特開2024-150516ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質に対する抗体のエピトープ、該エピトープに反応する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法、該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出キット、該エピトープのポリペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用ワクチン及び該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024150516
(43)【公開日】2024-10-23
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質に対する抗体のエピトープ、該エピトープに反応する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法、該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出キット、該エピトープのポリペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用ワクチン及び該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬
(51)【国際特許分類】
C07K 16/10 20060101AFI20241016BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20241016BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241016BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241016BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241016BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241016BHJP
【ＦＩ】
C07K16/10 ZNA
A61K39/215
A61K39/395 S
A61P31/14
G01N33/569 L
G01N33/53 N
C07K16/10
C12N15/13
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024109831
(22)【出願日】2024-07-08
(62)【分割の表示】P 2022505853の分割
【原出願日】2021-02-10
(31)【優先権主張番号】P 2020040960
(32)【優先日】2020-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003296
【氏名又は名称】デンカ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100185591
【弁理士】
【氏名又は名称】中塚 岳
(72)【発明者】
【氏名】小笠原 真也
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キットを提供すること。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ等の重篤な呼吸器症状を引き起こすヒト感染性コロナウイルスを同時に検出する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト感染性コロナウイルスを同時に検出する方法及び該抗体を含む検出キットを提供すること。
【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質がＮ－タンパク質である、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、並びに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質に反応する抗体と特異的に反応するハプテンであって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＮ－タンパク質である、前記ハプテン。
【選択図】なし
【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質がＮ－タンパク質である、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、並びに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質に反応する抗体と特異的に反応するハプテンであって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＮ－タンパク質である、前記ハプテン。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質がＮ－タンパク質である、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項2】
前記Ｎ－タンパク質の１９～４９番目（配列番号１８）、４０１～４１９番目（配列番号２５）、１～１８番目（配列番号１７）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）又は３３６～３５０番目（配列番号２２）のアミノ酸領域に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項3】
前記Ｎ－タンパク質の２０～４８番目、４０３～４１７番目、１～１２番目、３６６～３７７番目、３８１～３９１番目、２５４～２６３番目、１７５～２０６番目、２３４～２５０番目又は３３８～３４８番目のアミノ酸領域に結合する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項4】
前記Ｎ－タンパク質の２７～４１番目、４０６～４１５番目、４～１１番目、３６７～３７５番目、３８４～３９０番目、２５６～２６１番目、１８５～１９６番目、２３７～２４７番目又は３４０～３４７番目のアミノ酸領域に結合する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、免疫学的測定法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することを含む、検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法。
【請求項6】
Ｎ－タンパク質の１９～４９番目（配列番号１８）、４０１～４１９番目（配列番号２５）、１～１８番目（配列番号１７）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）及び３３６～３５０番目（配列番号２２）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キット。
【請求項8】
Ｎ－タンパク質の１９～４９番目（配列番号１８）、４０１～４１９番目（配列番号２５）、１～１８番目（配列番号１７）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）及び３３６～３５０番目（配列番号２２）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質がＮ－タンパク質であり、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質がＮ－タンパク質である、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項10】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶである、請求項９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項11】
請求項９又は１０に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、免疫学的測定法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出することを含む、検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出する方法。
【請求項12】
請求項９又は１０に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの検出キット。
【請求項13】
配列番号１８、２５、１７、２３、２４、２１、１９、２０及び２２のいずれか一つのアミノ酸配列であるポリペプチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリペプチドと検体とを接触させ、免疫学的測定法により抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出することを含む、検体中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法。
【請求項15】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出キット。
【請求項16】
請求項１３に記載のポリペプチドと検体とを接触させ、免疫学的測定法により抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体を検出することを含む、検体中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体を検出する方法。
【請求項17】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体の検出キット。
【請求項18】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用ワクチン。
【請求項19】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス用ワクチン。
【請求項20】
請求項１３に記載のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療のための抗体医薬。
【請求項21】
請求項１３に記載のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス感染症の治療のための抗体医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質に対する抗体が認識するエピトープ、該エピトープに反応する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法、該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出キット及び該エピトープのポリペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用ワクチン及び該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスは正の一本鎖ＲＮＡゲノムとらせん対称性のヌクレオカプシドをもつエンベロープウイルスである。ヒトに感染するコロナウイルスとしてはベータコロナウイルスがあり、中でもＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及びＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は重篤な呼吸器症状を引き起こすことが知られている。
【0003】
２０１９年に中国で新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が発生し、２０２０年２月現在東アジアを中心に東南アジア、中東、ヨーロッパなどで感染拡大が続いている。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療法やワクチンに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を早期に発見して感染拡大を抑えるべく、迅速かつ簡便な検出法の開発が急務となっている。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発生以降、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原性及び候補エピトープに関する報告がなされているが（例えば、非特許文献１）、当該候補エピトープはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの開発を指向したものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に適したエピトープ及び当該エピトープを認識する抗体については未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Suresh Kumar, Preprints, doi:https://www.preprints.org/manuscript/202002.0071/v1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キットを提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ等の重篤な呼吸器症状を引き起こすヒト感染性コロナウイルスを同時に検出する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びヒト感染性コロナウイルスを同時に検出する方法及び該抗体を含む検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
従来、抗原性を予測する複数のアルゴリズムが報告されているが（例えば、Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure ofproteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol47:45-148）、これらのアルゴリズムは互いに相反する指標を含んでいることから、個々のアルゴリズムでは抗原性予測の精度に乏しいという問題点があった。本発明者らはこれらのアルゴリズムを統合して抗原性の精度を高めることができるための改良を行い、当該改良したアルゴリズムを用いて得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する構造タンパク質分子全体についての抗原性の強弱スコア（図１～４）から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する構造タンパク質における特定のアミノ酸配列を有する領域においてウイルス抗原性が強く、当該特定のアミノ酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープ（ポリペプチド）として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットを提供する。ここで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質は、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質である。
【0009】
また、本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、免疫学的測定法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することを含む、検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供する。検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法においては、各構造タンパク質について少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法が好ましい。
【0010】
また、本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス（好ましくは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ）の構造タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び該抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス（好ましくは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ）の検出キットを提供する。ここで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質は、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質であり、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質は、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質である。
【0011】
また、本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープ（ポリペプチド）を提供する。更に、本発明は、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法、該エピトープのポリペプチドを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出キット、該エピトープのポリペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用ワクチン及び該抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬を提供する。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キットを提供することができる。また、本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ等の重篤な呼吸器症状を引き起こすコロナウイルスを同時に検出する抗体及び該抗体を含む検出キットを提供することができる。さらに、本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープ（ポリペプチド）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化したグラフである。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化したグラフである。
【図3】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化したグラフである。
【図4】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化したグラフである。
【図5a】配列番号５の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5b】配列番号６の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5c】配列番号７の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5d】配列番号８の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5e】配列番号９の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5f】配列番号１０の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5g】配列番号１１の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5h】配列番号１３の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5i】配列番号１５の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5j】配列番号１６の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5k】配列番号１８の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5l】配列番号１９の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5m】配列番号２０の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5n】配列番号２１の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5o】配列番号２３の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5p】配列番号２４の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5q】配列番号２５の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5r】配列番号２６の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5s】配列番号２７の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5t】配列番号３０の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5u】配列番号３１の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5v】配列番号３２の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5w】配列番号３３の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図5x】配列番号３４の配列を有するポリペプチドを免疫した際の、当該ポリペプチドに対する特異的な反応性を示すグラフである。
【図6】実施例１で得られた計２４種類の抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原への反応性を示すグラフである。
【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を免疫して得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを解析した結果を示すグラフである。
【図8】配列番号２記載のrecombinant Ｎ－タンパク質（full-length）を免疫して得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを解析した結果を示すグラフである。
【図9】実施例３及び４で得られた抗血清中の抗体の、配列番号１７～２５のＮ－タンパク質エピトープ配列への反応性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キット〕
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主にＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）から構成される、ベータコロナウイルス属のウイルスである。本実施形態に係るモノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する主要な構造タンパク質、すなわち、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主にＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）から構成される、ベータコロナウイルス属のウイルスである。本実施形態に係るモノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する主要な構造タンパク質、すなわち、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応する。
【0015】
本実施形態において「特異的に」とは、タンパク質と本実施形態に係るモノクローナル抗体が混じり合う液系において、該抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、又は何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。
【0016】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質（表面タンパク質；以下、本明細書において単に「Ｓ－タンパク質」とも称する）は、代表的には配列番号１で表される１２７３個のアミノ酸配列からなる。Ｓ－タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、配列番号１と９０％以上（好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【0017】
本実施形態に係る、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、Ｓ－タンパク質の６６～８５番目（配列番号５）、８７～１０７番目（配列番号６）、１０５～１３１番目（配列番号７）、１４０～１５７番目（配列番号８）、１５５～１７０番目（配列番号９）、５２２～５４１番目（配列番号１０）、５３８～５６２番目（配列番号１１）、５９５～６１１番目（配列番号１２）、６７０～６９３番目（配列番号１３）、７６１～７９７番目（配列番号１４）、８０２～８１８番目（配列番号１５）又は１２３５～１２７３番目（配列番号１６）のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｓ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図１において、抗原性スコア（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が閾値スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）と比較して高く、少なくとも１６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0018】
本実施形態に係る、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、好ましくはＳ－タンパク質の７１～８３番目、８９～１０３番目、１０７～１２７番目、１４３～１５４番目、１５８～１６７番目、５２４～５３８番目、５４６～５６０番目、５９８～６０８番目、６７２～６９１番目、７７２～７９６番目、８０６～８１６番目又は１２３８～１２６９番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｓ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図１において、抗原性スコアが閾値スコアと比較してより高く、少なくとも１０個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0019】
本実施形態に係る、Ｓ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、より好ましくはＳ－タンパク質の７３～７９番目、９３～９９番目、１０９～１１５番目、１４５～１５２番目、１６０～１６５番目、５２６～５３１番目、５５３～５５８番目、５９９～６０７番目、６７４～６８４番目、７７３～７９５番目、８０８～８１４番目又は１２５７～１２６１番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｓ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図１において、抗原性スコアが閾値スコアと比較して最も高く、少なくとも５個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0020】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質；以下、本明細書において単に「Ｎ－タンパク質」とも称する）は、配列番号２で表される４１９個のアミノ酸配列からなる。
【0021】
本実施形態に係る、Ｎ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、Ｎ－タンパク質の１～１８番目（配列番号１７）、１９～４９番目（配列番号１８）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、３３６～３５０番目（配列番号２２）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）又は４０１～４１９番目（配列番号２５）のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｎ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図２において、抗原性スコア（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が閾値スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）と比較して高く、少なくとも１５配列からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0022】
本実施形態に係る、Ｎ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、好ましくはＮ－タンパク質の１～１２番目、２０～４８番目、１７５～２０６番目、２３４～２５０番目、２５４～２６３番目、３３８～３４８番目、３６６～３７７番目、３８１～３９１番目又は４０３～４１７番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｎ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図２において、抗原性スコアが閾値スコアと比較してより高く、少なくとも１０個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0023】
本実施形態に係る、Ｎ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、より好ましくはＮ－タンパク質の４～１１番目、２７～４１番目、１８５～１９６番目、２３７～２４７番目、２５６～２６１番目、３４０～３４７番目、３６７～３７５番目、３８４～３９０番目又は４０６～４１５番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｎ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図２において、抗原性スコアが閾値スコアと比較して最も高く、少なくとも６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0024】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ－タンパク質（膜タンパク質；以下、本明細書において単に「Ｍ－タンパク質」とも称する）は、配列番号３で表される２２２個のアミノ酸配列からなる。
【0025】
本実施形態に係る、Ｍ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、Ｍ－タンパク質の１～２４番目（配列番号２６）、３３～５０番目（配列番号２７）、１０１～１２０番目（配列番号２８）、１２１～１３９番目（配列番号２９）、１４６～１７１番目（配列番号３０）、１６９～１９５番目（配列番号３１）又は１９３～２２２番目（配列番号３２）のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｍ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図３において、抗原性スコア（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が閾値スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）と比較して高く、少なくとも１８個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0026】
本実施形態に係る、Ｍ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、好ましくはＭ－タンパク質の１～１９番目、３８～４５番目、１０３～１１８番目、１２２～１３８番目、１５５～１６８番目、１７２～１９５番目又は１９６～２１６番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｍ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図３において、抗原性スコアが閾値スコアと比較してより高く、少なくとも８個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0027】
本実施形態に係る、Ｍ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、より好ましくはＭ－タンパク質の１～１６番目、４０～４４番目、１０５～１１７番目、１２３～１３６番目、１６０～１６７番目、１７３～１７９番目又は２０５～２１５番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｍ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図３において、抗原性スコアが閾値スコアと比較して最も高く、少なくとも５配列からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0028】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質；以下、本明細書において単に「Ｅ－タンパク質」とも称する）は、配列番号４で表される７５個のアミノ酸配列からなる。
【0029】
本実施形態に係る、Ｅ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、Ｅ－タンパク質の１～１９番目（配列番号３３）又は５０～７５番目（配列番号３４）のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｅ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図４において、抗原性スコア（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が閾値スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）と比較して高く、少なくとも１９個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0030】
本実施形態に係る、Ｅ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、好ましくはＥ－タンパク質の４～１３番目又は５１～７２番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｅ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図４において、抗原性スコアが閾値スコアと比較してより高く、少なくとも１０個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0031】
本実施形態に係る、Ｅ－タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体は、より好ましくはＥ－タンパク質の５～１０番目又は６０～７１番目のアミノ酸領域に結合する。これらのアミノ酸領域は、Ｅ－タンパク質分子全体について抗原性の強弱をスコア化した図４において、抗原性スコアが閾値スコアと比較して最も高く、少なくとも６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0032】
本実施形態に係るモノクローナル抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させて使用することもできる。すなわち、公知の方法により作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）は本発明の範囲に含まれる。また、本実施形態に係るモノクローナル抗体のクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＹ、ＩｇＭ、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ又はＩｇ ＮＡＲでもよい。なお、本明細書において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「抗体」は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する。
【0033】
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分ペプチド（例えば、上記したＳ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質又はＥ－タンパク質における特定のアミノ酸領域からなるポリペプチド）を被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより、又は遺伝子組換え技術による組換え抗体として作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上、更に好ましくは１３アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。
【0034】
免疫原とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質は培養ウイルス液から得ることもできるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。
【0035】
免疫原とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はそれらの部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、又は未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓｔｒｅｐ－ＩＩタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、Ａｖｉタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。
【0036】
免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免疫した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。
【0037】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。
【0038】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、すなわち、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、免疫学的測定法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することを含む。
【0039】
本実施形態に係る検出方法において用いる検体としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液；粘液；糞便；血管若しくは肝臓などの臓器；組織；細胞、又はそれらの抽出液など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質が含まれる可能性のある生体試料が挙げられ、好ましくは、採取が容易である、口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支又は肺などからの細胞及び分泌液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、うがい液、喀痰、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液などである。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いた方法が挙げられる。
【0040】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の測定は、当業者にとって周知の免疫学的測定法であればいずれも採用できる。免疫学的測定法としては、例えば競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法などが挙げられる。
【0041】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質の測定法としては、少なくとも２種類のモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法などにより行うことができる。本実施形態に係る測定法は、上記したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。
【0042】
サンドイッチ法において、測定するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＳ－タンパク質である場合、６６～８５番目（配列番号５）、８７～１０７番目（配列番号６）、１０５～１３１番目（配列番号７）、１４０～１５７番目（配列番号８）、１５５～１７０番目（配列番号９）、５２２～５４１番目（配列番号１０）、５３８～５６２番目（配列番号１１）、５９５～６１１番目（配列番号１２）、６７０～６９３番目（配列番号１３）、７６１～７９７番目（配列番号１４）、８０２～８１８番目（配列番号１５）及び１２３５～１２７３番目（配列番号１６）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【0043】
サンドイッチ法において、測定するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＮ－タンパク質である場合、１～１８番目（配列番号１７）、１９～４９番目（配列番号１８）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、３３６～３５０番目（配列番号２２）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）及び４０１～４１９番目（配列番号２５）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【0044】
サンドイッチ法において、測定するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＭ－タンパク質である場合、１～２４番目（配列番号２６）、３３～５０番目（配列番号２７）、１０１～１２０番目（配列番号２８）、１２１～１３９番目（配列番号２９）、１４６～１７１番目（配列番号３０）、１６９～１９５番目（配列番号３１）及び１９３～２２２番目（配列番号３２）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【0045】
サンドイッチ法において、測定するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質がＥ－タンパク質である場合、１～１９番目（配列番号３３）及び５０～７５番目（配列番号３４）のアミノ酸領域に同時に結合することのできる、２種類のモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【0046】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、すなわち、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0047】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットは、上記した免疫学的測定法に用いられる形態であればいずれも採用できるが、好ましくは、正確、迅速かつ簡便にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質を測定することが可能なイムノクロマトストリップの形態である。
【0048】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットの好ましい一態様は、Ｓ－タンパク質の６６～８５番目（配列番号５）、８７～１０７番目（配列番号６）、１０５～１３１番目（配列番号７）、１４０～１５７番目（配列番号８）、１５５～１７０番目（配列番号９）、５２２～５４１番目（配列番号１０）、５３８～５６２番目（配列番号１１）、５９５～６１１番目（配列番号１２）、６７０～６９３番目（配列番号１３）、７６１～７９７番目（配列番号１４）、８０２～８１８番目（配列番号１５）及び１２３５～１２７３番目（配列番号１６）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0049】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットの好ましい一態様は、Ｎ－タンパク質の１～１８番目（配列番号１７）、１９～４９番目（配列番号１８）、１７４～２０７番目（配列番号１９）、２３０～２５２番目（配列番号２０）、２４７～２６７番目（配列番号２１）、３３６～３５０番目（配列番号２２）、３６２～３７９番目（配列番号２３）、３７７～３９５番目（配列番号２４）及び４０１～４１９番目（配列番号２５）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0050】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットの好ましい一態様は、Ｍ－タンパク質の１～２４番目（配列番号２６）、３３～５０番目（配列番号２７）、１０１～１２０番目（配列番号２８）、１２１～１３９番目（配列番号２９）、１４６～１７１番目（配列番号３０）、１６９～１９５番目（配列番号３１）及び１９３～２２２番目（配列番号３２）からなる群より選択されるアミノ酸領域に同時に結合することのできる、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0051】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出キットの好ましい一態様は、Ｅ－タンパク質の１～１９番目（配列番号３３）及び５０～７５番目（配列番号３４）のアミノ酸領域に同時に結合することのできる、２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0052】
〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスに対する抗体；該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出する方法；及び該抗体を含む検出キット〕
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応する。
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのＳ－タンパク質（表面タンパク質）、Ｎ－タンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ－タンパク質（膜タンパク質）及びＥ－タンパク質（エンベロープタンパク質）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と特異的に反応する。
【0053】
本実施形態において「特異的に」とは、タンパク質と本実施形態に係るモノクローナル抗体が混じり合う液系において、該抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのタンパク質以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、又は何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのタンパク質以外のタンパク質との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。
【0054】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスは、ヒトに重篤な呼吸器症状を引き起こすコロナウイルスであれば特に制限されないが、好ましくはＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶであり、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶである。
【0055】
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、上記〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キット〕において記載した方法と同様の方法で調製することができる。
【0056】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出する方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのＳ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、免疫学的測定法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出することを含む。
【0057】
本実施形態に係る方法において用いる検体、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのタンパク質の測定は、上記〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及び該抗体を含む検出キット〕において記載した検体及び測定方法と同様である。
【0058】
本実施形態に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの検出キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの構造タンパク質、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスのＳ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0059】
〔ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープ（ポリペプチド）〕
本実施形態に係る、配列番号５～３４のいずれか一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドは、検体中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープとして利用可能である。また、本実施形態に係るポリペプチドは、検体中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出する抗体の認識するエピトープとして利用可能である。
本実施形態に係る、配列番号５～３４のいずれか一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドは、検体中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する抗体の認識するエピトープとして利用可能である。また、本実施形態に係るポリペプチドは、検体中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスを検出する抗体の認識するエピトープとして利用可能である。
【0060】
本実施形態に係るポリペプチドは、検体中（好ましくは血液中）に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体（すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する生体内での防御機構によって産生した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体）を検出するハプテンとして利用可能である。したがって、本発明の一実施形態として、配列番号５～３４のアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のポリペプチドと検体（好ましくは血液）とを接触させ、免疫学的測定法により抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出することを含む、検体中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法が提供される。また、本発明の一実施形態として、配列番号５～３４のアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のポリペプチドを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出キットが提供される。
【0061】
本実施形態に係るポリペプチドは、検体中（好ましくは血液中）に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスに対する抗体（すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスに対する生体内での防御機構によって産生した抗ヒト感染性コロナウイルス抗体）を検出するハプテンとして利用可能である。したがって、本発明の一実施形態として、配列番号５～３４のアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のポリペプチドと検体（好ましくは血液）とを接触させ、免疫学的測定法により抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体を検出することを含む、検体中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体を検出する方法が提供される。また、本発明の一実施形態として、配列番号５～３４のアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のポリペプチドを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体以外の抗ヒト感染性コロナウイルス抗体の検出キットが提供される。
【0062】
本実施形態に係るポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染予防を目的としたワクチン（例えば、ペプチドワクチン、カクテルペプチドワクチン、融合ペプチド、又は当該ペプチドを含むフラグメントドメイン）の基本骨格としての利用可能性を有する。また、本実施形態に係るポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスの感染予防を目的としたワクチンの基本骨格としての利用可能性を有する。
【0063】
本実施形態に係るポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重篤化の予防を目的としたワクチン（例えば、ペプチドワクチン、カクテルペプチドワクチン、融合ペプチド又は当該ペプチドを含むフラグメントドメイン）の基本骨格としての利用可能性を有する。また、本実施形態に係るポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス感染症の重篤化の予防を目的としたワクチンの基本骨格としての利用可能性を有する。
【0064】
本実施形態に係るポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療を目的とした抗体医薬（中和抗体）としての利用可能性を有する。また、本実施形態に係るポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルス感染症の治療のための抗体医薬（中和抗体）としての利用可能性を有する。
【0065】
上記した各実施形態におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のヒト感染性コロナウイルスとしては、ヒトに重篤な呼吸器症状を引き起こすコロナウイルスであれば特に制限されないが、好ましくはＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶであり、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶである。
【実施例0066】
〔実施例１：抗体価の測定〕
配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３又は３４の配列を有する計２４種の各ポリペプチドを、MBS法（Syed Salman Lateef, et al. J BiomolTech. 2007 Jul; 18(3): 173-176.）に基づき、Blue CarrierProtein（mollusk-derived hemocyanin）とBSA（bovine serum albumin）に各々個別に共有結合させたペプチドコンジュゲートを調製した。Blue Carrier Proteinを用いたペプチドコンジュゲートを免疫抗原として、それぞれ３匹ずつのBALB/cマウスに100 μg/200μL /headの投与量で腹腔投与した。アジュバントとしてsigmaadjuvant systemを使用した。免疫期間中の経時採血は尾静脈から行った。抗体価はBSAを用いたペプチドコンジュゲート固相化ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法により、以下の手順で確認した。
１）PBSで2 μg/mLに希釈した計２４種のBSAペプチドコンジュゲート溶液を100 μL/wellずつ96-wellイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。
２）BSAペプチドコンジュゲート溶液を廃棄し、wash buffer (0.05%Tween20/PBS)で２回洗浄後、MilliQ waterで５倍希釈したBlocking One（ナカライテスク社製）を250 μL/wellずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。
３）ブロッキング溶液を廃棄し、wash bufferで２回洗浄後、wash bufferで１００～１００，０００倍希釈したマウス血漿を100 μL/wellずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。
４）血漿溶液を廃棄し、wash bufferで３回洗浄後、wash bufferで５，０００倍希釈したPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins（DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。
５）抗体溶液を廃棄し、wash bufferで３回洗浄後、TMB溶液（TMB One-Step Substrate System：DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加した。
６）２５℃で２０分間インキュベート後、2N H2SO4を100 μL/wellずつ添加して反応を停止した。
７）プレートリーダーで450 nm/630 nmの吸光度を測定した。
その結果を図５ａ～５ｘに示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（ＳＤ）は免疫マウスの個体間差（ｎ＝３）である。
配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３又は３４の配列を有する計２４種の各ポリペプチドを、MBS法（Syed Salman Lateef, et al. J BiomolTech. 2007 Jul; 18(3): 173-176.）に基づき、Blue CarrierProtein（mollusk-derived hemocyanin）とBSA（bovine serum albumin）に各々個別に共有結合させたペプチドコンジュゲートを調製した。Blue Carrier Proteinを用いたペプチドコンジュゲートを免疫抗原として、それぞれ３匹ずつのBALB/cマウスに100 μg/200μL /headの投与量で腹腔投与した。アジュバントとしてsigmaadjuvant systemを使用した。免疫期間中の経時採血は尾静脈から行った。抗体価はBSAを用いたペプチドコンジュゲート固相化ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法により、以下の手順で確認した。
１）PBSで2 μg/mLに希釈した計２４種のBSAペプチドコンジュゲート溶液を100 μL/wellずつ96-wellイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。
２）BSAペプチドコンジュゲート溶液を廃棄し、wash buffer (0.05%Tween20/PBS)で２回洗浄後、MilliQ waterで５倍希釈したBlocking One（ナカライテスク社製）を250 μL/wellずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。
３）ブロッキング溶液を廃棄し、wash bufferで２回洗浄後、wash bufferで１００～１００，０００倍希釈したマウス血漿を100 μL/wellずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。
４）血漿溶液を廃棄し、wash bufferで３回洗浄後、wash bufferで５，０００倍希釈したPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins（DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。
５）抗体溶液を廃棄し、wash bufferで３回洗浄後、TMB溶液（TMB One-Step Substrate System：DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加した。
６）２５℃で２０分間インキュベート後、2N H2SO4を100 μL/wellずつ添加して反応を停止した。
７）プレートリーダーで450 nm/630 nmの吸光度を測定した。
その結果を図５ａ～５ｘに示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（ＳＤ）は免疫マウスの個体間差（ｎ＝３）である。
【0067】
図５ａ～５ｘに示すとおり、Ｓ－タンパク質、Ｎ－タンパク質、Ｍ－タンパク質及びＥ－タンパク質のエピトープペプチドに対する抗体価が上昇していることが確認された。
【0068】
〔実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原への抗体の反応性〕
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（EPI_ISL_406034）の不活化抗原を固相化したマイクロタイタープレートを用いて、実施例１で得られた計２４種の抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原への反応性をELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法により、以下の手順で確認した。
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を固相化した96-wellイムノプレートに実施例１で得られた計２４種の抗体を100 μL/wellずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
２）血漿溶液を廃棄し、wash buffer（0.05% Tween20/PBS）で２回洗浄後、dilution buffer（0.05% Tween20, 0.5% BSA/PBS）で２５，０００倍希釈したPeroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）を100 μL/wellずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
３）抗体溶液を廃棄し、wash bufferで２回洗浄後、TMB溶液（TMB One-Step Substrate System：DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加した。
４）２５℃で２０分間インキュベート後、2N H2SO4を100 μL/wellずつ添加して反応を停止した。
５）プレートリーダーで450 nm/630 nmの吸光度を測定した。
その結果を図６に示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（１．９６×ＳＤ）は測定間差（ｎ＝３）である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（EPI_ISL_406034）の不活化抗原を固相化したマイクロタイタープレートを用いて、実施例１で得られた計２４種の抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原への反応性をELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法により、以下の手順で確認した。
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を固相化した96-wellイムノプレートに実施例１で得られた計２４種の抗体を100 μL/wellずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
２）血漿溶液を廃棄し、wash buffer（0.05% Tween20/PBS）で２回洗浄後、dilution buffer（0.05% Tween20, 0.5% BSA/PBS）で２５，０００倍希釈したPeroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）を100 μL/wellずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
３）抗体溶液を廃棄し、wash bufferで２回洗浄後、TMB溶液（TMB One-Step Substrate System：DAKO社製）を100 μL/wellずつ添加した。
４）２５℃で２０分間インキュベート後、2N H2SO4を100 μL/wellずつ添加して反応を停止した。
５）プレートリーダーで450 nm/630 nmの吸光度を測定した。
その結果を図６に示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（１．９６×ＳＤ）は測定間差（ｎ＝３）である。
【0069】
図６に示すとおり、実施例１で得られた計２４種の抗体は、何れもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活性化抗原に反応することが確認された。
【0070】
〔実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を免疫原とした場合の抗血清中に存在する抗体のエピトープの解析〕
実施例２で用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を免疫原として、実施例１と同じ手順でBALB/cマウスに免疫を行った。得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを以下の手順で解析した。
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質の配列（配列番号２）をＮ末端から１アミノ酸ずつＣ末端側にスライドさせ、且つ連続した１５アミノ酸からなるポリペプチドであり、且つ各ポリペプチド鎖のＮ末端にはビオチン標識を行い、且つ各ポリペプチド鎖のＣ末端にはグリシンを１残基付加した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ－タンパク質ペプチドセット（BioTidesTM Biotinylated Peptides：JPTPeptide Technologies GmbH社製）を用いた。
２）上記１）記載のBioTidesTM Biotinylated PeptidesをDMF（N,N-dimethylformamide）に溶解し、LumAvidinMicrospheres（Liminex社製）へビオチン－アビジン反応を介してBioTidesTM Biotinylated Peptides-immobilized LumAvidinMicrospheresを調製した。本調製の詳細は、Luminex社のxMAP（registered trademark）Cookbook（Chapter 4.2.1）に従った。
３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原をBALB/cマウスに免疫して得た抗血清をPBS-TBN（0.02% Tween20, 0.1% BSA/PBS）で１００倍希釈した溶液50 μLと、上記２）で調製したBioTidesTMBiotinylated Peptides-immobilized LumAvidin MicrospheresをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質ペプチド各種に対して500 beads of LumAvidin Microspheresで混合したbeadsmix 50 μLを混合後、３７℃で１時間インキュベートした。
４）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash buffer（0.02% Tween20/PBS）で２回洗浄した。
５）R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）をPBS-TBNで２００倍希釈した溶液100 μLを、上記４）で反応後のbeads mixに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
６）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash bufferで２回洗浄した。
７）PBS-BN（1% BSA/PBS）50μLを、上記６）で反応後のbeads mixに添加し、beads懸濁液を調製した。
８）上記７）で調製したbeads懸濁液についてBio-Plex 200（Bio-Rad社製）を用いてMFI（meadianfluorescence intensity）を計測した。なお、Blank（reference control）として、上記３）において、抗血清に代えてdiluentであるPBS-TBNのみを測定試料に用いた条件でも計測し、抗血清での計測値からBlankでの計測値を差し引いた値をΔMFI（-Blank）と表した。
その結果を図７に示す。
実施例２で用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原を免疫原として、実施例１と同じ手順でBALB/cマウスに免疫を行った。得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを以下の手順で解析した。
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質の配列（配列番号２）をＮ末端から１アミノ酸ずつＣ末端側にスライドさせ、且つ連続した１５アミノ酸からなるポリペプチドであり、且つ各ポリペプチド鎖のＮ末端にはビオチン標識を行い、且つ各ポリペプチド鎖のＣ末端にはグリシンを１残基付加した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ－タンパク質ペプチドセット（BioTidesTM Biotinylated Peptides：JPTPeptide Technologies GmbH社製）を用いた。
２）上記１）記載のBioTidesTM Biotinylated PeptidesをDMF（N,N-dimethylformamide）に溶解し、LumAvidinMicrospheres（Liminex社製）へビオチン－アビジン反応を介してBioTidesTM Biotinylated Peptides-immobilized LumAvidinMicrospheresを調製した。本調製の詳細は、Luminex社のxMAP（registered trademark）Cookbook（Chapter 4.2.1）に従った。
３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化抗原をBALB/cマウスに免疫して得た抗血清をPBS-TBN（0.02% Tween20, 0.1% BSA/PBS）で１００倍希釈した溶液50 μLと、上記２）で調製したBioTidesTMBiotinylated Peptides-immobilized LumAvidin MicrospheresをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ－タンパク質ペプチド各種に対して500 beads of LumAvidin Microspheresで混合したbeadsmix 50 μLを混合後、３７℃で１時間インキュベートした。
４）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash buffer（0.02% Tween20/PBS）で２回洗浄した。
５）R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）をPBS-TBNで２００倍希釈した溶液100 μLを、上記４）で反応後のbeads mixに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
６）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash bufferで２回洗浄した。
７）PBS-BN（1% BSA/PBS）50μLを、上記６）で反応後のbeads mixに添加し、beads懸濁液を調製した。
８）上記７）で調製したbeads懸濁液についてBio-Plex 200（Bio-Rad社製）を用いてMFI（meadianfluorescence intensity）を計測した。なお、Blank（reference control）として、上記３）において、抗血清に代えてdiluentであるPBS-TBNのみを測定試料に用いた条件でも計測し、抗血清での計測値からBlankでの計測値を差し引いた値をΔMFI（-Blank）と表した。
その結果を図７に示す。
【0071】
図７に示すとおり、実施例３で得られた抗血清は、配列番号２１と２２以外のＮ－タンパク質エピトープ配列に対して有意な抗体価を有することが確認された。
【0072】
〔実施例４：recombinant Ｎ－タンパク質を免疫原とした場合の抗血清中に存在する抗体のエピトープの解析〕
recombinant Ｎ－タンパク質（full-length；配列番号２）を免疫原として、実施例１と同じ手順でBALB/cマウスに免疫を行った。得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを実施例３と同じ手順で解析した。その結果を図８に示す。
recombinant Ｎ－タンパク質（full-length；配列番号２）を免疫原として、実施例１と同じ手順でBALB/cマウスに免疫を行った。得られた抗血清中に存在する抗体のエピトープを実施例３と同じ手順で解析した。その結果を図８に示す。
【0073】
図８に示すとおり、実施例４で得られた抗血清は、配列番号１７～２５のＮ－タンパク質の全エピトープ配列に対して有意な抗体価を有することが確認された。
【0074】
〔実施例５：Ｎ－タンパク質のエピトープ配列への抗血清中の抗体の反応性〕
実施例３及び実施例４で得られた抗血清を用いて、配列番号１７～２５のＮ－タンパク質のエピトープ配列への上記抗血清中の抗体の反応性を以下の手順で確認した。
１）配列番号１７～２５の各ポリペプチドのＮ末端にビオチン標識を施し、当該ポリペプチドをDMF（N,N-dimethylformamide）に溶解し、LumAvidin Microspheres（Liminex社製）へビオチン－アビジン反応を介してBiotinylated epitope-peptides-immobilized LumAvidin Microspheresを調製した。本調製の詳細は、Luminex社のxMAP（registeredtrademark）Cookbook（Chapter4.2.1）に従った。
２）実施例３及び実施例４で得られた抗血清をPBS-TBN（0.02% Tween20, 0.1% BSA/PBS）で１００倍希釈した溶液50 μLと、上記調製したBiotinylatedepitope-peptides-immobilized LumAvidin Microspheresを配列番号１７～２５の各ポリペプチドに対して500 beads of LumAvidin Microspheresで混合したbeadsmix 50 μLを混合後、３７℃で１時間インキュベートした。
３）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash buffer（0.02% Tween20/PBS）で２回洗浄した。
４）R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）をPBS-TBNで２００倍希釈した溶液100 μLを、上記３）で反応後のbeads mixに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
５）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash bufferで２回洗浄した。
６）PBS-BN（1% BSA/PBS）50μLを、上記５）で反応後のbeads mixに添加し、beads懸濁液を調製した。
７）上記６）で調製したbeads懸濁液についてBio-Plex 200（Bio-Rad社製）を用いてMFI（meadianfluorescence intensity）を計測した。なお、Blank（reference control）として、上記２）において、抗血清に代えてdiluentであるPBS-TBNのみを測定試料に用いた条件でも計測した。
その結果を図９に示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（ＳＤ）は測定間差（ｎ＝３）である。
実施例３及び実施例４で得られた抗血清を用いて、配列番号１７～２５のＮ－タンパク質のエピトープ配列への上記抗血清中の抗体の反応性を以下の手順で確認した。
１）配列番号１７～２５の各ポリペプチドのＮ末端にビオチン標識を施し、当該ポリペプチドをDMF（N,N-dimethylformamide）に溶解し、LumAvidin Microspheres（Liminex社製）へビオチン－アビジン反応を介してBiotinylated epitope-peptides-immobilized LumAvidin Microspheresを調製した。本調製の詳細は、Luminex社のxMAP（registeredtrademark）Cookbook（Chapter4.2.1）に従った。
２）実施例３及び実施例４で得られた抗血清をPBS-TBN（0.02% Tween20, 0.1% BSA/PBS）で１００倍希釈した溶液50 μLと、上記調製したBiotinylatedepitope-peptides-immobilized LumAvidin Microspheresを配列番号１７～２５の各ポリペプチドに対して500 beads of LumAvidin Microspheresで混合したbeadsmix 50 μLを混合後、３７℃で１時間インキュベートした。
３）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash buffer（0.02% Tween20/PBS）で２回洗浄した。
４）R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（subclasses 1+2a+2b+3）及びFcγ Fragment Specific（Jackson ImmunoResearch社製）をPBS-TBNで２００倍希釈した溶液100 μLを、上記３）で反応後のbeads mixに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
５）3000rpmで５分間の遠心後、反応溶液の上清を廃棄し、wash bufferで２回洗浄した。
６）PBS-BN（1% BSA/PBS）50μLを、上記５）で反応後のbeads mixに添加し、beads懸濁液を調製した。
７）上記６）で調製したbeads懸濁液についてBio-Plex 200（Bio-Rad社製）を用いてMFI（meadianfluorescence intensity）を計測した。なお、Blank（reference control）として、上記２）において、抗血清に代えてdiluentであるPBS-TBNのみを測定試料に用いた条件でも計測した。
その結果を図９に示す。なお、図中のＥｒｒｏｒ ｂａｒ（ＳＤ）は測定間差（ｎ＝３）である。
【0075】
図９に示すとおり、実施例３及び実施例４で得られた抗血清は、配列番号１７～２５のＮ－タンパク質の全エピトープ配列に対して有意な抗体価を有することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【図5h】
【図5i】
【図5j】
【図5k】
【図5l】
【図5m】
【図5n】
【図5o】
【図5p】
【図5q】
【図5r】
【図5s】
【図5t】
【図5u】
【図5v】
【図5w】
【図5x】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】