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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024150488
(43)【公開日】2024-10-23
(54)【発明の名称】重水素を含有する化合物
(51)【国際特許分類】
C07C 237/20 20060101AFI20241016BHJP
C07C 229/36 20060101ALI20241016BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241016BHJP
A61K 31/27 20060101ALI20241016BHJP
A61K 31/216 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C07C237/20 CSP
C07C229/36
A61K45/00
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/27
A61K31/216
【審査請求】有
【請求項の数】23
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024107578
(22)【出願日】2024-07-03
(62)【分割の表示】P 2021521145の分割
【原出願日】2019-10-17
(31)【優先権主張番号】1816998.7
(32)【優先日】2018-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1909695.7
(32)【優先日】2019-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(71)【出願人】
【識別番号】513267523
【氏名又は名称】オンコペプティデス エービー
【氏名又は名称原語表記】Ｏｎｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ＡＢ
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】フレドリック・レーマン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】改善された特性を有するメルフルフェンの重水素化誘導体を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）の化合物：
式中、各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。本発明はまた、化合物を含有する薬学的組成物、および化合物の使用を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】式（Ｉ）の化合物：
式中、各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。本発明はまた、化合物を含有する薬学的組成物、および化合物の使用を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、
式中、
各Ｒ１～Ｒ３０が、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【化1】
各Ｒ１～Ｒ３０が、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが、少なくとも１ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、または９８ｍｏｌ％の重水素の、重水素存在量レベルを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも１つが、少なくとも５ｍｏｌ％の存在量レベルを有する重水素である、請求項１および２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも１つが、少なくとも５ｍｏｌ％の存在量レベルを有する重水素である、請求項１および２に記載の化合物。
【請求項5】
Ｒ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも１つが、少なくとも５ｍｏｌ％の存在量レベルを有する重水素である、請求項１および２に記載の化合物。
【請求項6】
Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つが、少なくとも５ｍｏｌ％の存在量レベルを有する重水素である、請求項１および２に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが、少なくとも５ｍｏｌ％の存在量レベルを有する重水素である、請求項１および２に記載の化合物。
【請求項8】
Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも２つが重水素である、例えば、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの２つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０のうちの３つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０のうちの４つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０の各々が重水素である、請求項７に記載の化合物。
【請求項9】
前記存在量レベルが、少なくとも１０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、または９８ｍｏｌ％の重水素である、請求項８に記載の化合物。
【請求項10】
前記化合物が、以下の群から選択される構造式を有する、請求項３に記載の化合物。
【化2】
【請求項11】
前記化合物が、以下の群から選択される構造式を有する、請求項４に記載の化合物。
【化3】
【請求項12】
前記化合物が、以下の群から選択される構造式を有する、請求項６に記載の化合物。
【化4】
【請求項13】
前記化合物が、以下の群から選択される構造式を有する、請求項７、８または９に記載の化合物。
【化5】
【請求項14】
前記化合物が、前記以下の構造式を有する、請求項１３に記載の化合物。
【化6】
【請求項15】
前記化合物が、以下の構造式を有する、請求項４および７、８または９に記載の化合物。
【化7】
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に定義される化合物を、薬学的に許容される担体と一緒に、任意選択で、追加の治療薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）またはアルキル化剤と一緒に含む、薬学的組成物。
【請求項17】
医薬としての使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
癌の治療または予防における使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項19】
多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病およびリンパ腫の治療または予防における使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項20】
薬学的有効量の請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物または請求項１６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、患者を治療するための方法。
【請求項21】
有効量の請求項１～１５に記載の化合物または請求項１６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、癌の治療または予防のための方法。
【請求項22】
前記癌が、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病およびリンパ腫のうちのいずれか１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
以下の群から選択される構造式を有する化合物、
またはその薬学的に許容される塩。
【化8】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に有益な特性を有する新規の重水素化メルフルフェン誘導体に関する。新規の重水素化メルフルフェン誘導体、またはそれらの塩は、癌の治療または予防における使用を見いだす。
【背景技術】
【0002】
メルフルフェン（メルファランフルフェナミドおよびL-メルファラニル-4-フルオロ-L-フェニルアラニンエチルエステルとしても知られる）は、癌の治療、特に多発性骨髄腫の治療に有用な抗腫瘍剤である。メルフルフェンは、ＷＯ０１／９６３６７およびＷＯ２０１４／０６５７５１に記載される。メルフルフェンの塩酸塩の構造は、下に示される。
メルフルフェンは、強力で親油性の高いアルキル化薬剤であり、腫瘍細胞へのアルキル化代謝物の標的化された送達を達成する。親水性である他のアルキル化薬剤とは対照的に、メルフルフェンの高い親油性は、組織および細胞へのその急速な取り込みにつながる。細胞の内側に入ると、メルフルフェンは、ＤＮＡに直接結合し得るか、または細胞内ペプチダーゼによってメルファランに容易に加水分解されるか、もしくは細胞内エステラーゼによってデス－エチルメトフルフェンに加水分解されるが、これもアルキル化特性を有する。ヒト腫瘍におけるエステラーゼおよびペプチダーゼの高い活性は、これらの細胞におけるメルフルフェンの代謝物の急速な形成につながり、次いで、より多くのメルフルフェンの流入につながる（Gullbo, J., et al, J Drug Target, (2003) Vol 11, pages 355-363；Wickstrom, M., et al, Biochem Pharmacol (2010) Vol 79, pages 2381 - 1290）。デス－エチルメルフルフェンおよびメルファランは比較的親水性であるため、これらの薬剤の細胞内捕捉に対する可能性が存在する。
【化1】
【0003】
ヒト腫瘍細胞の初代培養物のパネルへのメルフルフェンの添加は、メルファランのものと同様の活性のパターンを生じるが、有効性は５０～１００倍高く（Wickstrom, M., et al, Invest New Drugs (2008) Vol 26, pages 195 - 204）、このことは１０～２０倍高い細胞内濃度によって説明される（Gullbo, J., et al, J Drug Target, (2003) Vol 11, pages 355-363；Wickstrom, M., et al, Biochem Pharmacol (2010) Vol 79, pages 2381 - 1290）。このことは、これらの細胞へのメルフルフェンの非常に効率的な取り込み、およびメルフルフェン代謝物の効率的な形成によって説明され得る。
【0004】
メルフルフェンは、一般に、合成後に結晶形態で提供される。結晶形態は、多くの場合に製造および薬学的目的に好適でない強酸性水溶液にのみ溶解できる。以前の薬学的調製物では、結晶形態は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびグルコース溶液に溶解した。しかしながら、この調製物は、不安定であり、不要なメルフルフェン二量体を容易に形成した。ＤＭＡなどの有機溶媒はまた、患者に対して有害であり得、投与のために使用される医療装置に損傷を与え得る。ＷＯ２０１２／１４６６２５およびＷＯ２０１４／０６５７５１に記載されるように、メルフルフェンの凍結乾燥調製物は、水溶液中での改善された安定性および溶解性を有することが見いだされている。
【0005】
本質的に不安定である化合物は、取り扱いが難しく、不要な代謝物および不純物を形成する可能性がより高い。メルフルフェンなどのアルキル化薬剤は、患者にオフターゲット効果を引き起こし得る不要な遺伝毒性代謝物および不純物を形成する可能性を有するため、さらなる困難を提示する。したがって、不十分な安定性を有するアルキル化薬剤は、多くの場合に取り扱いが難しく、望ましくない薬理学的特性を有し得る。したがって、改善された安定性および取り扱い特性を有するメルフルフェン誘導体に対する必要性が、存在する。
【0006】
本発明者らは、メルフルフェンの重水素化誘導体が、重水素の天然存在量レベルを有するメルフルフェンと比較して改善された特性を有することを発見した。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、
式中、
各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【化2】
各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【0008】
本発明は、式（Ｉａ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩をさらに提供し、
式中、
各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【化3】
各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【0009】
本発明は、式（Ｉ）または（Ｉａ）の重水素化メルフルフェンを、許容可能な担体と一緒に含む組成物をさらに提供する。組成物は、任意選択で、追加の治療薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）またはアルキル化剤を含み得る。
【0010】
本発明は、式（Ｉ）または（Ｉａ）の重水素化メルフルフェンを、薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、任意選択で、追加の治療薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）またはアルキル化剤を含み得る。
【0011】
本発明は、医薬としての使用のための本発明による化合物または薬学的組成物をさらに提供する。さらに、癌、例えば、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病およびリンパ腫の治療または予防における使用のための本発明による化合物または薬学的組成物も、提供される。
【0012】
本発明は、薬学的有効量の本発明による化合物または薬学的組成物を投与することを含む、患者を治療する方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇ注入後の、雄および雌のビーグル犬の組み合わせにおけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の平均血漿濃度を示す。
【図2】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）またはメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）のＣ最大の比較を示す。
【図3】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）またはメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）のＡＵＣ最後の比較を示す。
【図4】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、デスエチル-メルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）のＣ最大の比較を示す。
【図5】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、デスエチル-メルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）のＡＵＣ最後の比較を示す。
【図6a】雄および雌のビーグル犬（群２は性別を組み合わせた）への１．２５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図6b】雄および雌のビーグル犬（群２は性別を組み合わせた）への１．２５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図7a】雄および雌のビーグル犬（群３は性別を組み合わせた）への２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図7b】雄および雌のビーグル犬（群３は性別を組み合わせた）への２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図8a】雄および雌のビーグル犬（群４は性別を組み合わせた）への２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェンの注入後のメルフルフェンならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図8b】雄および雌のビーグル犬（群４は性別を組み合わせた）への２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェンの注入後のメルフルフェンならびにその代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの平均血漿濃度を示す。
【図9】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、メルファランの個々および平均（±ＳＤ）のＣ最大の比較を示す。
【図10】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、メルファランの個々および平均（±ＳＤ）のＡＵＣ最後の比較を示す。
【図11】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、メルファランの個々および平均（±ＳＤ）のｔ１／２，ｚの比較を示す。
【図12】雄および雌のビーグル犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後の、メルファランの個々および平均（±ＳＤ）のＡＵＣ∞の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から独立して選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【0015】
本発明は、式（Ｉａ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、各Ｒ１～Ｒ３０は、独立して、Ｈおよび重水素からなる群から選択され、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは、重水素の天然に生じる存在量よりも多い存在量レベルを有する重水素である。
【0016】
重水素の天然に生じる存在量は、０．０１５６ｍｏｌ％であり、ｍｏｌ％は、重水素である試料の水素の総モル数の百分率である。したがって、１ｍｏｌの天然に生じる水素において、０．１５６ｍｍｏｌは重水素であるか、または６．０２２×１０２３個の天然に生じる水素原子の試料において、９．３９×１０１９個の重水素の原子があるか、または６４１３個の天然に生じる水素原子の試料には、１個の重水素の原子がある。
【0017】
メルフルフェンにおいて３０の炭素－水素（Ｃ－Ｈ）基があり、各々は天然に生じる水素同位体の分布を含む。したがって、メルフルフェンの試料において、各位置での重水素の存在量は、およそ０．０１５６ｍｏｌ％である。したがって、１ｍｏｌのメルフルフェンにおいて、４．６８ｍｍｏｌの重水素があるか、６．０２２×１０２３個のメルフルフェンの分子の試料において、２．８２×１０２１個の重水素の原子があるか、または２１４個のメルフルフェンの分子において、１個の重水素の原子がある。
【0018】
式（Ｉ）または（Ｉａ）のＲ１～Ｒ３０のうちの一つ以上が「重水素」と本明細書に示される場合、示された位置での重水素存在量は、重水素の天然に生じる存在量よりも多い。重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量レベルは、少なくとも１ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、または９８ｍｏｌ％の重水素であり得る。
【0019】
重水素は、安全で安定した水素の同位体である。炭素－重水素（Ｃ－Ｄ）結合を切断するために必要とされるエネルギーは、炭素－水素（Ｃ－Ｈ）結合を切断するために必要とされるエネルギーよりも高い。したがって、Ｃ－Ｄ結合の切断を伴う反応は、Ｃ－Ｈ結合を切断する反応よりも遅い速度で進行する。Ｃ－Ｈ結合が反応の律速段階において切断される場合、Ｃ－Ｄ結合への置換は、反応速度が減少させるであろう。この効果は、重水素速度論的同位体効果（ＤＫＩＥ）と呼ばれる。
【0020】
薬物の薬理学的特性に対する重水素化の影響は、予測不可能であり、経験的に決定されなければならない。いくつかの選択された場合では、重水素化は、薬物の薬理学的特性を改善することが示されている（例えば、ＷＯ２０１０／０４４９８１を参照されたい）。他の場合では、重水素化は、臨床的に関連する効果を有しないか、または薬物の薬理学的特性に対する負の影響を有し得る。
【0021】
薬物の重水素化は、薬物がシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）、エステラーゼ、ペプチダーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼなどの酵素によって代謝される速度を減少させ、その薬理学的特性を改変する場合がある。重水素化は、多くの場合に「代謝スイッチング」と称される現象である薬物の代謝プロファイルを改変する効果を有し得ることも、可能である。
【0022】
代謝スイッチングは、重水素化した薬物が、非重水素化薬物と比較して異なる立体構造で代謝酵素に結合する際に生じ得る。このことは、異なる割合の既知の代謝物の形成、または新しい代謝物の形成にもつながり得る（Fischer et al., Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(1), 100-109）。特定の位置での重水素の増加した存在量が、薬物の代謝物プロファイルをどのように改変し得るかを予測することは、可能でない。また、改変された代謝物プロファイルが、薬物の薬理学的特性を改善するか、またはそれに有害になるかどうかを予測することも、可能でない。
【0023】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明による重水素化メルフルフェン誘導体が特に有益な特性を有することを見いだした。例えば、重水素化メルフルフェン誘導体は、注入によって投与されると、同等用量のメルフルフェンと比較して、誘導体自体、同様に活性代謝物メルファランへの増加した全身曝露を生じる。この効果は、下の実施例（ａ）、および特に犬へのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェンの投与後の平均および個々のＣ最大およびＡＵＣ最後メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）／メルフルフェンまたはメルファランを示す実施例（ａ）の図３、４、９および１０に示される。
【0024】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルファランの同一用量についてのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルファランへの増加した曝露の結果は、非常に顕著な利益を有する。上で言及されたように、メルフルフェンの優れた臨床的有効性は、細胞へのメルフルフェンの非常に効率的な取り込みおよびメルフルフェン代謝物の効率的な形成によって説明され得る。したがって、メルフルフェンと比較して、メルフルフェン誘導体のさらにより高い曝露、および活性代謝物メルファランのより高い曝露につながる誘導体は、メルフルフェンのこれらの特性の両方を改善するように期待されるため、特に有利である。より少ない化合物が作製され、保管され、投与されるのに必要であることを意味するこれらの利点に加えて、同等用量のメルフルフェンと比較して、より低い用量の重水素化メルフルフェン誘導体が投与されることも可能にし、メルフルフェンの投与からの副作用のリスクを低減するか、または、メルフルフェンの用量と同じ用量が投与される場合、重水素化メルフルフェン誘導体およびメルファランへのより高い曝露が達成され得、耐え難い毒性副作用のリスクを増加させることなく、患者に臨床的利益を提供するより良い機会につながる。
【0025】
本発明による好まれる化合物は、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるものである。本発明による特に好まれる化合物は、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるものである。
【0026】
本発明によるさらに好まれる化合物は、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも２つが重水素であるか、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも３つが重水素であるか、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも４つが重水素であるか、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも５つが重水素であるか、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも６つが重水素であるか、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも７つが重水素であるか、またはＲ１～Ｒ８の少なくとも８つが重水素であるものである。
【0027】
本発明によるさらに好まれる化合物は、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも２つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも３つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも４つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも５つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも６つが重水素であるか、またはＲ９～Ｒ１５のうちの少なくとも７つが重水素であるものである。
【0028】
本発明によるさらに好まれる化合物は、Ｒ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも２つが重水素であるか、またはＲ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも３つが重水素であるものである。
【0029】
本発明によるさらに好まれる化合物は、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも２つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも３つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも４つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも５つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも６つが重水素であるか、またはＲ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも７つが重水素であるものである。
【0030】
本発明によるさらに好まれる化合物は、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも２つが重水素であるか、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも３つが重水素であるか、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも４つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも５つが重水素であるものである。本発明の１つの特に好まれる実施形態では、本発明による化合物は、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの５つが重水素であるものである。
【0031】
本発明によるさらに好ましい化合物は、Ｒ１～Ｒ３０のうちの少なくとも２つが重水素であるものである。特に好まれる化合物は、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも１つが重水素でありＲ９～Ｒ１５、Ｒ１６～Ｒ１８、Ｒ１９～Ｒ２５もしくはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも１つが重水素でありＲ１～Ｒ８、Ｒ１６～Ｒ１８、Ｒ１９～Ｒ２５もしくはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも１つが重水素でありＲ１～Ｒ８、Ｒ９～Ｒ１５、Ｒ１９～Ｒ２５もしくはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるか、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つが重水素でありＲ１～Ｒ８、Ｒ９～Ｒ１５、Ｒ１６～Ｒ１８もしくはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素であるか、またはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つが重水素でありＲ１～Ｒ８、Ｒ９～Ｒ１５、Ｒ１６～Ｒ１８もしくはＲ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つが重水素であるものである。
【0032】
本発明の一実施形態では、Ｒ１～Ｒ８のうち少なくとも２つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の群から選択され得る。
【化4】
【0033】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも４つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の群から選択され得る。
【化5】
【0034】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１～Ｒ８のうちの少なくとも８つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化6】
【0035】
本発明の別の実施形態では、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも２つは重水素であり、例えば、Ｒ９～Ｒ１２のうちの少なくとも２つは重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の群から選択され得る。
【化7】
【0036】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１６～Ｒ１８のうちの少なくとも３つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化8】
【0037】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化9】
【0038】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも２つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化10】
【0039】
本発明の別の実施形態では、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも３つは、重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化11】
【0040】
本発明の特に好まれる実施形態では、Ｒ２６～Ｒ３０のうちの５つは、重水素である（すなわち、Ｒ２６～Ｒ３０の各々は、重水素である）。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化12】
【0041】
本発明の別の実施形態では、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも１つは重水素であり、Ｒ１９～Ｒ２５のうちの少なくとも１つは重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の構造を有し得る。
【化13】
【0042】
本発明の別の実施形態では、Ｒ９～Ｒ１５のうちの少なくとも１つは重水素であり、Ｒ１～Ｒ８またはＲ２６～Ｒ３０のうちの少なくとも１つは重水素である。例えば、本発明による化合物は、重水素（Ｄ）であるように示される原子の各々が、重水素の天然に生じる存在量よりも多い重水素存在量を有する、以下の群から選択され得る。
【化14】
【0043】
本発明の化合物は、有機化学の当業者に既知の方法を使用して、かつメルフルフェンを調製するための既知の手順の日常的な修正によって調製され得る。メルフルフェンを調製するための手順は、ＷＯ０１／９６３６７およびＷＯ２０１６／１８０７４０に記載される。重水素化化合物を調製するための手順は、当技術分野で既知である。例えば、Sajiki, New Horizons of Process Chemistry (2017), Springer, pg 29-40およびHanson, The Organic Chemistry of Isotopic Labelling (2011), Chapter 3, RSC Publishingを参照されたい。
【0044】
本発明の化合物は、重水素化試薬を用いる合成技法によって調製され得る。代替的には、重水素は、重水素化還元剤を使用する還元可能な部分の還元によって導入され得る。さらなる代替的アプローチは、金属触媒、例えば、Ｐｄ／ＣまたはＰｔ／Ｃ触媒の存在下でＤ２ガスを使用する合成後水素－重水素交換反応の使用である。
【0045】
本発明の化合物は、重水素化および非重水素化試薬の組み合わせを使用することによって調製され得る。好適な重水素化試薬は、各重水素が重水素の天然に生じる存在量よりも大きい存在量レベルを有するものである。例えば、少なくとも１ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、または９８ｍｏｌ％の重水素の存在量レベルである。好適な重水素化試薬は、重水素化クロロ酢酸、重水素化クロロエタノール、重水素化エチレンオキシド、重水素化エタノール、重水素化パラ－フルオロ－フェニルアラニン、重水素化パラ－ニトロ－フェニルアラニンおよび重水素化パラ－アミノ－フェニルアラニンを含む。重水素化試薬は、商業的供給業者から購入され得る。代替的には、それらは、上記のような水素－重水素交換反応を使用して、非重水素化試薬から調製され得る。
【0046】
本発明の化合物はまた、重水素化還元剤を使用することによって調製され得る。好適な重水素化還元剤は、重水素化ボラン、重水素化ボラン－ルイス塩基複合体、ボロ重水素化物（borodeuteride）、金属重水素化物、および金属触媒の存在下でのＤ２ガスを含む。
【0047】
本発明の化合物はまた、水素－重水素交換反応を使用してメルフルフェンから調製され得る。
【0048】
本発明による化合物を調製するための特定の方法は、実施例セクションにおいて本明細書に記載される。
【0049】
疑いを避けるために、この文書では、用語「重水素化メルフルフェン」は、使用される際に、別段明記されない限り、その塩（複数可）を含む。メルフルフェン、およびその塩、特にその塩酸塩は、例えば、ＷＯ０１／９６３６７およびＷＯ２０１４／０６５７５１から既知であり、同じ塩は本発明における使用に好適である。
【0050】
本発明における使用に好適である重水素化メルフルフェンの塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。好適な塩は、有機または無機酸を用いて形成されたものを含む。特に、本発明による酸を用いて形成された好適な塩は、例えば、非置換であるか、もしくは例えば、ハロゲンによって置換されている１～４個の炭素原子のアルカンカルボン酸などの、飽和もしくは不飽和ジカルボン酸などの、ヒドロキシカルボン酸などの、アミノ酸などの鉱酸、強有機カルボン酸を用いるか、または例えば、非置換であるか、もしくは例えばハロゲンによって置換されている（Ｃ１－Ｃ４）－アルキルもしくはアリール－スルホン酸などの有機スルホン酸を用いて形成されたものを含む。薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、およびグルタミン酸、リジンおよびアルギニンから形成されたものを含む。
【0051】
重水素化メルフルフェンの好ましい塩は、塩酸、臭化水素酸、酢酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、硫酸、コハク酸、リン酸、シュウ酸、硝酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、およびクエン酸から形成されたものなどの酸付加塩を含む。より好ましくは、本発明による重水素化メルフルフェンの塩は、塩酸塩（すなわち、塩酸から形成された付加塩）である。
【0052】
有機化学の当業者は、多くの有機化合物が、それらが反応するか、またはそれらから沈殿もしくは結晶化される溶媒と複合体を形成できることを理解するであろう。これらの複合体は、「溶媒和物」として知られる。例えば、水との複合体は「水和物」として知られる。複合体は、化学量論的または非化学量論的量で溶媒を組み込むことができる。溶媒和物は、Water-Insoluble Drug Formulation, 2nd ed R. Lui CRC Press, page 553 and Byrn et al Pharm Res 12(7), 1995, 945-954に記載される。溶液中で作製される前に、本発明における使用のための式（Ｉ）および（Ｉａ）の重水素化メルフルフェン、またはその塩は、溶媒和物の形態にあり得る。医薬としての使用に好適である重水素化メルフルフェンの溶媒和物は、関連する溶媒が薬学的に許容されるものである。例えば、水和物は、薬学的に許容される溶媒和物である。
【0053】
本発明による化合物は、単独で投与されることは可能である一方で、組成物、特に、薬学的組成物に存在することが好ましい。薬学的組成物は、経口、非経口（皮下、皮内、骨内注入、筋肉内、血管内（ボーラスまたは注入）、および髄内を含む）、腹腔内、経粘膜、経皮、直腸および局所（皮膚、頬側、舌下および眼内を含む）投与に好適なものを含むが、最も好ましい経路は、例えば、治療下の対象の状態および障害に依存し得る。
【0054】
経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、所定量の活性成分を各々含有するカプセル、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として、粉末もしくは顆粒として、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または、水中油型液体エマルションまたは油中水型液体エマルションとして、提示され得る。重水素化メルフルフェンはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提示され得る。様々な薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準的な製剤専門書、例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載される。Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S, 1988も参照されたい。
【0055】
非経口投与のための薬学的組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性無菌注射液と、懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液と、を含む。好ましくは、製剤は、単位投与量または分割投与量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルに提示され得る。製剤は、使用直前に、無菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。かかる凍結乾燥製剤は、確立されたメルフルフェン化合物についてのＷＯ２０１２／１４６６２５およびＷＯ２０１４／０６５７５１から既知である。本発明の化合物は、同様の方法で、例えば、活性成分およびスクロースを含有する凍結乾燥形態で、例えば、１：２５～１：７５、例えば、１：５０の重量比で製剤化され得る。即時注射および注入溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒または他の乾燥組成物から調製され得る。非経口投与のための例示的な組成物は、例えば、好適な無毒性の、非経口的に許容される希釈剤もしくは溶剤、マンニトール、1,3-ブタンジオール、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、または合成モノグリセリドもしくはジグリセリド、およびオレイン酸もしくはCremaphorを含む脂肪酸を含む、他の好適な分散剤もしくは湿潤剤ならびに懸濁剤を含有できる、注射可能な液剤または懸濁液を含む。
【0056】
鼻腔、エアロゾルまたは吸入投与のための薬学的組成物は、例えば、ベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、生物学的利用能を向上させるための吸収促進剤、および／または当該技術分野で既知のものなどの他の可溶化剤もしくは分散剤を含有できる、生理食塩水中の溶液を含む。
【0057】
直腸投与のための薬学的組成物は、カカオバター、合成グリセリドエステル、またはポリエチレングリコールなどの通常の担体と共に坐剤として提示され得る。かかる担体は、典型的には、常温で固体であるが、直腸腔内では液化および／または溶解して薬物を放出する。
【0058】
口腔における局所投与、例えば、頬側または舌下投与のための薬学的組成物は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの香味付けした基剤中に活性成分を含むロゼンジ剤、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの基剤中に活性成分を含むパスチル（pastille）を含む。局所投与用の例示的な組成物は、Plastibase（ポリエチレンを用いてゲル化された鉱油）等の局所用担体を含む。
【0059】
本発明による化合物、組成物および薬学的組成物は、癌の治療および／または予防において使用され得、腫瘍増殖を低減し、かつ／または腫瘍細胞を死滅させる。したがって、重水素化メルフルフェンは、癌疾患に苦しむ患者を治癒し、かつ／またはその生存を延長するために使用され得る。本発明は、特に状態が再発性または難治性である際に、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、白血病およびリンパ腫の治療ならびに／または予防に特に有用である。本発明は、再発性難治性多発性骨髄腫の治療における特定の使用を見いだす。
【0060】
治療効果を達成するために必要とされる重水素化メルフルフェンの量は、投与の特定の経路および治療下の対象の特徴、例えば、種、年齢、重量、性別、医学的状態、特定の疾患およびその重症度、ならびに他の関連する医学的および身体的因子によって異なるであろう。通常の熟練した医師は、癌の治療または予防のために必要とされる重水素化メルフルフェンの有効量を容易に決定および投与することができる。
【0061】
重水素化メルフルフェン、またはその塩は、毎日、２日もしくは３日ごと、毎週、２、３、もしくは４週ごと、または治療される対象および癌形態に依存して高単回用量としても投与され得る。
【0062】
好ましくは、重水素化メルフルフェン、またはその塩（任意の塩の質量を除く）は、投与あたり約１５～１５０ｍｇの量で投与され得る。例えば、１５、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍｇである。
【0063】
代替的には、重水素化メルフルフェン、またはその塩（任意の塩の質量を除く）は、単回高用量で投与され得る。単回高用量は、約１５０～１２００ｍｇ、例えば、約１５０～８００ｍｇであり得る。例えば、それは、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００および１２００ｍｇから選択され得る。例えば、それは、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００および８００ｍｇから選択され得る。
【0064】
重水素化メルフルフェン、またはその塩は、本発明の唯一の活性成分として使用され得るが、１つ以上のさらなる治療薬（複数可）と組み合わせて使用することも可能であり、かかる組み合わせの使用は、本発明の１つの好まれる実施形態を提供する。かかるさらなる治療薬は、癌の治療または予防に有用な薬剤、または他の薬学的に活性な材料であり得る。かかる薬剤は、当技術分野で既知である。本発明における使用のためのさらなる治療薬の例は、ステロイド（プレドニゾンおよびデキサメタゾン）、ＩＭｉＤ（サリドマイド、レナリドマイドおよびポマリドマイド）、ＰＩ（ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（パノビノスタット）および従来の化学療法（アルキル化剤（例えば、メルファラン、シクロホスファミド）およびドキソルビシン）を含む。
【実施例0065】
本発明の化合物の合成
一般的な実験の詳細
別段明記されない限り、全ての試薬および溶媒を、商業的供給業者から購入し、さらなる精製なく使用した。メルフルフェンおよびメルフルフェン中間体は、ＷＯ２０１６／１８０７４０またはＷＯ０１／９６３６７に記載される合成方法を使用して調製され得る。
一般的な実験の詳細
別段明記されない限り、全ての試薬および溶媒を、商業的供給業者から購入し、さらなる精製なく使用した。メルフルフェンおよびメルフルフェン中間体は、ＷＯ２０１６／１８０７４０またはＷＯ０１／９６３６７に記載される合成方法を使用して調製され得る。
【0066】
分析用ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳを、エレクトロスプレーインターフェースおよびＵＶダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100シリーズ液体クロマトグラフィー／質量選択検出器（ＭＳＤ、シングル四重極）を使用して実施した。分析を、３分にわたる０．１％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリルの１０－９７％勾配および１ｍｌ／分の流量を用いるACE 3 C8（３．０×５０ｍｍ）カラム（条件＃１）、または３分にわたる１０ｍＭ重炭酸アンモニウム中のアセトニトリルの１０－９７％勾配および１ｍｌ／分の流量を用いるXbridge C18（３．０×５０ｍｍ）カラム（条件＃２）のいずれかを使用する２つの方法によって実施し、両方とも３０５ｎｍでＵＶ検出を有した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、２５℃でBruker 400MHz機器に記録した。分取ＨＰＬＣを、Xbridge Prep C18 5μM OBD（１９×５０ｍｍ）カラムを使用し、アセトニトリルおよび５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを緩衝剤として用いるＵＶ検出器を備えたGilsonシステム上で実施した。
【0067】
実施例１ (2S)-2-[[(2S)-2-アミノ-3-[4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル]プロパノイル]アミノ]-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸（ＩＩ）の合成。
塩酸メルフルフェン（５００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、水（１０ｍＬ）に懸濁させ、濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）の添加が続いた。反応混合物を、室温で２４時間撹拌した。トルエンを反応混合物に添加し、溶液を真空中で濃縮した。このプロセスを、３回繰り返した。次いで、溶液を、真空中で蒸発乾固させた。粗混合物を、実施例２のための出発材料として使用した。
【化15】
【0068】
実施例２ メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェン-ｄ６（ＩＶ）およびメルフルフェン-ｄ７（Ｖ）の合成
化合物ＩＩ（５０７ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、エタノール-ｄ６（４．８６ｇ、９３．３２ｍｍｏｌ）に溶解し、還流させた。２時間後、化合物ＩＩのエステルへのほぼ完全な変換があった。反応混合物を、室温に冷却し、次いで真空中で蒸発乾固させて、白色固体（４９５ｍｇ、９５％）を得た。
【化16】
【0069】
最終化合物のＮＭＲは、アニリン官能基のオルト位置で部分的な重水素化を示した。δ６．７８－６．８２ｐｐｍでの二重線の積分は、最終試料がメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェン-ｄ６（ＩＶ）およびメルフルフェン-ｄ７（Ｖ）の不均一混合物であり、最終試料が約１２．５％のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）を含むことを示唆した。重水素－プロトン交換は、重水素化溶媒中の熱および酸性条件下で、アニリン官能基においてプロトンと共に生じることが知られている。
ＬＣ－ＭＳ（条件＃１）：ｔＲ ２．２８分（純度＞９７％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０５。ＬＣ－ＭＳ（条件＃２）：ｔＲ ２．６３分（純度＞９８％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ／ｐｐｍ；２．９２－２．９７（ｍ，１Ｈ），３．０１－３０６（ｍ，１Ｈ），３．１６－３．２１（ｄｄ，２Ｈ），３．６７－３．７１（ｍ，４Ｈ），３．７８－３．８１（ｍ，４Ｈ），４．０２－４．０５（ｍ，１Ｈ），４．６９－４．７３（ｍ，１Ｈ），６．７８－６．８２（ｄ，０．２５Ｈ），７．０２－７．０７（ｔ，２Ｈ），７．１９（ｓ，２Ｈ），７．２４－７．２８（ｍ，２Ｈ）。
ＬＣ－ＭＳ（条件＃１）：ｔＲ ２．２８分（純度＞９７％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０５。ＬＣ－ＭＳ（条件＃２）：ｔＲ ２．６３分（純度＞９８％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０５。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ／ｐｐｍ；２．９２－２．９７（ｍ，１Ｈ），３．０１－３０６（ｍ，１Ｈ），３．１６－３．２１（ｄｄ，２Ｈ），３．６７－３．７１（ｍ，４Ｈ），３．７８－３．８１（ｍ，４Ｈ），４．０２－４．０５（ｍ，１Ｈ），４．６９－４．７３（ｍ，１Ｈ），６．７８－６．８２（ｄ，０．２５Ｈ），７．０２－７．０７（ｔ，２Ｈ），７．１９（ｓ，２Ｈ），７．２４－７．２８（ｍ，２Ｈ）。
【0070】
実施例３ エチル (2S)-2-[[(2S)-3-[4-[ビス(1,1,2,2-テトラデューテリオ-2-ヒドロキシ-エチル)アミノ]フェニル]-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロパノイル]アミノ]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（ＶＩ）の合成
エチル (2S)-2-[[(2S)-3-(4-アミノフェニル)-2-tertブトキシカルボニルアミノ)プロパノイル]アミノ]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（４７０ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、好適な合成方法についてはＷＯ２０１６／１８０７４０を参照されたい）を、アセトニトリルに懸濁させた。Ｎａ２ＣＯ３（２１０．４２ｍｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を、室温で反応混合物に添加した。次いで、反応混合物を、1,1,2,2-テトラデューテリオ-2-ヨード-エタノール（０．１７ｍＬ、２．１８ｍｍｏｌ）を添加する前に１５分間撹拌した。反応混合物を、還流下で１か月間撹拌した。冷却後、反応物を、ＤＣＭおよび水に分割し、ＤＣＭで抽出した。有機相を濃縮し、生成物を分取ＨＰＬＣによって精製して、表題化合物（０．２９ｇ、５１％）を得た。
【化17】
【0071】
実施例４ メルフルフェン-ｄ８（ＶＩＩ）の合成。
化合物ＶＩ（２９０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭに溶解し、ＰＯＣｌ３の緩徐な添加が続いた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を、水およびＤＣＭ上で分割し、次いで１ＭのＮａＯＨを添加することによって塩基性化した。表題化合物をジエチルエーテルで抽出し、溶媒を真空中で蒸発させて、表題化合物をおよそ９５％純度（９６ｍｇ、３７％）の淡黄色の泡として得た。ＬＣ－ＭＳ（条件＃１）：ｔＲ ２．２７分、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０６。ＬＣ－ＭＳ（条件＃２）：ｔＲ ２．６３分、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］５０６。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ／ｐｐｍ；１．００－１．１５（ｔ，３Ｈ），２．８０－２．８４（ｍ，１Ｈ），２．９１－２．９５（ｍ，１Ｈ），３．０４－３．０９（ｄｄ，２Ｈ），３．９０－３．９４（ｍ，１Ｈ），４．０３－４．０８（ｑ，２Ｈ），４．５８－４．６２（ｍ，１Ｈ），６．６８－６．７０（ｄ，２Ｈ），６．９０－６．９４（ｔ，２Ｈ），７．０７－７．１０（ｄ，２Ｈ），７．１３－７．１７（ｍ，２Ｈ）。
【化18】
【0072】
実施例５ (2S)-2-[[(2S)-2-アミノ-3-[4-[ビス(2-クロロ-1,1,2,2-テトラデューテリオエチル)アミノ]フェニル]プロパノイル]アミノ]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（ＶＩＩＩ）の調製
化合物ＶＩＩ（２０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、水（３ｍＬ）に懸濁させ、濃ＨＣｌ（３ｍＬ）の添加が続いた。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。トルエンを反応混合物に添加し、溶液を真空中で濃縮した。このプロセスを、３回繰り返した。残留物を、アセトニトリル／水に溶解し、バイアルに移し、Ｎ２流を使用した溶媒の除去が続いて、表題化合物（１３．７ｍｇ、６４％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（条件＃１）：ｔＲ １．９７分（純度＞９５％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］４７８。ＬＣ－ＭＳ（条件＃２）：ｔＲ １．７２分（純度＞９４％）、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］４７８。
【化19】
【0073】
実施例６ 生物学的活性
蛍光マイクロカルチャー細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）（Larsson, R., et al-1992: Int J Cancer, 50,177-185）が、化合物を評価するために使用される。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC, Roskilde, Denmark）は、２０μｌの薬液を所望の濃度の１０倍で調製され、－７０℃で最大２か月間保管される。一般に、物質は、最初に無水または酸性エタノールに４．０～８．２ｍＭの濃度に溶解され、さらに無菌水または無菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈される。水での全ての希釈は、マスタード加水分解の影響を最小化するために実験の直前に行われる。最終エタノール濃度は、１％ｖ／ｖを超えない。実験のゼロ日目に、適切な濃度の細胞懸濁液１８０μＬを解凍したプレートのウェルに添加し、６つのウェルを対照（細胞懸濁液のみ）として、６つのウェルをブランク（細胞培地のみ）として供する。７２時間のインキュベーション後、細胞がＰＢＳで１回洗浄され、生理学的緩衝液中の１００μＬのフルオレセインジアセテート（１０μｇ／ｍｌ）が添加される。さらに４５分後、生成した蛍光（ex 485 rim ; em 528 nm）は、９６ウェルスキャニング蛍光光度計（Fluoroscan II, Labsystems Oy, Helsinki, Finland）で測定される。生成した蛍光は生細胞の数に比例し、データは生存指数（ブランク値が差し引かれた対照ウェルのパーセントでの試験ウェルにおける蛍光）およびＩＣ５０（ソフトウェアGraphPad Prism＠（Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USAによって計算された場合、阻害濃度５０％）として提示される。成功したアッセイのための品質基準は、トリパンブルー排除試験によって判断された場合、それぞれブランク（６ウェル）、対照（６ウェル）、試験ウェル（３）において３０％未満の変動係数、ブランクの１０倍超の対照信号、および最後に７０％（初代ヒト腫瘍培養物）または９０％（細胞株）超の初期細胞生存率を含む。
蛍光マイクロカルチャー細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）（Larsson, R., et al-1992: Int J Cancer, 50,177-185）が、化合物を評価するために使用される。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC, Roskilde, Denmark）は、２０μｌの薬液を所望の濃度の１０倍で調製され、－７０℃で最大２か月間保管される。一般に、物質は、最初に無水または酸性エタノールに４．０～８．２ｍＭの濃度に溶解され、さらに無菌水または無菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈される。水での全ての希釈は、マスタード加水分解の影響を最小化するために実験の直前に行われる。最終エタノール濃度は、１％ｖ／ｖを超えない。実験のゼロ日目に、適切な濃度の細胞懸濁液１８０μＬを解凍したプレートのウェルに添加し、６つのウェルを対照（細胞懸濁液のみ）として、６つのウェルをブランク（細胞培地のみ）として供する。７２時間のインキュベーション後、細胞がＰＢＳで１回洗浄され、生理学的緩衝液中の１００μＬのフルオレセインジアセテート（１０μｇ／ｍｌ）が添加される。さらに４５分後、生成した蛍光（ex 485 rim ; em 528 nm）は、９６ウェルスキャニング蛍光光度計（Fluoroscan II, Labsystems Oy, Helsinki, Finland）で測定される。生成した蛍光は生細胞の数に比例し、データは生存指数（ブランク値が差し引かれた対照ウェルのパーセントでの試験ウェルにおける蛍光）およびＩＣ５０（ソフトウェアGraphPad Prism＠（Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USAによって計算された場合、阻害濃度５０％）として提示される。成功したアッセイのための品質基準は、トリパンブルー排除試験によって判断された場合、それぞれブランク（６ウェル）、対照（６ウェル）、試験ウェル（３）において３０％未満の変動係数、ブランクの１０倍超の対照信号、および最後に７０％（初代ヒト腫瘍培養物）または９０％（細胞株）超の初期細胞生存率を含む。
【0074】
フルオレセインジアセテート（FDA, Sigma）は、ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌに溶解され、暗所でストック溶液として凍結保存される。１０％熱不活化胎仔ウシ血清（FCS, Sigma chemical Co., St. Louis, MO）、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００μｇ／ｍｌペニシリンを添加した細胞増殖培地ＲＰＭＩ－１６４０（Sigma）が、使用される。
【0075】
実施例７ａ エタノール（ｄ６）と共にp-フルオロ-L-フェニルアラニンのエステル化による（２Ｈ５）エチル (2S)-2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩の製造
p-フルオロ-L-フェニルアラニン（１．０ｋｇ、ＣＡＳ番号1132-68-9）を、エタノール-ｄ６（２．５ｌ、ＣＡＳ番号：1516-08-1）および1,2-ジクロロエタン（２．０ｌ）にスラリー化した。ＮａＯＨ（５Ｍ溶液）を含むスクラバーを、反応器の出口、コンデンサーの後に接続した。スクラバー液の分解を追跡するために、ブロモチモールブルー（１～２ｍｇ）を、添加した。
【化20】
【0076】
反応器を、６０℃の内部温度に加熱した。内部温度が６０℃に達した際に、塩化チオニル（６００ｍｌ）の添加を、緩徐な速度で開始した。最初に、非常に厚い沈殿物が形成された。最初の非常に厚いスラリーは、反応の過程で薄くなった。添加のための総時間は、約３時間であった。内部温度は、７０℃の最大値に達することができ、それに応じてマントル温度を調整することによって制御された。完全な添加後、マントル温度を調整して、内部温度を６５～７０℃に維持した。
【0077】
所望の（２Ｈ５）エチル(2S)-2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩への完全な変換を、塩化チオニルの完全な添加の点の３時間後に達成した。完全な変換が確認された後（以下の通りの条件でのＬＣ－ＭＳ分析：３分にわたる１０－９０％のＢグラジエントを用いるACE 3 C8（３．０×５０ｍｍ）カラム、移動相Ａ、水０．１％のＴＦＡ、移動相Ｂ、純粋なアセトニトリル、１ｍＬ／分の流量、２１５～３９５、２５４および２２０ｎｍでのＵＶ検出）、反応物を冷却し（内部温度約４５℃）、tert-ブチルメチルエーテル（１２．５Ｌ）を添加して、生成物を白色沈殿物として得た。混合物を、均一な混合物を得るために撹拌した。
【0078】
次いで、混合物を、０℃の内部温度に冷却し、濾過前にこの温度で約３０分間熟成させた。固体の（２Ｈ５）エチル (2S)-2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩を、約１Ｌのtert-ブチルメチルエーテルで洗浄し、次いで、減圧下で３０℃の最高温度で乾燥させた。塊が存在する場合はそれを取り除くために、製品を、注意深く篩にかけた。（２Ｈ５）エチル (2S)-2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩の単離収率は、９２％であった。ＬＣ－ＭＳ：ｔＲ １．４３分、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２１７。
【0079】
実施例７ｂ （２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（ＩＸ）のＫｇスケール製造
メルファラン（１．６６３ｋｇ、５．４５ｍｏｌ、１当量）を、精製水（１６．０ｋｇ）、ＮａＯＨ（３２％、水溶液、１．０４ｋｇ）、およびテトラヒドロフラン（１０．０ｋｇ）の混合物に１０～１５℃で添加した。二炭酸ジ-tert-ブチル（１．３０８ｋｇ、５．９９ｍｏｌ、１．１当量）およびテトラヒドロフラン（４．７５ｋｇ）の混合物を、１０～１５℃で添加した。反応混合物を、メルファランの最小９７．０％（ＨＰＬＣ）変換が達成されるまで１８～２３℃で４～５時間撹拌した。温度を１５～２０℃に調整し、この温度を維持しながら、ｐＨを１．５ＭのＨＣｌで２．５～３．０に調整した。酢酸エチル（７．３４ｋｇ）を添加し、相を分離した。水相を、酢酸エチル（７．３４ｋｇ）で抽出した。組み合わせた有機相を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、フィルターケーキを酢酸エチルで洗浄した。溶媒を真空蒸留によって除去し、(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパン酸を含有する残留物を２０～２５℃で最低１２時間真空中で乾燥させた。ＨＰＬＣ：保持時間１１．９分。（ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：試料溶媒アセトニトリル：水、１：１（ｖ／ｖ）、Waters、Atlantic T3（３μ、４．６×１５０ｍｍ）カラム、２３分にわたる１０－９０－１０％Ｂ勾配、１ｍＬ／分の流量、移動相Ａ：１．０ＬのＭＱ水中５００μＬのリン酸８５％、移動相Ｂ：１．０アセトニトリル中５００μＬのリン酸８５％、２６２ｎｍでのＵＶ検出を伴う）。
【化21】
【0080】
(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパン酸残留物を、ジクロロメタン（４４．０ｋｇ）に再溶解した。4-メチルモルホリン（１．３７８ｋｇ、１３．６３ｍｏｌ、２．５当量）を添加し、（２Ｈ５）エチル (2S)-2-アミノ-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩（１．３７７ｋｇ、５．４５ｍｏｌ、１．０当量）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｈ２Ｏ（０．０８３ｋｇ、０．５４ｍｏｌ、０．１当量）およびN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド、ＨＣｌ（１．０４５ｋｇ、５．４５ｍｏｌ、１．０当量）が続いた。反応混合物を、(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパン酸の（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエートへの最小９７．０％（ＨＰＬＣ）の変換が達成されるまで、１８～２３℃で３～４時間撹拌した（ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：試料溶媒アセトニトリル、Waters、Atlantic T3（３μ、４．６×１５０ｍｍ）カラム、２３分にわたる１０－９０－１０％Ｂ勾配、１ｍＬ／分の流量、移動相Ａ：１．０ＬのＭＱ水中の５００μＬのリン酸８５％、移動相Ｂ：１．０アセトニトリル中の５００μＬのリン酸８５％、２６２ｎｍでのＵＶ検出を伴う）。
【0081】
ｐＨを、５％のＫＨＳＯ４（水溶液）を用いて３．０～４．０に調整した。有機相を固定し、水相をジクロロメタン（２９．０ｋｇ）で抽出した。第１の有機相を、６％のＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機相を固定し、残りの水相を第２の有機相で逆抽出した。組み合わせた有機相を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。乾燥した有機相を、真空中での蒸留によって２２～２６Ｌに濃縮した。還元した有機相を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル（４０～６３ｐｍ、２２．４ｋｇ）、n-ヘプタン（６．７ｋｇ）およびジクロロメタン（５２．２ｋｇ））に適用した。カラムを、６％酢酸エチル／ジクロロメタンで溶出した。（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（ＴＬＣ）を含有する画分を、組み合わせ、減圧下で２６～２８Ｌに蒸発させた。酢酸エチル（５．８ｋｇ）を添加し、蒸発を２６～２８Ｌに続けた。この手順を繰り返した。酢酸エチルの添加後、（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエートの沈殿が、開始した。任意選択で、（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエートの種結晶は、沈殿を支援するために添加され得る。酢酸エチル（５．８ｋｇ）を再度添加し、任意選択の播種ステップは繰り返され得る。混合物を減圧下で１９～２１Ｌに蒸発させ、n-ヘプタン（２２．１ｋｇ）を３５～４５℃で添加した。懸濁液を、－２～２℃に冷却し、２～１８時間撹拌した。固体を遠心分離によって単離し、フィルターケーキをn-ヘプタンで洗浄した。固体を３０℃で真空中で乾燥させて、（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（２．６ｋｇ、８０％）を、白色からわずかに黄色の固体材料として得た。ＨＰＬＣ：保持時間１３．４分。
【0082】
実施例７ｃ メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩）のＫｇスケール製造
塩化水素（１．３１ｋｇ、３５．９ｍｏｌ）およびアセトニトリル（２１．７ｋｇ）から調製されたアセトニトリル中１．３ＭのＨＣｌ中の（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート（化合物ＩＸ）（３．１０ｋｇ、５．１４ｍｏｌ）の溶液を、２９～３３℃で１２～２４時間撹拌した。（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}-2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]-アミノ}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエートの、最小９９．０％（ＨＰＬＣ）の（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩への変換が得られた（ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：試料溶媒ＤＭＳＯアセトニトリル、１：９（ｖ／ｖ）、Waters、Atlantic T3（３μ、４．６×１５０ｍｍ）カラム、２３分にわたる１０－９０－１０％Ｂ勾配、１ｍＬ／分の流量、移動相Ａ：１．０ＬのＭＱ水中５００μＬのリン酸８５％、移動相Ｂ：１．０アセトニトリル中５００μＬのリン酸８５％、２６２ｎｍでのＵＶ検出を伴う）。
【化22】
【0083】
反応混合物を、ポリッシュ濾過（polish filtration）に供し、アセトニトリル（６８．９ｋｇ）で希釈した。次いで、減圧での蒸留を、４５℃のジャケット温度を使用して実施した。反応混合物の体積が８６Ｌになった際に、アセトニトリル（２２．７ｋｇ）を添加し、蒸留を続けた。８６Ｌの反応混合物が残った際に、アセトニトリル（２２．７ｋｇ）を添加し、蒸留を続けた。反応器における体積が８６Ｌになった際に、アセトニトリル（２２．７ｋｇ）を添加し、蒸留を、反応器における８６Ｌの体積に達するまで続けた。
【0084】
tert-ブチルメチルエーテル（６８．４ｋｇ）を、３５～４５℃で２５～４５分の期間にわたって添加し、２２～２８℃への冷却が続いた。この温度で６０～１２０分間撹拌した後、粗（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩を、濾別し、tert-ブチルメチルエーテル（１２．５ｋｇ）で洗浄した。粗材料を、３０℃のジャケット温度設定点を使用する反応器において真空中で乾燥させた。
【0085】
アセトニトリル（８４．０ｋｇ）を添加し、生じた懸濁液を４８～５４℃で３０～９０分間撹拌し、４０～４５℃への冷却が続いた。tert-ブチルメチルエーテル（７４．６ｋｇ）を、３８～４５℃で４０～７０分の期間にわたって添加し、２２～２８℃への冷却が続いた。この温度で６０～１２０分間撹拌した後、粗（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩を、濾別し、tert-ブチルメチルエーテル（１４．０ｋｇ）で洗浄した。３０～３５℃で真空中での乾燥することは、（２Ｈ５）エチル (2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-{4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]フェニル}プロパンアミド]-3-(4-フルオロフェニル)プロパノエート塩酸塩（メルフルフェン-ｄ５、（ＩＩＩ））（２．５ｋｇ、９０％）を、白色からオフホワイトの固体として提供した。ＨＰＬＣ：保持時間９．０分。
【0086】
生物学的試験
実施例（ａ）イヌにおけるインビボ研究
イヌにおける３０分の注入としてのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェン単回静脈内投与後に、イヌにおける比較単回用量毒性試験を実行し、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンを比較して、メルフルフェンおよびメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの毒物動態を調査した。
実施例（ａ）イヌにおけるインビボ研究
イヌにおける３０分の注入としてのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェン単回静脈内投与後に、イヌにおける比較単回用量毒性試験を実行し、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンを比較して、メルフルフェンおよびメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）ならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの毒物動態を調査した。
【0087】
（ｉ）序論および目的
この研究は、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンの潜在的な急性毒性を比較することを目的とした。メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの毒物動態を、イヌにおける３０分の注入としての単回静脈内投与後に評価した。
この研究は、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンの潜在的な急性毒性を比較することを目的とした。メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの毒物動態を、イヌにおける３０分の注入としての単回静脈内投与後に評価した。
【0088】
（ｉｉ）材料および方法
略語
以下の略語が、本文書において使用される。
略語
以下の略語が、本文書において使用される。
【表1】
【0089】
研究デザイン
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェンを、以下のスキームに従って雄および雌のイヌへの３０分の注入として与えた。
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェンを、以下のスキームに従って雄および雌のイヌへの３０分の注入として与えた。
【表2】
【0090】
試料回収
血液試料を、１日目の投与前、１５分、３０分（注入終了直前）、注入開始後４０分、１時間、２時間、４時間および６時間に末梢静脈から回収した。
血液試料を、１日目の投与前、１５分、３０分（注入終了直前）、注入開始後４０分、１時間、２時間、４時間および６時間に末梢静脈から回収した。
【0091】
血液試料を、ヘパリン処理した回収チューブに回収し、氷水浴に入れ、直ちに遠心分離した（３分、１００００ｇ、＋４℃）。得られた血漿を、２つのアリコートに分割し、事前冷却したクライオバイアルに入れ、分析まで７０℃の冷凍庫に入れた。
【0092】
毒物動態計算
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにその代謝物である、デスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの血漿毒物動態分析を、Phoenix WinNonlin（v. 6.3, Certara Company, USA）を使用する標準的非コンパートメントアプローチに従って実施した。
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにその代謝物である、デスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの血漿毒物動態分析を、Phoenix WinNonlin（v. 6.3, Certara Company, USA）を使用する標準的非コンパートメントアプローチに従って実施した。
【0093】
投与後、最大濃度であるＣ最大、および最大濃度が達成された時間であるＴ最大を、時間経過の最高血漿濃度の座標として読み取った。最後の検出可能な濃度であるＣ最後、および最後の検出可能な濃度の時間であるＴ最後を、パラメータとして報告した。
【0094】
最後の検出可能な濃度までの血漿濃度対時間の曲線下の面積であるＡＵＣ最後を、線形台形公式によって計算した。
【0095】
実行可能な際に、以下のパラメータを計算した。
終末相の半減期であるｔ１／２，ｚを、次の式に従って自然対数濃度対時間の曲線の線形回帰分析によって計算し、
－λｚは、回帰直線の傾きである。ｔ１／２，ｚの推定を、少なくとも３つの時点で実行した。
終末相の半減期であるｔ１／２，ｚを、次の式に従って自然対数濃度対時間の曲線の線形回帰分析によって計算し、
【数1】
【0096】
無限時間までの血漿濃度対時間の曲線下の面積であるＡＵＣ∞を、単指数関数的減衰を仮定するＡＵＣｌａｓｔにＣｌａｓｔ／λｚとして計算された領域の一部を加算することによって計算した。
【0097】
曲線下の外挿された面積を占めたＡＵＣ∞の割合を、以下の通り計算した。
個々の記述統計（平均±ＳＤ、ＣＶ％）血漿濃度および毒物動態パラメータを、３桁の有効数字で報告した。
【数2】
【0098】
（ｉｉｉ）結果
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランは、対照群（群１）の血漿試料、同様に治療群２、３および４の投与前において測定されなかった。
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランは、対照群（群１）の血漿試料、同様に治療群２、３および４の投与前において測定されなかった。
【0099】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンおよびそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの雄および雌に関する全身曝露パラメータは同等であり、したがって、組み合わされた雄および雌のパラメータに関する記述統計も報告した。
【0100】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）
要約したメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の毒物動態パラメータが、表１および２に報告される。
要約したメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の毒物動態パラメータが、表１および２に報告される。
【表3】
【表4】
【0101】
１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間注入されたメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群２および３）は、中間注入でその最大血漿濃度に達し、次いで、投与の開始から４０分以内に消失した。終末相の時点の不十分な数のため、半減期を計算しなかった。
【0102】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）への曝露は、曲線下のピークおよび面積に関して用量と共に増加した（組み合わせた性パラメータに関して計算された、２倍の用量増加に対して２．７倍）。
【0103】
１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇ後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の平均＋ＳＤ血漿濃度が、図１に示される。
【0104】
メルフルフェン
要約したメルフルフェンの毒物動態パラメータが、以下の表３および４に報告される。
要約したメルフルフェンの毒物動態パラメータが、以下の表３および４に報告される。
【表5】
【表6】
【0105】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンへの全身曝露の間の比較
組み合わされた雄および雌のビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図２（Ｃ最大）および図３（ＡＵＣ最後）に示される。
組み合わされた雄および雌のビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図２（Ｃ最大）および図３（ＡＵＣ最後）に示される。
【0106】
メルフルフェンへの平均曝露は、２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）へのものよりも２倍低かった。図２および図３に示されるように、平均値に対する差異は、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）で治療された１匹の雄イヌにおいて測定された高濃度によって部分的に引き起こされた。しかしながら、各動物について個々のＣ最大およびＡＵＣ最後の値を示す図２および図３から見られ得るように、メルフルフェンと比較してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）について、増加したＣ最大および増加したＡＵＣ最後の明らかな傾向がある。
【0107】
２つの群における動物間変動（ＣＶ％）は、同じ桁数のものであった。
【0108】
デスエチル-メルフルフェン
代謝物であるデスエチル-メルフルフェンの要約した毒物動態パラメータが、表５および６に報告される。
代謝物であるデスエチル-メルフルフェンの要約した毒物動態パラメータが、表５および６に報告される。
【表7】
【表8】
【0109】
１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）注入（群２および３）後、代謝物であるデスエチル-メルフルフェンは、最初のサンプリング時間で血漿中に現れ、１５～３０分でその最大濃度に達して、投与（１．２５～２．５ｍｇ／ｋｇ）後４０～６０分後には全く検出可能でなくなった。２．５ｍｇ／ｋｇの用量で１匹の動物でのみ推定可能な半減期は、５分であった。
【0110】
デスエチル-メルフルフェンへの曝露は、２倍のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）用量増加に対して、Ｃ最大に関して３．１倍かつＡＵＣ最後に関して３．５倍増加した（組み合わされた性パラメータに基づいて計算された）。
【0111】
メルフルフェン投与（群４）後、デスエチル-メルフルフェンの血漿プロファイルは、ｔ最大およびｔ最後に関してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）投与後に観察されたものと同様であった。２．５ｍｇ／ｋｇの用量で１匹の動物でのみ推定可能な半減期は、７分であった。
【0112】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェン投与後のデスエチル-メルフルフェンへの全身曝露の間の比較
組み合わされた雄および雌のビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後のデスエチル-メルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図４（Ｃ最大）および図５（ＡＵＣ最後）に示される。
組み合わされた雄および雌のビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後のデスエチル-メルフルフェンの個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図４（Ｃ最大）および図５（ＡＵＣ最後）に示される。
【0113】
デスエチル-メルフルフェンへの平均曝露は、２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後よりも２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェンの注入後で低かった。図４および図５に示されるように、平均値に対する差異は、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）で治療された１匹の雄イヌにおいて測定されたデスエチル-メルフルフェンの高濃度によって主に引き起こされた。しかしながら、各動物について個々のＣ最大値を示す図４から見られ得るように、メルフルフェンと比較してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後にデスエチル-メルフルフェンの増加したＣ最大の傾向がある。
【0114】
メルファラン
代謝物であるメルファランの要約した毒物動態パラメータが、表７および８に報告される。
代謝物であるメルファランの要約した毒物動態パラメータが、表７および８に報告される。
【表9】
【表10】
【0115】
１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）注入後、代謝物であるメルファランは、最初のサンプリング時間で血漿中に現れ３０分の平均ｔ最大でその最大濃度に達し、各メルファラン-ｄ５（ＩＩＩ）用量後の投与後４時間まで検出可能であった。推定半減期は、およそ４０分であった。
【0116】
メルフルフェン注入（群４）後、メルファランの血漿プロファイルは、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）によって形成されたものと同等であった。２回の治療でのメルファランのＴ最大およびｔ最後は、同様であった。
【0117】
メルファランへの曝露は、ピークおよびＡＵＣ値に関してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の投与された用量と共に増加した：性別を組み合わせることによって、２倍の用量増加は、平均Ｃ最大における２．２倍の増加、および代謝物のＡＵＣ最後およびＡＵＣ∞における２．０倍の増加に対応した。
【0118】
メルファラン-ｄ５（ＩＩＩ）の２つの漸増用量で、メルファランＡＵＣ最後は、それぞれ、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）曝露よりも４８倍および３５倍高かった（組み合わされた性別データのＡＵＣ最後値に関して計算された）。メルファラン-ｄ５（ＩＩＩ）の２つの漸増用量で、メルファランＡＵＣ最後は、それぞれ、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）曝露よりも平均して５１．１倍（範囲３７～７０）および４４．８倍（範囲２２～１００）高かった（組み合わされた性別の個々の値に関して計算された）。
【0119】
メルファラン注入後、メルファランＡＵＣ最後は、メルフルフェン曝露よりも平均して７５倍（範囲３８～１４２）高かった（組み合わされた性別の個々の値に関して計算された）。
【0120】
群２または群３におけるイヌ（組み合わされた性別）におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルファランおよびデスエチル-メルフルフェンの平均＋ＳＤ血漿濃度が、図６ａ（群２、対数スケール）および６ｂ（群２、非対数スケール）および図７ａ（群３、対数スケール）および７ｂ（群３、非対数スケール）に示される。図７ａおよび７ｂに示されるように、２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェン-Ｄ５（ＩＩＩ）の注入後の平均Ｃ最大は、２．７３μｍｏｌ／Ｌであった。
【0121】
群４におけるイヌ（組み合わされた性別）におけるメルフルフェンの注入後のメルフルフェン、メルファランおよびデスエチル-メルフルフェンの平均＋ＳＤ血漿濃度が、図８ａ（群４、対数スケール）および８ｂ（群４、非対数スケール）に示される。図８ａおよび８ｂに示されるように、２．５ｍｇ／ｋｇのメルフルフェンの注入後の平均Ｃ最大は、２．２３μｍｏｌ／Ｌであった。
【0122】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）またはメルフルフェン投与後のメルファランへの全身曝露の間の比較
組み合わされた雄および雌のビーグル犬ビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後のメルファランの個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図９（Ｃ最大）および図１０（ＡＵＣ最後）に示される。ｔ１／２，ｚおよびＡＵＣ∞の結果はまた、図１１および図１２に示される。
組み合わされた雄および雌のビーグル犬ビーグル犬におけるメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（群３、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルフルフェン（群４、２．５ｍｇ／ｋｇ）の注入後のメルファランの個々および平均（±ＳＤ）全身曝露パラメータの比較が、図９（Ｃ最大）および図１０（ＡＵＣ最後）に示される。ｔ１／２，ｚおよびＡＵＣ∞の結果はまた、図１１および図１２に示される。
【0123】
メルファランへの平均曝露は、２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後よりも２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェンの注入後で低かった。各動物について個々のＣ最大、ＡＵＣ最後およびＡＵＣ∞値を示す、図９、図１０および２１から見られ得るように、メルフルフェンと比較してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後のメルファランの増加したＣ最大、増加したＡＵＣ最後および増加したＡＵＣ∞の傾向がある。図１１に示されるように、メルファランに対する平均ｔ１／２，ｚは、メルフルフェンの注入後よりも２．５ｍｇ／ｋｇでのメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後で低く、メルフルフェンと比較してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後の個々の動物におけるメルファランについての減少したｔ１／２，ｚの傾向がある。
【0124】
結論
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇ）またはメルフルフェン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の単回３０分注入後の、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの全身曝露記述子は、雄および雌において同様であった。
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）（１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇ）またはメルフルフェン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の単回３０分注入後の、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）、メルフルフェンならびにそれらの代謝物であるデスエチル-メルフルフェンおよびメルファランの全身曝露記述子は、雄および雌において同様であった。
【0125】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）および代謝物のデセチ－メルフルフェンは、全身循環から急速に消失した。デスエチル-メルフルフェンへの曝露は、親化合物曝露の約半分であった。
【0126】
代謝物であるメルファランは、急速かつ広範囲に形成された。メルファランは、注入終了後４時間まで血漿中に検出され、約４０分の終末半減期で崩壊した。メルファランのＴ最大、ｔ最後およびｔ１／２，ｚは、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）用量の間で一定であった。組み合わされた性別では、形成されたメルファランへの曝露の程度は、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）曝露よりもおよそ５０倍高かった。
【0127】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）注入の漸増用量を増加させた後、全身曝露は、予想通りに増加し（メルファラン）、用量比例性を仮定すると予想よりもわずかに多く増加した（メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびデスエチル-メルフルフェン）。
【0128】
メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルフルフェンの同等用量を比較すると、メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）および活性代謝物メルファランへの全体的な曝露は、メルフルフェンと比較してメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）の注入後に一貫してより高かった。メルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルファランの同一用量に対するメルフルフェン-ｄ５（ＩＩＩ）およびメルファランへのこの増加した曝露は、非常に顕著な利益である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【外国語明細書】