特開 2024-146544 ユーグレナの培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024146544

(43)【公開日】2024-10-15

(54)【発明の名称】ユーグレナの培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20241004BHJP

【ＦＩ】

C12N1/12 A

C12N1/12 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023059516

(22)【出願日】2023-03-31

(71)【出願人】

【識別番号】522160206

【氏名又は名称】株式会社ユーグリード

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】東海 彰太

(72)【発明者】

【氏名】受川 友衣乃

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA83X

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB16

4B065BC02

4B065BC03

4B065CA41

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】ユーグレナを大量培養する技術を提供すること。
【解決手段】本発明のユーグレナの培養方法は、スクロースが所定の濃度となるように調整されたスクロース含有培養液を用いてユーグレナを培養するスクロース培養工程を含み、前記スクロース培養工程の少なくとも一部の期間において、培養培地のpHを3.0以下に維持することを特徴とする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スクロースが所定の濃度となるように調整されたスクロース含有培養液を用いてユーグレナを培養するスクロース培養工程を含み、
前記スクロース培養工程の少なくとも一部の期間において、培養培地のpHを3.0以下に維持する、ユーグレナの培養方法。

【請求項2】

前記スクロース含有培養液に含まれるスクロースの濃度が10w/v％以下となるように調整されている、請求項１に記載のユーグレナの培養方法。

【請求項3】

培養開始から所定の期間において、グルコース及びフルクトースのうちの少なくとも一方の単糖を含み、該単糖の濃度が0.1w/v％以上8.0w/v％未満である単糖含有培養液を用いてユーグレナを培養する、請求項１に記載のユーグレナの培養方法。

【請求項4】

前記スクロース含有培養液が、0.1w/v％以上8.0w/v％未満の濃度のグルコース又はフルクトースをさらに含み、前記スクロースの濃度の2倍の値と前記グルコース又はフルクトースの濃度の値の合計が12.0w/v％以下に調整されたものである、請求項１に記載のユーグレナの培養方法。

【請求項5】

前記スクロース培養工程の開始から所定の期間における培養培地のpHが3.0を超えて7.0以下に維持され、残りの期間における培養培地のpHが3.0以下に維持される、請求項１に記載のユーグレナの培養方法。

【請求項6】

前記スクロース培養工程の全期間中における培養培地のpHが3.0以下に維持される、請求項１に記載のユーグレナの培養方法。

【請求項7】

培養温度が20℃以上35℃以下である、請求項１～６のいずれかに記載のユーグレナの培養方法。

【請求項8】

実質的に光がない環境下、又は全く光がない環境下で従属栄養的に培養する、請求項１～６のいずれかに記載のユーグレナの培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ユーグレナの培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微細藻類の一種であるユーグレナ（Euglena gracilis）は長さが約50μm、幅が約10μm、植物にも動物にも属する生き物である。ユーグレナはミドリムシとしても知られており、光合成によって水と二酸化炭素から有機化合物を合成し、酸素を放出する。ユーグレナは、細胞内にタンパク質やビタミン類を豊富に含み、それ自身の栄養価が高いことから、乾燥粉末が食品添加物や栄養補助食品（サプリメント）として利用されている。

【0003】

一方、ユーグレナは、光非照射下で有機炭素源を利用する従属栄養的な培養を行うと葉緑体が消失してパラミロンを多量に含む細胞になり、光非照射下で従属栄養的に嫌気培養を行うとワックスエステルを多量に含む細胞になる。パラミロンは、ナノファイバーの原料物質として利用され、ワックスエステル（炭素数が十数個のアルコールとカルボン酸からなるエステル化合物）は燃料としての活用が期待されている。

【0004】

ユーグレナが産生するパラミロンやワックスエステル等の物質の工業的、商業的利用を実現するためには、ユーグレナを安定的に且つ大量に培養する技術が求められる。

【0005】

微生物を大量に培養する技術の一つに、培養槽内に微生物を高密度に充填して培養する高密度培養法がある。高密度培養における培養能力は、例えば、一度に培養可能な単位容量当たりの微生物の量（これを最大バイオマス収量という）で表すことができる。これまでに報告されている高密度培養における微細藻類の最大バイオマス収量は、クロレラ属（chlorella vulgaris）が117.2g/L、クリプテコディヌウム属（Cryptecodiniumu cohnii）が109.0g/L、ガルディエリア属（Galdieria sulphurariaha）が116.0g/L、スラウストキトリアルス（Thraustochytriales）が221.0g/Lであるのに対して、ユーグレナ（Euglena gracilis）では48.2g/Lであり、他の微細藻類に比べるとユーグレナは最大バイオマス収量が低く（特許文献１、２、非特許文献１～５）、ユーグレナの最大バイオマス収量を高めることができる培養条件が模索されていた。なお、ここでは、単位容量当たりの微細藻類の乾燥重量でバイオマス収量が表されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第2003/0180898号明細書

【特許文献2】特開昭63-71192号公報

【特許文献3】特開2021-166510号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ogbonna, JC., Tomiyama, S., Tanaka, H., Heterotrophic cultivation of Euglena gracilis Z for efficient production of alpha-tocopherol. Journal of Applied Phycology 10, 67.

【非特許文献2】Doucha, J., Livansky, K.,(2011), Production of high-density Chlorella culture grown in fermenters. J Appl Phycol, 24, 35-43.

【非特許文献3】Swaaf, ME., Sijtsma, L.,Pronk, JT., (2003), High-cell-density fed-batch cultivation of the docosahexaenoic acid producing marine alga Crypthecodinium cohnii. Biotechnol Bioeng, 81, 666-672.

【非特許文献4】Schmidt, RA., Wiebe, MG., Eriksen, NT., (2005), Heterotrophic high cell-density fed-batch cultures of the phycocyanin-producing red alga Galdieria sulphuraria. Biotechnol Bioeng, 90, 77-84. 29-36.

【非特許文献5】Ganuza, E., et al., (2008), High-cell-density cultivation of Schizochytrium sp. In an ammonium/pH-auxostat fed-batch system. Biotechnology Letters. 30, 1559-1564.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

一般的に、培養液に含まれる炭素源の濃度が高いほど微細藻類の高密度培養が可能となり、バイオマス収量が増加する。ユーグレナを従属栄養的に培養する場合、グルコースやフルクトース等の単糖を有機炭素源として利用することができるが、培養液に含めることができる単糖の濃度は、ユーグレナの株や種類にもよるが、2.0w/v％～8.0w/v％程度であり、それ以上に単糖の濃度を高くするとかえってユーグレナの増殖率が低下したり、増殖阻害が起きたりする。そのため、ユーグレナを大量培養することが難しく、ユーグレナの最大バイオマス収量を高めることができる培養条件が模索されていた。

【0009】

本発明が解決しようとする課題は、ユーグレナを大量培養する技術の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記課題を解決するために成された本発明に係るユーグレナの培養方法は、スクロースの濃度所定の濃度となるように調整されたスクロース含有培養液を用いてユーグレナを培養するスクロース培養工程を含み、
前記スクロース培養工程の少なくとも一部の期間において、培養培地のpHを3.0以下に維持するようにしたものである。

【0011】

本発明に係るユーグレナの培養方法においては、スクロース含有培養液に含まれるスクロースの濃度は、ユーグレナの種や株に応じて、あるいは、スクロース含有培養液に含まれるスクロース以外の成分の量や種類に応じて、さらに或いは、スクロース培養工程の少なくとも一部の期間におけるpHの値に応じて、適宜の値に設定するとよい。例えば、スクロース含有培養液にグルコースやフルクトースなどの単糖が含まれていない場合、スクロースの濃度は高めに設定することができる。また例えば、前記一部の期間においてpHを3.0以下のより低い値に設定するほどスクロースの加水分解が促進されて、スクロース含有培養液中にグルコースとフルクトースが短時間で生成されることになるため、スクロースの濃度は低めに設定するとよい。さらにまた、本発明の培養方法を用いて培養するユーグレナが典型的なユーグレナ属のユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）の場合、スクロースの濃度は10.0w/v％以下、好ましくは8w/v％以下にする。このような濃度にすることにより、スクロースが急速に加水分解されてグルコースとフルクトースが生成されたときにユーグレナが増殖阻害を受けにくくすることができる。

【0012】

本発明のユーグレナの培養方法においては、培養開始から所定の期間において、グルコース及びフルクトースのうちの少なくとも一方の単糖を含み、該単糖の濃度が0.1w/v％～8.0w/v％である単糖含有培養液を用いてユーグレナを培養することとすることができる。

【0013】

本発明に係るユーグレナの培養方法においては、
また、本発明に係るユーグレナの培養方法においては、前記スクロース含有培養液が、0.1w/v％～8.0w/v％の濃度のグルコース又はフルクトースをさらに含み、前記スクロースの濃度の2倍の値と前記グルコース又はフルクトースの濃度の値の合計が12.0w/v％以下に調整されたものとすることができる。

【0014】

さらにまた、本発明に係るユーグレナの培養方法においては、前記スクロース培養工程の開始から所定の期間における培養培地のpHが3.0を超えて7.0以下に維持され、残りの期間における培養培地のpHが3.0以下に維持されるようにすることができる。あるいは、本発明に係るユーグレナの培養方法においては、前記スクロース培養工程の全期間中における培養培地のpHが3.0以下に維持されるようにすることができる。

【0015】

また、本発明に係るユーグレナの培養方法においては、培養温度を20℃以上35℃以下にすることが好ましい。20℃以上35℃以下では、スクロースの加水分解は緩やかに進む。このような温度範囲で培養することにより、培養液中のスクロースの加水分解が過度に促進されることが防止され、培養液中の単糖の急激な濃度上昇によりユーグレナの増殖率が低下することを防止することができる。

【0016】

本発明に係るユーグレナの培養方法においては、実質的に光がない環境下、又は全く光がない環境下で従属栄養的に培養することができる。本発明の方法を用いてユーグレナを従属栄養液に培養することにより、細胞中にパラミロンやワックスエステルを多量に含むユーグレナを大量培養できる。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、ユーグレナを効率よく大量培養することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】実験１で用いた各pHの培養液におけるスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度の時間的変化を示すグラフ。

【図2A】実験２における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフ。

【図2B】実験２における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示す別のグラフ。

【図3】実験３における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフ。

【図4】実験４における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフ。

【図5A】実験５における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフ。

【図5B】実験５における各試験区の培養液の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフ。

【図6】実験６における各試験区の培養液の濁度、乾燥細胞重量、pH、及び糖濃度の時間的変化を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明のユーグレナの培養方法は、スクロースの濃度が6w/v％以下となるように調整されたスクロース含有培養液を用いてユーグレナを培養するスクロース培養工程を含み、前記スクロース培養工程の少なくとも一部の期間において、培養培地のpHを1.0～2.5に維持することを特徴とする。

【0020】

なお、本発明における「ユーグレナ」とは、典型的にはユーグレナ属のユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）であるが、ユーグレナ属であればそれ以外の種（species）であってもよい。

【0021】

本発明に係るユーグレナの培養方法では、ユーグレナを培養する全期間においてスクロース含有培養液を用いてもよく、一部の期間においてのみスクロース含有培養液を用いてもよい。ユーグレナを培養する全期間においてスクロース含有培養液を用いる場合は、スクロース含有培養液にグルコースやフルクトースなどの単糖が含まれていることが好ましい。また、一部の期間においてのみスクロース含有培養液を用いる場合でも、培養期間の初めにスクロース培養工程が実行される場合は、スクロース含有培養液にグルコースやフルクトースなどの単糖が含まれていることが好ましい。なお、培養期間の一部の期間においてのみスクロース含有培養液を用いる場合、残りの期間ではグルコースやフルクトース等の単糖を含み、スクロースを含まない培養液を用いてユーグレナを培養することになる。

【0022】

スクロースは、そのままではユーグレナの従属栄養培養における栄養源として利用されないが、加水分解されて単糖であるグルコースとフルクトースに分かれることによって、ユーグレナの従属栄養培養における栄養源として利用可能となる。ユーグレナを従属栄養培養するときの培養液の一般的な温度（20～35℃）、pH（3.0～7.0）では、スクロースはほとんど加水分解されない。一方、培養液の温度が35℃を超えて高くなるほど、又は培養液のpHが3.0以下に低下するほど、スクロースの加水分解は促進される。ただし、培養液の温度が高くなるとユーグレナの生育が抑制されるおそれがある。そこで、本発明では、スクロース培養工程の少なくとも一部の期間において培養液に酸を添加してpHを3.0以下に低下させた状態に維持することにより、スクロースの加水分解を促進し、培養液中の、ユーグレナの栄養源となる単糖（グルコース及びフルクトース）の濃度を上昇させるようにした。培養液のpHを3.0以下にすることに起因してユーグレナの増殖が抑制されることはないため、ユーグレナを効率よく大量培養することができる。ここで、pHを低下させるためにスクロース含有培養液に添加する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸を用いることができる。

【0023】

ただし、培養液中の単糖の濃度が高くなりすぎるとユーグレナの生育が阻害されるおそれがある。したがって、スクロース含有培養液がスクロースと単糖の両方を含む場合、或いは単糖を含む培養液を用いてユーグレナを培養した後、スクロース培養工程を実施する場合等、スクロース培養工程の開始時において培養液中に単糖が存在しているときは、該単糖の濃度が低下した頃にpHを3.0以下に低下させ、それまではpHを3.0から7.0の範囲に維持することが好ましい。このようにすることで、ユーグレナの栄養源となる単糖の濃度が過度に上昇することを防止しつつ該単糖をユーグレナに供給することができる。特に、スクロース含有培養液が単糖を含む場合は、適切な時期にpHを3.0以下に低下させることにより、長期にわたって栄養源となる単糖をユーグレナに供給し続けることができる。

【0024】

一方、スクロース含有培養液が単糖を含まない場合、或いはスクロース培養工程の前に単糖を含む培養液を用いた培養工程が実施されない場合は、スクロース培養工程の初めから培養培地のpHを3.0以下に維持することが好ましい。このようにすることで、スクロース培養工程の開始時から培養液中に含まれるスクロースを速やかに加水分解し、栄養源となる単糖をユーグレナに供給することができる。

【実施例0025】

以下、本発明に関連して行った実験例について説明する。
［実験１］
ユーグレナの培養・増殖の実験を行う前に、スクロースの加水分解とpHとの関係を確認するための実験を行った。
表１～表３に示す組成の培養液に2N（規定度）の塩酸を添加することによってpHを4.5、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5に調整した。なお、培養液に含まれるビタミンＢ_１液として250mg/Lのチアミン塩酸塩水溶液を用い、ビタミンＢ_１２液として5.0mg/Lのシアノコバラミン水溶液を用いた。

【0026】

【表1】

【表2】

【表3】

【0027】

続いて、100mL容量のバッフル付きフラスコを6個用意し、各フラスコに、上記の6種類の培養液をそれぞれ20mLずつ入れ、滅菌した後、各pHの培養液にフィルターろ過したスクロースを添加することによって、スクロース濃度が2w/v％で、pHが異なる6種類の培養液を用意した。この培養液にユーグレナを植藻せずに（未植藻）、常温（28℃）、撹拌速度110rpm、暗黒下の条件で93.5時間、回転振とうした。培養を開始してから適宜のタイミングで培養液を採取し、そこに含まれるグルコース、フルクトース、スクロースの濃度を測定した。グルコース、フルクトース、スクロースの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（Waters e2695）、HPLCカラム（Shodex HILICpak VG-50）、HPLC用示差屈折率検出器（Waters 2414 RI Detector）を用いて測定した。

【0028】

図１は、各pHの培養液のスクロース、グルコース、及びフルクトースの濃度の時間的変化を示すグラフであり、横軸は時間（hrs）を、縦軸は糖濃度（％）を示す。なお、この段落及び他の段落で用いる糖濃度（％）は全て溶質重量／容量％（w/v％）を表している。図１から分かるように、pHが4.5、3.5の培養液では、時間が経過してもスクロースはほとんど加水分解しなかった。一方、pHが3.0以下の培養液では時間の経過とともにスクロースが徐々にグルコースとフルクトースに加水分解され、pHが低くなるほど加水分解が早く進行することが分かった。例えば、pHが2.0の培養液では、1日に約10％ずつ漸次的にスクロースが加水分解され、pHが1.5の培養液では、1日に約30％ずつ漸次的にスクロースが加水分解されていた。

【0029】

以上より、培養液のpHを3.0以下に調整することで、培養液中のスクロースが、ユーグレナが利用可能な単糖であるグルコースとフルクトースの供給源となり得ることが分かった。

【0030】

［実験２］
次に、ユーグレナを増殖させる際の培養条件を検討するため、培養液中のスクロース、グルコース、及び／又はフルクトースの濃度をそれぞれ異ならせた複数種類の培養液を用いて、ユーグレナの培養を行った。前記ユーグレナとしては、国立環境研究所から入手したユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis Z株 NIES48）を使用した。

【0031】

培養液としては、上述した実験１で用いた培養液と同じ組成の培養液に、2N（規定度）の塩酸を添加することによってpHを4.5に調整し、その後、適宜の量のスクロース、グルコース、及び／又はフルクトースを添加することにより、それぞれの濃度を表４に示す値に調整した12種類の培養液w1～w12を用意した。

【0032】

【表4】

【0033】

また、培養開始から116.5時間経過したときに、培養液w1～w12に、6N（規定度）の塩酸を、培養液1mL当たり約4.3μLずつ添加して、pHを低下させた。

【0034】

続いて、100mL容量のバッフル付きフラスコを複数個用意し、上記の培養液w1～w12をそれぞれ異なるフラスコに20mLずつ入れ、滅菌した後、上記ユーグレナを植藻した。これを、28℃、撹拌速度110rpm、暗黒下の条件で134.5時間、回転振とう培養を行った。培養を開始してから適宜のタイミングで培養液を採取し、培養を開始してから適宜のタイミングで、増殖したユーグレナを含む培養液を採取し、そのバイオマス収量（1Lあたりの乾燥藻体重量）、pH、グルコース、フルクトース、スクロースそれぞれの濃度（糖濃度）を測定した。なお、グルコース、フルクトース、スクロースの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（Waters e2695）、HPLCカラム（Shodex HILICpak VG-50）、HPLC用示差屈折率検出器（Waters 2414 RI Detector）を用いて測定した。

【0035】

＜乾燥細胞重量（バイオマス収量）の測定＞
(1) 恒量になった1.5mL容量のエッペンドルフチューブに、採取した1.0mLの培養液を入れ、遠心分離（5000rpm、5分間）を行った。
(2) 遠心分離の後、上清を除去し、そこに、0.8％生理食塩水を1.0mL加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。
(3) 再び、遠心分離（5000rpm、5分間）を行い、上清を除去した。
(4) (2)及び（3）の工程を再度繰り返した。
(5) エッペンドルフチューブを加熱し、該チューブ内の細胞（ユーグレナの細胞）を乾燥した（105℃、6時間）。
(6) エッペンドルフチューブをデシケーターに入れて放冷した後、エッペンドルフチューブの重量を測定し、そこから該エッペンドルフチューブの初期重量を差し引いて細胞の乾燥細胞重量を算出した。

【0036】

図２Ａ、図２Ｂは、各培養液を用いて培養したときの乾燥細胞重量（g/L）、グルコース、フルクトース、スクロースの濃度（w/v％）の時間的変化を示すグラフである。グルコース又はフルクトースのみを添加し、スクロースを添加しなかった培養液（w3-w8）を用いて培養した試験区のグラフにはグルコース又はフルクトースの濃度のみを示し、スクロースを添加した培養液（w1-w2, w9-w12）を用いた試験区のグラフにはスクロースとグルコース及びフルクトースの濃度を示している。なお、以下の説明では、培養液w1等を用いた試験区を「試験区w1」等という。

【0037】

図２Ａから分かるように、スクロースしか添加していない試験区w1, w2でも、ユーグレナの増殖が確認された。これは、測定開始時（0hr）において、培養液中にグルコース及びフルクトースが存在していたことによるもので、滅菌時の加熱によりスクロースの１～３割程度が加水分解されてグルコースとフルクトースになったためである。ただし、試験区w1では、培養開始から63.5時間が経過した時点で、ユーグレナが有機炭素源として利用可能な単糖が枯渇してしまい、それが原因であると推定されるpH上昇が起きたため、116.5時間経過後に6N（規定度）の塩酸を培養液に添加しても十分にpHが低下しなった。このため、スクロースが加水分解されず、培養開始から116.5時間が経過した後もユーグレナがほとんど増殖せず、乾燥細胞重量は低いままだった。

【0038】

また、図２Ａ、２Ｂから分かるように、グルコース又はフルクトースのみを含む培養液を用いて培養した試験区w3-w8ではいずれも培養開始から徐々に乾燥細胞重量が増加した。ただし、グルコース又はフルクトースの濃度が2％の培養液を用いた試験区（w3, w6）では培養開始から94.5時間経過した時点で培養液中の糖が枯渇し、グルコース又はフルクトースの濃度が3％の培養液を用いた試験区（w4, w7）では培養開始から116.5時間が経過した時点で培養液中の糖が枯渇してしまい、それ以降の乾燥細胞重量が減少した。

【0039】

一方、2％の濃度のグルコース又はフルクトースと1％又は3％の濃度のスクロースを含む培養液を用いた試験区（w9-w12）では、培養開始から116.5時間が経過した時点で6N（規定度）の塩酸を培養液に添加したことでpHが低下した。その結果、スクロースが加水分解されてグルコースとフルクトースが生成されたため、グルコース又はフルクトースの濃度が2％で、スクロースを含まない培養液を用いた試験区（w3, w6）と異なり、培養開始から116.5時間が経過した後においても乾燥細胞重量の増加が確認された。

【0040】

なお、スクロース濃度が1％の培養液を用いた試験区（w9, w10）では、培養開始から116.5時間が経過した時点で乾燥細胞重量が減少したが、スクロース濃度が3％の培養液を用いた試験区（w11, w12）では培養開始から116.5時間が経過した時点でも乾燥細胞重量が減少しなかった。これは、滅菌時にスクロースが加水分解することで培養開始時における培養液中のグルコース及びフルクトース濃度が増加した結果、培養開始から94.5時間が経過した時点でも培養液中に、ユーグレナの増殖に必要な量の糖が存在していたためと考えられた。このことから、培養液中のグルコース又はフルクトースの初期濃度や、培養液のpHを低下させるタイミングを調整することで、培養期間の途中で培養液にグルコース又はフルクトースを追加することなくユーグレナを継続的に増殖させることが可能であることが推測された。

【0041】

また、培養液中の糖濃度の合計が5％の培養液を用いた試験区（w5, w8, w11, w12）を比較すると、単糖のみの濃度が5％の試験区（w5, w8）は、単糖の濃度が2％でスクロースの濃度が3％の試験区（w11, w12）に比べて培養初期の増殖率が低くなる傾向がみられた。これは、培養液中の単糖濃度が5％を超えたことでユーグレナの増殖が阻害されたことが原因だと考えられた。

【0042】

［実験３］
ユーグレナを増殖させる際の培養条件をさらに検討するため、実験１で用いた培養液と同じ組成（表１～表３に示す組成）の培養液に、2N（規定度）の塩酸を添加することによってpHを2.0に調整した。実験１と同様、培養液に含まれるビタミンＢ_１液として250mg/Lのチアミン塩酸塩水溶液を用い、ビタミンＢ_１２液として5.0mg/Lのシアノコバラミン水溶液を用いた。

【0043】

続いて、100mL容量のバッフル付きフラスコを5個用意し、各フラスコに、上記の培養液をそれぞれ20mLずつ入れて滅菌した後、各培養液にフィルターろ過した適宜の量のスクロースを添加することによって、スクロース濃度が1 w/v％、2 w/v％、4 w/v％、6 w/v％、8 w/v％の5種類の培養液w13～w17を用意した。これら培養液にそれぞれユーグレナを植藻し、28℃、撹拌速度110rpm、暗黒下の条件で94時間、回転振とう培養を行った。培養を開始してから適宜のタイミングで、増殖したユーグレナを含む培養液を採取し、そのバイオマス収量（1Lあたりの乾燥藻体重量）、pH、グルコース、フルクトース、スクロースそれぞれの濃度（糖濃度）を測定した。なお、実験２と異なり、実験３では培養の途中で塩酸を添加してpHを低下させる処理は行わなかった。

【0044】

グルコース、フルクトース、スクロースの濃度の測定方法、乾燥細胞重量の測定方法、は、実験２と同じであるため説明を省略する。

【0045】

図３は、各培養液を用いて培養したときの乾燥細胞重量（g/L）、グルコース、フルクトース、スクロースの濃度（w/v％）の時間的変化を示すグラフである。いずれの試験区も、培養開始時は培養液中に単糖（グルコース、フルクトース）が含まれておらず（濃度が0w/v％）、また、培養開始からしばらくの間はスクロースの加水分解により生成される単糖の量が十分ではないことから、ユーグレナはほとんど増殖していないが、培養開始から16.5時間を経過した頃から、徐々にユーグレナの増殖が観察された。また、培養開始時におけるスクロース濃度が4 w/v％、6 w/v％、8 w/v％の試験区（w15, w16, w17）では、培養開始から45時間を経過した以降、乾燥細胞重量が大きく増加した。本実験では、94時間で培養を終了したが、培養終了時においても試験区w15, w16, w17の培養液中にスクロースが残存していたことから、94時間以上、培養を継続しても乾燥細胞重量の増加が見込まれた。一方、スクロース濃度が1 w/v％、2 w/v％試験区（w13, w14）では、培養開始から45時間が経過した以降も乾燥細胞重量が大きく増加することはなかった。

【0046】

培養液中のスクロース濃度が低い試験区w13, w14では、培養開始から徐々にpHが上昇したのに対して、培養液中のスクロース濃度が高い試験区w16, w17では、培養開始から徐々にpHが低下した。このことから、培養液に含まれる単糖の量が少なく増殖が阻害されると、ユーグレナは培養液のpHを上昇させる成分を放出する、又は培地中の硫酸などの酸性成分の吸収が促進されると推測され、その結果、スクロースの加水分解があまり進まず、試験区w13, w14において乾燥細胞重量が伸び悩んだものと思われる。一方、培養液に含まれる単糖の量が多くなると増殖が促進され、ユーグレナは培養液のpHを低下させる成分を放出する、又は培地中のアンモニアなどの塩基性成分の吸収が促進されることが推測された。このことから、培養開始時に培養液に単糖が含まれていなくても、培養液中のスクロース濃度及びpHを適切な値に調整することで、ユーグレナを培養することが可能であり、また、培養途中で培養液に酸を添加してpHを低下させなくても、ユーグレナの培養を長期間継続することが可能である。

【0047】

［実験４］
ユーグレナを増殖させる際の培養条件をさらに検討するため、実験２の試験区w5, w9, w11と同じ培養液を用い、6N（規定度）の塩酸を添加するタイミングを培養開始から65時間経過した時点に変更して、実験２と同じように、ユーグレナの培養を行った。実験４の試験区をそれぞれRE_w5, RE_w9, RE_w11と呼ぶ。なお、前記ユーグレナとしては、国立環境研究所から入手したユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis Z株 NIES48）を使用した。6N（規定度）の塩酸を添加するタイミング以外の培養条件は実験２と同じであるため、説明を省略する。

【0048】

図４は各試験区RE_w5, RE_w9, RE_w11の乾燥細胞重量（g/L）、グルコース、フルクトース、スクロースの濃度（w/v％）の時間的変化を示すグラフである。また、図５は各試験区RE_w5, RE_w9, RE_w11の各測定時における濁度（OD₆₆₀）、乾燥細胞重量（g/L）、pH、糖（グルコース、フルクトース及びスクロース）の濃度（w/v％）を示す表である。グルコースのみを添加し、スクロースを添加しなかった培養液を用いて培養した試験区（RE_w5）のグラフにはグルコースの濃度のみが示され、スクロースを添加した培養液を用いた試験区（RE_w9, RE_w11）のグラフにはスクロースとグルコース及びフルクトースの濃度が示されている。

【0049】

図４から分かるように、グルコースとスクロースの両方を含む培養液を用いた試験区（RE_w9, RE_w11）では、培養開始から44時間経過した時点における乾燥細胞重量が多く、また、合計糖濃度が同じ試験区（RE_w5, RE_w11）を比較すると、グルコースとスクロースの両方を含む培養液を用いた試験区RE_w11の方が、増殖速度が高くなる時期が早く、また増殖速度が高い状態を維持していた。これは、培養初期におけるグルコース濃度が高すぎずユーグレナの増殖阻害が起きにくかったこと、培養中期以降、スクロースの加水分解による徐放的な単糖供給の効果がみられたことに起因すると推測された。

【0050】

［実験５］
ユーグレナを増殖させる際の培養条件をさらに検討するため、培養液中のスクロース、グルコース、及び／又はフルクトースの濃度をそれぞれ異ならせた複数種類の培養液を用いて、ユーグレナの培養を行った。前記ユーグレナとしては、自然界から採取したユーグレナを使用した。

【0051】

培養液としては、上述した実験１で用いた培養液と同じ組成の培養液に、2N（規定度）の塩酸を添加することによってpHを4.5に調整し、その後、適宜の量のスクロース、グルコース、及び／又はフルクトースを添加することにより、それぞれの濃度を表５に示す値に調整した12種類の培養液x1～x12を用意した。

【0052】

【表5】

【0053】

また、培養開始から65時間が経過したときに、培養液x1～x12を用いた試験区に6N（規定度）の塩酸を、培養液1mL当たり約4.3μLずつ添加して、pHを低下させた。
続いて、100mL容量のバッフル付きフラスコを複数個用意し、上記のx1～x12の培養液をそれぞれ異なるフラスコに20mLずつ入れ、滅菌した後、上記ユーグレナを植藻（植藻）した後、実験２と同じ条件でユーグレナを培養した。その結果を図５Ａ、５Ｂに示す。

【0054】

図５Ａ、５Ｂは各培養液を用いて培養したときの乾燥細胞重量（g/L）、グルコース、フルクトース、スクロースの濃度（w/v％）の時間的変化を示すグラフである。グルコース又はフルクトースのみを添加し、スクロースを添加しなかった培養液を用いて培養した試験区（x3-x8）のグラフにはグルコース又はフルクトースの濃度のみが示され、スクロースを添加した培養液を用いた試験区（x1-x2, x9-x12）のグラフにはスクロースとグルコース及びフルクトースの濃度が示されている。

【0055】

図６Ａ、６Ｂから分かるように、糖濃度の合計値が10％の試験区（x5, x8, x11, x12）では、ユーグレナはほとんど増殖しなかった。また、糖の合計濃度が6％の試験区x4と試験区x9の乾燥重量の時間推移を比較すると、実験２と同様、スクロースを含有する培養液を用いた試験区x9の方が、増殖率が大きかった。

【0056】

［実験６］
ユーグレナを増殖させる際の培養条件をさらに検討するため、実験２の試験区w11と同じ培養液1.2Lを用い、培養開始から69.01時間経過した以降、硫酸とアンモニアを培養液に添加してpHがおよそ2.0～1.5の範囲に収まるように調整しつつ、培養開始から94.03時間経過した時点で濃度2.5w/v％分のスクロースを追加する流加培養を実施した。この試験区を2L_w11_流加培養、と呼ぶ。

【0057】

なお、試験区2L_w11_流加培養において、硫酸とアンモニアを培養液に添加した具体的な時間は以下の通りである。
69.01時間後：1N（規定度）の硫酸25mL
85.01時間後：2M（モル）のアンモニア12mL
94.01時間後：2M（モル）のアンモニア10mL
94.02時間後：1N（規定度）の硫酸10mL
112.01時間後：2M（モル）のアンモニア12mL
135.01時間後：2M（モル）のアンモニア16mL
165.01時間後：2M（モル）のアンモニア15mL

【0058】

また、この実験では、pH4.5においてスクロースが分解されないことを示すため、実験２の試験区w11と同じ培養液を、pH4.5に維持したまま培養した。この試験区を2L_w11_con.、と呼ぶ。

【0059】

2つの試験区のいずれにおいても、前記ユーグレナとしては、国立環境研究所から入手したユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis Z株 NIES48）を使用した。

【0060】

図６は、2つの試験区の糖濃度及び乾燥細胞重量の時間的変化を示すグラフである。この図から分かるように、試験区2L_w11_con.では培養液中のスクロースの加水分解が起きず、培養途中でユーグレナが利用可能な単糖が枯渇することが確認された。一方、試験区2L_w11_流加培養においては、培養開始から69.01時間経過した時点で硫酸を添加して以降、pHが2.0～1.5の範囲に維持された結果、スクロースの加水分解によりユーグレナの利用可能な単糖が継続的に生成され、さらに、途中で追加されたスクロースによって単糖が枯渇することなく、187時間、継続してユーグレナが増殖することが観察された。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】