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特開2024-147596レプチン受容体および／またはＧＰ１３０に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024147596
(43)【公開日】2024-10-16
(54)【発明の名称】レプチン受容体および／またはＧＰ１３０に結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20241008BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241008BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241008BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241008BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241008BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241008BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241008BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241008BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241008BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241008BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/397 20060101ALI20241008BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/155 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20241008BHJP
C07H 9/04 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/135 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/485 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/423 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20241008BHJP
A61K 31/536 20060101ALI20241008BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20241008BHJP
C07D 205/08 20060101ALN20241008BHJP
C07D 305/12 20060101ALN20241008BHJP
C07D 489/08 20060101ALN20241008BHJP
C07D 261/20 20060101ALN20241008BHJP
C07D 223/16 20060101ALN20241008BHJP
C07D 265/26 20060101ALN20241008BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61P3/04
A61P3/00
A61P15/00
A61P3/10
A61P25/28
A61P43/00 121
A61K9/08
A61K31/397
A61K38/28
A61K31/155
A61K31/137
A61K31/337
A61K31/7048
C07H9/04
A61K31/135
A61K31/485
A61K31/423
A61K31/55
A61K31/536
C07K16/18
C07K16/46
C07D205/08 101
C07D305/12
C07D489/08
C07D261/20
C07D223/16 B
C07D265/26
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024106551
(22)【出願日】2024-07-02
(62)【分割の表示】P 2020552684の分割
【原出願日】2018-12-17
(31)【優先権主張番号】62/607,137
(32)【優先日】2017-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/635,406
(32)【優先日】2018-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】グロマダ ジェスパー
(72)【発明者】
【氏名】ステヴィス パナヨティス
(72)【発明者】
【氏名】アルタレホス ジュディス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒトＧＰ１３０および／またはヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する二重特異性抗原結合分子を含む抗原結合分子、ならびにレプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連する状態および障害の治療のためのかかる抗原結合分子の使用を提供する。
【解決手段】本発明の二重特異性抗原結合分子は、ヒトＧＰ１３０に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインと、ヒトＬＥＰＲに特異的に結合する第二の抗原結合ドメインとを含む、例えば、二重特異性抗体でありうる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、誘発されたレプチンおよび／またはＬＥＰＲ介在性シグナル伝達が有益である治療用途において、例えば、肥満、リポジストロフィー、ならびにレプチン欠損症もしくはレプチン抵抗性に関連するかまたはそれらが原因となる他の疾患および障害の治療において、有用である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の二重特異性抗原結合分子は、ヒトＧＰ１３０に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインと、ヒトＬＥＰＲに特異的に結合する第二の抗原結合ドメインとを含む、例えば、二重特異性抗体でありうる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、誘発されたレプチンおよび／またはＬＥＰＲ介在性シグナル伝達が有益である治療用途において、例えば、肥満、リポジストロフィー、ならびにレプチン欠損症もしくはレプチン抵抗性に関連するかまたはそれらが原因となる他の疾患および障害の治療において、有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ヒトＧＰ１３０に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項2】
Ｄ１および／またはＤ２がイムノグロブリン可変ドメインを含む、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項3】
Ｄ１および／またはＤ２がイムノグロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）およびイムノグロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項4】
Ｄ１をＤ２と接続する多量体形成成分をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項5】
前記多量体形成成分が、イムノグロブリンのＦｃ部分を含む、請求項４に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項6】
Ｄ１が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約５０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴法によって決定されるとおり、サルＧＰ１３０に結合するがラットまたはマウスのＧＰ１３０には実質的に結合しない、
（ｉｉｉ）細胞ベースのＧＰ１３０シグナル伝達アッセイにおいてＧＰ１３０リガンド介在性シグナル伝達を阻害しない、および
（ｉｖ）ＧＰ１３０リガンドの非存在下においてＧＰ１３０シグナル伝達を活性化しない
を示す抗ＧＰ１３０抗体由来である、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約５０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴法によって決定されるとおり、サルＧＰ１３０に結合するがラットまたはマウスのＧＰ１３０には実質的に結合しない、
（ｉｉｉ）細胞ベースのＧＰ１３０シグナル伝達アッセイにおいてＧＰ１３０リガンド介在性シグナル伝達を阻害しない、および
（ｉｖ）ＧＰ１３０リガンドの非存在下においてＧＰ１３０シグナル伝達を活性化しない
を示す抗ＧＰ１３０抗体由来である、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項7】
Ｄ２が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、および
（ｉｉ）インビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する
を示す抗ＬＥＰＲ抗体由来である、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、および
（ｉｉ）インビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する
を示す抗ＬＥＰＲ抗体由来である、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項8】
以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約３分より大きいｔ１／２で、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１５０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｉｖ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約２．５分より大きいｔ１／２で、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｖ）サルＬＥＰＲに結合する、
（ｖｉ）サルＧＰ１３０に結合する、
（ｖｉｉ）ＦＡＣＳによって測定されるとおり、レプチンの存在下または非存在下でヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合する、
（ｖｉｉｉ）同じまたは類似の実験的アッセイ条件下でヒトオンコスタチンＭによって媒介される活性化より少なくとも２０％以上の効力で、細胞ベースのアッセイにおいてＧＰ１３０を活性化する、および
（ｉｘ）動物に治療有効用量で投与された場合に体重減少を生じさせる
を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
（ｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約３分より大きいｔ１／２で、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉｉ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約１５０ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｉｖ）２５℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約２．５分より大きいｔ１／２で、単量体ヒトＧＰ１３０に結合する、
（ｖ）サルＬＥＰＲに結合する、
（ｖｉ）サルＧＰ１３０に結合する、
（ｖｉｉ）ＦＡＣＳによって測定されるとおり、レプチンの存在下または非存在下でヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合する、
（ｖｉｉｉ）同じまたは類似の実験的アッセイ条件下でヒトオンコスタチンＭによって媒介される活性化より少なくとも２０％以上の効力で、細胞ベースのアッセイにおいてＧＰ１３０を活性化する、および
（ｉｘ）動物に治療有効用量で投与された場合に体重減少を生じさせる
を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項9】
Ｄ１が、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ１－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ１－ＨＣＤＲ１、Ｄ１－ＨＣＤＲ２、およびＤ１－ＨＣＤＲ３）と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ１－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ１－ＬＣＤＲ１、Ｄ１－ＬＣＤＲ２、およびＤ１－ＬＣＤＲ３）とを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項10】
Ｄ１－ＨＣＤＲ１が配列番号１５６のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＨＣＤＲ２が配列番号１５８のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＨＣＤＲ３が配列番号１６０のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＬＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＬＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項11】
Ｄ１－ＨＣＶＲが配列番号１５４のアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＬＣＶＲが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項12】
Ｄ２が、配列番号２、１６２、１７０、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ２－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、およびＤ２－ＨＣＤＲ３）と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ２－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ２－ＬＣＤＲ１、Ｄ２－ＬＣＤＲ２、およびＤ２－ＬＣＤＲ３）とを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項13】
Ｄ２－ＨＣＶＲが、
それぞれ配列番号４、６、８；それぞれ配列番号１６４、１６６、１６８；それぞれ配列番号１７２、１７４、１７６；および、それぞれ配列番号１８０、１８２、１８４
からなる群から選択されるＤ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、Ｄ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み；
Ｄ２－ＬＣＶＲが、それぞれ配列番号１２、１４、１６であるＤ２－ＬＣＤＲ１、Ｄ２－ＬＣＤＲ２、Ｄ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
それぞれ配列番号４、６、８；それぞれ配列番号１６４、１６６、１６８；それぞれ配列番号１７２、１７４、１７６；および、それぞれ配列番号１８０、１８２、１８４
からなる群から選択されるＤ２－ＨＣＤＲ１、Ｄ２－ＨＣＤＲ２、Ｄ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み；
Ｄ２－ＬＣＶＲが、それぞれ配列番号１２、１４、１６であるＤ２－ＬＣＤＲ１、Ｄ２－ＬＣＤＲ２、Ｄ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項14】
Ｄ２－ＨＣＶＲが、配列番号２、１６２、１７０、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１－ＬＣＶＲが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項15】
Ｄ２が、ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項16】
Ｄ２が、ＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を活性化しない抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項17】
ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したシグナル伝達を活性化し、かつＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したレプチン介在性シグナル伝達を実質的に活性化しない、請求項１に記載の単離二重特異性抗原結合分子。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を含む、容器または注射装置。
【請求項20】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子のイムノグロブリン鎖をコードする、単離核酸。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸を含む、単離ベクター。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、核酸、またはベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項23】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項24】
対象における、レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項25】
レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる前記疾患または状態が、リポジストロフィー、肥満、代謝症候群、食餌誘発性食物渇望、機能性視床下部性無月経、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン受容体の突然変異による重度のインスリン抵抗性、アルツハイマー病、レプチン欠損症、レプチン抵抗性、レプレコーニズム／ドナヒュー症候群、およびラブソン・メンデンホール症候群からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
対象におけるリポジストロフィー状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１８に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、前記リポジストロフィー状態が、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、後天性部分型リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、リポアトロフィアアニュラリス（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、局所性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーからなる群から選択される、前記方法。
【請求項27】
第二の治療薬剤を前記対象に投与する工程をさらに含み、前記第二の治療薬剤が、組み換えヒトレプチン、ＰＣＳＫ９阻害剤、スタチン、エゼチミブ、インスリン、インスリンバリアント、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、ＧＬＰ－１アゴニスト／類似体、グルカゴン（ＧＣＧ）阻害剤、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）阻害剤、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）阻害剤、フェンテルミン、オリスタット、トピラマート、ブプロピオン、トピラマート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレピン（Ｍｅｔｒｅｌｅｐｉｎ）、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、およびベルネペリトからなる群から選択される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
以下の工程を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子またはそのイムノグロブリン鎖を作製するための方法：
（ａ）前記抗原結合タンパク質のイムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で前記宿主細胞を培養する工程、ならびに
（ｃ）任意で、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞を成育させた培地から前記抗原結合タンパク質またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。
（ａ）前記抗原結合タンパク質のイムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で前記宿主細胞を培養する工程、ならびに
（ｃ）任意で、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞を成育させた培地から前記抗原結合タンパク質またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。
【請求項29】
請求項２８に記載の方法の産物である、二重特異性抗原結合分子またはイムノグロブリン鎖。
【請求項30】
請求項１～１７、１８、または２９のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を対象に投与するための方法であって、前記分子または組成物を前記対象の体内に注射する工程を含む、前記方法。
【請求項31】
前記分子または組成物が、静脈内、筋肉内、または皮下注射される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、ヒトＧＰ１３０および／またはヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む抗原結合分子、およびレプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連する状態および障害の治療のためのかかる抗原結合分子の使用に関する。
本発明は、ヒトＧＰ１３０および／またはヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む抗原結合分子、およびレプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連する状態および障害の治療のためのかかる抗原結合分子の使用に関する。
【0002】
配列表
配列表の公的な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出された。当該写しのファイル名は「１０３９７ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１８年１２月１７日が作成日であり、サイズはおよそ１５１ＫＢである。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の公的な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出された。当該写しのファイル名は「１０３９７ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１８年１２月１７日が作成日であり、サイズはおよそ１５１ＫＢである。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
背景
糖タンパク質１３０（ＧＰ１３０）は、ＣＮＴＲＦ－αおよびＬＩＦＲ－βも含む受容体複合体の成分である。この受容体複合体を通したシグナル伝達は、特定の生物学的状況において、食欲の減少、食物摂取の減少、および重量損失を生じさせるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する。
糖タンパク質１３０（ＧＰ１３０）は、ＣＮＴＲＦ－αおよびＬＩＦＲ－βも含む受容体複合体の成分である。この受容体複合体を通したシグナル伝達は、特定の生物学的状況において、食欲の減少、食物摂取の減少、および重量損失を生じさせるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する。
【0004】
レプチンは、主に脂肪組織によって発現され、代謝、エネルギーバランス、食物摂取の調節に関与するポリペプチドホルモンである。レプチン活性は、レプチン受容体との相互作用およびシグナル伝達によって媒介される。レプチン受容体（また、「ＬＥＰＲ」、「ＷＳＸ」、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ－Ｒ」、及び「ＣＤ２９５」としても知られる）は、大きな（８１８アミノ酸）細胞外ドメインを有するクラスＩサイトカイン受容体ファミリーの単回膜貫通受容体である。レプチン欠損症、レプチン抵抗性、および特定のＬＥＰＲシグナル伝達欠損症／シグナル伝達障害性突然変異は、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、リポジストロフィー、脂肪肝、非アルコール性、およびアルコール性脂肪性肝疾患、重度のインスリン抵抗性、レプレコーニズム／ドナヒュー症候群、ラブソン・メンデンホール症候群、および関連合併症と関連する。レプチン抵抗性、レプチン欠損症、および低レプチン血症（例えば、リポジストロフィー）に対処する治療アプローチは、影響を受ける個人への補足的なレプチンまたはレプチン類似体の送達に主に焦点を合わせてきた。しかしながら、このようなアプローチは、一般的に限定的な有効性、特にレプチン抵抗性の個体において示されており、有害な副作用に頻繁に関連している。したがって、レプチン抵抗性、およびレプチン欠損症または低レプチン血症に関連するその他の状態を治療するための代替的アプローチのための当技術分野における必要性が存在する。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、部分的に、ＬＥＰＲおよびＧＰ１３０の抗体媒介性ヘテロ二量体化の概念に関し、両方の受容体を活性化し、それによってこれらの受容体を通るシグナル伝達に関連する食欲不振誘発効果を刺激する。したがって、本発明は、ヒトＧＰ１３０および／またはヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗原結合分子（抗体および抗体の抗原結合断片）を提供する。特定の実施形態によると、本発明は、ヒトＧＰ１３０に特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。本発明は、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明の特定の例示的な実施形態では、抗ＧＰ１３０抗原結合ドメイン（Ｄ１）および抗ＬＥＰＲ（Ｄ２）抗原結合ドメインはそれぞれ、同一または異なる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とペアリングされた、異なる個別の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
【0006】
本発明の抗原結合分子（例えば、二重特異性抗原結合分子）は、とくに、ＬＥＰＲを発現する細胞、および／またはＧＰ１３０を発現する細胞、あるいはその両方を標的化するために有用である。特定の実施形態によると、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＬＥＰＲシグナル伝達を刺激するために、細胞表面上のＬＥＰＲ及びＧＰ１３０を互いに物理的に連結するために有用である。このように、本発明の二重特異性抗原結合分子は、レプチン及び／またはＬＥＰＲ介在性シグナル伝達が有益である様々な治療用途において（例えば、肥満、リポジストロフィー、ならびにレプチン欠損症もしくはレプチン抵抗性に関連した、またはそれらが原因となる他の疾患および障害において）ＬＥＰＲアゴニストとして機能しうる。
【0007】
[本発明1001]
（ａ）ヒトＧＰ130に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ1）と
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ2）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1002]
Ｄ1および／またはＤ2がイムノグロブリン可変ドメインを含む、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1003]
Ｄ1および／またはＤ2がイムノグロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）およびイムノグロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1004]
Ｄ1をＤ2と接続する多量体形成成分をさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1005]
前記多量体形成成分が、イムノグロブリンのＦｃ部分を含む、本発明1004の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1006]
Ｄ1が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約50ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴法によって決定されるとおり、サルＧＰ130に結合するがラットまたはマウスのＧＰ130には実質的に結合しない、
（ｉｉｉ）細胞ベースのＧＰ130シグナル伝達アッセイにおいてＧＰ130リガンド介在性シグナル伝達を阻害しない、および
（ｉｖ）ＧＰ130リガンドの非存在下においてＧＰ130シグナル伝達を活性化しない
を示す抗ＧＰ130抗体由来である、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1007]
Ｄ2が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約110ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、および
（ｉｉ）インビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する
を示す抗ＬＥＰＲ抗体由来である、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1008]
以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約110ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約3分より大きいｔ1／2で、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約150ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｉｖ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約2．5分より大きいｔ1／2で、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｖ）サルＬＥＰＲに結合する、
（ｖｉ）サルＧＰ130に結合する、
（ｖｉｉ）ＦＡＣＳによって測定されるとおり、レプチンの存在下または非存在下でヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合する、
（ｖｉｉｉ）同じまたは類似の実験的アッセイ条件下でヒトオンコスタチンＭによって媒介される活性化より少なくとも20％以上の効力で、細胞ベースのアッセイにおいてＧＰ130を活性化する、および
（ｉｘ）動物に治療有効用量で投与された場合に体重減少を生じさせる
を示す、本発明1001～1007のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1009]
Ｄ1が、配列番号154のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ1－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ1－ＨＣＤＲ1、Ｄ1－ＨＣＤＲ2、およびＤ1－ＨＣＤＲ3）と、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ1－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ1－ＬＣＤＲ1、Ｄ1－ＬＣＤＲ2、およびＤ1－ＬＣＤＲ3）とを含む、本発明1001～1008のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1010]
Ｄ1－ＨＣＤＲ1が配列番号156のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＨＣＤＲ2が配列番号158のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＨＣＤＲ3が配列番号160のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ1が配列番号12のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ2が配列番号14のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ3が配列番号16のアミノ酸配列を含む、本発明1009の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1011]
Ｄ1－ＨＣＶＲが配列番号154のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＶＲが配列番号10のアミノ酸配列を含む、本発明1010の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1012]
Ｄ2が、配列番号2、162、170、および178からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ2－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ2－ＨＣＤＲ1、Ｄ2－ＨＣＤＲ2、およびＤ2－ＨＣＤＲ3）と、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ2－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ2－ＬＣＤＲ1、Ｄ2－ＬＣＤＲ2、およびＤ2－ＬＣＤＲ3）とを含む、本発明1001～1011のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1013]
Ｄ2－ＨＣＶＲが、
それぞれ配列番号4、6、8；それぞれ配列番号164、166、168；それぞれ配列番号172、174、176；および、それぞれ配列番号180、182、184
からなる群から選択されるＤ2－ＨＣＤＲ1、Ｄ2－ＨＣＤＲ2、Ｄ2－ＨＣＤＲ3アミノ酸配列を含み；
Ｄ2－ＬＣＶＲが、それぞれ配列番号12、14、16であるＤ2－ＬＣＤＲ1、Ｄ2－ＬＣＤＲ2、Ｄ2－ＬＣＤＲ3アミノ酸配列を含む、
本発明1012の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1014]
Ｄ2－ＨＣＶＲが、配列番号2、162、170、および178からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＶＲが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、本発明1013の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1015]
Ｄ2が、ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1016]
Ｄ2が、ＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を活性化しない抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1017]
ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したシグナル伝達を活性化し、かつＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したレプチン介在性シグナル伝達を実質的に活性化しない、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1018]
本発明1001～1017のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1019]
本発明1001～1018のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を含む、容器または注射装置。
[本発明1020]
本発明1001～1017のいずれかの二重特異性抗原結合分子のイムノグロブリン鎖をコードする、単離核酸。
[本発明1021]
本発明1020の核酸を含む、単離ベクター。
[本発明1022]
本発明1001～1021のいずれかの二重特異性抗原結合分子、核酸、またはベクターを含む、単離宿主細胞。
[本発明1023]
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、本発明1022の宿主細胞。
[本発明1024]
対象における、レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1018の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1025]
レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる前記疾患または状態が、リポジストロフィー、肥満、代謝症候群、食餌誘発性食物渇望、機能性視床下部性無月経、1型糖尿病、2型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン受容体の突然変異による重度のインスリン抵抗性、アルツハイマー病、レプチン欠損症、レプチン抵抗性、レプレコーニズム／ドナヒュー症候群、およびラブソン・メンデンホール症候群からなる群から選択される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
対象におけるリポジストロフィー状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明1018の医薬組成物を投与する工程を含み、前記リポジストロフィー状態が、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、後天性部分型リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、リポアトロフィアアニュラリス（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、局所性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーからなる群から選択される、前記方法。
[本発明1027]
第二の治療薬剤を前記対象に投与する工程をさらに含み、前記第二の治療薬剤が、組み換えヒトレプチン、ＰＣＳＫ9阻害剤、スタチン、エゼチミブ、インスリン、インスリンバリアント、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体2（ＳＧＬＴ2）阻害剤、ＧＬＰ－1アゴニスト／類似体、グルカゴン（ＧＣＧ）阻害剤、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）阻害剤、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）阻害剤、フェンテルミン、オリスタット、トピラマート、ブプロピオン、トピラマート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレピン（Ｍｅｔｒｅｌｅｐｉｎ）、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、およびベルネペリトからなる群から選択される、本発明1024～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
以下の工程を含む、本発明1001～1017のいずれかの二重特異性抗原結合分子またはそのイムノグロブリン鎖を作製するための方法：
（ａ）前記抗原結合タンパク質のイムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で前記宿主細胞を培養する工程、ならびに
（ｃ）任意で、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞を成育させた培地から前記抗原結合タンパク質またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。
[本発明1029]
本発明1028の方法の産物である、二重特異性抗原結合分子またはイムノグロブリン鎖。
[本発明1030]
本発明1001～1017、1018、または1029のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を対象に投与するための方法であって、前記分子または組成物を前記対象の体内に注射する工程を含む、前記方法。
[本発明1031]
前記分子または組成物が、静脈内、筋肉内、または皮下注射される、本発明1030の方法。
他の実施形態は、次の発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。
（ａ）ヒトＧＰ130に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ1）と
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ2）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1002]
Ｄ1および／またはＤ2がイムノグロブリン可変ドメインを含む、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1003]
Ｄ1および／またはＤ2がイムノグロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）およびイムノグロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1004]
Ｄ1をＤ2と接続する多量体形成成分をさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1005]
前記多量体形成成分が、イムノグロブリンのＦｃ部分を含む、本発明1004の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1006]
Ｄ1が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約50ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴法によって決定されるとおり、サルＧＰ130に結合するがラットまたはマウスのＧＰ130には実質的に結合しない、
（ｉｉｉ）細胞ベースのＧＰ130シグナル伝達アッセイにおいてＧＰ130リガンド介在性シグナル伝達を阻害しない、および
（ｉｖ）ＧＰ130リガンドの非存在下においてＧＰ130シグナル伝達を活性化しない
を示す抗ＧＰ130抗体由来である、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1007]
Ｄ2が、以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約110ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、および
（ｉｉ）インビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する
を示す抗ＬＥＰＲ抗体由来である、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1008]
以下からなる群から選択される一つ以上の特性：
（ｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約110ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約3分より大きいｔ1／2で、単量体ヒトＬＥＰＲに結合する、
（ｉｉｉ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約150ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｉｖ）25℃で、表面プラズモン共鳴法によって測定される約2．5分より大きいｔ1／2で、単量体ヒトＧＰ130に結合する、
（ｖ）サルＬＥＰＲに結合する、
（ｖｉ）サルＧＰ130に結合する、
（ｖｉｉ）ＦＡＣＳによって測定されるとおり、レプチンの存在下または非存在下でヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合する、
（ｖｉｉｉ）同じまたは類似の実験的アッセイ条件下でヒトオンコスタチンＭによって媒介される活性化より少なくとも20％以上の効力で、細胞ベースのアッセイにおいてＧＰ130を活性化する、および
（ｉｘ）動物に治療有効用量で投与された場合に体重減少を生じさせる
を示す、本発明1001～1007のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1009]
Ｄ1が、配列番号154のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ1－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ1－ＨＣＤＲ1、Ｄ1－ＨＣＤＲ2、およびＤ1－ＨＣＤＲ3）と、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ1－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ1－ＬＣＤＲ1、Ｄ1－ＬＣＤＲ2、およびＤ1－ＬＣＤＲ3）とを含む、本発明1001～1008のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1010]
Ｄ1－ＨＣＤＲ1が配列番号156のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＨＣＤＲ2が配列番号158のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＨＣＤＲ3が配列番号160のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ1が配列番号12のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ2が配列番号14のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＤＲ3が配列番号16のアミノ酸配列を含む、本発明1009の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1011]
Ｄ1－ＨＣＶＲが配列番号154のアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＶＲが配列番号10のアミノ酸配列を含む、本発明1010の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1012]
Ｄ2が、配列番号2、162、170、および178からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｄ2－ＨＣＶＲ）からの三つの重鎖相補性決定領域（Ｄ2－ＨＣＤＲ1、Ｄ2－ＨＣＤＲ2、およびＤ2－ＨＣＤＲ3）と、配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｄ2－ＬＣＶＲ）からの三つの軽鎖相補性決定領域（Ｄ2－ＬＣＤＲ1、Ｄ2－ＬＣＤＲ2、およびＤ2－ＬＣＤＲ3）とを含む、本発明1001～1011のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1013]
Ｄ2－ＨＣＶＲが、
それぞれ配列番号4、6、8；それぞれ配列番号164、166、168；それぞれ配列番号172、174、176；および、それぞれ配列番号180、182、184
からなる群から選択されるＤ2－ＨＣＤＲ1、Ｄ2－ＨＣＤＲ2、Ｄ2－ＨＣＤＲ3アミノ酸配列を含み；
Ｄ2－ＬＣＶＲが、それぞれ配列番号12、14、16であるＤ2－ＬＣＤＲ1、Ｄ2－ＬＣＤＲ2、Ｄ2－ＬＣＤＲ3アミノ酸配列を含む、
本発明1012の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1014]
Ｄ2－ＨＣＶＲが、配列番号2、162、170、および178からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｄ1－ＬＣＶＲが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、本発明1013の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1015]
Ｄ2が、ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1016]
Ｄ2が、ＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を活性化しない抗ＬＥＰＲ抗体に由来する、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1017]
ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したシグナル伝達を活性化し、かつＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したレプチン介在性シグナル伝達を実質的に活性化しない、本発明1001の単離二重特異性抗原結合分子。
[本発明1018]
本発明1001～1017のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1019]
本発明1001～1018のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を含む、容器または注射装置。
[本発明1020]
本発明1001～1017のいずれかの二重特異性抗原結合分子のイムノグロブリン鎖をコードする、単離核酸。
[本発明1021]
本発明1020の核酸を含む、単離ベクター。
[本発明1022]
本発明1001～1021のいずれかの二重特異性抗原結合分子、核酸、またはベクターを含む、単離宿主細胞。
[本発明1023]
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、本発明1022の宿主細胞。
[本発明1024]
対象における、レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1018の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1025]
レプチン欠損症またはレプチン抵抗性に関連するかあるいはレプチン欠損症またはレプチン抵抗性によって引き起こされる前記疾患または状態が、リポジストロフィー、肥満、代謝症候群、食餌誘発性食物渇望、機能性視床下部性無月経、1型糖尿病、2型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン受容体の突然変異による重度のインスリン抵抗性、アルツハイマー病、レプチン欠損症、レプチン抵抗性、レプレコーニズム／ドナヒュー症候群、およびラブソン・メンデンホール症候群からなる群から選択される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
対象におけるリポジストロフィー状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明1018の医薬組成物を投与する工程を含み、前記リポジストロフィー状態が、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、後天性部分型リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、リポアトロフィアアニュラリス（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、局所性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーからなる群から選択される、前記方法。
[本発明1027]
第二の治療薬剤を前記対象に投与する工程をさらに含み、前記第二の治療薬剤が、組み換えヒトレプチン、ＰＣＳＫ9阻害剤、スタチン、エゼチミブ、インスリン、インスリンバリアント、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体2（ＳＧＬＴ2）阻害剤、ＧＬＰ－1アゴニスト／類似体、グルカゴン（ＧＣＧ）阻害剤、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）阻害剤、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）阻害剤、フェンテルミン、オリスタット、トピラマート、ブプロピオン、トピラマート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレピン（Ｍｅｔｒｅｌｅｐｉｎ）、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、およびベルネペリトからなる群から選択される、本発明1024～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
以下の工程を含む、本発明1001～1017のいずれかの二重特異性抗原結合分子またはそのイムノグロブリン鎖を作製するための方法：
（ａ）前記抗原結合タンパク質のイムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で前記宿主細胞を培養する工程、ならびに
（ｃ）任意で、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞を成育させた培地から前記抗原結合タンパク質またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。
[本発明1029]
本発明1028の方法の産物である、二重特異性抗原結合分子またはイムノグロブリン鎖。
[本発明1030]
本発明1001～1017、1018、または1029のいずれかの単離二重特異性抗原結合分子またはその医薬組成物を対象に投与するための方法であって、前記分子または組成物を前記対象の体内に注射する工程を含む、前記方法。
[本発明1031]
前記分子または組成物が、静脈内、筋肉内、または皮下注射される、本発明1030の方法。
他の実施形態は、次の発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１は、アイソタイプ対照抗体（黒丸）での治療と比較した、ヒトＬＥＰＲおよびヒトＧＰ１３０を発現する、高脂肪食を与えられた肥満マウスにおける、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体治療（白正方形および白斜方形）の効果を示す。抗体を０日目および７日目に３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した（「用量」および上方矢印で示す）、そして体重に対する抗体治療の効果（投与前からの体重の平均パーセント変化に関して表現）を、経時的に各治療群について経時的にプロットする。白正方形は、ｂｓＡｂ２１２３６（代替的に「Ｈ４Ｈ２１２３６Ｄ」と呼称される）で治療されたマウスを表す。白斜方形は、ｂｓＡｂ２１２３７（代替的に「Ｈ４Ｈ２１２３７Ｄ」と呼称される）で治療されたマウスを表す。（＊）は、Ｐ＜０．０５アイソタイプ対照対ｂｓＡｂ２１２３６を示す。（＃）は、Ｐ＜０．０５アイソタイプ対照対ｂｓＡｂ２１２３７を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
詳細な説明
本発明について記述する前に、本発明が本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されず、それはこのような方法および条件が変化する場合があるからであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
本発明について記述する前に、本発明が本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されず、それはこのような方法および条件が変化する場合があるからであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
【0010】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて使用される場合、用語「約」とは、特定の言及される数値に関して使用される場合、値が言及された値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書にて使用される場合、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびに間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、など）が含まれる。
【0011】
本明細書に記述したものと類似または同等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書にて言及される全ての特許、特許出願、および非特許出版物は、参照によりそれらの全体が本発明に組み込まれる。
【0012】
ＧＰ１３０タンパク質
本明細書において使用される場合、「糖タンパク質１３０」、「ＧＰ１３０」、「ｇｐ１３０」およびこれに類する表現は、配列番号１８５に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＧＰ１３０タンパク質を指す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１７ＲＡ０も参照）。「ＧＰ１３０」という表現は、単量体および多量体ＧＰ１３０分子の両方を含む。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＧＰ１３０」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有も、有してもいなく、かつ、別のＧＰ１３０分子への直接的な物理的接続なしに、単一のＧＰ１３０分子として、通常の条件下に存在する、ＧＰ１３０タンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＧＰ１３０分子は、本明細書において、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＧＰ１３０」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＧＰ１３０分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＧＰ１３０分子は、本明細書において、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｈＦｃ」、又は配列番号１９０のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｍＦｃ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。
本明細書において使用される場合、「糖タンパク質１３０」、「ＧＰ１３０」、「ｇｐ１３０」およびこれに類する表現は、配列番号１８５に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＧＰ１３０タンパク質を指す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１７ＲＡ０も参照）。「ＧＰ１３０」という表現は、単量体および多量体ＧＰ１３０分子の両方を含む。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＧＰ１３０」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有も、有してもいなく、かつ、別のＧＰ１３０分子への直接的な物理的接続なしに、単一のＧＰ１３０分子として、通常の条件下に存在する、ＧＰ１３０タンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＧＰ１３０分子は、本明細書において、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＧＰ１３０」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＧＰ１３０分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＧＰ１３０分子は、本明細書において、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｈＦｃ」、又は配列番号１９０のアミノ酸配列を含む「ｈＧＰ１３０．ｍＦｃ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。
【0013】
本明細書における、タンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての参照は、非ヒト種からと明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図されている。したがって、「ＧＰ１３０」という表現は、例えば、「マウスＧＰ１３０」、「サルＧＰ１３０」など、非ヒト種からであると特定されていない限り、ヒトＧＰ１３０を意味する。
【0014】
本明細書において使用される場合、「細胞表面発現ＧＰ１３０」という表現は、ＧＰ１３０タンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に曝露され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボによって細胞の表面上に発現される、一つ以上のＧＰ１３０タンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＧＰ１３０」は、通常ＧＰ１３０タンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＧＰ１３０タンパク質を含むか、またはそれらからなりうる。あるいは、「細胞表面発現ＧＰ１３０」は、通常はその表面上にヒトＧＰ１３０を発現せず、その表面上にＧＰ１３０を発現するように人為的に操作されている、細胞の表面上で発現されるＧＰ１３０タンパク質を含むか、またはそれらからなりうる。
【0015】
抗ＧＰ１３０抗体およびその抗原結合断片
本発明の一態様によれば、抗ＧＰ１３０抗体が提供される（例えば、単一特異性抗ＧＰ１３０抗体）。本発明の本態様による例示的な抗ＧＰ１３０抗体は、本明細書の表１および表２に列挙されている。表１には、本発明の二重特異性抗原結合分子が由来しうる例示的な抗ＣＤ１３０抗体の、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別名が記載されている。表２には、例示的な抗ＧＰ１３０抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別名が記載されている。
本発明の一態様によれば、抗ＧＰ１３０抗体が提供される（例えば、単一特異性抗ＧＰ１３０抗体）。本発明の本態様による例示的な抗ＧＰ１３０抗体は、本明細書の表１および表２に列挙されている。表１には、本発明の二重特異性抗原結合分子が由来しうる例示的な抗ＣＤ１３０抗体の、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別名が記載されている。表２には、例示的な抗ＧＰ１３０抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別名が記載されている。
【0016】
本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0017】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0018】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアリングされた、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号１５４／１０である。
【0019】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0020】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0021】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0022】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0023】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0024】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それの実質的に類似の配列を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【0025】
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペアリングされた表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片も提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、配列番号１６０／１６である。
【0026】
本発明はまた、表１に列挙された例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、配列番号：２０－２２－２４－１２－１４－１６、２８－３０－３２－１２－１４－１６、３６－３８－４０－１２－１４－１６、４４－４６－４８－１２－１４－１６、５２－５４－５６－１２－１４－１６、６０－６２－６４－１２－１４－１６、６８－７０－７２－１２－１４－１６、７６－７８－８０－１２－１４－１６、８４－８６－８８－１２－１４－１６、９２－９４－９６－１２－１４－１６、１００－１０２－１０４－１２－１４－１６、１０８－１１０－１１２－１２－１４－１６、１１６－１１８－１２０－１２－１４－１６、１２４－１２６－１２８－１２－１４－１６、１３２－１３４－１３６－１２－１４－１６、１４０－１４２－１４４－１２－１４－１６、１４８－１５０－１５２－１２－１４－１６、および１５６－１５８－１６０－１２－１４－１６からなる群から選択される。
【0027】
関連の実施形態では、本発明は、表１に列挙される例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号１５４／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、ＧＰ１３０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0028】
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は当該技術分野で周知であり、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【0029】
本発明は、抗ＧＰ１３０抗体またはその一部をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0030】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0031】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0032】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0033】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0034】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0035】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0036】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【0037】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここにおいて、ＨＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）のセットを含み、ここにおいて、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表１に列挙された例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかによって定義される。
【0038】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここにおいて、ＬＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含み、ここにおいて、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表１に列挙された例示的な抗ＧＰ１３０抗体のいずれかによって定義される。
【0039】
本発明はまた、ＨＣＶＲとＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供し、ここにおいて、ＨＣＶＲは、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつここにおいて、ＬＣＶＲは、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列と、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列とを含む。本発明のこの態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両方とも、表１に列挙された同じ抗ＧＰ１３０抗体から誘導される。
【0040】
本発明はまた、抗ＧＰ１３０抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え型発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載されるようなＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む、組み換え型発現ベクターを含む。また、本発明の範囲内に含まれるのは、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその一部分を生産する方法ならびにそうして生産された抗体および抗体断片を回収する方法である。
【0041】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＧＰ１３０抗体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損していることが有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害 （ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【0042】
ＬＥＰＲタンパク質
本明細書で使用される場合、「レプチン受容体」、「ＬＥＰＲ」、およびこれに類する表現は、配列番号１８６で表されるアミノ酸配列を含むヒトレプチン受容体を意味する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ４８３５７も参照）。科学的文献で使用されるＬＥＰＲの代替名は、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ－Ｒ」、および「ＣＤ２９５」を含む。ＬＥＰＲは、「ＷＳＸ」とも称される（例えば、米国特許第７，５２４，９３７号を参照）。「ＬＥＰＲ」という表現には、単量体及び多量体ＬＥＰＲ分子の両方が含まれる。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有も、有してもいなく、かつ、別のＬＥＰＲ分子への直接的な物理的接続なしに、単一のＬＥＰＲ分子として、通常の条件下に存在する、ＬＥＰＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＬＥＰＲ分子は、本明細書において、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例１０を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＬＥＰＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＬＥＰＲ分子は、本明細書において、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例１０を参照）。
本明細書で使用される場合、「レプチン受容体」、「ＬＥＰＲ」、およびこれに類する表現は、配列番号１８６で表されるアミノ酸配列を含むヒトレプチン受容体を意味する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ４８３５７も参照）。科学的文献で使用されるＬＥＰＲの代替名は、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ－Ｒ」、および「ＣＤ２９５」を含む。ＬＥＰＲは、「ＷＳＸ」とも称される（例えば、米国特許第７，５２４，９３７号を参照）。「ＬＥＰＲ」という表現には、単量体及び多量体ＬＥＰＲ分子の両方が含まれる。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有も、有してもいなく、かつ、別のＬＥＰＲ分子への直接的な物理的接続なしに、単一のＬＥＰＲ分子として、通常の条件下に存在する、ＬＥＰＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＬＥＰＲ分子は、本明細書において、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例１０を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のＬＥＰＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＬＥＰＲ分子は、本明細書において、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む「ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ」と呼称される分子である（例えば、本明細書の実施例１０を参照）。
【0043】
本明細書における、タンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての参照は、非ヒト種からと明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図されている。したがって、「ＬＥＰＲ」という表現は、例えば、「マウスＬＥＰＲ」、「サルＬＥＰＲ」など、非ヒト種からであると特定されていない限り、ヒトＬＥＰＲを意味する。
【0044】
本明細書において使用される場合、「細胞表面発現ＬＥＰＲ」という表現は、ＬＥＰＲタンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に曝露され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボによって細胞の表面上に発現される、一つ以上のＬＥＰＲタンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常ＬＥＰＲタンパク質を発現する細胞の表面上で発現されるＬＥＰＲタンパク質を含むか、またはそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常はその表面上にヒトＬＥＰＲを発現せず、その表面上にＬＥＰＲを発現するように人為的に操作されている、細胞の表面上で発現されるＬＥＰＲタンパク質を含むか、またはそれからなりうる。
【0045】
ＬＥＰＲのいくつかのアイソフォームは、代替的スプライシングを介して生成され、それによって、最も高く最も広範な発現パターンを示すアイソフォームａ（ＬＥＰＲ－ａ）を含む、長いアイソフォームｂ（ＬＥＰＲ－ｂ）といくつかの短い形態とが生じる（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ＬＡ．Ｔｈｅ ｌｅｐｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：６０９３～６０９６）。ＬＥＰＲ－ｂは、脳で発現される優勢なアイソフォームであり、ＬＥＰＲ－ａは肝臓で広く発現される。すべてのアイソフォームは、同じ細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびボックス１領域を含む細胞質ドメインの短い区間を共有し、その後可変領域が続く。長い形態は、レプチンの全シグナル伝達能力を媒介するために必要な細胞内配列モチーフを含み、短い形態はこれらの領域を欠いている。短い形態の細胞外ドメインは、シグナル伝達能力の高い長い形態と同一である。
【0046】
ＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子
本発明は、細胞表面上のＬＥＰＲおよびＧＰ１３０をブリッジングすることによって、ＬＥＰＲおよびＧＰ１３０シグナル伝達を刺激する概念に基づく。特に、本発明は、（本明細書において別に記載されている）ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体などの二重特異性抗原結合分子が、レプチン非存在下でさえも、細胞表面上のレプチン受容体の相対的近傍にＧＰ１３０を導くことによって、ＳＴＡＴ３のＬＥＰＲ依存性シグナル伝達を刺激することができる、という前提に関連する。このように、本発明の二重特異性抗原結合分子は、誘発されたレプチン／ＬＥＰＲシグナル伝達が有益及び／又は望ましい治療状況で用途を見出すことができるＬＥＰＲアゴニストとして機能し得る。
本発明は、細胞表面上のＬＥＰＲおよびＧＰ１３０をブリッジングすることによって、ＬＥＰＲおよびＧＰ１３０シグナル伝達を刺激する概念に基づく。特に、本発明は、（本明細書において別に記載されている）ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体などの二重特異性抗原結合分子が、レプチン非存在下でさえも、細胞表面上のレプチン受容体の相対的近傍にＧＰ１３０を導くことによって、ＳＴＡＴ３のＬＥＰＲ依存性シグナル伝達を刺激することができる、という前提に関連する。このように、本発明の二重特異性抗原結合分子は、誘発されたレプチン／ＬＥＰＲシグナル伝達が有益及び／又は望ましい治療状況で用途を見出すことができるＬＥＰＲアゴニストとして機能し得る。
【0047】
したがって、本発明は、ヒトＧＰ１３０に結合する第一抗原結合ドメイン（本明細書において「Ｄ１」とも称される）、およびヒトＬＥＰＲに結合する第二抗原結合ドメイン（本明細書において「Ｄ２」とも称される）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。本発明によると、および本明細書の作業実施例において実証されるように、本発明の二重特異性抗原結合分子によるＬＥＰＲおよびＧＰ１３０の同時結合は、ＬＥＰＲシグナル伝達の刺激をもたらす。
【0048】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、「ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体」またはその他の関連用語として本明細書において称され得る。
【0049】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は、単一特異性（従来型）抗ＬＥＰＲ抗体および抗ＧＰ１３０抗体由来の抗原結合ドメインを使用して構築されてもよい。例えば、モノクローナル、単一特異性、抗ＬＥＰＲ、および／または抗ＧＰ１３０抗体の収集は、当技術分野で公知の標準方法を使用して製作されてもよく、その抗原結合ドメインは、当技術分野で公知の従来技術を使用してＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を構築するために使用されうる。
【0050】
ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を産生するために本発明の状況で使用され得る例示的な抗ＬＥＰＲ抗体には、米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７７号に記載される抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかが含まれ、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる抗ＬＥＰＲ抗体は、アゴニスト抗体、すなわち、ヒトＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達を活性化する抗体であってもよい。他の実施形態では、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる抗ＬＥＰＲ抗体は、増強抗体、すなわち、ＬＥＰＲを介したレプチン介在性シグナル伝達を増強する抗体であってもよい。ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の構築に有用である抗ＬＥＰＲ抗体は、レプチンと複合体化されてＬＥＰＲに結合することができる抗体であり得る。このような抗体には、ＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲ：レプチン相互作用を遮断しないものが含まれる。あるいは、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の構築に有用である抗ＬＥＰＲ抗体は、ＬＥＰＲへの結合についてレプチンと競合する、および／またはレプチンの非存在下においてＬＥＰＲに結合するだけである抗体であり得る。ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる特定の抗ＬＥＰＲ抗体の非限定的な例は、本明細書では「ｍＡｂ１８４４５」及び「ｍＡｂ１８４４６」と呼称される抗ＬＥＰＲ抗体を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は、ＬＥＰＲ－ｂアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を増強する抗ＬＥＰＲ抗体に由来する。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は、ＬＥＰＲ－ａアイソフォームを介したインビトロでのレプチン介在性シグナル伝達を活性化しない抗ＬＥＰＲ抗体に由来する。
【0053】
ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を製作するために本発明の状況で使用されうる、例示的な抗ＧＰ１３０抗体は、本明細書において別に記載されている抗ＧＰ１３０抗体のいずれかを含む。ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の構築に有用な抗ＧＰ１３０抗体は、下記の特性の一つ以上を有する抗ＧＰ１３０抗体を含む：サルＧＰ１３０に結合する、マウスまたはラットＧＰ１３０に結合しない、ＧＰ１３０のＦＮＩＩＩドメイン内のエピトープに結合する、ＧＰ１３０リガンド介在性シグナル伝達を阻害しない、および／またはＧＰ１３０リガンドの非存在下においてＧＰ１３０シグナル伝達を活性化しない。ＧＰ１３０リガンドには、例えば、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が含まれる。ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる特定の抗ＧＰ１３０抗体の非限定的な例は、本明細書では「ｍＡｂ１６６８３」と呼称される抗ＧＰ１３０抗体を含む。
【0054】
本発明によれば、二重特異性抗原結合分子は単一の多機能性ポリペプチドであってもよいか、または互いに共有結合的にまたは非共有結合的に関連する二つ以上のポリペプチドの多量体複合体であってもよい。本開示によって明らかであるように、ヒトＬＥＰＲに特異的に結合する抗原結合ドメインと、ヒトＧＰ１３０に特異的に結合する抗原結合ドメインとを有する任意の抗原結合構築物は、「二重特異性抗原結合分子」と見なされる。本発明におけるあらゆる二重特異性抗原結合分子、またはそのバリアントは、当業者に周知である、標準的な分子生物学的手法（例えば、組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を用いて構成することができる。
【0055】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、「単離されて」もよい。本明細書において使用される「単離二重特異性抗原結合分子」は、その天然環境の少なくとも一つの成分から特定及び分離及び／又は回収された二重特異性抗原結合分子を意味する。例えば、生物体の少なくとも一つの成分から、または抗体が生成される組織もしくは細胞から分離または除去された二重特異性抗体は、本発明の目的では「単離二重特異性抗体」である。単離二重特異性抗原結合分子はまた、組み換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで分子を含む。単離二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの精製工程または単離工程を受けた分子である。特定の実施形態によれば、単離二重特異性抗原結合分子は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【0056】
抗原結合領域
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子には、二つの別々の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）が含まれる。本明細書にて使用される場合、「抗原結合ドメイン」という表現は、所望の特定の抗原に特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型（ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔｙｐｅ）分子、ペプチドディスプレイ分子（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、またはポリペプチド含有構築物を意味する（例えば、ヒトＬＥＰＲ、またはヒトＧＰ１３０）。用語「特異的に結合する」または同様の用語は、抗原結合ドメインに関して本明細書にて使用される場合、抗原結合ドメインが、特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下においてその他の無関係な抗原に結合しないことを意味する。「無関係な抗原」とは、互いに９５％未満のアミノ酸相同性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子には、二つの別々の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）が含まれる。本明細書にて使用される場合、「抗原結合ドメイン」という表現は、所望の特定の抗原に特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型（ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔｙｐｅ）分子、ペプチドディスプレイ分子（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、またはポリペプチド含有構築物を意味する（例えば、ヒトＬＥＰＲ、またはヒトＧＰ１３０）。用語「特異的に結合する」または同様の用語は、抗原結合ドメインに関して本明細書にて使用される場合、抗原結合ドメインが、特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下においてその他の無関係な抗原に結合しないことを意味する。「無関係な抗原」とは、互いに９５％未満のアミノ酸相同性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
【0057】
本発明と関連して使用することができる抗原結合ドメインの例示的な分類には、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原と特異的に結合する受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合足場（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＨＥＡＴ反復タンパク質、ＡＲＭ反復タンパク質、テトラトリコペプチド反復タンパク質、および天然の反復タンパク質に基づくその他の足場など［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９～８５７、およびそこに引用される参考文献を参照］）、ならびにそれらのアプタマーまたは部分が包含される。
【0058】
二個の分子が互いに特異的に結合するかどうかを判定する方法は、当該分野において周知であり、例えば、平衡分析、表面プラズモン共鳴法、および同様の方法が挙げられる。用語「表面プラズモン共鳴法」とは、本明細書にて使用される場合、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥヘルスケア内Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス部門、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて検出することにより、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【0059】
上記の通り、「抗原結合ドメイン」（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗体または抗体の抗原結合断片を含んでもよいか、またはこれらからなってもよい。用語「抗体」とは、本明細書にて使用される場合、特定の抗原（例えば、ヒトＭＥＴ）と特異的に結合する、または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」には、四つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む、イムノグロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲおよび四つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態において、本発明に記載の抗体のＦＲ（またはその抗原結合部分）は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【0060】
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子のＤ１および／またはＤ２成分は、完全抗体分子（ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の抗原結合断片を含んでいても、これらからなっていてもよい。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子的に操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変領域および随意に定常ドメインをコード化するＤＮＡの操作および発現に関するタンパク質消化または組み換え遺伝子工学技術といった、あらゆる好適な標準的方法を用いる、完全抗体分子に由来してもよい。このようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、一つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させるなどが可能である。
【0061】
抗体結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
【0062】
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインはあらゆる大きさであってもよいか、またはアミノ酸組成であってもよく、一般的に一つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはフレーム内にある少なくとも一つのＣＤＲを含み得る。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有し得る。代替的に、抗体の抗原結合断片は、モノマーＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。
【0063】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。上に列挙される例示的な構成のうちのいずれかを含む可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可動性または半可動性連鎖をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなってもよい。らに、抗原結合断片は、上にリスト化したあらゆる可変ドメインおよび定常ドメイン配置のホモ二量体またはヘテロ二量体（またはその他の多量体）を、互いにおよび／または一以上の単量体のＶＨまたはＶＬドメインと非共有結合性会合で（例えば、ジスルフィド結合によって）、含んでいてもよい。
【0064】
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子は、ヒト抗体および／もしくは遺伝子組み換えヒト抗体、またはその断片を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。にもかかわらず、ヒト抗体は、例えばＣＤＲおよび特定のＣＤＲ３において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコード化されていないアミノ酸残基（例えば、ランダムもしくはインビトロでの部位特異的変異によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。
【0065】
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子は、遺伝子組換えヒト抗体またはその抗原結合断片を含んでいてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。用語「遺伝子組換えヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、遺伝子組換え手段によって、調製される、発現する、作成される、または単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述する）中に形質導入された組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組替え体から単離され抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下で詳述する）、ヒトイムノグロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照のこと）、または抗体ヒトイムノグロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へスプライスすることを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現する、作成される、もしくは単離される抗体などを含むように意図される。その様な遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。特定の実施形態において、しかしながら、その様な遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組替え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
【0066】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知であり、本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するのに使用してもよい。本発明に関して使用することのできる例示的な二重特異性のフォーマットとしては、非限定的に、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディ二重特異性のフォーマット（ｄｉａｂｏｄｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｍａｔ）、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマット（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１～１１、およびそこで引用される参考文献を、前述のフォーマットの考察のために参照）が挙げられる。
【0067】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子に含めることができる例示的な抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）には、本明細書に開示される抗ＬＥＰＲおよび／または抗ＧＰ１３０抗体のいずれかから誘導される抗原結合ドメイン、または当該技術分野において公知の他の方法での抗原結合ドメインが含まれる。
【0068】
例えば、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似したその配列を含むＨＣＶＲを含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。
【0069】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0070】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアリングされた、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を提供する。
【0071】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0072】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0073】
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0074】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0075】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0076】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれの実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0077】
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペアリングされた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0078】
本発明はまた、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も提供する。
【0079】
関連の実施形態では、本発明は、表１に列挙される例示的な抗ＭＥＴ抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有される六個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を提供する。
【0080】
本発明は、本明細書に記載される、その開示がその全体で本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７７号に記載される、又は当技術分野で公知のその他の方法での、抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかから誘導される可変ドメイン（ＨＣＶＲ、及び／またはＬＣＶＲ）、及び／又は相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３）を含むＤ２（ＬＥＰＲ結合）抗原結合ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。
【0081】
非限定的な例証的実施例として、本発明は、Ｄ１（ＧＰ１３０結合）抗原結合ドメインとＤ２ （ＬＥＰＲ結合）抗原結合ドメインとを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含み、ここにおいて、Ｄ１抗原結合ドメインが、配列番号１５４／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを、または配列番号１５６－１５８－１６０－１２－１４－１６を含む重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、およびここにおいて、Ｄ２（ＬＥＰＲ結合）抗原結合ドメインが、配列番号１７０／１０、もしくは１７８／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを、または配列番号１７２－１７４－１７６－１２－１４－１６、もしくは１８０－１８２－１８４－１２－１４－１６を含む重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。これらの配列特性を有する例示的なＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体は、ｂｓＡｂ２１２３６と表示された二重特異性抗体であり、ｍＡｂ１６６８３由来のＤ１およびｍＡｂ１８４４５由来のＤ２を含む。これらの配列特性を有する別の例示的なＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体は、ｂｓＡｂ２１２３７と表示された二重特異性抗体であり、ｍＡｂ１６６８３由来のＤ１およびｍＡｂ１８４４６由来のＤ２を含む。本発明の二重特異性抗体のその他の具体的な例は、本明細書の実施例９、表２０に記載されている。
【0082】
多量体形成成分
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子はまた、特定の実施形態において、一つ以上の多量体形成成分を含んでいてもよい。多量体形成成分は、抗原結合領域（Ｄ１およびＤ２）間の会合を維持するように機能することができる。本明細書にて使用される場合、「多量体形成成分」とは、同一のもしくは同様の構造または構成の第二多量体形成成分と会合する能力を有する、あらゆる巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成成分は、イムノグロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成成分の非限定的な例として、イムノグロブリンのＦｃ部分（例えば、以下のアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群におけるあらゆるアロタイプから選択されるアイソタイプのＦｃドメイン）が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成成分は断片であるか、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する１～約２００のアミノ酸長のアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成成分はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、これらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
本発明に記載の二重特異性抗原結合分子はまた、特定の実施形態において、一つ以上の多量体形成成分を含んでいてもよい。多量体形成成分は、抗原結合領域（Ｄ１およびＤ２）間の会合を維持するように機能することができる。本明細書にて使用される場合、「多量体形成成分」とは、同一のもしくは同様の構造または構成の第二多量体形成成分と会合する能力を有する、あらゆる巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成成分は、イムノグロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成成分の非限定的な例として、イムノグロブリンのＦｃ部分（例えば、以下のアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群におけるあらゆるアロタイプから選択されるアイソタイプのＦｃドメイン）が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成成分は断片であるか、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する１～約２００のアミノ酸長のアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成成分はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、これらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
【0083】
特定の実施形態において、本発明に記載の二重特異性抗原結合分子は、二つの多量体形成ドメインＭ１およびＭ２を含み、ここにおいて、Ｄ１はＭ１に付着し、Ｄ２はＭ２に付着し、Ｍ１およびＭ２の会合は、単一の二重特異性抗原結合分子におけるＤ１とＤ２との互いの物理的結合を促進する。特定の実施形態において、Ｍ１およびＭ２は互いに同一である。例えば、Ｍ１は特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインであってもよく、Ｍ２はＭ１と同一のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。あるいは、Ｍ１およびＭ２は一つ以上のアミノ酸位置において互いに異なっていてもよい。例えば、Ｍ１は第一イムノグロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、Ｍ２は第二Ｉｇ ＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは少なくとも一つのアミノ酸が互いに異なっており、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、同一のＭ１およびＭ２配列を有する参照構築物と比べて、標的指向化する構築物とプロテインＡの結合を減少させる。一実施形態において、Ｍ１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、Ｍ２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；Ｈ４３５ＲはＥＵナンバリングによる）などのプロテインＡ結合を減少させるかまたは破壊する突然変異を含有する。Ｍ２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；Ｙ４３６ＦはＥＵによる）を含んでいてもよい。Ｍ２のＣＨ３にて見出され得るさらなる修飾として、以下を挙げることができる：Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの場合においては、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）；ＩｇＧ２ Ｆｃドメインの場合においては、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）；ならびに、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインの場合においては、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２ＩはＥＵによる）。
【0084】
バリアント
本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における一つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含みうる。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子、または本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来するその抗原結合ドメイン抗体（Ｄ１および／またはＤ２）を含み、ここにおいて、一つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（そのような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖系列変異」と称される）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列に見られる残基に再び変異する。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが、元の生殖系列配列に変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの一つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異する。さらに、本発明の二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。一旦得られると、一つ以上の生殖系列変異を含有する二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合により得る）、免疫原性の低下などの一つ以上の所望の特性について容易に試験することができ、このような一般的な方法で得られた二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、本発明内に包含される。
本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における一つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含みうる。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子、または本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来するその抗原結合ドメイン抗体（Ｄ１および／またはＤ２）を含み、ここにおいて、一つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（そのような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖系列変異」と称される）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列に見られる残基に再び変異する。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが、元の生殖系列配列に変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの一つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異する。さらに、本発明の二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。一旦得られると、一つ以上の生殖系列変異を含有する二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合により得る）、免疫原性の低下などの一つ以上の所望の特性について容易に試験することができ、このような一般的な方法で得られた二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、本発明内に包含される。
【0085】
本発明はまた、抗ＬＥＰＲ抗体、抗ＧＰ１３０抗体、および本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む二重特異性抗原結合分子も含む。本発明のこの態様に含まれる例示的なバリアントには、一つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントが含まれる。例えば、本発明は、本明細書に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する、抗ＬＥＰＲ抗体、抗ＧＰ１３０抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。
【0086】
本発明のこの態様に含まれる例示的なバリアントには、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかとの実質的な配列同一性を有するバリアントが含まれる。アミノ酸配列の状況において、本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、二つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。特定の実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の百分率または相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３～１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負以外の値を有する何らかの変化である。
【0087】
二つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。配列解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を判定するための既定パラメータとともに使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれが、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
【0088】
Ｆｃバリアントを含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる一つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に突然変異を含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質を含み、突然変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。このようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）における修飾、あるいは２５０位および／もしくは４２８位における修飾、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる一つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に突然変異を含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質を含み、突然変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。このようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）における修飾、あるいは２５０位および／もしくは４２８位における修飾、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。
【0089】
例えば、本発明は、以下からなる群から選択される変異の一つ以上のペアまたは群を含むＦｃドメインを含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質を含む：２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；および４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内であることが企図される。
【0090】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、高親和性でヒトＬＥＰＲに結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０抗原結合分子を含む。特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約３分より大きい解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子が提供される。
本発明は、高親和性でヒトＬＥＰＲに結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約１１０ｎＭ未満のＫＤで単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０抗原結合分子を含む。特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約３分より大きい解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子が提供される。
【0091】
本発明は、高親和性でヒトＧＰ１３０に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約１５０ｎＭ未満のＫＤで単量体ヒトＧＰ１３０（例えば、ｈＧＰ１３０．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０抗原結合分子を含む。特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例１０に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴法によって測定される約２．５分より大きい解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＧＰ１３０（例えば、ｈＧＰ１３０．ｍｍｈ）に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子が提供される。
【0092】
本発明は、ヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合する能力を有するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。一部の態様では、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は、ヒトＬＥＰＲ、アイソフォームｂを発現する細胞に結合する能力を有する。特定の実施形態では、レプチンの存在および／または非存在においてヒトＬＥＰＲを発現する細胞に結合するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。本発明は、ヒトＧＰ１３０を発現する細胞に結合する能力を有するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子による細胞結合は、例えば、本明細書の実施例１１に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、ＬＥＰＲおよびＧＰ１３０を発現する細胞上の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価されてもよい。
【0093】
本発明は、ＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達を活性化するＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。特定の実施形態では、本発明は、ＧＰ１３０リガンドでの処理により観察される活性化の少なくとも２０％の程度である効力を有するＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達を活性化する、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、同じまたは類似の実験的アッセイ条件下でヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）での処理によって観察される活性化の少なくとも２０％または２５％の程度である効力を有するＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達を活性化する、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子によるＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達の活性化は、例えば、本明細書の実施例１２に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、インビトロ細胞シグナル伝達アッセイにより評価されてもよい。
【0094】
本発明は、特異的に、または優先的に、ＬＥＰＲアイソフォーム「ｂ」（長い形態）を介したシグナル伝達を活性化し、かつＬＥＰＲアイソフォーム「ａ」（短い形態）を介したシグナル伝達を実質的に活性化しないＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。特定の実施形態によれば、特異的に、または優先的に、ＬＥＰＲアイソフォーム「ｂ」（長い形態）を介したレプチンシグナル伝達を増強し、かつＬＥＰＲアイソフォーム「ａ」（短い形態）を介したレプチンシグナル伝達を実質的に増強しない、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を提供する。ＬＥＰＲアイソフォーム「ｂ」および／またはＬＥＰＲアイソフォーム「ａ」を介したシグナル伝達の活性化または増強は、例えば、本明細書の実施例１４に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、特異的にＬＥＰＲアイソフォーム「ｂ」またはＬＥＰＲアイソフォーム「ａ」を発現するレポーター細胞株を使用してインビトロアッセイにより評価され得る。
【0095】
本発明は、動物に投与されたときに体重の減少を生じさせる、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、動物に対する治療有効用量の二重特異性抗原結合分子の投与の２～１４日後、動物の体重の１％～４％の減少を生じさせるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子による重量損失の誘発は、例えば、本明細書の実施例１３に記載のインビボモデルを使用して、または実質的に類似したモデルを使用して、遺伝子操作されたモデル系を使用して評価されてもよい。
【0096】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、前述の生物学的特徴、またはそれらの任意の組み合わせのうちの一つ以上を有してもよい。本発明の二重特異性抗原結合分子の生物学的特徴の前述のリストは、網羅的であることを意図していない。本発明の二重特異性抗原結合分子のその他の生物学的特徴は、本明細書の作業実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかであろう。
【0097】
エピトープマッピング、結合ドメイン、および関連技術
本発明の抗体および抗原結合ドメインが結合するエピトープは、ＬＥＰＲまたはＧＰ１３０タンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸での単一の連続配列からなり得る。あるいは、関連するエピトープは、標的タンパク質の複数の非連続的アミノ酸（または、アミノ酸配列）からなってもよい。
本発明の抗体および抗原結合ドメインが結合するエピトープは、ＬＥＰＲまたはＧＰ１３０タンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸での単一の連続配列からなり得る。あるいは、関連するエピトープは、標的タンパク質の複数の非連続的アミノ酸（または、アミノ酸配列）からなってもよい。
【0098】
当業者に公知の様々な技術を使用して、本発明の抗体および抗原結合ドメインが相互作用するＬＥＰＲおよび／またはＧＰ１３０上のエピトープを決定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な技術には、例えば、ポイント突然変異誘発（例えば、アラニンスキャン突然変異誘発、アルギニンスキャン突然変異誘発など）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３～４６３）、プロテアーゼ保護、およびペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７～４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的な用語において、水素／重水素交換方法は、対象タンパク質を重水素ラベル標識すること、続いて抗原標識タンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、抗体によって保護された残基（重水素標識のまま残る）を除く全ての残基で、水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析解析を受け、それと抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ （１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２～２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （２００１） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａを参照されたい。Ｘ線結晶構造解析もまた使用して、それと抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。
【0099】
本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗ＧＰ１３０抗体または抗原結合ドメイン（例えば、本明細書において表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合するＤ１（ＧＰ１３０結合）ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗ＬＥＰＲ抗体または抗原結合ドメイン（例えば、本明細書において表１８に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合するＤ２（ＬＥＰＲ結合）ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗ＧＰ１３０抗体（例えば、本明細書において表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＧＰ１３０への結合について競合するＤ１（ＧＰ１３０結合）ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も含む。さらに、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗ＬＥＰＲ抗体（例えば、本明細書において表１８に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＬＥＰＲへの結合について競合するＤ２（ＬＥＰＲ結合）ドメインを含む、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子も含む。
【0100】
当該技術分野で知られており、本明細書に例証される通常の方法を使用することにより、抗体または抗原結合ドメインが、参照抗ＧＰ１３０または抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗ＧＰ１３０または抗ＬＥＰＲ抗体と結合について競合するかを簡単に判断できる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＧＰ１３０または抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判断するために、参照抗体は、標的分子（すなわち、ＧＰ１３０またはＬＥＰＲタンパク質、場合により得る）に結合されることができる。次に、標的分子に結合する試験抗体の能力が評価される。参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合することができる場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、試験抗体が参照抗体との飽和結合後に標的分子に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合してもよい。追加的な通常の実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）が、試験抗体の結合の観察された欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することによるのかどうか、または立体遮断（または別の現象）が観察された結合の欠如に責任を負うかどうか、を確認するために実行され得る。この種類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明の特定の実施形態によると、もしも、例えば、一方の抗体の１、５、１０、２０、または１００倍の過剰が、競合結合アッセイで測定されように、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、または９９％までも他方の抗体の結合を阻害する場合、二個の抗体は同一（または重複）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５～１５０２を参照されたい）。別の方法として、一個の抗体の結合を減少または除去する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は同一エピトープに結合するとみなされる。一個の抗体の結合を減少または除去するアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
【0101】
抗体が、参照抗ＧＰ１３０または抗ＬＥＰＲ抗体との結合について競合する（または結合について交差競合する）かどうかを判断するために、上述の結合方法論が二つの方向性で実施される：第一の方向性では、参照抗体は、飽和条件下で標的分子に結合されることができ、その後に標的分子への試験抗体の結合を評価する。第二の方向性では、試験抗体は、飽和条件下で標的分子に結合されることができ、その後に標的分子への参照抗体の結合を評価する。両方の方向性で、第一の（飽和する）抗体のみが標的分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は標的分子への結合について競合すると結論付けられる。当分野の当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてよく、重複したエピトープまたは隣接するエピトープを結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【0102】
本発明の二重特異性抗原結合分子の抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗原結合ドメインが相互作用するＧＰ１３０またはＬＥＰＲのドメインに関して記載しうる。ＧＰ１３０およびＬＥＰＲタンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＦＮＩＩＩと呼称される様々なドメインを含む。したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子のＤ１およびＤ２抗原結合ドメインは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、又はＦＮＩＩＩからなる群から選択されるＬＥＰＲ又はＧＰ１３０のドメインに結合してもよい。特定の例示的実施形態によると、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０の二重特異性抗原結合分子が提供され、ここにおいて、Ｄ１（抗ＧＰ１３０）抗原結合ドメインがＧＰ１３０のＦＮＩＩＩドメインに結合し、Ｄ２（抗ＬＥＰＲ）抗原結合ドメインがＬＥＰＲのＦＮＩＩＩドメインに結合する。他の結合ドメインの組み合わせは、本発明の範囲内で意図されている。
【0103】
ヒト抗体の調製
本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０の二重特異性抗体は、完全ヒト抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は当該技術分野で既知である。ヒトＧＰ１３０および／またはヒトＬＥＰＲに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、任意のこのような既知の方法が、本発明の状況において使用され得る。
本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０の二重特異性抗体は、完全ヒト抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は当該技術分野で既知である。ヒトＧＰ１３０および／またはヒトＬＥＰＲに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、任意のこのような既知の方法が、本発明の状況において使用され得る。
【0104】
完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または任意の他の類似の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するヒトＧＰ１３０および／またはヒトＬＥＰＲに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験セクションと同様に、抗体を、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。必要であれば、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、例えば野生型のまたは修飾されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４、完全ヒト抗ＧＰ１３０および／または抗ＬＥＰＲ抗体を生成する。選択される定常領域は特定の用途に応じて異なり得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は可変領域に存在する。特定の場合、完全ヒト抗ＧＰ１３０および／または抗ＬＥＰＲ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。
【0105】
生物学的等価物
本発明は、記載された抗体のアミノ酸配列からは変化するが、関連する標的抗原（ＧＰ１３０及び／またはＬＥＰＲ）に結合する能力を保持し、かかるバリアントが由来する親抗体の一つ以上の生物機能を発揮するアミノ酸配列を有する、バリアント抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体を含む。このようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本発明は、本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列を含み、ここにおいて、かかるＤＮＡ配列が、開示された親配列と比較した場合、ヌクレオチドの一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本明細書に開示される例示的抗体と本質的に生物学的に等価である抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体をコードする。このようなバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、本明細書の他の箇所で考察される。
本発明は、記載された抗体のアミノ酸配列からは変化するが、関連する標的抗原（ＧＰ１３０及び／またはＬＥＰＲ）に結合する能力を保持し、かかるバリアントが由来する親抗体の一つ以上の生物機能を発揮するアミノ酸配列を有する、バリアント抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体を含む。このようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本発明は、本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列を含み、ここにおいて、かかるＤＮＡ配列が、開示された親配列と比較した場合、ヌクレオチドの一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本明細書に開示される例示的抗体と本質的に生物学的に等価である抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体をコードする。このようなバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、本明細書の他の箇所で考察される。
【0106】
二つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば類似の実験条件下、同じモル用量で、単一用量または複数用量のいずれかで投与されたとき、吸収の速度および程度が著しい差異を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的等価物であるとみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は同等であるがこれらの吸収速度は同等ではない場合、等価物または薬学的代替物とみなされ、さらに、吸収速度のこのような差異が、意図的であり、ラベルに反映されており、例えば、慢性使用において有効身体薬物濃度の獲得に不可欠ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的等価物であるとみなされる。
【0107】
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
【0108】
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品の間での一回以上の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される上昇または有効性の減退が生じずに、患者がその様な切り替えを行うことができる場合、生物学的に等価である。
【0109】
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、一つまたは複数の使用条件について、一つのまたは複数の共通の作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【0110】
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒトのインビボでの生物学的利用能データと相関し、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【0111】
種選択性および種交差反応
特定の実施形態によると、本発明は、ヒトＧＰ１３０およびヒトＬＥＰＲに結合するが他種からの対応するタンパク質には結合しない、抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（および抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む他の抗原結合分子）を提供する。本発明はまた、ヒトＧＰ１３０及びヒトＬＥＰＲ、ならびに一つ以上の非ヒト種からのＧＰ１３０及びＬＥＰＲに結合する、抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（および抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）も含む。例えば、本発明は、第一及び第二の抗原結合ドメインを含有する二重特異性抗原結合分子を含み、ここにおいて、第一の抗原結合ドメインは、ヒト及びサル（例えば、カニクイザル）ＧＰ１３０に結合するが、齧歯類（ラットおよび／またはマウス）ＧＰ１３０に結合しない。本発明は、第一及び第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここにおいて、第二の抗原結合ドメインは、ヒト及びサル（例えば、カニクイザル）ＬＥＰＲに結合するが、齧歯類（ラットおよび／またはマウス）ＬＥＰＲに結合しない。
特定の実施形態によると、本発明は、ヒトＧＰ１３０およびヒトＬＥＰＲに結合するが他種からの対応するタンパク質には結合しない、抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（および抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む他の抗原結合分子）を提供する。本発明はまた、ヒトＧＰ１３０及びヒトＬＥＰＲ、ならびに一つ以上の非ヒト種からのＧＰ１３０及びＬＥＰＲに結合する、抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（および抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）も含む。例えば、本発明は、第一及び第二の抗原結合ドメインを含有する二重特異性抗原結合分子を含み、ここにおいて、第一の抗原結合ドメインは、ヒト及びサル（例えば、カニクイザル）ＧＰ１３０に結合するが、齧歯類（ラットおよび／またはマウス）ＧＰ１３０に結合しない。本発明は、第一及び第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここにおいて、第二の抗原結合ドメインは、ヒト及びサル（例えば、カニクイザル）ＬＥＰＲに結合するが、齧歯類（ラットおよび／またはマウス）ＬＥＰＲに結合しない。
【0112】
本発明はさらに、ヒトＧＰ１３０および／またはヒトＬＥＰＲに結合し、かつ場合によっては、対応するＧＰ１３０および／またはＬＥＰＲタンパク質のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーバージョンの一つ以上に、結合しうる、または結合しない、抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、およびＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（および抗ＧＰ１３０および／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む他の抗原結合分子）を提供する。
【0113】
治療用の製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（及び抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む他の抗原結合分子）を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された転位、送達、耐用能、および同様のものを提供するその他の薬剤と共に、製剤化してもよい。
本発明は、本発明の抗ＧＰ１３０、抗ＬＥＰＲ抗体、及びＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体（及び抗ＧＰ１３０及び／または抗ＬＥＰＲ抗原結合ドメインを含む他の抗原結合分子）を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された転位、送達、耐用能、および同様のものを提供するその他の薬剤と共に、製剤化してもよい。
【0114】
抗体の治療用途
本発明は、それを必要とする対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子（例えば、本明細書において表２０に記載のＤ１及びＤ２成分のいずれかを含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子）を含む治療用組成物を投与する工程を含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤のいずれかを含むことができる。
本発明は、それを必要とする対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子（例えば、本明細書において表２０に記載のＤ１及びＤ２成分のいずれかを含むＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子）を含む治療用組成物を投与する工程を含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤のいずれかを含むことができる。
【0115】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は有用であり、特に、レプチン欠損症、レプチン抵抗性、低レプチン血症に関連する、または媒介される、任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善について、あるいは、インビトロもしくはインビボでレプチンの本来の活性をシグナル伝達する、または模倣するＬＥＰＲを刺激するまたは活性化することによって治療可能なその他の方法について、有用である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子は、リポジストロフィー状態の治療に有用である。本発明の二重特異性抗原結合分子によって治療可能である例示的なリポジストロフィーの状態には、例えば、先天性全身性リポジストロフィー、後天性全身性リポジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、後天性部分型リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、リポアトロフィアアニュラリス（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）、局所性リポジストロフィー、およびＨＩＶ関連リポジストロフィーが含まれる。
【0116】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子はまた、肥満、代謝症候群、食餌誘発性食物渇望、機能性視床下部性無月経、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン受容体の突然変異による重度のインスリン抵抗性を含む重度のインスリン抵抗性、インスリン受容体の突然変異が原因ではない重度のインスリン抵抗性、下流シグナル伝達経路における突然変異が引き起こす、または他の原因によって誘発される重度のインスリン抵抗性、非アルコール性、およびアルコール性脂肪性肝疾患、アルツハイマー病、レプチン欠損症、レプチン抵抗性、リポジストロフィー、レプレコーニズム／ドナヒュー症候群、ラブソン・メンデンホール症候群からなる群から選択される一つ以上の疾患または障害の治療または予防にも有用である。
【0117】
本明細書に記載される治療方法の状況では、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子は、単剤療法（すなわち、唯一の治療薬剤として）として投与されてもよく、または一つ以上の追加的治療薬剤（その実施例は本明細書において別に記載されている）と組み合わされて投与されてもよい。
【0118】
併用療法および製剤
本発明は、一つ以上の追加的治療活性成分と組み合わせた、本明細書に記載されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤を含み、かつそれを必要とする対象にかかる組み合わせを投与する工程を含む治療方法を含む。
本発明は、一つ以上の追加的治療活性成分と組み合わせた、本明細書に記載されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤を含み、かつそれを必要とする対象にかかる組み合わせを投与する工程を含む治療方法を含む。
【0119】
本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０の二重特異性抗原結合分子は、一つ以上の追加的治療活性成分と共製剤化されうる、および／または、例えば、肥満、高コレステロール血症、高脂血症、２型糖尿病、１型糖尿病、食欲管理、不妊などの治療に対して処方された医薬品などの、一つ以上の追加的治療活性成分と組み合わされて投与されうる。このような追加的治療上活性成分の例には、例えば、組換えヒトレプチン（例えば、メトレレプチン［ＭＹＡＬＥＰＴ］）、ＰＣＳＫ９阻害剤（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体［アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシズマブ、ロデルシズマブ、ラルパンシズマブなど］）、スタチン（アトルバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなど）、エゼチミブ、インスリン、インスリンバリアント、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、スルホニル尿素、ナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ダパグリホジン（ｄａｐａｇｌｉｆｏｚｉｎ）、カナグリホジン（ｃａｎａｇｌｉｆｏｚｉｎ）、エンパグリフロジンなど）、ＧＬＰ－１アゴニスト／類似体（例えば、エクステンジン（ｅｘｔｅｎｄｉｎ）－４、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、など）、グルカゴン（ＧＣＧ）阻害剤（例えば、抗ＧＣＧ抗体）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）阻害剤（例えば、抗ＧＣＧＲ抗体、小分子ＧＣＧＲアンタゴニスト、ＧＣＧＲ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＧＣＧＲアプタマー［例えば、シュピーゲルマー］、など）、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）阻害剤（例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ８抗体など）、フェンテルミン、オリスタット、トピラマート、ブプロピオン、トピラマート／フェンテルミン、ブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、プラムリンチド／メトレレピン（Ｍｅｔｒｅｌｅｐｉｎ）、ロルカセリン、セチリスタット、テソフェンシン、ベルネペリトなど、が挙げられる。
【0120】
追加的治療活性成分は、例えば、上に列挙した薬剤またはその誘導体のいずれか、本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の投与の直前に、それと同時に、またはその直後に投与されてもよい；（本開示の目的のために、かかる投与レジメンは、追加的治療活性成分と「組み合わせて」、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の投与とみなされる）。本発明は、本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子が、本明細書の他の場所に記載される追加的治療活性成分のうちの一つ以上と共製剤化されている医薬組成物を含む。
【0121】
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によると、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子（または本明細書に記載されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子と追加的治療活性薬剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の複数用量は、定義された時間コースにわたって対象に投与されてもよい。本発明の本態様による方法は、本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の複数用量を対象に逐次的に投与する工程を含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与する」とは、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の各用量が、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）によって分離された異なる日にのような、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本発明は、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の単回初回用量を、次にＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の一つ以上の二次用量を、そして任意で、その後にＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の一つ以上の三次用量を、患者に逐次的に投与する工程を含む方法を含む。
本発明の特定の実施形態によると、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子（または本明細書に記載されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子と追加的治療活性薬剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の複数用量は、定義された時間コースにわたって対象に投与されてもよい。本発明の本態様による方法は、本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の複数用量を対象に逐次的に投与する工程を含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与する」とは、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の各用量が、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）によって分離された異なる日にのような、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本発明は、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の単回初回用量を、次にＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の一つ以上の二次用量を、そして任意で、その後にＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の一つ以上の三次用量を、患者に逐次的に投与する工程を含む方法を含む。
【0122】
「初回用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、本発明のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の投与の時間配列を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量である（また「ベースライン用量」、「負荷用量」、「開始用量」などとも呼称される）、「二次用量」は初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量および三次用量はすべて、同じ量のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含有するが、投与頻度に関しては一般的に互いに異なっていてもよい。しかしながら、特定の実施形態では、初回用量、二次用量および／または三次用量に含有されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子の量は、治療過程の間、互いに異なる（例えば、適宜調整して加減する）。特定の実施形態では、二回以上（例えば、２、３、４、または５）の用量は、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、その後に続く用量が、より低い頻度ベースで投与される（例えば、「維持用量」）。
【0123】
装置
本発明はまた、本明細書に記載されている二重特異性抗原結合分子（例えば、その医薬製剤）を含む、容器（例えば、バイアルまたはクロマトグラフィーカラム）または注射装置（例えば、シリンジ、充填済みシリンジまたは自動注射器）も提供する。容器または注射装置は、キット内に包装されうる。
本発明はまた、本明細書に記載されている二重特異性抗原結合分子（例えば、その医薬製剤）を含む、容器（例えば、バイアルまたはクロマトグラフィーカラム）または注射装置（例えば、シリンジ、充填済みシリンジまたは自動注射器）も提供する。容器または注射装置は、キット内に包装されうる。
【0124】
注射装置は、物質を対象（例えば、ヒト）の身体内に非経口経路、例えば、眼内、硝子体内、筋肉内、皮下または静脈内、を介して導入する装置である。例えば、注射装置は、例えば、注入される流体（例えば、抗体、またはその断片またはその医薬製剤を含む）を保持するためのシリンダーまたはバレル、流体の注入のための皮膚、血管またはその他の組織を貫通するためのニードル、を含むシリンジ（例えば、自動注射器など、医薬製剤が充填済みの）、および液体をシリンダーからニードルの穴を通って対象の体内へ押し出すためのプランジャーであってもよい。
【0125】
本発明は、例えば、注射装置で、対象の体内に分子を導入する工程、例えば注射する工程を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子を投与するための方法を含む。
【0126】
発現方法
本発明には、下記の工程を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのイムノグロブリン鎖を作製するための組み換え方法を含む：（ｉ）例えば、二重特異性抗原結合分子などの、軽および／または重イムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、ここにおいて、ポリヌクレオチドはベクター中にある、および／または宿主細胞染色体に組み込まれる、および／またはプロモーターに動作可能に連結されている、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で宿主細胞（例えば、哺乳類、真菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ピキアまたはピキア・パストリス）を培養する工程、ならびに（ｉｉｉ）任意で、宿主細胞および／または宿主細胞を成育させた培地から二重特異性抗原結合分子またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。こうした方法の産物はまた、その医薬組成物と共に本発明の一部を形成する。
本発明には、下記の工程を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのイムノグロブリン鎖を作製するための組み換え方法を含む：（ｉ）例えば、二重特異性抗原結合分子などの、軽および／または重イムノグロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、ここにおいて、ポリヌクレオチドはベクター中にある、および／または宿主細胞染色体に組み込まれる、および／またはプロモーターに動作可能に連結されている、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で宿主細胞（例えば、哺乳類、真菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ピキアまたはピキア・パストリス）を培養する工程、ならびに（ｉｉｉ）任意で、宿主細胞および／または宿主細胞を成育させた培地から二重特異性抗原結合分子またはイムノグロブリン鎖を単離する工程。こうした方法の産物はまた、その医薬組成物と共に本発明の一部を形成する。
【0127】
本発明の実施形態では、二重特異性抗原結合分子を作製するための方法は、例えば、カラムクロマトグラフィー、析出および／または濾過によって、分子を精製する方法を含む。こうした方法の産物はまた、本発明の一部をその医薬組成物と共に形成する。
【0128】
本発明の二重特異性抗原結合分子および／または（例えば、ベクター中で）そのような分子のイムノグロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞もまた、本発明の一部である。宿主細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および、ピキア細胞（例えば、Ｐ．パストリス）などの真菌細胞などの哺乳類細胞が含まれる。
【実施例0129】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し使用するかを当業者へ完全に開示するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図していない。使用した数字（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するために努力がなされているが、一部の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。
【0130】
実施例１： 抗ＧＰ１３０抗体の生成
抗ＧＰ１３０抗体は、組換えヒトＧＰ１３０細胞外ドメインを含む免疫原を有するヒトイムノグロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたマウスを免疫化することによって得られた。免疫化に使用されるマウスは、「普遍的軽鎖」を発現する。すなわち、このマウスで製造された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有する。
抗ＧＰ１３０抗体は、組換えヒトＧＰ１３０細胞外ドメインを含む免疫原を有するヒトイムノグロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたマウスを免疫化することによって得られた。免疫化に使用されるマウスは、「普遍的軽鎖」を発現する。すなわち、このマウスで製造された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有する。
【0131】
抗体の免疫応答を、ＧＰ１３０特異的イムノアッセイによってモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持した、およびハイブリドーマ細胞株から。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＧＰ１３０特異的抗体を産生する細胞株を識別した。この技術を使用して、数種の抗ＧＰ１３０キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを保有する抗体）を得た。さらに、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＧＰ１３０抗体を、骨髄腫細胞への融合なしに抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
【0132】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＧＰ１３０抗体の特定の生物学的特性、およびそれから構築される二重特異性抗体を、以下に記載した実施例において詳細に説明する。
【0133】
実施例２： 抗ＧＰ１３０の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸の配列
表１は、本発明の選択された抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別名を示す。（上述のように、実施例１で生成された全ての抗体は、同じ軽鎖可変領域、および同じ軽鎖ＣＤＲ配列をも有する）。対応する核酸配列識別名を表２に記載する。
表１は、本発明の選択された抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別名を示す。（上述のように、実施例１で生成された全ての抗体は、同じ軽鎖可変領域、および同じ軽鎖ＣＤＲ配列をも有する）。対応する核酸配列識別名を表２に記載する。
【0134】
（表１）抗GP130アミノ酸配列識別名
【0135】
（表２）抗GP130核酸配列識別名
【0136】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプであり得る。例えば、本発明の抗ＧＰ１３０抗体は、表１および２に記載の可変ドメインおよびＣＤＲ配列、ならびにアイソタイプＩｇＧ４、ＩｇＧ１などのヒトＦｃドメインを含みうる。特定の用途または実験では、ＦｃドメインはマウスＦｃドメインであってもよい。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１を有する抗体に変換することができる、など）が、いずれの場合でも、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）－これは、表１および２に示される数値識別名によって示されている－は変わらず、結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず同一または実質的に類似していると予想される。
【0137】
実施例３： ２５℃および３７℃で測定された各種ＧＰ１３０反応部に結合する抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合動態
精製された抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体に結合する各種ＧＰ１３０反応部についての平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ ４０００バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニング緩衝液中、２５℃および３７℃で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーの表面を、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ，＃ ＢＲ－１００８－３９）を用いたアミンカップリングによって誘導体化し、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体を捕捉した。以下の単量体および二量体ＧＰ１３０反応部で結合試験を行った：Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９１）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍｆＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９４）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ｈＦｃ；配列番号１９７）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたマウスＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９６）、およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたラットＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｒＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９５）。「ｍｍＨ」でタグ付けされた反応部は単量体であり、一方で「ｍＦｃ」でタグ付けされた反応部は二量体である。したがって、例えば、「ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ」はまた、「単量体ヒトＧＰ１３０」とも呼称され、「ｈＧＰ１３０－ｍＦｃ」はまた「二量体ヒトＧＰ１３０」とも呼称される。
精製された抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体に結合する各種ＧＰ１３０反応部についての平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ ４０００バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニング緩衝液中、２５℃および３７℃で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーの表面を、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ，＃ ＢＲ－１００８－３９）を用いたアミンカップリングによって誘導体化し、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体を捕捉した。以下の単量体および二量体ＧＰ１３０反応部で結合試験を行った：Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９１）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍｆＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９４）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ｈＦｃ；配列番号１９７）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたマウスＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９６）、およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたラットＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｒＧＰ１３０－ｍｍＨ；配列番号１９５）。「ｍｍＨ」でタグ付けされた反応部は単量体であり、一方で「ｍＦｃ」でタグ付けされた反応部は二量体である。したがって、例えば、「ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ」はまた、「単量体ヒトＧＰ１３０」とも呼称され、「ｈＧＰ１３０－ｍＦｃ」はまた「二量体ヒトＧＰ１３０」とも呼称される。
【0138】
異なる濃度のｈＧＰ１３０－ｍｍＨ、ｍｆＧＰ１３０－ｍｍＨ、ｈＧＰ１３０－ｍＦｃ（１００ｎＭ～３．７ｎＭ；３倍連続希釈）、または１００ｎＭのｍＧＰ１３０－ｍｍＨおよびｒＧＰ１３０－ｍｍＨを、まずＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で調製し、抗ヒトＦｃに捕捉された抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体表面の上に、流速３０μＬ／分で４分間注入し、その間に、ＧＰ１３０反応部に結合したモノクローナル抗体の解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で１０分間モニタリングした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃカーブフィッティングソフトウェアを使用して、質量輸送限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を用いてリアルタイム結合センサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングさせることによって、会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、以下のように運動速度から計算した。
【0139】
２５℃および３７℃での本発明の各種抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体に結合するｈＧＰ１３０－ＭＭＨ、ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨ、ｈＧＰ１３０．ｍＦｃ、ｍＧＰ１３０－ＭＭＨ、またはｒＧＰ１３０－ＭＭＨについての結合動態パラメータを、表３から表１２に示す。
【0140】
（表３）25℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するhGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0141】
（表４）37℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するhGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0142】
25℃では、表3に示すように、抗GP130モノクローナル抗体が、663pM～411nMの範囲のKD値で、hGP130-MMHに結合した。37℃では、表4に示すように、抗GP130モノクローナル抗体が、1.84nM～225nMの範囲のKD値で、hGP130-MMHに結合した。
【0143】
（表５）25℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するmfGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
ＩＣは、 現在の実験条件下で 観察された結合が包括的であり、リアルタイム結合データに適合することができなかったことを示す。
ＩＣは、 現在の実験条件下で 観察された結合が包括的であり、リアルタイム結合データに適合することができなかったことを示す。
【0144】
（表６）37℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するmfGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0145】
本発明の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体の２６個中２３個がｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。２５℃では、表５に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、８１２ｐＭ～２３３ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表６に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、２．３４ｎＭから２３９ｎＭに及ぶＫＤ値で、ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。
【0146】
（表７）25℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するhGP130-mFcの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0147】
（表８）37℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するhGP130-mFcの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#は、捕捉されたGP130モノクローナル抗体からのhGP130-mFcの解離が観察されなかったことを意味し、分析中に、kd値を1.00E～05に手動で固定した。
#は、捕捉されたGP130モノクローナル抗体からのhGP130-mFcの解離が観察されなかったことを意味し、分析中に、kd値を1.00E～05に手動で固定した。
【0148】
２５℃では、表７に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、３６．６ｐＭ～８．２１ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＧＰ１３０－ｍＦｃに結合した。３７℃では、表８に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、１７ｐＭ～９．５６ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＧＰ１３０－ｍＦｃに結合した。
【0149】
（表９）25℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するmGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0150】
（表１０）37℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するmGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0151】
表9および10に示されるように、25℃または37℃で、mGP130-MMHに結合した本発明の抗GP130モノクローナル抗体はなかった。
【0152】
（表１１）25℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するrGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0153】
（表１２）37℃でのGP130モノクローナル抗体に結合するrGP130-MMHの結合動態パラメータ
NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0154】
表１１および１２に示されるように、本発明の２６個の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体のうち２つがｒＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。２５℃では、表１１に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、３４４ｎＭ～４６０ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｒＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表１２に示すように、抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体が、４０３ｎＭ～９５０の範囲のＫＤ値で、ｒＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。
【0155】
実施例４： ＦＡＣＳ分析による抗ＧＰ１３０抗体細胞結合
本発明の抗ＧＰ１３０抗体による細胞結合を評価するために、２個の細胞株が生成された。生成された一つの細胞株は、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に、全長（ＦＬ）ヒトｇｐ１３０（位置２でバリンに変化するロイシンを有する登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８、天然バリアント）を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞であった。フローサイトメトリーを使用して、ｇｐ１３０の高発現について細胞を二回ソートした。以後、ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソートとして知られる。ＩＭＲ－３２細胞（ヒト神経芽細胞腫、ＡＴＣＣ）もまた、これらの細胞がｇｐ１３０を内因的に発現しバイオアッセイに使用されるので、細胞結合について評価された。結合に使用された細胞は、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に発現するために生成され、以下でＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ細胞と呼称される。
本発明の抗ＧＰ１３０抗体による細胞結合を評価するために、２個の細胞株が生成された。生成された一つの細胞株は、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に、全長（ＦＬ）ヒトｇｐ１３０（位置２でバリンに変化するロイシンを有する登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８、天然バリアント）を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞であった。フローサイトメトリーを使用して、ｇｐ１３０の高発現について細胞を二回ソートした。以後、ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソートとして知られる。ＩＭＲ－３２細胞（ヒト神経芽細胞腫、ＡＴＣＣ）もまた、これらの細胞がｇｐ１３０を内因的に発現しバイオアッセイに使用されるので、細胞結合について評価された。結合に使用された細胞は、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に発現するために生成され、以下でＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ細胞と呼称される。
【0156】
ＦＡＣＳ分析については、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなし）中において４℃で３０分間各細胞タイプの０．５×１０６細胞／ウェルを染色するために、抗体の１０ｎＭを使用した。ＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－ｌｕｃ細胞を、４℃で３０分間、１ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧでインキュベートし、抗体を添加する前にＦｃ受容体を遮断した。抗ｇｐ１３０抗体の結合がＩＭＲ－３２細胞上のｇｐ１３０に特異的であるかどうかを試験するために、２５℃で３０分間にわたり、ｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグ（ｈｇｐ１３０．ｍｍｈ）に融合されたヒトｇｐ１３０の外部ドメインの組み換えタンパク質１０００ｎＭに事前結合されて、または事前結合されることなく、抗体がＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞に添加された。一次抗体によるインキュベーションの後、細胞は８μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、抗ヒト番号１０９－６０７－００３）で３０分間染色された。細胞は、ＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃５５４６５５）を使用して固定され、ＩＱｕｅ（登録商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標））フローサイトメーターで分析された。未染色および二次抗体単独の対照もまた、すべての細胞株に対して試験された。生細胞に対する蛍光の幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎｓ）を決定するために、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標））ソフトウェアを使用して結果を分析した。
【0157】
表１３に示されるように、１０ｎＭで試験した本発明の２６個の抗ｇｐ１３０抗体は、２９～１５９倍の範囲の結合比を有するＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソート細胞に対する結合を示した。抗ｇｐ１３０抗体は、結合比４～４５倍の結合比を有するＨＥＫ２９３親細胞に対する結合を示した。ＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞に対する結合比は、ｈｇｐ１３０．ｍｍｈなしで５～２３倍、およびｈＧＰ１３０．ｍｍｈありで４～９倍の範囲であった。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独サンプルは、ＨＥＫ２９３細胞株に対して１～３倍の範囲の結合比を示し、ＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞に対して１～８倍の範囲の結合比を示した。
【0158】
（表１３）HEK293/Stat3-luc/gp130-2XソートおよびIMR-32/Stat3-luc細胞に対する10nM抗gp130抗体の結合
【0159】
実施例５： 各種抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体間のＯｃｔｅｔクロス競合
抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体のパネル間の結合競合は、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）上で、リアルタイムの標識非含有バイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイを使用して決定された。実験全体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）緩衝液中で、１０００ｒｐｍの速度で振盪するプレートを用いて、２５℃で実施した。組み換えヒトＧＰ１３０（ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ；Ｃ末端と共に発現させたｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ配列番号１８８）上のそれぞれのエピトープに結合するために、２個の抗体が互いに競合するかどうかを評価するため、約０．４～０．５ｎｍのｈＧＰ１３０－ｍｍＨを、バイオセンサー先端部を４０～５０μｇ／ｍＬのｈＧＰ１３０－ＭＭＨ溶液を含むウェルで４分間浸漬することにより、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体被覆Ｏｃｔｅｔバイオセンサー先端部（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ、＃１８－５１２２）上に最初に捕捉した。次いで、抗原を捕捉したバイオセンサー先端部を、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１溶液を含むウェルへと４分間浸漬することによって、第一の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体（ｍＡｂ－１）で飽和した。次いで、バイオセンサー先端部を、５０μｇ／ｍＬの第二の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体（ｍＡｂ－２）の溶液を含むウェルへと３分間浸漬した。バイオセンサー先端部を、実験のすべてのステップ間でＨＢＳ－ＥＴＢ緩衝液で洗浄した。実験の過程全体の間にリアルタイム結合応答をモニタリングし、各ステップの終了時に結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と予め複合体化されたｈＧＰ１３０－ＭＭＨへのｍＡｂ－２結合の応答を比較し、表１４に示すとおり、各種抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体の競合／非競合挙動を判定した。
抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体のパネル間の結合競合は、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）上で、リアルタイムの標識非含有バイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイを使用して決定された。実験全体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）緩衝液中で、１０００ｒｐｍの速度で振盪するプレートを用いて、２５℃で実施した。組み換えヒトＧＰ１３０（ｈＧＰ１３０－ｍｍＨ；Ｃ末端と共に発現させたｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ配列番号１８８）上のそれぞれのエピトープに結合するために、２個の抗体が互いに競合するかどうかを評価するため、約０．４～０．５ｎｍのｈＧＰ１３０－ｍｍＨを、バイオセンサー先端部を４０～５０μｇ／ｍＬのｈＧＰ１３０－ＭＭＨ溶液を含むウェルで４分間浸漬することにより、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体被覆Ｏｃｔｅｔバイオセンサー先端部（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ、＃１８－５１２２）上に最初に捕捉した。次いで、抗原を捕捉したバイオセンサー先端部を、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１溶液を含むウェルへと４分間浸漬することによって、第一の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体（ｍＡｂ－１）で飽和した。次いで、バイオセンサー先端部を、５０μｇ／ｍＬの第二の抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体（ｍＡｂ－２）の溶液を含むウェルへと３分間浸漬した。バイオセンサー先端部を、実験のすべてのステップ間でＨＢＳ－ＥＴＢ緩衝液で洗浄した。実験の過程全体の間にリアルタイム結合応答をモニタリングし、各ステップの終了時に結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と予め複合体化されたｈＧＰ１３０－ＭＭＨへのｍＡｂ－２結合の応答を比較し、表１４に示すとおり、各種抗ＧＰ１３０モノクローナル抗体の競合／非競合挙動を判定した。
【0160】
（表１４）抗GP130モノクローナル抗体間のクロス競合
【0161】
実施例６： Ｌｕｍｉｎｅｘ－ＧＰ１３０デルタＤ１－ｍｍＨおよびＧＰ１３０デルタＤ１－３－ｍｍＨ ＣＨＯ上清におけるＧＰ１３０ドメインタンパク質に結合するモノクローナル抗体
本発明の抗ＧＰ１３０抗体が相互作用するヒトＧＰ１３０の結合領域を特定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦＬＥＸＭＡＰ（ＦＭ３ＤＤ，ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ）フローサイトメトリーベースの分析を利用して、組み換えヒトＧＰ１３０タンパク質ドメインの相互作用を特徴付けた。アッセイについては、約３００万のカルボキシル化されたマイクロプレックスＲ マイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｃａｔ＃ ＬＣ１０００Ａ）を洗浄し、渦動し、０．１ Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ ６．２（活性化緩衝液）で超音波で分解し、次に遠心分離して上清を除去した。マイクロスフェアを１２０μＬの活性化緩衝液に再懸濁し、５０ｍｇ／ｍＬのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ＃ ２４５００）を１５μＬを加えることによって、カルボキシレート基（－ＣＯＯＨ）が活性化された、次に２５℃で、５０ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ ２２９８０）を１５μＬ加えた。１０分後に５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５（カップリング緩衝液）の６００μＬを加えることによって、反応のｐＨを５．０に減少させ、マイクロスフェアは渦動され遠心分離で上清を除去された。活性化されたビーズを、カップリング緩衝液中で、マウスＩｇＧを有する２０μｇ／ｍＬモノクローナル抗ｍｙｃ抗体の５００μＬと直ちに混合し、２５℃で二時間インキュベートした。１Ｍ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を５０μＬ加えて、カップリング反応をクエンチし、マイクロスフェアを急速に渦動し、遠心分離し、１ｍＬのダルベッコの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃１４１９０１３６）で四回洗浄し、脱共役タンパク質およびその他の反応成分を除去した。
本発明の抗ＧＰ１３０抗体が相互作用するヒトＧＰ１３０の結合領域を特定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦＬＥＸＭＡＰ（ＦＭ３ＤＤ，ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ）フローサイトメトリーベースの分析を利用して、組み換えヒトＧＰ１３０タンパク質ドメインの相互作用を特徴付けた。アッセイについては、約３００万のカルボキシル化されたマイクロプレックスＲ マイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｃａｔ＃ ＬＣ１０００Ａ）を洗浄し、渦動し、０．１ Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ ６．２（活性化緩衝液）で超音波で分解し、次に遠心分離して上清を除去した。マイクロスフェアを１２０μＬの活性化緩衝液に再懸濁し、５０ｍｇ／ｍＬのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ＃ ２４５００）を１５μＬを加えることによって、カルボキシレート基（－ＣＯＯＨ）が活性化された、次に２５℃で、５０ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ ２２９８０）を１５μＬ加えた。１０分後に５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５（カップリング緩衝液）の６００μＬを加えることによって、反応のｐＨを５．０に減少させ、マイクロスフェアは渦動され遠心分離で上清を除去された。活性化されたビーズを、カップリング緩衝液中で、マウスＩｇＧを有する２０μｇ／ｍＬモノクローナル抗ｍｙｃ抗体の５００μＬと直ちに混合し、２５℃で二時間インキュベートした。１Ｍ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を５０μＬ加えて、カップリング反応をクエンチし、マイクロスフェアを急速に渦動し、遠心分離し、１ｍＬのダルベッコの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃１４１９０１３６）で四回洗浄し、脱共役タンパク質およびその他の反応成分を除去した。
【0162】
Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０デルタＤ１（ヒトＧＰ１３０デルタＤ１－ＭＭＨ、配列番号１９２）およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０デルタＤ１～Ｄ３（ヒトＧＰ１３０デルタＤ１～Ｄ３－ＭＭＨ、配列番号１９３）を含む、一時的に発現させたＧＰ１３０タンパク質は、血清遊離ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ ＃３１０３３０２０）で懸濁させ、次いで遠心分離によって清澄化した。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃヘキサヒスチジンタグ（ヒトＧＰ１３０－ＭＭＨ、配列番号１９１）と共に発現させた精製ＧＰ１３０全長細胞外ドメインを、ＰＢＳ中で１０ｕｇ／ｍＬで調製した。上述のように調製された固定化抗ｍｙｃモノクローナル抗体を有するマイクロスフェアのアリコートを、これらのタンパク質上清の各々の１ｍＬに、および精製されたＧＰ１３０タンパク質の５００ｕＬに、個別に添加した。マイクロスフェアを穏やかに混合し、２５℃で二時間インキュベートし、１ｍＬのＤＢＰＳで二回洗浄し、遠心分離して上清を除去し、最終的に１ｍＬのＤＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。完全長ヒトＧＰ１３０と、ヒトＧＰ１３０ドメインタンパク質の各々との個々の反応から抗ｍｙｃ ＩｇＧにカップリングしたマイクロスフェアの４８μＬを引き出し、３．６ｍＬのＰＢＳ＋２０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋０．０５％のアジ化ナトリウム（遮断緩衝液）中で一緒に混合した。
【0163】
この混合プールから７５μＬのマイクロスフェアが、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＭＳＢＶＮ１２５０）上にウェル当たりで播種され、２５μＬの個々の抗ヒトＧＰ１３０モノクローナル抗体（０．５または５μｇ／ｍＬ）と混合され、２５℃で二時間インキュベートされ、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）を含むＤＰＢＳ２００μＬで、二回洗浄した。個々のマイクロスフェアに対する結合抗ＧＰ１３０抗体レベルの量を検出および定量化するために、遮断緩衝液中の１００μＬの２．５μｇ／ｍＬのいずれかのＲ－フィコエリトリン結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃２０６３～０９）を加え、３０分間２５℃でインキュベートした。３０分後、サンプルを２００μＬの洗浄緩衝液で二回洗浄し、１５０μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。マイクロスフェアの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＬｕｍｉｎｅｘ分析器で測定した。
【0164】
（表１５）ヒトGP130のmycタグ捕捉全長細胞外ドメイン、単離されたヒトGP130デルタD1、およびデルタD1～D3ドメインに結合する抗GP130抗体のLuminex MFIシグナル
【0165】
Ｌｕｍｉｎｅｘベースの分析の結果を表１５に表に示す。Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＦＩシグナル強度は、本発明の２６の抗ＧＰ１３０抗体がヒトＧＰ１３０全長細胞外ドメインに結合したことを示す。
【0166】
抗ＧＰ１３０抗体ｍＡｂ１６６３７、ｍＡｂ１６６４１、ｍＡｂ１６６５６、ｍＡｂ１６６５９、ｍＡｂ１６６６４、ｍＡｂ１６６６５、ｍＡｂ１６６７６、ｍＡｂ１６６８７、およびＭＡｂ１６６９５は、ヒトＧＰ１３０のＤ１ドメイン内の結合エピトープを示唆しつつ、両方の欠失タンパク質への結合を失った。
【0167】
抗ＧＰ１３０抗体ｍＡｂ１６６１４、ｍＡｂ１６６１８、ｍＡｂ１６６２２、ｍＡｂ１６６３６、ｍＡｂ１６６６２、ｍＡｂ１６６６６、ｍＡｂ１６６７３、ｍＡｂ１６６８２、ｍＡｂ１６６９２は、それらの結合エピトープはヒトＧＰ１３０のドメインＤ２～Ｄ３内であることを示しつつ、ＧＰ１３０デルタＤ１への結合を保持する一方で、ＧＰ１３０デルタＤ１～Ｄ３への結合を失った。
【0168】
抗ＧＰ１３０抗体ｍＡｂ１６６２３、ｍＡｂ１６６４６、ｍＡｂ１６６６９、ｍＡｂ１６６８０、ｍＡｂ１６６８３、ｍＡｂ１６６８４、ｍＡｂ１６６９３、ｍＡｂ１６７０２は、それらの結合ドメインはヒトＧＰ１３０のＦＮＩＩＩ内であることを示しつつ、ＧＰ１３０デルタＤ１に、およびＧＰ１３０デルタＤ１～Ｄ３に結合した。
【0169】
実施例７： リガンドを伴わない、あるいはｈオンコスタチンＭ、ｈＬＩＦ、またはｈＣＮＴＦを伴うＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞における機能的細胞ベースアッセイ
抗ＧＰ１３０抗体の転写活性化または阻害を評価するために、ＩＭＲ－３２細胞（ヒト神経芽細胞ＡＴＣＣ）を生成して、ルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に発現させた。結果として得られた細胞株は、以下で、ＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃと呼称される（本明細書の実施例４を参照）。
抗ＧＰ１３０抗体の転写活性化または阻害を評価するために、ＩＭＲ－３２細胞（ヒト神経芽細胞ＡＴＣＣ）を生成して、ルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に発現させた。結果として得られた細胞株は、以下で、ＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃと呼称される（本明細書の実施例４を参照）。
【0170】
バイオアッセイについては、ＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ細胞を、アッセイ緩衝液中（Ｐｅｎ／ＳｔｒｅｐのあるＯｐｔｉｍｅｍ中０．１％ ＦＢＳ）、９６ウェルプレートにおいて、１５，０００細胞／ウェルで播種し、５％ ＣＯ２で、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗ｇｐ１３０抗体またはアイソタイプ対照を、アッセイ緩衝液（試験分子なしで緩衝液単独を含有するサンプルを加えて）中で１００ｎＭ～２４．４ｐＭで連続希釈し、細胞に添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。３０分後、１００ｐＭ ヒトオンコスタチンＭ（ｈＯＳＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２９３－ＯＭ）、２０ｐＭヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７７３４－ＬＦ）、２０ｐＭヒト毛様体神経栄養因子（ｈＣＮＴＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２５７－ＮＴ）、またはアッセイ緩衝液のいずれかを、細胞に添加した。ｈＯＳＭ、ｈＬＩＦ、およびｈＣＮＴＦを、アッセイ緩衝液（試験分子なしで緩衝液単独を含有するサンプルを加えて）中で１０ｎＭ～０．１７ｐＭで連続希釈し、抗体で処置しなかった細胞に添加した。５％ ＣＯ２、３７℃で５時間後、ＯｎｅＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、＃ Ｅ６０３１）、およびＶｉｃｔｏｒ（商標）Ｘマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して解析し、ＥＣ５０、およびＩＣ５０値を得た。抗体の活性化は、ｈＯＳＭによって達成されるＲＬＵの最大範囲にわたって抗体によって達成されるＲＬＵの最大範囲で計算された。以下の方程式を使用して、阻害率をＲＬＵ値で計算した。
【0171】
この方程式では、「ＲＬＵベースライン」は、抗体を含まない一定量のリガンド（ｈＯＳＭ、ｈＬＩＦ、またはｈＣＮＴＦ）で処理された細胞からの発光値である。「ＲＬＵ阻害」は、特定の濃度のリガンドを有する特定の抗体の１００ｎＭを有する発光値であり、「ＲＬＵバックグラウンド」は、いかなるリガンドも抗体もない細胞からの発光値である。
【0172】
表１６に示されるように、本発明の２６個の抗ヒトｇｐ１３０抗体を、ＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞の活性化を活性化する、または阻害するのいずれかの能力について試験した。表１９に示すように、任意の追加されたリガンドが存在しない場合、試験された本発明の抗体は、ＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞のいかなる活性化も示さなかった。本発明の２６個の抗体のうちの一つ、ＭＡｂ１６６９２は、それぞれｈＯＳＭ、ｈＬＩＦ、およびｈＣＮＴＦについての４８ｐＭ、１４０ｐＭ、および２３０ｐＭのＩＣ５０値で試験された三つのリガンド全ての完全阻害を示した。試験された本発明の追加の１０個の抗体は、１７％～９５％の範囲の阻害率を有する、＞１００ｎＭ～８８ｐＭの範囲の阻害抗体についてのＩＣ５０値を有する、少なくとも一つのリガンドへのいくらかの阻害を示した。本発明の１５個の抗体は、試験されたリガンドのいずれにも阻害を示さなかった。アイソタイプ対照抗体は、いかなるＩＭＲ－３２／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ細胞の測定可能な活性化も阻害も実証しなかった。リガンドは、ｈＯＳＭについての５４ｐＭのＥＣ５０値、ｈＬＩＦについての２３ｐＭのＥＣ５０値、およびｈＣＮＴＦについての４ｐＭのＥＣ５０値を有するＩＭＲ－３２／ＳＴＡＴ３－ｌｕｃ細胞を活性化した。
【0173】
（表１６）IMR-32/Stat3-luc細胞におけるGP130リガンドの非存在下または存在下での抗gp130抗体の活性化および阻害
【0174】
実施例８： ＧＰ１３０精製抗体の遮断ＥＬＩＳＡ
ＧＰ１３０（糖タンパク質１３０）は、ＣＮＴＦＲα（毛様体神経向性因子受容体アルファサブユニット）と関連付けられた場合に、リガンド毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）（ｌｉｇａｎｄ ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ）と高親和性三量複合体を形成するＩ型サイトカイン受容体の膜貫通タンパク質である。プレート結合ＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体に対するＧＰ１３０タンパク質結合を遮断する抗ｇｐ１３０抗体の能力を、競合サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。このアッセイでは、様々な濃度の抗ｇｐ１３０抗体を一定量の二量体ＧＰ１３０タンパク質と予混合し、プレート固定化されたＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体に対する抗体の存在によるｇｐ１３０結合の減少をモニタリングした。
ＧＰ１３０（糖タンパク質１３０）は、ＣＮＴＦＲα（毛様体神経向性因子受容体アルファサブユニット）と関連付けられた場合に、リガンド毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）（ｌｉｇａｎｄ ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ）と高親和性三量複合体を形成するＩ型サイトカイン受容体の膜貫通タンパク質である。プレート結合ＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体に対するＧＰ１３０タンパク質結合を遮断する抗ｇｐ１３０抗体の能力を、競合サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。このアッセイでは、様々な濃度の抗ｇｐ１３０抗体を一定量の二量体ＧＰ１３０タンパク質と予混合し、プレート固定化されたＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体に対する抗体の存在によるｇｐ１３０結合の減少をモニタリングした。
【0175】
実験で使用された二量体ｇｐ１３０タンパク質は、ｃ－末端でマウスＩｇＧ２ａタンパク質のＦｃ部分（ｈＧＰ１３０－ｍＦｃ；配列番号１９０、ｍｗ９４，２１０ダルトン）と共に発現させたヒトｇｐ１３０細胞外ドメイン（登録番号ＮＰ＿００２１７５．２のアミノ酸Ｅ２３～Ｅ６１９）の一部から成る。ＣＮＴＦＲαタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された（登録番号６９９２のアミノ酸Ｑ２３～Ｐ３４６、ｍｗ ３６，０００ダルトン）。ＣＮＴＦタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された（登録番号６４４１．１のアミノ酸 Ａ２～Ｍ２００、ｍｗ ２２，８００ダルトン）。アイソタイプ抗体対照、抗Ｆｅｌ ｄ １、およびヒトＩｇＧ４Ｐ抗体は、ＩｇＧバックグラウンド検出の対照として含まれた。
【0176】
実験は以下の手順を使用して実施された。ヒトＣＮＴＦＲαは、４℃で一晩９６ウェルマイクロタイタープレート上のＨＢＳＳ中の濃度２ｍｇ／ｍＬで被覆された。非特異的結合部位は、ＨＢＳＳ中のＢＳＡの１％（ｗ／ｖ）溶液を使用してその後遮断された。ＨＢＳＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度でヒトＣＮＴＦを、室温で１時間、プレート結合ＣＮＴＦＲαに加えた。別個の希釈プレートでは、ヒトＧＰ１３０－ｍＦｃタンパク質の２．５ｎＭの一定量を、連続希釈で３．４ｐＭ～２００ｎＭの範囲の抗体で、および抗体が存在しない状態で、滴定した。これらの溶液を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、その後、洗浄なしでＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体と共にマイクロタイタープレートに移した。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ緩衝液で洗浄し、プレート結合ｈＧＰ１３０－ｍＦｃをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）とコンジュゲートした抗ｍＦｃポリクローナル抗体で検出した。サンプルをＴＭＢ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、基材ＡおよびＢを、メーカーの指示に従って１：１の比で混合）で発色させ、比色反応を生じさせ、次にＶｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダー上で４５０ｎｍで吸光度を測定する前に、１Ｍ硫酸で中和した。
【0177】
プリズム（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）内でのシグモイド用量反応モデルを使用してデータ解析を実施した。ＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦ複合体へのＧＰ１３０結合の５０％を減少するために必要な抗体濃度として定義される、計算されたＩＣ５０値は、遮断効力の指標として使用された。試験された最大濃度での遮断率は、用量曲線から決定されるように、ＧＰ１３０がプレート上のＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦへ結合することを遮断する抗体の能力の指標として計算された。抗体（０％遮断）なしのＧＰ１３０の２．５ｎＭのシグナルと、ＨＲＰ結合二次抗体単独（１００％遮断）からのバックグラウンドシグナルとの間の差に対する、最高試験濃度の２００ｎＭ抗体の存在下で観察されたシグナルの減少の比率は、１００％遮断から減算された。
【0178】
遮断ＥＬＩＳＡの結果を、全抗体に対して報告された２００ｎＭ抗体の存在下での遮断率で表１７に示す。ＩＣ５０値は、ＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦへのＧＰ１３０結合の＞３０％を遮断する抗体についてのみ報告されている。２６個のＧＰ１３０抗体のうち１９個が、プレートコートされたＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦに結合するＧＰ１３０タンパク質の＜３０％を遮断する。陰性数は、抗体の存在下で検出されたＧＰ１３０結合の増加を示す。７個の抗体が、ＣＮＴＦＲα／ＣＮＴＦに対するＧＰ１３０タンパク質結合を＞３０％遮断し、およびＩＣ５０値は、１．２５ｎＭ～６．５ｎＭのアッセイの定量化の下限より下からの範囲を示し、それらのうちの四つは試験された最も高い抗体濃度での９０％以上のシグナルを遮断した。無関連な遮断対照抗体は、最大２００ｎＭの濃度で４．５％の遮断を示した。
【0179】
（表１７）GP130精製抗体の遮断ELISA
この実施例では、100%遮断は、GP130なしのOD450nm値HRP結合二次抗体と等しい。
0%遮断は、抗体を含まない2.5nM hGP130-mFcで、OD450nm値である。
負の最大遮断%は、抗体の存在下で検出されたGP130結合の増加を示す。
-IC50値は、試験された最高濃度で<30%遮断する抗体の定量的なものではない。
*は、アッセイに対して1.25E～09Mの定量化の下限より下のIC50値を示す。
0%遮断は、抗体を含まない2.5nM hGP130-mFcで、OD450nm値である。
負の最大遮断%は、抗体の存在下で検出されたGP130結合の増加を示す。
-IC50値は、試験された最高濃度で<30%遮断する抗体の定量的なものではない。
*は、アッセイに対して1.25E～09Mの定量化の下限より下のIC50値を示す。
【0180】
実施例９： ＬＥＰＲｘＧＰ１３０を焦点にアプローチする二重特異性スクリーニング
本実施例は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の促進についてＬＥＰＲとＧＰ１３０との両方に結合する二重特異性抗体の生成について説明する。このような抗体は、本明細書では、「ＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体」または「ＬＥＰＲ×ＧＰ１３０ ｂｓＡｂ」、「抗ＬＥＰＲ×抗ＧＰ１３０二重特異性抗体」またはこれに類するものと呼称される。本実施例において、いくつかの抗ＧＰ１３０結合アームは、四つの異なる抗ＬＥＰＲ結合アームとペアリングされた。本実施例の二重特異性抗体を構築するために使用される抗ＬＥＰＲ抗体は、ｍＡｂ１６６７９、ｍＡｂ１８４４５、ｍＡｂ１８４４６およびｍＡｂ１８４４９と呼称されるアゴニスト抗体である（米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７７号を参照されたい、当該開示は参照によりその全体が本明細書に援用される）。本実施例において使用される、抗ＬＥＰＲ抗体の可変ドメインおよびＣＤＲのアミノ酸配列および核酸配列を、それぞれ表１８および１９にまとめる。
本実施例は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達の促進についてＬＥＰＲとＧＰ１３０との両方に結合する二重特異性抗体の生成について説明する。このような抗体は、本明細書では、「ＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体」または「ＬＥＰＲ×ＧＰ１３０ ｂｓＡｂ」、「抗ＬＥＰＲ×抗ＧＰ１３０二重特異性抗体」またはこれに類するものと呼称される。本実施例において、いくつかの抗ＧＰ１３０結合アームは、四つの異なる抗ＬＥＰＲ結合アームとペアリングされた。本実施例の二重特異性抗体を構築するために使用される抗ＬＥＰＲ抗体は、ｍＡｂ１６６７９、ｍＡｂ１８４４５、ｍＡｂ１８４４６およびｍＡｂ１８４４９と呼称されるアゴニスト抗体である（米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７７号を参照されたい、当該開示は参照によりその全体が本明細書に援用される）。本実施例において使用される、抗ＬＥＰＲ抗体の可変ドメインおよびＣＤＲのアミノ酸配列および核酸配列を、それぞれ表１８および１９にまとめる。
【0181】
（表１８）抗LEPRアミノ酸配列識別名
【0182】
（表１９）抗LEPR核酸配列識別名
【0183】
１８個の二重特異性抗体を、ｍＡｂ１６６７９からの抗ＬＥＰＲ結合アームを１８個の異なる抗ＧＰ１３０抗体からの結合アームとペアリングさせることによって生成した。６個の追加の二重特異性抗体を、抗ＬＥＰＲ抗体ｍＡｂ１８４４９、ｍＡｂ１８４４５、およびｍＡｂ１８４４６からの結合アームを抗ＧＰ１３０結合アームとペアリングさせることによって生成した。本明細書に記載される二重特異性抗体を産生するために標準的方法を使用した。本実施例に示されるすべてのＬＥＰＲｘ ＧＰ１３０二重特異性抗体は、同一（「共通の」）軽鎖（配列番号１０の軽鎖可変領域［ＬＣＶＲ］アミノ酸配列、および配列番号１２、１４および１６の軽鎖ＣＤＲ［ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３］アミノ酸配列を含む）を含む。本実施例の二重特異性抗体の成分を、表２０に要約する。
【0184】
（表２０）LEPR×GP130二重特異性抗体成分の概要
【0185】
実施例１０： ２５℃および３７℃で測定された各種ＧＰ１３０反応部に結合する抗ＬＥＰＲｘ抗ＧＰ１３０二重特異性抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合動態
精製された抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体に結合するＬＥＰＲ、およびＧＰ１３０についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００機器を使用して、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニング緩衝液中、２５℃および３７℃で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーの表面を、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ，＃ ＢＲ－１００８－３９）を用いたアミンカップリングによって誘導体化し、抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体を捕捉した。以下の反応部で結合試験を行った：Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ；配列番号１８７）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍｆＬＥＰＲ－ＭＭＨ；配列番号１８８）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ＭＭＨ；配列番号１９１）、およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨ；配列番号１９４）。異なる濃度のＬＥＰＲまたはＧＰ１３０反応部を、まずＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で調製し（１００ｎＭ～３．７ｎＭ；３倍連続希釈）、抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体表面に捕捉された抗ヒトＦｃの上に、流速３０μＬ／分で４分間注入し、その間に、ＬＥＰＲ、またはＧＰ１３０反応部に結合した二重特異性抗体の解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で１０分間モニタリングした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃカーブフィッティングソフトウェアを使用して、質量輸送限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を用いてリアルタイム結合センサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングさせることによって、動態速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動力学的速度定数から以下のように計算した。
精製された抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体に結合するＬＥＰＲ、およびＧＰ１３０についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００機器を使用して、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニング緩衝液中、２５℃および３７℃で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーの表面を、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ，＃ ＢＲ－１００８－３９）を用いたアミンカップリングによって誘導体化し、抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体を捕捉した。以下の反応部で結合試験を行った：Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ；配列番号１８７）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍｆＬＥＰＲ－ＭＭＨ；配列番号１８８）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたヒトＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ＭＭＨ；配列番号１９１）、およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現させたカニクイザルＧＰ１３０細胞外ドメイン（ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨ；配列番号１９４）。異なる濃度のＬＥＰＲまたはＧＰ１３０反応部を、まずＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で調製し（１００ｎＭ～３．７ｎＭ；３倍連続希釈）、抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体表面に捕捉された抗ヒトＦｃの上に、流速３０μＬ／分で４分間注入し、その間に、ＬＥＰＲ、またはＧＰ１３０反応部に結合した二重特異性抗体の解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で１０分間モニタリングした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃカーブフィッティングソフトウェアを使用して、質量輸送限界（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を用いてリアルタイム結合センサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングさせることによって、動態速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動力学的速度定数から以下のように計算した。
【0186】
２５℃および３７℃での本発明の各種抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体に結合するｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ、ｍｆＬＥＰＲ－ＭＭＨ、ｈＧＰ１３０－ＭＭＨ、またはｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨについての結合動態パラメータを、表２１から表２８に示す。
【0187】
（表２１）25℃での抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するhLEPR-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0188】
（表２２）37℃での抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するhLEPR-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
【0189】
２５℃では、表２１に示すように、抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体が、５．９１ｎＭ～１０６ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表２２に示すように、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体が、１６．２ｎＭ～７２６ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨに結合した。
【0190】
（表２３）25℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するmfLEPR-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の3倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の3倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0191】
（表２４）37℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するmfLEPR-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0192】
２５℃では、表２３に示すように、２２個中２１個の本発明の抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体が、２．６３ｎＭ～５８３ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｍｆＬＥＰＲ－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表２４に示すように、２２個中２０個の本発明の抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体が、５．０５ｎＭ～２８４ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｍｆＬＥＰＲ－ＭＭＨに結合した。
【0193】
（表２５）25℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するhGP130-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0194】
（表２６）37℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するhGP130-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0195】
２５℃では、表２５に示すように、２２個中１７個の本発明の抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体が、４４８ｐＭ～２１９ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表２６に示すように、２２個中１７個の本発明の抗ＬＥＰＲ／ＧＰ１３０二重特異性抗体が、９０１ｐＭ～３５８ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。
【0196】
（表２７）25℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するmfGP130-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0197】
（表２８）37℃における抗LEPR/GP130二重特異性抗体に結合するmfGP130-MMHの結合動態パラメータ
*NBは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
#ICは、観察された結合シグナルが、アイソタイプ対照抗体表面について観察された非特異的結合に対して、上記の三倍未満であったこと、および／またはデータは結合動態パラメータを測定するために使用できないことを示す。
【0198】
２５℃では、表２７に示すように、２２個中１７個の本発明のＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体が、５１３ｐｎＭ～１８８ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。３７℃では、表２８に示すように、２２個中１６個の本発明のＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体が、９５９ｐＭ～４５０ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｍｆＧＰ１３０－ＭＭＨに結合した。
【0199】
実施例１１： ＦＡＣＳ分析により測定されたＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体細胞結合
ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体による細胞結合を評価するために、ＨＥＫ２９３安定細胞株が生成された。一つの細胞株を完全長のヒトＧＰ１３０（バリンに変化する位置２でロイシンを有する登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８、天然バリアント）が、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に安定的に過剰発現するように生成され、ＧＰ１３０の高発現のためのフローサイトメトリーを使用して二回ソートした。この細胞株は、以後「ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソート」と呼称される。本実施例で使用される別の細胞株は、以後「ＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ」として知られており、タンパク質が膜に対してＧＰＩアンカーされることができるように、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）を付加することを導く、ヒトカルボキシペプチダーゼＭからＮ末端ｍｙｃ－ｍｙｃタグ、およびＣ末端ペプチド配列と共にヒトＬＥＰＲの細胞外ドメイン（登録番号Ｐ４８３５７のアミノ酸２２～８３９、アイソフォームＢ）を安定的に発現する。
ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体による細胞結合を評価するために、ＨＥＫ２９３安定細胞株が生成された。一つの細胞株を完全長のヒトＧＰ１３０（バリンに変化する位置２でロイシンを有する登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８、天然バリアント）が、ルシフェラーゼレポーター（Ｓｔａｔ３－ルシフェラーゼ、Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に安定的に過剰発現するように生成され、ＧＰ１３０の高発現のためのフローサイトメトリーを使用して二回ソートした。この細胞株は、以後「ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソート」と呼称される。本実施例で使用される別の細胞株は、以後「ＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ」として知られており、タンパク質が膜に対してＧＰＩアンカーされることができるように、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）を付加することを導く、ヒトカルボキシペプチダーゼＭからＮ末端ｍｙｃ－ｍｙｃタグ、およびＣ末端ペプチド配列と共にヒトＬＥＰＲの細胞外ドメイン（登録番号Ｐ４８３５７のアミノ酸２２～８３９、アイソフォームＢ）を安定的に発現する。
【0200】
ＦＡＣＳ分析については、ＨＥＫ２９３親細胞、ＨＥＫ２９３／Ｓｔａｔ３－ｌｕｃ／ｇｐ１３０－２Ｘソート細胞、およびＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ細胞の０．５×１０６細胞／ウェルを、ＧＰ１３０またはＬＥＰＲのいずれかに対する、あるいはＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体と共に２００ｎＭの従来的抗体と共に、アイソタイプ対照抗体と共に、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中（カルシウムおよびマグネシウムなし）で４℃でインキュベートした。
【0201】
細胞に対する、抗ＬＥＰＲ抗体結合またはＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体結合が、レプチンの存在によって影響を受けたかどうかを試験するために、１μＭ ヒトレプチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８－ＬＰ）を細胞と共に３０分間インキュベートし、次に抗ＬＥＰＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体を添加した。一次抗体を用いたインキュベーション後、細胞を８ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、＃１０９－６０７－００３）で３０分間染色した。細胞は、ＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘＴＭ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃ ５５４６５５）を使用して固定され、ＩＱｕｅ（登録商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）フローサイトメーターで分析された。未染色および二次抗体単独の対照もまた、すべての細胞株に対して試験された。生細胞に対する蛍光の幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎｓ）を決定するために、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）、およびＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒｓｉｏｎ １０ソフトウェアを使用して結果を分析した。
【0202】
表２９に示されるように、２００ｎＭで試験した本発明の二個のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体は、ＨＥＫ２９３／ｇｐ１３０ ２Ｘソート細胞に結合比１３２倍および１６９倍で、ならびにＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ細胞にレプチンなしで結合比４４２３倍および６３２０倍で、１μＭのレプチンの存在下で３５９６倍および５９３２倍で結合することを示した。従来的抗体（ｍＡｂ１６６８３）として作製された本発明の二重特異性抗体のＧＰ１３０結合アームは、ＨＥＫ２９３／ｇｐ１３０ ２Ｘソート細胞に結合比２３５倍で、およびＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ細胞に結合比２１倍で結合することを示した。従来的抗体として作製された、二重特異性のＬＥＰＲ結合アーム（ｍＡｂ１８４４５およびｍＡｂ１８４４６）は、ＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ－ＧＰＩ細胞にレプチンなしで結合比４７１１倍および７０２３倍で、ならびに１μＭのレプチンの存在下で結合比４２４６倍および６３９０倍で結合することを示した。抗ＧＰ１３０および抗ＬＥＰＲの従来的抗体および二重特異性抗体は、３～２４倍の範囲の結合比でＨＥＫ２９３親細胞への結合を示した。アイソタイプ対照抗体、および二次抗体単独サンプルも、レプチンの有り無しで、結合比１～３倍の範囲で試験された細胞株のいずれに対しても有意な結合を示さなかった。
【0203】
（表２９）FACSによって評価された細胞への抗体結合
【0204】
実施例１２： 機能的細胞ベースのアッセイ
サイトカイン受容体ＧＰ１３０（登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８）およびＬＥＰＲ（登録番号Ｐ４８３５７のアミノ酸１～１１６５）は、細胞質ドメインの膜近位領域に結合して非共有結合型チロシンキナーゼ、ＪＡＫ２を有する。同族リガンドまたはアゴニスト抗体を用いた処置は、ＪＡＫ２の活性化において最高度に達し、これは次に受容体の細胞質領域上のキーチロシン残基をリン酸化する。リン酸化チロシン残基は、リン酸化に伴いＳＴＡＴ３およびＥＲＫなどのシグナル伝達経路の刺激につながるシグナル伝達複合体のためのドッキング部位として機能する。ＬＥＰＲについては、チロシン残基Ｙ１１４１はＳＴＡＴ３シグナル伝達を媒介し、この残基のフェニルアラニン（Ｙ１１４１Ｆ）への突然変異はＳＴＡＴ３シグナル伝達を除去する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６０６１～６０６６）。
サイトカイン受容体ＧＰ１３０（登録番号Ｐ４０１８９のアミノ酸１～９１８）およびＬＥＰＲ（登録番号Ｐ４８３５７のアミノ酸１～１１６５）は、細胞質ドメインの膜近位領域に結合して非共有結合型チロシンキナーゼ、ＪＡＫ２を有する。同族リガンドまたはアゴニスト抗体を用いた処置は、ＪＡＫ２の活性化において最高度に達し、これは次に受容体の細胞質領域上のキーチロシン残基をリン酸化する。リン酸化チロシン残基は、リン酸化に伴いＳＴＡＴ３およびＥＲＫなどのシグナル伝達経路の刺激につながるシグナル伝達複合体のためのドッキング部位として機能する。ＬＥＰＲについては、チロシン残基Ｙ１１４１はＳＴＡＴ３シグナル伝達を媒介し、この残基のフェニルアラニン（Ｙ１１４１Ｆ）への突然変異はＳＴＡＴ３シグナル伝達を除去する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６０６１～６０６６）。
【0205】
ＬＥＰＲｘＧＰ１３０ｂｓＡｂでの処置後のＧＰ１３０およびＬＥＰＲヘテロ二量体化の促進を介したＳＴＡＴ３の転写活性化を検出するために、バイオアッセイを開発した。特に、突然変異体であるヒトＬＥＰＲ（Ｙ１１４１Ｆ）および野生型ヒトＧＰ１３０を安定的に発現するレポーター細胞株を、ＳＴＡＴ３応答ルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ、Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に生成した。ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（Ｙ１１４１Ｆ）と呼称される、結果として得られる安定細胞株を、１０％ＦＢＳ、１ｕｇ／ｍＬピューロマイシン、２５０ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ、５００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥ培地中で単離し、維持した。二個のＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体を、このバイオアッセイ、ｂｓＡｂ２１２３６、およびｂｓＡｂ２１２３７で特定し、これはレプチンの存在下でＳＴＡＴ３活性を促進した。
【0206】
バイオアッセイについては、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（Ｙ１１４１Ｆ）細胞を密度２０，０００細胞／ウェルで播種し、次いで翌日培地を１％ＢＳＡと０．１％ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）で補充した８０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで置換した。続いて、１０ｕＬの固定濃度１０ｎＭのヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８－ＬＰ－０１Ｍ）をウェルに加えた。ｈＬｅｐｔｉｎ処理の直後に、二重特異性抗体は、アッセイ緩衝液中で５００ｎＭ～５ｐＭの範囲の最終濃度まで半対数連続希釈され（１２点）、次いで細胞に加えられた。アイソタイプ対照およびヒトＯＳＭ（ｈＯＳＭ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２９５－ＯＭ／ＣＦ）は、アッセイ緩衝液中で１００ｎＭ～１ｐＭの範囲の最終濃度まで半対数希釈され（１１点）、次いで細胞に追加された。次いで、プレートを、インキュベーター内に、５％ ＣＯ２で３７℃で一晩配置した。次いで、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）をサンプルに加え、発光モードでＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でルシフェラーゼ活性を測定した。相対光単位（ＲＬＵ）値を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で非線形回帰を用いて結果を分析した。ｈＯＳＭ用量反応から得られた最大ＲＬＵ値は、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬｅｐＲ（Ｙ１１４１Ｆ）細胞ベースアッセイで１００％の活性化として定義された。
【0207】
ＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達を介して活性化するためのＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体の能力は、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ｇｐ１３０．ｈＬｅｐＲ（Ｙ１１４１Ｆ）細胞ベースアッセイで評価された。結果として得られるＥＣ５０値および活性化率を表３０に示す。細胞株の反応性をｈＯＳＭの用量反応を使用して確認した。これは５９２ｐＭのＥＣ５０値でアッセイにおける活性化を示した。試験されたＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体、ｂｓＡｂ２１２３６およびｂｓＡｂ２１２３７の両方で、このアッセイにおいてそれぞれ２．１１ｎＭ、および２．４６ｎＭのＥＣ５０値で活性化が示された。両二重特異性抗体は、ｈＯＳＭで観察された最大活性化の約２０％を有する。
【0208】
（表３０）LEPRxGP130二重特異性抗体によるHEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR（Y1141F）細胞株の活性化
【0209】
ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（Ｙ１１４１Ｆ）細胞ベースのアッセイにおけるＬＥＰＲｘＧＰ１３０の二重特異性抗体による活性化が、ＬＥＰＲおよびＧＰ１３０両方を介して活性化されることによるということを確認するために、二重特異性抗体による活性化を遮断するための可溶性ＬＥＰＲ及びＧＰ１３０タンパク質を用いて、競合バイオアッセイを行った。競合バイオアッセイは、Ｃ末端ｈＦｃタグを有するヒトＬＥＰＲの細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ－ｈＦｃ；配列番号１８９）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有するヒトＬＥＰＲの細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ；配列番号１８７）、Ｃ末端ｈＦｃタグを有するヒトＧＰ１３０の細胞外ドメイン（ｈＧＰ１３０－ｈＦｃ；配列番号１９７）、およびＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有するヒトＣＮＴＦＲの細胞外ドメイン（ｈＣＮＴＦＲ－ＭＭＨ；配列番号１９８）の過剰な固定濃度５００ｎＭを使用した。
【0210】
アッセイについては、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（Ｙ１１４１Ｆ）細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、次いで翌日培地を１％ＢＳＡおよび０．１％ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）で補充した７０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで置換した。１０ｕＬの固定濃度１０ｎＭのヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃３９８－ＬＰ－０１Ｍ）をウェルに添加した。ｈＬｅｐｔｉｎ処理の直後に、アッセイ緩衝液中の１０ｎＭの二重特異性抗体を細胞に添加した。直後に、過剰な量、５００ｎＭ、の可溶性タンパク質ｈＬＥＰＲ－ｈＦｃ、ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ、ｈＧＰ１３０－ｈＦｃ、およびｈＣＮＴＦＲ－ＭＭＨを適切な指定されたウェルに添加した。次いで、プレートを、インキュベーター内に、５％ ＣＯ２で３７℃で一晩配置した。次いで、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）をサンプルに加え、発光モードでＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でルシフェラーゼ活性を測定した。相対光単位（ＲＬＵ）値を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて結果を分析した。
【0211】
競合アッセイ結果により、可溶性ｈＬＥＰＲ－ｈＦｃ、ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨおよびｈＧＰ１３０－ｈＦｃが二重特異性抗体活性を遮断することができたが、可溶性ｈＣＮＴＦＲ．ｍｍｈは二重特異性抗体の活性を遮断しなかったことを実証した。二重特異性抗体のみの活性は１００％と定義されているが、アイソタイプ対照の活性は０％の活性を表す。
【0212】
以下の表３１は、可溶性ヒトＬＥＰＲ、ＧＰ１３０およびＣＮＴＦＲの存在下の二重特異性抗体によるＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ細胞の活性化を示す。表３２は、ｈＬＥＰＲ－ＭＭＨ、ｈＬＥＰＲ－ｈＦｃ、ｈＧＰ１３０－ｈＦｃまたはｈＣＮＴＦＲ－ＭＭＨの存在下のＲＬＵ産生を示す。
【0213】
（表３１）可溶性ヒトLEPR、GP130、及びCNTFRの存在下でのLEPRx GP130二重特異性抗体によるHEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR（Y1141F）細胞の活性化
【0214】
（表３２）可溶性ヒトLEPR、GP130、及びCNTFRの存在下でのLEPRx GP130二重特異性抗体によるHEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR（Y1141F）細胞の活性化
【0215】
実施例１３： 食餌誘発性肥満マウスにおけるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体ｂｓＡｂ２１２３６およびｂｓＡｂ２１２３７のインビボ有効性
体重に対する本発明の二個のＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体、ｂｓＡｂ２１２３６およびｂｓＡｂ２１２３７の効果を、マウスＬＥＰＲ細胞外ドメイン配列の代わりにヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン配列で構成されるレプチン受容体、およびマウスＩＬ６ＳＴ細胞外ドメイン配列の代わりにヒトＩＬ６ＳＴ細胞外ドメイン配列で構成されるＧＰ１３０タンパク質を発現する、高脂肪食を与えられた肥満ＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕ；ＩＬ６ＳＴＨｕ／Ｈｕマウスを使ってインビボモデルで判定した。
体重に対する本発明の二個のＬＥＰＲ×ＧＰ１３０二重特異性抗体、ｂｓＡｂ２１２３６およびｂｓＡｂ２１２３７の効果を、マウスＬＥＰＲ細胞外ドメイン配列の代わりにヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン配列で構成されるレプチン受容体、およびマウスＩＬ６ＳＴ細胞外ドメイン配列の代わりにヒトＩＬ６ＳＴ細胞外ドメイン配列で構成されるＧＰ１３０タンパク質を発現する、高脂肪食を与えられた肥満ＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕ；ＩＬ６ＳＴＨｕ／Ｈｕマウスを使ってインビボモデルで判定した。
【0216】
０日目に、１２週間高脂肪食餌を与えられた２３匹のオスのＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕ；ＩＬ６ＳＴＨｕ／Ｈｕマウスを、体重に基づいて７～８匹のマウスからなる三つの群に無作為化した。０日目および７日目に、各群は、３０ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照抗体、３０ｍｇ／ｋｇでｂｓＡｂ２１２３６、または３０ｍｇ／ｋｇでｂｓＡｂ２１２３７のいずれかの用量を皮下注射により受けた。使用されたアイソタイプ対照抗体は、いずれの既知のマウスタンパク質にも結合しない。各マウスの体重を試験期間について毎日測定した。０日目からの体重の変化率は、測定された時点ごとに各動物に対して計算された。図１は、各処置群における動物の体重の平均変化率をまとめたものである。すべての結果は、平均±ＳＥＭとして表される。
【0217】
図１に示されるように、３０ｍｇ／ｋｇのｂｓＡｂ２１２３６で処置したＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕ；ＩＬ６ＳＴＨｕ／Ｈｕマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体治療の三日後に始まった体重量パーセント変化における有意な減少、および測定された他のその後の時点での体重量パーセント変化における有意な減少を示した。３０ｍｇ／ｋｇのｂｓＡｂ２１２３７で処置したＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕ；ＩＬ６ＳＴＨｕ／Ｈｕマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して、抗体治療の五日後に始まった体重量パーセント変化における有意な減少、および測定された他のその後の時点での体重量パーセント変化における有意な減少を示した。
【0218】
実施例１４： ＬＥＰＲｘＧＰ１３０ ｂｓＡｂでの処置後のＧＰ１３０およびＬＥＰＲ（短い形態）ヘテロ二量体化の促進を介したＳＴＡＴ３の転写活性化
ＧＰ１３０は、複数のサイトカインの共受容体に貢献し、ヒト組織で広く発現されている（Ｔａｇａ Ｔ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．ｇｐ１３０ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１５：７９７～８１９）。ＬＥＰＲのアイソフォームは、代替的スプライシングを介して生成され、それによって、最も高く最も広範な発現パターンを示すアイソフォームａ（ＬＥＰＲ－ａ）を含む、長いアイソフォームｂ（ＬＥＰＲ－ｂ）といくつかの短い形態とが生じる（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ＬＡ．Ｔｈｅ ｌｅｐｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：６０９３～６０９６）。すべてのアイソフォームは、同じ細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびボックス１領域を含む細胞質ドメインの短い区間を共有し、その後可変領域が続く。長い形態は、レプチンの全シグナル伝達能力を媒介するために必要な細胞内配列モチーフを含み、短い形態はこれらの領域を欠いている。短い形態の細胞外ドメインはシグナル伝達能力の高い長い形態と同一であるため、二重特異性抗体は短い形態に結合し、ＧＰ１３０と複合体を生成することができる。一般的なＬＥＰＲアゴニストの主要な意図標的組織（ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む）は、ＬＥＰＲアイソフォームｂが主に発現される脳である。しかしながら、ＧＰ１３０の広範囲な発現およびＬＥＰＲのアイソフォームを考慮すると、肝臓などの組織における不必要なＳＴＡＴ３活性化の可能性が存在する。
ＧＰ１３０は、複数のサイトカインの共受容体に貢献し、ヒト組織で広く発現されている（Ｔａｇａ Ｔ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．ｇｐ１３０ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；１５：７９７～８１９）。ＬＥＰＲのアイソフォームは、代替的スプライシングを介して生成され、それによって、最も高く最も広範な発現パターンを示すアイソフォームａ（ＬＥＰＲ－ａ）を含む、長いアイソフォームｂ（ＬＥＰＲ－ｂ）といくつかの短い形態とが生じる（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ＬＡ．Ｔｈｅ ｌｅｐｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：６０９３～６０９６）。すべてのアイソフォームは、同じ細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびボックス１領域を含む細胞質ドメインの短い区間を共有し、その後可変領域が続く。長い形態は、レプチンの全シグナル伝達能力を媒介するために必要な細胞内配列モチーフを含み、短い形態はこれらの領域を欠いている。短い形態の細胞外ドメインはシグナル伝達能力の高い長い形態と同一であるため、二重特異性抗体は短い形態に結合し、ＧＰ１３０と複合体を生成することができる。一般的なＬＥＰＲアゴニストの主要な意図標的組織（ＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗原結合分子を含む）は、ＬＥＰＲアイソフォームｂが主に発現される脳である。しかしながら、ＧＰ１３０の広範囲な発現およびＬＥＰＲのアイソフォームを考慮すると、肝臓などの組織における不必要なＳＴＡＴ３活性化の可能性が存在する。
【0219】
ＬＥＰＲの短いアイソフォームａおよびＧＰ１３０の複合体から生じるシグナル伝達結果を評価するために、バイオアッセイを開発して、ＬＥＰＲｘＧＰ１３０ｂｓＡｂでの処置後の、ＧＰ１３０およびＬＥＰＲ（短い形態）ヘテロ二量体化の促進を介したＳＴＡＴ３の転写活性化を検出した。特に、ｈＬＥＰＲ（ａ）と呼称されるＬＥＰＲ（ＮＰ＿００１００３６７９．１）の優性の短い形態および野生型ヒトＧＰ１３０を安定的に発現するレポーター細胞株を、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼレポーター（ＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ、Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）と共に生成した。ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（ａ）と呼称される、結果として得られる安定細胞株を、１０％ＦＢＳ、１ｕｇ／ｍＬピューロマイシン、２５０ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ、５００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥ培地中で単離し、維持した。
【0220】
バイオアッセイについては、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（ａ）細胞を密度２０，０００細胞／ウェルで播種し、次いで翌日培地を１％ＢＳＡと０．１％ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）で補充した８０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで置換した。続いて、１０ｕＬの固定濃度１０ｎＭのヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８－ＬＰ－０１Ｍ）をウェルに加えた。ｈＬｅｐｔｉｎ処理の直後に、二重特異性抗体は、アッセイ緩衝液中で５００ｎＭ～５ｐＭの範囲の最終濃度まで半減期希釈され（１２点）、次いで細胞に加えられた。対照として、ヒトレプチンおよびＯＳＭ（ｈＯＳＭ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２９５－ＯＭ／ＣＦ）は、アッセイ緩衝液中で１００ｎＭ～１ｐＭの範囲の最終濃度まで半対数希釈され（１１点）、次いで細胞に追加された。次いで、プレートを、インキュベーター内に、５％ ＣＯ２で３７℃で一晩配置した。次いで、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）をサンプルに加え、発光モードでＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でルシフェラーゼ活性を測定した。相対光単位（ＲＬＵ）値を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で非線形回帰を用いて結果を分析した。ｈＯＳＭ用量反応から得られた最大ＲＬＵ値は、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ＧＰ１３０．ｈＬＥＰＲ（ａ）細胞ベースアッセイで１００％の活性化として定義された。
【0221】
ＧＰ１３０媒介細胞シグナル伝達を介して活性化するためのＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体の能力は、ＨＥＫ２９３．ＳＴＡＴ３．Ｌｕｃ．ｇｐ１３０．ｈＬＥＰＲ（ａ）細胞ベースアッセイで評価された。結果として得られた反応を表３３に示す。細胞株の応答性をｈＯＳＭの用量応答を使用して確認し、これは１２１ｐＭのＥＣ５０値でアッセイにおける活性化を示した、そしてその最大応答を１００％活性化と指定した。試験されたＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体、ｂｓＡｂ２１２３６およびｂｓＡｂ２１２３７の両方で、ＬＥＰＲ（ａ）を用いたＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化できなかった。レプチンと同様に、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＬＥＰＲの長い形態を含有する細胞タイプでのみ生産的なＳＴＡＴ３シグナル伝達を生成する。
【0222】
（表３３）LEPRxGP130二重特異性抗体によるHEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR（a）細胞株の活性化
【0223】
まとめると、データは、本明細書に提供されるＬＥＰＲｘＧＰ１３０二重特異性抗体は、レプチン受容体（ＬＥＰＲ－ａアイソフォーム）の「短い形態」を通してシグナル伝達を活性化しないが、レプチン受容体（ＬＥＰＲ－ｂアイソフォーム）の「長い形態」を通してシグナル伝達を活性化することを示している。この所見の関連性は、これらの二重特異性抗体が主に、「ｂ」アイソフォームが主に発現されている脳内で活性を発揮することを示唆するが、「ａ」形態が広範囲に発現される肝臓などの他の組織では活性を発揮しないことが示唆されている。これらの二重特異性抗体を脳内でのＬＥＰＲシグナル伝達を活性化することにより肥満を治療するために使用できると仮定すると、この作業は、本明細書において提供される二重特異性抗体が、体内のあらゆる箇所（例えば炎症性肝細胞腺腫の肝臓など、（Ｒｅｂｏｕｉｓｓｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５７（８）：２００～２０５，２００９を参照））での不必要なシグナル伝達を避けながら、（脳内で）必要な場合の標的レプチンシグナル伝達において効果的であることを確認する。
【0224】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の種々の修飾は、本発明に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【0225】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> BISPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULES THAT BIND LEPTIN RECEPTOR
AND/OR GP130, AND METHODS OF USE THEREOF
<150> US 62/607,137
<151> 2017-12-18
<150> US 62/635,406
<151> 2018-02-26
<160> 198
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agttatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatactatg atggaagtta taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagttataac 300
tggaactact ggtacttcga tttctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
ggattcacct tcagtagtta tgcc 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 5
atatactatg atggaagtta taaa 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 6
Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys
1 5
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 7
gcgagttata actggaacta ctggtacttc gatttc 36
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 8
Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
cagagcatta gcagctat 18
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 12
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 13
gctgcatcc 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 14
Ala Ala Ser
1
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 15
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acttatgaca ttcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtc atatcttttg atggaagtaa tagaaattat 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca attccgacaa taccctgttt 240
ctggaaatga acaatctgag atttgaagac acggctgtgt attactgtgc gaaagagggc 300
tacggtgttg acttccaaca ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Arg Asn Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Tyr Gly Val Asp Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
ggattcacct tcagtactta tgac 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Asp
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
atatcttttg atggaagtaa taga 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Arg
1 5
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
gcgaaagagg gctacggtgt tgacttccaa cac 33
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
Ala Lys Glu Gly Tyr Gly Val Asp Phe Gln His
1 5 10
<210> 25
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattactact ggacctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggcat atctctaaca gtgggaccac caactataac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgacct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag actccccctc 300
ggtattgcag cagttgatac agattattat tattacttcg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 26
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Ser Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Pro Leu Gly Ile Ala Ala Val Asp Thr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 27
ggtggctcca tcagtaatta ctac 24
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
atctctaaca gtgggaccac c 21
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
Ile Ser Asn Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
gcgagactcc ccctcggtat tgcagcagtt gatacagatt attattatta cttcggtatg 60
gacgtc 66
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
Ala Arg Leu Pro Leu Gly Ile Ala Ala Val Asp Thr Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Met Asp Val
20
<210> 33
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag aacagaatat 180
gcagacgctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt atttctgtgc gagaacggaa 300
ttacggtggg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Glu Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 35
ggattcacct ttgatgatta tggc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 37
attaattgga atggtggtag aaca 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 38
Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
gcgagaacgg aattacggtg ggactac 27
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 40
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Trp Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcacac attagtagtg ctggtagtac caaatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctattt attactgtgc gggctataac 300
tacgcctact actacttcgg tgtggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 42
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ala Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Phe Gly Val Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
ggactcacct tcagtagtta tgaa 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 44
Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 45
attagtagtg ctggtagtac caaa 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
Ile Ser Ser Ala Gly Ser Thr Lys
1 5
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
gcgggctata actacgccta ctactacttc ggtgtggacg tc 42
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
Ala Gly Tyr Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Phe Gly Val Asp Val
1 5 10
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 49
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
atttgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtaataatt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggaatggatt gggaatttgt atggtagtgg gagtacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttttgt gaccgccgca gacacggctg tgtatcactg tgcgagatgg 300
gacactaacg ggggggcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 50
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr His
85 90 95
Cys Ala Arg Trp Asp Thr Asn Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
ggtggctcca tcagcagtaa taattactac 30
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 52
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
ttgtatggta gtgggagtac c 21
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 54
Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 55
gcgagatggg acactaacgg gggggctttt gatatc 36
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
Ala Arg Trp Asp Thr Asn Gly Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 57
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agccttggaa tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcct acagtggtaa tagagactat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctat 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attattgtgc gagatctcta 300
cgttttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 58
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Leu
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 59
ggttacacct ttaccagcct tgga 24
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 60
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Leu Gly
1 5
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 61
atcagcgcct acagtggtaa taga 24
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 62
Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Arg
1 5
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 63
gcgagatctc tacgttttga ctac 24
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 64
Ala Arg Ser Leu Arg Phe Asp Tyr
1 5
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt caccttggat gattttgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagcggtaa tataggttat 180
gcggactctg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agcggaagac acggccttgt attactgcac ctcgggatac 300
tacctctact acgctatgga cgtctggggc caggggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 67
ggattcacct tggatgattt tgcc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 68
Gly Phe Thr Leu Asp Asp Phe Ala
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 69
attagttgga atagcggtaa tata 24
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 70
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile
1 5
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 71
acctcgggat actacctcta ctacgctatg gacgtc 36
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 73
caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctgggtcttc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccatcgac agaaatgaaa tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta atcatcccta tcttaggtga ggcacactac 180
gaacgaaaat tccagggcag actcacgatt accatggacg agtccacgag tacagcctat 240
atggaactga gtaatctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagagagg 300
gcagctcgag gctaccttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Asp Arg Asn
20 25 30
Glu Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Leu Gly Glu Ala His Tyr Glu Arg Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Met Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 75
ggaggcacca tcgacagaaa tgaa 24
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 76
Gly Gly Thr Ile Asp Arg Asn Glu
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
<400> 77
atcatcccta tcttaggtga ggca 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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Ile Ile Pro Ile Leu Gly Glu Ala
1 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
gcgagagaga gggcagctcg aggctacctt gactac 36
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
Ala Arg Glu Arg Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt caccttcagt aattatgcta tattctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggaata tgtttcaggt attagtaata atggggttac taaatattat 180
gcagactctg tgagggacag attcaccatc tccagagaca attccaggaa cacggtgtct 240
attcaaatgg acagcctgag aactgaggac atggctgtgt attactgtgc gcgagaaaac 300
tggggatcgg acgatggttt tgatatctgg ggccaaggaa caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 82
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Asn Asn Gly Val Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Ile Gln Met Asp Ser Leu Arg Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Trp Gly Ser Asp Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 83
ggattcacct tcagtaatta tgct 24
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 85
attagtaata atggggttac taaa 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 86
Ile Ser Asn Asn Gly Val Thr Lys
1 5
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 87
gcgcgagaaa actggggatc ggacgatggt tttgatatc 39
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
Ala Arg Glu Asn Trp Gly Ser Asp Asp Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 89
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
caggtgcagt tggtgcagtc tgggactgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatccta tcaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac ggcaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcgcgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga acagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagagagg 300
ccgaactggg gatctaatga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Pro Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Asn Trp Gly Ser Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 91
ggaggcacct tcagcaccta tcct 24
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 92
Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Pro
1 5
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 93
atcatcccta tctttggtac ggca 24
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 94
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 95
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 95
gcgagagaga ggccgaactg gggatctaat gactac 36
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 96
Ala Arg Glu Arg Pro Asn Trp Gly Ser Asn Asp Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 97
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
gcctgtgcag cgtctggatt cacctttaga agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atctggtatg atggaagtaa taaatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gatagacaaa 300
tgggctacgg tgactacgta cctgtttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asp Lys Trp Ala Thr Val Thr Thr Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 99
ggattcacct ttagaagtta tggc 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly
1 5
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 101
atctggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 102
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 103
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 103
gcgatagaca aatgggctac ggtgactacg tacctgtttg actac 45
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 104
Ala Ile Asp Lys Trp Ala Thr Val Thr Thr Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 105
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 105
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagt ctggagggtc cctgagactc 60
tcttgtgcag cctctggatt caccttcagt cgttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttgcatat attagtaata ctggtactac cagggactat 180
tcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactatat 240
ctacaaatga gcagcctgag agtcgaggac acggctgttt attattgtgt gagagagaaa 300
tttagtggga cctctgactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 106
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Thr Gly Thr Thr Arg Asp Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Glu Lys Phe Ser Gly Thr Ser Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 107
ggattcacct tcagtcgtta tgaa 24
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 108
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
1 5
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 109
attagtaata ctggtactac cagg 24
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 110
Ile Ser Asn Thr Gly Thr Thr Arg
1 5
<210> 111
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 111
gtgagagaga aatttagtgg gacctctgac tggttcgacc cc 42
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 112
Val Arg Glu Lys Phe Ser Gly Thr Ser Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 113
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 113
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac 180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagaggag 300
attgttatgt tggtaggtgc taccccgggg tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 114
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Ile Val Met Leu Val Gly Ala Thr Pro Gly Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 115
ggattcacct ttagtagcta tgcc 24
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 116
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 117
attagtggta gtggtgatag caca 24
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 118
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 119
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 119
gcgaaagagg agattgttat gttggtaggt gctaccccgg ggtggttcga cccc 54
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 120
Ala Lys Glu Glu Ile Val Met Leu Val Gly Ala Thr Pro Gly Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 121
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 121
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agttactgga tcgactgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg atgactctga taccagatac 180
agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagtcgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatat attactgtgc gagacatgag 300
agaggtatag tagaagctgg tacggattac tactactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 122
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Arg Gly Ile Val Glu Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 123
ggatacagtt ttaccagtta ctgg 24
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 124
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 125
atctatcctg atgactctga tacc 24
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 126
Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 127
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 127
gcgagacatg agagaggtat agtagaagct ggtacggatt actactacta ctacggtatg 60
gacgtc 66
<210> 128
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 128
Ala Arg His Glu Arg Gly Ile Val Glu Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 129
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgatgaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaggg cttctggtta cacctttagc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcagcactg ccactggtaa cacaaactat 180
ccacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca catcaacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtac gagagagggc 300
aattcgaagg gctggctcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Ala Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Pro Gln Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Asn Ser Lys Gly Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 131
ggttacacct ttagcagcta tgat 24
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 132
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 133
atcagcactg ccactggtaa caca 24
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 134
Ile Ser Thr Ala Thr Gly Asn Thr
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 135
acgagagagg gcaattcgaa gggctggctc gacccc 36
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 136
Thr Arg Glu Gly Asn Ser Lys Gly Trp Leu Asp Pro
1 5 10
<210> 137
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 137
caggtacagc tgcagcagtc aggtcccgga caaatgaagt cctcgcagac cctcacactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctatttggta ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg gggaggacaa agttcaggtc caaatggtat 180
aatgattttg cactatctat gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcacctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtata ttactgtgca 300
agatataagt gggaacttta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 138
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 138
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Gln Met Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ile Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Lys Phe Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Phe Ala
50 55 60
Leu Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Lys Trp Glu Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 139
ggggacagtg tctctagcaa cagtgctatt 30
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 140
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ile
1 5 10
<210> 141
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 141
acaaagttca ggtccaaatg gtataat 27
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 142
Thr Lys Phe Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1 5
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 143
gcaagatata agtgggaact ttactttgac tac 33
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 144
Ala Arg Tyr Lys Trp Glu Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 145
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt acctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaggaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggt 300
tttggagtgg ttacctatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca 354
<210> 146
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Gly Val Val Thr Tyr Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 147
ggattcacct ttagtaccta ttgg 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 148
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 149
ataaaggaag atggaagtga gaaa 24
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 150
Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 151
gcgagagagg gttttggagt ggttacctat atc 33
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 152
Ala Arg Glu Gly Phe Gly Val Val Thr Tyr Ile
1 5 10
<210> 153
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 153
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactata tgacctggat ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggattg ggtttcatac attagttcta gtggtactaa caaatacaac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtat attactgtgt gagagacccc 300
ccctggggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 154
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Thr Asn Lys Tyr Asn Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Pro Pro Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 155
ggattcacct tcagtgacta ctat 24
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 156
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 157
attagttcta gtggtactaa caaa 24
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 158
Ile Ser Ser Ser Gly Thr Asn Lys
1 5
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 159
gtgagagacc ccccctgggg tatggacgtc 30
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 160
Val Arg Asp Pro Pro Trp Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 161
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 161
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgttg cctctggatt caccttcaat aaatacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120
actggaaaag gtctagagtg ggtctcaggt attgatactg atggtgacac atactatcca 180
ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccgagaactc cctgtatctt 240
caaatgaacg gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag atggccttgg 300
agtggtttct atggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 162
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 163
ggattcacct tcaataaata cgac 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 164
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Asp
1 5
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 165
attgatactg atggtgacac a 21
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 166
Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 167
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 167
gcaagatggc cttggagtgg tttctatggt gcttttgata tc 42
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 168
Ala Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 169
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 169
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agcggtggtg actactggag ctggatccgc 120
cagctcccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180
tataatccgt ccctcaagag tcgaggtacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240
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cgatttttgg agtggttctt ggggggctgg ttcggcccct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 170
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 170
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Gly Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 171
ggtggctcca tcagcagcgg tggtgactac 30
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 172
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 173
atctattaca gtgggagcgc c 21
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 174
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 175
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 175
gtgaaattac gatttttgga gtggttcttg gggggctggt tcggcccc 48
<210> 176
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 176
Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly Pro
1 5 10 15
<210> 177
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 177
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct attactggtg gtggtggtag cacatactac 180
tcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcgaatga acagtgtgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatataag 300
tggaacttcg tggacgactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 178
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
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115
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 179
ggattcacct ttagcaacta tggc 24
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 180
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 181
attactggtg gtggtggtag caca 24
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 182
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 183
gcgaaatata agtggaactt cgtggacgac 30
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 184
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp
1 5 10
<210> 185
<211> 918
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human GP130 UniProtKB - Q17RA0
<400> 185
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
35 40 45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
50 55 60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
85 90 95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
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Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
180 185 190
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195 200 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
245 250 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385 390 395 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
450 455 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
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Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495
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420 425 430
Glu Trp Cys Val Leu Ser Glu Asn Ser Pro Cys Ile Pro Asp Trp Gln
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Gln Glu Asp Gly Thr Val Asn Arg Thr His Leu Arg Gly Ser Leu Leu
450 455 460
Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Phe Pro Gly Gly
465 470 475 480
Pro Gly Ser Pro Glu Ser Met Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Ala Pro
485 490 495
Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala
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Val Leu Glu Trp Asp His Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile
515 520 525
Arg Asn Tyr Ser Ile Ser Tyr Arg Thr Ser Val Gly Lys Glu Met Val
530 535 540
Val Arg Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Ser
545 550 555 560
Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val His Met Ala Ala Tyr Thr Glu Glu Gly
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Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Leu Lys Phe Ala Gln
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Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Ser Ser Glu Ser Ile Asn Phe Asp Pro
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Leu Gly Gly Leu Leu Asp Leu Lys Ser Asp Ile Gln Tyr Arg Thr Lys
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AND/OR GP130, AND METHODS OF USE THEREOF
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
atctctaaca gtgggaccac c 21
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
Ile Ser Asn Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
gcgagactcc ccctcggtat tgcagcagtt gatacagatt attattatta cttcggtatg 60
gacgtc 66
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
Ala Arg Leu Pro Leu Gly Ile Ala Ala Val Asp Thr Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Met Asp Val
20
<210> 33
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag aacagaatat 180
gcagacgctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt atttctgtgc gagaacggaa 300
ttacggtggg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Glu Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 35
ggattcacct ttgatgatta tggc 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 37
attaattgga atggtggtag aaca 24
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr
1 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
gcgagaacgg aattacggtg ggactac 27
<210> 40
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 40
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Trp Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcacac attagtagtg ctggtagtac caaatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctattt attactgtgc gggctataac 300
tacgcctact actacttcgg tgtggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 42
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ser Ala Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Phe Gly Val Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
ggactcacct tcagtagtta tgaa 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 44
Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 45
attagtagtg ctggtagtac caaa 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
Ile Ser Ser Ala Gly Ser Thr Lys
1 5
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
gcgggctata actacgccta ctactacttc ggtgtggacg tc 42
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
Ala Gly Tyr Asn Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Phe Gly Val Asp Val
1 5 10
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 49
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
atttgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtaataatt actactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggaatggatt gggaatttgt atggtagtgg gagtacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttttgt gaccgccgca gacacggctg tgtatcactg tgcgagatgg 300
gacactaacg ggggggcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 50
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Phe Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr His
85 90 95
Cys Ala Arg Trp Asp Thr Asn Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
ggtggctcca tcagcagtaa taattactac 30
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asn Tyr Tyr
1 5 10
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
ttgtatggta gtgggagtac c 21
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<211> 7
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<220>
<223> synthetic
<400> 54
Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 55
gcgagatggg acactaacgg gggggctttt gatatc 36
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
Ala Arg Trp Asp Thr Asn Gly Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 57
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agccttggaa tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcct acagtggtaa tagagactat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctat 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attattgtgc gagatctcta 300
cgttttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
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<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Leu
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 59
ggttacacct ttaccagcct tgga 24
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 60
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Leu Gly
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 61
atcagcgcct acagtggtaa taga 24
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 62
Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Arg
1 5
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 63
gcgagatctc tacgttttga ctac 24
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 64
Ala Arg Ser Leu Arg Phe Asp Tyr
1 5
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt caccttggat gattttgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagcggtaa tataggttat 180
gcggactctg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agcggaagac acggccttgt attactgcac ctcgggatac 300
tacctctact acgctatgga cgtctggggc caggggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 67
ggattcacct tggatgattt tgcc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 68
Gly Phe Thr Leu Asp Asp Phe Ala
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 69
attagttgga atagcggtaa tata 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 70
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile
1 5
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 71
acctcgggat actacctcta ctacgctatg gacgtc 36
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 73
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 73
caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctgggtcttc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccatcgac agaaatgaaa tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta atcatcccta tcttaggtga ggcacactac 180
gaacgaaaat tccagggcag actcacgatt accatggacg agtccacgag tacagcctat 240
atggaactga gtaatctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagagagg 300
gcagctcgag gctaccttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Asp Arg Asn
20 25 30
Glu Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Leu Gly Glu Ala His Tyr Glu Arg Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Met Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 75
ggaggcacca tcgacagaaa tgaa 24
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 76
Gly Gly Thr Ile Asp Arg Asn Glu
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 77
atcatcccta tcttaggtga ggca 24
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
Ile Ile Pro Ile Leu Gly Glu Ala
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
gcgagagaga gggcagctcg aggctacctt gactac 36
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
Ala Arg Glu Arg Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt caccttcagt aattatgcta tattctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggaata tgtttcaggt attagtaata atggggttac taaatattat 180
gcagactctg tgagggacag attcaccatc tccagagaca attccaggaa cacggtgtct 240
attcaaatgg acagcctgag aactgaggac atggctgtgt attactgtgc gcgagaaaac 300
tggggatcgg acgatggttt tgatatctgg ggccaaggaa caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 82
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Asn Asn Gly Val Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Ile Gln Met Asp Ser Leu Arg Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Trp Gly Ser Asp Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 83
ggattcacct tcagtaatta tgct 24
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 85
attagtaata atggggttac taaa 24
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 86
Ile Ser Asn Asn Gly Val Thr Lys
1 5
<210> 87
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 87
gcgcgagaaa actggggatc ggacgatggt tttgatatc 39
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
Ala Arg Glu Asn Trp Gly Ser Asp Asp Gly Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 89
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
caggtgcagt tggtgcagtc tgggactgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatccta tcaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac ggcaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcgcgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga acagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagagagg 300
ccgaactggg gatctaatga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 91
ggaggcacct tcagcaccta tcct 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 92
Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Pro
1 5
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 93
atcatcccta tctttggtac ggca 24
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 94
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 95
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 95
gcgagagaga ggccgaactg gggatctaat gactac 36
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 96
Ala Arg Glu Arg Pro Asn Trp Gly Ser Asn Asp Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 97
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
gcctgtgcag cgtctggatt cacctttaga agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atctggtatg atggaagtaa taaatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gatagacaaa 300
tgggctacgg tgactacgta cctgtttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asp Lys Trp Ala Thr Val Thr Thr Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 99
ggattcacct ttagaagtta tggc 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly
1 5
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 101
atctggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 102
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 103
gcgatagaca aatgggctac ggtgactacg tacctgtttg actac 45
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 104
Ala Ile Asp Lys Trp Ala Thr Val Thr Thr Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 105
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 105
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagt ctggagggtc cctgagactc 60
tcttgtgcag cctctggatt caccttcagt cgttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttgcatat attagtaata ctggtactac cagggactat 180
tcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactatat 240
ctacaaatga gcagcctgag agtcgaggac acggctgttt attattgtgt gagagagaaa 300
tttagtggga cctctgactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 106
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Thr Gly Thr Thr Arg Asp Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Glu Lys Phe Ser Gly Thr Ser Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 107
ggattcacct tcagtcgtta tgaa 24
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 108
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
1 5
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 109
attagtaata ctggtactac cagg 24
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 110
Ile Ser Asn Thr Gly Thr Thr Arg
1 5
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 111
gtgagagaga aatttagtgg gacctctgac tggttcgacc cc 42
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 112
Val Arg Glu Lys Phe Ser Gly Thr Ser Asp Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 113
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 113
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac 180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagaggag 300
attgttatgt tggtaggtgc taccccgggg tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 114
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Ile Val Met Leu Val Gly Ala Thr Pro Gly Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 115
ggattcacct ttagtagcta tgcc 24
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 116
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 117
attagtggta gtggtgatag caca 24
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 118
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 119
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 119
gcgaaagagg agattgttat gttggtaggt gctaccccgg ggtggttcga cccc 54
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 120
Ala Lys Glu Glu Ile Val Met Leu Val Gly Ala Thr Pro Gly Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 121
<211> 387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 121
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agttactgga tcgactgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg atgactctga taccagatac 180
agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagtcgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatat attactgtgc gagacatgag 300
agaggtatag tagaagctgg tacggattac tactactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 122
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Arg Gly Ile Val Glu Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 123
ggatacagtt ttaccagtta ctgg 24
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 124
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 125
atctatcctg atgactctga tacc 24
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 126
Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 127
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 127
gcgagacatg agagaggtat agtagaagct ggtacggatt actactacta ctacggtatg 60
gacgtc 66
<210> 128
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 128
Ala Arg His Glu Arg Gly Ile Val Glu Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 129
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgatgaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaggg cttctggtta cacctttagc agctatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcagcactg ccactggtaa cacaaactat 180
ccacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca catcaacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtac gagagagggc 300
aattcgaagg gctggctcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Ala Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Pro Gln Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Asn Ser Lys Gly Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 131
ggttacacct ttagcagcta tgat 24
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 132
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 133
atcagcactg ccactggtaa caca 24
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 134
Ile Ser Thr Ala Thr Gly Asn Thr
1 5
<210> 135
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 135
acgagagagg gcaattcgaa gggctggctc gacccc 36
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 136
Thr Arg Glu Gly Asn Ser Lys Gly Trp Leu Asp Pro
1 5 10
<210> 137
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 137
caggtacagc tgcagcagtc aggtcccgga caaatgaagt cctcgcagac cctcacactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctatttggta ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg gggaggacaa agttcaggtc caaatggtat 180
aatgattttg cactatctat gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcacctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtata ttactgtgca 300
agatataagt gggaacttta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 138
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 138
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Gln Met Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ile Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Lys Phe Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Phe Ala
50 55 60
Leu Ser Met Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Lys Trp Glu Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 139
ggggacagtg tctctagcaa cagtgctatt 30
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 140
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ile
1 5 10
<210> 141
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 141
acaaagttca ggtccaaatg gtataat 27
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 142
Thr Lys Phe Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1 5
<210> 143
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 143
gcaagatata agtgggaact ttactttgac tac 33
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 144
Ala Arg Tyr Lys Trp Glu Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 145
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt acctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaggaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggt 300
tttggagtgg ttacctatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca 354
<210> 146
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Gly Val Val Thr Tyr Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 147
ggattcacct ttagtaccta ttgg 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 148
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 149
ataaaggaag atggaagtga gaaa 24
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 150
Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 151
gcgagagagg gttttggagt ggttacctat atc 33
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 152
Ala Arg Glu Gly Phe Gly Val Val Thr Tyr Ile
1 5 10
<210> 153
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 153
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactata tgacctggat ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggattg ggtttcatac attagttcta gtggtactaa caaatacaac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtat attactgtgt gagagacccc 300
ccctggggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 154
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Thr Asn Lys Tyr Asn Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Pro Pro Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 155
ggattcacct tcagtgacta ctat 24
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 156
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
<400> 157
attagttcta gtggtactaa caaa 24
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 158
Ile Ser Ser Ser Gly Thr Asn Lys
1 5
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<223> synthetic
<400> 159
gtgagagacc ccccctgggg tatggacgtc 30
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<220>
<223> synthetic
<400> 160
Val Arg Asp Pro Pro Trp Gly Met Asp Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 161
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgttg cctctggatt caccttcaat aaatacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120
actggaaaag gtctagagtg ggtctcaggt attgatactg atggtgacac atactatcca 180
ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccgagaactc cctgtatctt 240
caaatgaacg gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag atggccttgg 300
agtggtttct atggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 162
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 163
ggattcacct tcaataaata cgac 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 164
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Asp
1 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 165
attgatactg atggtgacac a 21
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 166
Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr
1 5
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 167
gcaagatggc cttggagtgg tttctatggt gcttttgata tc 42
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 168
Ala Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 169
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agcggtggtg actactggag ctggatccgc 120
cagctcccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180
tataatccgt ccctcaagag tcgaggtacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tatatttctg tgtgaaatta 300
cgatttttgg agtggttctt ggggggctgg ttcggcccct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 170
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Gly Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 171
ggtggctcca tcagcagcgg tggtgactac 30
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<211> 10
<212> PRT
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<223> synthetic
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr
1 5 10
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<223> synthetic
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atctattaca gtgggagcgc c 21
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<223> synthetic
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Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala
1 5
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<223> synthetic
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<211> 16
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<223> synthetic
<400> 176
Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly Pro
1 5 10 15
<210> 177
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 177
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct attactggtg gtggtggtag cacatactac 180
tcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcgaatga acagtgtgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatataag 300
tggaacttcg tggacgactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 178
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Val Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 179
ggattcacct ttagcaacta tggc 24
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 180
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 181
attactggtg gtggtggtag caca 24
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 182
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 183
gcgaaatata agtggaactt cgtggacgac 30
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 184
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp
1 5 10
<210> 185
<211> 918
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human GP130 UniProtKB - Q17RA0
<400> 185
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
35 40 45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
50 55 60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
85 90 95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
130 135 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
180 185 190
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr
195 200 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
210 215 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu
225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
245 250 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385 390 395 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
405 410 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala
420 425 430
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu
435 440 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
450 455 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala
500 505 510
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
515 520 525
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val
530 535 540
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu
565 570 575
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met
580 585 590
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe
595 600 605
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro
610 615 620
Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys
625 630 635 640
Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro
645 650 655
Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro
660 665 670
Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe
675 680 685
Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn
705 710 715 720
Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser
725 730 735
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
740 745 750
Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg
755 760 765
His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln
770 775 780
Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp
785 790 795 800
His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys
805 810 815
Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu
820 825 830
Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu
835 840 845
Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln
850 855 860
Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly
865 870 875 880
Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala
885 890 895
Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln
900 905 910
Gly Gly Tyr Met Pro Gln
915
<210> 186
<211> 1165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human LEPR (UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P48357)
<400> 186
Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr
50 55 60
Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp
85 90 95
Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val
100 105 110
Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn
115 120 125
Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val
130 135 140
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro
165 170 175
Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu
180 185 190
Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr
195 200 205
Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser
210 215 220
Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro
225 230 235 240
Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser
245 250 255
Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys
260 265 270
Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val
275 280 285
Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr
290 295 300
Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser
305 310 315 320
Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe
325 330 335
Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys
340 345 350
Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp
355 360 365
Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val
370 375 380
Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys
385 390 395 400
Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His
405 410 415
Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile
420 425 430
Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg
435 440 445
Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu
450 455 460
Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His
465 470 475 480
Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr
485 490 495
Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp
500 505 510
Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys
515 520 525
Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys
530 535 540
Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys
545 550 555 560
Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu
565 570 575
Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys
580 585 590
Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala
595 600 605
Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn
610 615 620
Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met
625 630 635 640
Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys
645 650 655
Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser
660 665 670
Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn
675 680 685
Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu
690 695 700
Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile
705 710 715 720
Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser
725 730 735
Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser
740 745 750
Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met
755 760 765
Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys
770 775 780
Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His
785 790 795 800
Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met
805 810 815
Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp
820 825 830
Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val
835 840 845
Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His
850 855 860
Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn
865 870 875 880
Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr Phe Glu
885 890 895
His Leu Phe Ile Lys His Thr Ala Ser Val Thr Cys Gly Pro Leu Leu
900 905 910
Leu Glu Pro Glu Thr Ile Ser Glu Asp Ile Ser Val Asp Thr Ser Trp
915 920 925
Lys Asn Lys Asp Glu Met Met Pro Thr Thr Val Val Ser Leu Leu Ser
930 935 940
Thr Thr Asp Leu Glu Lys Gly Ser Val Cys Ile Ser Asp Gln Phe Asn
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Ser Val Asn Phe Ser Glu Ala Glu Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Asp
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
Leu Ser Asp Gln His Pro Asn Ile Ile Ser Pro His Leu Thr Phe
1040 1045 1050
Ser Glu Gly Leu Asp Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Asn Phe Pro
1055 1060 1065
Glu Glu Asn Asn Asp Lys Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Gly Val Thr
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645 650 655
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
660 665 670
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
675 680 685
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
690 695 700
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
705 710 715 720
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
725 730 735
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
740 745 750
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
755 760 765
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
770 775 780
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
785 790 795 800
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
805 810 815
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
820
<210> 198
<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hCNTFR-MMH
<400> 198
Gln Arg His Ser Pro Gln Glu Ala Pro His Val Gln Tyr Glu Arg Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Thr Leu Pro Cys Gly Thr Ala Asn Trp Asp Ala Ala
20 25 30
Val Thr Trp Arg Val Asn Gly Thr Asp Leu Ala Pro Asp Leu Leu Asn
35 40 45
Gly Ser Gln Leu Val Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ala Cys Phe His Arg Asp Ser Trp His Leu Arg His Gln Val Leu
65 70 75 80
Leu His Val Gly Leu Pro Pro Arg Glu Pro Val Leu Ser Cys Arg Ser
85 90 95
Asn Thr Tyr Pro Lys Gly Phe Tyr Cys Ser Trp His Leu Pro Thr Pro
100 105 110
Thr Tyr Ile Pro Asn Thr Phe Asn Val Thr Val Leu His Gly Ser Lys
115 120 125
Ile Met Val Cys Glu Lys Asp Pro Ala Leu Lys Asn Arg Cys His Ile
130 135 140
Arg Tyr Met His Leu Phe Ser Thr Ile Lys Tyr Lys Val Ser Ile Ser
145 150 155 160
Val Ser Asn Ala Leu Gly His Asn Ala Thr Ala Ile Thr Phe Asp Glu
165 170 175
Phe Thr Ile Val Lys Pro Asp Pro Pro Glu Asn Val Val Ala Arg Pro
180 185 190
Val Pro Ser Asn Pro Arg Arg Leu Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Ser
195 200 205
Thr Trp Pro Asp Pro Glu Ser Phe Pro Leu Lys Phe Phe Leu Arg Tyr
210 215 220
Arg Pro Leu Ile Leu Asp Gln Trp Gln His Val Glu Leu Ser Asp Gly
225 230 235 240
Thr Ala His Thr Ile Thr Asp Ala Tyr Ala Gly Lys Glu Tyr Ile Ile
245 250 255
Gln Val Ala Ala Lys Asp Asn Glu Ile Gly Thr Trp Ser Asp Trp Ser
260 265 270
Val Ala Ala His Ala Thr Pro Trp Thr Glu Glu Pro Arg His Leu Thr
275 280 285
Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ser Leu
290 295 300
Ala Pro Pro Pro Thr Thr Lys Ile Cys Asp Pro Gly Glu Leu Gly Ser
305 310 315 320
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu
325 330 335
Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
340 345
【図1】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ヒトＧＰ１３０に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
（ｂ）ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
を含む、単離二重特異性抗原結合分子。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】