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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024146270
(43)【公開日】2024-10-15
(54)【発明の名称】検体の分析方法及び染色試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 K
【審査請求】未請求
【請求項の数】40
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023059067
(22)【出願日】2023-03-31
(71)【出願人】
【識別番号】390014960
【氏名又は名称】シスメックス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100159385
【弁理士】
【氏名又は名称】甲斐 伸二
(74)【代理人】
【識別番号】100163407
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 裕輔
(74)【代理人】
【識別番号】100166936
【弁理士】
【氏名又は名称】稲本 潔
(74)【代理人】
【識別番号】100174883
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 雅己
(74)【代理人】
【識別番号】100189429
【弁理士】
【氏名又は名称】保田 英樹
(74)【代理人】
【識別番号】100213849
【弁理士】
【氏名又は名称】澄川 広司
(72)【発明者】
【氏名】鳥家 雄二
(72)【発明者】
【氏名】金村 絵美
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡ量異常白血球、芽球などを含む複数種類の異常細胞に対応し、且つ、一回の測定で白血球の分類及び異常細胞の検出を可能にする手段を提供することを課題とする。
【解決手段】ＤＮＡに特異的に結合する第１蛍光色素と、ＲＮＡに特異的に結合する第２蛍光色素とで染色された測定試料中の粒子をフローサイトメトリ法で測定し、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とに基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定し、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第１の異常細胞の存否を示す情報、第２の異常細胞の存否を示す情報及び第３の異常細胞の存否を示す情報を出力することを含む検体の分析方法により、上記の課題を解決する。
【選択図】図３４
【解決手段】ＤＮＡに特異的に結合する第１蛍光色素と、ＲＮＡに特異的に結合する第２蛍光色素とで染色された測定試料中の粒子をフローサイトメトリ法で測定し、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とに基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定し、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第１の異常細胞の存否を示す情報、第２の異常細胞の存否を示す情報及び第３の異常細胞の存否を示す情報を出力することを含む検体の分析方法により、上記の課題を解決する。
【選択図】図３４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１蛍光色素及び第２蛍光色素で染色された測定試料中の粒子に光を照射することにより生じた第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とを取得する工程と、
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定する工程と、
前記第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第１の異常細胞の存否を示す情報、第２の異常細胞の存否を示す情報及び第３の異常細胞の存否を示す情報を出力する工程と、
を含み、
前記測定試料が、被検者から採取された検体と前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とを混合することにより調製され、
前記第１蛍光情報が、前記第１蛍光色素からの蛍光強度であり、前記第２蛍光情報が、前記第２蛍光色素からの蛍光強度であり、
前記第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、前記第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、
検体の分析方法。
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定する工程と、
前記第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第１の異常細胞の存否を示す情報、第２の異常細胞の存否を示す情報及び第３の異常細胞の存否を示す情報を出力する工程と、
を含み、
前記測定試料が、被検者から採取された検体と前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とを混合することにより調製され、
前記第１蛍光情報が、前記第１蛍光色素からの蛍光強度であり、前記第２蛍光情報が、前記第２蛍光色素からの蛍光強度であり、
前記第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、前記第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、
検体の分析方法。
【請求項2】
前記検体が、血液試料である請求項１に記載の分析方法。
【請求項3】
前記取得する工程において、前記散乱光情報として、側方散乱光情報及び前方散乱光情報を取得する請求項２に記載の分析方法。
【請求項4】
前記特定する工程において、前記側方散乱光情報と前記第１蛍光情報とに基づいて、前記測定試料中の粒子から、第１のリンパ球集団を含む白血球の各亜集団を特定し、
前記側方散乱光情報と前記第２蛍光情報とに基づいて、前記測定試料中の粒子から、第２のリンパ球集団を含む白血球の各亜集団を特定する請求項３に記載の分析方法。
前記側方散乱光情報と前記第２蛍光情報とに基づいて、前記測定試料中の粒子から、第２のリンパ球集団を含む白血球の各亜集団を特定する請求項３に記載の分析方法。
【請求項5】
前記特定する工程において、前記第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含む場合、前記第１蛍光情報に基づいて、前記第１の特徴を有する粒子を特定し、
前記第１の特徴を有する粒子が、前記第１のリンパ球集団より高い前記第１蛍光情報を示す粒子である請求項４に記載の分析方法。
前記第１の特徴を有する粒子が、前記第１のリンパ球集団より高い前記第１蛍光情報を示す粒子である請求項４に記載の分析方法。
【請求項6】
前記第１の特徴を有する粒子の情報が、粒子数、第１蛍光情報の分散に関する情報及び前方散乱光情報を含む請求項５に記載の分析方法。
【請求項7】
前記出力する工程において、前記第１の特徴を有する粒子が、下記の1)～3)の条件：
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
3) 前記第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値以上である
を満たすとき、前記第１の特徴を有する粒子を前記第１の異常細胞と特定し、
前記第１の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
3) 前記第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値以上である
を満たすとき、前記第１の特徴を有する粒子を前記第１の異常細胞と特定し、
前記第１の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
【請求項8】
前記第１蛍光情報の分散に関する情報が、第１蛍光強度のCV値であり、前記前方散乱光情報が、前方散乱光強度である請求項７に記載の分析方法。
【請求項9】
前記DNA量異常白血球のDNAインデックスを算出する工程と、前記DNAインデックスを出力する工程とをさらに含む請求項７に記載の分析方法。
【請求項10】
前記出力する工程において、前記第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)及び4)の条件：
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、且つ
4) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、第１の特徴を有する粒子を前記第２の異常細胞と特定し、
前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、芽球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、且つ
4) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、第１の特徴を有する粒子を前記第２の異常細胞と特定し、
前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、芽球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
【請求項11】
前記第１蛍光情報の分散に関する情報が、第１蛍光強度のCV値である請求項１０に記載の分析方法。
【請求項12】
前記出力する工程において、前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であるとき、前記第１の特徴を有する粒子を前記第３の異常細胞と特定し、
前記第３の異常細胞の存否を示す情報として、異常リンパ球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
前記第３の異常細胞の存否を示す情報として、異常リンパ球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
【請求項13】
前記出力する工程において、第４の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力し、
前記第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)、2)及び5)の条件：
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
5) 前記第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、前記第１の特徴を有する粒子を前記第４の異常細胞と特定し、
前記第４の異常細胞の存否を示す情報として、幼若赤芽球又は巨赤芽球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
前記第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)、2)及び5)の条件：
1) 前記第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 前記第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
5) 前記第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、前記第１の特徴を有する粒子を前記第４の異常細胞と特定し、
前記第４の異常細胞の存否を示す情報として、幼若赤芽球又は巨赤芽球が存在することを示す情報を出力する請求項６に記載の分析方法。
【請求項14】
前記第１蛍光情報の分散に関する情報が、第１蛍光強度のCV値であり、前記前方散乱光情報が、前方散乱光強度である請求項１３に記載の分析方法。
【請求項15】
前記芽球が、リンパ芽球又は骨髄芽球であり、
前記第１の特徴を有する粒子の情報及び前記第１のリンパ球集団の情報に基づいて、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球又は骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する請求項１０に記載の分析方法。
前記第１の特徴を有する粒子の情報及び前記第１のリンパ球集団の情報に基づいて、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球又は骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する請求項１０に記載の分析方法。
【請求項16】
前記出力する工程において、
前記第１の特徴を有する粒子が、前記1)及び4)の条件を満たし、且つ、前記第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満であるとき、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球が存在することを示す情報を出力し、
前記第１の特徴を有する粒子が、前記1)及び4)の条件を満たし、且つ、前記第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する請求項１５に記載の分析方法。
前記第１の特徴を有する粒子が、前記1)及び4)の条件を満たし、且つ、前記第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満であるとき、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球が存在することを示す情報を出力し、
前記第１の特徴を有する粒子が、前記1)及び4)の条件を満たし、且つ、前記第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第２の異常細胞の存否を示す情報として、骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する請求項１５に記載の分析方法。
【請求項17】
前記側方散乱光情報の分散に関する情報が、側方散乱光強度のCV値である請求項１６に記載の分析方法。
【請求項18】
前記特定する工程において、前記第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含まない場合、前記第２蛍光情報と前記側方散乱光情報に基づいて、単球集団及び第２の特徴を有する粒子をさらに特定し、
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第５の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項５に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第５の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項５に記載の分析方法。
【請求項19】
前記第２の特徴を有する粒子が、前記単球集団より高い第２蛍光情報及び第１の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子であり、
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第２の特徴を有する粒子を前記第５の異常細胞と特定し、
前記第５の異常細胞の存否を示す情報として、異型リンパ球が存在することを示す情報を出力する請求項１８に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第２の特徴を有する粒子を前記第５の異常細胞と特定し、
前記第５の異常細胞の存否を示す情報として、異型リンパ球が存在することを示す情報を出力する請求項１８に記載の分析方法。
【請求項20】
前記第２蛍光情報が、第２蛍光強度であり、前記側方散乱光情報が、側方散乱光強度である請求項１９に記載の分析方法。
【請求項21】
前記特定する工程において、前記第２蛍光情報と前記側方散乱光情報に基づいて、好中球集団及び第３の特徴を有する粒子をさらに特定し、
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子及び前記第３の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第６の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項１９に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子及び前記第３の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第６の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項１９に記載の分析方法。
【請求項22】
前記第３の特徴を有する粒子が、前記好中球集団より高い第２蛍光情報及び第２の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子であり、
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ前記第３の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第３の特徴を有する粒子を前記第６の異常細胞と特定し、
前記第６の異常細胞の存否を示す情報として、幼若顆粒球が存在することを示す情報を出力する請求項２１に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ前記第３の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第３の特徴を有する粒子を前記第６の異常細胞と特定し、
前記第６の異常細胞の存否を示す情報として、幼若顆粒球が存在することを示す情報を出力する請求項２１に記載の分析方法。
【請求項23】
前記第２蛍光情報が、第２蛍光強度であり、前記側方散乱光情報が、側方散乱光強度である請求項２２に記載の分析方法。
【請求項24】
前記取得する工程において、散乱光情報として、側方散乱光情報と、前方散乱光信号の幅に関する情報とを取得し、
前記特定する工程において、前記第１蛍光情報と前記側方散乱光情報とに基づいて、第４の特徴を有する粒子をさらに特定し、
前記出力する工程において、前記第４の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第７の異常細胞の存否を示す情報及び第８の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項１に記載の分析方法。
前記特定する工程において、前記第１蛍光情報と前記側方散乱光情報とに基づいて、第４の特徴を有する粒子をさらに特定し、
前記出力する工程において、前記第４の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第７の異常細胞の存否を示す情報及び第８の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項１に記載の分析方法。
【請求項25】
前記第４の特徴を有する粒子が、前記第１蛍光情報が第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子であり、
前記出力する工程において、前記第４の特徴を有する粒子の情報が、下記の6)及び7)の条件：
6) 前記第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
7) 前記第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値以上である
を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を前記第７の異常細胞と特定し、
前記第７の異常細胞の存否を示す情報として、血小板凝集が存在することを示す情報を出力する請求項２４に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第４の特徴を有する粒子の情報が、下記の6)及び7)の条件：
6) 前記第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
7) 前記第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値以上である
を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を前記第７の異常細胞と特定し、
前記第７の異常細胞の存否を示す情報として、血小板凝集が存在することを示す情報を出力する請求項２４に記載の分析方法。
【請求項26】
前記出力する工程において、前記第４の特徴を有する粒子の情報が、下記の6)及び8)の条件：
6) 前記第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
8) 前記第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を前記第８の異常細胞と特定し、
前記第８の異常細胞の存否を示す情報として、マラリア感染赤血球が存在することを示す情報を出力する請求項２５に記載の分析方法。
6) 前記第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
8) 前記第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値未満である
を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を前記第８の異常細胞と特定し、
前記第８の異常細胞の存否を示す情報として、マラリア感染赤血球が存在することを示す情報を出力する請求項２５に記載の分析方法。
【請求項27】
前記特定する工程において、前記第１蛍光情報及び前記第２蛍光情報に基づいて、第５の特徴を有する粒子をさらに特定し、
前記出力する工程において、前記第５の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第９の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項２４に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第５の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第９の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する請求項２４に記載の分析方法。
【請求項28】
前記第５の特徴を有する粒子が、前記第１蛍光情報が第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上であり、且つ前記第２蛍光情報が第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子であり、
前記出力する工程において、前記第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第５の特徴を有する粒子を第９の異常細胞と特定し、
前記第９の異常細胞の存否を示す情報として、有核赤血球が存在することを示す情報を出力する請求項２７に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第５の特徴を有する粒子を第９の異常細胞と特定し、
前記第９の異常細胞の存否を示す情報として、有核赤血球が存在することを示す情報を出力する請求項２７に記載の分析方法。
【請求項29】
前記検体の種類に関する情報を取得する工程をさらに含み、
前記検体の種類が血液試料であるとの情報を取得した場合、前記取得する工程、前記特定する工程、及び前記出力する工程を実行し、
前記検体の種類が非血液試料であるとの情報を取得した場合、前記第１蛍光情報、前記第２蛍光情報及び前記散乱光情報を取得する工程と、
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報とに基づいて、第６の特徴を有する粒子、第７の特徴を有する粒子及び第８の特徴を有する粒子から選択される少なくとも１の粒子を特定する工程と、
前記第６の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第10の異常細胞の存否を示す情報を出力し、前記第７の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第11の異常細胞の存否を示す情報を出力し、且つ前記第８の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第12の異常細胞の存否を示す情報を出力する工程とを実行する請求項１に記載の分析方法。
前記検体の種類が血液試料であるとの情報を取得した場合、前記取得する工程、前記特定する工程、及び前記出力する工程を実行し、
前記検体の種類が非血液試料であるとの情報を取得した場合、前記第１蛍光情報、前記第２蛍光情報及び前記散乱光情報を取得する工程と、
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報とに基づいて、第６の特徴を有する粒子、第７の特徴を有する粒子及び第８の特徴を有する粒子から選択される少なくとも１の粒子を特定する工程と、
前記第６の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第10の異常細胞の存否を示す情報を出力し、前記第７の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第11の異常細胞の存否を示す情報を出力し、且つ前記第８の特徴を有する粒子の情報を得た場合は前記情報に基づいて、第12の異常細胞の存否を示す情報を出力する工程とを実行する請求項１に記載の分析方法。
【請求項30】
前記非血液試料が、体腔液、脳脊髄液、関節液、腹膜透析排液又は肺胞洗浄液である請求項２９に記載の分析方法。
【請求項31】
前記第６の特徴を有する粒子が、前記第１蛍光情報が第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子であり、
前記出力する工程において、前記第６の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第６の特徴を有する粒子を第10の異常細胞と特定し、
前記第10の異常細胞の存否を示す情報として、細菌又は真菌が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第６の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第６の特徴を有する粒子を第10の異常細胞と特定し、
前記第10の異常細胞の存否を示す情報として、細菌又は真菌が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
【請求項32】
前記第７の特徴を有する粒子が、前記第２蛍光情報が第２蛍光情報に対応する第３の閾値以上である粒子であり、
前記出力する工程において、前記第７の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第７の特徴を有する粒子を第11の異常細胞と特定し、
前記第11の異常細胞の存否を示す情報として、組織由来細胞が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第７の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第７の特徴を有する粒子を第11の異常細胞と特定し、
前記第11の異常細胞の存否を示す情報として、組織由来細胞が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
【請求項33】
前記第８の特徴を有する粒子が、前記第１蛍光情報が第１蛍光情報に対応する第２の閾値以上である粒子であり、
前記出力する工程において、前記第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第８の特徴を有する粒子を第12の異常細胞と特定し、
前記第12の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
前記出力する工程において、前記第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、前記第８の特徴を有する粒子を第12の異常細胞と特定し、
前記第12の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する請求項２９に記載の分析方法。
【請求項34】
前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とが、互いに異なる波長域に蛍光発光極大を有する蛍光色素である請求項１に記載の分析方法。
【請求項35】
前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とが、互いに異なる波長域に極大吸収を有する蛍光色素である請求項１に記載の分析方法。
【請求項36】
前記取得する工程において、前記第１蛍光色素を励起可能な第１波長の光、及び前記第２蛍光色素を励起可能な第２波長の光を前記測定試料中の粒子に照射する請求項１に記載の分析方法。
【請求項37】
前記第１波長が315 nm以上490 nm以下であり、前記第２波長が610 nm以上750 nm以下である請求項３６に記載の分析方法。
【請求項38】
前記第１蛍光色素及び前記第２蛍光色素が、抗体を含まない請求項１に記載の分析方法。
【請求項39】
第１蛍光色素及び第２蛍光色素で染色された測定試料中の粒子に光を照射することにより生じた第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とを取得する工程と、
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、測定試料に含まれる白血球を少なくとも５つの亜集団に分類する工程と、
５つの亜集団に分類できない測定試料について、前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、少なくともDNA量異常白血球と、異常リンパ球と、芽球を区別して検出する工程と、を含み、
前記測定試料が、被検者から採取された検体と前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とを混合することにより調製され、
前記第１蛍光情報が、前記第１蛍光色素からの蛍光強度であり、前記第２蛍光情報が、前記第２蛍光色素からの蛍光強度であり、
前記第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、前記第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、
検体の分析方法。
前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、測定試料に含まれる白血球を少なくとも５つの亜集団に分類する工程と、
５つの亜集団に分類できない測定試料について、前記第１蛍光情報と前記第２蛍光情報と前記散乱光情報とに基づいて、少なくともDNA量異常白血球と、異常リンパ球と、芽球を区別して検出する工程と、を含み、
前記測定試料が、被検者から採取された検体と前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とを混合することにより調製され、
前記第１蛍光情報が、前記第１蛍光色素からの蛍光強度であり、前記第２蛍光情報が、前記第２蛍光色素からの蛍光強度であり、
前記第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、前記第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、
検体の分析方法。
【請求項40】
前記第１蛍光色素と前記第２蛍光色素とを含み、請求項１～３９のいずれか１項に記載の分析方法に用いられる染色試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、検体の分析方法に関する。本発明は、その分析方法に用いられる染色試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
血液や体腔液などのように血球を含む検体の分析では、正常な白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５つの亜集団に分類される。臨床検査の分野では、血液や体腔液などの検体に通常ほとんど存在しない細胞は、異常細胞と呼ばれる。検体中の異常細胞を検出又は分類することは、被検者の健康状態や疾患を診断する上で極めて有用である。特許文献１では、異常細胞として異型リンパ球、異常リンパ球及び芽球を検出することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】米国特許出願公開第2012/0282601号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
異常細胞は、上記の異型リンパ球、異常リンパ球及び芽球の他にも存在し、例えばDNA量異常白血球、赤芽球、幼若顆粒球などがある。このように異常細胞には多くの種類があるが、従来の分析方法は、限られた種類の異常細胞の検出又は分類しかできなかった。試薬等を変更して複数回の測定を行うことにより、より多くの種類の異常細胞に対応できる分析方法もある。しかし、このような分析方法は費用と時間を要する。本発明は、一回の測定でDNA量異常白血球、芽球などのような複数種類の異常細胞の検出に対応できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、DNAに特異的に結合する蛍光色素とRNAに特異的に結合する蛍光色素の２種類の蛍光色素で、検体中の血球などの粒子を染色して測定することにより、複数種類の異常細胞を検出できることを見出して、本発明を完成した。
【0006】
本発明は、第１蛍光色素及び第２蛍光色素で染色された測定試料中の粒子に光を照射することにより生じた第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とを取得する工程と、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とに基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定する工程と、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第１の異常細胞の存否を示す情報、第２の異常細胞の存否を示す情報及び第３の異常細胞の存否を示す情報を出力する工程と、を含み、測定試料が、被検者から採取された検体と第１蛍光色素と第２蛍光色素とを混合することにより調製され、第１蛍光情報が、第１蛍光色素からの蛍光強度であり、第２蛍光情報が、第２蛍光色素からの蛍光強度であり、第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、検体の分析方法を提供する。
【0007】
また、本発明は、第１蛍光色素及び第２蛍光色素で染色された測定試料中の粒子に光を照射することにより生じた第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とを取得する工程と、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とに基づいて、測定試料に含まれる白血球を少なくとも５つの亜集団に分類する工程と、５つの亜集団に分類できない測定試料について、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報とに基づいて、少なくともDNA量異常白血球と、異常リンパ球と、芽球を区別して検出する工程と、を含み、測定試料が、被検者から採取された検体と第１蛍光色素と第２蛍光色素とを混合することにより調製され、第１蛍光情報が、第１蛍光色素からの蛍光強度であり、第２蛍光情報が、第２蛍光色素からの蛍光強度であり、第１蛍光色素が、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である、検体の分析方法を提供する。
【0008】
また、本発明は、第１蛍光色素と第２蛍光色素とを含み、上記の分析方法に用いられる染色試薬を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、複数種類の異常細胞の検出を可能にする分析方法、及びその方法に用いられる染色試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本実施形態の検体の分析方法に適した分析システムを示す斜視図である。
【図2】測定ユニットにおける検体吸引部、試料調製部及びフローサイトメータ(ＦＣＭ)検出部を含む流体回路を示す図である。
【図3】測定ユニットの構成を示すブロック図である。
【図4】ＦＣＭ検出部の光学系の構成の一例を示す概略図である。
【図5】フローセルを通過する粒子に光を照射したときに発せされる各種の光が、ＦＣＭ検出部の光学系に受光されることを示す模式図である。
【図6】分析ユニットの構成を示すブロック図である。
【図7】分析システムの動作の流れを示すフローチャートである。
【図8】実施形態１及び２の測定処理の手順を示すフローチャートである。
【図9A】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図9B】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図9C】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図9D】実施形態１の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図10】Ａは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に第１蛍光強度をとったスキャッタグラム(第１スキャッタグラム)において、白血球の各亜集団が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に第２蛍光強度をとったスキャッタグラム(第２スキャッタグラム)において、白血球の各亜集団が出現する位置を例示する模式図である。
【図11】Ａは、第２スキャッタグラムにおいて、第２の蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光強度を示す粒子がリンパ球集団に増加したことを示す模式図である。Ｂは、第１スキャッタグラムにおいて、リンパ球集団より高い第１蛍光強度を示す粒子が出現する位置を例示する模式図である。
【図12】Ａは、第１スキャッタグラムにおいて、リンパ球集団より高い第１蛍光強度を示す粒子が、白血球の各亜集団から離散した集団を形成することを示す模式図である。Ｂは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムにおいて、リンパ球集団より高い第１蛍光強度を示す粒子が、リンパ球集団よりも前方散乱光強度が高い領域に出現したことを示す模式図である。
【図13】Ａは、第２スキャッタグラムにおいて、第２の特徴を有する粒子が出現する領域を例示する模式図である。Ｂは、第２スキャッタグラムにおいて、第３の特徴を有する粒子が出現する領域を例示する模式図である。
【図14】実施形態１の変形例の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図15】Ａは、第１スキャッタグラムにおいて、リンパ芽球が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、第１スキャッタグラムにおいて、骨髄芽球が出現する位置を例示する模式図である。
【図16A】実施形態２の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図16B】実施形態２の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図17】Ａは、第１スキャッタグラムにおいて、デブリ、血小板凝集及びマラリア感染赤血球が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、横軸に前方散乱光パルス幅をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムにおいて、血小板凝集及びマラリア感染赤血球が出現する位置を例示する模式図である。
【図18】Ａは、第１スキャッタグラムにおいて、有核赤血球が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、第２スキャッタグラムにおいて、有核赤血球が出現する位置を例示する模式図である。
【図19】実施形態３の測定処理の手順を示すフローチャートである。
【図20A】実施形態３の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図20B】実施形態３の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図20C】実施形態３の分析処理の手順を示すフローチャートである。
【図21】Ａは、第１スキャッタグラムにおいて、白血球の単核球集団及び多形核球集団が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、第１スキャッタグラムにおいて、細菌又は真菌の集団が出現する位置を例示する模式図である。
【図22】Ａは、第２スキャッタグラムにおいて、白血球のリンパ球集団、単球集団及び多形核球集団が出現する位置を例示する模式図である。Ｂは、第２スキャッタグラムにおいて、組織由来細胞の集団が出現する位置を例示する模式図である。
【図23】第１スキャッタグラムにおいて、DNA量異常白血球が出現する位置を例示する模式図である。
【図24A】本実施形態の検体の分析方法に用いられる染色試薬の一例を示す図である。この図では、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬が収容された１つの試薬容器が箱に梱包されている。
【図24B】本実施形態の検体の分析方法に用いられる染色試薬の一例を示す図である。この図では、第１蛍光色素を含む試薬が収容された試薬容器と、第２蛍光色素を含む試薬が収容された試薬容器とが箱に梱包されている。
【図25】参考例１の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図26】実施例１の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図27】実施例１の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図28】実施例２の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図29】実施例３の各種のスキャッタグラムである。
【図30】実施例３の各種のスキャッタグラムである。
【図31】実施例４の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図32】実施例５の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図33】実施例６の各種のスキャッタグラムである。
【図34】実施例６の各種のスキャッタグラムである。
【図35】実施例７の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図36】実施例７の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図37】実施例７の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図38】実施例７の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図39】実施例７の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図40】参考例２の第２スキャッタグラム及び蛍光ヒストグラムである。
【図41】参考例３のイメージングフローサイトメータにより取得した画像である。
【図42】参考例４のスキャッタグラム及び蛍光ヒストグラムである。
【図43】参考例４の第１スキャッタグラムである。
【図44】本実施形態の検体の分析方法と標準測定法との相関性を示すグラフである。
【図45】実施例８の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図46】実施例９の第１及び第２スキャッタグラムである。
【図47】実施例１０の顕微鏡画像、第１及び第２スキャッタグラムである。
【図48】実施例１１の顕微鏡画像、第１及び第２スキャッタグラムである。
【図49】実施例１１の第１及び第２スキャッタグラム及び蛍光ヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
(分析システム)
まず、図１を参照して、本実施形態の検体の分析方法に適した分析システムについて説明する。分析システム５００は、測定装置である測定ユニット４００と、分析装置である分析ユニット３００とを備える。分析ユニット３００は、例えば、測定対象となる検体を分析するためのソフトウェアが組み込まれたパーソナルコンピュータである。分析ユニット３００は、測定ユニット４００の動作制御も実行する。分析システム５００は、測定ユニット４００内に分析ユニット３００が設けられた構成であってもよい。
まず、図１を参照して、本実施形態の検体の分析方法に適した分析システムについて説明する。分析システム５００は、測定装置である測定ユニット４００と、分析装置である分析ユニット３００とを備える。分析ユニット３００は、例えば、測定対象となる検体を分析するためのソフトウェアが組み込まれたパーソナルコンピュータである。分析ユニット３００は、測定ユニット４００の動作制御も実行する。分析システム５００は、測定ユニット４００内に分析ユニット３００が設けられた構成であってもよい。
【0012】
測定ユニット４００は、検体を測定するためのユニットであり、フローサイトメータを含んでいる。測定ユニット４００では、検体と試薬とを混合して測定試料を調製する。測定試料の調製には、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬と、界面活性剤を含む溶血試薬とが用いられる。検体、染色試薬及び溶血試薬の詳細については後述する。この分析システムによる検体中の粒子の分析では、第１及び第２蛍光色素によって染色された測定試料中の粒子を分析する。「測定試料中の粒子」とは、後述のＦＣＭ検出部４６０により個々に測定され得る、測定試料に含まれる有形成分をいう。測定試料中の粒子としては、検体に含まれる細胞、血小板凝集、溶血した赤血球の残骸(赤血球ゴースト)、脂質粒子、真菌、細菌などが挙げられる。
【0013】
測定試料は、測定ユニット４００のＦＣＭ検出部４６０で測定される。測定試料中の染色された粒子の第１及び第２蛍光色素のそれぞれから発せられる蛍光に関する光学的信号と、当該粒子から発せられる散乱光に関する光学的信号が取得される。取得された光学的信号はＡ／Ｄ変換されて、デジタルデータが取得される。分析ユニット３００は、測定ユニット４００で取得されたデジタルデータを分析して、検体中の粒子を検出又は分類する。
【0014】
図２を参照して、測定ユニット４００における流体系の構成について説明する。測定ユニット４００は、試料調製部４４０と、検体吸引部４５０と、ＦＣＭ検出部４６０とを備える。試料調製部４４０は、試薬容器４１０と、試薬容器４１１と、反応チャンバ４２０と、廃液チャンバ４３０とを含む。例えば、試薬容器４１０は溶血試薬を収容し、試薬容器４１１は染色試薬を収容する。試薬容器４１０及び試薬容器４１１はそれぞれ送液管により反応チャンバ４２０に接続される。試料調製部４４０は、各送液管を通じて溶血試薬及び染色試薬を反応チャンバ４２０に注入する。検体吸引部４５０は吸引管２００を含む。吸引管２００は、採血管１００に収容された検体を吸引し、反応チャンバ４２０に吐出する。反応チャンバ４２０は、送液管によりＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３と接続される。
【0015】
反応チャンバ４２０は、測定試料を調製するための容器である。反応チャンバ４２０内で、検体と、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色液と、溶血試薬とが混合されて測定試料が調製される。反応チャンバ４２０内の測定試料は、送液管を介してＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３に供給されて測定される。ＦＣＭ検出部４６０は、測定試料中の個々の粒子から発せられる各種の光学的信号を取得する。ＦＣＭ検出部４６０による測定が完了した後、反応チャンバ４２０に残った測定試料は廃液チャンバ４３０に廃棄される。反応チャンバ４２０は、次の測定試料が調製される前に、図示しない洗浄機構によって洗浄される。
【0016】
図３を参照して、測定ユニット４００における各部の電気的接続について説明する。試料調製部４４０及び検体吸引部４５０は、インターフェース(ＩＦ)部４８８を介してＦＣＭ検出部４６０に接続される。ＦＣＭ検出部４６０は、アナログ処理部４８１及びＡ／Ｄ変換部４８２に接続される。アナログ処理部４８１は、ＦＣＭ検出部４６０から出力されるアナログ信号を処理し、Ａ／Ｄ変換部４８２は、アナログ処理部４８１から出力されるアナログ信号をデジタル信号に変換する。また、測定ユニット４００は、ＩＦ部４８９を介して、分析ユニット３００と接続される。ＩＦ部４８４、ＩＦ部４８８及びＩＦ部４８９はバス４８５に接続される。
【0017】
図４を参照して、ＦＣＭ検出部４６０、アナログ処理部４８１及びＡ／Ｄ変換部４８２について説明する。ＦＣＭ検出部４６０は、第１光源４１１ａ、第２光源４１１ｂと、フローセル４１３と、ダイクロイックミラー４１８ａ、４１８ｂ、４１８ｃと、側方散乱光受光素子４１２ａ、４１２ｂと、前方散乱光受光素子４１６と、側方蛍光受光素子４２２ａ、４２２ｂとを備える。第１光源４１１ａ及び第２光源４１１ｂは、互いに異なる波長の励起光を射出する。例えば、第１光源４１１ａは、第１蛍光色素を励起可能な第１波長の光を射出し、第２光源４１１ｂは、第２蛍光色素を励起可能な第２波長の光を射出する。第１波長は、例えば315 nm以上490 nm以下であり、好ましくは400 nm以上450 nm以下であり、より好ましくは400 nm以上410 nm以下である。第２波長は、例えば610 nm以上750 nm以下であり、好ましくは620 nm以上700 nm以下であり、より好ましくは633 nm以上643 nm以下である。第１及び第２光源として、例えば半導体レーザ光源を使用できる。
【0018】
反応チャンバ４２０で調製された測定試料は、ＦＣＭ検出部４６０のフローセル４１３に流される。図４の例では、紙面に対して垂直方向に測定試料が流される。フローセル４１３に測定試料が流れている状態で、第１光源４１１ａから照射された光は、ダイクロイックミラー４１８ａによって反射され、フローセル４１３内を流れる測定試料中の個々の粒子に照射される。第２光源４１１ｂから発せられた光は、ダイクロイックミラー４１８ａを透過して、フローセル４１３内を流れる測定試料中の個々の粒子に照射される。
【0019】
図４の例では、前方散乱光受光素子４１６は、第２光源４１１ｂから照射された光に基づいて細胞から発せられる前方散乱光を受光するように配置される。あるいは、受光素子４１６は、第１光源４１１ａから照射された光に基づいて粒子から発せられる前方散乱光を受光するように配置されてもよい。あるいは、第１光源４１１ａから照射された光に基づいて粒子から発せられる前方散乱光を受光するために、別の受光素子をさらに配置してもよい。前方散乱光は、例えば、受光角度が０度から約20度の散乱光である。前方散乱光受光素子４１６は、例えばフォトダイオードである。第１光源４１１ａから照射された光に対応する側方散乱光(第１側方散乱光)は、ダイクロイックミラー４１８ｂによって反射され、側方散乱光受光素子４１２ａによって受光される。第２光源４１１ｂから照射された光に対応する側方散乱光(第２側方散乱光)は、ダイクロイックミラー４１８ｃによって反射され、側方散乱光受光素子４１２ｂによって受光される。側方散乱光は、例えば、受光角度が約20度から約90度の散乱光である。側方散乱光受光素子４１２ａ及び４１２ｂは、例えばフォトダイオードである。
【0020】
第１蛍光色素が励起されて生じた光に対応する側方蛍光(第１側方蛍光)は、ダイクロイックミラー４１８ｂを透過して側方蛍光受光素子４２２ａによって受光される。第２蛍光色素が励起されて生じた光に対応する側方蛍光(第２側方蛍光)は、ダイクロイックミラー４１８ｃを透過して側方蛍光受光素子４２２ｂによって受光される。側方蛍光受光素子４２２ａ及び４２２ｂは、例えばアバランシェフォトダイオードである。
【0021】
図５を参照して、フローセル４１３中を通過する粒子Ｐに光を照射したときに発せされる各種の光と、ＦＣＭ検出部４６０の光学系との関係について説明する。図５では、第１光源４１１ａから照射された光は、第１波長の光Ｌ１であり、第２光源４１１ｂから照射された光は、第２波長の光Ｌ２である。フローセル４１３中を通過する粒子Ｐに光Ｌ１及びＬ２が照射されると、光の進行方向に対して前方に前方散乱光(FSC)が生じる。図５の例では、受光素子４１６は、第２光源４１１ｂから照射された光に対応する前方散乱光を受光するので、第２波長の光に対応する第２前方散乱光のみを示し、第１波長の光に対応する第１前方散乱光は省略した。また、光の進行方向に対して側方に、第１波長の光に対応する第１側方散乱光(SSC-1)と、第１波長の光によって励起された第１側方蛍光(SFL-1)が生じる。さらに、光の進行方向に対して側方に、第２波長の光に対応する第２側方散乱光(SSC-2)と、第２波長の光によって励起された第２側方蛍光(SFL-2)が生じる。上記のとおり、FSC、SSC-1、SFL-1、SSC-2及びSFL-2は、それぞれ受光素子４１６、４１２ａ、４２２ａ、４１２ｂ及び４２２ｂに受光される。各受光素子は、受光強度に応じたパルスを含む波形状の電気信号(アナログ信号ともいう)を出力する。以下、FSCに対応するアナログ信号を「前方散乱光信号」、SSC-1に対応するアナログ信号を「第１側方散乱光信号」、SFL-1に対応するアナログ信号を「第１蛍光信号」、SSC-2に対応するアナログ信号を「第２側方散乱光信号」、SFL-2に対応するアナログ信号を「第２蛍光信号」ともいう。各アナログ信号の１つのパルスが、１つの粒子(例えば１つの細胞)に対応する。
【0022】
各種の光に対応するアナログ信号は、それぞれアナログ処理部４８１に入力されて、ノイズ除去、平滑化等の処理が行われる。Ａ／Ｄ変換部４８２は、所定のサンプリングレート(例えば、10ナノ秒間隔で1024ポイントのサンプリング、80ナノ秒間隔で128ポイントのサンプリング、又は160ナノ秒間隔で64ポイントのサンプリング等)で、アナログ処理部４８１から出力されるアナログ信号をサンプリングする。Ａ／Ｄ変換部４８２は、サンプリングしたアナログ信号をデジタル化して、波形データを生成する。Ａ／Ｄ変換部４８２は、フローセル４１３を流れる個々の細胞に対応する５種類のアナログ信号をサンプリング及びデジタル化して、前方散乱光信号、第１側方散乱光信号、第１蛍光信号、第２側方散乱光信号及び第２蛍光信号の波形データを生成する。さらに、Ａ／Ｄ変換部４８２は、各信号の波形データから個々の細胞の形態的特徴を表す特徴パラメータを計算する。そのような特徴パラメータとしては、例えば、ピーク値(パルスのピークの高さ)、パルス幅、パルス面積、透過率、ストークスシフト、比率、経時変化及びそれらに相関する値などが挙げられる。
【0023】
光学的情報は、上記の特徴パラメータであり得る。光学的情報は、前方散乱光情報、第１蛍光情報、第２蛍光情報、第１側方散乱光情報及び第２側方散乱光情報の少なくとも１つを含む。第１蛍光情報は、有核細胞中のDNAを染色した蛍光色素の量を反映する情報であれば特に限定されない。第２蛍光情報は、有核細胞中のRNAを染色した蛍光色素の量を反映する情報であれば特に限定されない。第１及び第２蛍光情報としては、それぞれ第１蛍光信号のピーク値(以下、「第１蛍光強度」ともいう)及び第２蛍光信号のピーク値(以下、「第２蛍光強度」ともいう)が好ましい。第１及び第２側方散乱光情報は、細胞構造の複雑性、顆粒特性、核構造、分葉度などの内部情報を反映する情報であれば特に限定されない。第１及び第２側方散乱光情報としては、それぞれ第１側方散乱光信号のピーク値(以下、「第１側方散乱光強度」ともいう)及び第２側方散乱光信号のピーク値(以下、「第２側方散乱光強度」ともいう)が好ましい。前方散乱光情報は、細胞の大きさを反映する情報であれば特に限定されない。前方散乱光情報としては、前方散乱光信号のピーク値(以下、「前方散乱光強度」とも呼ぶ)が好ましい。
【0024】
図６を参照して、分析ユニット３００における各部の電気的接続について説明する。分析ユニット３００は、インターフェース部３０４を介して測定ユニット４００と電気的に接続される。インターフェース部３０４は、例えば、ＵＳＢインターフェースである。分析ユニット３００は、制御部３０１、バス３０２、記憶部３０３、インターフェース部３０４、表示部３０５及び操作部３０６を備える。分析ユニット３００は、例えば、パーソナルコンピュータ(図１の分析ユニット３００を参照)によって構成されており、記憶部３０３に格納されたプログラムを実行することで、分析システム５００の測定ユニット４００を制御する。分析ユニット３００は、測定ユニット４００で取得されたデータを分析して、分析結果を表示部３０５に表示する。分析ユニット３００は、前方散乱光強度、第１側方散乱光強度、第１蛍光強度、第２側方散乱光強度及び第２蛍光強度に基づいて、細胞の分類を行ってもよい。
【0025】
記憶部３０３には、例えば、測定ユニット４００を制御するためのプログラム、測定ユニット４００が取得したデータを分析するためのプログラムなどが記憶されている。表示部３０５には、例えば、測定ユニット４００で取得されたデータの分析結果が表示される。操作部３０６は、キーボード、マウス又はタッチパネルを含むポインティングデバイスを備える。
【0026】
図７を参照して、分析システム５００の動作の一例を説明するが、この例に限定されない。ステップＳ１１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、ユーザからの測定開始の指示を、操作部３０６を介して受け付ける。制御部３０１は、測定開始の指示を受け付けると、測定開始を指示する指示データを測定ユニット４００に送信する。測定ユニット４００は、当該指示データを受信して、ステップＳ１２において測定処理を実行する。測定処理では、測定ユニット４００は、検体から測定試料を調製し、当該試料を測定する。そして、測定ユニット４００は、測定により取得したデータを分析ユニット３００に送信する。分析ユニット３００は、測定ユニット４００から受信したデータに基づいて、ステップＳ１３の分析処理を実行する。分析処理では、白血球を亜集団に分類し、検体に異常細胞が存在する場合は当該異常細胞を検出する。分析処理の終了後、制御部３０１は、ステップＳ１４において、分析結果を表示部３０５に出力する。そして、分析システムは、図７に示される動作を終了する。図７のステップＳ１２の測定処理及びステップＳ１３の分析処理の詳細は、以下の実施形態ごとに説明する。
【0027】
本実施形態の検体の分析方法には、例えば、次の実施形態１～３が包含される。「実施形態１」では、血液試料から調製した測定試料を測定し、白血球の亜集団への分類及び異常細胞の検出を行う。実施形態１における異常細胞は、DNA量異常白血球、異常リンパ、芽球、幼若赤芽球又は巨赤芽球、幼若顆粒球及び異型リンパ球である。実施形態１は、従来は困難であったDNA量異常白血球、芽球及び異常リンパの区別を可能にする。「実施形態２」では、血液試料から調製した測定試料を測定し、実施形態１の分析に干渉し得る粒子を特定する。そして、実施形態１と同様にして、白血球の亜集団への分類及び上記の異常細胞の検出を行う。実施形態２において、実施形態１の分析に干渉し得る粒子とは、血小板凝集、感染細胞及び有核赤血球である。これらの粒子が検体に含まれる場合、例えば白血球の分類に影響し得る。例えば、実施形態２では、そのような分析に干渉し得る粒子を特定し、当該粒子の測定データを除くことにより、残りの細胞の分析精度の向上に寄与し得る。「実施形態３」は、分析システム５００が、血液試料及び非血液試料(以下、非血液試料を「体液」又は「体液試料」という)の両方の測定を行うことができる場合の測定及び分析を含む。実施形態３では、血液試料又は体液試料から調製した測定試料を測定し、白血球の亜集団への分類及び異常細胞の検出を行う。
【0028】
(検体及び異常細胞)
上述のとおり、実施形態１及び２の検体は血液試料であり、実施形態３の検体は、血液試料又は体液試料である。血液試料は、例えば、全血、全血の希釈物などが挙げられる。全血は、例えば、被検者から採取した末梢血である。血液試料には、抗凝固剤が含まれてもよい。そのような抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTA塩(例えばEDTA・2K、EDTA・2Naなど)、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ワーファリンなどが挙げられる。体液試料は、例えば、体液、体液の希釈物などが挙げられる。体液は、血液成分を含む可能性がある限り、特に限定されない。体液としては、例えば体腔液、脳脊髄液、関節液、腹膜透析排液、肺胞洗浄液などが挙げられる。体腔液としては、例えば腹水、胸水、心嚢液などが挙げられる。全血の希釈物又は体液の希釈物は、例えば、適切な水性溶媒により全血又は体液を希釈することにより得られる。そのような水性溶媒としては、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば、６以上８以下のpH)で緩衝作用を有することが好ましい。
上述のとおり、実施形態１及び２の検体は血液試料であり、実施形態３の検体は、血液試料又は体液試料である。血液試料は、例えば、全血、全血の希釈物などが挙げられる。全血は、例えば、被検者から採取した末梢血である。血液試料には、抗凝固剤が含まれてもよい。そのような抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTA塩(例えばEDTA・2K、EDTA・2Naなど)、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ワーファリンなどが挙げられる。体液試料は、例えば、体液、体液の希釈物などが挙げられる。体液は、血液成分を含む可能性がある限り、特に限定されない。体液としては、例えば体腔液、脳脊髄液、関節液、腹膜透析排液、肺胞洗浄液などが挙げられる。体腔液としては、例えば腹水、胸水、心嚢液などが挙げられる。全血の希釈物又は体液の希釈物は、例えば、適切な水性溶媒により全血又は体液を希釈することにより得られる。そのような水性溶媒としては、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば、６以上８以下のpH)で緩衝作用を有することが好ましい。
【0029】
本明細書において「血液成分」は、血液中に含まれることが知られた有形成分と、異常細胞とを包含する。血液中に含まれることが知られた有形成分としては、健常人の末梢血に通常含まれる血球などであり、例えば白血球、赤血球及び血小板が挙げられる。異常細胞とは、血液又は体液中に通常は出現しない有形成分をいう。異常細胞には、微生物、感染細胞、非細胞の粒子も含まれる。微生物は、フローサイトメトリ法により検出可能なサイズであれば特に限定されず、例えば細菌、真菌などが挙げられる。感染細胞としては、例えば、マラリア原虫が寄生した赤血球(以下、「マラリア感染赤血球」ともいう)、ウイルスに感染した細胞などが挙げられる。非細胞の粒子としては、例えば血小板凝集が挙げられる。血小板凝集は、採血時の組織液の混入、混和の不十分又はEDTAの作用により、採血管中に生じる。
【0030】
血液における異常細胞としては、例えば、芽球、幼若顆粒球、異型リンパ球、異常リンパ球、DNA量異常白血球、赤芽球、巨赤芽球、マラリア感染赤血球及び血小板凝集が挙げられる。「幼若顆粒球」は、前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球を含む。「赤芽球」は、有核赤血球(NRBC)とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。赤芽球のうち、前赤芽球、好塩基性赤芽球及び多染性赤芽球を「幼若赤芽球」とも呼ぶ。「芽球」は、骨髄芽球及びリンパ芽球を含む。「DNA量異常白血球」は、DNA異数性(aneuploidy)を示す白血球であり、通常の白血球に比べてDNA量が多いか又は少ない。「異型リンパ球」は、反応性リンパ球とも呼ばれ、抗原刺激により活性化して形態変化したリンパ球である。「異常リンパ球」は、腫瘍性の形態変化をしたリンパ球であり、クローナルで均質な細胞である。
【0031】
体液における異常細胞としては、例えば、組織由来細胞、細菌及び真菌が挙げられる。「組織由来細胞」は、例えば、組織球(組織中のマクロファージ)、中皮細胞及び腫瘍細胞を含む。組織由来細胞は、臨床検査の分野では「異常白血球」とも呼ばれる。
【0032】
同一検体中に複数種類の異常細胞を含むことは極めてまれである。しかし、測定前は検体がどのような種類の異常細胞を含むか不明である。上述の分析システム及び試薬を用いた分析処理(後述)は、複数種類の異常細胞検出に対応しているので、一回の測定で複数種類の異常細胞の存在及び不存在を示す情報が提供され得る。上述の分析システム及び試薬を用いた分析処理(後述)によると、異常細胞ごとに専用試薬を用いて都度測定する必要はない。
【0033】
(実施形態１の測定処理)
図７のステップＳ１２に関して、実施形態１の測定処理の例を、図８を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ２１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に、血液試料から測定試料を調製させる。具体的には、血液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、全血である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ２２において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させ、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。これにより、測定ユニット４００は、測定試料中の個々の粒子について光学的情報、例えばFSC、SSC-1、SFL-1、SSC-2及びSFL-2の波形データを検出する。ステップＳ２３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。
図７のステップＳ１２に関して、実施形態１の測定処理の例を、図８を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ２１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に、血液試料から測定試料を調製させる。具体的には、血液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、全血である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ２２において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させ、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。これにより、測定ユニット４００は、測定試料中の個々の粒子について光学的情報、例えばFSC、SSC-1、SFL-1、SSC-2及びSFL-2の波形データを検出する。ステップＳ２３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。
【0034】
(実施形態１の分析処理)
図７のステップＳ１３に関して、実施形態１の分析処理の例を、図９Ａ～図１３を参照して説明するが、この例に限定されない。この分析処理では、白血球の分類と、次の異常細胞の検出を可能にする：異常リンパ球、DNA量異常白血球、幼若赤芽球又巨赤芽球、芽球、異型リンパ球、及び幼若顆粒球。この例では、散乱光情報として、前方散乱光情報及び側方散乱光情報を用いる。より具体的には、前方散乱光情報として、前方散乱光強度(以下、「FSC強度」ともいう)を用いる。また、側方散乱光情報として、第２側方散乱光強度(以下、「SSC強度」ともいう)を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報として、第１側方蛍光強度(以下、「SFL-1強度」ともいう)を用い、第２蛍光情報として、第２側方蛍光強度(以下、「SFL-2強度」ともいう)を用いる。以下、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度をとったスキャッタグラムを「第１スキャッタグラム」とも呼ぶ。また、以下、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-2強度をとったスキャッタグラムを「第２スキャッタグラム」とも呼ぶ。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。縦軸を対数スケールとすることで、スキャッタグラム上において、デブリの集団と有核細胞の集団との距離が大きくなる。これにより、スキャッタグラム上で有核細胞の集団をゲーティングすることにより、測定試料中の全粒子の測定データからデブリの測定データを除外できる。
図７のステップＳ１３に関して、実施形態１の分析処理の例を、図９Ａ～図１３を参照して説明するが、この例に限定されない。この分析処理では、白血球の分類と、次の異常細胞の検出を可能にする：異常リンパ球、DNA量異常白血球、幼若赤芽球又巨赤芽球、芽球、異型リンパ球、及び幼若顆粒球。この例では、散乱光情報として、前方散乱光情報及び側方散乱光情報を用いる。より具体的には、前方散乱光情報として、前方散乱光強度(以下、「FSC強度」ともいう)を用いる。また、側方散乱光情報として、第２側方散乱光強度(以下、「SSC強度」ともいう)を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報として、第１側方蛍光強度(以下、「SFL-1強度」ともいう)を用い、第２蛍光情報として、第２側方蛍光強度(以下、「SFL-2強度」ともいう)を用いる。以下、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度をとったスキャッタグラムを「第１スキャッタグラム」とも呼ぶ。また、以下、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-2強度をとったスキャッタグラムを「第２スキャッタグラム」とも呼ぶ。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。縦軸を対数スケールとすることで、スキャッタグラム上において、デブリの集団と有核細胞の集団との距離が大きくなる。これにより、スキャッタグラム上で有核細胞の集団をゲーティングすることにより、測定試料中の全粒子の測定データからデブリの測定データを除外できる。
【0035】
(第１蛍光情報、第２蛍光情報及び側方散乱光情報に基づく白血球の分類)
図９Ａを参照して、ステップＳ１０１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１０２において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度とり、縦軸にSFL-2強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１０３において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。白血球の亜集団とは、リンパ球集団、単球集団、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団である。ここで、側方散乱光情報と第１蛍光情報とに基づいて特定されたリンパ球集団を、以下「第１のリンパ球集団」とも呼ぶ。また、側方散乱光情報と第２蛍光情報とに基づいて特定されたリンパ球集団を、以下「第２のリンパ球集団」とも呼ぶ。フローチャートにおいて、第１のリンパ球集団を「第１Lymp」と表記し、第２のリンパ球集団を「第２Lymp」と表記する。白血球の各亜集団を特定するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定できる。これにより、測定試料中の白血球が亜集団に分類される。
図９Ａを参照して、ステップＳ１０１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１０２において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度とり、縦軸にSFL-2強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１０３において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。白血球の亜集団とは、リンパ球集団、単球集団、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団である。ここで、側方散乱光情報と第１蛍光情報とに基づいて特定されたリンパ球集団を、以下「第１のリンパ球集団」とも呼ぶ。また、側方散乱光情報と第２蛍光情報とに基づいて特定されたリンパ球集団を、以下「第２のリンパ球集団」とも呼ぶ。フローチャートにおいて、第１のリンパ球集団を「第１Lymp」と表記し、第２のリンパ球集団を「第２Lymp」と表記する。白血球の各亜集団を特定するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定できる。これにより、測定試料中の白血球が亜集団に分類される。
【0036】
第１及び／又は第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、白血球の各亜集団を特定してもよい。スキャッタグラム上で白血球の各亜集団が出現する位置自体は公知である。例えば図１０のＡ及びＢに示されるように、白血球の各亜集団は、各スキャッタグラム上に分布する。図中、「Lymp」はリンパ球集団を指し、「Mono」は単球集団を指し、「Neut」は好中球集団を指し、「Eo」は好酸球集団を指し、「Baso」は好塩基球集団を指す。図１０のＡ及びＢでは、白血球の亜集団のみを示し、異常細胞は示していない。これらの図では、白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種の亜集団に分類されているが、これに限定されない。白血球は、リンパ球、単球及び顆粒球の３種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４種の亜集団に分類されてもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。図１０のＡから分かるように、白血球の各亜集団のSFL-1強度は同程度である。これは、白血球の各亜集団のDNA量が同程度であることを示唆する。
【0037】
白血球の分類後、プロセスは、図９ＢのステップＳ２０１へ進行する。本発明者らは、異常細胞のうち、異常リンパ球、DNA量異常白血球、芽球、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定検体では、第２のリンパ球集団に、高いSFL-2強度を示す粒子が増加する傾向があることを見出した。ステップＳ２０１では、そのような傾向が見られる第２のリンパ球集団を特定する。図９Ｂを参照して、ステップＳ２０１において、分析ユニット３００は、ステップＳ１０３で特定した第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含むかを判定する。第２蛍光情報としては、SFL-2強度が好ましい。第２蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、単球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最小値(以下、「単球集団のSFL-2強度の最小値」ともいう)を設定できる。好中球集団を特定している場合は、第２蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、好中球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最大値(以下、「好中球集団のSFL-2強度の最大」ともいう)を設定してもよい。
【0038】
第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、第２のリンパ球集団のうち、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を特定してもよい。図１１のＡを参照して、例えば、第２のリンパ球集団に、高いSFL-2強度を示す粒子が増加した場合、当該粒子は、単球集団が出現する領域にも現れる。図１１のＡにおいて、破線は、単球集団のSFL-2強度の最小値を示す。また、斜線は、第２のリンパ球集団のうち、単球集団のSFL-2強度の最小値以上のSFL-2強度を示す粒子を示す。
【0039】
ステップＳ２０１において、分析ユニット３００は、特定した第２のリンパ球集団を構成する各粒子の第２蛍光情報に基づいて、第２のリンパ球集団に、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子が存在すると判定した場合、プロセスはステップＳ２０２に進行する。第２のリンパ球集団に、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子が存在しないと判定した場合、プロセスは、図９ＤのステップＳ４０１に進行する。
【0040】
(第１の特徴を有する粒子の特定)
従来、DNA量異常白血球を、芽球及び異常リンパ球と区別して検出することは困難であった。また、本発明者らは、DNA量異常白血球と、幼若赤芽球及び巨赤芽球とを区別することも困難であることを見出した。本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定試料、芽球を含む測定試料、及び幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定試料に共通する特徴として、第１のリンパ球集団より高いSFL-1強度を示す粒子が増加することを見出した。一方、異常リンパ球を含む測定検体では、そのような粒子が増加する傾向は見られなかった。また、本発明者らは、第１のリンパ球集団より高いSFL-1強度を示す粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球と、芽球と、幼若赤芽球及び巨赤芽球とを区別できることを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、DNA量異常白血球、芽球、異常リンパ球、及び、幼若赤芽球又は巨赤芽球を分類するために、第１の特徴を有する粒子として、第１のリンパ球集団より高い第１蛍光情報を示す粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。
従来、DNA量異常白血球を、芽球及び異常リンパ球と区別して検出することは困難であった。また、本発明者らは、DNA量異常白血球と、幼若赤芽球及び巨赤芽球とを区別することも困難であることを見出した。本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定試料、芽球を含む測定試料、及び幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定試料に共通する特徴として、第１のリンパ球集団より高いSFL-1強度を示す粒子が増加することを見出した。一方、異常リンパ球を含む測定検体では、そのような粒子が増加する傾向は見られなかった。また、本発明者らは、第１のリンパ球集団より高いSFL-1強度を示す粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球と、芽球と、幼若赤芽球及び巨赤芽球とを区別できることを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、DNA量異常白血球、芽球、異常リンパ球、及び、幼若赤芽球又は巨赤芽球を分類するために、第１の特徴を有する粒子として、第１のリンパ球集団より高い第１蛍光情報を示す粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。
【0041】
ステップＳ２０２において、分析ユニット３００は、第１蛍光情報に基づいて、第１の特徴を有する粒子として、第１のリンパ球集団より高い第１蛍光情報を示す粒子を、測定試料中の粒子から特定する。第１のリンパ球集団より高い第１蛍光情報は、例えば、リンパ球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最大値(以下、「第１のリンパ球集団のSFL-1強度の最大値」ともいう)よりも高い値であり得る。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、第１のリンパ球集団より高い第１蛍光情報を示す粒子を特定してもよい。図１１のＢを参照して、例えば、第１のリンパ球集団より高いSFL-1強度を示す粒子が測定試料に含まれていた場合、当該粒子は、破線で囲まれた領域に現れる。図１１のＢにおいて、矢印は、第１のリンパ球集団のSFL-1強度の最大値を示す。
【0042】
(異常リンパ球の検出)
分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、異常リンパ球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２０３において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合は、分析ユニット３００は、測定試料に異常リンパ球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図９ＣのステップＳ３０１へ進行する。ステップＳ２０３において、第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値未満である場合、プロセスは、ステップＳ２０４へ進行する。第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値未満である場合には、第１の特徴を有する粒子が存在しなかったことを含む。ステップＳ２０４において、分析ユニット３００は、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を、異常リンパ球として特定する。そして、分析ユニット３００は、異常リンパ球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０６に異常リンパ球の存在を示す情報として「Abn-Lymp?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、異常リンパ球の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、異常リンパ球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２０３において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合は、分析ユニット３００は、測定試料に異常リンパ球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図９ＣのステップＳ３０１へ進行する。ステップＳ２０３において、第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値未満である場合、プロセスは、ステップＳ２０４へ進行する。第１の特徴を有する粒子の数が当該閾値未満である場合には、第１の特徴を有する粒子が存在しなかったことを含む。ステップＳ２０４において、分析ユニット３００は、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を、異常リンパ球として特定する。そして、分析ユニット３００は、異常リンパ球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０６に異常リンパ球の存在を示す情報として「Abn-Lymp?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、異常リンパ球の不存在を示す情報であり得る。
【0043】
第１の特徴を有する粒子の数に対応する閾値は、適宜決定できる。例えば、健常者の末梢血、異常リンパ球を含む末梢血、及びDNA量異常白血球、芽球、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む末梢血の測定により得られた光学的情報のデータを蓄積することにより、経験的に設定してもよい。
【0044】
(芽球の検出)
本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定試料と、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定試料では、第１の特徴を有する示す粒子が、第１スキャッタグラムにおいて縦軸(SFL-1強度)方向に、白血球の各亜集団より上方の領域に出現する傾向にあることを見出した。一方、芽球を含む測定試料では、第１の特徴を有する粒子にそのような傾向は見られなかった。分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、芽球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報は、第１の特徴を有する粒子の正常白血球(又はその亜集団の少なくとも１つ)に対する第１蛍光情報のばらつきを表す指標値であり得る。上記のとおり、正常白血球の各亜集団のSFL-1強度は同程度である。第１の特徴を有する粒子と、正常白血球又はその亜集団の少なくとも１つ(好ましくは第１のリンパ球集団)とを合わせて一つの粒子集団とみなしたとき、当該粒子集団の第１蛍光情報のばらつきは、第１スキャッタグラムにおける第１の特徴を有する粒子の分布を反映する。第１蛍光情報のばらつきが大きい場合、第１の特徴を有する粒子は、第１スキャッタグラムの縦軸(SFL-1強度)方向に正常白血球から離散的なクラスタとして表示される。一方、第１蛍光情報のばらつきが小さい場合、第１の特徴を有する粒子は、第１スキャッタグラムにおいて、正常白血球(特に第１のリンパ球集団)に連続的なクラスタとして表示される。すなわち、第１スキャッタグラムにおいて、第１の特徴を有する粒子の出現領域と、正常白血球(特に第１のリンパ球集団)の出現領域とはほぼ重複している。
本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定試料と、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定試料では、第１の特徴を有する示す粒子が、第１スキャッタグラムにおいて縦軸(SFL-1強度)方向に、白血球の各亜集団より上方の領域に出現する傾向にあることを見出した。一方、芽球を含む測定試料では、第１の特徴を有する粒子にそのような傾向は見られなかった。分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、芽球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報は、第１の特徴を有する粒子の正常白血球(又はその亜集団の少なくとも１つ)に対する第１蛍光情報のばらつきを表す指標値であり得る。上記のとおり、正常白血球の各亜集団のSFL-1強度は同程度である。第１の特徴を有する粒子と、正常白血球又はその亜集団の少なくとも１つ(好ましくは第１のリンパ球集団)とを合わせて一つの粒子集団とみなしたとき、当該粒子集団の第１蛍光情報のばらつきは、第１スキャッタグラムにおける第１の特徴を有する粒子の分布を反映する。第１蛍光情報のばらつきが大きい場合、第１の特徴を有する粒子は、第１スキャッタグラムの縦軸(SFL-1強度)方向に正常白血球から離散的なクラスタとして表示される。一方、第１蛍光情報のばらつきが小さい場合、第１の特徴を有する粒子は、第１スキャッタグラムにおいて、正常白血球(特に第１のリンパ球集団)に連続的なクラスタとして表示される。すなわち、第１スキャッタグラムにおいて、第１の特徴を有する粒子の出現領域と、正常白血球(特に第１のリンパ球集団)の出現領域とはほぼ重複している。
【0045】
第１蛍光情報の分散に関する情報は、好ましくは第１蛍光情報の変動係数(以下、「CV」ともいう)の値であり、より好ましくはSFL-1強度のCV値である。第１の特徴を有する粒子のSFL-1強度のCV値は、第１の特徴を有する粒子を含む集団のSFL-1強度の標準偏差を、当該集団のSFL-1強度の平均値で除算することにより算出できる。第１の特徴を有する粒子を含む集団としては、例えば、第１の特徴を有する粒子と正常白血球とを合わせた粒子集団、第１の特徴を有する粒子と正常白血球の亜集団から選択される少なくとも１つとを合わせた粒子集団、又は、第１の特徴を有する粒子と第１のリンパ球集団とを合わせた粒子集団が挙げられる。図９Ｃを参照して、ステップＳ３０１において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子のCV値が、CVに対応する第１の閾値以上であるかを判定する。CV値が当該第１の閾値以上であるとき、分析ユニット３００は、測定試料に芽球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスはステップＳ３０３に進行する。第１の特徴を有する粒子のCV値が、CVに対応する第１の閾値未満であるとき、ステップＳ３０２において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を芽球として特定する。そして、分析ユニット３００は、芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に芽球の存在を示す情報として「Blast?」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、芽球の不存在を示す情報であり得る。
【0046】
CVに対応する第１の閾値は、例えば、DNA量異常白血球、幼若赤芽球及び巨赤芽球の少なくともいずれかを含む検体と、芽球を含む検体とを複数測定し、その測定結果に基づいて予め設定される。好ましくは、CVに対応する第１の閾値は0.05～0.25の間で設定される。例えば、CVに対応する第１の閾値は0.05、0.1、0.15、0.2又は0.25である。DNA量異常白血球、幼若赤芽球及び巨赤芽球の少なくともいずれかを含む検体を測定した場合、図１２のＡの第１スキャッタグラムに示されるように、白血球の各亜集団から離れた位置に集団を形成する(図１２のＡにおいて、矢印で示す）。したがって、DNA量異常白血球、幼若赤芽球及び巨赤芽球の少なくともいずれかを含む検体を測定した場合、図１２のＡにおいて、粒子全体のSFL-1強度のCV又はリンパ球出現領域の粒子のSFL-1強度のCVが第1の閾値以上となる。すなわち、粒子全体のSFL-1強度のCV又はリンパ球出現領域の粒子のSFL-1強度のCVが第１の閾値以上である場合、検体がDNA量異常白血球、幼若赤芽球及び巨赤芽球の少なくともいずれかを含むと判断する。あるいは、当該SFL-1強度のCVが第１の閾値未満である場合、検体が芽球を含むと判断することができる(図９ＣのステップＳ３０１参照)。ここで、粒子全体とは、第１の特徴を有する粒子と正常白血球とを合わせた粒子集団をいう。また、リンパ球出現領域の粒子とは、第１の特徴を有する粒子と第１のリンパ球集団とを合わせた粒子集団をいう。
【0047】
(DNA量異常白血球、及び幼若赤芽球・巨赤芽球の検出)
本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定検体では、第１の特徴を有する粒子のFSC強度が、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定検体に比べて高いことを見出した。これは、FSC強度が粒子の大きさを反映するところ、幼若赤芽球及び巨赤芽球は、DNA量異常白血球よりも小さい粒子であるためと考えられる。分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球の存否を示す情報を出力できる。また、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、幼若赤芽球又は巨赤芽球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の前方散乱光情報である。前方散乱光情報は、好ましくはFSC強度である。
本発明者らは、DNA量異常白血球を含む測定検体では、第１の特徴を有する粒子のFSC強度が、幼若赤芽球又は巨赤芽球を含む測定検体に比べて高いことを見出した。これは、FSC強度が粒子の大きさを反映するところ、幼若赤芽球及び巨赤芽球は、DNA量異常白血球よりも小さい粒子であるためと考えられる。分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球の存否を示す情報を出力できる。また、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子の情報に基づいて、幼若赤芽球又は巨赤芽球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第１の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の前方散乱光情報である。前方散乱光情報は、好ましくはFSC強度である。
【0048】
ステップＳ３０３において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子のFSC強度が、FSC強度に対応する閾値以上であるかを判定する。FSC強度が当該閾値以上であるとき、ステップＳ３０４において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子をDNA量異常白血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にDNA量異常白血球の存在を示す情報として「DNA aneuploidy?」というフラグを出力してもよい。さらに、分析ユニット３００は、DNAインデックスを算出し、その値を出力してもよい。表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、DNA量異常白血球の不存在を示す情報であり得る。
【0049】
DNAインデックスは、後述の参考例２に示されるように、単球及びリンパ球として特定された集団の第１蛍光情報に基づいて算出できる。具体的には次のとおりである。まず、第２スキャッタグラムにおいて、単球及びリンパ球が出現した領域をゲーティングする。この領域には、正常な単球及びリンパ球の他に、DNA量異常白血球が含まれる。そして、この領域内の粒子について、SFL-1強度のヒストグラムを作成する。ヒストグラムでは、正常な単球及びリンパ球に由来するSFL-1強度が低値のピークと、DNA量異常白血球に由来するSFL-1強度が高値のピークとが認められる。２つのピークのそれぞれに含まれる粒子について、SFL-1強度の最頻値を取得する。そして、下記の式によりDNAインデックスを算出する。
【0050】
(DNAインデックス) = (SFL-1強度が高値の集団の最頻値)/(SFL-1強度が低値の集団の最頻値)
【0051】
ステップＳ３０３において、第１の特徴を有する粒子のFSC強度が、これに対応する閾値未満であるとき、ステップＳ３０５において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を幼若赤芽球又は巨赤芽球と特定する。そして、分析ユニット３００は、幼若赤芽球又は巨赤芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に幼若赤芽球又は巨赤芽球の存在を示す情報として「Immature NRBC/Megaloblast?」というフラグを出力してもよい。表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、幼若赤芽球及び巨赤芽球の不存在を示す情報であり得る。
【0052】
FSC強度に対応する閾値として、例えば、第１のリンパ球集団を構成する全ての粒子のFSC強度の最大値(以下、「第１のリンパ球集団のFSC強度の最大値」ともいう)を設定できる。FSC強度が当該閾値以上である場合、第１のリンパ球集団より高いFSC強度を示す粒子は、図１２のＢのスキャッタグラム(横軸がSSC強度であり、縦軸がFSC強度である)に示されるように、破線より上側の領域に集団を形成する。図１２のＢにおいて、破線は、第１のリンパ球集団のFSC強度の最大値を示す。測定試料にDNA量異常白血球が存在する場合、DNA量異常白血球は、図１２のＢのスキャッタグラムにおいて、破線より上側の領域に出現する。測定試料に幼若赤芽球又は巨赤芽球が存在する場合、これらの細胞は、当該スキャッタグラムにおいて、破線より下側の領域に出現する。
【0053】
(第２の特徴を有する粒子の特定)
図９ＢのステップＳ２０１において、第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含まないと判定された場合、図９ＤのステップＳ４０１において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を特定する。本発明者らは、異型リンパ球を含む測定試料では、第２スキャッタグラムにおいて、縦軸(SFL-2強度)方向に単球集団より上方の位置に粒子が出現するという特徴を見出した。一方、幼若顆粒球を含む測定試料では、そのような特徴は見られなかった。本実施形態の検体の分析方法では、異型リンパ球及び幼若顆粒球を分類するために、第２の特徴を有する粒子として、単球集団より高い第２蛍光情報及び第１の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子を特定する。単球集団は、ステップＳ１０２において特定されている。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。
図９ＢのステップＳ２０１において、第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含まないと判定された場合、図９ＤのステップＳ４０１において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を特定する。本発明者らは、異型リンパ球を含む測定試料では、第２スキャッタグラムにおいて、縦軸(SFL-2強度)方向に単球集団より上方の位置に粒子が出現するという特徴を見出した。一方、幼若顆粒球を含む測定試料では、そのような特徴は見られなかった。本実施形態の検体の分析方法では、異型リンパ球及び幼若顆粒球を分類するために、第２の特徴を有する粒子として、単球集団より高い第２蛍光情報及び第１の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子を特定する。単球集団は、ステップＳ１０２において特定されている。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。
【0054】
ステップＳ４０１において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子として、単球集団より高いSFL-2強度及び第１の範囲内のSSC強度を示す粒子を特定する。単球集団より高いSFL-2強度は、例えば、単球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最大値(以下、「単球集団のSFL-2強度の最大値」ともいう)よりも高い値であり得る。SSC強度に関して、第１の範囲は、例えば、第２のリンパ球集団のSSC強度の統計的代表値以上、且つ好中球集団のSSC強度の統計的代表値以下であり得る。ここで、白血球の１つの亜集団のSSC強度の統計的代表値は、当該亜集団を構成する全て粒子のSSC強度から取得される値であり、例えば中央値、平均値、最頻値などが挙げられる。好ましくは中央値である。あるいは、第１の範囲は、単球集団と同じSSC強度であってもよい。すなわち、第１の範囲は、単球集団を構成する全ての粒子のSSC強度の最小値(以下、「単球集団のSSC強度の最小値」ともいう)以上、且つSSC強度の最大値(以下、「単球集団のSSC強度の最大値」ともいう)以下であり得る。第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、第２の特徴を有する粒子を特定してもよい。図１３のＡを参照して、第２の特徴を有する粒子が測定試料に含まれていた場合、当該粒子は、破線で囲まれた領域に現れる。図中、破線で囲まれた領域は、SFL-2強度が単球集団のSFL-2強度の最大値以上であり、且つSSC強度が第１の範囲内である領域を表す。
【0055】
(異型リンパ球の検出)
分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子の情報に基づいて、異型リンパ球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第２の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の数である。ステップＳ４０２において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第２の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合、ステップＳ４０３において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を異型リンパ球と特定する。そして、分析ユニット３００は、異型リンパ球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に異型リンパ球の存在を示す情報として「Aty-Lymp?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ４０２において、第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合、分析ユニット３００は、測定試料に異型リンパ球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、ステップＳ４０４へ進行する。第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、第２の特徴を有する粒子が存在しなかったことを含む。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、異型リンパ球の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子の情報に基づいて、異型リンパ球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第２の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の数である。ステップＳ４０２において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第２の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合、ステップＳ４０３において、分析ユニット３００は、第２の特徴を有する粒子を異型リンパ球と特定する。そして、分析ユニット３００は、異型リンパ球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に異型リンパ球の存在を示す情報として「Aty-Lymp?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ４０２において、第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合、分析ユニット３００は、測定試料に異型リンパ球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、ステップＳ４０４へ進行する。第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、第２の特徴を有する粒子が存在しなかったことを含む。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、異型リンパ球の不存在を示す情報であり得る。
【0056】
(第３の特徴を有する粒子の特定)
本発明者らは、幼若顆粒球を含む測定試料では、第２スキャッタグラムにおいて、縦軸(SFL-2強度)方向に好中球集団より上方の位置に粒子が出現することを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、幼若顆粒球を特定するために、第３の特徴を有する粒子として、好中球集団より高い第２蛍光情報及び第２の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子を特定する。好中球集団は、ステップＳ１０２において特定されている。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。
本発明者らは、幼若顆粒球を含む測定試料では、第２スキャッタグラムにおいて、縦軸(SFL-2強度)方向に好中球集団より上方の位置に粒子が出現することを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、幼若顆粒球を特定するために、第３の特徴を有する粒子として、好中球集団より高い第２蛍光情報及び第２の範囲内の側方散乱光情報を示す粒子を特定する。好中球集団は、ステップＳ１０２において特定されている。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。
【0057】
ステップＳ４０４において、分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子として、単球集団より高いSFL-2強度及び第１の範囲内のSSC強度を示す粒子を特定する。好中球集団より高いSFL-2強度は、例えば、好中球集団のSFL-2強度の最大値よりも高い値であり得る。SSC強度に関して、第２の範囲は、例えば、単球集団のSSC強度の最大値以上、且つ好中球集団を構成する全ての粒子のSSC強度の最大値(以下、「好中球集団のSSC強度の最大値」ともいう)以下であり得る。あるいは、第２の範囲は、好中球集団と同じSSC強度であってもよい。すなわち、第２の範囲は、好中球集団を構成する全ての粒子のSSC強度の最小値(以下、「好中球集団のSSC強度の最小値」ともいう)以上、且つ好中球集団のSSC強度の最大値以下であり得る。第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、第３の特徴を有する粒子を特定してもよい。図１３のＢを参照して、第３の特徴を有する粒子が測定試料に含まれていた場合、当該粒子は、破線で囲まれた領域に現れる。図中、破線で囲まれた領域は、SFL-2強度が好中球集団のSFL-2強度の最大値以上であり、且つSSC強度が第２の範囲内である領域を表す。
【0058】
(幼若顆粒球の検出)
分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子の情報に基づいて、幼若顆粒球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第３の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の数である。ステップＳ４０５において、分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第３の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合、ステップＳ４０６において、分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子を幼若顆粒球と特定する。そして、分析ユニット３００は、幼若顆粒球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に幼若顆粒球の存在を示す情報として「IG?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ４０５において、第３の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、分析ユニット３００は、測定試料に幼若顆粒球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、ステップＳ４０７へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、幼若顆粒球の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子の情報に基づいて、幼若顆粒球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第３の特徴を有する粒子の情報は、例えば、当該粒子の数である。ステップＳ４０５において、分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。第３の特徴を有する粒子の数が当該閾値以上である場合、ステップＳ４０６において、分析ユニット３００は、第３の特徴を有する粒子を幼若顆粒球と特定する。そして、分析ユニット３００は、幼若顆粒球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に幼若顆粒球の存在を示す情報として「IG?」というフラグを出力してもよい。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ４０５において、第３の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、分析ユニット３００は、測定試料に幼若顆粒球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、ステップＳ４０７へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、幼若顆粒球の不存在を示す情報であり得る。
【0059】
ステップＳ４０７において、分析ユニット３００は、測定試料に異常細胞が存在しないことを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に「Normal」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。
【0060】
第２の特徴を有する粒子の数、及び第３の特徴を有する粒子の数のそれぞれに対応する閾値は、適宜決定できる。例えば、健常者の末梢血、異型リンパ球を含む末梢血、及び幼若顆粒球を含む末梢血の測定により得られた光学的情報のデータを蓄積することにより、経験的に設定してもよい。
【0061】
上記のとおり、実施形態１の分析処理の手順をフローチャートに基づいて説明した。このフローチャートから、第１、第２及び第３の特徴を有する粒子の情報と、その情報に基づいて特定される異常細胞との関係を抽出し、以下に記載する。
【0062】
第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含む場合、第１蛍光情報に基づいて、第１の特徴を有する粒子を特定する。第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)～3)の条件を満たすとき、第１の特徴を有する粒子を第１の異常細胞と特定する。そして、第１の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
3) 第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値以上である。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
3) 第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値以上である。
【0063】
あるいは、第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)及び4)の条件を満たすとき、第１の特徴を有する粒子を第２の異常細胞と特定する。そして、第２の異常細胞の存否を示す情報として、芽球が存在することを示す情報を出力する。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、且つ
4) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満である。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、且つ
4) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満である。
【0064】
あるいは、第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であるとき、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を、第３の異常細胞と特定する。そして、第３の異常細胞の存否を示す情報として、異常リンパ球が存在することを示す情報を出力する。
【0065】
あるいは、第１の特徴を有する粒子の情報が、下記の1)、2)及び5)の条件を満たすとき、第１の特徴を有する粒子を第４の異常細胞と特定する。そして、第４の異常細胞の存否を示す情報として、幼若赤芽球又は巨赤芽球が存在することを示す情報を出力する。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
5) 第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値未満である。
1) 第１の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であり、
2) 第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であり、且つ
5) 第１の特徴を有する粒子の前方散乱光情報が、これに対応する閾値未満である。
【0066】
第２のリンパ球集団が、第２蛍光情報に対応する第１の閾値以上の第２蛍光情報を示す粒子を含まない場合、第２蛍光情報と側方散乱光情報に基づいて、単球集団及び第２の特徴を有する粒子を特定する。第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第２の特徴を有する粒子を第５の異常細胞と特定する。そして、第５の異常細胞の存否を示す情報として、異型リンパ球が存在することを示す情報を出力する。
【0067】
第２蛍光情報と前記側方散乱光情報に基づいて、好中球集団及び第３の特徴を有する粒子をさらに特定する。第２の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ第３の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第３の特徴を有する粒子を第６の異常細胞と特定する。そして、第６の異常細胞の存否を示す情報として、幼若顆粒球が存在することを示す情報を出力する。
【0068】
(実施形態１の分析処理の変形例)
図９ＣのステップＳ３０２で第１の特徴を有する粒子を芽球として特定した場合に、芽球をさらに分類する分析処理の例を、図１４及び１５を参照して説明する。しかし、本実施形態の検体の分析方法はこの例に限定されない。この分析処理では、芽球をリンパ芽球又は骨髄芽球に分類することを可能にする。
図９ＣのステップＳ３０２で第１の特徴を有する粒子を芽球として特定した場合に、芽球をさらに分類する分析処理の例を、図１４及び１５を参照して説明する。しかし、本実施形態の検体の分析方法はこの例に限定されない。この分析処理では、芽球をリンパ芽球又は骨髄芽球に分類することを可能にする。
【0069】
本発明者らは、芽球が、骨髄芽球であるか又はリンパ芽球であるかを判別できることを見出した。具体的には、測定試料に骨髄芽球が含まれる場合、第１スキャッタグラムにおいて第１のリンパ球集団は、横軸方向の右方に広がって分布する傾向にある。一方、測定試料にリンパ芽球が含まれる場合は、第１のリンパ球集団にそのような傾向は見られなかった。本実施形態の検体の分析方法では、第１の特徴を有する粒子の第１蛍光情報の分散に関する情報(ステップＳ３０１参照)、及び第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報に基づいて、芽球をリンパ芽球又は骨髄芽球として特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。第１蛍光情報の分散に関する情報は、好ましくは第１蛍光情報のCV値であり、より好ましくはSFL-1強度のCV値である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。側方散乱光情報の分散に関する情報は、粒子の側方散乱光情報のばらつきを表す指標値であり得る。側方散乱光情報の分散に関する情報は、好ましくは側方散乱光情報のCV値であり、より好ましくはSSC強度のCV値である。
【0070】
(リンパ芽球の検出)
図１４を参照して、ステップＳ５０１において、分析ユニット３００は、例えば、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満であるかを判定する。SSC強度のCV値は、第１のリンパ球集団のSSC強度の標準偏差を、第１のリンパ球集団のSSC強度の平均値で除算することにより算出できる。CVに対応する第２の閾値は、例えば、骨髄芽球を含む複数の検体と、リンパ芽球を含む複数の検体とを測定し、その測定結果に基づいて予め設定される。好ましくは、CVに対応する第２の閾値は0.3～0.5の間で設定される。例えば、第２の閾値は0.3、0.35、0.4、0.45又は0.5である。SSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満である場合、図１５のＡの第１スキャッタグラムに示されるように、第１のリンパ球集団はリンパ芽球を包含するが、横軸(SSC強度)方向への広がるような分布はあまり認められない。ステップＳ５０１において、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満である場合、ステップＳ５０２において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子をリンパ芽球と特定する。そして、分析ユニット３００は、リンパ芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にリンパ芽球の存在を示す情報として「L-Blast?」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、リンパ芽球の不存在を示す情報であり得る。
図１４を参照して、ステップＳ５０１において、分析ユニット３００は、例えば、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満であるかを判定する。SSC強度のCV値は、第１のリンパ球集団のSSC強度の標準偏差を、第１のリンパ球集団のSSC強度の平均値で除算することにより算出できる。CVに対応する第２の閾値は、例えば、骨髄芽球を含む複数の検体と、リンパ芽球を含む複数の検体とを測定し、その測定結果に基づいて予め設定される。好ましくは、CVに対応する第２の閾値は0.3～0.5の間で設定される。例えば、第２の閾値は0.3、0.35、0.4、0.45又は0.5である。SSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満である場合、図１５のＡの第１スキャッタグラムに示されるように、第１のリンパ球集団はリンパ芽球を包含するが、横軸(SSC強度)方向への広がるような分布はあまり認められない。ステップＳ５０１において、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値未満である場合、ステップＳ５０２において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子をリンパ芽球と特定する。そして、分析ユニット３００は、リンパ芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にリンパ芽球の存在を示す情報として「L-Blast?」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、リンパ芽球の不存在を示す情報であり得る。
【0071】
(骨髄芽球の検出)
SSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値以上である場合、図１５のＢの第１スキャッタグラムに示されるように、第１のリンパ球集団は骨髄芽球を包含し、横軸(SSC強度)方向への広がるような分布が認められる。ステップＳ５０１において、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値以上である場合、ステップＳ５０３において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を骨髄芽球と特定する。そして、分析ユニット３００は、骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に骨髄芽球の存在を示す情報として「M-Blast?」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、骨髄芽球の不存在を示す情報であり得る。
SSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値以上である場合、図１５のＢの第１スキャッタグラムに示されるように、第１のリンパ球集団は骨髄芽球を包含し、横軸(SSC強度)方向への広がるような分布が認められる。ステップＳ５０１において、第１のリンパ球集団のSSC強度のCV値が、CVに対応する第２の閾値以上である場合、ステップＳ５０３において、分析ユニット３００は、第１の特徴を有する粒子を骨髄芽球と特定する。そして、分析ユニット３００は、骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に骨髄芽球の存在を示す情報として「M-Blast?」というフラグを出力してもよい。そして、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、骨髄芽球の不存在を示す情報であり得る。
【0072】
上記のとおり、実施形態１の変形例の分析処理の手順をフローチャートに基づいて説明した。このフローチャートから、第１の特徴を有する粒子の情報及び第１のリンパ球集団の情報と、それらの情報に基づいて特定される第２の異常細胞との関係を抽出し、以下に記載する。
【0073】
第１の特徴を有する粒子の情報及び第１のリンパ球集団の情報に基づいて、第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球又は骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する。より具体的には、第１の特徴を有する粒子の情報が、上記1)及び4)の条件を満たし、且つ、第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値未満であるとき、第２の異常細胞の存否を示す情報として、リンパ芽球が存在することを示す情報を出力する。あるいは、第１の特徴を有する粒子の情報が、上記1)及び4)の条件を満たし、且つ、第１のリンパ球集団の側方散乱光情報の分散に関する情報が、これに対応する閾値以上であるとき、第２の異常細胞の存否を示す情報として、骨髄芽球が存在することを示す情報を出力する。
【0074】
(実施形態２の測定処理及び分析処理)
図７のステップＳ１２に関して、実施形態２の測定処理は、実施形態１について述べたことと同様である。図７のステップＳ１３に関して、実施形態２の分析処理の例を、図１６Ａ～図１８を参照して説明するが、この例に限定されない。上述のとおり、実施形態２の分析処理では、まず、実施形態１の分析に干渉し得る粒子を特定する。そして、実施形態１と同様にして、白血球の亜集団への分類及び異常細胞の検出を行う。実施形態２において、実施形態１の分析処理の前に特定する粒子は、血小板凝集、マラリア感染赤血球及び有核赤血球である。以下では、これらの粒子を特定するステップまでを説明する。これらの粒子を特定した後の分析処理については、実施形態１について述べたことと同様である。実施形態２の分析処理の例では、散乱光情報として、前方散乱光情報及び側方散乱光情報を用いる。より具体的には、前方散乱光情報として、前方散乱光信号の幅に関する情報を用いる。また、側方散乱光情報として、SSC強度を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報としてSFL-1強度を用い、第２蛍光情報としてSFL-2強度を用いる。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムを作成してもよい。また、これらのスキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。
図７のステップＳ１２に関して、実施形態２の測定処理は、実施形態１について述べたことと同様である。図７のステップＳ１３に関して、実施形態２の分析処理の例を、図１６Ａ～図１８を参照して説明するが、この例に限定されない。上述のとおり、実施形態２の分析処理では、まず、実施形態１の分析に干渉し得る粒子を特定する。そして、実施形態１と同様にして、白血球の亜集団への分類及び異常細胞の検出を行う。実施形態２において、実施形態１の分析処理の前に特定する粒子は、血小板凝集、マラリア感染赤血球及び有核赤血球である。以下では、これらの粒子を特定するステップまでを説明する。これらの粒子を特定した後の分析処理については、実施形態１について述べたことと同様である。実施形態２の分析処理の例では、散乱光情報として、前方散乱光情報及び側方散乱光情報を用いる。より具体的には、前方散乱光情報として、前方散乱光信号の幅に関する情報を用いる。また、側方散乱光情報として、SSC強度を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報としてSFL-1強度を用い、第２蛍光情報としてSFL-2強度を用いる。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムを作成してもよい。また、これらのスキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。
【0075】
(第１蛍光情報及び側方散乱光情報に基づく白血球の分類)
図１６Ａを参照して、ステップＳ１１１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。
図１６Ａを参照して、ステップＳ１１１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-1強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。
【0076】
(第４の特徴を有する粒子の特定)
第２スキャッタグラムでは、血小板凝集及びマラリア感染赤血球が出現する領域は、好塩基球集団、好中球集団及び好酸球集団が出現する領域と重なる。また、第２スキャッタグラムでは、血小板凝集とマラリア感染赤血球とがほぼ同じ領域に出現する。そのため、第２スキャッタグラムにより、血小板凝集及びマラリア感染赤血球を特定することは困難であった。一方、第１スキャッタグラムでは、図１７のＡに示されるように、第１蛍光情報に基づいて、白血球と、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。検体に有核赤血球も含まれる場合は、有核赤血球と、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。これは、白血球及び有核赤血球は核を有するので、第１蛍光情報が高値を示すのに対して、血小板凝集及びマラリア感染赤血球は核を有さないので、第１蛍光情報が低値を示すことによる。本実施形態の検体の分析方法では、血小板凝集及びマラリア感染赤血球を特定するために、第４の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子を特定する。好ましい実施形態では、第４の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満であり、且つ側方散乱光情報が、側方散乱光情報に対応する閾値以上である粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。第１蛍光情報と側方散乱光情報とを組み合わせることにより、デブリと、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。
第２スキャッタグラムでは、血小板凝集及びマラリア感染赤血球が出現する領域は、好塩基球集団、好中球集団及び好酸球集団が出現する領域と重なる。また、第２スキャッタグラムでは、血小板凝集とマラリア感染赤血球とがほぼ同じ領域に出現する。そのため、第２スキャッタグラムにより、血小板凝集及びマラリア感染赤血球を特定することは困難であった。一方、第１スキャッタグラムでは、図１７のＡに示されるように、第１蛍光情報に基づいて、白血球と、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。検体に有核赤血球も含まれる場合は、有核赤血球と、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。これは、白血球及び有核赤血球は核を有するので、第１蛍光情報が高値を示すのに対して、血小板凝集及びマラリア感染赤血球は核を有さないので、第１蛍光情報が低値を示すことによる。本実施形態の検体の分析方法では、血小板凝集及びマラリア感染赤血球を特定するために、第４の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子を特定する。好ましい実施形態では、第４の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満であり、且つ側方散乱光情報が、側方散乱光情報に対応する閾値以上である粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。側方散乱光情報は、好ましくはSSC強度である。第１蛍光情報と側方散乱光情報とを組み合わせることにより、デブリと、血小板凝集及びマラリア感染赤血球とを区別できる。
【0077】
図１６Ａを参照して、ステップＳ１１３において、分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子を特定する。ここで、SFL-1強度は、粒子に含まれるDNA量を反映する。第１蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、リンパ球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「第１のリンパ球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を設定できる。あるいは、単球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「単球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として設定できる。好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団を特定できている場合は、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を設定してもよい。すなわち、そのような第１の閾値未満であるSFL-1強度を示す粒子を抽出したとき、当該粒子に白血球はほとんど含まれない。SFL-1強度が第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子は、DNA量が白血球よりも少ない粒子である。そのような粒子としては、例えば、赤血球ゴーストなどのデブリ、血小板凝集(PLT-clumps)及びマラリア感染赤血球(iRBCs)が挙げられる。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、デブリ、血小板凝集及びマラリア感染赤血球が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図１７のＡに示されるように、白血球の各亜集団よりもSFL-1強度が低い領域(破線で囲まれた領域)にデブリ、血小板凝集(図では「PLTc」と表示する)及びマラリア感染赤血球(iRBCs)が分布する。なお、図１７のＡでは、デブリ、血小板凝集及びマラリア感染赤血球の全てが出現しているが、これに限定されない。デブリ、血小板凝集及びマラリア感染赤血球の少なくとも１つがスキャッタグラムに出現してもよい。
【0078】
第１蛍光情報に対応する第１の閾値は、第１蛍光情報に対応する数値範囲であってもよい。デブリは蛍光色素による染色がほとんどなされないので、例えば、デブリの集団よりも高いSFL-1強度を数値範囲の下限としてもよい。そして、数値範囲の上限を、白血球のいずれの亜集団よりも低いSFL-1強度としてもよい。測定試料中の粒子から、SFL-1強度が当該数値範囲内である粒子を特定することにより、デブリを除外し、且つ血小板凝集又はマラリア感染赤血球である粒子を選別し得る。
【0079】
ステップＳ１１３において、分析ユニット３００は、測定試料中の粒子から、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満であり、且つSSC強度が、側方散乱光情報に対応する閾値以上である粒子を特定してもよい。側方散乱光情報に対応する閾値としては、例えば、好中球集団のSSC強度の最小値又は単球集団のSSC強度の最大値を設定してもよい。通常、デブリの集団のSSC強度は、好中球集団、血小板凝集及びマラリア感染赤血球のSSC強度より低い傾向にある。よって、上記の第１の閾値未満であるSFL-1強度を示し、且つ上記の閾値以下のSSC強度を示す粒子を抽出したとき、当該粒子には、白血球だけでなく、デブリもほとんど含まれない。
【0080】
分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子の情報に基づいて、血小板凝集又はマラリア感染赤血球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第４の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数及び前方散乱光情報である。ステップＳ１１４において、分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値未満であるかを判定する。第４の特徴を有する粒子の数が、当該閾値未満である場合は、測定試料に血小板凝集及びマラリア感染赤血球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図１６ＢのステップＳ２１１へ進行する。なお、第４の特徴を有する粒子がデブリであると判断して、当該粒子を測定試料中の粒子から除外してもよい。ステップＳ１１４において、第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合は、測定試料に血小板凝集又はマラリア感染赤血球が含まれていると判断する。この場合、プロセスはステップＳ１１５へ進行する。
【0081】
第４の特徴を有する粒子の数に対応する閾値は、適宜決定できる。例えば、健常者の末梢血、血小板凝集が生じた末梢血、及びマラリア感染赤血球を含む末梢血の測定により得られた光学的情報のデータを蓄積することにより、経験的に設定してもよい。
【0082】
従来、血小板凝集とマラリア感染赤血球との判別は困難であった。図１７のＡに示されるように、血小板凝集とマラリア感染赤血球とは、SFL-1強度及びSSC強度で明確に区別できない。しかし、本発明者らは、前方散乱光情報に基づいて、血小板凝集とマラリア感染赤血球とを判別できることを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、第４の特徴を有する粒子が血小板凝集又はマラリア感染赤血球であるかを判別するために、第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。前方散乱光信号の幅に関する情報は、好ましくは前方散乱光パルス幅(以下、「FSC-W」ともいう)である。ここで、血小板凝集は、複数の血小板の集合体であり、マラリア感染赤血球は単一の粒子である。したがって、両者の間には、FSC-Wに差があり得る。
【0083】
ステップＳ１１５において、分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子のFSC-W値が、FSC-Wに対応する閾値以上であるかを判定する。分析ユニット３００は、図１７のＢに示すような、横軸にFSC-Wをとり、縦軸にFSC強度をとったスキャッタグラムを作成してもよい。図１７のＢにおいて、破線は、FSC-Wに対応する閾値を示す。マラリア感染赤血球の集団は、スキャッタグラム上の破線より左側の領域に出現する。血小板凝集の集団は、スキャッタグラム上の破線より右側の領域に出現する。第４の特徴を有する粒子のFSC-W値が、FSC-Wに対応する閾値以上であるとき、ステップＳ１１６において、分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子を血小板凝集と特定する。そして、分析ユニット３００は、血小板凝集が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に血小板凝集の存在を示す情報として「PLT-clumps?」というフラグを出力してもよい。その後、プロセスは、図１６ＢのステップＳ２１１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、血小板凝集の不存在を示す情報であり得る。
【0084】
第４の特徴を有する粒子のFSC-W値が、FSC-Wに対応する閾値未満であるとき、ステップＳ１１７において、分析ユニット３００は、第４の特徴を有する粒子をマラリア感染赤血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、マラリア感染赤血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にマラリア感染赤血球の存在を示す情報として「iRBCs?」というフラグを出力してもよい。その後、プロセスは、図１６ＢのステップＳ２１１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、マラリア感染赤血球の不存在を示す情報であり得る。
【0085】
(第２蛍光情報及び側方散乱光情報に基づく白血球の分類)
図１６Ｂを参照して、ステップＳ２１１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-2強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ２１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。
図１６Ｂを参照して、ステップＳ２１１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸にSSC強度をとり、縦軸にSFL-2強度とった平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ２１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から白血球の各亜集団を特定する。
【0086】
(第５の特徴を有する粒子の特定)
図１８のＡに示されるように、第１スキャッタグラムでは、有核赤血球の集団は、デブリの集団から離れた位置に出現するが、有核赤血球が出現する領域は、リンパ球集団が出現する領域と重なる。そのため、第１スキャッタグラムのみにより、有核赤血球を特定することは困難であった。一方、図１８のＢに示されるように、第２スキャッタグラムでは、有核赤血球の集団は、白血球の各亜集団から離れた位置に出現するが、有核赤血球が出現する領域とデブリが出現する領域とが近接する。そのため、第２スキャッタグラムのみにより、有核赤血球を特定することは困難であった。しかし、本発明者らは、第１蛍光情報及び第２蛍光情報に基づいて、有核赤血球を検出できることを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の有核赤血球(NRBC)を検出するために、第５の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上であり、且つ第２蛍光情報が、第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度であり、第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。第１蛍光情報に対応する第１の閾値は、上記のとおりである。第１蛍光情報と第２蛍光情報とを組み合わせることにより、有核赤血球のみを抽出できる。この点について、以下に説明する。
図１８のＡに示されるように、第１スキャッタグラムでは、有核赤血球の集団は、デブリの集団から離れた位置に出現するが、有核赤血球が出現する領域は、リンパ球集団が出現する領域と重なる。そのため、第１スキャッタグラムのみにより、有核赤血球を特定することは困難であった。一方、図１８のＢに示されるように、第２スキャッタグラムでは、有核赤血球の集団は、白血球の各亜集団から離れた位置に出現するが、有核赤血球が出現する領域とデブリが出現する領域とが近接する。そのため、第２スキャッタグラムのみにより、有核赤血球を特定することは困難であった。しかし、本発明者らは、第１蛍光情報及び第２蛍光情報に基づいて、有核赤血球を検出できることを見出した。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の有核赤血球(NRBC)を検出するために、第５の特徴を有する粒子として、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上であり、且つ第２蛍光情報が、第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子を特定する。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度であり、第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。第１蛍光情報に対応する第１の閾値は、上記のとおりである。第１蛍光情報と第２蛍光情報とを組み合わせることにより、有核赤血球のみを抽出できる。この点について、以下に説明する。
【0087】
有核赤血球は、DNA量が白血球と同程度である。測定試料に有核赤血球が含まれる場合、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上の粒子は、有核赤血球及び白血球を包含する。また、有核赤血球は、RNA量が白血球の各亜集団よりも少ない。ここで、SFL-2強度は、粒子に含まれるRNA量を反映する。第２蛍光情報に対応する第２の閾値として、例えば、リンパ球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最小値(以下、「第２のリンパ球集団のSFL-2強度の最小値」ともいう)を設定できる。好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団を特定している場合は、第２蛍光情報に対応する第２の閾値として、例えば、好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最小値(以下、「好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団のSFL-2強度の最小値」ともいう)を設定してもよい。そのような第２の閾値未満であるSFL-2強度を示す粒子を抽出したとき、当該粒子に白血球はほとんど含まれない。SFL-2強度が第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子は、RNA量が白血球よりも少ない粒子である。よって、測定試料に有核赤血球が含まれる場合、SFL-2強度が、第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下の粒子は、有核赤血球及びデブリを包含する。したがって、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上であり、且つSFL-2強度が、第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子には、有核赤血球が含まれるが、白血球及びデブリは含まれない。
【0088】
図１６Ｂを参照して、ステップＳ２１３において、分析ユニット３００は、第５の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上であり、且つSFL-2強度が、第２蛍光情報に対応する第２の閾値以下である粒子を特定する。スキャッタグラムに基づいて、第５の特徴を有する粒子を特定してもよい。例えば、測定試料中の全粒子の測定データから、第１蛍光情報に対応する第１の閾値以上のSFL-1強度を示す粒子の測定データを抽出する。これにより、デブリの測定データを除外できる。次いで、抽出した粒子のデータに基づいて、第２スキャッタグラムを作成する。デブリが除外されているので、第２スキャッタグラムには、デブリは出現しない。また、第２スキャッタグラムでは、白血球の各亜集団は、第２蛍光情報に対する第２の閾値以上の領域に分布する。よって、デブリ及び白血球の影響を受けることなく、第５の特徴を有する粒子を第２スキャッタグラム上で特定できる。
【0089】
(有核赤血球の検出)
分析ユニット３００は、第５の特徴を有する粒子の情報に基づいて有核赤血球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第５の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２１４において、分析ユニット３００は、特定した粒子を計数し、その数が、当該粒子に対応する閾値未満であるかを判定する。第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、測定試料に有核赤血球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図９ＢのステップＳ２０１へ進行する。ステップＳ２１４において、第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ２１５において、分析ユニット３００は、第５の特徴を有する粒子を有核赤血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、有核赤血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に有核赤血球の存在を示す情報として「NRBC?」というフラグを出力してもよい。その後、プロセスは、図９ＢのステップＳ２０１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、有核赤血球の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第５の特徴を有する粒子の情報に基づいて有核赤血球の存否を示す情報を出力できる。このとき、第５の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２１４において、分析ユニット３００は、特定した粒子を計数し、その数が、当該粒子に対応する閾値未満であるかを判定する。第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、測定試料に有核赤血球は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図９ＢのステップＳ２０１へ進行する。ステップＳ２１４において、第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ２１５において、分析ユニット３００は、第５の特徴を有する粒子を有核赤血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、有核赤血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に有核赤血球の存在を示す情報として「NRBC?」というフラグを出力してもよい。その後、プロセスは、図９ＢのステップＳ２０１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、有核赤血球の不存在を示す情報であり得る。
【0090】
第５の特徴を有する粒子の数に対応する閾値は、適宜決定できる。例えば、健常者の末梢血、及び有核赤血球を含む末梢血の測定により得られた光学的情報のデータを蓄積することにより、経験的に設定してもよい。
【0091】
上記のとおり、実施形態２の分析処理の手順をフローチャートに基づいて説明した。このフローチャートから、第４及び第５の特徴を有する粒子の情報と、その情報に基づいて特定される異常細胞との関係を抽出し、以下に記載する。
【0092】
第４の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第７の異常細胞の存否を示す情報及び第８の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する。第４の特徴を有する粒子の情報が、下記の6)及び7)の条件を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を第７の異常細胞と特定する。そして、第７の異常細胞の存否を示す情報として、血小板凝集が存在することを示す情報を出力する。
6) 第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
7) 第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値以上である。
6) 第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
7) 第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値以上である。
【0093】
あるいは、第４の特徴を有する粒子の情報が、下記の6)及び8)の条件を満たすとき、第４の特徴を有する粒子を第８の異常細胞と特定する。そして、第８の異常細胞の存否を示す情報として、マラリア感染赤血球が存在することを示す情報を出力する。
6) 第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
8) 第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値未満である。
6) 第４の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満であり、且つ
8) 第４の特徴を有する粒子の前方散乱光信号の幅に関する情報が、これに対応する閾値未満である。
【0094】
また、第５の特徴を有する粒子の情報に基づいて、第９の異常細胞の存否を示す情報をさらに出力する。第５の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第５の特徴を有する粒子を第９の異常細胞と特定する。そして、第９の異常細胞の存否を示す情報として、有核赤血球が存在することを示す情報を出力する。
【0095】
(実施形態３に用いられる分析システム)
実施形態３では、血液試料及び体液試料の両方の測定ができる分析システム５００を用いる。そのような分析システム５００の動作の一例を、図７を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ１１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、ユーザからの測定開始の指示を、操作部３０６を介して受け付ける。測定開始の指示の入力受付は、表示部３０５に表示される検体の種類の選択画面に基づいて行われる。制御部３０１は、検体の種類を指定するための選択画面を表示部３０５に表示する。当該選択画面により、ユーザは、検体の種類として、例えば全血及び体液のいずれかを指定できる。検体の種類や測定項目等の設定後、画面に表示される測定開始をユーザが決定することで測定が行われる。なお、検体の種類の選択はこの例に限られず、例えば、体液について、体腔液、脳脊髄液、関節液、腹膜透析排液、肺胞洗浄液等の具体的な種類を指定する構成であってもよい。
実施形態３では、血液試料及び体液試料の両方の測定ができる分析システム５００を用いる。そのような分析システム５００の動作の一例を、図７を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ１１において、分析ユニット３００の制御部３０１は、ユーザからの測定開始の指示を、操作部３０６を介して受け付ける。測定開始の指示の入力受付は、表示部３０５に表示される検体の種類の選択画面に基づいて行われる。制御部３０１は、検体の種類を指定するための選択画面を表示部３０５に表示する。当該選択画面により、ユーザは、検体の種類として、例えば全血及び体液のいずれかを指定できる。検体の種類や測定項目等の設定後、画面に表示される測定開始をユーザが決定することで測定が行われる。なお、検体の種類の選択はこの例に限られず、例えば、体液について、体腔液、脳脊髄液、関節液、腹膜透析排液、肺胞洗浄液等の具体的な種類を指定する構成であってもよい。
【0096】
制御部３０１は、測定開始の指示及び検体の種類の指定を受け付けると、測定開始を指示する指示データを測定ユニット４００に送信する。検体の種類として体液の指定の入力を受け付けた場合、制御部３０１は、体液測定のための設定(例えば、反応時間、測定時間、追加の洗浄等)に関する指示データも測定ユニット４００に送信する。体液試料を測定する場合、試薬との反応時間及び測定時間を、血液試料を測定する場合とは異なる長さに設定できる。例えば、体液が脳脊髄液である場合、反応時間及び測定時間を、血液試料を測定する場合よりも長く設定できる。また、血液試料と体液試料との間のキャリーオーバー等を抑制するため、検体吸引部やフローセルに対して追加の洗浄を行うよう設定できる。測定ユニット４００は、当該指示データを受信して、ステップＳ１２において測定処理を実行する。
【0097】
(実施形態３の測定処理)
図７のステップＳ１２に関して、実施形態３の測定処理の例を、図１９を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ３１において、分析ユニット３００が、検体の種類として全血の指定を受け付けた場合、ステップＳ３２において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に全血モードで測定試料を調製させる。具体的には、血液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、全血である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ３１において、分析ユニット３００が、検体の種類として体液の指定を受け付けた場合、ステップＳ３３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に体液モードで測定試料を調製させる。具体的には、体液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、体液である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ３４において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、調製された測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させて、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。ステップＳ３５において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。
図７のステップＳ１２に関して、実施形態３の測定処理の例を、図１９を参照して説明するが、この例に限定されない。ステップＳ３１において、分析ユニット３００が、検体の種類として全血の指定を受け付けた場合、ステップＳ３２において、分析ユニット３００の制御部３０１は、測定ユニット４００に全血モードで測定試料を調製させる。具体的には、血液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、全血である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ３１において、分析ユニット３００が、検体の種類として体液の指定を受け付けた場合、ステップＳ３３において、制御部３０１は、測定ユニット４００に体液モードで測定試料を調製させる。具体的には、体液試料から測定試料を調製する条件で、測定ユニット４００は、体液である検体と染色試薬と溶血試薬とを反応チャンバ４２０内で混合して、測定試料を調製する。ステップＳ３４において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、調製された測定試料をＦＣＭ検出部４６０に導出させて、フローサイトメトリ法による光学的測定を実行させる。ステップＳ３５において、制御部３０１は、測定ユニット４００に、光学的情報を分析ユニット３００に送信させて、測定処理を終了する。そして、分析ユニット３００は、図７のステップＳ１３の分析処理を実行する。
【0098】
(実施形態３の分析処理)
図７のステップＳ１３に関して、分析ユニット３００が、検体の種類として体液試料の指定を受け付けた場合の分析処理の例を、図２０Ａ～図２３を参照して説明するが、この例に限定されない。この分析処理では、白血球の分類と、次の異常細胞の検出を可能にする：細菌又は真菌、組織由来細胞、及びDNA量異常白血球。血液試料の指定を受け付けた場合の分析処理は、実施形態１及び２について述べたことと同様である。実施形態３の分析処理の例では、散乱光情報として側方散乱光情報を用いる。より具体的には、側方散乱光情報として、SSC強度を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報としてSFL-1強度を用い、第２蛍光情報としてSFL-2強度を用いる。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムを作成してもよい。また、これらのスキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。
図７のステップＳ１３に関して、分析ユニット３００が、検体の種類として体液試料の指定を受け付けた場合の分析処理の例を、図２０Ａ～図２３を参照して説明するが、この例に限定されない。この分析処理では、白血球の分類と、次の異常細胞の検出を可能にする：細菌又は真菌、組織由来細胞、及びDNA量異常白血球。血液試料の指定を受け付けた場合の分析処理は、実施形態１及び２について述べたことと同様である。実施形態３の分析処理の例では、散乱光情報として側方散乱光情報を用いる。より具体的には、側方散乱光情報として、SSC強度を用いる。SSC強度に替えて、第１側方散乱光強度を用いてもよい。また、第１蛍光情報としてSFL-1強度を用い、第２蛍光情報としてSFL-2強度を用いる。必要に応じて、第１及び第２スキャッタグラムを作成してもよい。また、これらのスキャッタグラムの縦軸を、各蛍光強度の対数スケールでとってもよい。
【0099】
(第１蛍光情報及び側方散乱光情報に基づく白血球の分類)
図２０Ａを参照して、ステップＳ１２１において、分析ユニット３００が、検体の種類として全血の指定を受け付けた場合、プロセスは、図９ＡのステップＳ１０１に進行する。あるいは、図１６ＡのステップＳ１１１へ進行してもよい。分析ユニット３００が、検体の種類として体液の指定を受け付けた場合、プロセスはステップＳ１２２に進行する。ステップＳ１２２において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸をSSC強度とし、縦軸をSFL-1強度とする平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から、単核球集団及び多形核集団を特定する。単核球とは、リンパ球及び単球の総称である。可能であれば、リンパ球集団及び単球集団を特定してもよい。単核球集団は、フローチャートにおいて「MN」と表記する。多形核球とは、好中球、好酸球及び好塩基球の総称である。可能であれば、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団の少なくとも１つを特定してもよい。多形核球集団は、フローチャートにおいて「PMN」と表記する。白血球を単核球集団及び多形核球集団に分類するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、白血球を亜集団に分類できる。また、スキャッタグラム上で白血球の単核球集団及び多形核球集団が出現する位置は公知であるので、スキャッタグラムに基づいて、各亜集団を特定してもよい。第１スキャッタグラムを作成している場合、例えば図２１のＡに示されるように、白血球の単核球集団及び多形核球集団がスキャッタグラム上に分布する。しかし、この図に限定されず、白血球は、例えばリンパ球、単球及び顆粒球の３種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種の亜集団に分類されてもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。白血球の分類後、プロセスはステップＳ１２４へ進行する。
図２０Ａを参照して、ステップＳ１２１において、分析ユニット３００が、検体の種類として全血の指定を受け付けた場合、プロセスは、図９ＡのステップＳ１０１に進行する。あるいは、図１６ＡのステップＳ１１１へ進行してもよい。分析ユニット３００が、検体の種類として体液の指定を受け付けた場合、プロセスはステップＳ１２２に進行する。ステップＳ１２２において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸をSSC強度とし、縦軸をSFL-1強度とする平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第１スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ１１２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から、単核球集団及び多形核集団を特定する。単核球とは、リンパ球及び単球の総称である。可能であれば、リンパ球集団及び単球集団を特定してもよい。単核球集団は、フローチャートにおいて「MN」と表記する。多形核球とは、好中球、好酸球及び好塩基球の総称である。可能であれば、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団の少なくとも１つを特定してもよい。多形核球集団は、フローチャートにおいて「PMN」と表記する。白血球を単核球集団及び多形核球集団に分類するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、白血球を亜集団に分類できる。また、スキャッタグラム上で白血球の単核球集団及び多形核球集団が出現する位置は公知であるので、スキャッタグラムに基づいて、各亜集団を特定してもよい。第１スキャッタグラムを作成している場合、例えば図２１のＡに示されるように、白血球の単核球集団及び多形核球集団がスキャッタグラム上に分布する。しかし、この図に限定されず、白血球は、例えばリンパ球、単球及び顆粒球の３種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種の亜集団に分類されてもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。白血球の分類後、プロセスはステップＳ１２４へ進行する。
【0100】
(第６の特徴を有する粒子の特定)
本発明者らは、第１蛍光情報に基づいて、細菌及び真菌を検出できることを見出した。具体的には、細菌及び真菌は、DNA量が白血球に比べて少ないので、SFL-1強度が低い傾向にある。フローサイトメトリ法では、いずれの細菌及び真菌も測定試料中の粒子の一種として扱われるので、細菌及び真菌の種類は特に限定されない。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の細菌及び真菌を検出するために、第６の特徴を有する粒子を特定する。第６の特徴を有する粒子は、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。ステップＳ１２４において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子を特定する。第１蛍光情報に対応する第１の閾値は、白血球をリンパ球集団、単球集団、好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団に分類できている場合は、上記のとおりである。あるいは、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「単核球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を設定できる。あるいは、多形核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「多形核球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として設定してもよい。
本発明者らは、第１蛍光情報に基づいて、細菌及び真菌を検出できることを見出した。具体的には、細菌及び真菌は、DNA量が白血球に比べて少ないので、SFL-1強度が低い傾向にある。フローサイトメトリ法では、いずれの細菌及び真菌も測定試料中の粒子の一種として扱われるので、細菌及び真菌の種類は特に限定されない。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の細菌及び真菌を検出するために、第６の特徴を有する粒子を特定する。第６の特徴を有する粒子は、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。ステップＳ１２４において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第１の閾値未満である粒子を特定する。第１蛍光情報に対応する第１の閾値は、白血球をリンパ球集団、単球集団、好中球集団、好酸球集団又は好塩基球集団に分類できている場合は、上記のとおりである。あるいは、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「単核球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を設定できる。あるいは、多形核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最小値(以下、「多形核球集団のSFL-1強度の最小値」ともいう)を、第１蛍光情報に対応する第１の閾値として設定してもよい。
【0101】
(細菌及び真菌の検出)
分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子の情報に基づいて、細菌又は真菌の存否を示す情報を出力できる。第６の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ１２５において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値未満であるかを判定する。第６の特徴を有する粒子の数が、当該閾値未満である場合は、測定試料に細菌及び真菌は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図２０ＢのステップＳ２２１へ進行する。ステップＳ１２５において、第６の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ１２６において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子を細菌又は真菌と特定する。そして、分析ユニット３００は、細菌又は真菌が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に細菌又は真菌の存在を示す情報として「Bacteria/Fungus?」というフラグを出力してもよい。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、細菌及び真菌が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２１のＢに示されるように、細菌及び真菌は、白血球の各亜集団よりもSFL-1強度が低い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。その後、プロセスは、図２０ＢのステップＳ２２１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、細菌及び真菌の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子の情報に基づいて、細菌又は真菌の存否を示す情報を出力できる。第６の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ１２５において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値未満であるかを判定する。第６の特徴を有する粒子の数が、当該閾値未満である場合は、測定試料に細菌及び真菌は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図２０ＢのステップＳ２２１へ進行する。ステップＳ１２５において、第６の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ１２６において、分析ユニット３００は、第６の特徴を有する粒子を細菌又は真菌と特定する。そして、分析ユニット３００は、細菌又は真菌が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に細菌又は真菌の存在を示す情報として「Bacteria/Fungus?」というフラグを出力してもよい。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、細菌及び真菌が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２１のＢに示されるように、細菌及び真菌は、白血球の各亜集団よりもSFL-1強度が低い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。その後、プロセスは、図２０ＢのステップＳ２２１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、細菌及び真菌の不存在を示す情報であり得る。
【0102】
第６の特徴を有する粒子の数に対応する閾値は、適宜決定できる。例えば、健常者の体液、及び、細菌又は真菌を含む体液の測定により得られた光学的情報のデータを蓄積することにより、経験的に設定してもよい。
【0103】
(第２蛍光情報及び側方散乱光情報に基づく白血球の分類)
図２０Ｂを参照して、ステップＳ２２１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸をSSC強度とし、縦軸をSFL-2強度とする平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ２２２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から、リンパ球集団、単球集団及び多形核球集団を特定する。可能であれば、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団の少なくとも１つを特定してもよい。白血球を各亜集団に分類するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、白血球を亜集団に分類できる。また、スキャッタグラム上で白血球のリンパ球集団、単球集団及び多形核球集団が出現する位置は公知であるので、スキャッタグラムに基づいて、各亜集団を特定してもよい。第２スキャッタグラムを作成している場合、例えば図２２のＡに示されるように、白血球のリンパ球集団、単球集団及び多形核球集団がスキャッタグラム上に分布する。しかし、この図に限定されず、白血球は、例えば単核球及び多形核球(顆粒球)の２種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種の亜集団に分類されてもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。白血球の分類後、プロセスはステップＳ２２３へ進行する。
図２０Ｂを参照して、ステップＳ２２１において、分析ユニット３００は、取得した光学的情報に基づいて、横軸をSSC強度とし、縦軸をSFL-2強度とする平面上において、各粒子に対応する点の位置を決定する。分析システム３００は、決定した各点の位置に基づいて、第２スキャッタグラムを作成してもよい。ステップＳ２２２において、分析ユニット３００は、決定した各点の位置に基づいて、測定試料中の粒子から、リンパ球集団、単球集団及び多形核球集団を特定する。可能であれば、好中球集団、好酸球集団及び好塩基球集団の少なくとも１つを特定してもよい。白血球を各亜集団に分類するアルゴリズム自体は公知である。例えば、分析ユニット３００に搭載されたプログラムにより、白血球を亜集団に分類できる。また、スキャッタグラム上で白血球のリンパ球集団、単球集団及び多形核球集団が出現する位置は公知であるので、スキャッタグラムに基づいて、各亜集団を特定してもよい。第２スキャッタグラムを作成している場合、例えば図２２のＡに示されるように、白血球のリンパ球集団、単球集団及び多形核球集団がスキャッタグラム上に分布する。しかし、この図に限定されず、白血球は、例えば単核球及び多形核球(顆粒球)の２種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の４種の亜集団に分類されてもよい。あるいは、白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種の亜集団に分類されてもよい。必要に応じて、白血球の各亜集団に含まれる細胞を計数してもよい。白血球の分類後、プロセスはステップＳ２２３へ進行する。
【0104】
(第７の特徴を有する粒子の特定)
本発明者らは、第２蛍光情報に基づいて、組織由来細胞を検出できることを見出した。具体的には、組織由来細胞は、RNA量が白血球に比べて多いので、組織由来細胞のSFL-2強度は白血球よりも高い傾向にある。なお、組織由来細胞はDNA量も多いが、後述のDNA量異常白血球もDNAを多量に含み得る。そのため、第１蛍光情報では、組織由来細胞とDNA量異常白血球との判別が困難であった。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の組織由来細胞を検出するために、第７の特徴を有する粒子を特定する。第７の特徴を有する粒子は、第２蛍光情報が、第２蛍光情報に対応する第３の閾値以上である粒子である。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。ステップＳ２２３において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子として、SFL-2強度が、第２蛍光情報に対応する第３の閾値以上である粒子を特定する。第２蛍光情報に対応する第３の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最大値(以下、「単核球集団のSFL-2強度の最大値」ともいう)を設定できる。あるいは、単球集団を特定できている場合は、単球集団のSFL-2強度の最大値を、第２蛍光情報に対応する第３の閾値として設定してもよい。
本発明者らは、第２蛍光情報に基づいて、組織由来細胞を検出できることを見出した。具体的には、組織由来細胞は、RNA量が白血球に比べて多いので、組織由来細胞のSFL-2強度は白血球よりも高い傾向にある。なお、組織由来細胞はDNA量も多いが、後述のDNA量異常白血球もDNAを多量に含み得る。そのため、第１蛍光情報では、組織由来細胞とDNA量異常白血球との判別が困難であった。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中の組織由来細胞を検出するために、第７の特徴を有する粒子を特定する。第７の特徴を有する粒子は、第２蛍光情報が、第２蛍光情報に対応する第３の閾値以上である粒子である。第２蛍光情報は、好ましくはSFL-2強度である。ステップＳ２２３において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子として、SFL-2強度が、第２蛍光情報に対応する第３の閾値以上である粒子を特定する。第２蛍光情報に対応する第３の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-2強度の最大値(以下、「単核球集団のSFL-2強度の最大値」ともいう)を設定できる。あるいは、単球集団を特定できている場合は、単球集団のSFL-2強度の最大値を、第２蛍光情報に対応する第３の閾値として設定してもよい。
【0105】
(組織由来細胞の検出)
分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子の情報に基づいて、組織由来細胞の存否を示す情報を出力できる。第７の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２２４において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値未満であるかを判定する。第７の特徴を有する粒子の数が、当該閾値未満である場合は、測定試料に組織由来細胞は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図２０ＣのステップＳ３２１へ進行する。ステップＳ２２４において、第７の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ２２５において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子を組織由来細胞と特定する。そして、分析ユニット３００は、組織由来細胞が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に組織由来細胞の存在を示す情報として「WBC Abnormal?」というフラグを出力してもよい。また、第７の特徴を有する粒子の数を、表示部３０５に「HF-BF計数値」(高蛍光領域に出現する細胞数)として出力してもよい。第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、組織由来細胞が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２２のＢに示されるように、組織由来細胞は、SFL-2強度が単球集団のSFL-2強度の最大値よりも高い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。その後、プロセスは、図２０ＣのステップＳ３２１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、組織由来細胞の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子の情報に基づいて、組織由来細胞の存否を示す情報を出力できる。第７の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ２２４において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値未満であるかを判定する。第７の特徴を有する粒子の数が、当該閾値未満である場合は、測定試料に組織由来細胞は含まれていないと判断する。この場合、プロセスは、図２０ＣのステップＳ３２１へ進行する。ステップＳ２２４において、第７の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ２２５において、分析ユニット３００は、第７の特徴を有する粒子を組織由来細胞と特定する。そして、分析ユニット３００は、組織由来細胞が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５に組織由来細胞の存在を示す情報として「WBC Abnormal?」というフラグを出力してもよい。また、第７の特徴を有する粒子の数を、表示部３０５に「HF-BF計数値」(高蛍光領域に出現する細胞数)として出力してもよい。第２スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、組織由来細胞が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２２のＢに示されるように、組織由来細胞は、SFL-2強度が単球集団のSFL-2強度の最大値よりも高い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。その後、プロセスは、図２０ＣのステップＳ３２１へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、組織由来細胞の不存在を示す情報であり得る。
【0106】
(第８の特徴を有する粒子の特定)
本発明者らは、第１蛍光情報に基づいて、DNA量異常白血球を検出できることを見出した。具体的には、DNA量異常白血球は、DNA量が白血球に比べて多いので、DNA量異常白血球のSFL-1強度は白血球よりも高い傾向にある。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中のDNA量異常白血球を検出するために、第８の特徴を有する粒子を特定する。第８の特徴を有する粒子は、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第２の閾値以上である粒子である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。ステップＳ３２１において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第２の閾値以上である粒子を特定する。第１蛍光情報に対応する第２の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最大値(以下、「単核球集団のSFL-1強度の最大値」ともいう)を設定できる。あるいは、多形核球集団を特定できている場合は、多形核球集団のSFL-1強度の最大値を、第１蛍光情報に対応する第２の閾値として設定してもよい。
本発明者らは、第１蛍光情報に基づいて、DNA量異常白血球を検出できることを見出した。具体的には、DNA量異常白血球は、DNA量が白血球に比べて多いので、DNA量異常白血球のSFL-1強度は白血球よりも高い傾向にある。本実施形態の検体の分析方法では、測定試料中のDNA量異常白血球を検出するために、第８の特徴を有する粒子を特定する。第８の特徴を有する粒子は、第１蛍光情報が、第１蛍光情報に対応する第２の閾値以上である粒子である。第１蛍光情報は、好ましくはSFL-1強度である。ステップＳ３２１において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子として、SFL-1強度が、第１蛍光情報に対応する第２の閾値以上である粒子を特定する。第１蛍光情報に対応する第２の閾値として、例えば、単核球集団を構成する全ての粒子のSFL-1強度の最大値(以下、「単核球集団のSFL-1強度の最大値」ともいう)を設定できる。あるいは、多形核球集団を特定できている場合は、多形核球集団のSFL-1強度の最大値を、第１蛍光情報に対応する第２の閾値として設定してもよい。
【0107】
(DNA量異常白血球の検出)
分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球の存否を示す情報を出力できる。第８の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ３２２において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。上記のステップＳ２２４において、組織由来細胞の数を取得した場合は、ステップＳ３２２で取得した粒子数から組織由来細胞の数を差し引くことが好ましい。これは、組織由来細胞もDNA量が多いからである。すなわち、測定試料に組織由来細胞及びDNA量異常白血球が含まれる場合、第８の特徴を有する粒子には、DNA量異常白血球だけでなく、組織由来細胞も含まれ得る。第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、測定試料にDNA量異常白血球は含まれていないと判断する。この場合、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ３２２において、第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ３２３において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子をDNA量異常白血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にDNA量異常白血球の存在を示す情報として「DNA aneuploidy?」というフラグを出力してもよい。さらに、分析ユニット３００は、DNAインデックスを算出し、その値を出力してもよい。DNAインデックスについては、上記のとおりである。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、DNA量異常白血球が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２３に示されるように、DNA量異常白血球は、SFL-1強度が単核球集団のSFL-1強度の最大値よりも高い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、DNA量異常白血球の不存在を示す情報であり得る。
分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子の情報に基づいて、DNA量異常白血球の存否を示す情報を出力できる。第８の特徴を有する粒子の情報は、例えば当該粒子の数である。ステップＳ３２２において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子を計数し、その数が、これに対応する閾値以上であるかを判定する。上記のステップＳ２２４において、組織由来細胞の数を取得した場合は、ステップＳ３２２で取得した粒子数から組織由来細胞の数を差し引くことが好ましい。これは、組織由来細胞もDNA量が多いからである。すなわち、測定試料に組織由来細胞及びDNA量異常白血球が含まれる場合、第８の特徴を有する粒子には、DNA量異常白血球だけでなく、組織由来細胞も含まれ得る。第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値未満である場合は、測定試料にDNA量異常白血球は含まれていないと判断する。この場合、分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。ステップＳ３２２において、第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上である場合、ステップＳ３２３において、分析ユニット３００は、第８の特徴を有する粒子をDNA量異常白血球と特定する。そして、分析ユニット３００は、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する。例えば、表示部３０５にDNA量異常白血球の存在を示す情報として「DNA aneuploidy?」というフラグを出力してもよい。さらに、分析ユニット３００は、DNAインデックスを算出し、その値を出力してもよい。DNAインデックスについては、上記のとおりである。第１スキャッタグラムを作成している場合、当該スキャッタグラムに基づいて、DNA量異常白血球が出現する領域に含まれる粒子を特定してもよい。例えば図２３に示されるように、DNA量異常白血球は、SFL-1強度が単核球集団のSFL-1強度の最大値よりも高い領域(破線で囲まれた領域)に分布する。分析ユニット３００は分析処理を終了し、プロセスは、図７のステップＳ１４へ進行する。なお、表示部３０５に上記フラグを表示しないことは、DNA量異常白血球の不存在を示す情報であり得る。
【0108】
上記のとおり、実施形態３の分析処理の手順をフローチャートに基づいて説明した。このフローチャートから、第６、第７及び第８の特徴を有する粒子の情報と、その情報に基づいて特定される異常細胞との関係を抽出し、以下に記載する。
【0109】
第１蛍光情報と第２蛍光情報とに基づいて、第６の特徴を有する粒子、第７の特徴を有する粒子及び第８の特徴を有する粒子から選択される少なくとも１の粒子を特定する。第６の特徴を有する粒子の情報を得た場合はこの情報に基づいて、第10の異常細胞の存否を示す情報を出力する。第６の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第６の特徴を有する粒子を第10の異常細胞と特定する。そして、第10の異常細胞の存否を示す情報として、細菌又は真菌が存在することを示す情報を出力する。
【0110】
第７の特徴を有する粒子の情報を得た場合はこの情報に基づいて、第11の異常細胞の存否を示す情報を出力する。第７の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第７の特徴を有する粒子を第11の異常細胞と特定する。そして、第11の異常細胞の存否を示す情報として、組織由来細胞が存在することを示す情報を出力する。
【0111】
第８の特徴を有する粒子の情報を得た場合はこの情報に基づいて、第12の異常細胞の存否を示す情報を出力する。第８の特徴を有する粒子の数が、これに対応する閾値以上であるとき、第８の特徴を有する粒子を第12の異常細胞と特定する。そして、第12の異常細胞の存否を示す情報として、DNA量異常白血球が存在することを示す情報を出力する。
【0112】
図７を参照して、上記の分析処理を終了すると、制御部３０１は、ステップＳ１４において、分析結果を表示部３０５に出力して、処理を終了する。上記のとおり、図９Ａ～図２３を用いて、測定試料に各種の異常細胞が含まれるかを分析する処理について個別に説明した。しかし、分析処理はこれらの一部でも実施していればよく、また全ての分析処理を行ってもよい。
【0113】
表示部３０５に出力される分析結果画面は、例えば、白血球の数、白血球の各亜集団(リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球)の数、検出した異常細胞の数を含んでもよい。また、画面は、これらの情報に加えて、光学的情報に基づいて作成したスキャッタグラムを含んでもよい。さらに、画面は、分析結果に基づくフラグを含んでもよい。
【0114】
このように本実施形態の検体の分析方法は、医師や検査技師などの医療従事者に対して、白血球の分類の結果と共に異常細胞の分析結果を提供できる。医療従事者は、取得した分析結果から、例えば、検体についてさらに検査を行うか否かを決定できる。上述の測定試料の調製及び検体の分析はすべてインビトロで行われる。
【0115】
(蛍光色素)
測定試料の調製に用いられる染色試薬中の各蛍光色素について説明する。第１蛍光色素は、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である。第２蛍光色素は、第１蛍光色素とは異なる波長域に極大吸収を有する蛍光色素である。すなわち、第２蛍光色素は、第１蛍光色素からの蛍光とは区別して検出可能な波長の蛍光を放出する蛍光色素である。第１蛍光色素及び第２蛍光色素はそれぞれ、白血球などの血液細胞の核酸に結合する性質を有する公知の蛍光色素から適宜選択できる。上記のとおり、第１及び第２蛍光色素自体が血液細胞の核酸を染色するので、本実施形態の検体の分析方法では、これらの蛍光色素で標識した抗体を用いて血液細胞を染色する必要がない。よって、第１及び第２蛍光色素は抗体を含まない。
測定試料の調製に用いられる染色試薬中の各蛍光色素について説明する。第１蛍光色素は、DNAに特異的に結合する蛍光色素であり、第２蛍光色素が、RNAに特異的に結合する蛍光色素である。第２蛍光色素は、第１蛍光色素とは異なる波長域に極大吸収を有する蛍光色素である。すなわち、第２蛍光色素は、第１蛍光色素からの蛍光とは区別して検出可能な波長の蛍光を放出する蛍光色素である。第１蛍光色素及び第２蛍光色素はそれぞれ、白血球などの血液細胞の核酸に結合する性質を有する公知の蛍光色素から適宜選択できる。上記のとおり、第１及び第２蛍光色素自体が血液細胞の核酸を染色するので、本実施形態の検体の分析方法では、これらの蛍光色素で標識した抗体を用いて血液細胞を染色する必要がない。よって、第１及び第２蛍光色素は抗体を含まない。
【0116】
第１蛍光色素及び第２蛍光色素は、フローサイトメータが備える光源から照射される光によって励起される。第１蛍光色素及び第２蛍光色素は、互いに異なる波長域に蛍光発光極大を有する。
【0117】
上記の測定ユニット４００のように２つの光源を備えるフローサイトメータを用いる場合、各光源から照射される光は、第１蛍光色素を励起可能な第１波長の光、及び第２蛍光色素を励起可能な第２波長の光の２種の光である。第２波長は、第１波長とは異なる。波長は、蛍光色素の種類に応じて適宜決定できる。例えば、第１波長は315～490 nmであり、好ましくは400～450 nmであり、より好ましくは400～410 nmである。第２波長は610～750 nmであり、好ましくは620～700 nmであり、より好ましくは633～643 nmである。
【0118】
第１蛍光色素は、極大吸収を400～490 nmの波長域に有し、当該波長域の光を吸収することにより励起されて蛍光を発する色素であって、細胞のDNAに結合する性質を有する色素が好ましい。例えば、アクリジン骨格を有する蛍光色素、4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール・ジヒドロクロリド(DAPI)、ヘキストシリーズのHoechst3342、Hoechst33258、Hoechst334580などが挙げられる。
【0119】
アクリジン骨格を有する蛍光色素としては、プロフラビン、9-アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローＧ、アクリフラビン、ベーシックイエロー９、乳酸エタクリジン、ユークリシンＧＧ(Euchrysine GGNX)、プロフラビンヘミ硫酸塩、3，6-ビス(ジメチルアミノ)アクリジン(Rhoduline Orange)、3,6-ジアミノ-2,7,10-トリメチル－塩化アクリジニウムが挙げられる。それらの中でも、アクリジンイエローＧが好ましい。あるいは、第１蛍光色素は、市販の蛍光色素を使用してもよい。
【0120】
第２蛍光色素としては、極大吸収を610～750 nmの波長域に有し、当該波長域の光を吸収することにより励起されて蛍光を発する色素であって、細胞のRNAに特異的に結合する性質を有する色素が好ましい。例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム-アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー-1、エチジウムホモダイマー-2、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス[[3-［［4-[[(3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム)-2-イル]メチレン]-1,4-ジヒドロキノリン］-1-イル］プロピル]ジメチルアミニウム]・テトラヨージド(TOTO-1)、4-[(3-メチルベンゾチアゾール-2(3H)-イリデン)メチル]-1-[3-(トリメチルアミニオ)プロピル]キノリニウム・ジヨージド(TO-PRO-1)、N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス［3-[4-[3-[(3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム)-2-イル]-2-プロペニリデン]-1,4-ジヒドロキノリン-1-イル]プロピル］-1,3-プロパンジアミニウム・テトラヨージド(TOTO-3)又は2-[3-[[1-[3-(トリメチルアミニオ)プロピル]-1,4-ジヒドロキノリン]-4-イリデン]-1-プロペニル]-3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム・ジヨージド(TOPRO-3)、下記の式(Ｖ)で表される蛍光色素、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【0121】
【化1】
【0122】
式(Ｖ)中、Ｒ１及びＲ４は、水素原子、メチル基、エチル基又は炭素数６～18のアルキル基であって、いずれか一方が炭素数６～18のアルキル基であるとき、他方が水素原子、メチル基又はエチル基である。Ｒ２及びＲ３は、互いに同一又は異なって、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基である。Ｚは、硫黄原子、酸素原子又はメチル基を有する炭素原子である。ｎは、０、１、２又は３である。Ｘ－は、アニオンである。
【0123】
式(Ｖ)において、炭素数６～18のアルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。炭素数６～18のアルキル基の中でも、炭素数が６、８又は10のアルキル基が好ましい。
【0124】
式(Ｖ)において、アニオンＸ－として、Ｆ－、Cl－、Br－及びＩ－のようなハロゲンイオン、CF３SO３
－、BF４
－、ClO４
－などが挙げられる。
【0125】
上記の式(Ｖ)で表される蛍光色素としては、下記の式で表される蛍光色素が好ましい。
【0126】
【化2】
【0127】
上記の第２蛍光色素を単独で含む市販の染色試薬を用いてもよい。例えば、フルオロセルWDF(シスメックス株式会社)、ストマトライザー4DS(シスメックス株式会社)が挙げられる。
【0128】
第１蛍光色素及び第２蛍光色素は溶液にして用いられることが好ましい。溶媒は、上記の各蛍光色素を溶解できれば特に限定されない。例えば、水、有機溶媒、及びそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、水に混合可能な溶媒が好ましく、例えば炭素数１～６のアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)などが挙げられる。
【0129】
測定試料の調製には、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬を用いることが好ましい。第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬は、一つの試薬容器に収容されてもよい。染色試薬を収容した試薬容器は、箱に梱包されてもよい。箱には、添付文書を同梱してもよい。添付文書には、染色試薬の組成、各蛍光色素の構造、使用方法、保管方法などが記載されてもよい。図２４Ａを参照して、１１は、本実施形態の染色試薬を示し、１２は、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬を収容した試薬容器を示し、１３は、梱包箱を示し、１４は、添付文書を示す。あるいは、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬は、第１蛍光色素を含む試薬と、第２蛍光色素を含む試薬とがそれぞれ別個の試薬容器に収容された形態にあってもよい。図２４Ｂを参照して、２１は、本実施形態の染色試薬を示し、２２は、第１蛍光色素を含む試薬を収容した第１試薬容器を示し、２３は、第２蛍光色素を含む試薬を収容した第２試薬容器を示し、２４は、梱包箱を示し、２５は、添付文書を示す。
【0130】
染色試薬中の第１蛍光色素の濃度は、蛍光色素の種類に応じて適宜決定できる。第１蛍光色素の濃度は、例えば0.01 mg/L以上、好ましくは0.1 mg/L以上、より好ましく0.5 mg/Lである。第１蛍光色素の濃度は、例えば100 mg/L以下、好ましくは75 mg/L以下、より好ましく50 mg/L以下である。染色試薬中の第２蛍光色素の濃度は、第１蛍光色素と同様である。
【0131】
本発明の一実施形態は、染色試薬の製造のための第１蛍光色素及び第２蛍光色素の使用に関する。「染色試薬」、「第１蛍光色素」及び「第２蛍光色素」は上述したとおりである。
【0132】
(溶血試薬)
測定試料の調製に用いられる溶血試薬について説明する。溶血試薬は界面活性剤を含み、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬と組み合わせて用いられる。当該界面活性剤により、検体中の赤血球を溶血させ、且つ、赤血球以外の細胞の細胞膜に第１蛍光色素及び第２蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えることができる。界面活性剤としては、例えばノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及びそれらの組み合わせが挙げられる。溶血試薬は、好ましくはノニオン性界面活性剤を含む。
測定試料の調製に用いられる溶血試薬について説明する。溶血試薬は界面活性剤を含み、第１蛍光色素及び第２蛍光色素を含む染色試薬と組み合わせて用いられる。当該界面活性剤により、検体中の赤血球を溶血させ、且つ、赤血球以外の細胞の細胞膜に第１蛍光色素及び第２蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えることができる。界面活性剤としては、例えばノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及びそれらの組み合わせが挙げられる。溶血試薬は、好ましくはノニオン性界面活性剤を含む。
【0133】
ノニオン性界面活性剤としては、例えば、下記の式(Ｉ)で表されるものが挙げられる。
Ｒ１－Ｒ２－(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ－Ｈ (Ｉ)
(式中、Ｒ１は、炭素数８以上25以下のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｒ２は、酸素原子、－(ＣＯＯ)－又は下記の式(II)：
Ｒ１－Ｒ２－(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ－Ｈ (Ｉ)
(式中、Ｒ１は、炭素数８以上25以下のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｒ２は、酸素原子、－(ＣＯＯ)－又は下記の式(II)：
【0134】
【化3】
【0135】
式(Ｉ)中、好ましくはｎが23又は25であり、より好ましくはｎが23である。ｎが23以上25以下の場合、溶血試薬における式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤の濃度は、1700 ppm以上であり、好ましくは1750 ppm以上である。また、ｎが23以上25以下の場合、測定試料における式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤の濃度は、2300 ppm以下であり、好ましくは2200 ppm以下である。
【0136】
ｎが30である場合、溶血試薬における式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤の濃度は、1900 ppm以上であり、好ましくは2000 ppm以上であり、より好ましくは2100 ppm以上である。また、ｎが30である場合、測定試料における式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤の濃度は、2300 ppm以下であり、好ましくは2200 ppmである。
【0137】
式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。それらの中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ポリオキシエチレン(23)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(25)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル及びそれらの群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。より好ましくは、ポリオキシエチレン(23)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(25)セチルエーテル及びそれらの組み合わせであり、さらに好ましくはポリオキシエチレン(23)セチルエーテルである。溶血試薬に含まれるノニオン界面活性剤は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。また、溶血試薬は、式(Ｉ)で表されるノニオン界面活性剤以外のノニオン界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
【0138】
溶血試薬は、カチオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。カチオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩型界面活性剤、ピリジウム塩型界面活性剤及びそれらの組み合わせが挙げられる。第四級アンモニウム塩型界面活性剤としては、例えば、下記の式(III)で表される、全炭素数が９～30の界面活性剤が好ましい。溶血試薬に含まれるカチオン界面活性剤は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【0139】
【化4】
【0140】
式(III)中、Ｒ１は、炭素数６～18のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｒ２及びＲ３は、互いに同一又は異なって、炭素数１～４のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｒ４は、炭素数１～４のアルキル基又はアルケニル基又はベンジル基であり、Ｘ－は、ハロゲンイオンである。
【0141】
式(III)中、Ｒ１は、炭素数が６、８、10、12及び14のアルキル基又はアルケニル基であることがましく、特に直鎖のアルキル基であることが好ましい。より具体的なＲ１としては、オクチル基、デシル基及びドデシル基が挙げられる。Ｒ２及びＲ３は、互いに同一又は異なって、メチル基、エチル基及びプロピル基であることが好ましい。Ｒ４は、メチル基、エチル基及びプロピル基であることが好ましい。
【0142】
ピリジウム塩型界面活性剤としては、例えば、式(IV)で表される界面活性剤が挙げられる。
【0143】
【化5】
【0144】
式(IV)中、Ｒ１は、炭素数６～18のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｘ－は、ハロゲンイオンである。
【0145】
式(IV)中、Ｒ１は、炭素数が６、８、10、12及び14のアルキル基又はアルケニル基であることがましく、特に直鎖のアルキル基であることが好ましい。より具体的なＲ１としては、オクチル基、デシル基及びドデシル基が挙げられる。
【0146】
溶血試薬におけるカチオン界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類により適宜選択できる。カチオン界面活性剤の濃度は10 ppm以上である。カチオン界面活性剤の濃度は、好ましくは400 ppm以上、より好ましくは500 ppm以上、さらに好ましくは600ppm以上である。また、カチオン界面活性剤濃度は10000 ppm以下である。カチオン界面活性剤の濃度は、好ましくは1000 ppm以下、より好ましくは800 ppm以下、さらに好ましくは700 ppm以下である。
【0147】
溶血試薬は、pHを一定にするための緩衝物質が含まれていてもよい。例えば、無機酸塩類、有機酸塩類、グッドの緩衝剤、それらの組み合わせなどが挙げられる。無機酸塩類としては、例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、それらの組み合わせなどが挙げられる。有機酸塩類としては、クエン酸塩、リンゴ酸塩、それらの組み合わせなどが挙げられる。グッドの緩衝剤としては、例えばMES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。
【0148】
溶血試薬は、芳香族有機酸をさらに含んでいてもよい。本明細書中では、芳香族有機酸とは、分子中に少なくとも１つの芳香環を有する酸及びその塩を意味する。芳香族有機酸としては、例えば、芳香族カルボン酸、芳香族スルホン酸などが挙げられる。芳香族カルボン酸としては、例えば、フタル酸、安息香酸、サリチル酸、馬尿酸、それらの塩、それらの組み合わせなどが挙げられる。芳香族スルホン酸としては、例えば、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、それらの塩、それらの組み合わせなどが挙げられる。溶血試薬に含まれる芳香族有機酸は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。また、芳香族有機酸が緩衝作用を示す場合がある。緩衝作用を示す芳香族有機酸を用いる場合、緩衝剤の添加は任意であり、上述の緩衝剤と組み合わせてもよい。
【0149】
溶血試薬が芳香族有機酸を含む場合、芳香族有機酸の濃度は特に限定されないが、単球とリンパ球の分類能の観点から、20 mM以上が好ましく、より好ましくは25 mM以上である。また、溶血試薬に含まれる芳香族有機酸の濃度は50 mM以下が好ましく、より好ましくは45 mM以下である。
【0150】
溶血試薬は、液体試薬であることが好ましい。溶媒は、上記の界面活性剤などの各成分を溶解できれば特に限定されない。溶媒としては、例えば水、有機溶媒及びそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、水に混合可能な溶媒が好ましく、例えば炭素数１～６のアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、DMSOなどが挙げられる。
【0151】
溶血試薬のpHは特に限定されないが、5.5以上が好ましい。より好ましくは、5.7以上であり、さらに好ましくは5.9以上である。また、pHは7.2以下が好ましい。より好ましくは6.9以下であり、さらに好ましくは6.6以下である。pHの調整には、公知の塩基(水酸化ナトリウムなど)や酸(塩酸など)を用いることができる。
【0152】
溶血試薬において、浸透圧は特に限定されないが、赤血球の溶血効率の観点から150 mOsm/kg以下が好ましく、130 mOsm/kg以下がより好ましく、110 mOsm/kg以下が最も好ましい。浸透圧の調整には適切な浸透圧調整剤を添加してもよい。浸透圧調整剤として、例えば、糖、アミノ酸、有機溶媒、塩化ナトリウム、それらの組み合わせなどが挙げられる。
【0153】
溶血試薬として、市販の血球測定用の溶血試薬を用いてもよい。例えば、ライザセルWDF(シスメックス株式会社)、ライザセルWDFII(シスメックス株式会社)などが挙げられる。
【0154】
第１蛍光色素及び第２蛍光色素は、測定試料中の濃度(終濃度)がそれぞれ所定の範囲内の濃度となるように、検体及び溶血試薬と混合される。測定試料中の第１蛍光色素の好ましい終濃度は1000 ppm以下、好ましくは100 ppm以下、より好ましくは10 ppm以下である。測定試料中の第１蛍光色素の好ましい終濃度は0.001 ppm以上、好ましくは0.01 ppm以上、より好ましくは0.1 ppm以上である。測定試料中の第２蛍光色素の好ましい終濃度は1000 ppm以下、好ましくは100 ppm以下、より好ましくは10 ppm以下である。測定試料中の第２蛍光色素の好ましい終濃度は0.001 ppm以上、好ましくは0.01 ppm以上、より好ましくは0.1 ppm以上である。
【0155】
溶血試薬と染色試薬と検体の混合比は、例えば、体積比で表して1000：１以上：１以上が好ましい。より好ましくは1000：10以上：10以上であり、さらに好ましくは1000：15以上：15以上である。また、溶血試薬と染色試薬と検体の混合比は、例えば、体積比で表して、1000：50以下：50以下であることが好ましい。より好ましくは1000：30以下：30以下であり、さらに好ましくは1000：25以下：25以下である。染色試薬と検体との混合比は同一でもよいし、異なっていてもよい。
【0156】
(フローサイトメータの光源が１つの場合の実施形態)
光は、１つの光源から照射されてもよい。１つの光源から光が照射される場合、当該光源から照射される光は、第１蛍光色素及び第２蛍光色素の両方を励起可能な光である。そのような光としては、複数の波長を含む光が好ましく、例えば白色光が挙げられる。あるいは、第１蛍光色素及び第２蛍光色素が、１つの波長の光で励起可能な程度に近い波長域に極大吸収を有する場合、光源から照射される光は当該１つの波長の光であってもよい。例えば、第１蛍光色素又は第２蛍光色素の一方が極大吸収を400～520 nmの波長域に有し、他方が極大吸収を300～420 nmの波長域に有する場合、400～420 nmに中心波長を有する光、例えば455 nmの光により、両方の蛍光色素を励起できる。あるいは、例えば、第１蛍光色素および第２蛍光色素の極大吸収が630～660 nmの波長域内にあり、第１蛍光色素又は第２蛍光色素の一方が660～670 nmの波長域にピークを有する蛍光を発し、他方が670 nmより長波長域にピークを有する蛍光を発する場合、630～655 nmに中心波長を有する光、例えば633 nmの光により、両方の蛍光色素を励起でき、かつ、それぞれの蛍光色素から生じる光を区別して検出できる。
光は、１つの光源から照射されてもよい。１つの光源から光が照射される場合、当該光源から照射される光は、第１蛍光色素及び第２蛍光色素の両方を励起可能な光である。そのような光としては、複数の波長を含む光が好ましく、例えば白色光が挙げられる。あるいは、第１蛍光色素及び第２蛍光色素が、１つの波長の光で励起可能な程度に近い波長域に極大吸収を有する場合、光源から照射される光は当該１つの波長の光であってもよい。例えば、第１蛍光色素又は第２蛍光色素の一方が極大吸収を400～520 nmの波長域に有し、他方が極大吸収を300～420 nmの波長域に有する場合、400～420 nmに中心波長を有する光、例えば455 nmの光により、両方の蛍光色素を励起できる。あるいは、例えば、第１蛍光色素および第２蛍光色素の極大吸収が630～660 nmの波長域内にあり、第１蛍光色素又は第２蛍光色素の一方が660～670 nmの波長域にピークを有する蛍光を発し、他方が670 nmより長波長域にピークを有する蛍光を発する場合、630～655 nmに中心波長を有する光、例えば633 nmの光により、両方の蛍光色素を励起でき、かつ、それぞれの蛍光色素から生じる光を区別して検出できる。
【0157】
１つの波長の光として、例えば633 nmの光を測定試料に照射する場合、第１蛍光色素及び第２蛍光色素の極大吸収が630～660 nmの波長域内にあり、第２蛍光色素が660～670 nmの波長域にピークを有する蛍光を発し、第１蛍光色素が670 nmより長波長域にピークを有する蛍光を発するような組み合わせが考えられる。そのような組み合わせとして、例えば、第１蛍光色素としてDRAQ5、DRAQ7又はDRAQ9(BioStatus社)、第２蛍光色素として上述の式(Ｖ)で表される蛍光色素を用いることができる。
【0158】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例0159】
以下の参考例及び実施例では、下記の溶血試薬、染色試薬及び分析装置を用いて本実施形態の検体の分析方法を行った。詳細は、以下の［測定方法］に記載したとおりである。
【0160】
［溶血試薬］
溶血試薬として、ライザセルWDFII(シスメックス株式会社)を用いた。
溶血試薬として、ライザセルWDFII(シスメックス株式会社)を用いた。
【0161】
［染色試薬］
(第１蛍光色素)
第１蛍光色素として、アクリジンイエローＧ(関東化学株式会社)を用いた。
(第１蛍光色素)
第１蛍光色素として、アクリジンイエローＧ(関東化学株式会社)を用いた。
【0162】
(第２蛍光色素)
第２蛍光色素として、米国特許第6004816号明細書に記載の色素化合物Ａを用いた。米国特許第6004816号明細書は本明細書に参照として組み込まれる。色素化合物Ａは、上記の式(Ｖ)において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、Ｒ４がｎ－オクチルであり、ｎが１であり、Ｚが硫黄原子であり、Ｘ－がCF3SO3 －である化合物であった。その構造式は、以下のとおりであった。
第２蛍光色素として、米国特許第6004816号明細書に記載の色素化合物Ａを用いた。米国特許第6004816号明細書は本明細書に参照として組み込まれる。色素化合物Ａは、上記の式(Ｖ)において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、Ｒ４がｎ－オクチルであり、ｎが１であり、Ｚが硫黄原子であり、Ｘ－がCF3SO3 －である化合物であった。その構造式は、以下のとおりであった。
【0163】
【化6】
【0164】
米国特許第6004816号明細書に記載されるように、色素化合物Ａは、次の工程によって得ることができた。１当量の3-メチル-2-メチルベンゾチアゾリウムメタンサルフェート及び３当量のN,N-ジフェニルホルムアミジンを酢酸中で、90℃の油浴上で加熱しながら1.5時間撹拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤色油状物をさらにヘキサンで懸濁洗浄し、酢酸を除いた。粗生成物を酢酸エチル-ヘキサンで再結晶した(収率48%)。これに１当量の1-オクチルレピジニウムトリフレートとピリジンを加え、90℃の油浴上で加熱しながら３時間撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノール－クロロホルムで精製して、濃暗青色粉末の色素化合物Ａを得た(収率62%)。得られた色素化合物Ａの物性試験(TLC、1H-NMR、MASS等)の結果は、米国特許第6004816号明細書に記載されている。色素化合物Ａの極大吸収スペクトルは629 nmであった。
【0165】
上記の色素化合物Ａ(27.5 mg)とアクリジンイエローＧ(25 mg)とを特級エチレングリコール(1 L)に溶解して、染色試薬を調製した。
【0166】
［分析装置］
多項目自動血球分析装置XN-1000(シスメックス株式会社)を以下のように改造して、分析装置として用いた。XN-1000は、図１～図３に示したハードウェアを備え、ＦＣＭ検出部４６０は、赤色(633 nm)の光を発する半導体レーザ光源と、赤色の前方散乱光の検出器と、赤色の側方散乱光の検出器と、赤色の光によって励起された蛍光(660 nm以上の光)を受光する検出器を有していた。このXN-1000に、青紫色(405 nm)の光を発する半導体レーザ光源、青紫色の散乱光の検出器、及び青紫色の光によって励起された蛍光(450～600 nm)を検出する蛍光検出器を増設する改造を行った。改造後のXN-1000のＦＣＭ検出部は、図４の構成を有していた。また、このXN-1000をフローサイトメトリ用解析ソフトFlowjo(商標)(BD Biosciences社)をインストールしたコンピュータに接続することで、赤色及び青紫色の散乱光情報ならびに第１蛍光色素及び第２蛍光色素から生じる蛍光情報について検出される測定データを解析し、所望のスキャッタグラムを表示するようにした。
多項目自動血球分析装置XN-1000(シスメックス株式会社)を以下のように改造して、分析装置として用いた。XN-1000は、図１～図３に示したハードウェアを備え、ＦＣＭ検出部４６０は、赤色(633 nm)の光を発する半導体レーザ光源と、赤色の前方散乱光の検出器と、赤色の側方散乱光の検出器と、赤色の光によって励起された蛍光(660 nm以上の光)を受光する検出器を有していた。このXN-1000に、青紫色(405 nm)の光を発する半導体レーザ光源、青紫色の散乱光の検出器、及び青紫色の光によって励起された蛍光(450～600 nm)を検出する蛍光検出器を増設する改造を行った。改造後のXN-1000のＦＣＭ検出部は、図４の構成を有していた。また、このXN-1000をフローサイトメトリ用解析ソフトFlowjo(商標)(BD Biosciences社)をインストールしたコンピュータに接続することで、赤色及び青紫色の散乱光情報ならびに第１蛍光色素及び第２蛍光色素から生じる蛍光情報について検出される測定データを解析し、所望のスキャッタグラムを表示するようにした。
【0167】
［測定方法］
XN-1000用染色試薬であるフルオロセルWDF(シスメックス株式会社)に替えて、上記のように調製した染色試薬を用いたことを除いて、測定試料の調製及び測定は、XN-1000(シスメックス株式会社)に付属のマニュアルに従って行った。データ解析はFlowjo(商標)により行った。測定試料は、1000μLのライザセルWDFIIと、17μLの検体と、20μLの染色試薬とを混合して調製した。測定試料における染色試薬の希釈倍率は51.85であり、測定試料中の第１蛍光色素及び第２蛍光色素の終濃度はそれぞれ0.53 ppm及び0.48 ppmであった。
XN-1000用染色試薬であるフルオロセルWDF(シスメックス株式会社)に替えて、上記のように調製した染色試薬を用いたことを除いて、測定試料の調製及び測定は、XN-1000(シスメックス株式会社)に付属のマニュアルに従って行った。データ解析はFlowjo(商標)により行った。測定試料は、1000μLのライザセルWDFIIと、17μLの検体と、20μLの染色試薬とを混合して調製した。測定試料における染色試薬の希釈倍率は51.85であり、測定試料中の第１蛍光色素及び第２蛍光色素の終濃度はそれぞれ0.53 ppm及び0.48 ppmであった。
【0168】
参考例１：血液試料の正常検体中の有核細胞と非有核成分との分画
血液試料の正常検体として、健常者から得た末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を上記の測定装置により測定して、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報を取得した。第１蛍光情報は、第１蛍光色素からの蛍光強度(以下、「青紫色蛍光強度」と呼ぶ)であった。第２蛍光情報は、第２蛍光色素からの蛍光強度(以下、「赤色蛍光強度」と呼ぶ)であった。散乱光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた側方散乱光強度であった。取得した光学的情報に基づいて、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に青紫色蛍光強度をとったスキャッタグラム(第１スキャッタグラム)を作成した。また、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に赤色蛍光強度をとったスキャッタグラム(第２スキャッタグラム)を作成した。
血液試料の正常検体として、健常者から得た末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を上記の測定装置により測定して、第１蛍光情報と第２蛍光情報と散乱光情報を取得した。第１蛍光情報は、第１蛍光色素からの蛍光強度(以下、「青紫色蛍光強度」と呼ぶ)であった。第２蛍光情報は、第２蛍光色素からの蛍光強度(以下、「赤色蛍光強度」と呼ぶ)であった。散乱光情報は、測定試料中の粒子に赤色レーザを照射して得られた側方散乱光強度であった。取得した光学的情報に基づいて、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に青紫色蛍光強度をとったスキャッタグラム(第１スキャッタグラム)を作成した。また、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に赤色蛍光強度をとったスキャッタグラム(第２スキャッタグラム)を作成した。
【0169】
作成したスキャッタグラムを図２５に示す。図２５において、Ａは、縦軸が赤色蛍光強度(リニアスケール)である第２スキャッタグラムであり、Ｂは、縦軸が赤色蛍光強度(対数スケール)である第２スキャッタグラムであり、Ｃは、縦軸が青紫色蛍光強度(リニアスケール)である第１スキャッタグラムであり、Ｄは、縦軸が青紫色蛍光強度(対数スケール)である第１スキャッタグラムである。各スキャッタグラム中、破線の楕円で囲まれた粒子群は、有核細胞(白血球)であり、実線の楕円で囲まれた粒子群は、非有核成分であった。有核細胞は主に白血球であった。非有核成分は、赤血球ゴースト、血小板などを含むデブリであった。図２５のＢ及びＤのスキャッタグラムについて、非有核成分の蛍光強度に対する有核細胞の蛍光強度の比(WBC/Debris比)を算出した。ＢのWBC/Debris比は8.9であり、ＤのWBC/Debris比は92.7であった。第１蛍光色素からの蛍光により、有核細胞と非有核成分との分画性能が向上したことが分かった。
【0170】
実施例１：血液試料の正常検体の分析
血液試料の正常検体として、健常者から得た末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図２６に示す。図２６のＡに示される第２スキャッタグラムでは、白血球が５つの亜集団、すなわちリンパ球(Lymph)の集団、単球(Mono)の集団、好中球(Neut)の集団、好酸球(Eo)の集団及び好塩基球(Baso)の集団に分類された。図２６のＢに示される第１スキャッタグラムでは、上記の５つの集団は、ほぼ同等の蛍光強度の領域に出現した。第１スキャッタグラムより、異常細胞は検出されなかった。
血液試料の正常検体として、健常者から得た末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図２６に示す。図２６のＡに示される第２スキャッタグラムでは、白血球が５つの亜集団、すなわちリンパ球(Lymph)の集団、単球(Mono)の集団、好中球(Neut)の集団、好酸球(Eo)の集団及び好塩基球(Baso)の集団に分類された。図２６のＢに示される第１スキャッタグラムでは、上記の５つの集団は、ほぼ同等の蛍光強度の領域に出現した。第１スキャッタグラムより、異常細胞は検出されなかった。
【0171】
第１スキャッタグラム(縦軸が対数スケール)において、青紫色蛍光強度が高値の領域に含まれる有核細胞の集団を選別(ゲーティング)し、その集団を第２スキャッタグラム上にプロットした。作成したスキャッタグラムを図２７に示す。図２７のＡに示される第１スキャッタグラムでは、実線の四角で囲まれた領域に出現した有核細胞(白血球)の集団をゲーティングした。図２７のＢに示される第２スキャッタグラムでは、ゲーティングされた有核細胞の集団が５つの亜集団に分類された。実線の楕円は、デブリが出現する領域を示すが、Ｂの第２スキャッタグラムではデブリは出現しなかった。図２７のＣに示される第２スキャッタグラムでは、第１スキャッタグラムにおいて有核細胞の集団をゲーティングせず、測定試料中の全粒子を分類した結果を表す。図２７のＣより、実線の楕円で示す領域にデブリが出現した。このように、第１スキャッタグラムにおいて有核細胞の集団をゲーティングすることで、デブリのような非有核成分の影響を除外できる。その結果、第２スキャッタグラムにおいて、白血球をより正確に分類できることが示された。
【0172】
実施例２：血小板凝集(PLT-clumps)を含む検体の分析
検体として、採血管中で血小板凝集が生じた末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図２８に示す。図２８のＡに示される第２スキャッタグラムでは、後述のように、血小板凝集が出現する領域は、好中球の集団及び好塩基球の集団が出現する領域と重なっていた。図２８のＢに示される第１スキャッタグラムでは、PLT-clumpsが疑われる集団が、破線の楕円で囲まれた領域に出現した。正常検体では、この領域に粒子群はほとんど認められない(図２６のＢ参照)。このように、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に、所定の数以上の粒子が存在する場合、当該粒子の集団は、PLT-clumpsであることが疑われる。よって、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に存在する粒子群のうち、好中球及び好酸球の集団と同程度の散乱光強度を有する集団は、PLT-clumpsとして定義できることが示された。
検体として、採血管中で血小板凝集が生じた末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図２８に示す。図２８のＡに示される第２スキャッタグラムでは、後述のように、血小板凝集が出現する領域は、好中球の集団及び好塩基球の集団が出現する領域と重なっていた。図２８のＢに示される第１スキャッタグラムでは、PLT-clumpsが疑われる集団が、破線の楕円で囲まれた領域に出現した。正常検体では、この領域に粒子群はほとんど認められない(図２６のＢ参照)。このように、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に、所定の数以上の粒子が存在する場合、当該粒子の集団は、PLT-clumpsであることが疑われる。よって、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に存在する粒子群のうち、好中球及び好酸球の集団と同程度の散乱光強度を有する集団は、PLT-clumpsとして定義できることが示された。
【0173】
図２８のＢに示される第１スキャッタグラムにおいて、PLT-clumpsと定義した集団をゲーティングし、その集団を第２スキャッタグラム上にプロットした。作成した第２スキャッタグラムを図２８のＣに示す。PLT-clumpsと定義した集団は、破線の四角で囲まれた領域に出現した。図２８のＣのスキャッタグラムを元の第２スキャッタグラム(図２８のＡ)と重ね合わせた。これを図２８のＤに示す。図２８のＤのスキャッタグラムから分かるように、破線の四角で囲まれた領域、すなわちPLT-clumpsと定義した集団が出現した領域は、好中球の集団及び好酸球の集団が出現する領域と重なっていた。よって、第２スキャッタグラムのみにより、PLT-clumpsを検出及び分類することは困難であった。一方、第１スキャッタグラムにより、PLT-clumpsを検出又は分類できることが示された。
【0174】
実施例３：血小板凝集(PLT-clumps)と感染赤血球(iRBC)との区別
PLT-clumpsを含む検体として、採血管中で血小板凝集が生じた末梢血を用いた。iRBCを含む検体として、培養マラリア添加人血を用いた。これは、インビトロで白血球を除去した健常者の血液にマラリア原虫を感染させ、所定の期間培養することにより取得された。各検体から調製した測定試料を測定した。測定では、青紫色蛍光強度、赤色蛍光強度及び側方散乱光強度の他に、前方散乱光シグナルの強度及び幅を取得した。それぞれの検体について、取得した情報に基づいてスキャッタグラムを作成した。PLT-clumpsを含む検体についてのスキャッタグラムを図２９に示す。iRBCを含む検体についてのスキャッタグラムを図３０に示す。図２９及び３０において、Ａは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムであり、Ｂは第２スキャッタグラムであり、Ｃは第１スキャッタグラムであり、Ｄは、横軸に前方散乱光の幅をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムである。
PLT-clumpsを含む検体として、採血管中で血小板凝集が生じた末梢血を用いた。iRBCを含む検体として、培養マラリア添加人血を用いた。これは、インビトロで白血球を除去した健常者の血液にマラリア原虫を感染させ、所定の期間培養することにより取得された。各検体から調製した測定試料を測定した。測定では、青紫色蛍光強度、赤色蛍光強度及び側方散乱光強度の他に、前方散乱光シグナルの強度及び幅を取得した。それぞれの検体について、取得した情報に基づいてスキャッタグラムを作成した。PLT-clumpsを含む検体についてのスキャッタグラムを図２９に示す。iRBCを含む検体についてのスキャッタグラムを図３０に示す。図２９及び３０において、Ａは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムであり、Ｂは第２スキャッタグラムであり、Ｃは第１スキャッタグラムであり、Ｄは、横軸に前方散乱光の幅をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムである。
【0175】
図２９のＡ及びＢのスキャッタグラムでは、PLT-clumpsの集団は、実線の四角で囲まれた領域に出現した。しかし、白血球の亜集団の分布により、PLT-clumpsの集団を検出することは困難であった。同様に、図３０のＡ及びＢのスキャッタグラムでは、iRBCの集団は、実線の四角で囲まれた領域に出現したが、iRBCの集団を検出することは困難であった。図２９のＣの第１スキャッタグラムでは、実線の四角で囲まれた青紫色蛍光強度が低い領域に、PLT-clumpsが疑われる集団が出現した。図３０のＣの第１スキャッタグラムでは、実線の四角で囲まれた青紫色蛍光強度が低い領域に、iRBCが疑われる集団が出現した。図２９のＣと図３０のＣとを比較すると、第１スキャッタグラムにより、PLT-clumpsとiRBCとを区別することは困難であった。ここで、PLT-clumpsは凝集物であるので、粒子の幅が大きくなる傾向にある。しかし、iRBCはマラリア感染赤血球であるので、凝集しない。ここで、フローセルを通過する粒子の幅が大きいほど、前方散乱光の幅の値は大きくなることが知られている。そこで、第１スキャッタグラムにおいてPLT-clumpsが疑われる集団及びiRBCが疑われる集団をそれぞれゲーティングし、図２９及び３０のＤのスキャッタグラムにプロットした。図２９のＤのスキャッタグラムでは、PLT-clumpsが疑われる集団は、実線の四角で囲まれた前方散乱光の幅の値が高い領域に出現した。一方、図３０のＤのスキャッタグラムでは、iRBCが疑われる集団は、実線の四角で囲まれた前方散乱光の幅の値が低い領域に出現した。このように、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に出現した粒子群をゲーティングし、横軸に前方散乱光の幅をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラム上にプロットすることにより、PLT-clumpsとiRBCとを区別できることが示された。
【0176】
実施例４：幼若顆粒球(IG)を含む検体の分析
IGを含む検体として、幼若顆粒球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３１に示す。図３１のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３１のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。また、単球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子は少数であった。しかし、好中球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この粒子群は、正常検体には認められなかったことから、当該領域に出現した粒子群をIGクラスタとして定義した。
IGを含む検体として、幼若顆粒球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３１に示す。図３１のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３１のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。また、単球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子は少数であった。しかし、好中球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この粒子群は、正常検体には認められなかったことから、当該領域に出現した粒子群をIGクラスタとして定義した。
【0177】
図３１のＢに示される第１スキャッタグラムにおいても、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。この第１スキャッタグラムでは、単球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。しかし、好中球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。当該領域に出現した粒子群をIGクラスタとして定義した。このように、第１又は第２スキャッタグラムにおいて、蛍光強度が好中球の集団よりも高く、且つ散乱光強度が好中球の集団と同じである領域を、IGクラスタが出現する領域として定義できることが示された。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をIGとして検出又は分類できることが示された。
【0178】
実施例５：有核赤血球(NRBC)を含む検体の分類
NRBCを含む検体として、赤芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３２に示す。図３２のＡに示される第２スキャッタグラムでは、赤芽球は、破線の楕円で囲まれた領域に出現したが、デブリと重なっていた。そのため、赤芽球とデブリの区別は困難であり、赤芽球を検出及び分類できなかった。一方、図３２のＢに示される第１スキャッタグラムでは、赤芽球は、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。しかし、この領域にはリンパ球も出現するので、赤芽球を検出及び分類することは困難であった。一方、デブリは、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に出現した。この第１スキャッタグラムから分かるように、赤芽球の集団は、青紫色蛍光強度により、デブリの集団と明確に区別できた。そこで、第１スキャッタグラムにおいて青紫色蛍光強度が高い領域をゲーティングし、第２スキャッタグラム上にプロットした。作成した第２スキャッタグラムを図３２のＣに示す。図３２のＣのスキャッタグラムでは、赤芽球は、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。このスキャッタグラムから分かるように、デブリの粒子は除外されているので、赤芽球の検出及び分類が可能となった。第１スキャッタグラムでのゲーティングに替えて、青紫色蛍光強度のヒストグラムにおいて当該強度が高値の粒子群を選別して、第２スキャッタグラムにプロットした場合も、図３２のＣと同様のスキャッタグラムが得られた。図３２のＣのスキャッタグラムにおいて、赤色蛍光強度がリンパ球の集団よりも低い領域を、NRBCクラスタが出現する領域として定義できることが示された。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をNRBCとして検出又は分類できることが示された。
NRBCを含む検体として、赤芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３２に示す。図３２のＡに示される第２スキャッタグラムでは、赤芽球は、破線の楕円で囲まれた領域に出現したが、デブリと重なっていた。そのため、赤芽球とデブリの区別は困難であり、赤芽球を検出及び分類できなかった。一方、図３２のＢに示される第１スキャッタグラムでは、赤芽球は、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。しかし、この領域にはリンパ球も出現するので、赤芽球を検出及び分類することは困難であった。一方、デブリは、第１スキャッタグラムの青紫色蛍光強度が低い領域に出現した。この第１スキャッタグラムから分かるように、赤芽球の集団は、青紫色蛍光強度により、デブリの集団と明確に区別できた。そこで、第１スキャッタグラムにおいて青紫色蛍光強度が高い領域をゲーティングし、第２スキャッタグラム上にプロットした。作成した第２スキャッタグラムを図３２のＣに示す。図３２のＣのスキャッタグラムでは、赤芽球は、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。このスキャッタグラムから分かるように、デブリの粒子は除外されているので、赤芽球の検出及び分類が可能となった。第１スキャッタグラムでのゲーティングに替えて、青紫色蛍光強度のヒストグラムにおいて当該強度が高値の粒子群を選別して、第２スキャッタグラムにプロットした場合も、図３２のＣと同様のスキャッタグラムが得られた。図３２のＣのスキャッタグラムにおいて、赤色蛍光強度がリンパ球の集団よりも低い領域を、NRBCクラスタが出現する領域として定義できることが示された。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をNRBCとして検出又は分類できることが示された。
【0179】
実施例６：幼若赤芽球及び巨赤芽球(immature NRBC/Megaloblast)とDNA量異常白血球(DNA aneuploidy)との区別
immature NRBC/Megaloblastを含む検体として、赤芽球(NRBC)を含む末梢血を用いた。DNA aneuploidyを含む検体として、DNA量異常白血球を含む末梢血を用いた。各検体から調製した測定試料を測定した。測定では、青紫色蛍光強度、赤色蛍光強度及び側方散乱光強度の他に、前方散乱光シグナルの強度を取得した。それぞれの検体について、取得した情報に基づいてスキャッタグラムを作成した。immature NRBC/Megaloblastを含む検体についてのスキャッタグラムを図３３に示す。DNA aneuploidyを含む検体についてのスキャッタグラムを図３４に示す。図３３及び３４において、Ａは第２スキャッタグラムであり、Ｂは第１スキャッタグラムであり、Ｃは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムである。
immature NRBC/Megaloblastを含む検体として、赤芽球(NRBC)を含む末梢血を用いた。DNA aneuploidyを含む検体として、DNA量異常白血球を含む末梢血を用いた。各検体から調製した測定試料を測定した。測定では、青紫色蛍光強度、赤色蛍光強度及び側方散乱光強度の他に、前方散乱光シグナルの強度を取得した。それぞれの検体について、取得した情報に基づいてスキャッタグラムを作成した。immature NRBC/Megaloblastを含む検体についてのスキャッタグラムを図３３に示す。DNA aneuploidyを含む検体についてのスキャッタグラムを図３４に示す。図３３及び３４において、Ａは第２スキャッタグラムであり、Ｂは第１スキャッタグラムであり、Ｃは、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムである。
【0180】
図３３のＡに示される第２スキャッタグラムでは、immature NRBC/Megaloblastは、破線の楕円で囲まれた領域に出現したが、リンパ球の集団と重なっていた。そのため、immature NRBC/Megaloblastを検出及び分類できなかった。図３３のＢに示される第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を示し、且つリンパ球又は単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この一群の粒子は、immature NRBC/Megaloblastであった。この粒子群と正常な白血球とを合わせた粒子集団について、青紫色蛍光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値以上であったことから、immature NRBC/Megaloblastは、第１スキャッタグラムにおいてリンパ球の集団及び単球の集団から分離したクラスタであった。
【0181】
図３４のＡに示される第２スキャッタグラムでも、図３３のＡと同様、DNA aneuploidyは、破線の楕円で囲まれた領域に出現したが、リンパ球の集団と重なっていた。そのため、DNA aneuploidyを検出及び分類できなかった。図３４のＢに示される第１スキャッタグラムでも、図３３のＢと同様、リンパ球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を示し、且つリンパ球と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この一群の粒子は、DNA aneuploidyであった。また、この粒子群と正常な白血球とを合わせた粒子集団について、青紫色蛍光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値以上であった。よって、DNA aneuploidyは、リンパ球の集団から分離したクラスタであった。図３３のＢと図３４のＢとを比較すると、第１スキャッタグラムにより、immature NRBC/MegaloblastとDNA aneuploidyとを区別することは困難であった。
【0182】
図３３のＣに示されるスキャッタグラムでは、immature NRBC/Megaloblastは、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。このスキャッタグラムから分かるように、immature NRBC/Megaloblastのクラスタはリンパ球の集団と重なっていた。すなわち、immature NRBC/Megaloblastの前方散乱光強度は、リンパ球の前方散乱光強度とほぼ同じであった。一方、図３４のＣに示されるスキャッタグラムでは、DNA aneuploidyは、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。このスキャッタグラムから分かるように、DNA aneuploidyのクラスタは、リンパ球の集団よりも前方散乱光強度が高い領域に出現した。図３３のＣと図３４のＣとを比較すると、immature NRBC/MegaloblastとDNA aneuploidyとを区別できることが示された。
【0183】
図３３及び３４より、第１スキャッタグラムにおいて、青色蛍光強度がリンパ球の集団よりも高く、且つ散乱光強度がリンパ球の集団又は単球の集団と同じである領域に、所定の数以上の粒子が出現し、当該粒子の青紫色蛍光強度のCV値が閾値以上であるとき、当該粒子は、immature NRBC/Megaloblast又はDNA aneuploidyと疑われることが示された。そして、当該粒子の前方散乱光強度が閾値未満であるとき、当該粒子はimmature NRBC/Megaloblastと定義できることが示された。また、当該粒子の前方散乱光強度が閾値以上であるとき、当該粒子はDNA aneuploidyと定義できることが示された。
【0184】
実施例７：異常白血球細胞群の検出及び分類
異常白血球細胞には主に、異型リンパ球、異常リンパ球、骨髄芽球及びリンパ芽球の４種類が知られている。また、異常リンパ球には、DNA量には異常のない腫瘍性細胞とDNA量異常白血球とが存在する。実施例７では、各種の異常白血球細胞を含む検体をそれぞれ分析した。
異常白血球細胞には主に、異型リンパ球、異常リンパ球、骨髄芽球及びリンパ芽球の４種類が知られている。また、異常リンパ球には、DNA量には異常のない腫瘍性細胞とDNA量異常白血球とが存在する。実施例７では、各種の異常白血球細胞を含む検体をそれぞれ分析した。
【0185】
(１) 異型リンパ球(Aty-Lymph)を含む検体の分析
Aty-Lymphを含む検体として、異型リンパ球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３５に示す。図３５のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３５のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。また、好中球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。しかし、単球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この粒子群は、正常検体には認められなかったことから、当該領域に出現した粒子群をAty-Lymphクラスタとして定義した。
Aty-Lymphを含む検体として、異型リンパ球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３５に示す。図３５のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３５のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。また、好中球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。しかし、単球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この粒子群は、正常検体には認められなかったことから、当該領域に出現した粒子群をAty-Lymphクラスタとして定義した。
【0186】
図３５のＢに示される第１スキャッタグラムにおいても、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。この第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団に、青紫色蛍光強度がこれに対応する閾値以上である示す粒子は、ほとんど認められなかった。また、好中球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有し、且つ好中球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子も、ほとんど認められなかった。しかし、単球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有し、且つ単球の集団と同じ散乱光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。当該領域に出現した粒子群をAty-Lymphクラスタとして定義した。このように、第１又は第２スキャッタグラムにおいて、蛍光強度が単球の集団よりも高く、且つ散乱光強度が単球の集団と同じである領域を、Aty-Lymphクラスタが出現する領域として定義できることが示された。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をAty-Lymphとして検出又は分類できることが示された。
【0187】
(２) 異常リンパ球(Abn-Lymph)を含む検体の分類
Abn-Lymphを含む検体として、DNA量異常白血球ではない異常リンパ球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３６に示す。図３６のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ亜集団に分類された。図３６のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。図３６のＢに示される第１スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ亜集団に分類された。この第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。よって、検体中にDNA量が異常な細胞はほとんど存在しないことが示唆された。第２スキャッタグラムにおいて、実線の四角で囲まれた領域、すなわち赤色蛍光強度が閾値以上であり、且つ散乱光強度がリンパ球の集団と同じである領域に出現した粒子群をAbn-Lymphクラスタとして定義した。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をAbn-Lymphとして検出又は分類できることが示された。
Abn-Lymphを含む検体として、DNA量異常白血球ではない異常リンパ球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３６に示す。図３６のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ亜集団に分類された。図３６のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。図３６のＢに示される第１スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ亜集団に分類された。この第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有する粒子は、ほとんど認められなかった。よって、検体中にDNA量が異常な細胞はほとんど存在しないことが示唆された。第２スキャッタグラムにおいて、実線の四角で囲まれた領域、すなわち赤色蛍光強度が閾値以上であり、且つ散乱光強度がリンパ球の集団と同じである領域に出現した粒子群をAbn-Lymphクラスタとして定義した。この定義した領域に、所定の数以上の粒子が出現した場合、当該粒子をAbn-Lymphとして検出又は分類できることが示された。
【0188】
(３) DNA量異常白血球(DNA aneuploidy)を含む検体の分析
DNA aneuploidyを含む検体として、DNA量異常白血球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３７に示す。図３７のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３７のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。ここで、図３７のＡと図３６のＡとを比較すると、第２スキャッタグラムにおける粒子の分布はほぼ同様であった。よって、第２スキャッタグラムにより、検体中の異常白血球細胞がAbn-Lymphであるか又はDNA aneuploidyであるかを区別することは困難であった。
DNA aneuploidyを含む検体として、DNA量異常白血球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３７に示す。図３７のＡに示される第２スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球及び好中球の３つ亜集団に分類された。図３７のＡでは、リンパ球に分類された集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。ここで、図３７のＡと図３６のＡとを比較すると、第２スキャッタグラムにおける粒子の分布はほぼ同様であった。よって、第２スキャッタグラムにより、検体中の異常白血球細胞がAbn-Lymphであるか又はDNA aneuploidyであるかを区別することは困難であった。
【0189】
図３７のＢに示される第１スキャッタグラムでは、正常な白血球が少なくともリンパ球、単球、好中球及び好酸球の４つ亜集団に分類された。この第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有する粒子が、実線の楕円で囲まれた領域に多数出現した。この一群の粒子は、正常な白血球よりも多量のDNAを含むことが示された。この粒子群と正常な白血球とを合わせた粒子集団について、青紫色蛍光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値以上であった。よって、この粒子群が正常な白血球の各亜集団に対して離散的であることが示唆された。実際、図３７のＢにおいて、実線の楕円で囲まれた領域に出現した粒子は、リンパ球の集団及び単球の集団から分離したクラスタであった。よって、実線の楕円で囲まれた領域に出現した粒子群は、DNA aneuploidyであることが示唆された。
【0190】
このように、第２スキャッタグラムにおいて、赤色蛍光強度が閾値以上であり、且つ散乱光強度がリンパ球の集団と同じである領域に出現した粒子群は、Abn-Lymph又はDNA aneuploidyであることが疑われる。しかし、第１スキャッタグラムにおいて、青紫色蛍光強度がリンパ球の集団よりも高い領域に、所定の数以上の粒子が出現し、且つその粒子群の青紫色蛍光強度のCV値が閾値以上である場合、当該粒子群をDNA aneuploidyとして検出又は分類できることが示された。
【0191】
(４) 骨髄芽球(M-Blast)を含む検体の分析
M-Blastを含む検体として、骨髄芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３８に示す。図３８のＡに示される第２スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と単球の集団とが重なり、大きな集団が認められた。また、好中球の集団及び好酸球の集団が分類された。リンパ球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数認められた。この領域に出現した粒子には骨髄芽球が含まれていたが、図３８のＡから分かるように、骨髄芽球の粒子群は単球の集団と重なっていた。
M-Blastを含む検体として、骨髄芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３８に示す。図３８のＡに示される第２スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と単球の集団とが重なり、大きな集団が認められた。また、好中球の集団及び好酸球の集団が分類された。リンパ球の集団よりも高い赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数認められた。この領域に出現した粒子には骨髄芽球が含まれていたが、図３８のＡから分かるように、骨髄芽球の粒子群は単球の集団と重なっていた。
【0192】
図３８のＢに示される第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と単球の集団とが重なった大きな集団が認められた。また、好中球の集団及び好酸球の集団が分類された。この第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数認められた。これらの粒子は、正常な白血球よりも多量のDNAを含むことが示された。第１スキャッタグラムにおける実線の四角で囲まれた領域中の粒子、リンパ球及び単球を合わせた粒子集団について、青紫色蛍光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値未満であった。よって、実線の四角で囲まれた領域中の粒子は、リンパ球の集団及び単球の集団に連続するクラスタであることが示唆された。このことは、第１スキャッタグラムに示された粒子の分布のとおりであった。また、第１スキャッタグラムにおけるリンパ球の集団について、側方散乱光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値以上であった。これらのことから、実線の四角で囲まれた領域、すなわち、青色蛍光強度がリンパ球の集団よりも高く、且つ側方散乱光強度がリンパ球の集団及び単球の集団と同じである領域内の粒子を、骨髄芽球として定義できることが示された。
【0193】
(５) リンパ芽球(L-Blast)を含む検体の分析
L-Blastを含む検体として、リンパ芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３９に示す。図３９のＡに示される第２スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と好中球の集団が分類された。リンパ球の集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この領域に出現した粒子にはリンパ芽球が含まれていたが、図３９のＡから分かるように、リンパ芽球の粒子群はリンパ球の集団と重なっていた。
L-Blastを含む検体として、リンパ芽球を含む末梢血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図３９に示す。図３９のＡに示される第２スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と好中球の集団が分類された。リンパ球の集団において、閾値以上の赤色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数出現した。この領域に出現した粒子にはリンパ芽球が含まれていたが、図３９のＡから分かるように、リンパ芽球の粒子群はリンパ球の集団と重なっていた。
【0194】
図３９のＢに示される第１スキャッタグラムでは、リンパ球の集団と好中球の集団が分類された。リンパ球の集団よりも高い青紫色蛍光強度を有する粒子が、実線の四角で囲まれた領域に多数認められた。これらの粒子は、正常な白血球よりも多量のDNAを含むことが示された。第１スキャッタグラムにおける実線の四角で囲まれた領域中の粒子及びリンパ球を合わせた粒子集団について、青紫色蛍光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値未満であった。よって、実線の四角で囲まれた領域中の粒子は、リンパ球の集団に連続するクラスタであることが示唆された。このことは、第１スキャッタグラムに示された粒子の分布のとおりであった。また、第１スキャッタグラムにおけるリンパ球の集団について、側方散乱光強度のCV値を算出した。算出したCV値は閾値未満であった。これらのことから、実線の四角で囲まれた領域、すなわち、青色蛍光強度がリンパ球の集団よりも高く、且つ側方散乱光強度がリンパ球の集団と同じである領域内の粒子を、リンパ芽球として定義できることが示された。
【0195】
参考例２：DNA量異常白血球のDNAインデックスの取得
本実施形態の検体の分析方法によりDNA量異常白血球(DNA aneuploidy)を検出又は分類した場合、第１蛍光色素からの蛍光強度のヒストグラムを用いてDNAインデックスを取得できる。DNAインデックスは、正常白血球のDNA量に対するDNA量異常白血球のDNA量の比率である。DNAインデックスは、リンパ腫の悪性度を示唆し得る。以下に、DNAインデックスを取得する方法について説明する。
本実施形態の検体の分析方法によりDNA量異常白血球(DNA aneuploidy)を検出又は分類した場合、第１蛍光色素からの蛍光強度のヒストグラムを用いてDNAインデックスを取得できる。DNAインデックスは、正常白血球のDNA量に対するDNA量異常白血球のDNA量の比率である。DNAインデックスは、リンパ腫の悪性度を示唆し得る。以下に、DNAインデックスを取得する方法について説明する。
【0196】
DNA aneuploidyを含む検体として、マントル細胞リンパ腫患者の末梢血を用いた。実施例７の(３)と同様に、当該末梢血から調製した測定試料を測定し、第２スキャッタグラムを作成した。図４０のＡを参照して、第２スキャッタグラムにおいて、単球及びリンパ球の集団が出現した領域(実線で囲まれた領域)をゲーティングした。この領域内の粒子を青紫色蛍光強度(以下、「V-SFL」ともいう)のヒストグラムで分析した。図４０のＢのヒストグラムには２つのピークが認められた。V-SFLが低い方のピーク(左のピーク)を「第１ピーク」と呼び、V-SFLが高い方のピーク(右のピーク)を「第２ピーク」と呼んだ。第１ピークを構成する全ての粒子を「V-SFL正常集団」と定義し、第２ピークを構成する全ての粒子を「V-SFL高値集団」と定義した。ここで、正常白血球のDNA量はほぼ一定であり、正常検体の第１スキャッタグラムから分かるように、正常白血球が示す青色蛍光強度の範囲も既知である。したがって、図４０のＢでは、V-SFL正常集団は、正常なリンパ球及び単球を含むことが示唆され、V-SFL高値集団は、DNA量異常白血球を含むことが示唆された。各集団のV-SFLの代表値として最頻値を用いて、下記の式によりDNAインデックスを算出した。図４０の例では、DNAインデックスは1.67であった。
【0197】
(DNAインデックス) = (V-SFL高値集団の最頻値)/(V-SFL正常集団の最頻値)
【0198】
参考例３：蛍光試薬による細胞の染色部位
上記の溶血試薬及び染色試薬を用いて、幼若顆粒球を含む末梢血から測定試料を調製した。測定試料中の細胞をイメージングフローサイトメータで撮像して、リンパ球、好中球及び幼若顆粒球における染色部位を確認した。結果を図４１に示す。図中、「Bright」は明視野像を表し、「1st dye」は第１蛍光色素による蛍光画像を表し、「2nd dye」は第２蛍光色素による蛍光画像を示し、「Merge」は第１蛍光色素による蛍光画像と第２蛍光色素による蛍光画像の重ね合わせを表す。図４１に示されるように、リンパ球(Lymp)及び好中球(Neut)に比べて、幼若顆粒球(IG)は第１蛍光色素及び第２蛍光色素により強く染色されていることが分かった。これは、幼若顆粒球が、リンパ球及び好中球よりもDNA及びRNAの量が多いことを示唆する。
上記の溶血試薬及び染色試薬を用いて、幼若顆粒球を含む末梢血から測定試料を調製した。測定試料中の細胞をイメージングフローサイトメータで撮像して、リンパ球、好中球及び幼若顆粒球における染色部位を確認した。結果を図４１に示す。図中、「Bright」は明視野像を表し、「1st dye」は第１蛍光色素による蛍光画像を表し、「2nd dye」は第２蛍光色素による蛍光画像を示し、「Merge」は第１蛍光色素による蛍光画像と第２蛍光色素による蛍光画像の重ね合わせを表す。図４１に示されるように、リンパ球(Lymp)及び好中球(Neut)に比べて、幼若顆粒球(IG)は第１蛍光色素及び第２蛍光色素により強く染色されていることが分かった。これは、幼若顆粒球が、リンパ球及び好中球よりもDNA及びRNAの量が多いことを示唆する。
【0199】
参考例４：DNA異常(％)の取得
正常検体及びDNA量異常白血球を含む検体の計16検体を、本実施形態の検体の分析方法及び標準測定法により分析して、DNA異常(％)を取得した。標準測定法とは、Takamoto S.ら, Guidelines for flow cytometric analysis of DNA aneuploidy, Cytometry Research, vol.19, no.1, pp.1-9, 2009に記載の日本フローサイトメトリ学会標準化委員会による測定方法であった。標準測定法では、第１蛍光色素としてヨウ化プロビジウム(PI)を含む染色液を用いた。染色液の組成は、50μg/mL PI、0.1％ Triton(商標)X-100、0.1％クエン酸二ナトリウム三水和物及び1 mg/mL RNaseであった。
正常検体及びDNA量異常白血球を含む検体の計16検体を、本実施形態の検体の分析方法及び標準測定法により分析して、DNA異常(％)を取得した。標準測定法とは、Takamoto S.ら, Guidelines for flow cytometric analysis of DNA aneuploidy, Cytometry Research, vol.19, no.1, pp.1-9, 2009に記載の日本フローサイトメトリ学会標準化委員会による測定方法であった。標準測定法では、第１蛍光色素としてヨウ化プロビジウム(PI)を含む染色液を用いた。染色液の組成は、50μg/mL PI、0.1％ Triton(商標)X-100、0.1％クエン酸二ナトリウム三水和物及び1 mg/mL RNaseであった。
【0200】
標準測定法では、全血(50μL)に染色液(1 mL)を混合し、30分以上静置して測定試料を得た。得られた測定試料を上記の分析装置で測定した。Flowjo(商標)により、横軸に側方散乱光強度をとり、縦軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムを作成した。図４２のＡを参照して、このスキャッタグラム上で、デブリを含まず且つ白血球を含む領域(実線で囲まれた領域)をゲーティングし、白血球についてPIの蛍光強度のヒストグラムを作成し、白血球を計数した。図４２のＢを参照して、このヒストグラム上で、蛍光強度が高値を示す集団をゲーティングし、計数した。本実施形態の検体の分析方法では、各検体から調製した測定試料を測定し、第１スキャッタグラムを作成した。図４３を参照して、第１スキャッタグラム上で、デブリを含まず且つ白血球を含む領域(実線で囲まれた領域)をゲーティングし、領域内の粒子を計数した。この領域内の粒子のうち、青色蛍光強度が高値の集団(破線で囲まれた領域)をゲーティングし、計数した。標準測定法及び本実施形態の検体の分析方法で計数した細胞数を用いて、下記の式により各検体のDNA異常(％)を算出した。
【0201】
(DNA異常) = {(第１蛍光色素の蛍光強度が高値を示す細胞の数)/(白血球の数)}×100
【0202】
標準測定法及び本実施形態の検体の分析方法で取得したDNA異常(％)の値をプロットし、回帰直線(y=3.5122x-0.3086)を得た。相関係数(r)は0.961であり、決定係数(r2)は0.9241であった。図４４を参照して、本実施形態の検体の分析方法は標準測定法と高い相関性を有することが示された。
【0203】
実施例８：感染赤血球(iRBC)を含む検体の分析
iRBCを含む検体として、培養マラリア添加人血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４５に示す。図４５のＡに示される第２スキャッタグラムでは、デブリの集団よりも高い赤色蛍光強度及び側方散乱光強度を有する粒子が、破線の楕円で囲まれた領域に出現した。この領域に出現した粒子にはiRBCが含まれていたが、図４５のＡから分かるように、iRBCの粒子群は好中球の集団と重なっていた。図４５のＢに示される第１スキャッタグラムでは、iRBCの粒子群が、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。第２スキャッタグラムとは異なり、第１スキャッタグラムでのiRBCの粒子群は、白血球の亜集団とは重なっていなかった。よって、第１スキャッタグラムにおいて、青色蛍光強度及び側方散乱光強度がデブリの集団よりも高い領域に出現した粒子群をiRBCクラスタとして定義できることが示された。なお、iRBCとPLT-clumpsとの区別については、実施例３のとおりである。
iRBCを含む検体として、培養マラリア添加人血を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４５に示す。図４５のＡに示される第２スキャッタグラムでは、デブリの集団よりも高い赤色蛍光強度及び側方散乱光強度を有する粒子が、破線の楕円で囲まれた領域に出現した。この領域に出現した粒子にはiRBCが含まれていたが、図４５のＡから分かるように、iRBCの粒子群は好中球の集団と重なっていた。図４５のＢに示される第１スキャッタグラムでは、iRBCの粒子群が、実線の楕円で囲まれた領域に出現した。第２スキャッタグラムとは異なり、第１スキャッタグラムでのiRBCの粒子群は、白血球の亜集団とは重なっていなかった。よって、第１スキャッタグラムにおいて、青色蛍光強度及び側方散乱光強度がデブリの集団よりも高い領域に出現した粒子群をiRBCクラスタとして定義できることが示された。なお、iRBCとPLT-clumpsとの区別については、実施例３のとおりである。
【0204】
実施例９：非血液試料の正常検体の分析
非血液試料の正常検体として、異常細胞を含まないことが既知の胸水を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４６に示す。図４６のＡに示される第１スキャッタグラムでは、破線の楕円で囲まれた領域に単核球(単球及びリンパ球)の集団が出現し、実線の楕円で囲まれた領域に多形核球(好中球、好酸球及び好塩基球)の集団が出現した。これらの集団は、青色蛍光強度が低い領域に出現したデブリの集団から離れていた。よって、第１スキャッタグラムより、有核細胞とデブリとを区別し、有核細胞のみをゲーティングできることが示された。また、側方散乱光強度が低い領域に出現した有核細胞の集団を単核球と定義し、側方散乱光強度が高い領域に出現した有核細胞の集団を多形核球と定義できることが示された。図４６のＢに示される第２スキャッタグラムでは、破線の楕円で囲まれた領域に単球の集団及びリンパ球の集団が出現し、実線の楕円で囲まれた領域に多形核球の集団が出現した。
非血液試料の正常検体として、異常細胞を含まないことが既知の胸水を用いた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４６に示す。図４６のＡに示される第１スキャッタグラムでは、破線の楕円で囲まれた領域に単核球(単球及びリンパ球)の集団が出現し、実線の楕円で囲まれた領域に多形核球(好中球、好酸球及び好塩基球)の集団が出現した。これらの集団は、青色蛍光強度が低い領域に出現したデブリの集団から離れていた。よって、第１スキャッタグラムより、有核細胞とデブリとを区別し、有核細胞のみをゲーティングできることが示された。また、側方散乱光強度が低い領域に出現した有核細胞の集団を単核球と定義し、側方散乱光強度が高い領域に出現した有核細胞の集団を多形核球と定義できることが示された。図４６のＢに示される第２スキャッタグラムでは、破線の楕円で囲まれた領域に単球の集団及びリンパ球の集団が出現し、実線の楕円で囲まれた領域に多形核球の集団が出現した。
【0205】
実施例１０：組織由来細胞を含む検体の分析
組織由来細胞を含む検体として、中皮細胞を含むことが確認された胸水を用いた。この検体をメイ・ギムザ染色して顕微鏡で観察すると、図４７のＡの顕微鏡画像に示されるように、実線の四角で囲まれた領域に中皮細胞が認められた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４７に示す。図４７のＢに示される第２スキャッタグラム及びＣに示される第１スキャッタグラムのいずれにおいても、破線の楕円で囲まれた領域に中皮細胞の粒子が出現した。よって、第１スキャッタグラム又は第２スキャッタグラムにおいて、蛍光強度が高い領域に出現した粒子群を組織由来細胞クラスタと定義できることが示された。
組織由来細胞を含む検体として、中皮細胞を含むことが確認された胸水を用いた。この検体をメイ・ギムザ染色して顕微鏡で観察すると、図４７のＡの顕微鏡画像に示されるように、実線の四角で囲まれた領域に中皮細胞が認められた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。作成したスキャッタグラムを図４７に示す。図４７のＢに示される第２スキャッタグラム及びＣに示される第１スキャッタグラムのいずれにおいても、破線の楕円で囲まれた領域に中皮細胞の粒子が出現した。よって、第１スキャッタグラム又は第２スキャッタグラムにおいて、蛍光強度が高い領域に出現した粒子群を組織由来細胞クラスタと定義できることが示された。
【0206】
実施例１１：細菌又は真菌を含む検体の分析
細菌又は真菌を含む検体として、真菌を含むことが確認された腹水を用いた。この検体をメイ・ギムザ染色して顕微鏡で観察すると、図４８のＡの顕微鏡画像に示されるように、実線の四角で囲まれた領域に真菌が認められた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。図４８のＢに示される第２スキャッタグラムでは、真菌の粒子群は、好中球の集団に重なり、検出できなかった。一方、図４８のＣに示される第１スキャッタグラムでは、真菌の粒子群は、破線の楕円で囲んだ領域に出現した。よって、第１スキャッタグラムにおいて、デブリの集団よりも青紫色蛍光強度が高く且つ白血球よりも青色蛍光強度が低い領域に出現した粒子群を、細菌又は真菌のクラスタと定義できることが示された。
細菌又は真菌を含む検体として、真菌を含むことが確認された腹水を用いた。この検体をメイ・ギムザ染色して顕微鏡で観察すると、図４８のＡの顕微鏡画像に示されるように、実線の四角で囲まれた領域に真菌が認められた。この検体から調製した測定試料を測定して、第１及び第２スキャッタグラムを作成した。図４８のＢに示される第２スキャッタグラムでは、真菌の粒子群は、好中球の集団に重なり、検出できなかった。一方、図４８のＣに示される第１スキャッタグラムでは、真菌の粒子群は、破線の楕円で囲んだ領域に出現した。よって、第１スキャッタグラムにおいて、デブリの集団よりも青紫色蛍光強度が高く且つ白血球よりも青色蛍光強度が低い領域に出現した粒子群を、細菌又は真菌のクラスタと定義できることが示された。
【0207】
【符号の説明】
【0208】
１１、２１ 染色試薬
１２ 試薬容器
１３、２４ 梱包箱
１４、２５ 添付文書
２２ 第１試薬容器
２３ 第２試薬容器
１００ 採血管
２００ 吸引管
３００ 分析ユニット
４００ 測定ユニット
４１０、４１１ 試薬容器
４１３ フローセル
４２０ 反応チャンバ
４３０ 廃液チャンバ
５００ 分析システム
１２ 試薬容器
１３、２４ 梱包箱
１４、２５ 添付文書
２２ 第１試薬容器
２３ 第２試薬容器
１００ 採血管
２００ 吸引管
３００ 分析ユニット
４００ 測定ユニット
４１０、４１１ 試薬容器
４１３ フローセル
４２０ 反応チャンバ
４３０ 廃液チャンバ
５００ 分析システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
