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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024149926
(43)【公開日】2024-10-23
(54)【発明の名称】がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20241016BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241016BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241016BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20241016BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 G
A61P35/00
A61K9/08
C07K7/06 ZNA
C07K14/705
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021129814
(22)【出願日】2021-08-06
(71)【出願人】
【識別番号】304058240
【氏名又は名称】ブライトパス・バイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】吉森 孝行
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB16
4C076CC06
4C076DD22
4C076DD51
4C076DD60
4C076DD67
4C085AA04
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA41
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA20
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することにある。
【解決手段】配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、及び、配列番号４のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、及び、配列番号４のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド；
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。
【請求項2】
工程（Ａ）で得られる溶液中の配列番号１～４のペプチドの濃度がそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下となるような量のｐＨ２．５～４の溶媒を添加する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤。
【請求項6】
請求項４に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤であって、水を添加することによってワクチン投与液を調製し、該ワクチン投与液を対象に投与することを特徴とする、前記がんペプチドワクチンカクテル製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
世界では、年間約１，８００万人が新たにがんを発症し、うち約９６０万人が死亡している。日本では、２０１９年のがん罹患数予測は約１００万人であり、死亡数予測は約３８万人とされている（https://ganjoho.jp/reg_stat/statistics/stat/short_pred.html）。このようながんに対する主な治療方法としては、手術、放射線療法、化学療法、分子標的薬、抗体医薬、免疫療法、細胞治療等が開発されている。
【0003】
特に近年においては、ＣＴＬＡ－４やＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１に代表される免疫チェックポイント分子をターゲットとした免疫チェックポイント阻害剤が開発された（特許文献１または２）。これらの阻害剤を用いた免疫療法は、従来の治療方法では達成し得なかった優れた臨床効果を得ることができることが示され、様々な免疫チェックポイント阻害剤の開発ならびにこれらを用いた治療方法の開発が盛んにおこなわれている。しかし、免疫チェックポイント阻害剤は、すべての患者において有効な臨床効果が得られるわけではなく、免疫チェックポイント阻害剤に不応答の患者はおおよそ２～５割存在し、また、臨床効果が得られないがん種も存在している。このため、免疫チェックポイント阻害剤の奏効率を高めるために、当該阻害剤と化学療法剤や分子標的薬等の薬剤の併用療法も盛んに検討されている。
【0004】
免疫チェックポイント阻害剤と併用する薬剤の候補の一つとしては、同じく免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドを用いるがんワクチンが挙げられる。生体による腫瘍細胞の排除には、細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬと称する）が重要な働きをしており、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド、すなわち腫瘍抗原ペプチドとヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ抗原との複合体を認識した前駆体Ｔ細胞が分化増殖して生成されるものであり、がん細胞を攻撃する。よって、腫瘍抗原ペプチドを薬剤として用い、がん細胞に対するＣＴＬの活性を惹起し、がん細胞を攻撃させることにより、腫瘍縮小効果等の臨床効果を得ることができる。
【0005】
このような腫瘍抗原ペプチドとしては、例えば、ルドウィヒ研究所で発見されたＭＡＧＥ－Ａ３抗原やＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐ１００等の腫瘍特異的抗原由来のペプチドや、腫瘍関連抗原由来のペプチドが検討されてきた（特許文献３～７、非特許文献１～２６）。しかしながら、これらのペプチドを含むがんワクチンは単独では十分な臨床効果を得ることができず、現在においても承認されたがんワクチンは存在しない。また、例えば、免疫チェックポイント阻害剤との併用療法として、抗ＣＴＬＡ－４抗体とｇｐ１００ペプチドを含むがんワクチンとの併用試験も実施されたが、併用療法による効果を証明するには至らなかった（非特許文献２７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１１／０１１０２７号
【特許文献2】国際公開第２００４／００４７７１号
【特許文献3】国際公開第９９／６７２８８号
【特許文献4】国際公開第００／１２７０１号
【特許文献5】国際公開第０２／０１０３６９号
【特許文献6】国際公開第２００９／０３８０２６号
【特許文献7】国際公開第２０１４／１８１８０５号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ito, M., et al., Molecular basis of T cell-mediated recognition ofpancreatic cancer cells. Cancer Res, 2001. 61(5): p. 2038-46.
【非特許文献2】Tamura, M., et al., Identification of cyclophilin B-derived peptidescapable of inducing histocompatibility leukocyte antigen-A2-restricted andtumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Jpn J Cancer Res, 2001. 92(7): p.762-7.
【非特許文献3】Ito, M., et al., Identification of SART3-derived peptides capable ofinducing HLA-A2-restricted and tumor-specific CTLs in cancer patients withdifferent HLA-A2 subtypes. Int J Cancer, 2000. 88(4): p. 633-9.
【非特許文献4】Tanaka, S., et al., Peptide vaccination for patients with melanomaand other types of cancer based on pre-existing peptide-specific cytotoxicT-lymphocyte precursors in the periphery. J Immunother, 2003. 26(4): p. 357-66.
【非特許文献5】Yoshiyama, K., et al., Personalized peptide vaccination in patientswith refractory non-small cell lung cancer. Int J Oncol, 2012. 40(5): p.1492-500.
【非特許文献6】Terazaki, Y., et al., Immunological evaluation of personalizedpeptide vaccination in refractory small cell lung cancer. Cancer Sci, 2012.103(4): p. 638-44.
【非特許文献7】Noguchi, M., et al., Phase I trial of patient-oriented vaccinationin HLA-A2-positive patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer.Cancer Sci, 2004. 95(1): p. 77-84.
【非特許文献8】Noguchi, M., et al., Immunological monitoring during combination ofpatient-oriented peptide vaccination and estramustine phosphate in patientswith metastatic hormone refractory prostate cancer. Prostate, 2004. 60(1): p.32-45.
【非特許文献9】Noguchi, M., et al., Combination therapy of personalized peptidevaccination and low-dose estramustine phosphate for metastatic hormone refractoryprostate cancer patients: an analysis of prognostic factors in the treatment.Oncol Res, 2007. 16(7): p. 341-9.
【非特許文献10】Naito, M., et al., Dexamethasone did not suppress immune boosting bypersonalized peptide vaccination for advanced prostate cancer patients.Prostate, 2008. 68(16): p. 1753-62.
【非特許文献11】Uemura, H., et al., Immunological evaluation of personalized peptidevaccination monotherapy in patients with castration-resistant prostate cancer.Cancer Sci, 2010. 101(3): p. 601-8.
【非特許文献12】Noguchi, M., et al., Phase II study of personalized peptidevaccination for castration-resistant prostate cancer patients who failed indocetaxel-based chemotherapy. Prostate, 2012. 72(8): p. 834-45.
【非特許文献13】Yamada, A., et al., Phase I clinical study of a personalized peptidevaccination available for six different human leukocyte antigen (HLA-A2, -A3,-A11, -A24, -A31 and -A33)-positive patients with advanced cancer. Exp TherMed, 2011. 2(1): p. 109-117.
【非特許文献14】Yamamoto, K., et al., Immunological evaluation of personalizedpeptide vaccination for patients with pancreatic cancer. Oncol Rep, 2005.13(5): p. 875-83.
【非特許文献15】Yanagimoto, H., et al., Immunological evaluation of personalizedpeptide vaccination with gemcitabine for pancreatic cancer. Cancer Sci, 2007.98(4): p. 605-11.
【非特許文献16】Yanagimoto, H., et al., A phase II study of personalized peptidevaccination combined with gemcitabine for non-resectable pancreatic cancerpatients. Oncol Rep, 2010. 24(3): p. 795-801.
【非特許文献17】Sato, Y., et al., Immunological evaluation of peptide vaccinationfor patients with gastric cancer based on pre-existing cellular response topeptide. Cancer Sci, 2003. 94(9): p. 802-8.
【非特許文献18】Mochizuki, K., et al., Immunological evaluation of vaccination withpre-designated peptides frequently selected as vaccine candidates in anindividualized peptide vaccination regimen. Int J Oncol, 2004. 25(1): p.121-31.
【非特許文献19】Sato, Y., et al., Immunological evaluation of personalized peptidevaccination in combination with a 5-fluorouracil derivative (TS-1) for advancedgastric or colorectal carcinoma patients. Cancer Sci, 2007. 98(7): p. 1113-9.
【非特許文献20】Hattori, T., et al., Immunological evaluation of personalizedpeptide vaccination in combination with UFT and UZEL for metastatic colorectalcarcinoma patients. Cancer Immunol Immunother, 2009. 58(11): p. 1843-52.
【非特許文献21】Suekane, S., et al., Phase I trial of personalized peptidevaccination for cytokine-refractory metastatic renal cell carcinoma patients.Cancer Sci, 2007. 98(12): p. 1965-8.
【非特許文献22】Matsumoto, K., et al., A phase I study of personalized peptidevaccination for advanced urothelial carcinoma patients who failed treatmentwith methotrexate, vinblastine, adriamycin and cisplatin. BJU Int, 2010.108(6): p. 831-8.
【非特許文献23】Tsuda N., et al., Vaccination with predesignated or evidence-basedpeptides for patients with recurrent gynecologic cancers. J Immunother, 2004.27: p. 60-72
【非特許文献24】Yajima, N., et al., Immunologic evaluation of personalized peptidevaccination for patients with advanced malignant glioma. Clin Cancer Res, 2005.11(16): p. 5900-11.
【非特許文献25】Takahashi, R., et al., Phase II study of personalized peptidevaccination for refractory bone and soft tissue sarcoma patients. Cancer Sci,2013. 104(10): p. 1285-94.
【非特許文献26】Yoshida, K., et al., Characteristics of severe adverse events afterpeptide vaccination for advanced cancer patients: Analysis of 500 cases. OncolRep, 2011. 25(1): p. 57-62.
【非特許文献27】F. Stephen Hodi, M.D., et al., Improved Survival with Ipilimumab inPatients with Metastatic Melanoma, N Engl J Med. 2010 Aug 19; 363 (8): 711-723
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ワクチン用のペプチド製剤は通常、ペプチドの種類ごとに製剤化（例えば凍結乾燥など）されて容器内に格納されていることが多いため、例えば複数種のペプチドを含むカクテル投与液とする場合は、医療機関にて、複数種のペプチド製剤の各容器に注射用水をそれぞれ添加して溶解し、得られた複数種のペプチド含有液を混合してカクテル投与液を調製するという煩雑な作業が必要であった。また、ワクチン効果を向上させるために、かかるカクテル投与液にアジュバントをさらに添加する場合もあり、かかるカクテル投与液の調製はさらに煩雑となる場合もあった。
また、カクテル投与液を前述のように調製する際には、各ペプチド含有液の不足が生じないようにするなどの目的から、各ペプチド含有液を過剰量調製する必要があり、その結果、カクテル投与液を調製する際にペプチド含有液が余って無駄なロスが生じる場合があった。
また、カクテル投与液を前述のように調製する際には、各ペプチド含有液の不足が生じないようにするなどの目的から、各ペプチド含有液を過剰量調製する必要があり、その結果、カクテル投与液を調製する際にペプチド含有液が余って無駄なロスが生じる場合があった。
【0009】
また、様々ペプチドの中には、溶媒への溶解性が低く、ワクチン投与液の調製が容易でないものがあり、そのようなペプチドについては溶媒への溶解性の改善が課題となる。従来、ペプチドの水溶液への溶解性の改善には、炭酸水素ナトリウムが用いられていたが、炭酸水素ナトリウムは、特にペプチド製剤が凍結乾燥製剤である場合、炭酸水素ナトリウムから水が生成することにより凍結乾燥製剤中の水分含量が正確に測定できないといった問題点や、水溶液にした場合にｐＨが塩基性になるためペプチドが酸化しやすいといった問題点があった。
【0010】
本発明の課題は、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
それぞれ配列番号１～４に示されるアミノ酸配列からなる４種類のペプチド（以下、「本発明における４種類のペプチド」とも表示する。）がそれぞれ単独でがんペプチドワクチンとしての効果を有することはこれまでに知られている（特許文献６）。
【0012】
本発明者らは、引き続き、上記の本発明の課題を解決するべく、本発明における４種類のペプチドを含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の好適な製造方法について鋭意検討を行った。本発明者らはまた、本発明における４種類のペプチドのうち、特に、配列番号１のペプチドは溶媒への溶解性が低く、かかるペプチドを溶解し得る溶媒の条件について鋭意検討を行った。これらの鋭意検討の結果、本発明者らは、以下の（i）～（iii）の事項を見いだし、本発明を完成するに至った。
（i）本発明における４種類のペプチドにｐＨ２．５～４の溶媒を添加すると、本発明における４種類のペプチドを溶解することができること。
（ii）上記（i）で得られるペプチド溶液のｐＨを５．５～８に調整しても、ペプチドの溶解状態を保持することができること。
（iii）上記（ii）で得られるペプチド溶液を乾燥した後、水を添加すると、ペプチド溶液を再構成することができること。
（i）本発明における４種類のペプチドにｐＨ２．５～４の溶媒を添加すると、本発明における４種類のペプチドを溶解することができること。
（ii）上記（i）で得られるペプチド溶液のｐＨを５．５～８に調整しても、ペプチドの溶解状態を保持することができること。
（iii）上記（ii）で得られるペプチド溶液を乾燥した後、水を添加すると、ペプチド溶液を再構成することができること。
【0013】
すなわち、本発明は、
（１）Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド；
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法；や、
（２）工程（Ａ）で得られる溶液中の配列番号１～４のペプチドの濃度がそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下となるような量のｐＨ２．５～４の溶媒を添加する、上記（１）に記載の製造方法；や、
（３）工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）をさらに含む、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；や、
（４）工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法；や、
（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤；や、
（６）上記（４）に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤であって、水を添加することによってワクチン投与液を調製し、該ワクチン投与液を対象に投与することを特徴とする、前記がんペプチドワクチンカクテル製剤；
等に関する。
（１）Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド；
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法；や、
（２）工程（Ａ）で得られる溶液中の配列番号１～４のペプチドの濃度がそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下となるような量のｐＨ２．５～４の溶媒を添加する、上記（１）に記載の製造方法；や、
（３）工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）をさらに含む、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；や、
（４）工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法；や、
（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤；や、
（６）上記（４）に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤であって、水を添加することによってワクチン投与液を調製し、該ワクチン投与液を対象に投与することを特徴とする、前記がんペプチドワクチンカクテル製剤；
等に関する。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することができる。
また、本発明によれば、本発明における４種類のペプチドをそれぞれ別個に製剤とする場合と比較して、安価な製造コストや品質試験コストで、がんペプチドワクチンカクテル製剤を製造することができる。
また、本発明によれば、本発明における４種類のペプチドをそれぞれ別個に製剤とする場合と比較して、安価な製造コストや品質試験コストで、がんペプチドワクチンカクテル製剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図7】図７は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。
【図8】図８は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置してからvortexした後に、チューブの先端を観察した写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明におけるがんペプチドワクチンカクテル製剤（以下、「本発明におけるカクテル製剤」又は単に「カクテル製剤」とも表示する。）は、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）を含む製造方法（以下、「本発明の製造方法」とも表示する。）で製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤である。
【0017】
本発明における４種類のペプチドは、以下に示す配列番号１～４の４種類のペプチドである。
Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）
これらペプチドは、がん細胞が発現する腫瘍抗原タンパク質に由来するペプチド（本明細書中、腫瘍抗原ペプチドともいう）であり、ＨＬＡクラスＩに拘束されるＣＴＬに認識され、がん細胞に対する細胞傷害活性を誘導するペプチドである。本明細書において、がんペプチドワクチンとは、がんを治療するためのペプチドワクチンと同義であり、腫瘍抗原ペプチドを有効成分とし、がん細胞に対する免疫応答を誘導することによりがんを治療する医薬を意味する。本明細書において、「ペプチド」なる用語は、文脈上不適切でない限り、その医薬的に許容される塩を包含する意味で用いられる。
Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）
これらペプチドは、がん細胞が発現する腫瘍抗原タンパク質に由来するペプチド（本明細書中、腫瘍抗原ペプチドともいう）であり、ＨＬＡクラスＩに拘束されるＣＴＬに認識され、がん細胞に対する細胞傷害活性を誘導するペプチドである。本明細書において、がんペプチドワクチンとは、がんを治療するためのペプチドワクチンと同義であり、腫瘍抗原ペプチドを有効成分とし、がん細胞に対する免疫応答を誘導することによりがんを治療する医薬を意味する。本明細書において、「ペプチド」なる用語は、文脈上不適切でない限り、その医薬的に許容される塩を包含する意味で用いられる。
【0018】
本明細書における「医薬的に許容される塩」としては、酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などが挙げられる。
【0019】
ペプチドは、常套的な方法で製造することができ、例えば、PeptideSynthesis, Interscience, NewYork, 1966；The Proteins, Vo1.2, Academic Press Inc, NewYork, 1976；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発続第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991などに記載の方法が挙げられるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。ペプチドの精製・回収は、ゲルクロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーや、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段などの公知の方法により、行うことができる。ペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製し、当該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法も利用可能である。製造されたペプチドは、通常、当該ペプチドに加え、酢酸、塩酸、ナトリウム、トリフルオロ酢酸などのカウンターイオンとの塩として回収される。かかる塩は、がんペプチドワクチンカクテル製剤の調製時の原薬として用いることができる。本明細書においてペプチドの質量に言及する場合、塩ではなく遊離形態のペプチドの質量を意味する。
【0020】
「本発明における４種類のペプチドを含む組成物」は、本発明における４種類のペプチドのみからなる組成物であってもよいし、後述するように、本発明における４種類のペプチドと任意成分を含む組成物であってもよいし、本発明における４種類のペプチドと任意成分からなる組成物であってもよい。また、かかる組成物は、固体であってもよいし、液体であってもよいが、ペプチドの安定性の観点から、固体であることが好ましく、乾燥物であることがより好ましい。
【0021】
本発明における４種類のペプチドを含む組成物に含まれる、かかる４種類のペプチドの質量比は特に制限されず、例えば、配列番号１のペプチドの質量：配列番号２のペプチド質量：配列番号３の質量：配列番号４の質量が、０．７～１．３：０．７～１．３：０．７～１．３：０．７～１．３が挙げられ、０．８～１．２：０．８～１．２：０．８～１．２：０．８～１．２：が好ましく挙げられ、０．９～１．１：０．９～１．１：０．９～１．１：０．９～１．１：がより好ましく挙げられる。
上記組成物に含まれる４種類のペプチドの含有量は、４種すべてで同質量であってもよいし、異なっていてもよい。
上記組成物に含まれる４種類のペプチドの含有量は、４種すべてで同質量であってもよいし、異なっていてもよい。
【0022】
本明細書の上記工程（Ａ）における「ｐＨ２．５～４の溶媒」としては、ｐＨ２．５～４の溶媒である限り特に制限されず、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸水溶液などの無機酸水溶液；クエン酸水溶液、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、コハク酸水溶液などの有機酸水溶液；ホウ酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、グリシンバッファー、炭酸ナトリウムバッファー、炭酸カリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー、酢酸カリウムバッファーなどのバッファー；が挙げられ、本発明における４種類のペプチド（特に配列番号１のペプチド）の溶解性の観点から、塩酸が好ましく挙げられる。ある実施形態において、ｐＨ２．５～４の溶媒は、クエン酸バッファー以外の、ｐＨ２．５～４の溶媒であり、別の実施形態において、ｐＨ２．５～４の溶媒は、グリシンバッファー以外の、ｐＨ２．５～４の溶媒である。
なお、発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加したものをそのままカクテル製剤とする場合は、前記溶媒として、医薬的に許容される、ｐＨ２．５～４の溶媒を用いる。
なお、発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加したものをそのままカクテル製剤とする場合は、前記溶媒として、医薬的に許容される、ｐＨ２．５～４の溶媒を用いる。
【0023】
「ｐＨ２．５～４の溶媒」のｐＨとしては、２．５～４である限り特に制限されないが、本発明における４種類のペプチド（特に配列番号１のペプチド）の溶解性の観点から、２．５～３．５が好ましい。
【0024】
工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加する量としては、特に制限されないが、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して得られる溶液における、本発明における４種類の各ペプチドの濃度が、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは３ｍｇ～２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｍｇ～１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３ｍｇ～５ｍｇ／ｍＬとなるような添加量であることが好適に挙げられる。かかる溶液における本発明における４種類のペプチドの濃度は、４種すべて同じであってもよいし、異なっていてもよい。
また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加する好適な量としては、かかる溶媒によって、本発明における４種類のペプチドを含む組成物を溶解した溶液のｐＨが２．５～４．５、好ましくは２．５～４．３となる量が挙げられる。したがって、上記工程（Ａ）として好適には、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して、前記ペプチドを溶解し、ｐＨ２．５～４．５（好ましくはｐＨ２．５～４．３）の溶液を得る工程、が挙げられる。
また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加した後は、撹拌することが好ましく、vortexミキサーを用いて撹拌することがより好ましく挙げられる。
また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加する好適な量としては、かかる溶媒によって、本発明における４種類のペプチドを含む組成物を溶解した溶液のｐＨが２．５～４．５、好ましくは２．５～４．３となる量が挙げられる。したがって、上記工程（Ａ）として好適には、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して、前記ペプチドを溶解し、ｐＨ２．５～４．５（好ましくはｐＨ２．５～４．３）の溶液を得る工程、が挙げられる。
また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加した後は、撹拌することが好ましく、vortexミキサーを用いて撹拌することがより好ましく挙げられる。
【0025】
本発明の製造方法としては、前述の工程（Ａ）に加えて、「工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）」をさらに含んでいてもよく、至適ｐＨが中性領域のアジュバントと併用する場合には、かかるアジュバントの機能をより長時間維持しつつ、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持する観点から、前述の工程（Ｂ）をさらに含んでいることが好ましい。カクテル製剤の投与液は、通常、複数人分をまとめて調製するため、投与液を調製後、投与液は一定時間保存しても、アジュバントの機能を維持しつつ、ペプチドの溶解状態が保持できることが好ましいからである。
なお、本発明の製造方法が工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含んでいる場合、溶解しにくい配列番号１のペプチドについても、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して一度溶解していることで、その後、工程（Ｂ）においてｐＨを５．５～８に調整しても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持できる点で優れている。
なお、本発明の製造方法が工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含んでいる場合、溶解しにくい配列番号１のペプチドについても、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して一度溶解していることで、その後、工程（Ｂ）においてｐＨを５．５～８に調整しても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持できる点で優れている。
【0026】
上記工程（Ｂ）における「ｐＨ６．５～１４の溶媒」としては、ｐＨ６．５～１４の溶媒である限り特に制限されず、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などの水溶液；ヒスチジンバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー、重炭酸バッファー、トリス－ＨＣｌバッファーなどのバッファー；などが挙げられる。
【0027】
「ｐＨ６．５～１４の溶媒」のｐＨとしては、６．５～１４である限り特に制限されず、６．５～１３や、６．５～１２であってもよい。
【0028】
本発明の製造方法としては、前述の工程（Ａ）に加えて、あるいは、前述の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）に加えて、「工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）」をさらに含んでいてもよく、がんペプチドワクチンカクテル製剤の保存安定性の観点から、前述の工程（Ｃ）をさらに含んでいることが好ましい。
【0029】
工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を乾燥する方法としては、ペプチド溶液を乾燥する常法を用いることができ、減圧乾燥や凍結乾燥が挙げられ、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）への溶解しやすさの観点から、凍結乾燥が好ましく挙げられる。
【0030】
本発明の製造方法は、工程（Ａ）以外に、工程（Ａ）及び（Ｂ）以外に、又は、工程（Ａ）～（Ｃ）以外に、任意の工程を含んでいてもよい。
【0031】
かかる任意の工程として、具体的には、工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を濾過滅菌する工程（Ｄ）；や、工程（Ａ）で得られる溶液、工程（Ｂ）で得られる溶液、又は、それらの溶液を濾過滅菌して得られる溶液を、ガラスバイアル等の容器に充填する工程（Ｅ）；などが挙げられる。ある実施形態において、本発明の製造方法が乾燥工程（Ｃ）及び充填工程（Ｅ）を含む場合、充填工程（Ｅ）の後に乾燥工程（Ｃ）を実施してもよいし、乾燥工程（Ｃ）の後に充填工程（Ｅ）を実施してもよいが、充填工程（Ｅ）の後に乾燥工程（Ｃ）を実施することが好ましい。
【0032】
他の任意の工程としては、任意成分を添加する工程（Ｆ）が挙げられる。かかる任意成分としては、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、賦形剤、懸濁剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤などが挙げられ、具体的には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムなどの保存剤；ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、およびリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、およびデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、およびソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；およびTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。なお、前述のトレハロースやスクロースは、凍結保護剤や浸透圧調節剤として好適に挙げられる。がんペプチドワクチンカクテル製剤が、トレハロース及び／又はスクロースを含有する場合、トレハロース及び／又はスクロースの含有量は特に制限されないが、トレハロース及び／又はスクロースの合計質量に対する各ペプチドの質量比が０．０１～１または０．０２～０．３であることが好ましい。本明細書においてトレハロースやスクロースの質量に言及する場合、トレハロース無水物やスクロース無水物の質量を意味する。
【0033】
ある実施形態において、本発明の製造方法が工程（Ｆ）を有する場合、各工程の順序は問わず、また、他の工程と同時であってもよいが、工程（Ａ）又は工程（Ｂ）の後に実施することや、工程（Ａ）又は工程（Ｂ）の後であって、工程（Ｃ）の前に実施することが挙げられる。また、工程（Ｆ）を工程（Ａ）より前に実施してもよく、例えば、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、上記任意成分を添加してもよい。
【0034】
本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、少なくとも、特定の４種類のペプチド（それぞれ配列番号１～４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）を含む。カクテル製剤の剤型としては、特に制限はないが、水溶液製剤または乾燥製剤が好ましく、ペプチドの安定性の観点から、乾燥製剤が好ましく、溶媒を添加した際の溶解しやすさの観点から、凍結乾燥製剤がより好ましい。
【0035】
本発明におけるカクテル製剤は、水溶液の状態で投与される。カクテル製剤が水溶液製剤である場合、そのまま患者に投与することができ、乾燥製剤である場合、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）で溶解した水溶液を投与することができる。かかる溶解の方法としては、乾燥製剤に、前述の溶媒を添加した後、撹拌することが好ましく、vortexミキサーを用いて撹拌することがより好ましく挙げられる。
【0036】
本発明におけるカクテル製剤の投与時の水溶液（すなわち、投与液）中の、本発明における４種類の各ペプチドの濃度としては、特に制限されないが、例えば、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは３ｍｇ～２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｍｇ～１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３ｍｇ～５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。かかる投与液における、前述の４種類のペプチドの濃度は、４種すべて同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0037】
本発明におけるカクテル製剤の投与時の水溶液（すなわち、投与液）のｐＨは特に制限されず、例えばｐＨ２．５～８．０が挙げられるが、例えば、前述の投与液にアジュバントを含有させて用いる場合に、そのアジュバントの至適ｐＨが中性領域であるときは、前述の投与液のｐＨとして、５．５～８．０；５．５～７．５；６．０～８．０；及び、６．０～７．５；などが好ましく挙げられる。カクテル製剤の投与液を調製する際に、ｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整してもよいが、簡便性の観点から、ｐＨ調整剤を添加せずに投与液を調整できることが好ましく、ｐＨ調整剤を添加せずに、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）を添加、撹拌することによって投与液を調整できることがより好ましい。
工程（Ａ）～（Ｃ）を含む本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液を調製する際に、ｐＨ調整剤を添加しない場合であっても、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）を添加、撹拌することによって、ｐＨが５．５～８．０；５．５～７．５；６．０～８．０；及び、６．０～７．５；などの投与液を簡便に調製できる点で優れている。また、本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液のｐＨを５．５～８としても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持することができる点で優れている。
工程（Ａ）～（Ｃ）を含む本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液を調製する際に、ｐＨ調整剤を添加しない場合であっても、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）を添加、撹拌することによって、ｐＨが５．５～８．０；５．５～７．５；６．０～８．０；及び、６．０～７．５；などの投与液を簡便に調製できる点で優れている。また、本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液のｐＨを５．５～８としても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持することができる点で優れている。
【0038】
本発明におけるカクテル製剤の投与液の濁度（ＯＤ６００）としては、特に制限されないが、例えば０．２以下が好ましく、０．１以下がより好ましく、０．０８以下がさらに好ましい。投与液の濁度（ＯＤ６００）の測定法は常法を用いることができる。
【0039】
本発明におけるカクテル製剤の対象となるがんの種類は特に限定されない。例えば、がんとしては、前立腺がん、膵臓がん、大腸がん、肺がん（非小細胞肺がんを含む）、造血器腫瘍、脳腫瘍、子宮がん、子宮頸がん、胃がん、黒色腫（悪性黒色腫を含む）、甲状腺がん、肝臓がん、食道がんが挙げられる。好ましくは、カクテル製剤は、黒色腫（悪性黒色腫を含む）または肺がん（非小細胞肺がんを含む）に用いられる。
【0040】
本発明におけるカクテル製剤は、さらにアジュバントを含んでもよく、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントとしては、ペプチドの水溶液をエマルション化することでペプチドの投与局所への貯留性を高める不完全フロイントアジュバント（例えばＩＳＡ－５１等、ＳＥＰＰＩＣ社）やプルランなどの多糖類や、完全フロイントアジュバント、ＢＣＧ、アラム、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＣｐＧ等の免疫増強作用を有するものを使用することができる。ＧＭ－ＣＳＦの至適ｐＨは中性領域（ｐＨ６～８）であり、本発明におけるカクテル製剤で使用するアジュバントとして特に好適に挙げられる。
【0041】
本発明におけるカクテル製剤は、通常、患者の皮内または皮下へ投与される。ペプチドは、例えば静脈注射等により投与されると速やかに分解されてしまい、免疫応答を十分に引き起こすことができないためである。また、抗原を捕獲し、ＨＬＡ分子を介して細胞表面上に提示して、ＣＴＬ等のＴ細胞を活性化する抗原提示細胞が、皮内または皮下に存在することから、皮内または皮下へ投与することで細胞傷害活性を示すＣＴＬ等を効率よく活性化できるためである。投与部位は、特に制限はないが、投与開始時から可能な限りがんの病変に近いリンパ節付近とすることが好ましく、例えば上腕部、大腿部などが挙げられる。また、投与の副作用により投与部位に炎症等が発生して投与が困難になった場合は、他の部位（腹部など）に投与してもよい。
【0042】
本発明におけるカクテル製剤は、所望の効果を発揮しうる量（本明細書において「有効量」ともいう）で患者に投与される。投与量は、皮内または皮下投与が許容される量であれば特に制限はないが、好ましくは、１種類のペプチドにつきペプチドの乾燥粉末の質量で、０．１ｍｇ以上、好ましくは、０．１ｍｇ～３ｍｇ、より好ましく１ｍｇ～３ｍｇである。本発明における４種類のペプチドの投与量は４種すべてで同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0043】
本発明におけるカクテル製剤の投与頻度は、免疫応答が得られる頻度であればよく、１日、２日、３日、４日、５日、または６日に１回投与しても、１週、２週、３週、４週、５週、または６週に１回投与してもよく、途中で投与頻度を変更してもよい。例えば、１週１回の投与を４回行った後、３週～４週に１回の投与を継続してもよい。カクテル製剤の投与回数は、例えば、少なくとも８回、好ましくは１６回以上である。患者が投与に耐えうる限り投与回数に上限はないが、臨床試験では最大８４回まで投与した実績があり、少なくとも当該回数までは投与可能である。
【0044】
本発明におけるカクテル製剤を患者に投与すると、患者体内で投与されたペプチドに対するＣＴＬが活性化され、がん細胞が排除され、臨床効果を得ることができる。
【0045】
本発明におけるカクテル製剤は、１以上の他の抗腫瘍薬または治療方法と併用されてもよい。各患者のがん細胞はヘテロな集団であり、免疫応答では排除しきれない細胞や、抗腫瘍薬やホルモン療法等に耐性を持つ細胞が存在していることから、本発明におけるカクテル製剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用することによって、がん病変の縮小や生存期間の延長等の臨床効果を高めることができる。
【0046】
ある実施形態において、抗腫瘍薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、がん細胞や抗原提示細胞による免疫抑制作用を阻害する。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、以下の分子に対する薬剤（例えば、抗体）が挙げられる：CTLA-4（イピリムマブ、トレメリムマブなど）、PD-1（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、AMP-224、AMP-514（MEDI0680）、ピディリズマブ（CT-011）など）、LAG-3（IMP-321、BMS-986016など）、BTLA、KIR（IPH2101など）、TIM-3、PD-L1（Durvalumab（MEDI4736）、MPDL3280A、BMS-936559、アベルマブ（MSB0010718C）など）、PD-L2、B7-H3（MGA-271など）、B7-H4、HVEM、GAL9、CD160、VISTA、BTNL2、TIGIT、PVR、BTN1A1、BTN2A2、BTN3A2、およびCSF1-R。好ましい実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1に対する薬剤、例えば抗PD-1抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、AMP-514（MEDI0680）、ピディリズマブ（CT-011）など）である。
【0047】
抗腫瘍薬としては、さらに、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、分子標的薬などが挙げられ、具体的には、5-FU、エストラムスチン、ドセタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、ジェムザール、リツキシマブなどが挙げられる。治療方法としては、手術、放射線療法、ホルモン療法（デキサメタゾン、ミトキサントロン、プレゾニゾロン、エストロゲン、プロゲストロンなどのステロイドやリュープリンなどのアナログ剤）などが挙げられる。
【0048】
本明細書において、併用とは、同一の患者のがんの治療に同時にまたは逐次使用されることを含み、その順序は問わない。本発明におけるカクテル製剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用する場合、カクテル製剤がＣＴＬ等の血球系の細胞を活性化して効果を発揮することから、造血系や免疫応答の活性化に影響を及ぼさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を使用することが好ましい。例えば、抗腫瘍薬の投与後リンパ球数が（例えば、１，０００個／ｍＬ以上に）回復してから本発明におけるカクテル製剤を投与する、本発明におけるカクテル製剤を投与した後に他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、あるいは本発明におけるカクテル製剤の投与期間中に白血球数やリンパ球数の減少を起こさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、などの方法が考えられる。
【0049】
さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法であって、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドを含むがんペプチドワクチンカクテル製剤を患者に投与することを含む方法に関する。
【0050】
さらなる態様において、本発明は、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造のための、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドの使用に関する。
【0051】
さらなる態様において、本発明は、がんの治療に使用するための、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドに関する。
【0052】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例0053】
がんペプチドワクチンのカクテル製剤の製造方法として、以下の表１の条件１～３の方法について、具体的な検討を行うこととした。
【0054】
【表1】
【0055】
［試験１］ペプチドの溶解性検討
表１の（i）の工程を評価するために、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド原薬（Lonza社に委託製造）を用いて、以下の方法にて、ペプチドの溶解性を検討した。
表１の（i）の工程を評価するために、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド原薬（Lonza社に委託製造）を用いて、以下の方法にて、ペプチドの溶解性を検討した。
【0056】
（条件１；グリシンバッファーによるペプチドの溶解）
配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭのグリシンバッファー（グリシン－ＨＣｌ緩衝液）（ｐＨ３．５）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法でグリシンバッファーに添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
なお、配列番号１のペプチドについては、グリシンバッファーに添加した後、数十秒程度vortexする必要があった。
配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭのグリシンバッファー（グリシン－ＨＣｌ緩衝液）（ｐＨ３．５）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法でグリシンバッファーに添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
なお、配列番号１のペプチドについては、グリシンバッファーに添加した後、数十秒程度vortexする必要があった。
【0057】
また、配列番号１～４のペプチドのグリシンバッファー溶液を、１５０μＬずつ分取して、混合し、配列番号１～４の４種類のペプチドを含むペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
【0058】
（条件２、３；１ｍＭの塩酸によるペプチドの溶解）
配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を評価した。
配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法で１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
なお、配列番号１のペプチドについて、１ｍＭの塩酸を用いた場合は、グリシンバッファーを用いた場合よりも容易に溶解することができた。
配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を評価した。
配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法で１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
なお、配列番号１のペプチドについて、１ｍＭの塩酸を用いた場合は、グリシンバッファーを用いた場合よりも容易に溶解することができた。
【0059】
また、配列番号１～４のペプチドの１ｍＭの塩酸溶液を、１５０μＬずつ分取して、混合し、配列番号１～４の４種類のペプチドを含むペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
【0060】
（結果）
ペプチドの溶解性を評価した各結果を表２に示す。
ペプチドの溶解性を評価した各結果を表２に示す。
【0061】
【表2】
【0062】
表２の結果から、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒であれば、配列番号１～４の個々のペプチドを溶解することができることが分かった。また、前述したように、１ｍＭ塩酸を用いた場合（条件２、３）は、５０ｍＭグリシンバッファーを用いた場合（条件１）よりも、短時間の撹拌でペプチドを溶解させることができたため、１ｍＭ塩酸の方が好ましいことが分かった。
また、配列番号１～４のペプチドを混合した場合も、澄明な状態が保持されたことから、配列番号１～４のペプチドの混合物であっても、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒で溶解できると考えられた。
すなわち、配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を調製する際に、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒を用いればこれらのペプチドを容易かつ簡便に溶解することができ、カクテル製剤の投与液を容易かつ簡便に調製し得ることが示された。
また、配列番号１～４のペプチドを混合した場合も、澄明な状態が保持されたことから、配列番号１～４のペプチドの混合物であっても、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒で溶解できると考えられた。
すなわち、配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を調製する際に、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒を用いればこれらのペプチドを容易かつ簡便に溶解することができ、カクテル製剤の投与液を容易かつ簡便に調製し得ることが示された。
【0063】
［試験２］ペプチド混合液のｐＨを上昇させることによる、ペプチドの溶解性への影響の検討
配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を用いる場合に、かかるカクテル製剤のワクチン効果をより高めるために、アジュバントをさらに添加する場合がある。アジュバントには様々な種類のものがあり、中には、保存至適ｐＨが中性領域であるものもある。カクテル製剤の投与液は、通常、複数人分をまとめて調製するため、投与液を調製後、投与溶液は一定時間保存してもペプチドの溶解状態が保持できることが好ましい。
そこで、ペプチド混合液のｐＨを中性領域に上昇させても（表１の（ii）の工程）、ペプチドの溶解状態が保持できるかを、以下の方法にて検討した。
配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を用いる場合に、かかるカクテル製剤のワクチン効果をより高めるために、アジュバントをさらに添加する場合がある。アジュバントには様々な種類のものがあり、中には、保存至適ｐＨが中性領域であるものもある。カクテル製剤の投与液は、通常、複数人分をまとめて調製するため、投与液を調製後、投与溶液は一定時間保存してもペプチドの溶解状態が保持できることが好ましい。
そこで、ペプチド混合液のｐＨを中性領域に上昇させても（表１の（ii）の工程）、ペプチドの溶解状態が保持できるかを、以下の方法にて検討した。
【0064】
（条件１；グリシンバッファーでペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
試験１の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
試験１の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
【0065】
（条件２；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
試験１の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
試験１の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
【0066】
（結果）
ペプチド混合液のｐＨの測定結果、及び、ペプチドの溶解性を評価した各結果を表３に示す。
ペプチド混合液のｐＨの測定結果、及び、ペプチドの溶解性を評価した各結果を表３に示す。
【0067】
【表3】
【0068】
表３の結果から、ペプチド混合液のｐＨを６に調整した場合であっても、配列番号１～４のペプチドは溶解状態が保持されることが分かった。
【0069】
［試験３］ペプチド混合液の乾燥後、水を添加した際のペプチドの溶解性の確認
ペプチド混合液を減圧乾燥した後、水を添加した際に、ペプチドが水に溶解するかを、以下の方法にて検討した。
ペプチド混合液を減圧乾燥した後、水を添加した際に、ペプチドが水に溶解するかを、以下の方法にて検討した。
【0070】
（条件１；グリシンバッファーでペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
試験２の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
試験２の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
【0071】
（条件２；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
試験２の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
試験２の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
【0072】
（条件３；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解するが、ヒスチジンバッファーでのｐＨ調整は行わない）
試験１の条件３に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液に５０％スクロースを９０μＬ添加した後、ｐＨ調整は行わずに、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
試験１の条件３に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液に５０％スクロースを９０μＬ添加した後、ｐＨ調整は行わずに、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
【0073】
（減圧乾燥）
シリカゲルを敷き詰めたデシケーター内の中板の上に、ペプチド混合液を含む前述のチューブ（計９本）を、蓋を開けたまま配置した。真空ポンプでデシケーター内を－０．０８Ｍｐａ程度まで減圧して１週間放置することにより、減圧乾燥を実施した。
シリカゲルを敷き詰めたデシケーター内の中板の上に、ペプチド混合液を含む前述のチューブ（計９本）を、蓋を開けたまま配置した。真空ポンプでデシケーター内を－０．０８Ｍｐａ程度まで減圧して１週間放置することにより、減圧乾燥を実施した。
【0074】
（結果）
減圧乾燥後の各チューブの外観を目視した結果を表４及び図１～３に示す。
減圧乾燥後の各チューブの外観を目視した結果を表４及び図１～３に示す。
【0075】
【表4】
【0076】
表４及び図１～３の結果から、条件１や条件２の場合は、減圧乾燥により、透明な塊がチューブの底にこびりついた状態となったのに対し、条件３の場合は、減圧乾燥により、白い塊がチューブの底にこびりついた状態となることが分かった。
【0077】
また、乾燥した前述の９本のチューブに、それぞれ２００μＬのMilliQ水を添加、撹拌して、ペプチド混合液の再構成を行った。再構成を行ったときの各チューブの外観を目視した結果を表５及び図４～６に示す。また、再構成したペプチド混合液のｐＨ及びＯＤ６００を測定した結果を表５に示す。
【0078】
【表5】
【0079】
表５及び図４～６の結果から、条件１と比較して、条件２、３の方が、水を添加した際の、ペプチド乾燥物の水への溶解性が高く、好ましいことが分かった。特に、条件２や条件３の場合は、溶液のＯＤ６００の値が特に低く、他の場合と比較してペプチドが特に良く溶解していることが分かった。また、条件２と条件３を比較すると、ｐＨを中性領域に調整しない条件３の方が、ペプチドの溶解性は多少高かったものの、ｐＨを中性領域に調整する条件２においても、ペプチドの十分な溶解性が得られることが分かった。
なお、水を添加してペプチド混合液を再構成した場合の溶液のｐＨは、減圧乾燥前の溶液のｐＨとおおむね同程度であった。
なお、水を添加してペプチド混合液を再構成した場合の溶液のｐＨは、減圧乾燥前の溶液のｐＨとおおむね同程度であった。
【0080】
また、MilliQ水を添加、撹拌してから２４時間静置後の各チューブの外観を目視した。その結果を表６及び図７、９、１１に示す。また、それらの各チューブをvortexした後に、再度外観を目視した。これらの結果を表６及び図８、１０、１２に示す。
【0081】
【表6】
【0082】
表６及び図７～１２の結果から、水を添加してから２４時間静置後や、さらにvortex後においても、条件１と比較して、条件２、３の方が、ペプチドが水によく溶解している状態であり、好ましいことが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】