(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024147793
(43)【公開日】2024-10-16
(54)【発明の名称】Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20241008BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241008BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20241008BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/689 Z
C12N1/20
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024120312
(22)【出願日】2024-07-25
(62)【分割の表示】P 2019199027の分割
【原出願日】2019-10-31
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ノニデット
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】上倉 佳子
(57)【要約】
【課題】 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための手法を提供すること。
【解決手段】 以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための核酸プライマーセット：（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【選択図】 なし
【解決手段】 以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための核酸プライマーセット：（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための核酸プライマーセット：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【請求項2】
前記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項3】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、請求項１又は２に記載の核酸プライマーセット。
【請求項4】
前記（Ｉ）に記載の核酸プライマーが、配列番号３～９のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、請求項１～３のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
【請求項5】
前記（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１０～１５のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、請求項１～４のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
【請求項6】
検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、以下の（１）～（２）の工程を含む方法：
（１）検体試料中において、請求項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程。
（１）検体試料中において、請求項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程。
【請求項7】
請求項６に記載のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、前記工程（２）が、以下の（２－１）～（２－２）の工程を含む、検出方法：
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項8】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出する、請求項６又は７に記載の検出方法。
【請求項9】
前記工程（２－１）で用いる核酸プローブが、以下の特徴（Ａ）および（Ｂ）を有する核酸プローブである、請求項６～８のいずれかに記載の検出方法：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【請求項10】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項11】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項９又は１０に記載の検出方法。
【請求項12】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項９～１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項13】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項９～１２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項14】
前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである、請求項９～１３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項15】
前記工程（２－２）が以下の工程（２－２ａ）～（２－２ｃ）の少なくともひとつを含む、請求項７～１４のいずれかに記載の検出方法。
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
【請求項16】
前記工程（２）の核酸増幅反応がＰＣＲである、請求項６～１５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項17】
前記工程（２）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項６～１６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項18】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項19】
前記検体試料が、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料である、請求項６～１８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項20】
検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する核酸プローブ：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【請求項21】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、請求項２０に記載の核酸プローブ。
【請求項22】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、請求項２０又は２１に記載の核酸プローブ。
【請求項23】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項24】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項２０～２３のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項25】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項２０～２４のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項26】
前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである請求項２０～２５のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項27】
請求項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットおよび／または請求項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬。
【請求項28】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、請求項２７に記載の試薬。
【請求項29】
請求項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセット、請求項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブ、及び／又は請求項２７～２８のいずれかに記載の試薬を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキット。
【請求項30】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するための請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、検体試料中に含まれるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、検体試料中に含まれるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出する方法及びその方法に用いるための試薬・キット等に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の中でも特に百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、伝染性の強い呼吸器感染症である百日咳を引き起こす主たる原因菌である。百日咳は、三種混合ワクチン未接種の乳幼児が感染すると特に重症化しやすく死に至ることもある。最近ではワクチンの免疫効果減弱による既接種者（成人）の百日咳が問題になっている。このような成人感染者は、重症化する例は少ないため、百日咳菌の感染に気付かないこともあり、感染拡大や乳幼児の感染源となるおそれがある。
【0003】
百日咳の一部（約２～２０％）は、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）によって引き起こされることが知られている。パラ百日咳菌により引き起こされる百日咳の症状は、典型的には百日咳菌により引き起こされるものより軽いが、臨床兆候のみに基づく鑑別診断は困難である。そして百日咳菌を検知する既知の方法では、パラ百日咳菌が高濃度の場合、偽陽性となる可能性があることが報告されている（非参考文献１）。よって百日咳菌とパラ百日咳菌を特異的に区別し、簡便、迅速、高感度に検出ができる検査方法が、臨床診断上強く求められている。
【0004】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の従来の検査方法として、培養検査、血清学的検査、遺伝子検査がある。培養検査は、菌分離が困難であることが多いという問題がある。血清学的検査は、正確な診断にはペア血清を必要とするが採れないのが現状であり、ペア血清を採れたとしても診断に時間を要する。遺伝子検査としては、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による検査が知られているが現状では百日咳菌のみを検出する方法となっており、そして反応系に核酸増幅が正常に行われたかを確認するためのインターナルコントロールが組み込まれていないため、増幅阻害が起きても判断が困難であるという問題がある。ＰＣＲ法で、百日咳菌とパラ百日咳菌を検出する方法も検討されているが、感度がまだ十分でないこともあり他の百日咳菌やパラ百日咳菌以外のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌と交差反応するという欠点がある（非特許文献１）。
【0005】
さらに遺伝子検査を利用した方法の例として、百日咳菌は呼吸器感染症の原因菌の一つであるため、マイコプラズマ肺炎、クラミジア肺炎などの他の呼吸器感染症と区別して検出される方法がこれまでにも提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２）。
【0006】
またこれまでにも、百日咳菌とパラ百日咳菌を区別して検出する方法が提案されている（例えば、特許文献３）。しかし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌をより高感度に区別して検出できる更なる有用な方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特許６２５４０８５号公報
【特許文献2】特許４５０３８４４号公報
【特許文献3】特開２０１４－２３０５１１号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】体外診断用医薬品 ＦｉｌｍＡｒｒａｙ呼吸器パネル添付文書（２０１９年２月改訂第２版）、ビオメリュー・ジャパン株式会社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、簡便、高感度に検体試料中に含まれるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出する手法を提供することである。本発明者は、従来公知の百日咳菌とパラ百日咳菌とを区別して検出する方法について検討を重ねていたところ、この方法では十分に核酸精製できていない試料を用いるときに検体試料中に含まれる物質の影響等で、増幅阻害を受けやすく正確に検出できない場合があるという新たな知見を得た。そこで、本発明は、十分に核酸精製できていない試料を用いる場合であっても、簡便、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出できる新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は鋭意研究の結果、特定のオリゴヌクレオチドを用いることで、簡便、高感度に検体試料中に含まれるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。
【0011】
［項１］ 以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための核酸プライマーセット：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２］ 前記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項１に記載の核酸プライマーセット。
［項３］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項１又は２に記載の核酸プライマーセット。
［項４］ 前記（Ｉ）に記載の核酸プライマーが、配列番号３～９のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、項１～３のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
［項５］ 前記（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１０～１５のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、項１～４のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
［項６］ 検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、以下の（１）～（２）の工程を含む方法：
（１）検体試料中において、項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程。
［項７］ 項６に記載のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、前記工程（２）が、以下の（２－１）～（２－２）の工程を含む、検出方法：
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
［項８］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出する、項６又は７に記載の検出方法。
［項９］ 前記工程（２－１）で用いる核酸プローブが、以下の特徴（Ａ）および（Ｂ）を有する核酸プローブである、項６～８のいずれかに記載の検出方法：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
［項１０］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項９に記載の検出方法。
［項１１］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、項９又は１０に記載の検出方法。
［項１２］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項９～１１のいずれかに記載の検出方法。
［項１３］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項９～１２のいずれかに記載の検出方法。
［項１４］ 前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである、項９～１３のいずれかに記載の検出方法。
［項１５］ 前記工程（２－２）が以下の工程（２－２ａ）～（２－２ｃ）の少なくともひとつを含む、項７～１４のいずれかに記載の検出方法。
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
［項１６］ 前記工程（２）の核酸増幅反応がＰＣＲである、項６～１５のいずれかに記載の検出方法。
［項１７］ 前記工程（２）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項６～１６のいずれかに記載の検出方法。
［項１８］ ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１７に記載の検出方法。
［項１９］ 前記検体試料が、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料である、項６～１８のいずれかに記載の検出方法。
［項２０］ 検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する核酸プローブ：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
［項２１］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項２０に記載の核酸プローブ。
［項２２］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項２０又は２１に記載の核酸プローブ。
［項２３］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、項２０～２２のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２４］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項２０～２３のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２５］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項２０～２４のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２６］ 前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである項２０～２５のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２７］ 項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットおよび／または項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬。
［項２８］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項２７に記載の試薬。
［項２９］ 項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセット、項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブ、及び／又は項２７～２８のいずれかに記載の試薬を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキット。
［項３０］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するための項２９に記載のキット。
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
［項２］ 前記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項１に記載の核酸プライマーセット。
［項３］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項１又は２に記載の核酸プライマーセット。
［項４］ 前記（Ｉ）に記載の核酸プライマーが、配列番号３～９のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、項１～３のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
［項５］ 前記（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１０～１５のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、項１～４のいずれかに記載の核酸プライマーセット。
［項６］ 検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、以下の（１）～（２）の工程を含む方法：
（１）検体試料中において、項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程。
［項７］ 項６に記載のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法であって、前記工程（２）が、以下の（２－１）～（２－２）の工程を含む、検出方法：
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
［項８］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出する、項６又は７に記載の検出方法。
［項９］ 前記工程（２－１）で用いる核酸プローブが、以下の特徴（Ａ）および（Ｂ）を有する核酸プローブである、項６～８のいずれかに記載の検出方法：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
［項１０］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項９に記載の検出方法。
［項１１］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、項９又は１０に記載の検出方法。
［項１２］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項９～１１のいずれかに記載の検出方法。
［項１３］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項９～１２のいずれかに記載の検出方法。
［項１４］ 前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである、項９～１３のいずれかに記載の検出方法。
［項１５］ 前記工程（２－２）が以下の工程（２－２ａ）～（２－２ｃ）の少なくともひとつを含む、項７～１４のいずれかに記載の検出方法。
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
［項１６］ 前記工程（２）の核酸増幅反応がＰＣＲである、項６～１５のいずれかに記載の検出方法。
［項１７］ 前記工程（２）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項６～１６のいずれかに記載の検出方法。
［項１８］ ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１７に記載の検出方法。
［項１９］ 前記検体試料が、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料である、項６～１８のいずれかに記載の検出方法。
［項２０］ 検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する核酸プローブ：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
［項２１］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項２０に記載の核酸プローブ。
［項２２］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項２０又は２１に記載の核酸プローブ。
［項２３］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、項２０～２２のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２４］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項２０～２３のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２５］ 前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、項２０～２４のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２６］ 前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである項２０～２５のいずれかに記載の核酸プローブ。
［項２７］ 項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセットおよび／または項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブを含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬。
［項２８］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、項２７に記載の試薬。
［項２９］ 項１～５のいずれかに記載の核酸プライマーセット、項２０～２６のいずれかに記載の核酸プローブ、及び／又は項２７～２８のいずれかに記載の試薬を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキット。
［項３０］ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌として、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するための項２９に記載のキット。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、検体試料中から簡便、高感度に試料中に含まれるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することができ、なかでも百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とを高感度に区別して検出することができる。本発明の方法によれば、例えば、高度に核酸精製できていない試料を用いる場合であっても増幅阻害を受けにくく、十分な感度でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法、試薬、及びキットを使用することで、例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓの簡便、高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。
【0015】
また、本明細書では、核酸プライマーをオリゴヌクレオチドプライマー又は単にプライマーといい、核酸プローブをオリゴヌクレオチドプローブ又は単にプローブという場合があり、これらを総称してオリゴヌクレオチドともいう。
【0016】
（１．Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法）
本発明の実施態様の一つは、検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法である。より詳細には、本発明の方法は、少なくとも以下の（１）～（２）の工程：
（１）検体試料中において、特定の塩基配列からなる核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程、
を包含することを特徴とする。即ち本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出において、高感度な判定結果を得るために、核酸増幅反応において特定塩基配列の核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いることを一つの特徴とする。
本発明の実施態様の一つは、検体試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出する方法である。より詳細には、本発明の方法は、少なくとも以下の（１）～（２）の工程：
（１）検体試料中において、特定の塩基配列からなる核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程、
を包含することを特徴とする。即ち本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出において、高感度な判定結果を得るために、核酸増幅反応において特定塩基配列の核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いることを一つの特徴とする。
【0017】
［核酸プライマーセット］
本発明においてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するために用いる、前記（１）に記載の核酸プライマーセットは、以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
本発明においてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するために用いる、前記（１）に記載の核酸プライマーセットは、以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【0018】
上記（Ｉ）及び（ＩＩ）において規定した配列番号１は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の一種である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のゲノム配列の一部に相当する塩基配列である。そして、配列番号２は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の一種であるパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のゲノム配列の一部であって、配列番号１で示される百日咳菌のゲノム配列の一部と相同性を示す領域の塩基配列である。配列番号１（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に示される塩基配列と、配列番号２（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に示される塩基配列とは高い相同性（約９９．６％）を示すゲノム領域であるが、本発明はこのゲノム領域を標的として核酸増幅反応を行うことにより、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を高感度に区別して検出できることを見出したことに基づく。
【0019】
なお、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のゲノム配列は、菌株によって僅かに（例えば、１又は数個の塩基において）塩基配列が異なる場合があることが知られている。本発明は、このように１又は数個の塩基が異なる百日咳菌又はパラ百日咳菌のゲノム配列に基づいて、上記（Ｉ）又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーを設計することもできる。従って、本発明の上記（Ｉ）又は（ＩＩ）に規定される核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーであり得る。より特異性の高い核酸増幅反応が期待できるという観点から、好ましくは、核酸プライマーの塩基配列は、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列と９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは１００％の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーである。
【0020】
特定の実施形態では、上記（Ｉ）又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーは、例えば、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる核酸プライマーであってもよい。ここで、１又は数個とは、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個であり得る。このように配列番号１又は２で示される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有する核酸プライマーを用いることで、より特異性の高い核酸増幅反応が可能となり得る。
【0021】
本発明に用いる核酸プライマーは、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列に相当するＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌のゲノム領域を増幅できるものであればよく、配列番号１と配列番号２との間で同一の塩基配列を示す領域において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーであってもよいし、配列番号１と配列番号２との間で一部の塩基が異なる領域において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーであってもよい。さらに、本発明の方法では、上記（Ｉ）に該当する核酸プライマーを複数用いてもよく、上記（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを複数用いてもよい。複数の（Ｉ）及び（ＩＩ）に該当するプライマーを使用することでマルチプレックス法での核酸増幅反応を行うこともできる。より低コストでありながら高感度な検出が可能であるという観点からは、上記（Ｉ）に該当する核酸プライマーを１種類及び上記（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを１種類含有する核酸プライマーセットで核酸増幅反応を行う方法が好ましい。
【0022】
一つの好ましい実施形態において、上記（Ｉ）で規定した核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の７０番目～１９０番目に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーである。この場合に組み合わせて用いることが好ましい上記（ＩＩ）で規定した核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の２２０番目～３４０番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーである。このような核酸プライマーの組み合わせで核酸増幅産物を生成することにより、より良好にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
【0023】
他の好ましい実施形態において、上記（Ｉ）で規定した核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の３００番目～３９０番目に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーである。この場合に組み合わせて用いることが好ましい上記（ＩＩ）で規定した核酸プライマーは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の４７０番目～５１０番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマーである。このような核酸プライマーの組み合わせで核酸増幅産物を生成することによっても、良好にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能である。
【0024】
上記（Ｉ）及び（ＩＩ）で規定した核酸プライマーの長さは、１５～３０塩基である限り特に限定されないが、例えば、１６～２５塩基、好ましくは１７～２４塩基であり得る。このような長さの核酸プライマーを用いることで十分な核酸増幅反応を可能にしつつ、非特異的な増幅反応を抑えて高感度に特異的な核酸増幅産物を生成させることが可能となる。
【0025】
特定の好ましい実施形態において、前記（Ｉ）に記載の核酸プライマーの具体例としては、配列番号３～９のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーを挙げることができる。更に特定の好ましい実施形態において、前記（ＩＩ）に記載の核酸プライマーの具体例としては、配列番号１０～１５のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーを挙げることができる。とりわけ、これらの（Ｉ）及び（ＩＩ）に記載の核酸プライマーの組み合わせを含む核酸プライマーセットを用いることにより、より一層高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能である。
【0026】
［核酸増幅反応］
一つの実施態様において、本発明の方法は、前記のような核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成させる。核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明で行う核酸増幅法はＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法を含む）が好ましいが、これに限定されない。
一つの実施態様において、本発明の方法は、前記のような核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成させる。核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明で行う核酸増幅法はＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法を含む）が好ましいが、これに限定されない。
【0027】
［ＰＣＲ反応］
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理
によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。より簡便、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することを可能にできるという観点から、本発明では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理
によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。より簡便、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することを可能にできるという観点から、本発明では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【0028】
ＰＣＲ反応の条件は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、最初の熱変形工程が８０～１００℃で０秒～５分、繰り返しの熱変形工程が８０～１００℃で０．５～３００秒、アニーリンクが３５～８０℃で１～３００秒、伸長反応工程が３５～８５℃で１～３００秒程度行い、この繰り返しを３０～７０回繰り返すことが好ましい。ここで繰り返し行うサイクルの温度及び時間は、１～数サイクル毎に変化させてもよい。
【0029】
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、本発明には、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）が、伸長性や熱安定性に優れているという観点から、本発明においてとりわけ好適に用いることができる。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、本発明には、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）が、伸長性や熱安定性に優れているという観点から、本発明においてとりわけ好適に用いることができる。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。
【0030】
［ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ］
本明細書において、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼともいう）とは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、天然由来のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加することにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）をいう。一つの好ましい実施形態において、本発明は、このようなＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、後述の実施例に示すように、簡便でありながら高感度でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
本明細書において、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼともいう）とは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、天然由来のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加することにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）をいう。一つの好ましい実施形態において、本発明は、このようなＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、クルードサンプル耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、後述の実施例に示すように、簡便でありながら高感度でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
【0031】
［増幅産物を検出する工程］
本発明の前記方法では、工程（２）として、前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程を包含する。この検出する工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。
本発明の前記方法では、工程（２）として、前記工程（１）で得られた増幅産物を検出する工程を包含する。この検出する工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。
【0032】
一つの実施形態において、前記工程（２）は、以下の（２－１）～（２－２）の工程：
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
を包含することを特徴とする。好ましい本実施態様では、本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出において、高感度な判定結果を得るために、前記（１）工程によって得られた核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる核酸プローブを用いることを一つの特徴とする。
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程。
を包含することを特徴とする。好ましい本実施態様では、本発明はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出において、高感度な判定結果を得るために、前記（１）工程によって得られた核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる核酸プローブを用いることを一つの特徴とする。
【0033】
［核酸プローブ］
一つの実施形態において、本発明は、前記特定の塩基配列からなる核酸プライマーを含む核酸プライマーセットで増幅した核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる核酸プローブを使用する。
一つの実施形態において、本発明は、前記特定の塩基配列からなる核酸プライマーを含む核酸プライマーセットで増幅した核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる核酸プローブを使用する。
【0034】
核酸プローブの塩基配列は、前記（Ｉ）及び（ＩＩ）の核酸プライマーにより増幅され得る配列番号１及び／又は配列番号２の塩基配列と相同性が比較的高いことが望ましい。例えば、本発明に用いる核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるものであり得る。好ましくは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列と９０％以上、より好ましくは９３％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を示す塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブであり得る。特に好ましくは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と１００％同一の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブである。
【0035】
特定の実施形態では、核酸プローブは、例えば、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる核酸プローブであり得る。ここで、１又は数個とは、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個であり得る。このように配列番号１又は２で示される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有する核酸プローブを用いることで、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
【0036】
本発明の核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列に相同性の高い配列を有するものであれば特に限定されないが、後述するグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識した核酸プローブとする場合には、当該色素で標識される少なくとも一つの末端塩基がシトシンであることが好ましい。
【0037】
一つの好ましい実施形態において、本発明の核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の１９０番目～２２０番目に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブである。このような核酸プローブと核酸増幅産物とを反応させることで、より良好にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
【0038】
他の好ましい実施形態において、本発明の核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の４００番目～４４０番目に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブである。このような核酸プローブと核酸増幅産物とを反応させることで、より良好にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能となる。
【0039】
上記（Ｉ）及び（ＩＩ）で規定した核酸プローブの長さは、１５塩基以上である限り特に限定されないが、例えば、１５～２５塩基、好ましくは１６～１９塩基であり得る。このような長さの核酸プローブを用いることで、より高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して高感度に検出することが可能である。
【0040】
特定の好ましい実施形態において、本発明に用いる核酸プローブの具体例としては、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プローブを挙げることができる。このような特定の塩基配列を有する核酸プローブを用いることにより、より一層高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出することが可能になる。
【0041】
上記の核酸プローブは、核酸が標識されていてもされていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくは核酸プローブの末端の核酸が標識されている形態であり、より好ましくは末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光物質であることがより好ましい。
【0042】
蛍光標識としては特に標的の核酸増幅産物とハイブリダイズして複合体を形成することにより蛍光を生じる蛍光物質又は消光を生じる蛍光物質のいずれであってもよいが、好ましくは標的の核酸増幅産物とハイブリダイズした際に消光を生じる蛍光物質であり、特に好ましくは、標的の核酸増幅産物とハイブリダイズにおいてグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素（例えば、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素）である。具体的には、フルオロセイン及びその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ローダミン及びその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシローダミン、ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ－５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－５６４、ＢＯＤＩＰＹ－５８１、ＢＯＤＩＰＹ－５９１、ＢＯＤＩＰＹ－６３０、ＢＯＤＩＰＹ－６５０、ＢＯＤＩＰＹ－６６５）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0043】
より具体的には、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素として、例えば、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素を挙げることができ、本発明にはこれらの蛍光消光色素が好適に使用され得る。
【0044】
特定の好ましい実施形態では、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基（即ち、両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンである核酸プローブがより好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
【0045】
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。即ち、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（シトシン塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。
【0046】
更に特定の実施態様では、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基（即ち、両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンでない核酸プローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。例えば、該プローブがハイブリダイズした際に、蛍光消光色素が標識されている少なくとも一つの末端塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（末端塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。
【0047】
［複合体を検出する工程］
本発明の前記増幅産物を検出する工程において、核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を検出する（２－２）の工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。
本発明の前記増幅産物を検出する工程において、核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を検出する（２－２）の工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。
【0048】
一つの実施形態において、前記工程（２－２）は、以下の工程（２－２ａ）～（２－２ｃ）の少なくともひとつを含む態様であり得る：
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
前記（２－２ａ）～（２－２ｃ）のような工程によれば、簡便かつ高感度に、核酸増幅産物と核酸プローブとで形成される複合体の生成を検出することが可能となり得る。
（２－２ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）前記工程（２－１）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
前記（２－２ａ）～（２－２ｃ）のような工程によれば、簡便かつ高感度に、核酸増幅産物と核酸プローブとで形成される複合体の生成を検出することが可能となり得る。
【0049】
［（２－２ａ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニター］
核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定する。試料中に百日咳菌またはパラ百日咳菌のＤＮＡが含まれている場合、増幅した核酸量に依存してオリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズして蛍光強度が増加（あるいは減少）する。取得した蛍光強度を時間（ＰＣＲ反応ではサイクル数）に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできる。
核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする。核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定する。試料中に百日咳菌またはパラ百日咳菌のＤＮＡが含まれている場合、増幅した核酸量に依存してオリゴヌクレオチドプローブが増幅核酸にハイブリダイズして蛍光強度が増加（あるいは減少）する。取得した蛍光強度を時間（ＰＣＲ反応ではサイクル数）に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターできる。
【0050】
［（２－２ｂ）核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニター］
核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする（例えば、実施例３）。核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定する。反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の反応強度をコントロール反応液の反応強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターすることが好ましいが、検出工程をより簡便にする等の目的では、エンドポイントでモニターすることが好ましい。
核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸の定量も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする（例えば、実施例３）。核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定する。反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の反応強度をコントロール反応液の反応強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターすることが好ましいが、検出工程をより簡便にする等の目的では、エンドポイントでモニターすることが好ましい。
【0051】
［（２－２ｃ）蛍光強度の温度依存性を測定］
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである（例えば、実施例４）。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである（例えば、実施例４）。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
【0052】
一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。
オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）を行うことができる。
オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）を行うことができる。
【0053】
［検体試料］
本発明において使用できる検体試料はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）への感染が疑われる被験体から採取した、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などが挙げられるが、これらに限定されない。生体試料を測定対象の検体試料とする場合、各生体試料に応じて、特に制限はされないが、希釈や懸濁、遠心などの前処理もしくは核酸抽出を行ってもよい。
本発明において使用できる検体試料はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）への感染が疑われる被験体から採取した、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などが挙げられるが、これらに限定されない。生体試料を測定対象の検体試料とする場合、各生体試料に応じて、特に制限はされないが、希釈や懸濁、遠心などの前処理もしくは核酸抽出を行ってもよい。
【0054】
検体試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、本発明に用いる検体試料は、生体から採取した検体をアルカリ処理（例えばｐＨ８．０～１４．０、好ましくはｐＨ１０．０～１３．０）した試料を用いることができる。
【0055】
核酸抽出の方法は、特に制限されないが、検体の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。核酸抽出には、例えば、各メーカーから販売されているキット等を使用してもよい。
【0056】
特定の好ましい実施態様において、本発明の方法は、従来の核酸増幅反応において通常は必須と考えられていた核酸精製工程を行う必要が無い。後述の試験例の結果に示されるように、本発明の方法によれば、標的核酸以外の生体由来成分などの夾雑物（核酸増幅反応の阻害物質となり得る）を含む状態の検体試料においても、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出できることが確認されている。核酸精製を行う場合、専用試薬が必要であることに加えて、作業が煩雑で手間と時間がかかるという問題がある。しかし、本発明の遺伝子増幅反応によれば、そのような核酸精製を行うための専用機器を準備する必要がなく、煩雑な操作を省くことが可能である。更に、遠心分離法にかかる時間も短縮することができるので、被験体からの生体試料採取から遺伝子検査結果を得るまでの時間を短縮することができ、例えば、検体採取から遺伝子検査結果が得られるまでの時間を１日以内、好ましくは半日以内、より好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、なかでも好ましくは２時間以内（例えば、１時間半以内）とすることが可能となり得る。このように、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料を用いて検出できる本発明の方法は、核酸精製の手間を省くことができるので、簡便且つ短時間でのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出を可能にするものであり好ましい。
【0057】
［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌］
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌（ボルデテラ属菌）は、種々の呼吸器疾患の原因菌であることが知られているグラム陰性の球桿菌として知られている。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌は、例えば、百日咳菌を引き起こす百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）や、気管支炎を引き起こす気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）等の種々の感染症原因菌が知られている。本発明の方法によれば、これらの任意のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を高感度に区別して検出することが可能である。好ましくは、本発明の方法は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とを正確に区別して検出可能である。
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌（ボルデテラ属菌）は、種々の呼吸器疾患の原因菌であることが知られているグラム陰性の球桿菌として知られている。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌は、例えば、百日咳菌を引き起こす百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）や、気管支炎を引き起こす気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）等の種々の感染症原因菌が知られている。本発明の方法によれば、これらの任意のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を高感度に区別して検出することが可能である。好ましくは、本発明の方法は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とを正確に区別して検出可能である。
【0058】
［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬が挙げられる。試薬には、前述で説明した本発明の核酸プライマーセット及び／又は核酸プローブに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。必要な成分は、実施する核酸増幅反応によって異なっており、それぞれ公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出する場合、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩等の無機塩類を少なくとも含むことが好ましい。目的の実験に応じて各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、核酸プライマーは０．０１～１０μＭが好ましい。核酸プローブは０．０１～１μＭが好ましく、０．０２～０．５μＭがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１～１Ｕ／ｕＬが好ましく、０．０２～０．５Ｕ／ｕＬがより好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩等の無機塩類は０．１～１０ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するための試薬が挙げられる。試薬には、前述で説明した本発明の核酸プライマーセット及び／又は核酸プローブに加えて、核酸増幅に必要な成分が少なくとも含まれる。必要な成分は、実施する核酸増幅反応によって異なっており、それぞれ公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ反応を用いて試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出する場合、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩等の無機塩類を少なくとも含むことが好ましい。目的の実験に応じて各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、核酸プライマーは０．０１～１０μＭが好ましい。核酸プローブは０．０１～１μＭが好ましく、０．０２～０．５μＭがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１～１Ｕ／ｕＬが好ましく、０．０２～０．５Ｕ／ｕＬがより好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩等の無機塩類は０．１～１０ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。
【0059】
さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、公知の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等を用いてもよい。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。
【0060】
［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキット］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキットが挙げられる。本発明のキットは、前述で説明した本発明の核酸プライマーセット、核酸プローブ、及び／又はこれらを含む試薬を含み、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出できるように構成されていれば特に限定されない。例えば、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬及び／又は使用方法等を説明する使用説明書等を任意に含むことができる。例えば、前記核酸プライマーセットと核酸プローブとを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出するためのキットが挙げられる。本発明のキットは、前述で説明した本発明の核酸プライマーセット、核酸プローブ、及び／又はこれらを含む試薬を含み、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出できるように構成されていれば特に限定されない。例えば、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬及び／又は使用方法等を説明する使用説明書等を任意に含むことができる。例えば、前記核酸プライマーセットと核酸プローブとを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。
【実施例0061】
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0062】
〔実施例１：百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から抽出したＤＮＡ試料を滅菌水で希釈しそれぞれ１００（コピー／μＬ）となるように調製し、試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌又はパラ百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から抽出したＤＮＡ試料を滅菌水で希釈しそれぞれ１００（コピー／μＬ）となるように調製し、試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌又はパラ百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0063】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１１で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１６で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１１で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１６で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
【0064】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0065】
（３）結果
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として融解曲線解析の結果を表した図である。グラフのうちＢＰゲノムは百日咳菌ゲノムＤＮＡ、ＢＰＰゲノムはパラ百日咳菌ゲノムＤＮＡ試料の解析結果を、ＮＣは滅菌水の解析結果を示している。図１より明らかなように、本発明により百日咳菌又はパラ百日咳菌が区別して検出されていることが分かる。
図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として融解曲線解析の結果を表した図である。グラフのうちＢＰゲノムは百日咳菌ゲノムＤＮＡ、ＢＰＰゲノムはパラ百日咳菌ゲノムＤＮＡ試料の解析結果を、ＮＣは滅菌水の解析結果を示している。図１より明らかなように、本発明により百日咳菌又はパラ百日咳菌が区別して検出されていることが分かる。
【0066】
〔実施例２：百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰゲノム）を生理食塩水で懸濁した後鼻腔拭い液または咽頭拭い液と混合して１０（コピー／μＬ）となるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰゲノム）を生理食塩水で懸濁した後鼻腔拭い液または咽頭拭い液と混合して１０（コピー／μＬ）となるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0067】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１２で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号３で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１７で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１２で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号３で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１７で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
【0068】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0069】
（３）結果
図２は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。百日咳菌ゲノムＤＮＡが添加された後鼻腔拭い液または咽頭拭い液の測定結果を示している。図２に示されるように、後鼻腔拭い液及び咽頭拭い液中の百日咳が検出されている。この結果から、全く予想外のことに、百日咳菌を検体中に含まれる増幅阻害を受けずに検出できるということが明らかとなった。
図２は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。百日咳菌ゲノムＤＮＡが添加された後鼻腔拭い液または咽頭拭い液の測定結果を示している。図２に示されるように、後鼻腔拭い液及び咽頭拭い液中の百日咳が検出されている。この結果から、全く予想外のことに、百日咳菌を検体中に含まれる増幅阻害を受けずに検出できるということが明らかとなった。
【0070】
〔実施例３：百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰゲノム）を生理食塩水で懸濁した後鼻腔拭い液または咽頭拭い液と混合して１０（コピー／μＬ）となるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰゲノム）を生理食塩水で懸濁した後鼻腔拭い液または咽頭拭い液と混合して１０（コピー／μＬ）となるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0071】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１５で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１９で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１５で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１９で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
【0072】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0073】
（３）結果
図３は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。百日咳菌ゲノムＤＮＡが添加された後鼻腔拭い液または咽頭拭い液の測定結果を示している。図３に示されるように、後鼻腔拭い液及び咽頭拭い液中においても百日咳が検出されている。これらの検体は、生体由来の粘性物質（例えば、ムチン）等の核酸増幅阻害物質を含むことが知られている。本実施例の結果から、百日咳菌をこのような検体中に含まれる増幅阻害を受けずに検出できることが明らかとなった。
図３は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。百日咳菌ゲノムＤＮＡが添加された後鼻腔拭い液または咽頭拭い液の測定結果を示している。図３に示されるように、後鼻腔拭い液及び咽頭拭い液中においても百日咳が検出されている。これらの検体は、生体由来の粘性物質（例えば、ムチン）等の核酸増幅阻害物質を含むことが知られている。本実施例の結果から、百日咳菌をこのような検体中に含まれる増幅阻害を受けずに検出できることが明らかとなった。
【0074】
〔実施例４：パラ百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
咽頭拭い液をｅＳｗａｂ培地（コパン社製）で懸濁し、パラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰＰゲノム）をｅＳｗａｂ培地で懸濁した咽頭拭い液と混合して２コピー／μＬとなるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。また、滅菌水でパラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰＰゲノム）を２コピー／μＬとなるように調製し、陽性試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記の実施例試薬及び比較例試薬にそれぞれ添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
咽頭拭い液をｅＳｗａｂ培地（コパン社製）で懸濁し、パラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰＰゲノム）をｅＳｗａｂ培地で懸濁した咽頭拭い液と混合して２コピー／μＬとなるように調製し、疑似生体試料とした。この疑似生体試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。また、滅菌水でパラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料（ＢＰＰゲノム）を２コピー／μＬとなるように調製し、陽性試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記の実施例試薬及び比較例試薬にそれぞれ添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0075】
試薬
以下の試薬を含む溶液を実施例として調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号６で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を実施例として調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号６で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
【0076】
また、比較例の試薬として、本発明とは異なる以下の核酸プライマー及び核酸プローブ（配列番号２１～２３：特許文献３に記載の核酸プライマー及び核酸プローブ）を用いた以外は実質的に同じ試薬を調製して、対比実験に用いた。
１０μＭ 配列番号２１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２２で示されるプローブ ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２３で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号２１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２２で示されるプローブ ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２３で示されるプライマー １．５μＬ
【0077】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0078】
（３）結果
図４は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。本実施例の試薬及び比較例の試薬において、陽性試料ではいずれもパラ百日咳菌を検出されている。一方、疑似生体試料において比較例の試薬は検体中に含まれる物質により増幅阻害が起き検出できていないが、本試薬では阻害を受けず高感度に検出ができることが明らかとなった。本実施例の結果から、本発明の核酸プライマー、核酸プローブを用いることにより、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料においても、増幅反応を阻害し得る夾雑物の影響を抑制し、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出できることが分かる。
図４は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。本実施例の試薬及び比較例の試薬において、陽性試料ではいずれもパラ百日咳菌を検出されている。一方、疑似生体試料において比較例の試薬は検体中に含まれる物質により増幅阻害が起き検出できていないが、本試薬では阻害を受けず高感度に検出ができることが明らかとなった。本実施例の結果から、本発明の核酸プライマー、核酸プローブを用いることにより、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料においても、増幅反応を阻害し得る夾雑物の影響を抑制し、高感度にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を検出できることが分かる。
【0079】
〔実施例５：百日咳菌およびパラ百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
百日咳菌およびパラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を水酸化ナトリウム溶液でそれぞれ０．５（コピー／μＬ）、０．２５（コピー／μＬ）、０．１５（コピー／μＬ）、０．０７５（コピー／μＬ）となるように調製して試料（調製後ｐＨ１２．４）とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬にそれぞれ添加して、下記条件により百日咳菌およびパラ百日咳菌をｎ＝４で測定した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
百日咳菌およびパラ百日咳菌から抽出したＤＮＡ試料を水酸化ナトリウム溶液でそれぞれ０．５（コピー／μＬ）、０．２５（コピー／μＬ）、０．１５（コピー／μＬ）、０．０７５（コピー／μＬ）となるように調製して試料（調製後ｐＨ１２．４）とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬にそれぞれ添加して、下記条件により百日咳菌およびパラ百日咳菌をｎ＝４で測定した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0080】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．９μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１１で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料４μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．９μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１１で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料４μＬ
【0081】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0082】
（３）結果
下記の表１は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、百日咳菌およびパラ百日咳菌を低濃度で検出した結果をまとめた表である。ｎ＝４測定において検出された数を示している。表１より百日咳菌は、０．２５（コピー／μＬ）、パラ百日咳菌は０．１５（コピー／μＬ）まで全数検出可能であり、低コピー数の場合であっても高感度に検出できることが明らかとなった。
下記の表１は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、百日咳菌およびパラ百日咳菌を低濃度で検出した結果をまとめた表である。ｎ＝４測定において検出された数を示している。表１より百日咳菌は、０．２５（コピー／μＬ）、パラ百日咳菌は０．１５（コピー／μＬ）まで全数検出可能であり、低コピー数の場合であっても高感度に検出できることが明らかとなった。
【0083】
【表1】
【0084】
〔実施例６：百日咳菌およびパラ百日咳菌の検出〕
（１）試料の調製
後鼻腔拭い液、咽頭拭い液を水で懸濁し、他法（リアルタイムＰＣＲ法）でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出を行って、百日咳菌陽性検体又はパラ百日咳菌陽性検体であることが確認された試料を用いて下記の試験を行った。この試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬にそれぞれ添加して、下記条件により百日咳菌およびパラ百日咳菌を測定した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
後鼻腔拭い液、咽頭拭い液を水で懸濁し、他法（リアルタイムＰＣＲ法）でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出を行って、百日咳菌陽性検体又はパラ百日咳菌陽性検体であることが確認された試料を用いて下記の試験を行った。この試料は、さらなる核酸抽出及び精製処理を行わずそのまま使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料を下記試薬にそれぞれ添加して、下記条件により百日咳菌およびパラ百日咳菌を測定した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【0085】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号４で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号４で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１８で示されるプローブ ０．２５μＬ
試料３μＬ
【0086】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・６秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0087】
（３）結果
図５は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。本試薬により、生体由来の夾雑物質をそのまま含む実検体試料（陽性検体試料）においても、十分な感度で百日咳菌とパラ百日咳菌とを区別して検出できたことが分かる。
図５は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、その検出結果を表した図である。本試薬により、生体由来の夾雑物質をそのまま含む実検体試料（陽性検体試料）においても、十分な感度で百日咳菌とパラ百日咳菌とを区別して検出できたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0088】
本発明の核酸プライマーセット及び／又は核酸プローブを使用することで簡便、高感度に試料中に含まれ得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌を区別して検出できるようになった。従って、例えば、本発明は従来鑑別が難しかった百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とを簡便な方法でありながら正確に区別して検出することが可能とし、臨床診断等などにおいて大きく貢献することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体試料中に含まれ得るＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する核酸プローブ：
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
（Ａ）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【請求項2】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項3】
前記（Ａ）に記載の少なくとも１５塩基以上の塩基配列が、配列番号１６～２０のいずれかで示される塩基配列からなる、請求項１又は２に記載の核酸プローブ。
【請求項4】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項１～３のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項5】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５．７－ジメチル－４－ボラ－３ａ、４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項１～４のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項6】
前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである請求項１～５のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項7】
検体試料中に含まれ得るＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）検体試料中において、以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と請求項１～７のいずれかに記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
（１）検体試料中において、以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成する工程；
（２－１）前記工程（１）によって得られた核酸増幅産物と請求項１～７のいずれかに記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（２－２）前記工程（２－１）で得られた複合体を検出する工程：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【請求項8】
前記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、請求項７に記載の検出方法。
【請求項9】
前記（Ｉ）に記載の核酸プライマーが、配列番号３～９のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、請求項７又は８に記載の検出方法。
【請求項10】
前記（ＩＩ）に記載の核酸プライマーが、配列番号１０～１５のいずれかで示される塩基配列からなるプライマーである、請求項７～９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項11】
前記工程（２－２）が以下の工程（２－２ａ）～（２－２ｃ）の少なくともひとつを含む、請求項７～１０のいずれかに記載の検出方法。
（２－２ａ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
（２－２ａ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（２－２ｂ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（２－２ｃ）核酸増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を含むか又は含まない反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
【請求項12】
前記工程（１）の核酸増幅反応がＰＣＲである、請求項７～１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項13】
前記工程（１）の核酸増幅反応で用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項７～１２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項14】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項15】
前記検体試料が、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料である、請求項７～１４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項16】
請求項１～６のいずれかに記載の核酸プローブおよび以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む核酸プライマーセットを含む、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するための試薬：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
【請求項17】
請求項１～６のいずれかに記載の核酸プローブ、並びに、以下の（Ｉ）に該当する核酸プライマー及び（ＩＩ）に該当する核酸プライマーを含む核酸プライマーセット及び／又は請求項１６に記載の試薬を含む、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとＢ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓとを区別して検出するためのキット：
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。
（Ｉ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー；
（ＩＩ）配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列に相補的な塩基配列において連続する１５～３０塩基の塩基配列からなる核酸プライマー。