)及び(XI)で表される蛍光色素は、第２波長の光によって励起可能な蛍光色素であり得る。
【0078】
上記の式(X)及び(XI)中のアルキル基、アミノアシル基及びフェニル基の置換基については、式(I)について述べたことと同様である。上記の式(X)及び(XI)において、R1とR8とが互いに結合して形成されるベンゼン環、及び、R6とR7とが互いに結合して形成されるベンゼン環は、置換基を有してもよい。置換基としては、例えば-CN、-COOH、-NH2、-NO2、-OH、-SH、炭素数１～18のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアルキルアミノ基、炭素数１～６のアシルアミノ基、ハロゲン及び炭素数１～６のハロアルキル基が挙げられる。上記の式(X)及び(XI)中のカウンターイオンＸ-は、例えばＦ-、Cl-、Br-、Ｉ-、CF3SO3
-、BF4
-、ClO4
-、ZnCl4
2-、酢酸イオンなどが挙げられる。
【0079】
クマリン系化合物の蛍光色素としては、例えば、上記の式(XII)で表される蛍光色素が挙げられる。上記の式(XII)で表される蛍光色素は、第１波長の光によって励起可能な蛍光色素であり得る。上記の式(XII)中のアルキル基、アミノアシル基及びフェニル基の置換基については、式(I)について述べたことと同様である。R3及び／又はR4が、Ｎが結合しているベンゼン環と共に形成する複素環については、式(VII)及び(IX)について述べたことと同様である。R1とR2とが互いに結合して形成される環は、脂肪族環でもよいし、芳香族環でもよい。このましくは、脂肪族の五員環である。R2が、ベンゾイミダゾール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環又はピリジン環である場合、これらの環は置換基を有してもよい。置換基としては、例えば炭素数１～３のアルキル基が挙げられる。
【0080】
染色試薬は、蛍光色素の溶液を含むことが好ましい。溶媒は、上記の蛍光色素を溶解できれば特に限定されない。例えば、水、有機溶媒、及びそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、水に混合可能な溶媒が好ましく、例えば炭素数１～６のアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)などが挙げられる。染色試薬中の蛍光色素の濃度は、蛍光色素の種類に応じて適宜決定できる。蛍光色素の濃度は、例えば100 ppm以上、好ましくは500 ppm以上、より好ましく1000 ppm以上であり得る。蛍光色素の濃度は、例えば100000 ppm以下、好ましくは50000 ppm以下、より好ましく10000 ppm以下であり得る。
【0081】
上記のとおり、蛍光色素自体が細胞の核酸と結合するので、本実施形態の血球分析方法では、蛍光色素で標識した抗体を用いて細胞を染色する必要がない。よって、本実施形態の血球分析方法では、蛍光色素は抗体を含まない。
【0082】
上記の蛍光色素を含む染色試薬は、本実施形態の血球分析方法に用いられる血球分析用試薬として提供されてもよい。本実施形態の血球分析用試薬は、例えば、上記の蛍光色素の溶液が容器に収容された形態であり得る。図９を参照して、１１は、本実施形態の血球分析用試薬が収容された容器を示す。容器１１が梱包箱に収容される場合は、血球分析用試薬の組成、使用方法、保存方法などが記載された添付文書、外部からの衝撃を低減させるための緩衝材なども収容されてもよい。
【0083】
さらなる実施形態は、血球分析用試薬の製造のための蛍光色素の使用に関する。蛍光色素及び血球分析用試薬の詳細は上記のとおりである。
【0084】
(測定試料の調製)
蛍光色素は、測定試料中の濃度(終濃度)が所定の範囲内の濃度となるように、検体及び希釈試薬と混合される。測定試料中の蛍光色素の好ましい終濃度は500 ppm以下、より好ましくは100 ppm以下、さらに好ましくは50 ppm以下である。測定試料中の蛍光色素の好ましい終濃度は0.01 ppm以上、より好ましくは0.1 ppm以上、さらに好ましくは１ppm以上である。
蛍光色素は、測定試料中の濃度(終濃度)が所定の範囲内の濃度となるように、検体及び希釈試薬と混合される。測定試料中の蛍光色素の好ましい終濃度は500 ppm以下、より好ましくは100 ppm以下、さらに好ましくは50 ppm以下である。測定試料中の蛍光色素の好ましい終濃度は0.01 ppm以上、より好ましくは0.1 ppm以上、さらに好ましくは１ppm以上である。
【0085】
希釈試薬と染色試薬と検体の混合比は、染色試薬中の蛍光色素の濃度や検体の種類に応じて適宜決定できる。希釈試薬と染色試薬と検体の混合比は、例えば、体積比で表して1000：0.1以上：１以上が好ましい。より好ましくは1000：0.5以上：５以上であり、さらに好ましくは1000：１以上：10以上である。また、希釈試薬と染色試薬と検体の混合比は、例えば、体積比で表して、1000：50以下：100以下であることが好ましい。より好ましくは1000：30以下：50以下であり、さらに好ましくは1000：20以下：25以下である。染色試薬と検体との混合比は同一でもよいし、異なっていてもよい。
【0086】
上記のとおり、本実施形態の血球分析方法は、溶血試薬を用いずに有核赤血球の検出を可能とする。よって、本実施形態の血球分析方法では、測定試料は溶血試薬を含まない。すなわち、本実施形態の血球分析方法では、測定試料の調製において、成熟赤血球を溶血する工程を含まない。ここで、溶血試薬とは、検体と混合することにより、当該検体中の成熟赤血球を溶解するための試薬である。溶血試薬自体は公知であり、例えば、成熟赤血球を溶解可能な濃度で界面活性剤が含まれている。
【0087】
(実施形態１の分析処理)
図７のステップＳ１３に関して、実施形態１の分析処理の例を、図１０Ａ～図１３を参照して説明するが、この例に限定されない。この例では、第１散乱光情報として、第１側方散乱光強度(以下、「SSC-1強度」ともいう)を用いる。また、第２散乱光情報として、第２前方散乱光強度(以下、「FSC-2強度」ともいう)及び第２側方散乱光強度(以下、「SSC-2強度」ともいう)を用いる。また、蛍光情報として、第１側方蛍光強度(以下、「SFL-1強度」ともいう)を用いる。
図７のステップＳ１３に関して、実施形態１の分析処理の例を、図１０Ａ～図１３を参照して説明するが、この例に限定されない。この例では、第１散乱光情報として、第１側方散乱光強度(以下、「SSC-1強度」ともいう)を用いる。また、第２散乱光情報として、第２前方散乱光強度(以下、「FSC-2強度」ともいう)及び第２側方散乱光強度(以下、「SSC-2強度」ともいう)を用いる。また、蛍光情報として、第１側方蛍光強度(以下、「SFL-1強度」ともいう)を用いる。
【0088】
図１０Ａを参照して、この分析処理では、まず、測定試料中の粒子から有核細胞の集団を特定する。本実施形態の血球分析方法では、溶血試薬を用いないので、測定試料には成熟赤血球が含まれる。すなわち、測定ユニット４００から取得したデータには、成熟赤血球の光学的情報が含まれる。この分析処理では、測定試料中の粒子を、蛍光情報に基づいて、有核細胞の集団と、成熟赤血球などの核及び核酸を含まない粒子集団とに分類することにより、有核細胞の集団を特定する。有核細胞は核酸量が多く、上記の蛍光色素により強く染色される。一方、成熟赤血球、血小板及びデブリなどの核及び核酸を含まない細胞や粒子は、上記のとおり蛍光色素ではほとんど染色されないか又は弱く染色される。よって、有核細胞の集団と、核及び核酸を含まない粒子集団とを、蛍光情報の差異に基づいて弁別できる。
【0089】
蛍光情報に基づく有核細胞の集団の特定は、例えば、スキャッタグラムを用いた分析により行うことができる。以下、有核細胞の集団を特定するためのスキャッタグラムを「第１スキャッタグラム」とも呼ぶ。第１スキャッタグラムは、第１又は第２散乱光情報と、蛍光情報とに基づいて作成される。例えば、第１スキャッタグラムは、横軸に第１又は第２散乱光情報をとり、縦軸に蛍光情報をとる。図１０Ａを参照して、ステップＳ１０１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムを作成する。そして、この第１スキャッタグラムにおいて、各粒子に対応する点の位置を決定する。この例では、第１スキャッタグラムは、横軸にSSC-1強度をとり、縦軸にSFL-1強度をとる。しかし、この例に限定されない。第１スキャッタグラムの散乱光情報は、FSC-2強度、SSC-2強度又はFSC-1強度であってもよい。蛍光情報はSFL-2強度であってもよい。必要に応じて、第１スキャッタグラムの蛍光強度をとる軸を対数で表示してもよい。蛍光強度を対数で表示することで、第１スキャッタグラム上において、有核細胞の集団と、成熟赤血球、血小板及びデブリなどを含む集団との距離が大きくなる。これにより、スキャッタグラム上で有核細胞の集団を特定しやすくなる。
【0090】
図１０Ａを参照して、ステップＳ１０２において、分析ユニット３００は、測定試料中の粒子を、蛍光強度に基づいて、第１の粒子集団と、第２の粒子集団とに分類する。第２の粒子集団は、第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す集団である。図１１を参照して、第１スキャッタグラムでは、第１の粒子集団と、この第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す第２の粒子集団とが出現する。第２の粒子集団は、破線で囲まれた領域内の粒子から構成される集団である。ここで、スキャッタグラムにおける粒子集団間の蛍光強度の比較は、例えば、各粒子集団の蛍光強度の統計的代表値により行うことができる。一の粒子集団の蛍光強度の統計的代表値は、当該粒子集団を構成する粒子の蛍光強度から取得される値であり、例えば中央値、平均値、最頻値などが挙げられる。好ましくは中央値である。粒子集団の蛍光強度の統計的代表値は、分析ユニット３００により算出される。
【0091】
上述のとおり、成熟赤血球、血小板及びデブリなどの核及び核酸を含まない粒子は、有核細胞に比べて、蛍光色素により染色されにくいので、蛍光強度が低くなる。よって、図１１に示されるように、第１の粒子集団には、成熟赤血球(RBC)、血小板(PLT)及びデブリなどが含まれる。また、第２の粒子集団には、有核細胞が含まれる。具体的には、第２の粒子集団には、有核赤血球(NRBC)の集団及び白血球(WBC)の集団が含まれる。このように、第１スキャッタグラムでは、測定試料中の粒子が、成熟赤血球を含む第１の粒子集団と、有核細胞を含む第２の粒子集団とに分類される。なお、図１１では、白血球の集団が２つあるが、これはSSC-1強度に応じて白血球が亜集団を形成したことを表している。しかし、この例に限定されず、第１スキャッタグラム上に、白血球の集団として１つの集団が出現してもよいし、３つの集団が出現してもよい。
【0092】
図１０Ａを参照して、ステップＳ１０３において、分析ユニット３００は、第２の粒子集団を有核細胞の集団として特定する。上記のとおり、第２の粒子集団は有核細胞を含むので、第２の粒子集団を有核細胞の集団として特定できる。例えば、複数の検体についての測定データを蓄積することにより、第１スキャッタグラムにおいて第２の粒子集団が出現する領域を予め決定して、当該領域に出現した粒子を、有核細胞の集団として特定してもよい。
【0093】
ステップＳ１０３において、有核細胞の集団が特定されたことにより、測定試料中の粒子のデータから、成熟赤血球などの核及び核酸を含まない粒子のデータが除外される。必要に応じて、有核細胞の集団に含まれる細胞を計数してもよい。
【0094】
図１０Ｂを参照して、プロセスは、ステップＳ２０１へ進行する。この分析処理では、有核細胞の集団から有核赤血球及び白血球を特定する。検体に有核赤血球が含まれない場合は、白血球を特定する。この分析処理では、有核細胞の各粒子を、第１及び第２散乱光情報に基づいて、有核赤血球の集団と、白血球の集団とに分類することにより、有核赤血球及び白血球を特定する。ここで、有核赤血球に含まれるヘモグロビンは、青紫色の光を吸収することが知られている。青紫色の光に相当する第１波長の光を有核赤血球に照射すると、有核赤血球から生じた散乱光は、赤色の光に相当する第２波長の光を照射したときに生じる散乱光に比べて弱くなる。そのため、従来、血球分析には赤色の光が好ましく用いられていた。一方、白血球に第１波長の光と第２波長の光とを照射したとき、発生する散乱光の強度に差異はほとんど認められない。本発明者らは、上記の現象を利用して、有核赤血球の集団と白血球の集団とを弁別することを着想した。具体的には、第１波長の光を照射することにより、有核赤血球と白血球との間で第１散乱光情報に差異を生じさせる。例えば、第１散乱光情報がSSC-1強度である場合、有核赤血球のSSC-1強度は、ヘモグロビンによる吸収のため低くなる。しかし、白血球のSSC-1強度は影響されない。そのため、有核赤血球と白血球との間でSSC-1強度の差が大きくなる。本発明者らは、第１散乱光情報と第２散乱光情報とを組み合わせることにより、スキャッタグラム上で有核赤血球の集団と白血球の集団とを分離できることを明らかにした。
【0095】
第１及び第２散乱光情報に基づく有核赤血球の特定は、例えば、スキャッタグラムを用いた分析により行うことができる。以下、有核赤血球を特定するためのスキャッタグラムを「第２スキャッタグラム」とも呼ぶ。第２スキャッタグラムは、第１散乱光情報と第２散乱光情報とに基づいて作成される。例えば、第２スキャッタグラムは、横軸に第１側方散乱光情報又は第１前方散乱光情報をとり、縦軸に第２前方散乱光情報又は第２側方散乱光情報をとる。図１０Ｂを参照して、ステップＳ２０１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、第１散乱光情報及び第２散乱光情報を二軸とする第２スキャッタグラムを作成する。そして、この第２スキャッタグラムにおいて、各粒子に対応する点の位置を決定する。この例では、第２スキャッタグラムは、横軸にSSC-1強度をとり、縦軸にFSC-2強度をとる。しかし、この例に限定されず、第２スキャッタグラムの第１散乱光情報はFSC-1強度であってもよく、第２散乱光情報はSSC-2強度であってもよい。必要に応じて、第２スキャッタグラムの第１散乱光情報をとる軸を対数で表示してもよい。第１散乱光情報を対数で表示することで、第２スキャッタグラム上において、有核赤血球の集団と、白血球の集団との距離が大きくなる。これにより、スキャッタグラム上で有核赤血球の集団を特定しやすくなる。
【0096】
図１０Ｂを参照して、ステップＳ２０２において、分析ユニット３００は、有核細胞の集団中の粒子を、SSC-1強度に基づいて、第３の粒子集団と、第４の粒子集団とに分類する。第４の粒子集団は、第３の粒子集団よりも高いSSC-1強度を示す集団である。ここで、第２スキャッタグラムにおける粒子集団間の側方散乱光強度の比較は、例えば、各粒子集団の側方散乱光強度の統計的代表値により行うことが好ましい。一の粒子集団の散乱光強度の統計的代表値は、当該粒子集団を構成する粒子の散乱光強度から取得される値であり、例えば中央値、平均値、最頻値などが挙げられる。好ましくは中央値である。図１２を参照して、検体に有核赤血球が含まれる場合、第２スキャッタグラムでは、第３の粒子集団と、この第３の粒子集団よりも高いSSC-1強度を示す第４の粒子集団とが出現する。上述のとおり、有核赤血球のヘモグロビンが第１波長の光を吸収するので、有核赤血球のSSC-1強度が低くなる。そのため、第２スキャッタグラムにおいて、有核赤血球の集団は、SSC-1強度が低い側の領域に出現する。よって、図１２に示されるように、第３の粒子集団は、有核赤血球(NRBC)の集団である。一方、白血球にはヘモグロビンがないので、第１波長の光は吸収されない。そのため、第２スキャッタグラムにおいて、白血球の集団は、有核赤血球の集団よりSSC-1強度が高い側の領域に出現する。よって、第４の粒子集団は、白血球の集団である。このように、第２スキャッタグラムでは、有核細胞の集団中の粒子が、有核赤血球の集団と、白血球の集団とに分類される。
【0097】
図１０Ｂを参照して、ステップＳ２０３において、分析ユニット３００は、第３の粒子集団を有核赤血球として特定し、第４の粒子集団を白血球と特定する。例えば、複数の検体についての測定データを蓄積することにより、第２スキャッタグラムにおいて第３及び第４の各粒子集団が出現する領域を予め決定して、当該領域に出現した粒子を、有核赤血球の集団及び白血球の集団として特定してもよい。必要に応じて、有核赤血球の集団及び白血球の集団のそれぞれに含まれる細胞を計数してもよい。プロセスは、ステップＳ２０４へ進行する。
【0098】
ステップＳ２０４において、分析ユニット３００は、第１及び第２散乱光情報に基づいて、白血球の集団を、リンパ球、単球及び顆粒球の各亜集団に分類する。ここで、顆粒球とは、好中球、好酸球及び好塩基球の総称である。第１及び第２散乱光情報は、例えば、SSC-1強度又はFSC-1強度と、FSC-2強度又はSSC-2強度との組み合わせを用いることができる。図１３を参照して、白血球の各亜集団が第２スキャッタグラム上に分布する。この図では、白血球は、リンパ球(Lym)の亜集団、単球(Mono)の亜集団及び顆粒球(Gran)亜集団の３つに分類されているが、これに限定されない。有核赤血球が出現する検体では、白血球にも異常がある場合が知られている。例えば、白血球の亜集団の一部が、分類が困難なほどに減少することがある。白血球は、例えば、リンパ球又は単球の集団と、顆粒球の集団との２つに分類されてもよい。
【0099】
白血球の亜集団への分類は、例えば、複数の検体についての測定データを蓄積することにより、第２スキャッタグラムにおいて白血球の各亜集団が出現する領域を予め決定して、当該領域に出現した粒子を、白血球の亜集団として特定してもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。白血球の分類を実行した後、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。
【0100】
(実施形態１の変型例)
実施形態１の変形例では、第１スキャッタグラムを作成せずに、蛍光強度についての閾値を用いて、測定試料中の粒子から第２の粒子集団を特定する。例えば、まず、蛍光強度について、第１の粒子集団と第２の粒子集団とを区別可能な閾値を決定する。そして、測定試料中の粒子から、その閾値より高い蛍光強度を示す粒子を抽出し、当該粒子を第２の粒子集団として特定する。
実施形態１の変形例では、第１スキャッタグラムを作成せずに、蛍光強度についての閾値を用いて、測定試料中の粒子から第２の粒子集団を特定する。例えば、まず、蛍光強度について、第１の粒子集団と第２の粒子集団とを区別可能な閾値を決定する。そして、測定試料中の粒子から、その閾値より高い蛍光強度を示す粒子を抽出し、当該粒子を第２の粒子集団として特定する。
【0101】
実施形態１のさらなる変形例では、第１スキャッタグラムを作成せずに、蛍光強度についてのヒストグラムを用いて、測定試料中の粒子から第２の粒子集団を特定する。例えば、まず、測定試料中の粒子について、蛍光強度及び粒子数に基づくヒストグラムを作成する。このヒストグラムには、有核細胞の集団に対応するピークが、蛍光強度が高い側に出現する(後述の実施例２参照)。このピークに含まれる粒子を抽出し、当該粒子を第２の粒子集団として特定してもよい。あるいは、このヒストグラムにおいて、上記の閾値より高い蛍光強度を示す粒子を抽出し、当該粒子を第２の粒子集団として特定してもよい。
【0102】
(実施形態２の分析処理)
図７のステップＳ１３に関して、実施形態２の分析処理の例を、図１４及び１５を参照して説明するが、この例に限定されない。上述のとおり、実施形態２の分析処理では、有核細胞の集団を特定する前に、測定試料中の粒子から血小板を除外することにより、血小板を除く粒子集団を特定する。例えば、血小板が増加した検体などを分析する場合は、測定試料中の粒子から予め血小板を除くことで、有核赤血球がより精度よく検出され得る。ここで、血小板は、他の血球に比べてサイズが小さい。よって、血小板の集団と、血小板を除く粒子集団とを、前方散乱光情報の差異に基づいて弁別できる。これは、前方散乱光情報が、粒子の大きさを反映する情報であることによる。血小板を除く粒子集団には、例えば成熟赤血球、有核赤血球及び白血球などが含まれる。
図７のステップＳ１３に関して、実施形態２の分析処理の例を、図１４及び１５を参照して説明するが、この例に限定されない。上述のとおり、実施形態２の分析処理では、有核細胞の集団を特定する前に、測定試料中の粒子から血小板を除外することにより、血小板を除く粒子集団を特定する。例えば、血小板が増加した検体などを分析する場合は、測定試料中の粒子から予め血小板を除くことで、有核赤血球がより精度よく検出され得る。ここで、血小板は、他の血球に比べてサイズが小さい。よって、血小板の集団と、血小板を除く粒子集団とを、前方散乱光情報の差異に基づいて弁別できる。これは、前方散乱光情報が、粒子の大きさを反映する情報であることによる。血小板を除く粒子集団には、例えば成熟赤血球、有核赤血球及び白血球などが含まれる。
【0103】
図１４を参照して、実施形態２の分析処理では、実施形態１のステップＳ１０１～Ｓ１０３を実行する前に、ステップＳ３０１～Ｓ３０３を実行して、測定試料中の粒子から血小板を除外することにより、血小板を除く粒子集団を特定する。そして、実施形態１のステップＳ１０１～Ｓ１０３に替えて、ステップＳ３０４～Ｓ３０６を実行して、血小板を除く粒子集団から有核細胞の集団を特定する。
【0104】
前方散乱光情報に基づく、血小板を除く粒子集団の特定は、例えば、スキャッタグラムを用いた分析により行うことができる。以下、血小板を除く粒子集団を特定するためのスキャッタグラムを「第３スキャッタグラム」とも呼ぶ。第３スキャッタグラムは、前方散乱光情報と、側方散乱光情報又は蛍光情報とに基づいて作成される。例えば、第３スキャッタグラムは、横軸に第１側方散乱光情報、第１蛍光情報、第２側方散乱光情報又は第２蛍光情報をとり、縦軸に第１又は第２前方散乱光情報をとる。図１４を参照して、ステップＳ３０１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、側方散乱光強度又は蛍光強度と、前方散乱光強度とを二軸とする第３スキャッタグラムを作成する。そして、この第３スキャッタグラムにおいて、各粒子に対応する点の位置を決定する。この例では、第３スキャッタグラムは、横軸にSSC-2強度をとり、縦軸にFSC-2強度をとる。しかし、この例に限定されず、第３スキャッタグラムの前方散乱光情報はFSC-1強度であってもよい。また、SSC-2強度に替えて、SSC-1強度、SFL-1強度又はSFL-2強度を用いてもよい。必要に応じて、第３スキャッタグラムの横軸及び／又は縦軸を対数で表示してもよい。スキャッタグラムの横軸及び／又は縦軸の光学的情報を対数で表示することで、第３スキャッタグラムにおいて、血小板の集団と、血小板を除く粒子集団との距離が大きくなる。これにより、スキャッタグラム上で、血小板を除く粒子集団を特定しやすくなる。
【0105】
図１４を参照して、ステップＳ３０２において、分析ユニット３００は、測定試料中の粒子を、前方散乱光強度に基づいて、第５の粒子集団と、第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す第６の粒子集団とに分類する。図１５を参照して、第３スキャッタグラムでは、第５の粒子集団が、前方散乱光強度が低い側の領域に出現する。また、第６の粒子集団が、前方散乱光強度が高い側の領域に出現する。上述のとおり、血小板は、他の血球よりもサイズが小さいので、前方散乱光強度が低くなる。よって、図１５に示されるように、第５の粒子集団は、血小板(PLT)の集団である。また、第５の粒子集団よりも高い前方散乱光強度を示す第６の粒子集団は、血小板を除く粒子集団である。このように、第３スキャッタグラムでは、測定試料中の粒子が、血小板の粒子集団と、血小板を除く粒子集団とに分類される。
【0106】
図１４を参照して、ステップＳ３０３において、分析ユニット３００は、第６の粒子集団を、血小板を除く粒子集団として特定する。例えば、複数の検体についての測定データを蓄積することにより、第３スキャッタグラムにおいて第６の粒子集団が出現する領域を予め決定して、当該領域に出現した粒子を、有核細胞の集団として特定してもよい。
【0107】
なお、図１５では、血小板を除く粒子集団が１つであるが、この例に限定されない。例えば、第３スキャッタグラムとして、SSC-1強度及びFSC-2強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した場合、血小板を除く粒子集団が２つ以上に分離し得る。これは、血小板を除く粒子集団中の成熟赤血球及び有核赤血球は、ヘモグロビンを含むことにより、SSC-1強度が低下することによる。そのため、血小板を除く粒子集団は、成熟赤血球及び有核赤血球を含む集団と、白血球を含む集団とに分離し得る。また、白血球の集団も、SSC-1強度に応じて亜集団に分離し得る。さらに、第３スキャッタグラムとして、FSC-2強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した場合、血小板を除く粒子集団は３つに分離し得る。具体的には、検体に有核赤血球が含まれる場合、蛍光強度に応じて、血小板を除く粒子集団は、成熟赤血球を含む集団、有核赤血球を含む集団、及び白血球を含む集団に分離し得る。
【0108】
図１４を参照して、ステップＳ３０４において、分析ユニット３００は、第６の粒子集団の光学的情報に基づいて、横軸に散乱光強度をとり、縦軸に蛍光強度とった第１スキャッタグラムを作成する。そして、この第１スキャッタグラムにおいて、各粒子に対応する点の位置を決定する。ステップＳ３０５において、分析ユニット３００は、第６の粒子集団中の粒子を、蛍光強度に基づいて、第１の粒子集団と、第１の粒子集団よりも高い蛍光強度を示す第２の粒子集団とに分類する。ステップＳ３０４及びＳ３０５については、測定試料中の粒子の光学的情報に替えて、第６の粒子集団の光学的情報を用いたこと以外は、ステップＳ１０１及びＳ１０２と同様である。ステップＳ４０６において、分析ユニット３００は、ステップＳ１０３と同様にして、第２の粒子集団を有核細胞の集団として特定する。そして、プロセスは、図１０ＢのステップＳ２０１へ進行する。以降の分析については、実施形態１で述べたことと同様である。
【0109】
(分析結果の出力)
図７を参照して、上記の実施形態１又は２の分析処理を終了すると、制御部３０１は、ステップＳ１４において、分析結果を表示部３０５に出力して、処理を終了する。表示部３０５に出力される分析結果画面は、例えば、有核赤血球の数、白血球の数、白血球の各亜集団(リンパ球、単球及び顆粒球)の数を含んでもよい。また、画面は、これらの情報に加えて、光学的情報に基づいて作成したスキャッタグラムを含んでもよい。さらに、画面は、分析結果に基づくフラグを含んでもよい。例えば、有核赤血球が特定された場合、検体に有核赤血球が存在することを示す情報を出力してもよい。例えば、表示部３０５に「NRBC?」というフラグを出力してもよい。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、有核赤血球の不存在を示す情報であり得る。
図７を参照して、上記の実施形態１又は２の分析処理を終了すると、制御部３０１は、ステップＳ１４において、分析結果を表示部３０５に出力して、処理を終了する。表示部３０５に出力される分析結果画面は、例えば、有核赤血球の数、白血球の数、白血球の各亜集団(リンパ球、単球及び顆粒球)の数を含んでもよい。また、画面は、これらの情報に加えて、光学的情報に基づいて作成したスキャッタグラムを含んでもよい。さらに、画面は、分析結果に基づくフラグを含んでもよい。例えば、有核赤血球が特定された場合、検体に有核赤血球が存在することを示す情報を出力してもよい。例えば、表示部３０５に「NRBC?」というフラグを出力してもよい。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、有核赤血球の不存在を示す情報であり得る。
【0110】
このように本実施形態の血球分析方法は、医師や検査技師などの医療従事者に対して、有核細胞の分析結果として、検体に有核赤血球が含まれるか否か、含まれる場合はその数についての情報を提供できる。また、白血球についての分析結果も提供できる。医療従事者は、取得した分析結果から、例えば、検体についてさらに検査を行うか否かを決定できる。上述の測定試料の調製及び検体の分析はすべてインビトロで行われる。
【0111】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例0112】
以下の各実施例では、下記の血液検体、希釈試薬、染色試薬及び分析装置を用いて本実施形態の血球分析方法を行った。詳細は、以下の［測定方法］に記載したとおりである。
【0113】
［血液検体］
複数の健常者から得た末梢血を、正常検体として用いた。また、有核赤血球が含まれることが既知である複数の全血検体を、異常検体として用いた。
複数の健常者から得た末梢血を、正常検体として用いた。また、有核赤血球が含まれることが既知である複数の全血検体を、異常検体として用いた。
【0114】
［希釈試薬］
全血を希釈するための希釈試薬として、セルパック(登録商標)DFL(シスメックス株式会社)を用いた。
全血を希釈するための希釈試薬として、セルパック(登録商標)DFL(シスメックス株式会社)を用いた。
【0115】
［染色試薬］
核酸に結合可能な各種の蛍光色素を、濃度が5000 ppmとなるようにDMSOに溶解して、染色試薬を調製した。使用した蛍光色素の種類は、各実施例において記載した。
核酸に結合可能な各種の蛍光色素を、濃度が5000 ppmとなるようにDMSOに溶解して、染色試薬を調製した。使用した蛍光色素の種類は、各実施例において記載した。
【0116】
［分析装置］
フローサイトメータXF-1600(シスメックス株式会社)を改造した試作機を分析装置として用いた。試作機は次のようにして作製した。XF-1600は、青紫色(405 nm)の光、青色(488 nm)の光及び赤色(638 nm)の光のそれぞれを発する３つの半導体レーザ光源と、各色の散乱光の検出器と、各光によって励起された蛍光の検出器とを有していた。このXF-1600から青色(488 nm)の光を発する半導体レーザ光源を取り外して、２つの半導体レーザ光源を備えたFCM系に改造した。当該分析装置のＦＣＭ検出部は図４の構成を有していた。当該分析装置は、試料調製部４４０を備えず、吸引管２００によって吸引した試料を吸引管２００とフローセル４１３をつなぐ送液管を介して送液する点を除いて、図２及び図３に示される測定ユニットと同じ構成を有していた。
フローサイトメータXF-1600(シスメックス株式会社)を改造した試作機を分析装置として用いた。試作機は次のようにして作製した。XF-1600は、青紫色(405 nm)の光、青色(488 nm)の光及び赤色(638 nm)の光のそれぞれを発する３つの半導体レーザ光源と、各色の散乱光の検出器と、各光によって励起された蛍光の検出器とを有していた。このXF-1600から青色(488 nm)の光を発する半導体レーザ光源を取り外して、２つの半導体レーザ光源を備えたFCM系に改造した。当該分析装置のＦＣＭ検出部は図４の構成を有していた。当該分析装置は、試料調製部４４０を備えず、吸引管２００によって吸引した試料を吸引管２００とフローセル４１３をつなぐ送液管を介して送液する点を除いて、図２及び図３に示される測定ユニットと同じ構成を有していた。
【0117】
［測定方法］
セルパックDFL及び上記の染色試薬を用いたことを除いて、測定試料の調製及び測定は、XF-1600に付属のマニュアルに従って行った。測定試料は、40℃に加温したセルパックDFL(1000μL)に染色試薬(2μL)を混合し、さらに全血(15μL)を混合して調製した。測定試料は、40℃で25秒インキュベートした後に測定した。測定試料における染色試薬の希釈倍率は508.5であった。測定試料中の蛍光色素の終濃度は9.83 ppmであった。
セルパックDFL及び上記の染色試薬を用いたことを除いて、測定試料の調製及び測定は、XF-1600に付属のマニュアルに従って行った。測定試料は、40℃に加温したセルパックDFL(1000μL)に染色試薬(2μL)を混合し、さらに全血(15μL)を混合して調製した。測定試料は、40℃で25秒インキュベートした後に測定した。測定試料における染色試薬の希釈倍率は508.5であった。測定試料中の蛍光色素の終濃度は9.83 ppmであった。
【0118】
実施例１：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析
蛍光色素としてアクリジンイエロー(3,6-Diamino-2,7-dimethylacridinium)を含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置により当該測定試料中の有核赤血球及び白血球を分類した。アクリジンイエローは、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
蛍光色素としてアクリジンイエロー(3,6-Diamino-2,7-dimethylacridinium)を含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置により当該測定試料中の有核赤血球及び白血球を分類した。アクリジンイエローは、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
【0119】
(１) 測定
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、測定試料中の粒子に青紫色レーザを照射して得られた側方散乱光強度(以下、「側方散乱光強度(青紫)」又は「V-SSC」とも呼ぶ)であった。第２散乱光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた前方散乱光強度(以下、「前方散乱光強度(赤)」又は「R-FSC」とも呼ぶ)及び側方散乱光強度(以下、「側方散乱光強度(赤)」又は「R-SSC」とも呼ぶ)であった。蛍光情報は、測定試料中の粒子に青紫色レーザを照射して得られた蛍光強度(以下、「蛍光強度(青紫)」又は「V-SFL」とも呼ぶ)であった。
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、測定試料中の粒子に青紫色レーザを照射して得られた側方散乱光強度(以下、「側方散乱光強度(青紫)」又は「V-SSC」とも呼ぶ)であった。第２散乱光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた前方散乱光強度(以下、「前方散乱光強度(赤)」又は「R-FSC」とも呼ぶ)及び側方散乱光強度(以下、「側方散乱光強度(赤)」又は「R-SSC」とも呼ぶ)であった。蛍光情報は、測定試料中の粒子に青紫色レーザを照射して得られた蛍光強度(以下、「蛍光強度(青紫)」又は「V-SFL」とも呼ぶ)であった。
【0120】
(２) 分析
(2.1) 第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図１６の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。以下、図において、「TNC」は総有核細胞を表す。図１６を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。上記のとおり、有核細胞は、核酸に結合可能な蛍光色素により強く染色されるが、成熟赤血球、血小板及びデブリなどの核及び核酸を含まない細胞や粒子は、当該蛍光色素ではほとんど染色されないか又は弱く染色される。したがって、各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図１６の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞を抽出(ゲーティング)した。
(2.1) 第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図１６の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。以下、図において、「TNC」は総有核細胞を表す。図１６を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。上記のとおり、有核細胞は、核酸に結合可能な蛍光色素により強く染色されるが、成熟赤血球、血小板及びデブリなどの核及び核酸を含まない細胞や粒子は、当該蛍光色素ではほとんど染色されないか又は弱く染色される。したがって、各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図１６の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞を抽出(ゲーティング)した。
【0121】
(2.2) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第２スキャッタグラム上に表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図１７の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。以下、図において、「Gran」は顆粒球を表し、「Mono」は単球を表し、「Lyn」はリンパ球を表し、「NRBC」は有核赤血球を表す。図１７の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図１７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。図１７の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ａ)のスキャッタグラムの方が、白血球が明確に亜集団に分類された。有核赤血球が末梢血に出現するような疾患では、白血球にも異常が生じる症例が多いことが知られている。そのため、異常検体の白血球を亜集団に明確に分類することが難しい場合があり得る。
第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第２スキャッタグラム上に表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図１７の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。以下、図において、「Gran」は顆粒球を表し、「Mono」は単球を表し、「Lyn」はリンパ球を表し、「NRBC」は有核赤血球を表す。図１７の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図１７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。図１７の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ａ)のスキャッタグラムの方が、白血球が明確に亜集団に分類された。有核赤血球が末梢血に出現するような疾患では、白血球にも異常が生じる症例が多いことが知られている。そのため、異常検体の白血球を亜集団に明確に分類することが難しい場合があり得る。
【0122】
上記のとおり、測定試料は、溶血試薬を用いない非溶血条件下で調製されたので、測定試料には赤血球が含まれていた。しかし、第１スキャッタグラムにおいて蛍光強度に基づいて有核細胞をゲーティングしたことにより、成熟赤血球を除外できた。これにより、第２スキャッタグラムでは、成熟赤血球の影響を受けずに、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0123】
(2.3) 別の第２スキャッタグラム(V-SSC/R-SSC)による分析
別の第２スキャッタグラムとして、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に側方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラム上に、第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図１８の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図１８の(Ａ)を参照して、正常血液では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図１７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。第２スキャッタグラムの縦軸をR-FSCからR-SSCに変更しても、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
別の第２スキャッタグラムとして、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に側方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラム上に、第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図１８の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図１８の(Ａ)を参照して、正常血液では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図１７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。第２スキャッタグラムの縦軸をR-FSCからR-SSCに変更しても、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0124】
実施例２：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析(２)
実施例２では、第１スキャッタグラムに替えて、蛍光強度についてのヒストグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例２で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
実施例２では、第１スキャッタグラムに替えて、蛍光強度についてのヒストグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例２で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
【0125】
(１) 測定
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
【0126】
(２) 分析
(2.1) ヒストグラム(V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に蛍光強度(青紫)をとり、縦軸に粒子数(Count)をとったヒストグラムを作成した。正常検体及び異常検体についてのヒストグラムをそれぞれ図１９の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図１９を参照して、いずれの検体のヒストグラムにおいても、右側(蛍光強度が高値の側)にピークが認められた。また、各ヒストグラムの左側(蛍光強度が低値の側)に多数の粒子が認められた。各ヒストグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の粒子(図中、横線で示した範囲内の粒子)を、有核細胞として特定した。図１９の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のヒストグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各ヒストグラムで特定した有核細胞を抽出した。
(2.1) ヒストグラム(V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に蛍光強度(青紫)をとり、縦軸に粒子数(Count)をとったヒストグラムを作成した。正常検体及び異常検体についてのヒストグラムをそれぞれ図１９の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図１９を参照して、いずれの検体のヒストグラムにおいても、右側(蛍光強度が高値の側)にピークが認められた。また、各ヒストグラムの左側(蛍光強度が低値の側)に多数の粒子が認められた。各ヒストグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の粒子(図中、横線で示した範囲内の粒子)を、有核細胞として特定した。図１９の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のヒストグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各ヒストグラムで特定した有核細胞を抽出した。
【0127】
(2.2) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ヒストグラムから抽出した有核細胞を、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第２スキャッタグラム上に表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図２０の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２０の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図２０の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第１スキャッタグラムに替えて、蛍光強度のヒストグラムを用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、ヒストグラムにより特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ヒストグラムから抽出した有核細胞を、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第２スキャッタグラム上に表示した。正常検体及び異常検体についての第２スキャッタグラムをそれぞれ図２０の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２０の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図２０の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第１スキャッタグラムに替えて、蛍光強度のヒストグラムを用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、ヒストグラムにより特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0128】
実施例３：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析(３)
実施例３では、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例３で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
実施例３では、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例３で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
【0129】
(１) 測定
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)及び側方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)及び側方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
【0130】
(２) 分析
(2.1) 第１スキャッタグラム(R-SSC/V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図２１の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２１を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図２１の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
(2.1) 第１スキャッタグラム(R-SSC/V-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図２１の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２１を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図２１の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0131】
(2.2) 別の第１スキャッタグラム(R-FSC/V-SFL)による分析
別の第１スキャッタグラムとして、横軸に前方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図２２の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２２の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
別の第１スキャッタグラムとして、横軸に前方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に蛍光強度(青紫)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図２２の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２２の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0132】
(2.3) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
図２１の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図２３の第２スキャッタグラム上に表示した。図２２の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図２４の第２スキャッタグラム上に表示した。図２３及び２４の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図２３及び２４の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図２３及び２４の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第１スキャッタグラムの横軸をV-SSCからR-SSC又はR-FSCに変更しても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
図２１の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図２３の第２スキャッタグラム上に表示した。図２２の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図２４の第２スキャッタグラム上に表示した。図２３及び２４の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図２３及び２４の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図２３及び２４の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第１スキャッタグラムの横軸をV-SSCからR-SSC又はR-FSCに変更しても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0133】
実施例４：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析(４)
実施例４では、第１スキャッタグラムによる分析の前に、各種の第３スキャッタグラムに基づいて、測定試料中の粒子から血小板を除外した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例４で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
実施例４では、第１スキャッタグラムによる分析の前に、各種の第３スキャッタグラムに基づいて、測定試料中の粒子から血小板を除外した。それ以外は実施例１と同様にして、アクリジンイエローを含む染色試薬を用いて測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例４で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。
【0134】
(１) 測定
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)及び側方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)及び側方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。
【0135】
(２) 分析
(2.1) 第３スキャッタグラム(R-SSC/R-FSC)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第３スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２５の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２５を参照して、いずれの検体においても、高い前方散乱光強度を示す集団と、当該集団よりも前方散乱光強度が低い集団とが認められた。ここで、前方散乱光強度は、粒子の大きさを反映する反映するパラメータであることが知られている。血小板は他の血球に比べてサイズが小さく、FCM測定において前方散乱光強度が小さくなることが知られている。したがって、各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
(2.1) 第３スキャッタグラム(R-SSC/R-FSC)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった第３スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２５の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図２５を参照して、いずれの検体においても、高い前方散乱光強度を示す集団と、当該集団よりも前方散乱光強度が低い集団とが認められた。ここで、前方散乱光強度は、粒子の大きさを反映する反映するパラメータであることが知られている。血小板は他の血球に比べてサイズが小さく、FCM測定において前方散乱光強度が小さくなることが知られている。したがって、各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
【0136】
(2.2) 別の第３スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
別の第３スキャッタグラムとして、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２６の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
別の第３スキャッタグラムとして、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２６の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
【0137】
(2.3) 別の第３スキャッタグラム(V-SFL/R-FSC)による分析
さらに別の第３スキャッタグラムとして、横軸に蛍光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２７の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。上述のとおり、血小板は無核の細胞であるので、蛍光色素により比較的弱く染色されることが知られている。したがって、各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値且つ蛍光強度(青紫)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
さらに別の第３スキャッタグラムとして、横軸に蛍光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとったスキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第３スキャッタグラムをそれぞれ図２７の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。上述のとおり、血小板は無核の細胞であるので、蛍光色素により比較的弱く染色されることが知られている。したがって、各スキャッタグラムにおいて、前方散乱光強度(赤)が低値且つ蛍光強度(青紫)が低値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、血小板として特定した。各第３スキャッタグラムにおいて特定した血小板を、測定試料中の粒子から除外して、血小板を除く粒子を特定した。
【0138】
(2.4) 第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
図２５の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図２８の第１スキャッタグラム上に表示した。図２６の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図２９の第１スキャッタグラム上に表示した。図２７の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図３０の第１スキャッタグラム上に表示した。図２８～３０の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図２８～３０を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。図１６と図２８～３０とを比較すると、血小板が除外されているので、図２８～３０では、蛍光強度が低い集団の粒子数は減少した。各第１スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
図２５の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図２８の第１スキャッタグラム上に表示した。図２６の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図２９の第１スキャッタグラム上に表示した。図２７の第３スキャッタグラムで特定した血小板を除く粒子を、図３０の第１スキャッタグラム上に表示した。図２８～３０の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図２８～３０を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。図１６と図２８～３０とを比較すると、血小板が除外されているので、図２８～３０では、蛍光強度が低い集団の粒子数は減少した。各第１スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0139】
(2.5) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
図２８の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３１の第２スキャッタグラム上に表示した。図２９の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３２の第２スキャッタグラム上に表示した。図３０の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３３の第２スキャッタグラム上に表示した。図３１～３３の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図３１～３３の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３１～３３の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第３スキャッタグラムに基づいて血小板を除外した測定試料中の粒子から、有核細胞をゲーティングすることにより、第１スキャッタグラムでは、血小板の影響を受けずに、有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
図２８の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３１の第２スキャッタグラム上に表示した。図２９の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３２の第２スキャッタグラム上に表示した。図３０の第１スキャッタグラムでゲーティングした有核細胞を、図３３の第２スキャッタグラム上に表示した。図３１～３３の(Ａ)は正常検体のスキャッタグラムであり、(Ｂ)は異常検体のスキャッタグラムであった。図３１～３３の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３１～３３の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、第３スキャッタグラムに基づいて血小板を除外した測定試料中の粒子から、有核細胞をゲーティングすることにより、第１スキャッタグラムでは、血小板の影響を受けずに、有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0140】
実施例５：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析(５)
実施例５では、実施例１とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてベーシックイエロー９(2,7,9-trimethylacridine-3,6-diamine)を用いた。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ベーシックイエロー９は、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
実施例５では、実施例１とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてベーシックイエロー９(2,7,9-trimethylacridine-3,6-diamine)を用いた。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ベーシックイエロー９は、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
【0141】
(１) 測定及び第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図３４に示す。図３４を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図３４の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図３４に示す。図３４を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図３４の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0142】
(２) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図３５に示す。図３５の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３５の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素をアクリジンイエローからベーシックイエロー９に替えても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図３５に示す。図３５の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３５の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素をアクリジンイエローからベーシックイエロー９に替えても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0143】
実施例６：アクリジン系蛍光色素を用いた血球分析(６)
実施例６では、実施例１及び５とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてブリリアントフォスフィン(3,6-diamino-2,7,10-trimethylacridinium)を用いた。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ブリリアントフォスフィンは、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
実施例６では、実施例１及び５とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてブリリアントフォスフィン(3,6-diamino-2,7,10-trimethylacridinium)を用いた。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ブリリアントフォスフィンは、青紫色レーザで励起されるアクリジン系蛍光色素であった。
【0144】
(１) 測定及び第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図３６に示す。図３６を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図３６の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図３６に示す。図３６を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図３６の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0145】
(２) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図３７に示す。図３７の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素をアクリジンイエローからブリリアントフォスフィンに替えても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図３７に示す。図３７の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図３７の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素をアクリジンイエローからブリリアントフォスフィンに替えても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0146】
比較例：第１又は第２散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラムによる分析
比較例では、実施例６の第１スキャッタグラムで特定した各検体の有核細胞を、第１散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム及び第２散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム上に表示して、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができるかを検討した。
比較例では、実施例６の第１スキャッタグラムで特定した各検体の有核細胞を、第１散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム及び第２散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム上に表示して、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができるかを検討した。
【0147】
実施例６で作成した第１スキャッタグラム(図３６参照)でゲーティングした各検体の有核細胞を、第１散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム上に表示した。この第２スキャッタグラムでは、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に前方散乱光強度(青紫)をとった。これを図３８に示した。また、第２散乱光情報のみに基づく第２スキャッタグラム上に、上記の有核細胞を表示した。この第２スキャッタグラムでは、横軸に側方散乱光強度(赤)をとり、縦軸に前方散乱光強度(赤)をとった。これを図３９に示した。
【0148】
図３８の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核赤血球がほとんど含まれていなかったにもかかわらず、「NRBC？」とのフラグが表示された。これは、リンパ球の集団が、有核赤血球が出現する領域に認められたことにより、リンパ球の集団が有核赤血球として誤って特定されたと考えられる。図３８の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核赤血球が出現する領域と、リンパ球が出現する領域とが重なっていた。そのため、有核赤血球とリンパ球とを区別できなかった。このように、有核赤血球を正確に特定できないので、「NRBC？」とのフラグが表示された。図３９の(Ａ)を参照して、正常検体では、白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。しかし、図３９の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核赤血球が出現する領域と、白血球が出現する領域とが完全に重なっていた。そのため、有核赤血球の特定も白血球の分類もできなかった。このように、第１及び第２散乱光情報のいずれか一方のみでは、有核赤血球の特定及び白血球の分類はできないことが示された。
【0149】
実施例７：シアニン系蛍光色素を用いた血球分析
実施例７では、蛍光色素としてNK-88(3-Ethyl-2-[(3-ethyl-2-benzothiazolinylidene) methyl] benzothiazolium)を用いた。それ以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例７で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。NK-88は、青紫色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素であった。
実施例７では、蛍光色素としてNK-88(3-Ethyl-2-[(3-ethyl-2-benzothiazolinylidene) methyl] benzothiazolium)を用いた。それ以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例７で用いた正常検体及び異常検体は、実施例１と同じであった。NK-88は、青紫色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素であった。
【0150】
(１) 測定及び第１スキャッタグラム(V-SSC/V-SFL)による分析
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図４０に示す。図４０を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４０の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(青紫)であった。各測定試料について、実施例１と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図４０に示す。図４０を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(青紫)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４０の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0151】
(２) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４１に示す。図４１の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４１の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素としてシアニン系蛍光色素のNK-88を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４１に示す。図４１の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４１の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素としてシアニン系蛍光色素のNK-88を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0152】
実施例８：赤色レーザで励起される蛍光色素を用いた血球分析(１)
実施例８では、実施例１とは異なる正常検体を用い、蛍光色素としてNK-321(3-Ethyl-2-〔3-(1-ethyl-4(1H)-quinolylidene)-1-propenyl〕benzothiazolium iodide)を用いた。また、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例８で用いた異常検体は、実施例１と同じであった。NK-321は、赤色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素であった。
実施例８では、実施例１とは異なる正常検体を用い、蛍光色素としてNK-321(3-Ethyl-2-〔3-(1-ethyl-4(1H)-quinolylidene)-1-propenyl〕benzothiazolium iodide)を用いた。また、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。実施例８で用いた異常検体は、実施例１と同じであった。NK-321は、赤色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素であった。
【0153】
(１) 測定
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた蛍光強度(以下、「蛍光強度(赤)」又は「R-SFL」とも呼ぶ)であった。
各測定試料を分析装置により測定して、第１散乱光情報、第２散乱光情報及び蛍光情報を取得した。第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であった。第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であった。蛍光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた蛍光強度(以下、「蛍光強度(赤)」又は「R-SFL」とも呼ぶ)であった。
【0154】
(２) 分析
(2.1) 第１スキャッタグラム(V-SSC/R-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に蛍光強度(赤)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図４２の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図４２を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(赤)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４２の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
(2.1) 第１スキャッタグラム(V-SSC/R-SFL)による分析
各測定試料について、横軸に側方散乱光強度(青紫)をとり、縦軸に蛍光強度(赤)をとった第１スキャッタグラムを作成した。正常検体及び異常検体についての第１スキャッタグラムをそれぞれ図４２の(Ａ)及び(Ｂ)に示す。図４２を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(赤)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４２の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0155】
(2.2) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４３に示す。図４３の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４３の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素として赤色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４３に示す。図４３の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４３の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素として赤色レーザで励起されるシアニン系蛍光色素を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【0156】
実施例９：赤色レーザで励起される蛍光色素を用いた血球分析(２)
実施例９では、実施例１及び８とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてブリリアントクレシルブルーALD(3-methyl-7-amino-10-diethylaminiumylphonoxaxine)を用いた。また、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ブリリアントクレシルブルーALDは、赤色レーザで励起されるフェノキサジン系蛍光色素であった。
実施例９では、実施例１及び８とは異なる正常検体及び異常検体を用い、蛍光色素としてブリリアントクレシルブルーALD(3-methyl-7-amino-10-diethylaminiumylphonoxaxine)を用いた。また、実施例１とは異なる第１スキャッタグラムを用いて、測定試料中の有核細胞を特定した。それら以外は実施例１と同様にして、測定試料を調製し、分析装置による測定及び分析を行った。ブリリアントクレシルブルーALDは、赤色レーザで励起されるフェノキサジン系蛍光色素であった。
【0157】
(１) 測定及び第１スキャッタグラム(V-SSC/R-SFL)による分析
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(赤)であった。各測定試料について、実施例８と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図４４に示す。図４４を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(赤)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４４の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
分析装置により取得した第１散乱光情報は、側方散乱光強度(青紫)であり、第２散乱光情報は、前方散乱光強度(赤)であり、蛍光情報は、蛍光強度(赤)であった。各測定試料について、実施例８と同様に、第１スキャッタグラムを作成した。作成した第１スキャッタグラムを図４４に示す。図４４を参照して、いずれの検体においても、高い蛍光強度を示す集団と、当該集団よりも蛍光強度が低い集団とが認められた。各スキャッタグラムにおいて、蛍光強度(赤)が高値の領域(実線で囲んだ領域)に出現した集団を、有核細胞として特定した。図４４の(Ａ)と(Ｂ)とを比較すると、(Ｂ)のスキャッタグラムの方が、有核細胞数が多かった。これは、異常検体が有核赤血球を含むことを反映した。各第１スキャッタグラムにおいて特定した有核細胞をゲーティングした。
【0158】
(２) 第２スキャッタグラム(V-SSC/R-FSC)による分析
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４５に示す。図４５の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４５の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素として赤色レーザで励起されるフェノキサジン系蛍光色素を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
ゲーティングした有核細胞を、実施例１と同様に、第２スキャッタグラム上に表示した。作成した第２スキャッタグラムを図４５に示す。図４５の(Ａ)を参照して、正常検体では、有核細胞として含まれていた白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。正常検体では、有核赤血球に分類される粒子はほとんど出現しなかった。図４５の(Ｂ)を参照して、異常検体では、有核細胞として含まれていた有核赤血球が特定され、且つ白血球が、リンパ球、単球及び顆粒球に分類された。このように、蛍光色素として赤色レーザで励起されるフェノキサジン系蛍光色素を用いても、測定試料中の粒子から有核細胞を特定できることが示された。また、そのようにして特定された有核細胞から、有核赤血球の特定及び白血球の分類ができることが示された。
【符号の説明】
【0159】
１１ 血球分析用試薬
１００ 採血管
２００ 吸引管
３００ 分析ユニット
４００ 測定ユニット
４１０、４１１ 試薬容器
４１３ フローセル
４２０ 反応チャンバ
４３０ 廃液チャンバ
５００ 分析システム
１００ 採血管
２００ 吸引管
３００ 分析ユニット
４００ 測定ユニット
４１０、４１１ 試薬容器
４１３ フローセル
４２０ 反応チャンバ
４３０ 廃液チャンバ
５００ 分析システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
