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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024150520
(43)【公開日】2024-10-23
(54)【発明の名称】インサイチュ遺伝子編集
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241016BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20241016BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20241016BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241016BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20241016BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241016BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241016BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20241016BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241016BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241016BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241016BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241016BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241016BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12Q1/34
C12N5/10
C12N5/0789
C12N15/864 100Z
A61K38/46
A61K48/00
A61K35/76
A61P21/04
A61P21/00
A61P9/10
A61P25/00
A61P1/16
A61P13/12
A61P3/10
A61P19/00
A61P19/02
A61P43/00 105
C12N15/09 110
C12N15/55
C12N15/55 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】56
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024110718
(22)【出願日】2024-07-10
(62)【分割の表示】P 2021507890の分割
【原出願日】2019-08-19
(31)【優先権主張番号】62/719,628
(32)【優先日】2018-08-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507044516
【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ
(71)【出願人】
【識別番号】507183952
【氏名又は名称】ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウェイガース エイミー ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドスタイン ジル
(72)【発明者】
【氏名】ワン レオ
(72)【発明者】
【氏名】シュー ヤー－チェー
(72)【発明者】
【氏名】セレイロ メリエン ゴンザレス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞のインサイチュのゲノム修飾の方法を提供する。
【解決手段】ウイルス（例えば、ＡＡＶ）を介して送達される配列標的化ヌクレアーゼを使用した、細胞（例えば、幹細胞、組織幹細胞、筋幹細胞、骨格筋におけるＳｃａ－１＋間葉系前駆細胞、ＣＤ１４０ａ＋真皮間葉系細胞）のインサイチュのゲノム修飾の方法が提供される。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】ウイルス（例えば、ＡＡＶ）を介して送達される配列標的化ヌクレアーゼを使用した、細胞（例えば、幹細胞、組織幹細胞、筋幹細胞、骨格筋におけるＳｃａ－１＋間葉系前駆細胞、ＣＤ１４０ａ＋真皮間葉系細胞）のインサイチュのゲノム修飾の方法が提供される。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インビボで対象の細胞の標的化集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入することと、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、を含み、
前記細胞の標的化集団は、造血幹細胞でも造血前駆細胞でもない、前記方法。
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入することと、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、を含み、
前記細胞の標的化集団は、造血幹細胞でも造血前駆細胞でもない、前記方法。
【請求項2】
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、請求項２～３に記載の方法。
【請求項5】
ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項２～４に記載の方法。
【請求項6】
前記ウイルスが静脈内投与されるか、または前記細胞の標的化集団を含む組織に局所的に注射される、請求項１～５に記載の方法。
【請求項7】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項１～６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項１～８に記載の方法。
【請求項10】
前記対象を、前記細胞の標的化集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと接触させることをさらに含む、請求項１～９に記載の方法。
【請求項11】
前記第２のウイルスがＡＡＶである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、請求項１１～１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項１～１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞の標的化集団が幹細胞または前駆細胞である、請求項１～１４に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞の標的化集団が組織幹細胞である、請求項１～１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞の標的化集団が機能的筋肉幹細胞である、請求項１～１６に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞の標的化集団が骨格筋の間葉系前駆細胞（Ｓｃａ－１＋）である、請求項１～１６に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞の標的化集団が皮膚組織中の真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ＋）である、請求項１～１６に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞の標的化集団が、共通の骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、多能性前駆体集団、及び系統を方向付けられた赤血球前駆体集団から選択される前駆細胞集団である、請求項１～１６に記載の方法。
【請求項21】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項１～２０に記載の方法。
【請求項22】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項１～２０に記載の方法。
【請求項23】
前記対象が、ヒトである、請求項１～２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象がマウスである、請求項１～２２に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞の標的化集団の少なくとも４０％がウイルスによって形質導入される、請求項１～２４に記載の方法。
【請求項26】
インビボで対象の筋幹細胞の集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記ウイルスが静脈内注射によって前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持している、前記方法。
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記ウイルスが静脈内注射によって前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持している、前記方法。
【請求項27】
前記ウイルスがＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項２６～２７に記載の方法。
【請求項29】
前記筋肉幹細胞の集団の少なくとも５０％が前記ウイルスによって形質導入される、請求項２６～２８に記載の方法。
【請求項30】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項２６～２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項２６～３１に記載の方法。
【請求項33】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項２６～３２に記載の方法。
【請求項34】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項２６～３２に記載の方法。
【請求項35】
前記対象が、ヒトである、請求項２６～３２に記載の方法。
【請求項36】
前記対象がマウスである、請求項２６～３２に記載の方法。
【請求項37】
対象における間葉系前駆細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む、前記方法。
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む、前記方法。
【請求項38】
前記間葉系前駆細胞がＳｃａ－１＋である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記間葉系前駆細胞が骨格筋に位置する、請求項３７～３８に記載の方法。
【請求項40】
前記ウイルスがＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項３７～３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項３７～４０に記載の方法。
【請求項42】
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％が前記ウイルスによって形質導入される、請求項３７～４１に記載の方法。
【請求項43】
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％が前記ウイルスによって形質導入される、請求項３７～４１に記載の方法。
【請求項44】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項３７～４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項３７～４５に記載の方法。
【請求項47】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項３７～４６に記載の方法。
【請求項48】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項３７～４６に記載の方法。
【請求項49】
前記ウイルスが、組織もしくは器官への局所注射または静脈内注射を介して前記対象に投与される、請求項３７～４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ウイルスが、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、または結合組織への局所注射によって投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記対象が、ヒトである、請求項３７～５０に記載の方法。
【請求項52】
前記対象がマウスである、請求項３７～５０に記載の方法。
【請求項53】
対象の真皮間葉細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む方法。
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む方法。
【請求項54】
前記ウイルスが、ＡＡＶ８である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項５３～５４に記載の方法。
【請求項56】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項５３～５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項５３～５７に記載の方法。
【請求項59】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項５３～５８に記載の方法。
【請求項60】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項５３～５９に記載の方法。
【請求項61】
前記対象が、ヒトである、請求項５３～６０に記載の方法。
【請求項62】
前記対象がマウスである、請求項５３～６０に記載の方法。
【請求項63】
前記ウイルスが皮膚に局所的に注射されるか、または静脈内に投与される、請求項５３～６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１８年８月１８日に出願された米国仮出願第６２／７１９，６２８号の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年８月１８日に出願された米国仮出願第６２／７１９，６２８号の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号Ｆ３２ＡＧ０５０３９５、Ｒ０１
ＨＬ１３５２８７、ＤＰ１ ＡＧ０４８９１７、及びＲ０１ ＡＲ０７０８２５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号Ｆ３２ＡＧ０５０３９５、Ｒ０１
ＨＬ１３５２８７、ＤＰ１ ＡＧ０４８９１７、及びＲ０１ ＡＲ０７０８２５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
体の組織及び臓器の効果的な機能は、どちらのプロセスも、組織幹細胞の作用の調節を必要とする、適切な細胞数の維持（ホメオスタシス）及び損傷後の損傷細胞の交換（修復）に依存する。数十年にわたる多くの研究は、幹細胞機能の重要な分子調節因子を定義しようと努めてきた。しかし、研究者がそのようなメディエーターを調べて定義することができたペースは、そのような研究に通常使用される遺伝子操作されたマウス及び幹細胞移植モデルを生成する技術的限界によって制約されてきた。特に、トランスジェニック及び遺伝子ノックアウトベースのアプローチでは、目的の遺伝子を遍在的または組織特異的な方法で破壊するために、複数の異なる遺伝子操作された欠失及び／またはフロックス（ｆｌｏｘｅｄ）対立遺伝子の生成及び育種が必要であり、これは、いくつかの遺伝子を摂動させることの組合せ効果が目的である場合に悪化される課題である。同様に、幹細胞のエクスビボのゲノム操作には、これらの細胞の単離及び移植が必要であり、これは、内因性幹細胞ニッチに存在する重要な調節相互作用を妨害し、正常な幹細胞の特性を大幅に変更し得る（Ｗａｇｅｒｓ，２０１２）。したがって、この分野では、内因性幹細胞を単離したり、複雑な多対立遺伝子トランスジェニック動物を生成したりする必要なしに、内因性幹細胞の遺伝子発現を操作するためのプログラム可能なインビボプラットフォームの利用可能性から多大な恩恵を受けるであろう。
【0004】
現在提案されている多くのＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ベースの遺伝子修飾治療の様式は、修飾前に細胞の標的化集団を患者から除去するエクスビボ法を含む。ただし、固形組織は必ずしも患者から除去できるとは限らないため、これらの方法の適用性が制限される。さらに、このような造血細胞などの組織の除去は、生着不全及び感染の重大なリスクをもたらし、そしてエクスビボで細胞を取り扱うための高価なＧＭＰ施設を必要とする。組織の除去はまた、細胞のネイティブのニッチ及び調節相互作用の喪失により、組織内の細胞の機能も破壊し得る。したがって、特に対象の体から容易に除去できない細胞については、インサイチュ遺伝子修飾法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0005】
開示されているのは、ネイティブの幹細胞の特性及び調節相互作用を保ちながら、その生理学的ニッチ内の細胞を遺伝的に変化させる強力な新しいシステムである。具体的には、このシステムは、細胞の単離、培養、またはその後の移植を必要とせずに、幹細胞ゲノムをインサイチュで操作することを可能にし、それにより、ネイティブの調節相互作用及び現存する幹細胞特性を維持する。このシステムはまた、インビトロ条件で堅牢な幹細胞機能を維持できないこと、アブレーションコンディショニングの必要な使用、及び生着不全の避けられないリスクなど、エクスビボでの幹細胞の修飾及びその後の移植に関連する課題及び毒性を軽減する（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。したがって、内因性組織幹細胞にＤＮＡ修飾酵素を直接形質導入する機会は、幹細胞における治療的遺伝子
編集を目的とした現在進行中の学術的及び商業的取り組みに直接かつ特定の関連性があり、その全てが、これまで、エクスビボでの修飾及び再注入のために幹細胞を精製する必要性があると考えている（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
編集を目的とした現在進行中の学術的及び商業的取り組みに直接かつ特定の関連性があり、その全てが、これまで、エクスビボでの修飾及び再注入のために幹細胞を精製する必要性があると考えている（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0006】
本明細書に記載のＡＡＶベースのインビボシステムではまた、幹細胞機能を調査するための現在の実験システムに関連する重要な技術的及び実際的な制限も克服する。特に、一般的に採用されているトランスジェニック及び遺伝子ノックアウトベースのモデルは、複数の対立遺伝子を導入するために複雑な育種スキームを必要とすることが多く、時間及びリソースの両方に多大な投資を必要とし、高齢の動物において、非標準の遺伝子的背景において、または組み合わせた方式で、遺伝標的化効果を評価する際にはさらに問題となる。対照的に、本明細書に開示されるように、プログラム可能なＤＮＡ修飾酵素のＡＡＶ媒介送達は、広範な動物の年齢及び系統にわたって、そして様々な個々の及び多重化された遺伝子座に適用され得る。したがって、この技術は、遺伝子の機能及び相互作用をインビボで及び組織前駆体で調べることができるペースを加速する上で重要な用途を有する可能性が高い。最終的に、このシステムは、幹細胞の表現型に特異的に影響を与えると疑われる候補及び未知の遺伝子標的の迅速かつ直接的なインビボスクリーニングを可能にするように適合され得る。
【0007】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の細胞集団のゲノムを修飾する方法に関するものであり、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を細胞の集団に形質導入することと、この細胞集団のゲノム（例えば、細胞集団内の細胞のゲノム）を、配列標的化ヌクレアーゼで修飾することとを含み、この細胞集団は、造血幹細胞でも、造血前駆細胞でもない。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞の集団に対して選択的であるか、または１つ以上の他の細胞の集団を除外するために選択的である（本明細書に開示されるかまたは当技術分野で公知である細胞の任意の集団は除外され得る）。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、局所的または全身的に投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、局所的に注射される（例えば、細胞の集団を含む組織（すなわち、細胞の標的化集団）に注射される）。
【0008】
いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。
【0009】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この第２のウイルスはＡＡＶである。いくつかの実施形態では、このＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。
【0010】
いくつかの実施形態では、細胞の集団は、幹細胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組織幹細胞（例えば、固形組織幹細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は機能的な筋肉幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨格筋におけるＳｃａ－１+間葉系前駆細胞である。いくつかの実施形態では
、細胞の集団は、皮膚組織における真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ+）である。本発明のい
くつかの実施形態では、細胞の集団は、前駆細胞である（例えば、造血前駆細胞集団、一
般的な骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、系統を方向付けられた赤血球前駆体集団）。
、細胞の集団は、皮膚組織における真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ+）である。本発明のい
くつかの実施形態では、細胞の集団は、前駆細胞である（例えば、造血前駆細胞集団、一
般的な骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、系統を方向付けられた赤血球前駆体集団）。
【0011】
いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、この対象はヒトまたはマウスである。
【0013】
いくつかの実施形態では、細胞集団のうち少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、またはそれ以上が、ウイルス（例えば、第１のウイルスもしくは第２のウイルス、または第１のウイルス及び第２のウイルスの両方）によって形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞集団の少なくとも４０％が、ウイルス（例えば、第１のウイルスもしくは第２のウイルス、または第１のウイルス及び第２のウイルスの両方）によって形質導入される。
【0014】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の筋幹細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、ここでこのウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を筋幹細胞の集団に形質導入することと、筋幹細胞集団のゲノムを配列標的化ヌクレアーゼで修飾することとを含み、このウイルスは静脈内注射によって対象に投与され、この修飾された筋幹細胞は筋原性能力を保持する。いくつかの実施形態では、このウイルスは、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。
【0015】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％以上の筋幹細胞の集団が、ウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、筋幹細胞の集団の少なくとも５０％がウイルスによって形質導入される。
【0016】
いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【0017】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、この対象はヒトである。いくつかの実施形態では、この対象はマウスである。
【0020】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の間葉系前駆細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、間葉系前駆細胞の集団のゲノムを配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む。いくつかの実施形態では、このウイルスは、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。
【0021】
いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、Ｓｃａ－１+である。いくつかの実施形
態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置する。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置し、Ｓｃａ－１+である。
態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置する。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置し、Ｓｃａ－１+である。
【0022】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％がウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上がウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％がウイルスによって形質導入される。
【0023】
いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【0024】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、このウイルスは、局所注射または静脈内注射を介して対象に投与される。いくつかの実施形態では、この対象とはヒトである。いくつかの実施形態では、この対象とはマウスである。
【0026】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の真皮間葉細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、真皮間葉系細胞の集団のゲノムを配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。
【0027】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【0028】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。いくつかの実施形態では、この対象はヒトである。いくつかの実施形態では、この対象はマウスである。
【0029】
この特許または出願ファイルには、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて官庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身投与が筋衛星細胞を形質導入することを示す。実験計画。ＣｒｅリコンビナーゼをコードするＡＡＶを、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するｍｄｘ、Ａｉ９マウスに注射した。ｉ．ｖ．：静脈内。ＬＳＬ：ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘ。
【図1B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身投与が筋衛星細胞を形質導入することを示す。低用量（約５．５～８×１０１１ｖｇ）または高用量（約２．２×１０１２ｖｇ）で種々の血清型にパッケージングされたＡＡＶ－Ｃｒｅを用いて静脈内注射したｍｄｘ、Ａｉ９マウスから単離した骨格筋衛星細胞の代表的フローサイトメトリー分析。ＭｕＳＣ：筋肉衛星細胞。
【図1C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身投与が筋衛星細胞を形質導入することを示す。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋衛星細胞の頻度の定量化。個々のマウスのデータポイントは、平均値±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたり各ＡＡＶ血清型を注射されたマウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射されたマウス３匹。ｖｇ：ウイルスゲノム。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。
【図2A】ＡＡＶで形質導入された筋衛星細胞が、分化及び生着の可能性を保持していることを示す。低用量または高用量で異なるＡＡＶ血清型を注射されたマウスから単離された筋肉衛星細胞から分化したミオシン重鎖（ＭＨＣ）染色筋管の代表的な免疫蛍光画像。緑、ＭＨＣ。赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ。青、Ｈｏｅｃｈｓｔ。スケールバー、１００μｍ。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。
【図2B】ＡＡＶで形質導入された筋衛星細胞が、分化及び生着の可能性を保持していることを示す。移植されなかった（上段、対照）か、または高用量のＡＡＶ－Ｃｒｅ注射Ａｉ９マウス由来の５０，０００個のＦＡＣＳ精製ｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋肉衛星細胞を移植された（下段）ｍｄｘマウス由来のＴＡ筋肉における衛星細胞生着を分析する代表的な免疫蛍光画像。移植した２本の脚及び移植していない２本の反対側の脚由来のＴＡ筋肉を、移植後３週間で分析した。白い矢じり印は、Ｐａｘ７＋ｔｄＴｏｍａｔｏ－筋肉衛星細胞を示す。白い矢印は、Ｐａｘ７＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋肉衛星細胞を示す。ＴｄＴｏｍａｔｏ＋筋線維も明らかである。青、ＤＡＰＩ。白、ラミニン。緑、Ｐａｘ７。赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ。スケールバー：２０μｍ。
【図2C】ＡＡＶで形質導入された筋衛星細胞が、分化及び生着の可能性を保持していることを示す。ビヒクルのみの注射の３週間後のｍｄｘマウス由来のＴＡ筋肉（上段、対照）または以前に高用量のＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射されたｍｄｘ、Ａｉ９マウスから採取された筋衛星細胞（下段）における筋線維生着を分析する代表的な画像。赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ。緑、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）。青、ＤＡＰＩ。スケールバー、１００μｍ。
【図3A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。実験計画。ＣｒｅリコンビナーゼをコードするＡＡＶを、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを保有するｍｄｘ、Ａｉ９マウスに注射した。ｉ．ｖ．：静脈内。ＬＳＬ：ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘ。
【図3B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ＨＳＣゲーティング戦略（骨髄（ＢＭ）由来のＬｉｎ－Ｓｃａ－１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ４８－ＣＤ１５０＋）及びＨＳＣ内のｔｄＴｏｍａｔｏ発現の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図3C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＨＳＣの頻度。個々のマウスからのデータポイントは、平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたり各ＡＡＶ血清型を注射されたマウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図3D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。移植後の毎月の間隔での一次レシピエントの末梢血生細胞間のドナーキメラ現象の割合（％）。データは平均±ＳＤである。Ｎ＝１群あたりの一次レシピエントが８。
【図3E】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。移植後１６週間で示された末梢血系統内にｔｄＴｏｍａｔｏ＋多系統生着を有する一次レシピエントの頻度。各系統について、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋生着は、２つの基準の満足度に基づいてスコアリングされた：ＣＤ４５．２＋細胞が＞１％及びｔｄＴｏｍａｔｏ＋がＣＤ４５．＋細胞のうち＞１％。
【図3F】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度であって、移植後１６週での一次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生Ｔ細胞での頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり一次レシピエント６～８。
【図3G】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度であって、移植後１６週での一次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生Ｂ細胞での頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり一次レシピエント６～８。
【図3H】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度であって、移植後１６週での一次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生単球での頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり一次レシピエント６～８。
【図3I】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度であって、移植後１６週での一次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生好中球での頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり一次レシピエント６～８。
【図3J】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が機能的な造血幹細胞を形質導入することを示す。移植後６ヶ月の一次レシピエントにおけるＣＤ４５．２＋ＨＳＣ中のｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣのパーセンテージ。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり一次レシピエント６～８。ｖｇ：ウイルスゲノム。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。
【図4A】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後の月間隔での二次レシピエントにおける末梢血生細胞間のドナーキメラ現象の割合（％）。データは平均±ＳＤである。Ｎ＝１群あたり二次レシピエント６～９。
【図4B】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後１６週間で示された末梢血系統内のｔｄＴｏｍａｔｏ＋多系統生着を有する二次レシピエントの頻度。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋生着は、図３Ｅと同じ基準を使用して決定された。
【図4C】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後１６週での二次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生Ｔ細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたりマウス６～９匹。
【図4D】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後１６週での二次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生Ｂ細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたりマウス６～９匹。
【図4E】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後１６週での二次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生単球のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたりマウス６～９匹。
【図4F】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後１６週での二次レシピエントにおける、ＣＤ４５．２＋末梢血生好中球のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度。各系統について、その系統内で１％を超えるＣＤ４５．２＋細胞を示すレシピエントのみを示す。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたりマウス６～９匹。
【図4G】ＡＡＶで形質導入された造血幹細胞が、二次移植後に長期的な再構成の可能性を示すことを示す。移植後４～５か月の二次レシピエントにおけるＣＤ４５．２＋ＨＳＣ中のｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣの割合（％）。個々のデータポイントを、平均±ＳＤと重ね合わせて示す。Ｎ＝１群あたり二次レシピエント６～９。ｖｇ：ウイルスゲノム。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。
【図5A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。高用量ＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射してから２週間後（下）、注射していないＡｉ９ｆｌ／ｆｌマウス（上）または年齢を一致させたＡｉ９ｆｌ／ｆｌマウスから収集した前脛骨（ＴＡ）筋の代表的な免疫蛍光画像。Ｎ＝分析された、注射されたマウス４匹。スケールバー：２０μｍ。
【図5B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。注射されていないか、または高用量のＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射されたＡｉ９ｆｌ／ｆｌマウスのＴＡ筋肉内のｔｄＴｏｍａｔｏ＋Ｐａｘ７＋衛星細胞の頻度の定量化。Ｎ＝注射されていない分析マウス１匹。Ｎ＝高用量ＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射した分析マウス３匹。６０～８０のＰａｘ７+層下（ｓｕｂｌａｍｉｎａｒ）細胞をＴＡ筋肉あたり１０の異なる０．１８１ｍｍ２領域の中で定量した。個々のデータポイントは、平均値±ＳＤと重ね合わされる。
【図5C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。左：筋線維関連細胞におけるＬｉｎ+（ＣＤ４５+／Ｍａｃ－１+／Ｔｅｒ１１９+）造血細胞及びＳｃａ－１+間葉系前駆体のＦＡＣＳゲーティング戦略。右：確立された細胞表面マーカーを用いたＬｉｎ－Ｓｃａ－１－親ゲート由来のβ１－インテグリン+／ＣＸＣＲ４+ＭｕＳＣ（筋衛星細胞）のためのゲーティング戦略（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【図5D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。ＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射したマウス由来のＦＡＣＳ精製ｔｄＴｏｍａｔｏ+及びｔｄＴｏｍａｔｏ－衛星細胞におけるＰａｘ７、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏｄ１及び－Ｍｙｏｇ発現のリアルタイムＰＣＲ分析。Ｇａｐｄｈはハウスキーピング遺伝子として使用した。各遺伝子について、転写物レベルは、ｔｄＴｏｍａｔｏ－群に対して正規化した。ｐ値は、対応のあるｔ検定によって計算。
【図5E】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えｔｄＴｏｍａｔｏ+Ｌｉｎ+造血細胞の定量化。平均値±ＳＤと重ね合わされた個々のデータポイント。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図5F】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えＳｃａ－１+間葉系前駆体の定量化。平均値±ＳＤと重ね合わされた個々のデータポイント。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図5G】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が骨格筋衛星細胞及び間葉系前駆細胞を形質導入することを示している。ビヒクルのみ（左カラム）または高用量ＡＡＶ８－Ｃｒｅ（右の列）を注射したマウスから単離したＳｃａ－１+間葉系前駆体からエクスビボで分化された脂肪細胞の代表的な蛍光画像。緑、ＢＯＤＩＰＹ（脂質染色）。赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ。青、Ｈｏｅｃｈｓｔ。スケールバー、１００μｍ。
【図6A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が骨格筋衛星細胞への送達を可能にすることを示している。Ｌｉｎ＋（ＣＤ４５+／Ｍａｃ－１+／Ｔｅｒ１１９＋）造血細胞、Ｓｃａ－１＋間葉系前駆体、及びＳｃａ－１－Ｌｉｎ－Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ+ＭｕＳＣ（筋肉衛星細胞）のＦＡＣＳゲーティング戦略。筋線維関連細胞は、６ｘ１０１１個のＡＡＶ－Ｃｒｅのウイルスゲノム（ｖｇ）を注射したＰａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ＋／－、ｍｄｘ、Ａｉ９ｆｌ／＋マウスのＴＡ筋肉から採取した。
【図6B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が骨格筋衛星細胞への送達を可能にすることを示している。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えｔｄＴｏｍａｔｏ＋Ｌｉｎ＋造血細胞の定量化。個々のデータポイントは、平均±ＳＤと重ね合わせた。Ｎ＝各群にマウス２～３匹。
【図6C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が骨格筋衛星細胞への送達を可能にすることを示している。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えＳｃａ－１＋間葉系前駆体の定量化。個々のデータポイントは、平均±ＳＤと重ね合わせた。Ｎ＝各群にマウス２～３匹。
【図6D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が骨格筋衛星細胞への送達を可能にすることを示している。ＡＡＶ形質導入及びＣｒｅ組換えＳｃａ－１－Ｌｉｎ－Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ＋筋衛星細胞の定量化。個々のデータポイントは、平均±ＳＤと重ね合わせた。Ｎ＝各群にマウス２～３匹。
【図7A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。赤芽球前駆細胞のＦＡＣＳゲーティング戦略：ＥｒｙＡ（Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１＋ＦＳＣ高）、ＥｒｙＢ（Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１＋ＦＳＣ低）、及びＥｒｙＣ（Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１－ＦＳＣ低）。
【図7B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。骨髄系前駆細胞のＦＡＣＳゲーティング戦略：一般的な骨髄系前駆体（ＣＭＰ：Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃγＲ低）、顆粒球単球前駆体（ＧＭＰ：Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃγＲ＋）、及び巨核球赤血球前駆体（ＭＥＰ：Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４－ＦｃγＲ－）。
【図7C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＥｒｙＡ細胞の頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図7D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＥｒｙＢ細胞の頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図7E】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＥｒｙＣ細胞の頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。
【図7F】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＣＭＰの頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。スケールバー、１００μｍ。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。ｖｇ：ウイルスゲノム。
【図7G】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＧＭＰの頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。スケールバー、１００μｍ。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。ｖｇ：ウイルスゲノム。
【図7H】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射が造血前駆細胞を形質導入することを示す。ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＭＥＰの頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりＡＡＶ注射マウス４匹、Ｎ＝１群あたりビヒクル注射マウス３匹。スケールバー、１００μｍ。Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡｎｃ８０と略される。ｖｇ：ウイルスゲノム。
【図8A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。ＡＡＶ－Ｃｒｅの大腿内投与の６週間後のＨＳＣ内のｔｄＴｏｍａｔｏ発現の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図8B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。注射した脚（青）または反対側の脚（赤）内のｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＬｉｎ－Ｓｃａ－１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ４８－ＣＤ１５０＋ＨＳＣの頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりマウス３～４匹。円：２ｘ１０１２ｖｇ用量を注射されたマウス。三角形：４ｘ１０１２ｖｇの用量を注射されたマウス。反対側の脚にｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣが存在することは、局所投与されたウイルスの全身性播種を反映している。
【図8C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。移植後１６週間での一次レシピエントにおける末梢血生細胞間のドナーキメラ現象の割合（％）。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりマウス４～６匹。
【図8D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。示された系統内の移植後１６週間でのＣＤ４５．２＋末梢血細胞のうち１％超のＣＤ４５．２＋細胞及び１％超のｔｄＴｏｍａｔｏ＋を含む一次レシピエントの頻度。
【図8E】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。移植後１６週間でのＣＤ４５．２＋末梢血生細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の頻度。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりマウス４～６匹。
【図8F】ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射が造血幹細胞への送達を可能にすることを示す。移植後８か月でのドナー由来ＨＳＣ中のｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣの割合（％）。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝１群あたりマウス２～５匹。ｖｇ：ウイルスゲノム。
【図9A】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。造血細胞（ＣＤ４５＋）、皮膚線維芽細胞（ＣＤ４５－ＣＤ１４０ａ＋）、ならびに皮膚の真皮内のＣＤ２４及びＳｃａ－１の発現に基づく皮膚線維芽細胞の４つのサブセットを同定するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。細胞は、以前は生きた（ＤＡＰＩ－）シングレットとしてゲーティングされた。
【図9B】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。非注射及び高用量ＡＡＶ８－Ｃｒｅ注射マウス由来のＣＤ４５＋細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図9C】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。注射されていないマウス及び高用量のＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射されたマウス由来の皮膚切片の代表的な免疫蛍光画像。緑、ＣＤ１４０ａ。赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ。青、ＤＡＰＩ。スケールバー：５０μｍ。
【図9D】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。ＣＤ２４＋Ｓｃａ－１－細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図9E】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。ＣＤ２４＋Ｓｃａ－１＋細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図9F】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。ＣＤ２４－Ｓｃａ－１－細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図9G】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。ＣＤ２４－Ｓｃａ－１+細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図9H】ＡＡＶ－Ｃｒｅの全身注射により、皮膚常在造血細胞、線維芽細胞、及び間葉系前駆体の形質導入が可能になることを示す。注射後２週間での注射されたマウス由来の示された皮膚細胞集団のそれぞれにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ+細胞の割合（％）。個々のデータポイントは平均±ＳＤと重ね合わされる。Ｎ＝ＡＡＶ－Ｃｒｅを注射したマウス３匹。
【図10】全身ＡＡＶ投与が明白な肝臓組織病理学を誘発しないことを示している。（図１０Ａ）ビヒクル注射またはＡＡＶ８－Ｃｒｅ注射したｍｄｘ、Ａｉ９動物由来の肝臓切片の代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）画像。注射は静脈内に行った。（図１０Ｂ）ＡＡＶ８－Ｃｒｅ注射及びビヒクル注射ｍｄｘ、Ａｉ９マウス、ならびに注射されていないＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴ（野生型）対照のサブセットからの肝臓組織病理学スコアリング。組織には、正常なマウスによく見られるいくつかの微小膿瘍、及び正常なマウスに時折発生する小さな壊死病巣を含んでいた。スケールバー、２００μｍ。ｖｇ：ウイルスゲノム。
【図11A】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。Ｄｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位を含む増幅されたＤｎｍｔ３配列にインデルを含む配列読み取りの割合（％）を示す。
【図11B】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。野生型配列に対応するＤｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位を含む増幅されたＤｎｍｔ３配列における配列読み取りの割合（％）を示す。
【図11C】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。骨髄細胞におけるＤｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位周辺のインデルのヒストグラムを示している。
【図11D】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。ＨＳＣにおけるＤｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位周辺のインデルのヒストグラムを示している。
【図11E】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。ＭＰＰにおけるＤｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位周辺のインデルのヒストグラムを示している。
【図11F】ＡＡＶ－ｓａＣａｓ９－ｇＤｎｍｔ３ａを使用したＤｎｍｔ３ａのインビボ編集を示す。肝細胞のＤｎｍｔａ３ ｇＲＮＡ標的部位周辺のインデルのヒストグラムを示している。
【発明を実施するための形態】
【0031】
インビボ（すなわち、インサイチュ）での細胞（例えば、組織幹細胞）内のＤＮＡ配列の修飾のための戦略（すなわち、方法）が開示されている。この戦略は、インサイチュでの細胞への配列標的化ヌクレアーゼのウイルス（例えば、ＡＡＶ媒介）送達を利用する。ＡＡＶは、修飾する組織に直接注入するか、または全身に送達してもよい。このシステムの概念実証は、ＡＡＶを媒介したＣｒｅリコンビナーゼの蛍光レポーターマウス（ｌｏｘＰ Ｃｒｅ認識部位に隣接する配列の切除時に赤色蛍光を示すＡｉ９レポーター）への送達を使用して、多くの異なる細胞タイプで実証されている。インビボでの幹細胞及び前駆細胞の最大６５％の編集、ならびに修飾された細胞の確認された機能性が示されている。さらに、本明細書では、対象に注射されたＡＡＶ形質導入ｓａＣＡＳ９及びｇＲＮＡが、肝臓、骨髄、ＨＳＣ、及びＭＰＰを特異的に修飾し得ることが示されている。
【0032】
いくつかの態様では、本発明は、対象（例えば、ヒト、マウス）においてインサイチュで細胞の集団（例えば、標的化された細胞の集団）のゲノムを修飾するための方法に向けられ、この方法は、対象をウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））と接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を細
胞の集団に形質導入することと、配列標的化ヌクレアーゼで細胞集団のゲノムを修飾することとを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団とは、幹細胞集団、組織幹細胞集団、筋幹細胞集団（例えば、機能的筋幹細胞集団）、間葉系前駆細胞集団、Ｓｃａ－１+間葉
系前駆細胞集団、骨格筋集団中の間葉系前駆細胞、真皮間葉系細胞集団、またはＣＤ１４０ａ+真皮間葉系細胞集団である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、造血幹
細胞でも造血前駆細胞集団でもない。いくつかの実施形態では、この細胞集団とは、幹細胞集団、組織幹細胞集団、筋幹細胞集団（例えば、機能的筋幹細胞集団）、間葉系前駆細胞集団、Ｓｃａ－１+間葉系前駆細胞集団、骨格筋集団における間葉系前駆細胞、真皮間
葉系細胞集団、多能性前駆体集団、またはＣＤ１４０ａ+真皮間葉系細胞集団の前駆細胞
である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、前駆細胞集団（例えば、造血前駆細胞集団、共通骨髄前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤血球前駆体集団、系統を方向付けられた赤血球前駆体集団）である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、肝臓組織細胞集団である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、骨髄細胞集団である。
胞の集団に形質導入することと、配列標的化ヌクレアーゼで細胞集団のゲノムを修飾することとを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団とは、幹細胞集団、組織幹細胞集団、筋幹細胞集団（例えば、機能的筋幹細胞集団）、間葉系前駆細胞集団、Ｓｃａ－１+間葉
系前駆細胞集団、骨格筋集団中の間葉系前駆細胞、真皮間葉系細胞集団、またはＣＤ１４０ａ+真皮間葉系細胞集団である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、造血幹
細胞でも造血前駆細胞集団でもない。いくつかの実施形態では、この細胞集団とは、幹細胞集団、組織幹細胞集団、筋幹細胞集団（例えば、機能的筋幹細胞集団）、間葉系前駆細胞集団、Ｓｃａ－１+間葉系前駆細胞集団、骨格筋集団における間葉系前駆細胞、真皮間
葉系細胞集団、多能性前駆体集団、またはＣＤ１４０ａ+真皮間葉系細胞集団の前駆細胞
である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、前駆細胞集団（例えば、造血前駆細胞集団、共通骨髄前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤血球前駆体集団、系統を方向付けられた赤血球前駆体集団）である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、肝臓組織細胞集団である。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、骨髄細胞集団である。
【0033】
いくつかの実施形態では、細胞またはそのサブセット（例えば、特定の細胞表面マーカーまたはマーカーのセットを有する細胞）のうち少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％以上が修飾される。いくつかの実施形態では、細胞またはそのサブセットのゲノムのうち少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％以上が、相同組換えによって修飾される（例えば、ゲノム配列が置換または挿入される）。いくつかの実施形態では、細胞またはそのサブセットのゲノムのうち少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％以上が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修飾される（例えば、ゲノム配列が欠失される）。いくつかの実施形態では、この修飾は、少なくとも１つの対立遺伝子の修飾を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、両方の対立遺伝子の修飾を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の細胞集団が、細胞の非標的化集団（例えば、細胞の標的化集団を含む組織内の別の細胞型など、ウイルスとも接触した異なる細胞集団）と比較して修飾されている。
【0035】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、ヒトまたは動物（例えば、霊長類）を意味する。通常、動物とは脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、飼育動物または狩猟動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。飼育及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えば、マス、ナマズ及びサケが挙げられる。患者または対象は、前述の、例えば、上記した全ての任意のサブセットを含むが、ヒト、霊長類またはげっ歯類などの１つ以上の群または種を除く。ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「患者」、「個体」及び「対象」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定さ
れない。対象は雄性であっても、または雌性であってもよい。「対象」とは、様々な実施形態における任意の脊椎動物であってもよい。対象とは、例えば、実験、診断、及び／もしくは治療を目的として薬剤が投与される個体、または試料が得られる個体もしくは手順が実施される個体であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、新生児～６か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、６～２４か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、２～６歳、６～１２歳、または１２～１８歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８～３０歳、３０～５０歳、５０～８０歳、または８０歳を超える。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳である。いくつかの実施形態では、対象は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は成人である。この目的のために、若くとも１８歳のヒトが成人であると見なされる。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）である。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）ではない。いくつかの実施形態では、対象は胚である。いくつかの実施形態では、対象は胎児である。ある特定の実施形態では、子宮内の胚または胎児に対する生物学的効果を処置するか、または引き起こすために、薬剤が妊婦に投与される。
れない。対象は雄性であっても、または雌性であってもよい。「対象」とは、様々な実施形態における任意の脊椎動物であってもよい。対象とは、例えば、実験、診断、及び／もしくは治療を目的として薬剤が投与される個体、または試料が得られる個体もしくは手順が実施される個体であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、新生児～６か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、６～２４か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、２～６歳、６～１２歳、または１２～１８歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８～３０歳、３０～５０歳、５０～８０歳、または８０歳を超える。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳である。いくつかの実施形態では、対象は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は成人である。この目的のために、若くとも１８歳のヒトが成人であると見なされる。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）である。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）ではない。いくつかの実施形態では、対象は胚である。いくつかの実施形態では、対象は胎児である。ある特定の実施形態では、子宮内の胚または胎児に対する生物学的効果を処置するか、または引き起こすために、薬剤が妊婦に投与される。
【0036】
本明細書で使用される場合、細胞を１つ以上のウイルスと「接触させること」は、対象の全身に（例えば、静脈内に）または局所的に（例えば、皮膚組織、筋肉組織、または他の標的とされた組織もしくは器官への局所注射）ウイルスを投与することを含み得る。あるいは、他の投与経路が選択されてよい（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、及び他の親経路）。接触方法は限定されず、当該技術分野において利用可能な任意の好適な方法であってよい。
【0037】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの一本鎖核酸であり得る。あるいは、それは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一態様では、鋳型核酸はＤＮＡである。別の態様では、鋳型はＲＮＡである。好適な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の好適な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。核酸分子は、ゲノムＤＮＡと同様に天然に存在してもよいし、もしくはそれは合成であってもよく、すなわち、ヒトの行為に基づいて調製されてもよいし、または２つの組合せであってもよい。核酸分子はまた、ある特定の修飾、例えば、米国特許出願第２００７０２１３２９２号に記載されるような２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、コレステロール付加、及びホスホロチオエート骨格など、ならびに米国特許第６，２６８，４９０号に記載されるような、２’－酸素原子と４’－炭素原子との間でメチレン単位によって連結されているある特定のリボヌクレオシドを有し得、両方の特許及び特許出願の全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0038】
いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１５ＧＣの範囲内（体重が７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣである複製欠損ウイルスの量を含有するために投与単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０９ＧＣ、５．０×１０９ＧＣ、１．０×１０１０ＧＣ、５．０×１
０１０ＧＣ、１．０×１０１１ＧＣ、５．０×１０１１ＧＣ、１．０×１０１２ＧＣ、５．０×１０１２ＧＣ、または１．０×１０１３ＧＣ、５．０×１０１３ＧＣ、１．０×１０１４ＧＣ、５．０×１０１４ＧＣ、または１．０×１０１５ＧＣである。いくつかの実施形態では、製剤中の複製欠陥ウイルスの用量は、５．５～８×１０１１または２．２×１０１２のウイルスゲノム（ｖｇ）である。
０１０ＧＣ、１．０×１０１１ＧＣ、５．０×１０１１ＧＣ、１．０×１０１２ＧＣ、５．０×１０１２ＧＣ、または１．０×１０１３ＧＣ、５．０×１０１３ＧＣ、１．０×１０１４ＧＣ、５．０×１０１４ＧＣ、または１．０×１０１５ＧＣである。いくつかの実施形態では、製剤中の複製欠陥ウイルスの用量は、５．５～８×１０１１または２．２×１０１２のウイルスゲノム（ｖｇ）である。
【0039】
本明細書全体にわたって開示される方法での使用に好適なウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）などが挙げられる。ウイルスは、宿主細胞に導入される場合、感染性ウイルスを産生するのに十分なウイルス遺伝情報を含んでも含まなくてもよく、すなわち、ウイルスベクターは複製可能であっても複製欠損性であってもよい。
【0040】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さな（２０ｎｍ）複製欠損性の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ＡＡＶゲノムは、１９番染色体上の特定の部位に最も頻繁に組み込まれる。ゲノム中へのランダムな組込みは、ごくわずかな頻度で生じる。組込み能力は、ベクターからｒｅｐ ＯＲＦの少なくとも一部を除去することによって排除される場合があり、結果としてエピソームの状態を保持し、少なくとも非分裂細胞中で持続的な発現を提供するベクターをもたらす。ＡＡＶを遺伝子導入ベクターとして使用するために、プロモーターに機能的に連結される、所望のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列、例えば、ＡＴＰＩＦ１を阻害するポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸が、ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）間に挿入される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びベクターとしての、例えば、遺伝子治療のためのそれらの使用は、Ｓｎｙｄｅｒ，ＲＯ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８０７．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１１でも考察されている。
【0041】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０（すなわち、Ａｎｃ８０Ｌ６５）（参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５０５４６５３に開示される）である。いずれのＡＡＶ血清型も、または改変ＡＡＶ血清型も適宜使用されてよく、かつ限定されない。
【0042】
別の好適なＡＡＶは、例えば、ｒｈｌＯであってもよい［ＷＯ２００３／０４２３９７］。さらに他のＡＡＶ供給源としては、例えば、ＡＡＶ９［米国特許第７，９０６，１１１号、米国特許出願公開第２０１１－０２３６３５３－Ａ１号］、及び／またはｈｕ３７［例えば、米国特許第７，９０６，１１１号、米国特許出願公開第２０１１－０２３６３５３－Ａ１号を参照］、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８［米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号］などが挙げられてよい。これらの及び他の好適なＡＡＶの配列に加えて、ＡＡＶベクターを生成する方法については、例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、米国特許第７５８８７７２Ｂ２号を参照のこと。さらに他のＡＡＶが、必要に応じて、選択されたＡＡＶカプシドの組織選択性を考慮に入れて選択されてもよい。組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＡＡＶ ＩＴＲ、本明細書に記載される発現カセット及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含有する核酸分子を含んでよい。本明細書に記載されるように、発現カセ
ットは、各発現カセット内にオープンリーディングフレーム（複数可）のための調節エレメントを含有してもよく、核酸分子は、場合により追加の調節エレメントを含有してもよい。
ットは、各発現カセット内にオープンリーディングフレーム（複数可）のための調節エレメントを含有してもよく、核酸分子は、場合により追加の調節エレメントを含有してもよい。
【0043】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、細胞の標的化集団に対して向性（ｔｒｏｐｏｓｉｍ）を有するか、または優先的に形質導入する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、細胞の非標的化集団（例えば、細胞の標的化集団を含む組織内の別の細胞型など、ウイルスとも接触した異なる細胞集団）と比較して約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の細胞の標的化集団について、向性を有するか、または優先的に形質導入する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、細胞の標的化集団を実質的に形質導入するか、またはそれのみを形質導入する。
【0044】
ＡＡＶベクターは、全長ＡＡＶ ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び全長３’ＩＴＲを含んでもよい。ＡＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が記載されていて、それはＤ－配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している。「ｓｃ」という略語は、自己相補的であることを指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有しているコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時、第２鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、すぐに複製及び転写を行う準備ができている１本の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載され、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0045】
偽型ＡＡＶが産生される場合、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶカプシドとともに使用するために選択される場合がある。一実施形態では、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列、またはその欠失型（ＡＩＴＲ）が、便宜上、かつ規制当局の承認を早めるために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＲＴが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られたベクターは偽型と称される場合がある。しかしながら、ＡＡＶ ＩＴＲの他の供給源が利用されてもよい。
【0046】
一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが使用されてよい。対象への送達に好適なＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び米国特許第７５８８７７２Ｂ２号を参照のこと。１つのシステムでは、産生細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）で一過性トランスフェクトされる。第２システムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物で（一過性または安定に）トランスフェクトされる。これらの各システムでは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答してＡＡＶビリオンが産生されるため、混入ウイルスからｒＡＡＶを単離する必要がある。より最近では、ＡＡＶを回収するのにヘルパーウ
イルスの感染を必要としないシステムが開発され、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、このシステムによってトランスに供給される。これらの新しいシステムでは、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性トランスフェクトすることによって供給され得るか、または細胞が、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作され得、その発現は転写もしくは転写後レベルで制御され得る。さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターの感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関する概説については、一般に、例えば、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと。これらを作製かつ使用する方法及び他のＡＡＶ産生システムは、以下の米国特許にも記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。
イルスの感染を必要としないシステムが開発され、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、このシステムによってトランスに供給される。これらの新しいシステムでは、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性トランスフェクトすることによって供給され得るか、または細胞が、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作され得、その発現は転写もしくは転写後レベルで制御され得る。さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターの感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関する概説については、一般に、例えば、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと。これらを作製かつ使用する方法及び他のＡＡＶ産生システムは、以下の米国特許にも記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。
【0047】
別の実施形態では、他のウイルスベクターを使用してもよく、組込みウイルス、例えば、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルスを含むが、他のウイルスを選択してもよい。好適には、これらの他のベクターのうち１つが生成される場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして産生される。「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、合成または人工ウイルス粒子であって、その中では目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージングされ、このウイルスカプシドまたはエンベロープ内に同じくパッケージングされている任意のウイルスゲノム配列が複製欠損性であり、すなわち、それらは子孫ビリオンを生成できないが、標的細胞に感染する能力を保持し得る、合成または人工ウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（このゲノムは「ガットレス」である、すなわち、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含有するように操作され得る）が、これらの遺伝子は産生中に供給され得る。
【0048】
１つ以上のウイルスは、哺乳動物細胞中で発現（例えば、配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、及び／または１つ以上のｇＲＮＡの発現）を誘導できるプロモーター、例えば、好適なウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルスもしくは哺乳動物細胞に感染する他のウイルスに由来するプロモーター、または例えば、ＥＦ１アルファ、ユビキチン（例えば、ユビキチンＢもしくはＣ）、グロビン、アクチン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの遺伝子に由来する哺乳動物プロモーター、または複合プロモーター、例えば、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ－アクチンプロモーターの組合せ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヒトプロモーターが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、構成的プロモーター、及びユビキタスプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の細胞型（例えば、細胞の標的化集団）において発現を誘導する。例えば、筋幹細胞特異的プロモーター、間葉系前駆細胞特異的プロモーター、または真皮間葉系細胞（ＣＤ１４０ａ＋）特異的プロモーター。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の細胞の任意の集団における発現を選択的に指示する。
【0049】
本明細書に開示される方法に使用され得る配列標的化ヌクレアーゼは限定されることなく、本明細書に開示される任意の配列標的化ヌクレアーゼであってよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ））、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントである。
【0050】
現在使用されている配列標的化ヌクレアーゼ（すなわち、標的化可能なヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ）には、主に４つの種類がある：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩＩ型システムのＣａｓタンパク質、ならびに操作されたメガヌクレアーゼ。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、選択されたＤＮＡ配列をタンパク質の標的とするように適切に設計されている、部位特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合された制限酵素ＦｏｋＩ（またはその操作されたバリアント）のヌクレアーゼドメインを含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ジンクフィンガーＤＢＤを含む。ＴＡＬＥＮの場合、部位特異的ＤＢＤは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種などの植物病原菌に見られる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーである転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）によって用いられるＤＮＡ認識コードに基づいて設計される。
【0051】
規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムは、ゲノム工学用のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ技術として使用するために修飾されている細菌適応免疫系である。細菌系は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの内因性細菌ＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと部分的に相補性を有し、それと複合体を形成する。Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって標的配列に誘導され、これは標的内でｃｒＲＮＡ配列と相補配列との間にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。ゲノム修飾で使用するために、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、多くの場合に単一のキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）に組み合わされ、ｃｒＲＮＡの標的化特異性及びｔｒａｃｒＲＮＡの特性が組み合わされて、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断できるように標的配列にＣａｓタンパク質を局在化させる単一の転写物となる。ｓｇＲＮＡは、多くの場合に所望の標的配列に相補的な、またはそれと相同なおよそ２０ヌクレオチドのガイド配列に続いて、約８０ｎｔのハイブリッドｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当業者は、ガイドＲＮＡが標的配列に完全に相補的であるか、またはそれと相同である必要はないことを十分に理解する。例えば、いくつかの実施形態では、それは１つまたは２つのミスマッチを有する場合がある。ｇＲＮＡがハイブリダイズするゲノム配列には、通常、片側にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接しているが、当業者は、ある特定のＣａｓタンパク質がＰＡＭ配列に対して緩やかな要件を有する場合があることを十分に理解する。ＰＡＭ配列はゲノムＤＮＡ中に存在するが、ｓｇＲＮＡ配列中には存在しない。Ｃａｓタンパク質は、正確な標的配列及びＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡ配列を対象とすることになる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌の種に応じて変化する。Ｃａｓタンパク質の具体例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９及びＣａｓ１０が挙げられる。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ
に由来するＣａｓ９を使用してもよい。これらのＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、それぞれＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｓａＣａｓ９）に由来する。
に由来するＣａｓ９を使用してもよい。これらのＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、それぞれＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｓａＣａｓ９）に由来する。
【0052】
部位特異的ヌクレアーゼの操作されたバリアントは多数開発されていて、ある特定の実施形態で使用されてよい。例えば、Ｃａｓ９及びＦｏｋ１の操作されたバリアントは、当該技術分野において公知である。さらに、生物学的に活性な断片またはバリアントが使用され得ると理解される。他の選択肢としては、ハイブリッド部位特異的ヌクレアーゼの使用が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）タンパク質のアミノ末端に融合される。ＲＦＮは二量体として機能し、２つのガイドＲＮＡを利用する（Ｔｓａｉ，ＱＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９－５７６）。一本鎖ＤＮＡ切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼも、ゲノム編集に有用である。そのようなヌクレアーゼは「ニッカーゼ」と称されることもあり、２つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓタンパク質など）の２つのヌクレアーゼドメインのうち１つにおいて、主要な触媒残基に突然変異（例えば、アラニン置換）を導入することによって生成され得る。そのような突然変異の例としては、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＨ８４０Ａ、または他のＣａｓ９タンパク質の相同位置が挙げられる。ニックは、一部の細胞型では低効率でＨＤＲを刺激し得る。互いに近く、反対の鎖上に存在する一対の配列を標的とする２つのニッカーゼは、各鎖上に一本鎖切断を作成して（「ダブルニッキング」）、ＤＳＢを効果的に生成し得、これは場合によりドナーＤＮＡ鋳型を使用してＨＤＲによって修復され得る（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０－１３８９（２０１３））。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ三重バリアントまたはＮ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ四重バリアントである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２９，ｐｐ．４９０－４９５（及び補足資料）（２０１６）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２タイプＶ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のＣ２ｃ１である。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＰＡＭ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，” Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ．１８１４－１８２８（２０１６）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６０３１９２６０「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」に記載されているタンパク質である。
【0053】
配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）中に含まれるのに十分に短くなければならない。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９（ｓａＣａｓ９）である。
【0054】
いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、天然に存在する配列標的化ヌクレアーゼと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のポリペプチド配列同一性を有する。
【0055】
いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。
【0056】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。ｇＲＮＡは限定されず、本明細書に記載の任意のｇＲＮＡであり得る（例えば、目的の遺伝子領域に結合するｇＲＮＡ、目的の遺伝子領域に隣接する２つのｇＲＮＡ）。いくつかの実施形態では、ウイルスは単一のｇＲＮＡを形質導入する。いくつかの実施形態では、ウイルスは２つのｇＲＮＡを形質導入する。
【0057】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルス（例えば、ＡＡＶ）と対象とを接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：３～約１：１００であり、その間の比を含む。例えば、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：５～約１：５０、または約１：１０、または約１：２０であってよい。好ましくはないが、比は１：１であってもよいし、または第２ウイルスが多く存在してもよい。
【0058】
いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、目的の遺伝子領域に隣接する２つのｇＲＮＡ、または目的の遺伝子領域に結合する１つのｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞集団における治療的遺伝子置換を可能にするために、対象への相同ドナー鋳型の投与をさらに含む。相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＲ）媒介修復（相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）修復（ＨＤＲ）とも称される）は、切断を修復するための鋳型として相同ドナーＤＮＡを使用する。ドナーＤＮＡの配列がゲノム配列と異なる場合、このプロセスにより、ゲノムに配列変化が導入される。
【0059】
別の実施形態では、この方法は、ｇＲＮＡを送達するための単一のＡＡＶと、第２の異なるＣａｓ９送達システムとを含む。例えば、Ｃａｓ９（またはＣｐｆｌ）送達は、非ウイルス構築物、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡによって媒介され得る（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるものなどの他の構築物を含む、様々な送達組成物及びナノ粒子と併せて）。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０（その両方が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【0060】
いくつかの実施形態では、修飾される細胞集団は、幹細胞集団である。いくつかの実施形態では、修飾される細胞集団は、組織幹細胞集団、機能的筋幹細胞集団、間葉系前駆細胞集団、Ｓｃａ－１＋間葉系前駆細胞、骨格筋集団における間葉系前駆細胞、真皮間葉系細胞集団、またはＣＤ１４０ａ＋真皮間葉系細胞集団である。いくつかの実施形態では、修飾される細胞集団は、造血幹細胞集団でも造血前駆細胞集団でもない。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される方法によって修飾されたゲノムを有する細胞の運命または機能を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾された細胞の細胞生着、自己複製及び／または分化機能を評価する。いくつかの実施形態では、修飾された細胞の筋原性、造血性、線維形成性、脂肪生成性、及び／または骨形成性の能力が評価される。いくつかの実施形態では、細胞の形
態、成長速度、生存率、代謝、及び／または転移能。
態、成長速度、生存率、代謝、及び／または転移能。
【0062】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、疾患または状態を処置またはその可能性を低減する。本明細書に開示される方法は、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する様々な障害（すなわち、疾患及び状態）を処置及び／または予防することを企図している。本明細書に記載の方法及び組成物を使用して、標的ポリヌクレオチド配列の発現の増大、標的ポリヌクレオチド配列の発現の減少、または細胞における標的ポリヌクレオチド配列の発現の欠如に関連する障害を処置または予防し得ることを理解されたい。標的ポリヌクレオチド配列の発現の増大及び減少としては、標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルがそれぞれ増大または減少する状況、ならびに標的ポリヌクレオチド配列の発現産物の機能及び／または活性のレベルがそれぞれ、通常の発現及び／または活性レベルと比較して、増大または減少する状況が挙げられる。当業者は、標的ポリヌクレオチド配列（またはその発現産物）のレベル及び／または活性が本明細書に記載の組成物と細胞とを接触させた後、関連する細胞において減少するか否かを決定することによって、標的ポリヌクレオチド配列の発現の増大に関連する障害の処置または予防を評価し得ることを理解するであろう。当業者はまた、標的ポリヌクレオチド配列（またはその生成物の発現）のレベル及び／または活性が、本明細書に記載の組成物と細胞とを接触させた後、関連する細胞において増大したか否かを決定することにより、標的ポリヌクレオチド配列の発現低下に関連する障害の処置または予防（例えば、その可能性の低減）が評価され得ることも理解するであろう。
【0063】
いくつかの実施形態では、この障害は、遺伝性障害である。いくつかの実施形態では、この障害は、単一遺伝子障害である。いくつかの実施形態では、この障害は、多重遺伝子障害である。いくつかの実施形態では、この障害は、１つ以上のＳＮＰに関連する障害である。１つ以上のＳＮＰに関連する例示的な障害としては、米国特許第７，６２７，４３６号に記載されている複雑な疾患、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００９／１１２８８２に記載されているアルツハイマー病、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１８に記載されている炎症性疾患、米国特許出願公開第２０１２／０３０９６４２号に記載されている多嚢胞性卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号に記載されている心血管疾患、米国特許出願公開第２０１２／０１３６０３９号に記載されているハンチントン病、欧州特許出願公開番号第ＥＰ２５３５４２４号に記載されている血栓塞栓性疾患、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２０１２／００１６１３に記載されている神経血管疾患、米国特許出願公開番号２０１０／０２９２２１１に記載されている精神病、米国特許出願公開番号２０１１／０３１９２８８に記載されている多発性硬化症、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００６／０２３７１９Ａ２に記載されている統合失調症、統合失調性感情障害、及び双極性障害、米国特許出願公開第２０１１／０１０４６７４号に記載されている双極性障害及び他の疾患、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００６／１０４３７０Ａ１に記載されている結腸直腸癌、米国特許出願公開第２００６／０２０４９６９号に記載されているＡＫＴ１遺伝子遺伝子座に隣接するＳＮＰに関連する障害、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００３／０１２２４３Ａ１号に記載されている摂食障害、米国特許出願公開第２００７／０２６９８２７号に記載されている自己免疫疾患、米国特許第７，７９０，３７０号に記載されているクローン病を有する患者における線維狭窄症、及び米国特許第８，１８７，８１１号に記載されているパーキンソン病（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。本発明の方法に従って処置または予防され得る１つ以上のＳＮＰに関連する他の障害は、当業者には明らかであろう。
【0064】
いくつかの実施形態では、この疾患または状態は、幹細胞または組織幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、この疾患または状態は、修飾された機能的筋幹細胞で処置され得る。修飾された機能的筋幹細胞は、筋ジストロフィーなどの筋疾患または障害の処置を必要とする哺乳動物におけるそのような処置に使用し得る。筋ジストロフィーとしては、デ
ュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（シュタイネルト病としても公知）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー及びエメリー・ドレフス筋ジストロフィーが挙げられる。
ュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（シュタイネルト病としても公知）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ジストロフィー及びエメリー・ドレフス筋ジストロフィーが挙げられる。
【0065】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、肢虚血、脳卒中、一過性虚血、再灌流障害）神経障害（例えば、糖尿病性末梢神経障害、毒性神経障害）、肝不全、腎不全、糖尿病、骨及び関節の疾患、または幹細胞療法を必要とする任意の変性疾患の処置または予防に使用され得る。
【0066】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、神経障害の処置を必要とする対象において、内皮細胞へ分化する能力を有する細胞（例えば、多能性幹細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、単核球、またはその前駆体もしくはその子孫）のゲノムをインサイチュで修飾することであって、この細胞が目的の神経組織における血管新生を増強することを含む、修飾することを含む神経障害の処置のために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、神経障害の処置を必要とする対象において、内皮細胞へ分化する能力を有する細胞（例えば、多能性幹細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、単核球、またはその前駆体もしくはその子孫）のゲノムをインサイチュで修飾することであって、この細胞が目的の神経組織の微小血管系にあり、血管新生、血管分布、または神経組織の生物学的機能を増大させることを含む、修飾することを含む神経障害の処置のために使用され得る。さらに別の実施形態では、この方法は、インサイチュで修飾されたゲノムを有する、内皮細胞へ分化する能力を有する細胞（例えば、多能性幹細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、単核球、またはその前駆体もしくはその子孫）を、それを必要とする対象において提供し、この細胞は、治療効果（例えば、パラクリン因子、神経栄養因子、血管新生因子の増大、または血管新生の増大）を発揮するのに十分な神経組織における体液性応答を増強する。
【0067】
別の実施形態では、本発明は、肝不全、腎不全、または糖尿病の処置を必要とする対象に対して、肝細胞、腎細胞、またはインスリン産生細胞（例えば、膵島細胞）に分化転換する可能性を有する細胞のゲノムをインサイチュで修飾し、この細胞が組織を修復または再生することを含む、肝不全、腎不全、または糖尿病を処置するための方法を提供する。
【0068】
いくつかの実施形態では、この疾患または状態は、骨格筋における修飾された間葉系前駆細胞で処置され得る。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、皮膚組織における修飾された真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ＋）で処置され得る。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、脂肪異栄養症（例えば、先天性全身性脂肪異栄養症（ベラジネリ－セイプ症候群）、家族性部分型脂肪異栄養症、マルファノイド早老性リポジストロフィー症候群、ＣＡＮＤＬＥ症候群、後天性部分型脂肪異栄養症（バラケル－サイモン症候群）、遠心性腹部脂肪異栄養症（小児腹壁遠心性脂肪萎縮症）、環状脂肪萎縮（ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ ａｎｎｕｌａｒｉｓ）（フェレイラマークス脂肪萎縮症（Ｆｅｒｒｅｉｒａ－Ｍａｒｑｕｅｓ ｌｉｐｏａｔｒｏｐｈｉａ））、またはＨＩＶ関連脂肪異栄養症）である。いくつかの実施形態では、ゲノムがインサイチュで修飾された細胞は、組織美容、組織修復のために、または脂肪関連障害の処置のために使用される。
【0069】
本明細書で使用される場合、疾患、障害または病状に関連して使用される場合の「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」とは、状態の治療的処置を指し、この目的は、症状または状態の進行または重症度を逆転、軽減、改善、阻害、鈍化または停止することである。「処置すること」という用語は、状態の少なくとも１つの有害作用または症状を減少または軽減させることを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが減
少する場合、処置は一般に「効果的」である。あるいは、状態の進行が減少または停止する場合、処置は「効果的」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置が行われない場合に予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、処置が行われない場合に予想されるものと比較した場合に、１つ以上の症状（複数可）の軽減、欠損程度の縮小、安定した（すなわち、悪化しない）状態が挙げられるが、これらに限定されない。
少する場合、処置は一般に「効果的」である。あるいは、状態の進行が減少または停止する場合、処置は「効果的」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置が行われない場合に予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、処置が行われない場合に予想されるものと比較した場合に、１つ以上の症状（複数可）の軽減、欠損程度の縮小、安定した（すなわち、悪化しない）状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【0070】
障害または疾患に対する所与の処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、処置は、本用語が本明細書で使用される場合、障害の徴候または症状のうちいずれか１つまたは全てが有益な方法で変化される場合、他の臨床的に認められている症状が、例えば、本明細書に記載されるような薬剤または組成物を用いた処置後に少なくとも１０％向上または改善する場合「効果的な処置」と見なされる。有効性はまた、個体が悪化（入院によって評価される）しないこと、または医学的介入を必要としない（すなわち、疾患の進行が停止している）ことによって測定され得る。これらの指標を測定する方法は当業者に公知であるか、及び／または本明細書に記載されている。
【0071】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の筋幹細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を筋幹細胞の集団に形質導入することと、筋幹細胞集団のゲノムを配列標的化ヌクレアーゼで修飾することとを含み、このウイルスが静脈内注射によって対象に投与され、この修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持する。
【0072】
ＡＡＶは限定されておらず、本明細書に記載されているいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、このウイルスは、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％以上の筋幹細胞の集団が、ウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、筋幹細胞の集団の少なくとも５０％がウイルスによって形質導入される。
【0073】
配列標的化ヌクレアーゼは限定されるものではなく、本明細書に記載される任意の配列標的化ヌクレアーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、ｓａＣａｓ９）である。
【0074】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する。ｇＲＮＡは限定されるものではなく、本明細書に記載されるいずれであってもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。第２のウイルスは限定されるものではなく、本明細書に記載されているいずれであってもよい。
【0076】
いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、疾患（例えば、本明細書に記載の疾患）を処置、改善、または予防する。
【0077】
対象は限定されるものではなく、本明細書に記載される任意の対象であってもよい。いくつかの実施形態では、この対象はヒトである。いくつかの実施形態では、この対象はマウスである。
【0078】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の間葉系前駆細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、間葉系前駆細胞集団のゲノムを配列標的ヌクレアーゼで修飾することと、を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、Ｓｃａ－１＋である。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置する。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞は、骨格筋に位置し、Ｓｃａ－１＋である。
【0080】
ウイルスは限定されておらず、本明細書に記載されているいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％がウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上がウイルスによって形質導入される。いくつかの実施形態では、間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％がウイルスによって形質導入される。
【0081】
配列標的化ヌクレアーゼは限定されるものではなく、本明細書に記載されるいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｓａＣａｓ９）である。
【0082】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。第２のウイルスは限定されるものではなく、本明細書に記載されているいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、疾患（例えば、本明細書に記載の疾患）を処置、改善、または予防する。
【0083】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、局所注射または静脈内注射を介して対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。対象は限定されるものではなく、本明細書に記載されるいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、対象はマウスである。
【0084】
本開示のいくつかの態様は、インビボで対象の真皮間葉細胞の集団のゲノムを修飾する方法に向けられており、この方法は、対象をウイルスと接触させることであって、このウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、真皮間葉系細胞の集団のゲノムを配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む。
【0085】
ウイルスは限定されるものではなく、本明細書に記載されているいずれであってもよい
。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。
。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ｓａＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【0086】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと対象とを接触させることをさらに含む。第２のウイルスは限定されるものではなく、本明細書に記載されているいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、この修飾は、突然変異の導入または修正を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、疾患（例えば、本明細書に記載の疾患）を処置、改善、または予防する。対象は限定されるものではなく、本明細書に記載されるいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象はマウスである。
【0087】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少した」、「減少」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、及び「阻害する」という用語は全て、本明細書では一般に、参照と比較して統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「阻害する」は通常、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、最大及び例としては、例えば、参照レベルと比較した場合に所与の実体もしくはパラメータの完全な欠如を含む減少、または所与の処置を行わない場合と比較して１０～９９％のいずれかの減少を含み得る。
【0088】
「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は全て、本明細書では一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用され、あらゆる誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の増加を意味し、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大及び１００％の増加、または参照レベルと比較した場合に１０～１００％のいずれかの増加、あるいは少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加、または参照レベルと比較した場合に２倍～１０倍以上のいずれかの増加を意味する。
【0089】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、方法、及び方法または組成物に不可欠な、それらの各々の構成成分（複数可）に関連して使用されるが、不可欠であろうとなかろうと、指定されていない要素を含むことについて制限されない。
【0090】
「からなる」という用語は、本明細書に記載されるような組成物、方法、及びそれらの各々の構成成分を指し、これは実施形態のその記載に列挙されていない要素をいずれも除外する。
【0091】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なそれらの要素を指す。本用語は、その実施形態の基本的かつ新規の、または機能的な特徴（複数可）に実質的には影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【0092】
「統計的に有意」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に０．０５を超える「ｐ」値（関連の統計的検定によって算出される）を意味する。当業者は、任意の特定の実験に関連する統計的検定が、分析されているデータの種類に依存することを容易に理解することになる。追加の定義は、以下で個々の節の本文中において提供される。
【0093】
細胞生物学及び分子生物学の一般的な用語の定義は、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより出版，２００６（ＩＳＢＮ０－９１１９１０－１９－０）、ＲｏｂｅｒｔＳ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ０－６３２－０２１８２－９）、Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １４９）ｂｙ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ Ｊ．Ｒ．（２０００）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより出版，２００６に見出され得る。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｘ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより出版，２００９（ＩＳＢＮ－１０：０７６３７６６３２１）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）及びＣｕｎ－ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓにも見出され得る。
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓにも見出され得る。
【0094】
別段の記載がない限り、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２００１）及びＤａｖｉｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）に記載されているような、標準的な手順を使用して実施され、その両方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）に記載されているような、標準的な手順を使用して実施され、その両方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0095】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用され、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を示す。「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を含む、タンパク質アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関連して多くの場合に使用されるのに対して、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関連して多くの場合に使用されるが、当該技術分野においてこれらの用語の使用方法は重複する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物及びその断片を指す場合、本明細書では交換可能に使用される。
【0096】
したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、断片、ならびに前述の類似体が挙げられる。
＊＊＊
＊＊＊
【0097】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形式に限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施形態、及びその実施例は、例示目的のために本明細書に記載されているが、関連分野の当業者が認識するとおり、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法のステップまたは機能が所与の順序で提示されているが、代替の実施形態は、異なる順序で機能を実施する場合があるか、または機能は実質的に同時に実施される場合がある。本明細書で提供される本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用され得る。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本開示の態様は、必要であれば、上記の参考文献及び用途の組成物、機能及び構想を用いて、本開示のよりさらなる実施形態を提供するように修正され得る。これらの及び他の変更は、詳細な説明に照らして本開示で行われ得る。
【0098】
前述した実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態における要素と組み合わされ得るか、または置換され得る。さらに、本開示のある特定の実施形態と関連する利点が、これらの実施形態の文脈において記載されているが、他の実施形態もそのような利点を示す場合があり、全ての実施形態が、本開示の範囲内となるようにそのような利点を示す必要が必ずしもあるわけではない。
【0099】
全ての特許及び他の示された刊行物は、例えば、本発明と関連して使用される場合のあるそのような刊行物に記載される手法を記載かつ開示することを目的として、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日以前の、それらの開示のためにのみ提供される。この点で、本発明者らは、先行発明もしくは過去の刊行物によって、または他のいかなる理由によっても、そのような開示に先行する権利が付与されないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文献の日付または内容に関する描写に関する記載の全ては、出願人に利用可能な情報に基づいているが、これらの文献の日付または内容の正確さについて認めるものではない。
【0100】
当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された目的及び利点に加えて、それに固有のものを得るために十分に適合されていることを容易に理解する。本明細書における説明及び実施例の詳細は、ある特定の実施形態を代表するものであり、例示的であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書における修正及び他の使用は、当業者であれば想定するものである。これらの修正は、本発明の趣旨内に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な置換及び修正が本明細書に開示される本発明に加えられる可能性があることが、当業者には容易に明らかとなる。
【0101】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書及び特許請求の範囲で本明細書において使用される場合、特に明確な反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、特に反対の指示がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうち１つ、２つ以上、または全てが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーのうち２つ以上、または全てが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する実施形態を含む。さらに、本発
明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、列挙されている請求項のうち１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または関連するような任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入される全ての変更、組合せ、及び順列を提供すると理解されるべきである。本明細書に記載される全ての実施形態は、該当する場合、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが企図される。実施形態または態様のいずれかは、該当する場合は常に、１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わされ得ることも企図される。要素が一覧表として、例えば、マルクーシュ群または同様の形式で提示される場合、要素の各サブグループも開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ると理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと見なされる場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、いずれの場合においても本明細書では多数の用語で具体的に記載されているわけではない。特定の除外が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の活性剤、添加剤、成分、任意の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組合せが除外され得る。
明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、列挙されている請求項のうち１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または関連するような任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入される全ての変更、組合せ、及び順列を提供すると理解されるべきである。本明細書に記載される全ての実施形態は、該当する場合、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが企図される。実施形態または態様のいずれかは、該当する場合は常に、１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わされ得ることも企図される。要素が一覧表として、例えば、マルクーシュ群または同様の形式で提示される場合、要素の各サブグループも開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ると理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと見なされる場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、いずれの場合においても本明細書では多数の用語で具体的に記載されているわけではない。特定の除外が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の活性剤、添加剤、成分、任意の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組合せが除外され得る。
【0102】
特許請求の範囲または説明が組成物に関する場合、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される方法のいずれかに従って組成物を作製または使用する方法、及び本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が、本発明の態様であると理解されるべきである。特許請求の範囲または説明が方法に関する場合、例えば、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、方法の実施に有用な組成物を作製する方法、及び方法に従って生成された製品が本発明の態様であると理解されるべきである。
【0103】
範囲が本明細書で与えられる場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、及び一方の端点が含まれ、他方が除外される実施形態を含む。別段の指示がない限り、両方の端点が含まれていると想定されるべきである。さらに、別段の指示がない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態に記載されている範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、その範囲における下限値の単位の１０分の１まで想定し得ると理解されるべきである。一連の数値が本明細書に記載されている場合、本発明は、一連の任意の２つの値によって定義される任意の介在する値または範囲と同様に関連する実施形態、及び最小値が最小と見なされる場合があり、最大値が最大と見なされる場合がある実施形態を含むとさらに理解される。数値は、本明細書で使用される場合、パーセンテージで表される値を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付く本発明の任意の実施形態では、本発明は、正確な値が列挙されている実施形態を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付かない本発明の任意の実施形態では、本発明は、値の前に「約」または「およそ」が付く実施形態を含む。
【0104】
「およそ」または「約」は一般に、別段の記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、いずれの方向にも（その数を超えて、またはその数未満で）１％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の５％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の１０％の範囲内となる数を含む（そのような数が、可能な値の１００％を許容できないほど超えてしまう場合を除く）。特に明確に反対の指示がない限り、２つ以上の行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が列挙されている順序に必ずしも限定されるとは限らないが、本発明は順序がそのように限定
されている実施形態を含むと理解されるべきである。別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされる場合があることも理解されるべきである。
されている実施形態を含むと理解されるべきである。別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされる場合があることも理解されるべきである。
【実施例0105】
実施例１
【0106】
ゲノム修飾酵素のインビボ送達により、治療への応用及び機能的な遺伝子スクリーニングが大いに期待できる。これに関連して、恒常性において、そして再生の合図に応答して、細胞置換の永続的な供給源を提供する内因性組織幹細胞への送達は、特に興味深い。ここでは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって活性化される高感度蛍光レポーターシステムを利用して、内因性組織幹細胞におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によるインビボ形質導入後のゲノム修飾の効率を試験した。本発明者らは、免疫表現型分析と幹細胞機能の堅調なインビトロ及びインビボのアッセイを組み合わせて、複数のＡＡＶ血清型を使用して、組織に局在する骨格筋衛星細胞、間葉系前駆体、及び造血幹細胞の効果的な標的化を明らかにする。このアプローチによって達成されたゲノム修飾率は最大６５％に達し、修飾された細胞は重要な機能特性を保持していた。この研究は、ネイティブの幹細胞の特性及び調節相互作用を維持しながら、生理学的ニッチ内の組織幹細胞を遺伝的に変化させる強力な新しいプラットフォームを確立する。
【0107】
全身ＡＡＶ投与が成体動物の衛星細胞を形質導入し得るか否か、及びこのアプローチが追加のＡＡＶ血清型及び別個の組織幹細胞及び前駆体集団に拡張され得るか否かを本明細書に詳述するように調査した。ＡＡＶ－Ｃｒｅのインビボでの全身送達後の成体マウス衛星細胞の効率的な形質導入が見出され、これは、全衛星細胞プールの６０％超に達し、新生児マウスにおける本発明者らの以前の研究の６倍の増大を表している（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この形質導入能力は、ＡＡＶ９に限定されるものではなく、ＡＡＶ８及びＡｎｃ８０Ｌ６５（以下Ａｎｃ８０と呼ぶ）を含む追加のＡＡＶ血清型にも拡張される。また、骨格筋及び真皮の中の間葉系前駆体、ならびに骨髄の中の造血幹細胞及び前駆細胞を含む、複数の非筋原性幹細胞及び前駆細胞の形質導入及びゲノム修飾も本明細書に開示されている。その後の単離、分化、及び移植の研究により、標的化組織幹細胞は、インサイチュのＡＡＶ形質導入及びゲノム修飾後に再生機能を保持することが確認されている。まとめると、これらの研究は、成体哺乳動物におけるＡＡＶ送達を使用した、複数の解剖学的ニッチにわたる幹細胞及び前駆細胞の異なる系統の効率的なインビボのゲノム修飾を実証している。このシステムは、治療目的のための組織常在幹細胞におけるインビボでの遺伝子の活性化、破壊、及び編集戦略、ならびにトランスジェニックまたは内因性対立遺伝子を誘導または不活性化するアプローチを可能にして幹細胞及び前駆細胞のネイティブニッチ内のそれらの新規な分子調節因子を明らかにする。
【0108】
結果
【0109】
ゲノム修飾酵素のＡＡＶ９媒介性送達による、骨格筋幹細胞（衛星細胞）のインビボにおける遺伝子修飾の可能性は（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、以前に実証された。その研究では、成体マウスにおけるＡＡＶ９－Ｃｒｅの筋肉内送達後の衛星細胞の実質的な形質導入（３４～３７％）が観察されたが、静脈内注射後の成体衛星細胞の形質導入率は測定されなかった（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0110】
ここでは、ＣＭＶプロモーター及びキメライントロンの下流にあるＣｒｅリコンビナーゼ（ＡＡＶ－Ｃｒｅ）をコードする、血清型８、９、またはＡｎｃ８０（Ｚｉｎｎ ｅｔ
ａｌ．，２０１５）がパッケージされたＡＡＶ粒子を生成し、若年生体（６週齢）Ａｉ
９マウスに静脈内注射した（ｍｄｘバックグラウンド：ｍｄｘ、Ａｉ９マウス、図１Ａ）。Ａｉ９対立遺伝子は、停止カセットのＣｒｅ媒介性切除後、単一細胞の分解能で検出可能な、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光による、標的化細胞の不可逆的な標識を可能にする、Ｒｏｓａ２６－Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターをコードする（Ｍａｄｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＡＡＶ－Ｃｒｅ粒子は、２回の用量で、尾静脈または後眼窩洞のいずれかによって静脈内注射した（マウス１匹あたり５．５～８×１０１１または２．２×１０１２のウイルスゲノム（ｖｇ））。次に、注射の２～３週間後に、３つの明確に定義された再生成人前駆細胞集団（骨格筋衛星細胞、筋肉常在間葉系前駆細胞、ならびに骨髄に局在する造血幹細胞及び前駆細胞）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の存在について組織を分析した（これらは全て、広範囲に検証された細胞表面マーカープロファイルによって容易に識別可能である）（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
ａｌ．，２０１５）がパッケージされたＡＡＶ粒子を生成し、若年生体（６週齢）Ａｉ
９マウスに静脈内注射した（ｍｄｘバックグラウンド：ｍｄｘ、Ａｉ９マウス、図１Ａ）。Ａｉ９対立遺伝子は、停止カセットのＣｒｅ媒介性切除後、単一細胞の分解能で検出可能な、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光による、標的化細胞の不可逆的な標識を可能にする、Ｒｏｓａ２６－Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターをコードする（Ｍａｄｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＡＡＶ－Ｃｒｅ粒子は、２回の用量で、尾静脈または後眼窩洞のいずれかによって静脈内注射した（マウス１匹あたり５．５～８×１０１１または２．２×１０１２のウイルスゲノム（ｖｇ））。次に、注射の２～３週間後に、３つの明確に定義された再生成人前駆細胞集団（骨格筋衛星細胞、筋肉常在間葉系前駆細胞、ならびに骨髄に局在する造血幹細胞及び前駆細胞）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の存在について組織を分析した（これらは全て、広範囲に検証された細胞表面マーカープロファイルによって容易に識別可能である）（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【0111】
ｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋衛星細胞（ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ－１）－Ｔｅｒ１１９－Ｓｃａ－１－β１インテグリン＋ＣＸＣＲ４＋細胞として定義される。図５Ｃ（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４））は、静脈内注射の解剖学的位置（後眼窩または尾静脈）に関係なく、ＡＡＶ－Ｃｒｅを注射した全ての動物（Ｎ＝２４マウス）で８～６２％の範囲の頻度で検出され、これによって、ＡＡＶによるこれらの細胞のインビボ形質導入後の堅調かつ再現性のあるＣｒｅ依存性組換えが示される（図１Ｂ～１Ｃ）。ビヒクルを注射した対照（Ｎ＝６）ではｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は検出されなかった（図１Ｂ～１Ｃ）。同じ血清型のＡＡＶを注射したマウスを比較すると、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞の割合は、注射したＡＡＶの用量とほぼ相関し、平均して、衛星細胞のプール全体の半分超が形質導入され、より高用量のＡＡＶ８－ＣｒｅまたはＡｎｃ８０－Ｃｒｅのいずれかで遺伝的に修飾された（図１Ｃ）。これらの所見は、高用量ＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射した動物のサブセット（Ｎ＝３）での免疫蛍光分析によって検証され、３つの異なるＡＡＶ－Ｃｒｅを注射したマウスから分析した３０の切片のうち２９においてｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋衛星細胞の存在が確認された（Ｐａｘ７の発現と、基底膜の下のそれらの局在とを特徴とする（Ｓｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００））（図５Ａ）。注入されていない対照の切片では、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は検出されなかった。３匹全ての動物にわたるこれらの顕微鏡データの定量化は、フローサイトメトリーによって得られた結果（図１Ｃ）と同様に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋でもあるＰａｘ７＋衛星細胞の平均約３４％を示した（図５Ｂ）。興味深いことに、同じ筋肉から調製された異なる切片に存在するｔｄＴｏｍａｔｏ＋Ｐａｘ７＋筋肉衛星細胞の頻度の実質的な変動が観察され（図５Ｂ）、ＡＡＶ形質導入及びその後のゲノム修飾イベントが筋肉組織全体に均一に分布しない可能性があることを示唆している。
【0112】
次に、インビボでＡＡＶ形質導入及びゲノム修飾衛星細胞がそれらの筋原性能力を維持したか否か（図１Ａ）を調べた。ＡＡＶ－Ｃｒｅを注射したマウスの筋肉から選別された衛星細胞は、エクスビボで培養した場合、増殖、分化、融合してｔｄＴｏｍａｔｏ＋ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現筋管を形成する能力を保持していた（図２Ａ）。融合筋管におけるｔｄＴｏｍａｔｏシグナルの相対強度は、分類された集団の形質導入効率を反映しているようであり（ＦＡＣＳによって決定）、より高度に形質導入された集団は、視覚的に明るいｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋管を生成する（図２Ａ）。ＡＡＶ－Ｃｒｅで形質導入されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞の摂動されていない増殖及び分化特性と一致して、筋原性遺伝子発現の相対的定量化は、ｔｄＴｏｍａｔｏ－衛星細胞と比較した場合ｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞におけるＭｙｏｄ１のわずかな（約２５％）減少を伴う、同等レベルのＰａｘ７、Ｍｙｆ５、及びＭｙｏｇ発現を示した（図５Ｄ）。最後に、ＡＡＶで形質導入された筋衛星細胞は、ストリンジェントなインビボ移植アッセイを使用して、筋原性幹細胞の特
性を保持していることが確認された。実際、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞は、単離及び損傷前レシピエント筋肉への移植後に生着し、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋線維を生成し（図２Ｃ）、及び層下Ｐａｘ７＋衛星細胞のプールを補充する（図２Ｂ）能力を維持していた。まとめると、これらの結果は、成体動物における筋肉衛星細胞のインビボＡＡＶ形質導入後の主要な筋原性特徴及び衛星細胞機能の保持を確認している。
性を保持していることが確認された。実際、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞は、単離及び損傷前レシピエント筋肉への移植後に生着し、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋筋線維を生成し（図２Ｃ）、及び層下Ｐａｘ７＋衛星細胞のプールを補充する（図２Ｂ）能力を維持していた。まとめると、これらの結果は、成体動物における筋肉衛星細胞のインビボＡＡＶ形質導入後の主要な筋原性特徴及び衛星細胞機能の保持を確認している。
【0113】
衛星細胞コンパートメントに加えて、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞はまた、筋肉常在Ｓｃａ－１＋間葉系前駆体のサブセット（８～４６％の範囲）でも検出され、これらは分化して、異なる血清型のＡＡＶ－Ｃｒｅを注射した動物の筋肉内の脂肪細胞（Ｈｅｔｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）（図５Ｃ、５Ｆ～５Ｇ）、及び筋肉浸潤性造血細胞のサブセット（ＣＤ４５、Ｍａｃ－１及び／またはＴｅｒ１１９を特徴とする）（４～３３％の範囲）を形成し得る（図５Ｃ、５Ｅ）。ＣＭＶプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼをコードするＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の全身投与を評価する別の実験では、同様に、筋肉衛星細胞（６～１３％の範囲）及び筋肉に局在するＳｃａ－１＋前駆体（５～６％の範囲）の形質導入を示し、これは、このインビボ送達システムの再現性を強調している（表Ｓ１）。
【0114】
【表1】
【0115】
最後に、ＡＡＶ－Ｃｒｅを使用して筋肉前駆体を標的とする局所送達法を評価した。これらの研究では、筋肉衛星細胞をトランスジェニックにマークするＰａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ対立遺伝子を保有するｍｄｘ、Ａｉ９動物を使用した（図６Ａ）（Ａｒｐｋｅ ｅｔ
ａｌ．，２０１３、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。血清型１、８、または９を使用した６×１０１１ｖｇ／
マウスのＡＡＶ－Ｃｒｅを、直接筋肉内注射で送達し、全身送達の結果と同様に、ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射の３週間後の骨格筋の分析により、造血系統細胞（図６Ｂ、３３～６２％の範囲）、Ｓｃａ－１＋間葉系前駆体（図６Ｃ、６２～８０％の範囲）、及び衛星細胞（図６Ｄ、１０～２３％の範囲）のかなりの画分においてｔｄＴｏｍａｔｏ発現が明らかになった。ｍｄｘ筋肉でＰａｘ７レポーター対立遺伝子を使用して筋肉衛星細胞をマークするこの遺伝子アプローチは以前に適用されているが（Ｆｉｌａｒｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ対立遺伝子がｍｄｘマウスの一部の筋芽細胞を際立たせ得ることも否定できない。それにもかかわらず、全身ＡＡＶ送達後に得られた結果と合わせて、これらのデータは、複数のＡＡＶ血清型による、ネイティブニッチ内の骨格筋前駆体及び間葉系前駆体へのゲノム修飾酵素の効率的で用量依存的かつ再現性のある形質導入及び送達を実証する。
ａｌ．，２０１３、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。血清型１、８、または９を使用した６×１０１１ｖｇ／
マウスのＡＡＶ－Ｃｒｅを、直接筋肉内注射で送達し、全身送達の結果と同様に、ＡＡＶ－Ｃｒｅの局所注射の３週間後の骨格筋の分析により、造血系統細胞（図６Ｂ、３３～６２％の範囲）、Ｓｃａ－１＋間葉系前駆体（図６Ｃ、６２～８０％の範囲）、及び衛星細胞（図６Ｄ、１０～２３％の範囲）のかなりの画分においてｔｄＴｏｍａｔｏ発現が明らかになった。ｍｄｘ筋肉でＰａｘ７レポーター対立遺伝子を使用して筋肉衛星細胞をマークするこの遺伝子アプローチは以前に適用されているが（Ｆｉｌａｒｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ対立遺伝子がｍｄｘマウスの一部の筋芽細胞を際立たせ得ることも否定できない。それにもかかわらず、全身ＡＡＶ送達後に得られた結果と合わせて、これらのデータは、複数のＡＡＶ血清型による、ネイティブニッチ内の骨格筋前駆体及び間葉系前駆体へのゲノム修飾酵素の効率的で用量依存的かつ再現性のある形質導入及び送達を実証する。
【0116】
他の解剖学的ニッチにおける追加の幹細胞集団が同様に全身ＡＡＶ投与によって標的化され得るか否かを決定するために、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０を静脈内注射されたマウスから採取された骨髄細胞（図３Ａ）も分析した。検出可能なｔｄＴｏｍａｔｏ発現は、免疫表現型で同定された造血幹細胞（ＨＳＣ、Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１＋ｃ－ｋｉｔ＋ＣＤ４８－ＣＤ１５０＋として定義）内で観察された（図３Ｂ～図３Ｃ、範囲３～３８％）。これらの結果は、尾静脈または後眼窩洞のいずれかを通じた静脈内送達を使用して再現可能であり（図３Ｃ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９－Ｃｒｅを使用してＣＭＶ駆動Ｃｒｅを注射した別の実験で再現可能であった（表Ｓ１）。骨格筋衛星細胞での結果と同様に、骨髄ＨＳＣを、ウイルス力価と大まかに相関する効率で複数のＡＡＶ血清型によって形質導入及び修飾した（図３Ｃ）。
【0117】
ＨＳＣに加えて、全身送達されたＡＡＶ－Ｃｒｅによる骨髄中のより方向付けられた造血前駆体の標的化を調査した。ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光は、一般的な骨髄前駆体（ＣＭＰ、Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃγＲ低、４～２６％の範囲）、顆粒球単球前駆体（ＧＭＰ、Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＦｃγＲ＋、５～１７％の範囲）、及び巨核球赤血球前駆体（ＭＥＰ、Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ３４－ＦｃγＲ－、２．５～１２％の範囲）を含む骨髄前駆体の複数のサブセットで検出された（図７Ｂ、図７Ｆ～７Ｈ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、ＥｒｙＡ細胞（好塩基性赤芽球、Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１＋ＦＳＣ高、２３～７４％の範囲）、ＥｒｙＢ細胞（後期好塩基性及び多色性赤芽球、Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１＋ＦＳＣ低、９～２０％の範囲）及びＥｒｙＣ細胞のごく一部（オルソクロマチック赤芽球及び網状赤血球、Ｔｅｒ１１９＋ＣＤ７１－ＦＳＣ低、０．８～２．５％の範囲）を含む系統を方向付けられた赤血球前駆体からも検出された（図７Ａ、７Ｃ～７Ｅ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋系統が制限された造血前駆体の検出によって、これらの細胞がＡＡＶ－Ｃｒｅによって直接形質導入されたことか、またはＡＡＶ注射後１４日以内により上流の前駆細胞から生じたことが示唆される。
【0118】
免疫表現型検査によって検出された、インビボで形質導入されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣが、幹細胞の生着、自己複製、及び分化の能力を保持しているか否かを判断するために、ＡＡＶ－Ｃｒｅによって形質導入されたＨＳＣの長期再構成機能を評価するための厳密な一次及び二次移植アッセイを利用した。手短に言えば、Ｌｉｎ低ｔｄＴｏｍａｔｏ＋骨髄細胞を、ＣＤ４５．２アロタイプを発現するＡＡＶ－Ｃｒｅ注射Ａｉ９マウスからＦＡＣＳによって単離し、致死的に照射されたコンジェニックＣＤ４５．１＋レシピエントに移植した（図３Ａ）。末梢血キメラ現象の毎月の評価によって、全ての一次移植レシピエントの間で高レベルのドナー（ＣＤ４５．２＋）細胞生着が明らかになった（図３Ｄ）。さらに、全てのレシピエントは、移植後１６週間で、複数の造血系統におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＣＤ４５．２＋ドナー由来末梢血細胞の永続的な寄与を示した（図３Ｅ～Ｉ）。骨髄におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現の分析によって、分析された４６匹のレシピエント
マウスのうち４５匹においてドナー由来のＣＤ４５．２＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣの存在がさらに明らかになった（図３Ｊ）。移植されたレシピエントにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５．２＋ドナー由来の末梢血細胞及びＨＳＣの検出は、細胞純度よりも細胞収量を最大化するために、二重ではなく単回の選別の能力を反映している可能性が高い（図３Ｆ～Ｊ）。
マウスのうち４５匹においてドナー由来のＣＤ４５．２＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣの存在がさらに明らかになった（図３Ｊ）。移植されたレシピエントにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５．２＋ドナー由来の末梢血細胞及びＨＳＣの検出は、細胞純度よりも細胞収量を最大化するために、二重ではなく単回の選別の能力を反映している可能性が高い（図３Ｆ～Ｊ）。
【0119】
次に、以前に生着された一次レシピエントマウスのサブセット（図３Ａ）からの骨髄細胞の二次移植を行った。二次レシピエント内のドナーキメラ現象レベルの分析によって、末梢血細胞の間で約２０～８０％の範囲が明らかになった（図４Ａ）。これらの二次レシピエントのうち、大多数は、移植後１６週間でｔｄＴｏｍａｔｏ＋ドナー細胞による多系統生着を示した（図４Ｂ～図４Ｆ）。さらに、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ドナー由来のＨＳＣが、移植後４～５か月の二次レシピエントの骨髄で検出され（図４Ｇ）、ＡＡＶ－Ｃｒｅが、長命のオリゴリネージ前駆体ではなく、最初に注射された動物内で長期再構成ＨＳＣを実際に形質導入したという機能的証拠を提供する。（Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。複数のＡＡＶ注射動物の骨髄で検出された、ＡＡＶ血清型１、２、５、６、８、９、１０及びＡｎｃ８０の局所注射後のＨＳＣの形質導入であって、免疫表現型で（図８Ａ～８Ｂ、表Ｓ２）及び機能的に（図８Ｃ～８Ｆ）定義されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＨＳＣも評価した。
【0120】
表Ｓ２。
【0121】
【表2】
【0122】
まとめると、これらのデータによって、配列特異的ＤＮＡ修飾酵素をコードする任意の多数のＡＡＶ血清型の局所または全身注射が、最も原始的で長期の再構成ＨＳＣを含む内因性骨髄幹細胞及び前駆細胞の複数のサブセットの形質導入を可能にし得るという強力な証拠が提供される。この戦略によって、移植アッセイでアッセイされたように、ネイティ
ブニッチ内に存在する長期の再構成ＨＳＣの複数回の造血再生全体を通じて維持される不可逆的なゲノム修飾が可能になる。
ブニッチ内に存在する長期の再構成ＨＳＣの複数回の造血再生全体を通じて維持される不可逆的なゲノム修飾が可能になる。
【0123】
最後に、骨格筋と造血組織以外に分析を拡張するために、高用量のＡＡＶ８－Ｃｒｅを注射した動物のサブセットから皮膚組織を収集し、ＡＡＶの全身送達がこの明確に定義された解剖学的コンパートメント内の個別の前駆細胞集団を形質導入し得るか否かを評価した。骨髄分析から予想されるように、皮膚に局在する造血細胞内のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光（ＣＤ４５＋、７～２２％の範囲、図９Ａ～９Ｂ、９Ｈ）が観察され、ＣＤ１４０ａ発現（Ｐｄｇｆｒａとしても知られている）を特徴として皮膚線維芽細胞（図９Ｃ）でも観察された（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。フローサイトメトリーを使用して、評価されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現を、ＣＤ２４とＳｃａ－１の組み合わせ発現によって区別可能な、ＣＤ４５－ＣＤ１４０ａ＋皮膚線維芽細胞の４つの集団内でさらに評価した（図９Ａ）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光は、脂肪細胞前駆体（ＣＤ２４＋Ｓｃａ－１＋、８～２６％の範囲、図９Ｅ、９Ｈ）、真皮乳頭細胞（ＣＤ２４－Ｓｃａ－１－、１３～２０％の範囲、図９Ｆ、９Ｈ）、及び皮膚線維芽細胞の２つの集団（ＣＤ２４＋Ｓｃａ－１－、２～４％の範囲、及びＣＤ２４－Ｓｃａ－１＋、１６～２７％の範囲、図９Ｄ、９Ｇ、及び９Ｈ）を含むこれらの真皮サブセットのそれぞれで検出された。したがって、全身投与されたＡＡＶは、表皮の恒常性及び再生をサポートする真皮脂肪及び結合組織の前駆体を含む、哺乳類の皮膚の複数の免疫表現型が異なる細胞集団を標的とする（Ｄｒｉｓｋｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４で概説）。上記の骨格筋及び骨髄細胞集団の分析と一致して、これらのデータは、複数の異なる成体細胞系統及び解剖学的に異なる組織区画内で直接ゲノム修飾を達成するための全身ＡＡＶ投与の幅広い有用性を示す。
【0124】
考察
【0125】
本研究では、インビボでの組織幹細胞集団内の永久的なゲノム修飾を可能にするためのＡＡＶによるＤＮＡ修飾酵素の効率的な送達を立証した。この高度にプログラム可能なアプローチによって、３つの異なる解剖学的ニッチ（骨格筋、皮膚、及び骨髄）の幹／前駆細胞の４つの異なる系統（筋原性、造血、線維／脂肪生成、及び骨形成）における有効性を実証し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのシステム（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）及び他の器官系及び種における追加の幹／前駆体集団を含む他のＤＮＡ修飾酵素に対して一般化可能である可能性が高い。
【0126】
このアプローチの明確な利点は、細胞の単離、培養、またはその後の移植を必要とせずに、インサイチュで幹細胞ゲノムを操作できることであり、これによって、ネイティブの調節相互作用及び現存する幹細胞の特性が維持される。このシステムはまた、エクスビボ幹細胞の修飾ならびにその後の移植に関連する課題及び毒性、例えば、インビトロ条件で堅牢な幹細胞機能を維持できないこと、アブレーションコンディショニングの必要な使用、及び移植片の失敗の避けられないリスクを軽減する（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＤＮＡ修飾酵素で内因性組織幹細胞を直接形質導入する機会は、幹細胞における治療的遺伝子編集を目的とした現在進行中の学術的及び商業的取り組みに直接かつ特定の関連性があると予想され、その全てが、これまで、エクスビボでの修飾及び再注入のために幹細胞を精製する必要性があると考えている（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0127】
この研究の重要な発見は、ＡＡＶがインビボで複数の成体組織幹細胞及び前駆細胞型を効率的に形質導入し得るということである。これらの結果は、ＡＡＶが局所または全身投与後の成体動物の骨格筋衛星細胞を効果的に形質導入しないと結論付けた以前の報告とある程度対照的である（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ
ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，２０１７、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの以前の研究の１つ（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）では、ＣＭＶ駆動のｅＧＦＰをコードするＡＡＶ６を４週齢のマウスに全身投与しても、注射の４週間後、検出可能なＰａｘ７＋／ｅＧＦＰ＋衛星細胞は得られなかった。一方、ＣＭＶ－ｅＧＦＰをコードするＡＡＶ６またはＡＡＶ９を８週齢のマウスに筋肉内投与すると、注射後２週間でＰａｘ７＋／ｅＧＦＰ＋衛星細胞が検出されなかったが、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを同様に投与したところ、ｅＧＦＰを発現する衛星細胞コンパートメントはわずかとなった（＜５％）（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ，２０１４）。これらの不一致の１つの可能性として考えられる説明は、この研究では、一過性の発現を示し得るＡＡＶゲノムによってコードされる、導入されたｅＧＦＰタンパク質の発現を監視するのではなく、より感度の高いＣｒｅ／ｌｏｘ駆動システムを利用して、ＡＡＶ形質導入細胞及びその子孫におけるマウスゲノムからｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を確実に駆動したことであり得る。最終的に、これらの結果によって、ＡＡＶが治療用遺伝子編集に必要な効率で衛星細胞を形質導入し得ることが実証される。注目すべきことに、ＡＡＶ形質導入後に細胞が恒久的に修飾されるこのアプローチは、骨髄局在ＨＳＣを含む非筋原性幹細胞及び前駆細胞へのＡＡＶカーゴの送達の検出も可能にした。健康なヒトＣＤ３４＋造血細胞（ＡＡＶＨＳＣと呼ばれる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４））における天然に存在するクレードＦ ＡＡＶバリアントの近年の検出は、このような細胞を形質導入し得るＡＡＶの存在を示唆しているが、この報告書では、組換えＡＡＶベクターによるこれらの細胞の効率的なインビボ形質導入が実証され、免疫表現型検査及び移植アッセイを使用して、形質導入後のＨＳＣ機能の保存が確認される。それでも、将来の研究では、ＡＡＶ形質導入が幹細胞集団内のグローバルな遺伝子発現レベルに何らかの影響を与えるか否か、及びＡＡＶが組織幹細胞の特定のサブセットを他のサブセットよりも優先的に形質導入するか否かを調査することが重要である。
ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，２０１７、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの以前の研究の１つ（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）では、ＣＭＶ駆動のｅＧＦＰをコードするＡＡＶ６を４週齢のマウスに全身投与しても、注射の４週間後、検出可能なＰａｘ７＋／ｅＧＦＰ＋衛星細胞は得られなかった。一方、ＣＭＶ－ｅＧＦＰをコードするＡＡＶ６またはＡＡＶ９を８週齢のマウスに筋肉内投与すると、注射後２週間でＰａｘ７＋／ｅＧＦＰ＋衛星細胞が検出されなかったが、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを同様に投与したところ、ｅＧＦＰを発現する衛星細胞コンパートメントはわずかとなった（＜５％）（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ，２０１４）。これらの不一致の１つの可能性として考えられる説明は、この研究では、一過性の発現を示し得るＡＡＶゲノムによってコードされる、導入されたｅＧＦＰタンパク質の発現を監視するのではなく、より感度の高いＣｒｅ／ｌｏｘ駆動システムを利用して、ＡＡＶ形質導入細胞及びその子孫におけるマウスゲノムからｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を確実に駆動したことであり得る。最終的に、これらの結果によって、ＡＡＶが治療用遺伝子編集に必要な効率で衛星細胞を形質導入し得ることが実証される。注目すべきことに、ＡＡＶ形質導入後に細胞が恒久的に修飾されるこのアプローチは、骨髄局在ＨＳＣを含む非筋原性幹細胞及び前駆細胞へのＡＡＶカーゴの送達の検出も可能にした。健康なヒトＣＤ３４＋造血細胞（ＡＡＶＨＳＣと呼ばれる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４））における天然に存在するクレードＦ ＡＡＶバリアントの近年の検出は、このような細胞を形質導入し得るＡＡＶの存在を示唆しているが、この報告書では、組換えＡＡＶベクターによるこれらの細胞の効率的なインビボ形質導入が実証され、免疫表現型検査及び移植アッセイを使用して、形質導入後のＨＳＣ機能の保存が確認される。それでも、将来の研究では、ＡＡＶ形質導入が幹細胞集団内のグローバルな遺伝子発現レベルに何らかの影響を与えるか否か、及びＡＡＶが組織幹細胞の特定のサブセットを他のサブセットよりも優先的に形質導入するか否かを調査することが重要である。
【0128】
筋肉衛星細胞及びＨＳＣを標的とすることに加えて、ＡＡＶがインビボで間葉系前駆細胞を形質導入するというこれらの発見は、この細胞集団にとって重要な潜在的用途を持っている。間葉系前駆体は、筋形成の十分に確立された調節因子であり（Ｊｏｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、老化及び筋肉疾患における線維症及び脂肪沈着の主要な原因に相当する（Ｊｏｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｌｏｕｎｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｕｅｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｕｅｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、これらの細胞は、抗線維化介入に関して、またはそれらの筋原性活性を促進する操作に関しての潜在的な標的である。さらに、増殖、分化、または筋肉の栄養サポートにおける役割の調節因子を含む、これらの細胞の作用を支配する機構については現在ほとんど知られていないため、この細胞集団を標的とすることは、そのような機構を明らかにするのに、ならびに筋肉の維持及び再生の理解を進めるために、役立つ可能性があると予想される。これは次に、これらの細胞の有害な影響を軽減し、それらの筋原性活性を促進する治療的介入につながる可能性がある。そのような目的のためにこれらの細胞の遺伝子発現を操作するためにＣｒｅモデルを利用した多数の研究を考えると（Ｈｅｒｅｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｋｏｐｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｌｅｅｓ－Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、このシステムは、遺伝子操作のための代替の、場合によってはより簡単なシステムを提供すると予想される。
【0129】
ここで説明するインビボのＡＡＶシステムは、幹細胞機能を調べるための現在の実験システムに関連する重要な技術的及び実用的な制限を克服する。特に、一般的に採用されているトランスジェニック及び遺伝子ノックアウトベースのモデルは、複数の対立遺伝子を導入するために複雑な育種スキームを必要とすることが多く、時間及びリソースの両方に多大な投資を必要とする。このようなアプローチは、高齢の動物、非標準的な遺伝的背景、または組み合わせの方法で遺伝子標的化効果を評価する場合、さらに困難になる。対照
的に、プログラム可能なＤＮＡ修飾酵素のＡＡＶ媒介送達は、広範な動物の年齢及び系統にわたって、そして様々な個々の及び多重化された遺伝子座に適用され得る。さらに、ここで利用されるＡＡＶ－Ｃｒｅ戦略は、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ－（ＣｒｅＥＲ）依存性遺伝子活性化／不活性化戦略への代替の補完的なアプローチを提供し、さらに研究者がホルモン投与の潜在的な交絡効果を回避し得るようにする（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。したがって、この技術は、遺伝子の機能及び相互作用をインビボで及び組織前駆体で調べることができるペースを加速する上で、重要な用途を有する可能性が高い。本明細書に示される結果はまた、複数のＡＡＶ血清型が組織幹細胞及び前駆細胞に対して向性を示し、これによって特定の幹細胞集団を形質導入するＡＡＶカプシドバリアントの同定、及びＡＡＶにコードされた遺伝子の発現をこれらの細胞型のみに制限する天然に存在するかもしくは合成の遺伝子調節エレメントの同定を含む、より特異的かつ選択的なシステムの将来の開発の基盤を確立する。最終的に、このシステムは、幹細胞の表現型に特異的に影響を与えると疑われる候補及び未知の遺伝子標的の迅速かつ直接的なインビボスクリーニングを可能にするように適合され得る。
的に、プログラム可能なＤＮＡ修飾酵素のＡＡＶ媒介送達は、広範な動物の年齢及び系統にわたって、そして様々な個々の及び多重化された遺伝子座に適用され得る。さらに、ここで利用されるＡＡＶ－Ｃｒｅ戦略は、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ－（ＣｒｅＥＲ）依存性遺伝子活性化／不活性化戦略への代替の補完的なアプローチを提供し、さらに研究者がホルモン投与の潜在的な交絡効果を回避し得るようにする（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。したがって、この技術は、遺伝子の機能及び相互作用をインビボで及び組織前駆体で調べることができるペースを加速する上で、重要な用途を有する可能性が高い。本明細書に示される結果はまた、複数のＡＡＶ血清型が組織幹細胞及び前駆細胞に対して向性を示し、これによって特定の幹細胞集団を形質導入するＡＡＶカプシドバリアントの同定、及びＡＡＶにコードされた遺伝子の発現をこれらの細胞型のみに制限する天然に存在するかもしくは合成の遺伝子調節エレメントの同定を含む、より特異的かつ選択的なシステムの将来の開発の基盤を確立する。最終的に、このシステムは、幹細胞の表現型に特異的に影響を与えると疑われる候補及び未知の遺伝子標的の迅速かつ直接的なインビボスクリーニングを可能にするように適合され得る。
【0130】
ＳＴＡＲ方法
【0131】
【表3】
【0132】
実験モデル及び主題の詳細
【0133】
マウス
【0134】
マウスは、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ハーバード大学）／Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ファカルティーオブアーツアンドサイエンスバイオロジカルリサーチインフラストラクチャー）の動物施設に収容され、この施設は、実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）（ＡＡＬＡＣ）によって認定されている。全ての手順は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたプロトコールのもとで行った。マウスは、ケージあたり最大５匹の密度で標準的な換気ラックに収容された。室温は２２℃±１℃、湿度３０～７０％に維持された。マウスを１２時間の明／暗サイクルで飼育し、餌及び水は自由に与えた。ブリーダーマウスは、照射されたＰｉｃｏＬａｂＭｏｕｓｅ Ｄｉｅｔ ２０ ５０５８（ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で飼育し、非ブリーダーマウスは、照射されたＬａｂＤｉｅｔ Ｐｒｏｌａｂ Ｉｓｏｐｒｏ ＲＭＨ ３０００ ５Ｐ７５（ＬａｂＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で飼育した。ケージには、１／４インチのＡｎｄｅｒｓｏｎ’ｓ Ｂｅｄ ｏ Ｃｏｂ ｂｅｄｄｉｎｇ（Ｔｈｅ Ａｎｄｅｒｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ）を充填し、それぞれに１つのネストレット（２×２インチ四方の圧縮綿、Ａｎｃａｒｅ，Ｂｅｌｌｍｏｒｅ，ＮＹ）及び１つの赤いマウスの小屋（認定ポリカーボネート、３ ３／４インチ幅×１ ７／８インチ高×３インチ長、ＢｉｏＳｅｒｖ，Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）を備えた。ケージの交換は、少なくとも１４日ごとに、必要に応じてより頻繁に実行した。動物の健康サーベイランスは、インデックス動物のＰＣＲ試験及びラックプレナムからの綿棒を通して四半期ごとに実施した。
【0135】
Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪバックグラウンド）、Ｂ６、１２９Ｓ６－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ａｉ９、Ｂ６／１２９Ｓ６バックグラウンド）、Ｂ６．ＳＪＬ－ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ）１Ｋｙｂａ／Ｊ（Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統をこの研究に使用した。ｍｄｘ、Ａｉ９ホモ接合マウスを生成するには、ｍｄｘマウスを、Ａｉ９ホモ接合マウスと交配させた。ｍｄｘ、Ａｉ９マウスを、Ｐａｘ７－Ｚｓｇｒｅｅｎ マウスと交配させて、ｍｄｘ、Ａｉ９、Ｐａｘ７－Ｚｓｇｒｅｅｎ動物を生成した。Ｐａｘ７－ｚｓＧｒｅｅｎ対立遺伝子は、フローサイトメトリーによって骨格筋衛星細胞をマークするための複数の研究で広く検証されている（Ａｒｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。動物は、実験群と対照群にランダムに割り当てた。実験に使用された全てのマウスは免疫能力があった。
【0136】
大腿骨内注射実験では、６～９か月齢の雄性及び雌性のＡｉ９ホモ接合動物に、ＡＡＶ－Ｃｒｅまたはビヒクルを注射した。注射の６週間後、マウスを安楽死させ、造血細胞をフローサイトメトリー分析及びＦＡＣＳのために単離した。全身注射実験の場合、６週齢の雄性のｍｄｘ、Ａｉ９ホモ接合マウスに、ＡＡＶ－Ｃｒｅまたはビヒクルを、尾静脈または後眼窩の注射を介して注射した。注射の２週間後、マウスを採取し、肝臓、骨格筋、及び造血細胞を分析のために収集した。熟練したマウス病理学者（Ｒ．Ｂｒｏｎｓｏｎ）によって盲検法で実施された、ＡＡＶ－Ｃｒｅ及び対照注射動物のサブセットからの肝臓組織のヘマトキシリン及びエオシン染色切片の組織病理学的評価は、組織病理学の兆候を明らかにしなかった（図１０Ｂ）。
【0137】
造血細胞移植実験では、ホモ接合型ＣＤ４５．１マウスの骨髄細胞を採取し、Ｓｃａ－１を枯渇させてヘルパー骨髄に使用した。ホモ接合性ＣＤ４５．１マウスを、一次及び二次造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）移植のレシピエントとして使用した。ＨＳＰＣ移植後、レシピエント動物を、移植後４週間、０．６７ｍｇ／ｍＬのスルファジアジントリメトプリムを含む抗生物質水で飼育した。
【0138】
方法の詳細
【0139】
ＡＡＶの選択及び生産
【0140】
複数のＡＡＶ血清型を使用し、特に広範な生体内分布を伴う血清型に重点を置いた（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。大腿骨内注射実験では、７つのＡＡＶ血清型（１、２、５、６、８、９、及び１０）のパネルを評価し、ＨＳＣを最も効率的に標的化したものを特定した。筋肉内注射実験には、３つのＡＡＶ血清型（１、８、９）のより小さなパネルを使用した。本発明者らは、全身注射実験ではＡＡＶ１では先に進まなかった。この理由は、他のＡＡＶ血清型よりも大きな炎症反応を誘発することが公知であり（Ｌｕ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，２００９）、前臨床試験においても、疾患モデリングの適用でも有用性が制限され得るためである。全身注射実験のために使用されるＡＡＶ血清型の選択は、ＡＡＶ９がインビボで効果的に筋衛星細胞を形質導入することを示している本発明者らの以前の研究に基づいていた（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。予備分析（表Ｓ１）では、尾静脈注射によりＡＡＶ９を、さらに２つの血清型ＡＡＶ６及びＡＡＶ８（両方とも、インビボ送達後に骨格筋を標的とすることが示されている）とも投与した（Ｂｌａｎｋｉｎｓｈｉｐ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これらの結果に基づいて、次に本発明者らは、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の全身尾静脈投与を行い、また骨格筋または他の臓器に対して強い向性を持つ祖先のＡＡＶであるＡｎｃ８０Ｌ６５も含み（Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ＣＭＶプロモーター及びキメライントロンの下流のＣｒｅリコンビナーゼを発現させた。後眼窩の全身ＡＡＶ投与については、本発明者らは、特にＡｎｃ８０及びＡＡＶ８に焦点を当て、これらは両方とも、尾静脈注射実験で血液幹細胞と筋肉幹細胞に対してより高い標的化効率を示した。さらに、より高濃度のＡＡＶを注入すると、形質導入効率が向上するか否かを評価するために、ＡＡＶ８を２回投与した。
【0141】
ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡｎｃ８０Ｌ６５を使用した全身注射実験では、前述のように、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スケペンス眼研究所）及びＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ（マサチューセッツ眼・耳病院）（ＳＥＲ／ＭＥＥＩ）のＧｒｏｕｓｂｅｃｋ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ＧＴＶＣ）によってＡＡＶの生成を行った（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡＡＶ血清型１、２、５、６、８、９、及び１０を使用した大腿骨内注射実験では、ＡＡＶはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ペンシルベニア大学ペンベクターコア）で生成した。ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を使用した全身注射実験では、ＡＡＶの生成はＵＭＡＳＳ医大のベクターコアによって行われた。
【0142】
筋幹細胞の単離及びインビトロ分化
【0143】
ＡＡＶ－Ｃｒｅを全身注射したｍｄｘ、Ａｉ９マウスからの筋幹細胞の単離は、以前に記載されたように実施した（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。手短に言えば、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋、上腕三頭
筋、大腿四頭筋、及び腹筋をコラゲナーゼ及びディスパーゼで消化し、筋線維関連細胞を遠心分離によって単離した。細胞を、抗体ミックス（ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ１１ｂ（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＴＥＲｌ１９（１：２００）、ＡＰＣ抗Ｓｃａ－１（１：２００）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ２９（β１－インテグリン）（１：１００）、ビオチン抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）（１：１００））を用いて氷上で３０分間染色し、続いてストレプトアビジン－ＰＥ－Ｃｙ７（１：１００）を用いて氷上で１５分間で二次染色した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びカルセインブルーを使用して、それぞれ死細胞と生細胞を識別した。ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）－Ｔｅｒ１１９－Ｓｃａ－１－β１インテグリン＋ＣＸＣＲ４＋細胞は、筋衛星細胞としてＦＡＣＳによって単離した。Ｓｃａ－１＋、ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ－Ｔｅｒ１１９－細胞は、間葉系前駆体として単離した。系統（ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９）＋細胞を、分析のためにＬｉｎ＋血液細胞としてゲーティングした。ＡＡＶ形質導入筋肉から単離された衛星細胞のインビトロ増殖のために、衛星細胞を、２０％ドナーウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び１％グルタマックスを含むＦ１０中でコラーゲン／ラミニンコーティングプレートに播種した。５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを毎日培地に添加した。培地は１日おきに更新した。５日後、衛星細胞を回収し、細胞数をカウントし、分化のために細胞を９６ウェルプレートの複数のウェルに再プレートした。翌日、培地を２％ドナーウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭに交換した。筋管は、分化培地で６０時間または７２時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定した。
筋、大腿四頭筋、及び腹筋をコラゲナーゼ及びディスパーゼで消化し、筋線維関連細胞を遠心分離によって単離した。細胞を、抗体ミックス（ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ１１ｂ（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＴＥＲｌ１９（１：２００）、ＡＰＣ抗Ｓｃａ－１（１：２００）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ２９（β１－インテグリン）（１：１００）、ビオチン抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）（１：１００））を用いて氷上で３０分間染色し、続いてストレプトアビジン－ＰＥ－Ｃｙ７（１：１００）を用いて氷上で１５分間で二次染色した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びカルセインブルーを使用して、それぞれ死細胞と生細胞を識別した。ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）－Ｔｅｒ１１９－Ｓｃａ－１－β１インテグリン＋ＣＸＣＲ４＋細胞は、筋衛星細胞としてＦＡＣＳによって単離した。Ｓｃａ－１＋、ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ－Ｔｅｒ１１９－細胞は、間葉系前駆体として単離した。系統（ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９）＋細胞を、分析のためにＬｉｎ＋血液細胞としてゲーティングした。ＡＡＶ形質導入筋肉から単離された衛星細胞のインビトロ増殖のために、衛星細胞を、２０％ドナーウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び１％グルタマックスを含むＦ１０中でコラーゲン／ラミニンコーティングプレートに播種した。５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを毎日培地に添加した。培地は１日おきに更新した。５日後、衛星細胞を回収し、細胞数をカウントし、分化のために細胞を９６ウェルプレートの複数のウェルに再プレートした。翌日、培地を２％ドナーウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭに交換した。筋管は、分化培地で６０時間または７２時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【0144】
ｍｄｘ、Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ＋／－、Ａｉ９マウスのＡＡＶ－Ｃｒｅ注射ＴＡ筋肉からの筋幹細胞の単離は、以前に記載されたように実施された（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。簡単に説明すると、個々のＴＡ筋肉を、はさみを使用して別々に細かく切り刻み、その後コラゲナーゼ及びディスパーゼでの２つの消化ステップを続けた。筋肉は消化ステップの間と後に粉砕された。ホモジネートを遠心分離し、再懸濁し、ろ過してから、次の回の遠心分離及び再懸濁を行った。細胞は、ＡＰＣ抗Ｓｃａ－１（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）（１：２００）、及びＡＰＣ－Ｃｙ７抗Ｔｅｒ１１９（１：２００）の抗体混合物で染色した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びカルセインブルーを使用して、それぞれ死細胞と生細胞を識別した。ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）－Ｔｅｒ１１９－Ｓｃａ－１－Ｐａｘ７－ＺｓＧｒｅｅｎ＋細胞は筋肉衛星細胞として単離した。このトランスジェニック系統は、フローサイトメトリーによる衛星細胞同定の問題に特に取り組んだ本発明者らの研究室からの研究を含む（Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、筋肉衛星細胞の同定及び単離のための複数の研究で以前に使用されており、複数のグループによって広範な検証研究が行われている（Ａｒｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｍａｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0145】
筋肉Ｓｃａ－１＋前駆体の単離及び脂肪生成分化
【0146】
ＡＡＶ－Ｃｒｅを全身に注射したｍｄｘ、Ａｉ９マウス由来のＳｃａ－１＋前駆体（Ｓｃａ－１＋，ＣＤ４５－ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）－Ｔｅｒ１１９－）単離物を以前に記載のように行った（Ｈｅｔｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡単に説明すると、新たに選別したＳｃａ－１＋細胞を、コラーゲン／ラミニンでコーティングした９６ウェルプレートにプレートし、増殖培地（２０％ドナーウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び１％グルタマックスを含むＦ１０）中で８日間増殖させて、毎日５ｎｇのｂＦＧＦを提供し、新鮮な培地を１日おきに交換した。増殖培地で８日後、細胞を脂肪生成誘導培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭデキサメタゾン、１００ｎＭインスリン、１ｍＭロシグリタゾン及び０．５ｍＭの３－イソブチル－１－メチルキ
サンチンを含むＤＭＥＭ）に２日間切り替え、その後、脂肪生成分化培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１００ｎＭインスリンを含むＤＭＥＭ）にさらに８日間切り替えた。培地は１日おきに交換し、細胞は、製造業者の指示に従ってＢＯＤＩＰＹ（商標）４９３／５０３で染色した。
サンチンを含むＤＭＥＭ）に２日間切り替え、その後、脂肪生成分化培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１００ｎＭインスリンを含むＤＭＥＭ）にさらに８日間切り替えた。培地は１日おきに交換し、細胞は、製造業者の指示に従ってＢＯＤＩＰＹ（商標）４９３／５０３で染色した。
【0147】
筋肉衛星細胞移植
【0148】
移植の１日前に、Ｎａｊａ ｐａｌｌｉｄａ由来の１０μＭ心臓毒素ガンマ２５μＬを、麻酔をかけた７～８週齢の雄性ｍｄｘレシピエントマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。最大５０，０００個の単回選別のｔｄＴｏｍａｔｏ＋衛星細胞またはビヒクル（染色媒体）のみを、損傷前の前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。注射したＴＡ筋を、凍結切片化及び蛍光検出のために移植の３週間後に採取した。
【0149】
免疫蛍光
【0150】
インビトロで分化した筋管のミオシン重鎖（ＭＨＣ）染色では、筋管を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して室温で１５分間透過処理し、ＤＰＢＳで２×５分間洗浄し、５％正常ヤギ血清２％ＢＳＡ、２％タンパク質濃縮物（Ｍ．Ｏ．Ｍ．（商標）Ｂａｓｉｃ ｋｉｔ）、及び０．１％ｔｗｅｅｎ－２０を用いて室温で１時間ブロックした。細胞をＤＰＢＳで２×５分間洗浄し、抗骨格ミオシンＩＩ型（速い単収縮）（１：２００）及び抗骨格ミオシンＩ型（遅い単収縮）（１：１００）と４℃で一晩インキュベートし、ＤＰＢＳで３×５分間洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ－４８８コンジュゲート二次抗体（１：２５０）とインキュベートした。ＤＰＢＳで３×５分間洗浄した後、細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔで染色した。
【0151】
骨格筋組織の染色のために、前脛骨（ＴＡ）筋を切開し、すぐに１％ＰＦＡで室温で１時間固定し、ＤＰＢＳで洗浄し、３０％スクロースで４℃で一晩凍結保存した。次に、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物に包埋し、過冷却イソペンタンで凍結保存し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８６０クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片化した。切片を２％ＰＦＡで５分間、後固定し、０．１Ｍグリシン緩衝液で５分間インキュベートし、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＤＰＢＳで２０分間透過処理した。切片は１０％のＭ．Ｏ．Ｍ．のＩｇＧブロッキング試薬でブロックし、さらに１％のＭ．Ｏ．Ｍ．のＩｇＧブロッキング試薬、３％のＢＳＡ、８％のＭ．Ｏ．Ｍ．タンパク質濃縮物、及び５％の正常ヤギ血清でブロックした。一次抗体染色は、抗Ｐａｘ７（１５μｇ／ｍＬ）及びウサギ抗ラミニン（１：２００）を使用して４℃で一晩行った。翌日、切片を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：２５０）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１：２５０）で染色した。スライドには、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ＨａｒｄＳｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍをのせ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０倒立共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャした。免疫蛍光分析によるＰａｘ７＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋層下細胞（ｓｕｂｌａｍｉｎａｒ ｃｅｌｌ）の定量のために、６０～８０のＰａｘ７＋層下細胞を、動物１匹あたり１０ ０．１８１ｍｍ２の視野で定量した。
【0152】
皮膚組織の染色のために、背部皮膚試料を室温で４％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、ＰＢＳで十分に洗浄し、４℃で一晩３０％スクロースに浸し、Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）に包埋した。３０μＭの切片を１～２時間ブロックし（５％ロバ血清、１％ＢＳＡ、２％冷水魚ゼラチンを含む０．３％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ）、抗ＣＤ１４０ａ（１：２００）及び抗ＲＦＰ（１：１０００）抗体を、４℃で一晩、インキュベートし、ロバ抗ヤギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（１：４００）またはロバ抗ウサギＣｙ３（１：４００）二次抗体と室温で２～４時間インキュベートした。対比染色にはＤＡＰ
Ｉを使用した。
Ｉを使用した。
【0153】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲ
【0154】
衛星細胞を直接Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳに選別し、－８０℃で保存した。全ＲＮを製造元の指示に従って単離した。ｅｚＤＮａｓｅ酵素キットを含むＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ
ＶＩＬＯマスターミックスを使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムで実行した。下記のＴａｑＭａｎアッセイを、相対的な遺伝子発現を評価するために使用した：Ｐａｘ７（Ｍｍ０１３５４４８４＿ｍ１）、Ｍｙｆ５（Ｍｍ００４３５１２５＿ｍ１）、Ｍｙｏｄ１（Ｍｍ００４４０３８７＿ｍ１）、Ｍｙｏｇ（Ｍｍ００４４６１９４＿ｍ１）及びＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）。
ＶＩＬＯマスターミックスを使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムで実行した。下記のＴａｑＭａｎアッセイを、相対的な遺伝子発現を評価するために使用した：Ｐａｘ７（Ｍｍ０１３５４４８４＿ｍ１）、Ｍｙｆ５（Ｍｍ００４３５１２５＿ｍ１）、Ｍｙｏｄ１（Ｍｍ００４４０３８７＿ｍ１）、Ｍｙｏｇ（Ｍｍ００４４６１９４＿ｍ１）及びＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）。
【0155】
ＨＳＰＣ単離及びフローサイトメトリー分析／ＦＡＣＳ
【0156】
骨髄細胞を２１ゲージの針で４つの長骨全て（２つの大腿骨及び２つの脛骨）から染色培地（２％ＦＢＳを含むＨＢＳＳ）に洗い流し、再懸濁し、４０μｍのセルストレーナーでろ過した。細胞をペレット化し、氷上で５分間ＡＣＫ溶解し（赤芽球前駆細胞を分析する場合を除く）、４０μｍストレーナーで再ろ過し、染色培地で洗浄した。
【0157】
ＡＡＶを注射したマウスからＨＳＣを同定するために、細胞を以下の抗体で氷上で４５分間染色した：ＣＤ３－ｅｆ４５０またはＣＤ３－ビオチン（１：１００）、Ｂ２２０－ｅｆ４５０またはＢ２２０－ビオチン（１：２００）、Ｔｅｒ１１９－ｅｆ４０またはＴｅｒ１１９－ビオチン（１：１００）、Ｇｒ－１－ｅｆ４５０またはＧｒ－１－ビオチン（１：４００）、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣＣｙ７（１：２００）、ｃ－Ｋｉｔ－ＡＰＣ（１：２００）、Ｓｃａ－１－ＰＥＣｙ７（１：２００）、ＣＤ４８－ＦＩＴＣ（１：２００）、及びＣＤ１５０－ＢＶ５１０（１：５０）。ビオチン化抗体を使用した場合、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン－ｅｆ４５０（１：２００）とともに氷上で３０分間インキュベートした。
【0158】
移植されたマウスからＨＳＣを同定するために、細胞を氷上で４５分間、以下の抗体で染色した：Ｌｉｎｅａｇｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（１：２０）、ｃ－Ｋｉｔ－ＡＰＣ（１：２００）、Ｓｃａ－１－ＰＥＣｙ７（１：２００）、ＣＤ４８－ＦＩＴＣ（１：２００）、ＣＤ１５０－ＢＶ５１０（１：５０）、及びＣＤ４５．２－ＡＦ７００（１：１００）。
【0159】
ＡＡＶを注射したマウスから骨髄系前駆体を同定するために、細胞を以下の抗体で氷上で６０分間染色した：ＣＤ３－ｅｆ４５０またはＣＤ３－ビオチン（１：１００）、Ｂ２２０－ｅｆ４５０またはＢ２２０－ビオチン（１：２００）、Ｔｅｒ１１９－ｅｆ４０またはＴｅｒ１１９－ビオチン（１：１００）、Ｇｒ－１－ｅｆ４５０またはＧｒ－１－ビオチン（１：４００）、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣＣｙ７（１：２００）、ｃ－Ｋｉｔ－ＡＰＣ（１：２００）、Ｓｃａ－１－ＰＥＣｙ７（１：２００）、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（１：２５）及びＣＤ１６／ＣＤ３２－ＡＦ７００（１：１００）。ビオチン化抗体の場合、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン－ｅｆ４５０（１：２００）とともに氷上で３０分間インキュベートした。
【0160】
ＡＡＶを注射したマウスから赤芽球前駆細胞を同定するために、細胞を以下の抗体を用いて氷上で３０分間染色した：ＣＤ７１－ＦＩＴＣ（１：２００）及びＴｅｒ１１９－ＡＰＣ（１：２００）。全てのＨＳＰＣ染色パネルで、抗体／ストレプトアビジンのインキュベーション後に細胞を洗浄し、染色培地に再懸濁し、ＦＡＣＳの直前にＳｙｔｏｘ Ｂ
ｌｕｅ（１：１，０００）を添加して死細胞をマークした。細胞を、ＢＤＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩで選別を行った。データ分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ及びＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを使用して実行した。
ｌｕｅ（１：１，０００）を添加して死細胞をマークした。細胞を、ＢＤＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩで選別を行った。データ分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ及びＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを使用して実行した。
【0161】
ＨＳＰＣ移植
【0162】
各動物について、Ｌｉｎ低ｔｄＴｏｍａｔｏ＋生骨髄細胞を、骨髄から１０％ＦＢＳを含む染色培地中に単独で選別した。ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ－１）の発現は、炎症またはストレスの特定の状況でＨＳＣで増大することが報告されているため（Ｒａｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９９７）、ＡＡＶ投与後にこのマーカーの発現が変化する可能性があることに備えて、ＣＤ１１ｂの発現に基づいて移植に使用されるｔｄＴｏｍａｔｏ＋骨髄細胞を選別しなかった。各ドナー動物由来の細胞を６×１０５個のＳｃａ－１枯渇放射線防護ＣＤ４５．１ヘルパー骨髄細胞と組み合わせて、二匹の致死照射（９５０ラド、分割用量）ＣＤ４５．１レシピエント動物に静脈内注射した（１レシピエントあたり３×１０５個のヘルパー骨髄細胞）。細胞は、２８ゲージのインスリン注射器で後眼窩洞に注射した。
【0163】
Ｓｃａ－１の枯渇は、ＡＣＫ溶解ＣＤ４５．１骨髄細胞を、Ｓｃａ－１－ＡＰＣ（１：２００）を用いて氷上で１０分間染色すること、洗浄すること、及び抗ＡＰＣマイクロビーズとともに氷上で２０分間インキュベートすることによって行った。ＡｕｔｏＭＡＣＳ
Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｄｅｐｌｅｔｅｓプログラム）を使用して細胞を洗浄し、枯渇させた。枯渇効率は、フローサイトメトリー分析によって確認した。７－ＡＡＤ（１：２０）を生存率色素として使用し、分析の直前に細胞に添加した。
Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｄｅｐｌｅｔｅｓプログラム）を使用して細胞を洗浄し、枯渇させた。枯渇効率は、フローサイトメトリー分析によって確認した。７－ＡＡＤ（１：２０）を生存率色素として使用し、分析の直前に細胞に添加した。
【0164】
末梢血採取及びフローサイトメトリー分析
【0165】
ドナーのキメラ現象及びｔｄＴｏｍａｔｏ分析は、移植後４、８、１２、１６週間で一次及び二次移植レシピエントの末梢血試料から実施した。末梢血を尾静脈から１００μＬのＰＢＳ／１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５ｍＬチューブに採取し、氷上で保存した。１ｍＬの２％デキストラン／ＰＢＳを試料に添加し、混合し、３７℃で３０分間インキュベートして、赤血球を沈殿させた。残りの細胞を洗浄し、氷上で５分間ＡＣＫ溶解に供した。細胞を洗浄し、４０μｍセルストレーナーでろ過し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（１：５０）を含むＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡに氷上で５分間再懸濁した。細胞を氷上で３０分間、以下の抗体で染色した：ＣＤ３－ＰＥＣｙ７（１：６５）、Ｂ２２０－ＦＩＴＣ（１：１００）、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（１：２００）、Ｇｒ－１－ビオチン（１：４００）、ＣＤ４５．１－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（パシフィックブルー）（１：１００）及びＣＤ４５．２－ＡＰＣ（１：１００）。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン－パシフィックオレンジ（１：５００）で氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、分析の直前に７－ＡＡＤ（１：２０）を添加した。細胞をＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析し、データ分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。
【0166】
肝臓組織学
【0167】
肝臓組織を採取し、４％パラホルムアルデヒドで約２４時間固定した後、７０％エタノールに移した。試料は、ダナファーバー／ハーバードがんセンター（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のげっ歯類組織病理学コア（Ｒｏｄｅｎｔ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ）に提出し、パラフィンに包埋して、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。スライドは、げっ歯類の組織病理
学者によって盲検法で分析して、組織病理学についてスコア付けした。
学者によって盲検法で分析して、組織病理学についてスコア付けした。
【0168】
皮膚細胞の単離及びフローサイトメトリー分析
【0169】
マウスの背中の皮膚を切開した。切開した皮膚（真皮を下に向けた）を、ＨＢＳＳ中の０．２５％コラゲナーゼ中で３７℃で４０～６０分間インキュベートした。次に、外科用メスを使用して真皮をこすり落とした。回収した細胞を、３５０×ｇ、４℃で８分間、遠心分離した。トリプシン－ＥＤＴＡと３７℃で１０分間インキュベートすること、ならびに７０μＭ及び４０μＭのフィルターでろ過することにより、単細胞懸濁液を得た。次に、単細胞懸濁液を、３５０×ｇ、４℃で８分間遠心分離し、ＰＢＳ中の５％ＦＢＳに再懸濁し、３０分間染色した。次の抗体を使用した：ＣＤ４５－ｅｆ４５０（１：２５０）、ＣＤ１４０ａ－ビオチン（１：２５０）、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（１：５００）、ＣＤ２４－ＦＩＴＣ（１：２００）、及びＳｃａ－１－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（１：１０００）。ＤＡＰＩを使用して死細胞を除外した。血液系細胞はＣＤ４５＋としてゲーティングされた。皮膚線維芽細胞は、ＣＤ４５－ＣＤ１４０ａ＋としてゲーティングし、次いでＣＤ２４及びＳｃａ－１の発現に基づいてさらに分割した。細胞はＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩで分析し、データ分析はＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実行した。
【0170】
定量化及び統計分析
【0171】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計分析を行った。リアルタイムＰＣＲ分析では、対応のあるｔ検定を使用して２つの群間の統計的有意性を計算した。反復測定ＡＮＯＶＡを、ドナーのキメラ現象の縦断的分析に使用した。０．０５未満のＰ値の結果は、統計学的に有意であると見なされた。複製に関する情報は、図の凡例で報告する。
【0172】
参考文献
【0173】
Ａｍｏａｓｉｉ，Ｌ．，Ｈｉｌｄｙａｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｗ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｅ．，Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ａ．，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｄ．，Ｈａｒｒｏｎ，Ｒ．，Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔ．Ｒ．，Ｍａｓｓｅｙ，Ｃ．，Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
３６２，８６－９１．
３６２，８６－９１．
【0174】
Ａｒｎｅｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｐ．，Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｎ．，Ｈａｌｌ，Ｊ．，Ｏｄｏｍ，Ｇ．，Ｙａｂｌｏｎｋａ－Ｒｅｕｖｅｎｉ，Ｚ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１４）．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｏ ｎｏｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １．
【0175】
Ａｒｐｋｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｄａｒａｂｉ，Ｒ．，Ｍａｄｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｔｏｙａｍａ，Ａ．，Ｌｏｎｅｔｒｅｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｎａｓｈ，Ｎ．，Ｌｏｗｅ，Ｄ．Ａ．，Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｙｂａ，Ｍ．（２０１３）．Ａ
ｎｅｗ ｉｍｍｕｎｏ－，ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｄｅｌ，ｔｈｅ ＮＳＧ－ｍｄｘ（４Ｃｖ）ｍｏｕｓｅ，ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｌｌ
ｏｇｅｎｅｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，１６１１－１６２０．
ｎｅｗ ｉｍｍｕｎｏ－，ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｄｅｌ，ｔｈｅ ＮＳＧ－ｍｄｘ（４Ｃｖ）ｍｏｕｓｅ，ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｌｌ
ｏｇｅｎｅｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，１６１１－１６２０．
【0176】
Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．，Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｋ．，Ｏｄｏｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｈｅｌｐｓ，Ｍ．Ｐ．，Ａｎｄｒｕｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｈａｕｓｃｈｋａ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１７）．Ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ
ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４４５４．
ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４４５４．
【0177】
Ｂｌａｎｋｉｎｓｈｉｐ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ，Ｐ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｈ．，Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（２００４）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｕｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ６．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０，６７１－６７８．
【0178】
Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ，Ｄ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｔｈｅｔ，Ｓ．，Ｃｌｅａｖｅｒ，Ｏ．，Ｐｅｒｌｉｎｇｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｙｂａ，Ｍ．（２００８）．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ Ｐａｘ７ ｒｅｐｏｒｔｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６，３１９４－３２０４．
【0179】
Ｂｕｓｃｈ，Ｋ．，Ｋｌａｐｐｒｏｔｈ，Ｋ．，Ｂａｒｉｌｅ，Ｍ．，Ｆｌｏｓｓｄｏｒｆ，Ｍ．，Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｌｅｔｚ，Ｔ．，Ｓｃｈｌｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｅｔｈ，Ｍ．，Ｈｏｆｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｒｏｄｅｗａｌｄ，Ｈ．Ｒ．（２０１５）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ ５１８，５４２－５４６．
【0180】
Ｃｅｒｌｅｔｔｉ，Ｍ．，Ｊｕｒｇａ，Ｓ．，Ｗｉｔｃｚａｋ，Ｃ．Ａ．，Ｈｉｒｓｈｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｈａｄｒａｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｏｏｄｙｅａｒ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ
Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２００８）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌ １３４，３７－４７．
Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２００８）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌ １３４，３７－４７．
【0181】
Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１７）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，１１２５－１１３１．
【0182】
Ｃｈａｎｇ，Ｎ．Ｃ．，Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｆ．Ｐ．，ａｎｄ Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．（２０１６）．Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ－Ｌｏｓｔ ｉｎ Ｐｏｌａｒｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ
２２，４７９－４９６．
２２，４７９－４９６．
【0183】
Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．，Ｒｏｎｚｉｔｔｉ，Ｇ．，ａｎｄ Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．（
２０１８）．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ８，８７－１０４．
２０１８）．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ８，８７－１０４．
【0184】
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ａ．，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．（２０１１）．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｄｕｌｔ ｄｅｒｍｉｓ ｔｏ ａ
ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｔａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｃａｔｅｎｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８，５１８９－５１９９．
ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｔａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｃａｔｅｎｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８，５１８９－５１９９．
【0185】
Ｄｒｉｓｋｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｊａｈｏｄａ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｕｏｎｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏｒｓｌｅｙ，Ｖ．（２０１４）．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｄｅｒｍａｌ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２３，６２９－６３１．
【0186】
Ｆｉｌａｒｅｔｏ，Ａ．，Ｒｉｎａｌｄｉ，Ｆ．，Ａｒｐｋｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｄａｒａｂｉ，Ｒ．，Ｂｅｌａｎｔｏ，Ｊ．Ｊ．，Ｔｏｓｏ，Ｅ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｚ．，Ｅｒｖａｓｔｉ，Ｊ．Ｍ．，ＭｃＩｖｏｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｋｙｂａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｐａｘ３－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ ５，３６．
ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ ５，３６．
【0187】
Ｈｅｒｅｄｉａ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｕｋｕｎｄａｎ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｆ．Ｍ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｄｅｏ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈａｗｌａ，Ａ．（２０１３）．Ｔｙｐｅ ２ ｉｎｎａｔｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｆｉｂｒｏ／ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５３，３７６－３８８．
【0188】
Ｈｅｔｔｍｅｒ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｐａｒｋｓ，Ｃ．Ａ．，Ｇｕｅｒｔｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｌａｎｇｅｎａｕ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２０１１）．Ｓａｒｃｏｍａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，２０００２－２０００７．
【0189】
Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，Ｋａｔｚ，Ｎ．，Ｂｕｚａ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｙｅｒ，Ｃ．，Ｇｏｏｄｅ，Ｔ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１８）．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２９，２８５－２９８．
【0190】
Ｊｏｅ，Ａ．Ｗ．，Ｙｉ，Ｌ．，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ．，Ｌｅ Ｇｒａｎｄ，Ｆ．，Ｓｏ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．Ｍ．（２０１０）．Ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｆｉｂｒｏ／ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１５３－１６３．
【0191】
Ｋｉｅｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｙｉｌｍａｚ，Ｏ．Ｈ．，Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔｅｒｈｏｒｓｔ，Ｃ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．（２００５）．ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｃｈｅｓ ｆｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １２１，１１０９－１１２１．
【0192】
Ｋｏｐｉｎｋｅ，Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．，ａｎｄ Ｒｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．（２０１７）．Ｃｉｌｉａｒｙ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ Ｉｎｊｕｒｙ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １７０，３４０－３５１．ｅ３１２．
【0193】
Ｌｅｅｓ－Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ａ．Ａ．，Ｓｔｏｅｓｓｅｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，Ｄｅｖａｒａｋｏｎｄａ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｇｅｎｄｒｅ，Ｎ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ａｃｔｉｖｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｆｉｂｒｏ／ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｃａｕｓｅｓ ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，４７１．
【0194】
Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｓａｍａｎｔａ，Ａ．，Ｔｏｅｌｅｎ，Ｊ．，Ｄｅｂｙｓｅｒ，Ｚ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１０）．Ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
２１，１２５９－１２７１．
２１，１２５９－１２７１．
【0195】
Ｌｏｎｇ，Ｃ．，Ａｍｏａｓｉｉ，Ｌ．，Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ａ．Ａ．，ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｅ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｓ．，Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｒ．，ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．（２０１６）．Ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４００－４０３．
【0196】
Ｌｏｕｎｅｖ，Ｖ．Ｙ．，Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．，Ｗｏｓｃｚｙｎａ，Ｍ．Ｎ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｍａｉｄｍｅｎｔ，Ａ．Ｄ．，Ｓｈｏｒｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｈａｍｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ，Ｆ．Ｓ．（２００９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ ｓｋｅｌｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ ９１，６５２－６６３．
【0197】
Ｌｕ，Ｙ．，ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｓ．（２００９）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｒＡＡＶ１ ａｎｄ ｒＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ １０６，１７１５８－１７１６２．
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｒＡＡＶ１ ａｎｄ ｒＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ １０６，１７１５８－１７１６２．
【0198】
Ｍａｄｉｓｅｎ，Ｌ．，Ｚｗｉｎｇｍａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｓｕｎｋｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｏｈ
，Ｓ．Ｗ．，Ｚａｒｉｗａｌａ，Ｈ．Ａ．，Ｇｕ，Ｈ．，Ｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｈａｗｒｙｌｙｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｒｅ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３，１３３－１４０．
，Ｓ．Ｗ．，Ｚａｒｉｗａｌａ，Ｈ．Ａ．，Ｇｕ，Ｈ．，Ｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｈａｗｒｙｌｙｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｒｅ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３，１３３－１４０．
【0199】
Ｍａｅｓｎｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ａｌｍａｄａ，Ａ．Ｅ．，ａｎｄ Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２０１６）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ
ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ６，３５．
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ
ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ６，３５．
【0200】
Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，Ａｌ－Ｚａｉｄｙ，Ｓ．，Ｓｈｅｌｌ，Ｒ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｗ．Ｄ．，Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，Ｐｒｉｏｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｌｏｗｅｓ，Ｌ．，Ａｌｆａｎｏ，Ｌ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｋ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｓｅ Ｇｅｎｅ－Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，１７１３－１７２２．
【0201】
Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｈｉｇｈ，Ｋ．Ａ．（２０１１）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ＡＡＶ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １２，３４１－３５５．
【0202】
Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒａｙ，Ｄ．，Ｌｏｍｏｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．（２０１７）．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２１，５７４－５９０．
【0203】
Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｈａｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｒｉｖｅｒａ，Ｒ．Ｍ．，Ｍａｄｈａｖａｎ，Ｓ．，Ｐａｎ，Ｘ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
３５１，４０３－４０７．
３５１，４０３－４０７．
【0204】
Ｐａｔｅｌ，Ｓ．Ｈ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｌ．，Ａｔａｎａｓｓｏｖａ，Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｕｒｌｅｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｒｅｂｏｕｒｃｅｔ，Ｄ．，Ｄａｒｂｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｇａｎｎｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｂ．（２０１７）．Ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ
ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍａｌｅｓ ｈａｓ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，８９９１．
ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍａｌｅｓ ｈａｓ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，８９９１．
【0205】
Ｒａｎｄａｌｌ，Ｔ．Ｄ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．（１９９７）．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ
ａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ ８９，３５９６－３６０６．
ａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ ８９，３５９６－３６０６．
【0206】
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｄｅｏｎａｒｉｎｅ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｄｅｎｔｏｎ，Ａ．Ｅ．，Ｆｅｉｇ，Ｃ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｅｓｐｅｌｉ，Ｍ．，Ｋｒａｍａｎ，Ｍ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－α ｆｒｏｍ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃａｃｈｅｘｉａ ａｎｄ ａｎｅｍｉａ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０，１１３７－１１５１．
【0207】
Ｓａｗａｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｂａｂｏｖｉｃ，Ｓ．，Ｕｐａｄｈａｙａ，Ｓ．，Ｋｎａｐｐ，Ｄ．Ｊ．Ｈ．Ｆ．，Ｌａｖｉｎ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｌｏｂｏｒｏｄｋｏ，Ａ．，Ｆｅｎｇ，Ｊ．，Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｊ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ａｎｉｍａｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４５，５９７－６０９．
【0208】
Ｓｃｈｕｌｚ，Ｔ．Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｌ．，Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｈａｄｒａｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｅｒｌｅｔｔｉ，Ｍ．，ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，Ｌ．Ｅ．，Ｇｉｏｒｇａｄｚｅ，Ｎ．，Ｔｃｈｋｏｎｉａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｒｅｓｉｄｉｎｇ
ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｆａｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，１４３－１４８．
ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｆａｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，１４３－１４８．
【0209】
Ｓｅａｌｅ，Ｐ．，Ｓａｂｏｕｒｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｇｉｒｇｉｓ－Ｇａｂａｒｄｏ，Ａ．，Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ａ．，Ｇｒｕｓｓ，Ｐ．，ａｎｄ Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．（２０００）．Ｐａｘ７ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １０２，７７７－７８６．
【0210】
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｏｎｂｏｙ，Ｉ．Ｍ．，Ｃｏｎｂｏｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，ａｎｄ Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２００４）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｅｌｌ １１９，５４３－５５４．
【0211】
Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｊ．，Ｕｌ－Ｈａｓａｎ，Ｔ．，Ｃａｒｖａｉｎｅｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｅ．，Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．（２０１４）．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＡＡＶ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２，１６２５－１６３４．
【0212】
Ｓｕｎ，Ｊ．，Ｒａｍｏｓ，Ａ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｎｉｄｉｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｅ，Ｌ．，Ｈｏ，Ｙ．Ｊ．，Ｋｌｅｉｎ，Ａ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｏ．，ａｎｄ
Ｃａｍａｒｇｏ，Ｆ．Ｄ．（２０１４）．Ｃｌｏｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５１４，３２２－３２７．
Ｃａｍａｒｇｏ，Ｆ．Ｄ．（２０１４）．Ｃｌｏｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５１４，３２２－３２７．
【0213】
Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｗ．，Ｃｈｅｗ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｉｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，Ｍａｅｓｎｅｒ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｅ．Ｙ．，Ｘｉａｏ，Ｒ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０７－４１１．
【0214】
Ｔａｎ，Ｋ．Ｙ．，Ｅｍｉｎｌｉ，Ｓ．，Ｈｅｔｔｍｅｒ，Ｓ．，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２０１１）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２６４０６．
【0215】
Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｉｋｅｍｏｔｏ－Ｕｅｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｉ．，Ｈａｍａｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＧＦＲα＋ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ
５，ｅ１１８６．
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ
５，ｅ１１８６．
【0216】
Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．（２０１０）．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２．
【0217】
Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２０１２）．Ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ｉｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０，３６２－３６９．
【0218】
Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｚｈｕ，Ｔ．，Ｑｉａｏ，Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｊ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｘ．（２００５）．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｓ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｈｅａｒｔ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１－３２８．
【0219】
Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，ＭｃＭｅｎａｍｉｎ，Ｄ．，Ｈｅ，Ｚ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｈ．，Ｘｕ，Ｃ．，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ，Ｈ．，Ｍｕｓｕｎｕｒｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３３４－３３８．
【0220】
Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｔｓａｉ，Ｐ．Ｃ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃｅｌｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｏ．，Ｂｏｕｍａｒｄ，Ｂ．，Ｐｅｒｄｉｇｏｔｏ，Ｃ．Ｎ．，Ｅｚｈｋｏｖａ，Ｅ．，ａｎｄ Ｈｓｕ，Ｙ．Ｃ．（２０１６）．Ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ’
ｔｒａｎｓｉｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｇｏｖｅｒｎ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｒｍａｌ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３０，２３２５－２３３８．
ｔｒａｎｓｉｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｇｏｖｅｒｎ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｒｍａｌ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３０，２３２５－２３３８．
【0221】
Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．，Ｒｅｎｇｏ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．（２００８）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，１０７３－１０８０．
【0222】
Ｚｉｎｎ，Ｅ．，Ｐａｃｏｕｒｅｔ，Ｓ．，Ｋｈａｙｃｈｕｋ，Ｖ．，Ｔｕｒｕｎｅｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｌ．Ｓ．，Ａｎｄｒｅｓ－Ｍａｔｅｏｓ，Ｅ．，Ｓｈａｈ，Ｓ．，Ｓｈｅｌｋｅ，Ｒ．，Ｍａｕｒｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｐｌｏｖｉｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２，１０５６－１０６８．
【0223】
実施例２
【0224】
Ｄｎｍｔ３ａまたは対照遺伝子座（Ｊａｋ２）を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）＋ ｇＲＮＡを運ぶＡＡＶを、２か月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。４か月後、各処置群の１匹のマウスから肝臓及び骨髄を採取した。造血幹細胞（ＨＳＣ）及び多能性前駆体（ＭＰＰ）は、骨髄から単離されたＦＡＣＳであった。さらに、Ｄｎｍｔ３ａ遺伝子座のゲノムＤＮＡを、これらの細胞集団／臓器（肝臓、骨髄、ＨＳＣ、及びＭＰＰ）のそれぞれから増幅し、配列決定した。
【0225】
結果
【0226】
図１１Ａは、編集された読み取りの割合、すなわち、ｇＲＮＡ標的化部位を含む増幅されたＤｎｍｔ３ａ配列にインデルを含む配列決定読み取り％を示す。図１１Ｂは、ＷＴ読み取り％の割合、すなわち、野生型Ｄｎｍｔ３ａ配列にマッピングされる配列決定読み取り％を示している。図１１Ａに示すように、ｇＲＮＡを標的とするＤｎｍｔ３ａは、肝臓のＤｎｍｔ３ａ遺伝子座の約３０％の編集を導入する。インデルは、骨髄及びＨＳＣ及びＭＰＰの集団の読み取りの約０．５％でも検出される。これらのインデルは、切断部位の周りに特徴的なＣａｓ９誘導インデルピークを示す（図１１Ｃ～図１１Ｆ）。Ｊａｋ２を標的とするｇＲＮＡは、Ｄｎｍｔ３ａ編集を誘発せず、これはアプローチの特異性を示している。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の細胞の標的化集団のゲノムの修飾に使用するための組成物であって、一つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入する）、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、
を含み、
前記細胞の標的化集団は、筋幹細胞、間葉系前駆細胞、又は真皮間葉系細胞の集団であって、造血幹細胞でも造血前駆細胞の集団でもなく、
前記第１のＡＡＶはＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０Ｌ６５であって、
前記細胞の標的化集団が筋幹細胞の集団である場合、前記組成物は静脈内投与される、
前記組成物。
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入する）、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、
を含み、
前記細胞の標的化集団は、筋幹細胞、間葉系前駆細胞、又は真皮間葉系細胞の集団であって、造血幹細胞でも造血前駆細胞の集団でもなく、
前記第１のＡＡＶはＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡｎｃ８０Ｌ６５であって、
前記細胞の標的化集団が筋幹細胞の集団である場合、前記組成物は静脈内投与される、
前記組成物。
【請求項2】
前記第１のＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記第１のＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記第１のＡＡＶが、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項5】
静脈内投与されるか、または前記細胞の標的化集団を含む組織に局所的に注射されることによって特徴付けられる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記第１のＡＡＶが、細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記対象を、前記細胞の標的化集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のＡＡＶと接触させることをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記第２のＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記第２のＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記第２のＡＡＶが、ＡＡＶ６、８、またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記細胞の標的化集団が幹細胞または前駆細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記細胞の標的化集団が組織幹細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記細胞の標的化集団が機能的筋肉幹細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記細胞の標的化集団が骨格筋の間葉系前駆細胞（Ｓｃａ－１＋）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記細胞の標的化集団が皮膚組織中の真皮間葉系細胞（ＣＤ１４０ａ＋）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記細胞の標的化集団が、共通の骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、多能性前駆体集団、及び系統を方向付けられた赤血球前駆体集団から選択される前駆細胞集団である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記対象が、ヒト又はマウスである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記細胞の標的化集団の少なくとも４０％が前記第１のＡＡＶによって形質導入される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
対象の筋幹細胞の集団のゲノムの修飾に使用するための組成物であって、一つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記組成物が静脈内注射を介して前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持しており、
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、
前記組成物。
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記組成物が静脈内注射を介して前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持しており、
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、
前記組成物。
【請求項24】
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記第１のＡＡＶが、前記筋幹細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項２３又は２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記筋幹細胞の集団の少なくとも５０％が前記第１のＡＡＶによって形質導入される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記筋幹細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のＡＡＶと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記対象が、ヒト又はマウスである、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項33】
対象における間葉系前駆細胞の集団のゲノムの修飾に使用するための組成物であって、一つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、
前記組成物。
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、
前記組成物。
【請求項34】
前記間葉系前駆細胞がＳｃａ－１＋である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記間葉系前駆細胞が骨格筋に位置する、請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記第１のＡＡＶがＡＡＶ８又はＡＡＶ９である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項37】
前記第１のＡＡＶが、前記間葉系前駆細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％が前記第１のＡＡＶによって形質導入される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％が前記第１のＡＡＶによって形質導入される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項40】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項41】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項42】
前記間葉系前駆細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のＡＡＶと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項43】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項44】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項45】
組織もしくは器官への局所注射または静脈内注射を介して前記対象に投与されることにより特徴づけられる、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項46】
筋肉組織、脂肪組織、骨髄、または結合組織への局所注射によって投与されることにより特徴づけられる、請求項４５に記載の組成物。
【請求項47】
前記対象が、ヒト又はマウスである、請求項３３～４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項48】
対象の真皮間葉系細胞の集団のゲノムの修飾に使用するための組成物であって、一つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記第１のＡＡＶが、ＡＡＶ８である、
組成物。
前記使用が、
ａ．前記対象を第１のＡＡＶと接触させることと（ここで、前記第１のＡＡＶは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入する）、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記第１のＡＡＶが、ＡＡＶ８である、
組成物。
【請求項49】
前記第１のＡＡＶが、前記真皮間葉系細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項50】
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、請求項４８又は４９に記載の組成物。
【請求項51】
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項52】
前記真皮間葉系細胞の集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のＡＡＶと前記対象とを接触させることをさらに含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項53】
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項54】
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項55】
前記対象が、ヒト又はマウスである、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項56】
皮膚に局所的に注射されるか、または静脈内に投与されることにより特徴づけられる、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0104】
「およそ」または「約」は一般に、別段の記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、いずれの方向にも（その数を超えて、またはその数未満で）１％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の５％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の１０％の範囲内となる数を含む（そのような数が、可能な値の１００％を許容できないほど超えてしまう場合を除く）。特に明確に反対の指示がない限り、２つ以上の行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が列挙されている順序に必ずしも限定されるとは限らないが、本発明は順序がそのように限定されている実施形態を含むと理解されるべきである。別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされる場合があることも理解されるべきである。
[項１]
インビボで対象の細胞の標的化集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入することと、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、を含み、
前記細胞の標的化集団は、造血幹細胞でも造血前駆細胞でもない、前記方法。
[項２]
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項１に記載の方法。
[項３]
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、項２に記載の方法。
[項４]
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、項２～３に記載の方法。
[項５]
ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項２～４に記載の方法。
[項６]
前記ウイルスが静脈内投与されるか、または前記細胞の標的化集団を含む組織に局所的に注射される、項１～５に記載の方法。
[項７]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項１～６に記載の方法。
[項８]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項７に記載の方法。
[項９]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項１～８に記載の方法。
[項１０]
前記対象を、前記細胞の標的化集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと接触させることをさらに含む、項１～９に記載の方法。
[項１１]
前記第２のウイルスがＡＡＶである、項１０に記載の方法。
[項１２]
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、項１１に記載の方法。
[項１３]
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、項１１～１２に記載の方法。
[項１４]
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項１～１３に記載の方法。
[項１５]
前記細胞の標的化集団が幹細胞または前駆細胞である、項１～１４に記載の方法。
[項１６]
前記細胞の標的化集団が組織幹細胞である、項１～１５に記載の方法。
[項１７]
前記細胞の標的化集団が機能的筋肉幹細胞である、項１～１６に記載の方法。
[項１８]
前記細胞の標的化集団が骨格筋の間葉系前駆細胞（Ｓｃａ－１＋）である、項１～１６に記載の方法。
[項１９]
前記細胞の標的化集団が皮膚組織中の真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ＋）である、項１～１６に記載の方法。
[項２０]
前記細胞の標的化集団が、共通の骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、多能性前駆体集団、及び系統を方向付けられた赤血球前駆体集団から選択される前駆細胞集団である、項１～１６に記載の方法。
[項２１]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項１～２０に記載の方法。
[項２２]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項１～２０に記載の方法。
[項２３]
前記対象が、ヒトである、項１～２２に記載の方法。
[項２４]
前記対象がマウスである、項１～２２に記載の方法。
[項２５]
前記細胞の標的化集団の少なくとも４０％がウイルスによって形質導入される、項１～２４に記載の方法。
[項２６]
インビボで対象の筋幹細胞の集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記ウイルスが静脈内注射によって前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持している、前記方法。
[項２７]
前記ウイルスがＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項２６に記載の方法。
[項２８]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項２６～２７に記載の方法。
[項２９]
前記筋肉幹細胞の集団の少なくとも５０％が前記ウイルスによって形質導入される、項２６～２８に記載の方法。
[項３０]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項２６～２９に記載の方法。
[項３１]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項３０に記載の方法。
[項３２]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項２６～３１に記載の方法。
[項３３]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項２６～３２に記載の方法。
[項３４]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項２６～３２に記載の方法。
[項３５]
前記対象が、ヒトである、項２６～３２に記載の方法。
[項３６]
前記対象がマウスである、項２６～３２に記載の方法。
[項３７]
対象における間葉系前駆細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと
、を含む、前記方法。
[項３８]
前記間葉系前駆細胞がＳｃａ－１＋である、項３７に記載の方法。
[項３９]
前記間葉系前駆細胞が骨格筋に位置する、項３７～３８に記載の方法。
[項４０]
前記ウイルスがＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項３７～３９に記載の方法。
[項４１]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項３７～４０に記載の方法。
[項４２]
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％が前記ウイルスによって形質導入される、項３７～４１に記載の方法。
[項４３]
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％が前記ウイルスによって形質導入される、項３７～４１に記載の方法。
[項４４]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項３７～４３に記載の方法。
[項４５]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項４４に記載の方法。
[項４６]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項３７～４５に記載の方法。
[項４７]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項３７～４６に記載の方法。
[項４８]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項３７～４６に記載の方法。
[項４９]
前記ウイルスが、組織もしくは器官への局所注射または静脈内注射を介して前記対象に投与される、項３７～４８に記載の方法。
[項５０]
前記ウイルスが、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、または結合組織への局所注射によって投与される、項４９に記載の方法。
[項５１]
前記対象が、ヒトである、項３７～５０に記載の方法。
[項５２]
前記対象がマウスである、項３７～５０に記載の方法。
[項５３]
対象の真皮間葉細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む方法。
[項５４]
前記ウイルスが、ＡＡＶ８である、項５３に記載の方法。
[項５５]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項５３～５４に記載の方法。
[項５６]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項５３～５５に記載の方法。
[項５７]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項５６に記載の方法。
[項５８]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項５３～５７に記載の方法。
[項５９]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項５３～５８に記載の方法。
[項６０]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項５３～５９に記載の方法。
[項６１]
前記対象が、ヒトである、項５３～６０に記載の方法。
[項６２]
前記対象がマウスである、項５３～６０に記載の方法。
[項６３]
前記ウイルスが皮膚に局所的に注射されるか、または静脈内に投与される、項５３～６２に記載の方法。
[項１]
インビボで対象の細胞の標的化集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を、前記細胞の標的化集団に形質導入することと、
ｂ．前記配列標的化ヌクレアーゼを用いて、前記細胞の標的化集団のゲノムを修飾することと、を含み、
前記細胞の標的化集団は、造血幹細胞でも造血前駆細胞でもない、前記方法。
[項２]
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項１に記載の方法。
[項３]
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、項２に記載の方法。
[項４]
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、項２～３に記載の方法。
[項５]
ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項２～４に記載の方法。
[項６]
前記ウイルスが静脈内投与されるか、または前記細胞の標的化集団を含む組織に局所的に注射される、項１～５に記載の方法。
[項７]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項１～６に記載の方法。
[項８]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項７に記載の方法。
[項９]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項１～８に記載の方法。
[項１０]
前記対象を、前記細胞の標的化集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと接触させることをさらに含む、項１～９に記載の方法。
[項１１]
前記第２のウイルスがＡＡＶである、項１０に記載の方法。
[項１２]
前記ＡＡＶが、前記細胞の標的化集団に対して向性を有する、項１１に記載の方法。
[項１３]
前記ＡＡＶが、細胞の非標的化集団に対して向性が低下しているか、または全くない、項１１～１２に記載の方法。
[項１４]
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１、２、６、８、９、１０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項１～１３に記載の方法。
[項１５]
前記細胞の標的化集団が幹細胞または前駆細胞である、項１～１４に記載の方法。
[項１６]
前記細胞の標的化集団が組織幹細胞である、項１～１５に記載の方法。
[項１７]
前記細胞の標的化集団が機能的筋肉幹細胞である、項１～１６に記載の方法。
[項１８]
前記細胞の標的化集団が骨格筋の間葉系前駆細胞（Ｓｃａ－１＋）である、項１～１６に記載の方法。
[項１９]
前記細胞の標的化集団が皮膚組織中の真皮間葉細胞（ＣＤ１４０ａ＋）である、項１～１６に記載の方法。
[項２０]
前記細胞の標的化集団が、共通の骨髄系前駆体集団、顆粒球単球前駆体集団、巨核球赤芽球前駆体集団、多能性前駆体集団、及び系統を方向付けられた赤血球前駆体集団から選択される前駆細胞集団である、項１～１６に記載の方法。
[項２１]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項１～２０に記載の方法。
[項２２]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項１～２０に記載の方法。
[項２３]
前記対象が、ヒトである、項１～２２に記載の方法。
[項２４]
前記対象がマウスである、項１～２２に記載の方法。
[項２５]
前記細胞の標的化集団の少なくとも４０％がウイルスによって形質導入される、項１～２４に記載の方法。
[項２６]
インビボで対象の筋幹細胞の集団のゲノムを修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記筋幹細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記筋幹細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含み、
前記ウイルスが静脈内注射によって前記対象に投与され、前記修飾された筋幹細胞が筋原性能力を保持している、前記方法。
[項２７]
前記ウイルスがＡＡＶ８またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項２６に記載の方法。
[項２８]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項２６～２７に記載の方法。
[項２９]
前記筋肉幹細胞の集団の少なくとも５０％が前記ウイルスによって形質導入される、項２６～２８に記載の方法。
[項３０]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項２６～２９に記載の方法。
[項３１]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項３０に記載の方法。
[項３２]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項２６～３１に記載の方法。
[項３３]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項２６～３２に記載の方法。
[項３４]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項２６～３２に記載の方法。
[項３５]
前記対象が、ヒトである、項２６～３２に記載の方法。
[項３６]
前記対象がマウスである、項２６～３２に記載の方法。
[項３７]
対象における間葉系前駆細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記間葉系前駆細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記間葉系前駆細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと
、を含む、前記方法。
[項３８]
前記間葉系前駆細胞がＳｃａ－１＋である、項３７に記載の方法。
[項３９]
前記間葉系前駆細胞が骨格筋に位置する、項３７～３８に記載の方法。
[項４０]
前記ウイルスがＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡｎｃ８０Ｌ６５である、項３７～３９に記載の方法。
[項４１]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項３７～４０に記載の方法。
[項４２]
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも１１％が前記ウイルスによって形質導入される、項３７～４１に記載の方法。
[項４３]
前記間葉系前駆細胞の集団の少なくとも２０％が前記ウイルスによって形質導入される、項３７～４１に記載の方法。
[項４４]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項３７～４３に記載の方法。
[項４５]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項４４に記載の方法。
[項４６]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項３７～４５に記載の方法。
[項４７]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項３７～４６に記載の方法。
[項４８]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項３７～４６に記載の方法。
[項４９]
前記ウイルスが、組織もしくは器官への局所注射または静脈内注射を介して前記対象に投与される、項３７～４８に記載の方法。
[項５０]
前記ウイルスが、筋肉組織、脂肪組織、骨髄、または結合組織への局所注射によって投与される、項４９に記載の方法。
[項５１]
前記対象が、ヒトである、項３７～５０に記載の方法。
[項５２]
前記対象がマウスである、項３７～５０に記載の方法。
[項５３]
対象の真皮間葉細胞の集団のゲノムをインビボで修飾するための方法であって、
ａ．前記対象をウイルスと接触させることであって、前記ウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を前記真皮間葉系細胞の集団に形質導入することと、
ｂ．前記真皮間葉系細胞の集団のゲノムを前記配列標的化ヌクレアーゼで修飾することと、を含む方法。
[項５４]
前記ウイルスが、ＡＡＶ８である、項５３に記載の方法。
[項５５]
前記ウイルスが、前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに形質導入する、項５３～５４に記載の方法。
[項５６]
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである、項５３～５５に記載の方法。
[項５７]
前記ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項５６に記載の方法。
[項５８]
前記細胞集団において１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列を形質導入する第２のウイルスと前記対象とを接触させることをさらに含む、項５３～５７に記載の方法。
[項５９]
前記修飾が、突然変異の導入または修正を含む、項５３～５８に記載の方法。
[項６０]
前記修飾が、相同性指向修復を介した突然変異の修正を含む、項５３～５９に記載の方法。
[項６１]
前記対象が、ヒトである、項５３～６０に記載の方法。
[項６２]
前記対象がマウスである、項５３～６０に記載の方法。
[項６３]
前記ウイルスが皮膚に局所的に注射されるか、または静脈内に投与される、項５３～６２に記載の方法。
【外国語明細書】