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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024150778
(43)【公開日】2024-10-23
(54)【発明の名称】育毛剤、およびこれを含む飲食品
(51)【国際特許分類】
C07K 5/062 20060101AFI20241016BHJP
C07K 5/078 20060101ALI20241016BHJP
C07K 5/072 20060101ALI20241016BHJP
C07K 5/065 20060101ALI20241016BHJP
C07K 5/083 20060101ALI20241016BHJP
C07K 5/093 20060101ALI20241016BHJP
C07K 5/097 20060101ALI20241016BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20241016BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20241016BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20241016BHJP
A61Q 7/00 20060101ALI20241016BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20241016BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20241016BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20241016BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241016BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C07K5/062
C07K5/078
C07K5/072
C07K5/065
C07K5/083
C07K5/093
C07K5/097
C07K14/435
A23L33/18
A61K8/64
A61Q7/00
A61P17/14
A61K38/05
A61K38/06
A61P43/00 107
A61K38/39
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024130906
(22)【出願日】2024-08-07
(62)【分割の表示】P 2021533956の分割
【原出願日】2020-07-13
(31)【優先権主張番号】P 2019137125
(32)【優先日】2019-07-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000190943
【氏名又は名称】新田ゼラチン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小泉 聖子
(72)【発明者】
【氏名】真野 博
(72)【発明者】
【氏名】清水 純
(72)【発明者】
【氏名】君羅 好史
(72)【発明者】
【氏名】野村 佳歩
(57)【要約】 （修正有）
【課題】頭髪における発毛または育毛の促進、あるいは脱毛の進行予防の少なくともいずれかの作用を奏するアミノ酸、ペプチド等を含む育毛剤、およびこれを含む飲食品を提供する。
【解決手段】育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。
【選択図】なし
【解決手段】育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する、育毛剤。
【請求項2】
前記ペプチドは、コラーゲン由来である、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項3】
前記育毛剤は、前記ペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物である、請求項１または請求項２に記載の育毛剤。
【請求項4】
前記コラーゲンペプチド混合物は、その重量平均分子量が１００Ｄａ以上８０００Ｄａ以下である、請求項３に記載の育毛剤。
【請求項5】
前記育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の育毛剤。
【請求項6】
前記育毛剤は、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の育毛剤。
【請求項7】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の育毛剤を含む、飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、育毛剤、およびこれを含む飲食品に関する。
【背景技術】
【0002】
コラーゲン加水分解物（以下、「コラーゲンペプチド混合物」とも記す）は、生体に対して様々な生理活性を示すことが公知である。たとえば国際公開第２０１２／１０２３０８号（特許文献１）は、コラーゲンペプチド混合物がインスリン分泌を制御する酵素に対して作用を示すことから、コラーゲンペプチド混合物を糖尿病の治療または予防剤として用いることを開示している。特開２００９－１２０５１２号公報（特許文献２）は、コラーゲンペプチド混合物が軟骨の再生を促進する作用を示すことから、コラーゲンペプチド混合物を関節軟骨再生促進剤として用いることを開示している。特開２００５－０２９４８８号公報（特許文献３）は、コラーゲンペプチド混合物が血圧降下作用を示すことから、コラーゲンペプチド混合物を血圧降下剤として用いることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１２／１０２３０８号
【特許文献2】特開２００９－１２０５１２号公報
【特許文献3】特開２００５－０２９４８８号公報
【特許文献4】特開２００９－１６１５０９号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Tanimura S et al., Cell Stem Cell, 2011年, Vol 8，pp.177-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ここで特開２００９－１６１５０９号公報（特許文献４）および上記非特許文献１は、ＸＶＩＩ型コラーゲンが脱毛抑制作用および毛髪の脱色素化抑制作用を有することを開示しているが、上述のコラーゲンペプチド混合物において、頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛の進行予防作用を示すことはこれまで知られていない。このためコラーゲンペプチド混合物、およびこれに含まれるコラーゲン由来のアミノ酸およびペプチド等が有する新たな生理活性として、頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛の進行予防作用を探索する研究が鋭意進められている。
【0006】
上記実情に鑑み、本発明は、頭髪における発毛または育毛の促進、あるいは脱毛の進行予防の少なくともいずれかの作用を奏するアミノ酸、ペプチド等を含む育毛剤、およびこれを含む飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、コラーゲンペプチド混合物が有する新たな生理活性を探索する中で、コラーゲンペプチド混合物に含まれる所定のアミノ酸、および所定のペプチド等において、頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛の進行予防作用の少なくともいずれかを奏することを知見し、本発明に到達した。本発明は、具体的には以下のとおりである。
【0008】
本発明に係る育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。
【0009】
上記アミノ酸および上記ペプチドは、コラーゲン由来であることが好ましい。
上記育毛剤は、上記アミノ酸または上記ペプチドのいずれかを少なくとも含むコラーゲンペプチド混合物であることが好ましい。
上記育毛剤は、上記アミノ酸または上記ペプチドのいずれかを少なくとも含むコラーゲンペプチド混合物であることが好ましい。
【0010】
上記コラーゲンペプチド混合物は、その重量平均分子量が１００Ｄａ以上８０００Ｄａ以下であることが好ましい。
【0011】
上記育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤であることが好ましい。
上記育毛剤は、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤であることが好ましい。
上記育毛剤は、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤であることが好ましい。
【0012】
本発明に係る飲食品は、上記育毛剤を含む。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、頭髪における発毛または育毛の促進、あるいは脱毛の進行予防の少なくともいずれかの作用を奏するアミノ酸、ペプチド等を含む育毛剤、およびこれを含む飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】マグネシウム欠乏特殊飼料を与えたコントール群の生後１１週齢のヘアレスマウスの頭部を示す図面代用写真である。
【図2】Ｐｒｏ－Ｈｙｐを含むマグネシウム欠乏特殊飼料を与えた第１群の生後１１週齢のヘアレスマウスの頭部を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明に係る実施形態について、さらに詳細に説明する。ここで、本明細書において「Ａ～Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。本明細書において「育毛剤」における「育毛」の用語には、毛髪を育てる作用を表す「育毛」の意味のみならず、新しい毛髪を生やし、その成長を促す作用を表す「発毛」の意味、および毛髪を抜けにくくする作用を表す「脱毛の進行予防」の意味がいずれも含まれるものとする。
【0016】
［育毛剤］
本発明に係る育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。このような特徴を備える育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛の進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。
本発明に係る育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。このような特徴を備える育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛の進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。
【0017】
〔頭髪における発毛または育毛の促進、あるいは脱毛の進行予防の作用を奏する所定のアミノ酸、または所定のペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体〕
上述のとおり育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。本明細書において「アミノ酸」は、別段の表記がない限り、３文字表記の略号で表される。さらに「アミノ酸」は、別段の表記がない限り、Ｌ型アミノ酸を意味する。本明細書において「ペプチド」は、たとえば「Ｐｒｏ－Ｈｙｐ」であれば、Ｎ末端側からプロリン、ヒドロキシプロリンの順にＣ末端側へ向けて配列したペプチド（ジペプチド）を意味し、「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」であれば、Ｎ末端側からグルタミン酸、ヒドロキシプロリン、グリシンの順にＣ末端側へ向けて配列したペプチド（トリペプチド）を意味する。このことは、「Ｐｒｏ－Ｈｙｐ」および「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」以外のジペプチドおよびトリペプチドの記載についても同様である。
上述のとおり育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。本明細書において「アミノ酸」は、別段の表記がない限り、３文字表記の略号で表される。さらに「アミノ酸」は、別段の表記がない限り、Ｌ型アミノ酸を意味する。本明細書において「ペプチド」は、たとえば「Ｐｒｏ－Ｈｙｐ」であれば、Ｎ末端側からプロリン、ヒドロキシプロリンの順にＣ末端側へ向けて配列したペプチド（ジペプチド）を意味し、「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」であれば、Ｎ末端側からグルタミン酸、ヒドロキシプロリン、グリシンの順にＣ末端側へ向けて配列したペプチド（トリペプチド）を意味する。このことは、「Ｐｒｏ－Ｈｙｐ」および「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」以外のジペプチドおよびトリペプチドの記載についても同様である。
【0018】
育毛剤は、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－ＧｌｙならびにＰｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸、またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有することが好ましい。育毛剤は、Ｐｒｏ－ＨｙｐまたはＨｙｐ－Ｇｌｙの少なくともいずれかのペプチド、もしくはその塩、あるいはその化学修飾体を含有することがより好ましい。さらに育毛剤は、ＨｙｐとＰｒｏとの組合せを含有する態様、あるいはＨｙｐとＧｌｙとの組合せを含有する態様であってもよい。これらの場合、育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用をより顕著に示すことができる。
【0019】
上記アミノ酸およびペプチドの「塩」は、たとえば上記アミノ酸またはペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機塩基塩などとして形成される。
【0020】
上記アミノ酸およびペプチドの「化学修飾体」とは、構成単位であるアミノ酸残基が有する遊離の官能基が化学修飾された化合物を意味する。化学修飾は、たとえばヒドロキシプロリンの水酸基、Ｎ末（アミノ末端）側のアミノ酸のアミノ基およびＣ末（カルボキシル末端）側のアミノ酸のカルボキシル基に対して実行することができる。化学修飾の具体的手段およびその処理条件は、従来公知のアミノ酸およびペプチドを対象とした化学修飾技術が適用される。このような化学修飾によって、上記アミノ酸およびペプチドの化学修飾体は、弱酸性から中性で溶解性が向上する効果、他の有効成分との相溶性が向上する効果などを奏することができる。
【0021】
たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙのトリペプチドに対し、ヒドロキシプロリンにおける水酸基の化学修飾として、Ｏ－アセチル化などを行うことができる。このＯ－アセチル化は、たとえば水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることによって実行することができる。グリシンにおけるカルボキシル基の化学修飾として、エステル化、アミド化などを行うことができる。上記エステル化は、上記ペプチドをメタノールに懸濁した後、これに乾燥塩化水素ガスを通気することによって実行することができる。上記アミド化は、上記ペプチドにカルボジイミドなどを作用させることによって実行することができる。
【0022】
さらにペプチド中の遊離のアミノ基の化学修飾として、メチル化を行うことができる。ペプチド中の遊離の水酸基の化学修飾として、リン酸化および硫酸化の少なくともいずれかを行うことができる。
【0023】
上記アミノ酸およびペプチドは、コラーゲン由来であることが好ましい。この場合、原料としてのコラーゲンは、たとえば牛、豚、羊、鶏、ダチョウなどに代表される動物の皮、皮膚、骨、軟骨、腱など、あるいは魚類の骨、皮、鱗などに対して従来公知の脱脂または脱灰処理、抽出処理などを実行することにより得ることができる。さらに上記ペプチドの原料として、ゼラチンを用いることもできる。ゼラチンは、上述のようにして得たコラーゲンを熱水抽出などの従来公知の方法で処理することにより得ることができる。コラーゲンおよびゼラチンは、市販のものを原料として用いることもできる。
【0024】
上記アミノ酸およびペプチドは、上記コラーゲンおよびゼラチンの両方またはいずれか一方に対し、エンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの２種以上を組み合わせて加水分解することによって得ることができる。上記アミノ酸およびペプチドは、上記の加水分解によって他のコラーゲンペプチドとともに混在するコラーゲンペプチド混合物として得られるが、このコラーゲンペプチド混合物自体、およびこれを部分精製した混合物を本発明に係る育毛剤として用いることができる。すなわち育毛剤は、上記アミノ酸または上記ペプチドのいずれかを少なくとも含むコラーゲンペプチド混合物であることも好ましい。さらに、上記コラーゲンペプチド混合物をさらに精製することにより、上述したアミノ酸、またはペプチドのいずれかを含む精製物を高純度で得ることができる。上記アミノ酸およびペプチドは、コラーゲン由来である場合、後述するコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法を用いることにより得ることが好ましい。
【0025】
さらに上記コラーゲンペプチド混合物は、その重量平均分子量が１００Ｄａ以上８０００Ｄａ以下であることが好ましい。上記コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量は、より好ましくは１００Ｄａ以上６０００Ｄａ以下であり、さらに好ましくは１００Ｄａ以上４０００Ｄａ以下である。上記コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量が上述した範囲内である場合、育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖作用をより顕著に示し、もって頭髪における発毛および育毛の促進作用、ならびに脱毛の進行予防作用の少なくともいずれかをより十分に得ることができる。上記重量平均分子量が８０００Ｄａを超える場合、育毛剤は、上述した効果が不十分となる恐れがある。
【0026】
上記コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量は、以下の測定条件の下でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実行することにより求めることができる。
機器 ：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（東ソー株式会社製)
カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷXL
カラム温度：４０℃
カラムサイズ：７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、５μｍ
溶離液：４５質量％アセトニトリル（０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出 ：ＵＶ２１４ｎｍ
分子量マーカー：以下の５種を使用
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ Ｃ Ｍｗ：１２０００
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ Ｍｗ：６５００
Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｍｗ：１４５０
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ Ｍｗ：４５１
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ Ｍｗ：１８９。
機器 ：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（東ソー株式会社製)
カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷXL
カラム温度：４０℃
カラムサイズ：７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、５μｍ
溶離液：４５質量％アセトニトリル（０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出 ：ＵＶ２１４ｎｍ
分子量マーカー：以下の５種を使用
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ Ｃ Ｍｗ：１２０００
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ Ｍｗ：６５００
Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｍｗ：１４５０
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ Ｍｗ：４５１
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ Ｍｗ：１８９。
【0027】
具体的には、約０．２ｇの上記コラーゲンペプチド混合物を含む試料を約１００ｍｌの蒸留水に添加し、撹拌した後、０．２μｍフィルターを用いてろ過することにより、重量平均分子量を測定する試料（被測定物）を調製する。この被測定物を上述したサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより、上記コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量を求めることができる。
【0028】
〔育毛剤の製造方法〕
育毛剤に含まれる上記アミノ酸またはペプチドは、従来公知の方法により得ることができる。たとえば上記アミノ酸（Ｈｙｐ）は、市販のアミノ酸を購入することにより得ることができる。上記アミノ酸は、コラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることにより得ることもできる。
育毛剤に含まれる上記アミノ酸またはペプチドは、従来公知の方法により得ることができる。たとえば上記アミノ酸（Ｈｙｐ）は、市販のアミノ酸を購入することにより得ることができる。上記アミノ酸は、コラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることにより得ることもできる。
【0029】
上記ペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙおよびＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）は、従来公知の液相または固相のペプチド合成方法、あるいはコラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることによりそれぞれ得ることができる。上記ペプチドは、効率性の観点から後述するアミノ酸を用いた化学合成方法、あるいは後述するコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法を用いることにより製造することが好ましい。さらに上記ペプチドは、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法に代えて、１次酵素を省略し２次酵素のみにより酵素処理する方法、１次酵素および２次酵素による酵素処理を同時に行う方法を用いることにより製造することも可能である。以下、育毛剤に含まれるペプチドの中から「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」に着目し、これを製造する方法を育毛剤に含まれるペプチドの製造方法の例示として説明する。
【0030】
＜化学合成方法＞
上記ペプチドは、一般的なペプチド合成法を用いて得ることができる。このペプチド合成法としては、固相合成法および液相合成法が公知である。固相合成法には、Ｆｍｏｃ法とＢｏｃ法とが知られている。上記ペプチドは、Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法のいずれの方法を用いても得ることができる。ペプチドの固相合成法として、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの合成方法は、次のように行うことができる。
上記ペプチドは、一般的なペプチド合成法を用いて得ることができる。このペプチド合成法としては、固相合成法および液相合成法が公知である。固相合成法には、Ｆｍｏｃ法とＢｏｃ法とが知られている。上記ペプチドは、Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法のいずれの方法を用いても得ることができる。ペプチドの固相合成法として、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの合成方法は、次のように行うことができる。
【0031】
まず表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として準備する。縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを別途準備する。次に、上記アミノ酸配列においてＣ末（カルボキシル末端）側のアミノ酸であるグリシンのアミノ基をＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ－ｍｅｔｈｏｘｙ－ｃａｒｂｏｎｙｌ）基で保護するとともに、上記縮合剤を用いた脱水反応により上記グリシンのカルボキシル基と上記固相の上記アミノ基とをペプチド結合させる。さらに上記固相を溶媒で洗浄することにより、残存する縮合剤およびアミノ酸を除去した後、上記固相にペプチド結合しているグリシンのアミノ基の保護基を除去（脱保護）する。
【0032】
続いて、Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリンを準備し、このヒドロキシプロリンのカルボキシル基と、上記グリシンの脱保護したアミノ基とを上記縮合剤を用いることによりペプチド結合させる。以後、同様の要領で上記ヒドロキシプロリンのアミノ基の脱保護、Ｆｍｏｃ基で保護したグルタミン酸の準備、ならびにこのグルタミン酸と上記ヒドロキシプロリンとをペプチド結合させる反応を実行することにより、上記固相にＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを合成する。最後に、上記グルタミン酸のアミノ基の脱保護を行い、さらに上記固相から上記トリペプチドをトリフルオロ酢酸で温浸して切り離すことにより、上記トリペプチドを製造することができる。
【0033】
＜コラーゲンまたはゼラチンを用いた製造方法＞
さらにコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを製造する方法は、次のように行うことができる。
さらにコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを製造する方法は、次のように行うことができる。
【0034】
ここでコラーゲンまたはゼラチンを「２段階で酵素処理する」とは、次のことを意味する。すなわち、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断する従来公知の方法により１次酵素処理を実行した後に、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せにより２次酵素処理を実行することをいう。１次酵素処理を実行することにより、コラーゲンペプチド混合物前駆体を得ることができる。さらに２次酵素処理を実行することにより、上記コラーゲンペプチド混合物前駆体から上記Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法について、以下さらに詳述する。
【0035】
（１次酵素処理）
１次酵素処理で用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されるべきではなく、任意のタンパク質分解酵素を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどを挙げることができ、これらの群から選ばれる１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどを用いることができる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどを用いることができる。１次酵素処理で用いる酵素としては、本発明に係る育毛剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
１次酵素処理で用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されるべきではなく、任意のタンパク質分解酵素を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどを挙げることができ、これらの群から選ばれる１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどを用いることができる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどを用いることができる。１次酵素処理で用いる酵素としては、本発明に係る育毛剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
【0036】
１次酵素処理における酵素量としては、たとえばコラーゲンまたはゼラチン１００質量部に対し上述した酵素を０．１～５質量部とすることが好ましい。１次酵素処理における処理温度は３０～６５℃とし、処理時間は１０分～７２時間とすることが好ましい。上記１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物前駆体の重量平均分子量は、好ましくは５００～２００００Ｄａ、より好ましくは５００～１００００Ｄａ、さらに好ましくは５００～８０００Ｄａである。重量平均分子量が上述の範囲にあれば、分子量が適切なペプチドが十分に生成しているといえる。１次酵素処理の後に、必要に応じて酵素を失活させることができる。この場合の失活温度としては、たとえば７０～１００℃とすることが好ましい。コラーゲンペプチド混合物前駆体の重量平均分子量は、上述したＳＥＣを用いる方法によって求めることができる。
【0037】
（２次酵素処理）
２次酵素処理で用いる酵素としては、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せを挙げることができる。ここで本明細書において「アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素」とは、ペプチド鎖のＮ末側からアミノ酸を遊離させる働きを有するペプチダーゼであって、Ｎ末側から２番目にプロリンあるいはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する酵素をいう。本明細書において「プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素」とは、Ｎ末側から３番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンであるペプチドから、Ｎ末側の３アミノ酸残基のみを遊離するペプチダーゼをいう。２次酵素処理で用いる酵素も、本発明に係る育毛剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
２次酵素処理で用いる酵素としては、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せを挙げることができる。ここで本明細書において「アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素」とは、ペプチド鎖のＮ末側からアミノ酸を遊離させる働きを有するペプチダーゼであって、Ｎ末側から２番目にプロリンあるいはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する酵素をいう。本明細書において「プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素」とは、Ｎ末側から３番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンであるペプチドから、Ｎ末側の３アミノ酸残基のみを遊離するペプチダーゼをいう。２次酵素処理で用いる酵素も、本発明に係る育毛剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
【0038】
アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素としては、たとえばアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２．；T.Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem., 52:217-225(1988)）などを挙げることができる。またたとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素を挙げることができる。プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素としては、たとえばプロリルトリぺプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．；A.Banbula et al., J.Biol. Chem., 274:9246-9252(1999)）などを挙げることができる。
【0039】
２次酵素処理を実行することにより、上記コラーゲンペプチド混合物前駆体に含まれていなかったペプチド含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。具体的には、上記Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。
【0040】
２次酵素処理における酵素量としては、たとえば上記コラーゲンペプチド混合物前駆体１００質量部に対して上述した酵素を０．０１～５質量部とすることが好ましい。２次酵素処理における処理温度は３０～６５℃とし、処理時間は１０分～７２時間とすることが好ましい。上記２次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量は、好ましくは１００～１００００Ｄａ、より好ましくは１００～８０００Ｄａ、さらに好ましくは１００～４０００Ｄａである。コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量も、上述したＳＥＣを用いる方法によって求めることができる。
【0041】
２次酵素処理は、上述したＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙのトリペプチドを生成することを主たる目的として実行される。このため上記コラーゲンペプチド混合物前駆体に含まれるペプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、２次酵素処理における酵素量、処理温度、処理時間およびｐＨを調整することが好ましい。これによりコラーゲンペプチド混合物を上述した重量平均分子量の範囲内とすることが好ましい。２次酵素処理の後に、酵素を失活させる必要がある。この場合の失活温度としては、たとえば７０～１００℃とすることが好ましい。さらに１２０℃で数秒以上の殺菌処理を行うことが好ましい。また、これに２００℃以上の熱をかけて噴霧乾燥させることも可能である。
【0042】
２次酵素処理では、上記アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の他に、異なる活性を併有する酵素を用いることができ、かつ異なる活性を有する酵素を２種以上併用することもできる。これにより副生成物を分解し除去することが可能となる。この場合において用いる酵素としては、原料となるコラーゲンの種類、１次酵素処理に用いる酵素の種類に応じて適宜選択することが好ましい。上述した異なる活性としては、たとえばプロリダーゼ活性、ヒドロキシプロリダーゼ活性などのジペプチダーゼ活性を挙げることができる。これにより副生成物となるジペプチドなどを分解除去することができる。
【0043】
さらにアミノペプチダーゼＮ活性は、基本的にＮ末端側のアミノ酸を１つずつ遊離させる活性である。このため１次酵素処理によって得られるコラーゲンペプチド混合物前駆体に分子量が極めて大きいペプチドが含まれる場合、２次酵素処理をアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素のみで実行したとき、その処理時間が著しく長期化する。このような場合に対応するため、２次酵素処理では、たとえばプロリンのカルボキシル基側を加水分解する活性（プロリダーゼ活性）を有するエンドペプチダーゼであるプロリルオリゴペプチダーゼを用いることができる。これにより２次酵素処理を効率的に行うことができる。
【0044】
コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法では、１次酵素処理によって比較的分子量の大きなペプチドを生成することができる。このペプチドは、たとえば［Ｘ1－Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］（Ｘ1およびＸ2≠Ｈｙｐ）で表されるアミノ酸配列を有することができる。続く２次酵素処理では、上記［Ｘ1－Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドにアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素が作用し、Ｎ末端のＸ1が遊離することにより［Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが得られる。次に、上記［Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドに、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素が２度作用し、グリシンおよびＸ2が遊離することにより、［Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドが得られる。
【0045】
（コラーゲンペプチド混合物の精製）
上述した２段階での酵素処理を実行することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド混合物を製造することができる。上記コラーゲンペプチド混合物には、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド以外のペプチドも含まれているため、必要に応じて精製することが好ましい。この場合の精製方法としては、従来公知の方法を用いることができ、たとえば限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーなどを用いることができる。
上述した２段階での酵素処理を実行することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙを含むコラーゲンペプチド混合物を製造することができる。上記コラーゲンペプチド混合物には、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド以外のペプチドも含まれているため、必要に応じて精製することが好ましい。この場合の精製方法としては、従来公知の方法を用いることができ、たとえば限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーなどを用いることができる。
【0046】
具体的には、コラーゲンペプチド混合物を以下の操作により精製することができる。すなわち上記コラーゲンペプチド混合物の約２ｇ／１０ｍＬをイオン交換カラム（たとえば商品名：「トヨパール（登録商標）ＤＥＡＥ－６５０」、東ソー株式会社製）に負荷した後、蒸留水で溶出される第１ボイドボリューム画分を回収する。次いで、第１ボイドボリューム画分を上記イオン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム（たとえば商品名：「トヨパール（登録商標）ＳＰ－６５０」、東ソー株式会社製）に負荷した後、蒸留水で溶出される第２ボイドボリューム画分を回収する。
【0047】
次に、第２ボイドボリューム画分をゲル濾過カラム（たとえば商品名：「セファデックスＬＨ－２０」、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に負荷し、３０質量％メタノール水溶液で溶出することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙのトリペプチドが含まれる画分を回収する。最後に、この画分に対して逆相カラム（たとえば商品名：「μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Åカラム」、ウォーターズ社製）を装填した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む３２質量％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配で分画することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙを高純度で得ることができる。
【0048】
〔毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤、頭髪における発毛または育毛の促進剤、脱毛進行予防剤〕
本発明に係る育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤であることが好ましい。育毛剤は、上述のようにＨｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸、またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有し、もって毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を示すことができる。これにより育毛剤は、頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。したがって育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤として毛乳頭細胞の細胞増殖を促進させる用途に適用することができる。
本発明に係る育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤であることが好ましい。育毛剤は、上述のようにＨｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸、またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有し、もって毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を示すことができる。これにより育毛剤は、頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。したがって育毛剤は、毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤として毛乳頭細胞の細胞増殖を促進させる用途に適用することができる。
【0049】
育毛剤は、上記アミノ酸、またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有することから、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤であることも好ましい。育毛剤は、上述のように毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有するため、頭髪における発毛または育毛の促進剤として毛乳頭細胞を増殖させることにより、頭髪の発毛または育毛を促進する治療に用いることができる。さらに育毛剤は、頭髪における脱毛進行予防剤として毛乳頭細胞を増殖させることにより、毛乳頭細胞の減少によって発生する脱毛の進行を抑制ならびに予防する目的で用いることもできる。
【0050】
育毛剤は、経口的にまたは非経口的に種々の形態で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合、たとえば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤などの剤型とすることができる。さらに上述した剤型の育毛剤を、飲食品に混合することもできる。育毛剤は、たとえば上述したアミノ酸、アミノ酸の組み合わせ、またはペプチドの少なくともいずれかを含むが、これらは腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。
【0051】
育毛剤は、非経口的に投与する場合、たとえば軟膏、クリーム、ローションなどの外用剤、経皮剤などの剤型とすることができる。さらに頭皮に直接塗り込むための液剤または塗布剤とすることもできる。
【0052】
育毛剤の投与量は、対象者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、製剤の種類などによって異なる。上記育毛剤を経口投与する場合、投与量は、たとえば成人１日あたり０．０００１～２５００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。育毛剤は、その剤型がたとえば錠剤である場合、１錠当たり０．００１～８０質量％で育毛剤が含まれる錠剤とし、たとえば粉剤である場合、０．００１～１００質量％で育毛剤が含まれる粉剤とすることができる。上記投与量は、非経口的に投与する場合、その他の形態の製剤によって投与する場合などにおいて、経口投与の場合の投与量を参考にして適宜決めることができる。育毛剤は、１日１～数回に分けて投与することができ、あるいは１～数日に１回投与することもできる。
【0053】
育毛剤は、本発明の効果に悪影響を及ぼさない範囲で、他の有効成分、製剤用の担体などを適宜含有させることができる。他の有効成分として、イヌリン、コーヒー酸、キナ酸およびこれらの誘導体、マジョラムからの抽出物、金不換、ヒメハギ（遠志）および白眉草、仮鷹爪などの各種の生薬、ローヤルゼリー、エキナセアからの抽出物、アサイーからの抽出物、クプアスからの抽出物などを挙げることができる。さらに医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担体としては、希釈剤、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（乳糖、ショ糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（バレイショデンプン）および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム）などを挙げることができる。
【0054】
〔用途発明〕
本発明に係る育毛剤は、上述のようにＨｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。育毛剤は、上述したアミノ酸、またはペプチドの未知の属性として毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。換言すれば本発明は、頭髪における発毛または育毛の促進用、あるいは脱毛進行予防用の上記アミノ酸またはペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体であるといえる。
本発明に係る育毛剤は、上述のようにＨｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸またはペプチド、もしくはそれらの塩、あるいはそれらの化学修飾体を含有する。育毛剤は、上述したアミノ酸、またはペプチドの未知の属性として毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって頭髪における発毛または育毛の促進作用、あるいは脱毛進行予防作用の少なくともいずれかを奏することができる。換言すれば本発明は、頭髪における発毛または育毛の促進用、あるいは脱毛進行予防用の上記アミノ酸またはペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体であるといえる。
【0055】
［飲食品］
本発明に係る飲食品は、上記育毛剤を含む。たとえば育毛剤に含まれることが好ましい上記のペプチドは、上述のとおり腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。したがって、本発明は、上記育毛剤を含む飲食品として食事または飲料に混ぜて摂取することができる。さらに本発明に係る飲食品は、特定保健用食品、または機能性表示食品として用いることもできる。飲食品に含まれる育毛剤の濃度としては、０．００１～１００質量％であることが好ましい。
本発明に係る飲食品は、上記育毛剤を含む。たとえば育毛剤に含まれることが好ましい上記のペプチドは、上述のとおり腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。したがって、本発明は、上記育毛剤を含む飲食品として食事または飲料に混ぜて摂取することができる。さらに本発明に係る飲食品は、特定保健用食品、または機能性表示食品として用いることもできる。飲食品に含まれる育毛剤の濃度としては、０．００１～１００質量％であることが好ましい。
【実施例0056】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0057】
［実施例１：細胞生物学的試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）］
〔試料の準備〕
＜アミノ酸、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物の準備＞
毛乳頭細胞に対する細胞増殖促進作用を評価する試料として、後述する表１～２に表すアミノ酸、アミノ酸の組合せ、ジペプチド、トリペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物を、上述した方法により製造し、または後述するメーカーから入手することにより準備した。
〔試料の準備〕
＜アミノ酸、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物の準備＞
毛乳頭細胞に対する細胞増殖促進作用を評価する試料として、後述する表１～２に表すアミノ酸、アミノ酸の組合せ、ジペプチド、トリペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物を、上述した方法により製造し、または後述するメーカーから入手することにより準備した。
【0058】
ここで表１中に表されるアミノ酸、アミノ酸の組合せおよびペプチドは、アミノ酸を一文字で表記する略号を用いる。表１中、「ＰＯ」は、プロリン－ヒドロキシプロリンで表されるジペプチド（商品名：「Ｇ－３０２５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）であり、「ＯＧ」は、ヒドロキシプロリン－グリシンで表されるジペプチド（商品名：「Ｇ－２３６５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）である。「ＧＰＯ」は、グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリンで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。なお「ＰＯ」は、Ｎ末端側からプロリン、ヒドロキシプロリンの順にＣ末端側へ向けて配列したペプチドを意味する。このことは、「ＰＯ」以外のペプチドの記載についても同様である。
【0059】
さらに表１中、「ＡＯＧ」は、アラニン－ヒドロキシプロリン－グリシンで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）であり、「ＥＯＧ」は、グルタミン酸－ヒドロキシプロリン－グリシンで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。「ＳＯＧ」は、セリン－ヒドロキシプロリン－グリシンで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）であり、「ＧＰ」は、グリシン－プロリンで表されるジペプチド（商品名：「Ｇ－３０１５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）である。「ＬＯ」は、ロイシン－ヒドロキシプロリンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）であり、「ＦＯ」は、フェニルアラニン－ヒドロキシプロリンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）であり、「ＥＯ」は、グルタミン酸－ヒドロキシプロリンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。
【0060】
「ＰＡ」は、プロリン－アラニンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）であり、「ＰＡＧ」は、プロリン－アラニン－グリシンで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。「ＰＧ」は、プロリン－グリシンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。「ＰＰ」は、プロリン－プロリンで表されるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）である。「Ｏ」は、ヒドロキシプロリン（商品名：「０８０－０１６４２」、富士フィルム和光純薬株式会社製）であり、「Ｇ」は、グリシン（商品名：「０７３－００７３２」、富士フィルム和光純薬株式会社製）であり、「Ｐ」は、プロリン（商品名：「１６１－０４６０２」、富士フィルム和光純薬株式会社製）であり、「Ｐ＋Ｏ」は、上記プロリンとヒドロキシプロリンとの組合せであり、「Ｏ＋Ｇ」は、上記ヒドロキシプロリンとグリシンとの組合せである。
【0061】
さらに、表２中に表されるコラーゲンペプチド混合物Ａ（商品名：「ＴＹＰＥ－Ｓ」、新田ゼラチン株式会社製、重量平均分子量（Ｍｗ）：約７５０Ｄａ）は、後述する条件で実行したＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析において、以下の組成を含んでいた。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：７３８９ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１９９ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：９ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１７６ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：１１５９ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２２２９ｐｐｍ、合計：１１１７７ｐｐｍ。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：７３８９ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１９９ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：９ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１７６ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：１１５９ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２２２９ｐｐｍ、合計：１１１７７ｐｐｍ。
【0062】
表２中に表されるコラーゲンペプチド混合物Ｂ（商品名：「コラペプＰＵ」、新田ゼラチン株式会社製、重量平均分子量（Ｍｗ）：約６３０Ｄａ）は、後述する条件で実行したＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析において、以下の組成を含んでいた。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：３４４７ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：３６ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４３６ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１２０ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：２３７９ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２６４５ｐｐｍ、合計：９０７４ｐｐｍ。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：３４４７ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：３６ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４３６ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１２０ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：２３７９ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２６４５ｐｐｍ、合計：９０７４ｐｐｍ。
【0063】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析は、次の条件で実行した。
ＨＰＬＣ装置：「ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ」、Ｗａｔｅｒｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
カラム：「Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ ２．１×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ． Ｉｎｃ製）
カラム温度：４０℃（リニアグラジエント）
移動相：（Ａ）０．２％ギ酸および２ｍＭ酢酸アンモニウム含有水溶液
（Ｂ）１００％メタノール
（グラジエント設定）
Ｔｉｍｅ（分） 流速（μＬ／分） 移動相（Ａ）の質量％
イニシャル ２００ ９８
３．５０ ２００ ９８
３．５１ ４００ ５
７．００ ４００ ５
７．１０ ２００ ９８
１７．００ ２００ ９８
注入量：０．５μｌ。
ＨＰＬＣ装置：「ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ」、Ｗａｔｅｒｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
カラム：「Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ ２．１×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ． Ｉｎｃ製）
カラム温度：４０℃（リニアグラジエント）
移動相：（Ａ）０．２％ギ酸および２ｍＭ酢酸アンモニウム含有水溶液
（Ｂ）１００％メタノール
（グラジエント設定）
Ｔｉｍｅ（分） 流速（μＬ／分） 移動相（Ａ）の質量％
イニシャル ２００ ９８
３．５０ ２００ ９８
３．５１ ４００ ５
７．００ ４００ ５
７．１０ ２００ ９８
１７．００ ２００ ９８
注入量：０．５μｌ。
【0064】
ＭＳ／ＭＳ装置：「Ｘｅｖｏ ＴＱ－ＸＳ」、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製
イオン化法：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＥＳＩ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ （ｋＶ）：１
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：５００
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：１５０
ＭＲＭ条件：
ペプチド（略号） precursor ion（m/z） product ion（m/z）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＰ） １７３ １１６
Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＯＧ） １８９ ８６
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＰＯ） ２２９ １３２
Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＡＯＧ） ２６０ １８９
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ） ３１８ ２２５
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＧＰＯ） ２８６ １５５
Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＳＯＧ） ２７６ １８９
Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（ＰＡＧ） ２４４ １４１。
イオン化法：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＥＳＩ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ （ｋＶ）：１
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：５００
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：１５０
ＭＲＭ条件：
ペプチド（略号） precursor ion（m/z） product ion（m/z）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＰ） １７３ １１６
Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＯＧ） １８９ ８６
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＰＯ） ２２９ １３２
Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＡＯＧ） ２６０ １８９
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ） ３１８ ２２５
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＧＰＯ） ２８６ １５５
Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＳＯＧ） ２７６ １８９
Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（ＰＡＧ） ２４４ １４１。
【0065】
＜毛乳頭細胞の準備＞
まず、ヒト正常毛乳頭細胞ＨＦＤＰＣ－Ｃ（タカラバイオ株式会社製）を入手し、次いで上記毛乳頭細胞を細胞培養用９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに０．２×１０4個／ｄｉｓｈとなるように播種した。さらに上記毛乳頭細胞の入手時に付属していた成長因子を含む基本培地（商品名：「Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ」、タカラバイオ株式会社製）を、各ウェルに対し２００μＬずつ供給するとともに、各ウェル中で上記毛乳頭細胞を２４時間、３７℃で前培養した。
まず、ヒト正常毛乳頭細胞ＨＦＤＰＣ－Ｃ（タカラバイオ株式会社製）を入手し、次いで上記毛乳頭細胞を細胞培養用９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに０．２×１０4個／ｄｉｓｈとなるように播種した。さらに上記毛乳頭細胞の入手時に付属していた成長因子を含む基本培地（商品名：「Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ」、タカラバイオ株式会社製）を、各ウェルに対し２００μＬずつ供給するとともに、各ウェル中で上記毛乳頭細胞を２４時間、３７℃で前培養した。
【0066】
次に、上記毛乳頭細胞がサブコンフルエントになったことを確認した後、各ウェル中の上記基本培地を、上述した成長因子を含まない別の基本培地（商品名：「Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ」、タカラバイオ株式会社製）２００μＬに置換した。以上により、上記試料を添加することによって細胞増殖が促進するか否かを判断するための毛乳頭細胞を準備した。
【0067】
〔細胞増殖試験〕
上述のように準備された毛乳頭細胞に対し、上記の各試料であるアミノ酸、アミノ酸の組合せ、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物を表１～２に示す最終濃度となるように添加するとともに、各ウェル中で上記毛乳頭細胞を７２時間、３７℃で培養した。ここで上述のように準備された毛乳頭細胞を含むウェルの一つに対し、精製水を２０μＬ添加し、他の毛乳頭細胞と同様に７２時間、３７℃で培養することにより対照試験体（コントロール）を準備した。その後、精製水または各試料を添加したウェル中の毛乳頭細胞に対し、それぞれニュートラルレッド法により生存している細胞数（生細胞数）をカウントした。ここで「ニュートラルレッド法」とは、細胞が培養されているウェル中へ最終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにニュートラルレッドを添加し、２０分培養した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、さらに上記ウェル中へ抽出液として１質量％酢酸を含む５０質量％エタノール溶液２００μＬ添加し、撹拌する。その後、ニュートラルレッドを含む上記ウェルの波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、上記ウェル中の生細胞数を測定する方法をいう。
上述のように準備された毛乳頭細胞に対し、上記の各試料であるアミノ酸、アミノ酸の組合せ、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物を表１～２に示す最終濃度となるように添加するとともに、各ウェル中で上記毛乳頭細胞を７２時間、３７℃で培養した。ここで上述のように準備された毛乳頭細胞を含むウェルの一つに対し、精製水を２０μＬ添加し、他の毛乳頭細胞と同様に７２時間、３７℃で培養することにより対照試験体（コントロール）を準備した。その後、精製水または各試料を添加したウェル中の毛乳頭細胞に対し、それぞれニュートラルレッド法により生存している細胞数（生細胞数）をカウントした。ここで「ニュートラルレッド法」とは、細胞が培養されているウェル中へ最終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるようにニュートラルレッドを添加し、２０分培養した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、さらに上記ウェル中へ抽出液として１質量％酢酸を含む５０質量％エタノール溶液２００μＬ添加し、撹拌する。その後、ニュートラルレッドを含む上記ウェルの波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、上記ウェル中の生細胞数を測定する方法をいう。
【0068】
さらに、精製水を添加したウェル中の毛乳頭細胞（対照試験体）の生細胞数に対する各試料を添加したウェル中の毛乳頭細胞の生細胞数を細胞増殖率（％）として求めることにより、各試料が有する毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を評価した。さらに上記細胞増殖率（％）を統計処理することにより、各試料が有する毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用の有意性を評価した。この有意性の評価は、統計処理としてソフトウエア（商品名：「エクセル統計（Ｖｅｒ２．１）」、株式会社社会情報サービス製」を用い、Ｓｍｉｒｎｏｖ－Ｇｒｕｂｂｓ（両側検定）を実行し、かつ有意水準（Ｐ値）として０．０５をしきい値に設定した。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ（ｔ検定）を実行することにより判断することとした。結果を表１および表２に示す。表１～２中、「＋＋」が付された試料において、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用に有意性があると判断された。「＋」が付された試料では、細胞増殖率（％）が１００を超えた。
【0069】
【表1】
【0070】
【表2】
【0071】
〔考察〕
表１～２によれば、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸、またはペプチドは、いずれも毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有することが分かった。これらのアミノ酸、またはペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物も、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有していた。さらにＰｒｏおよびＨｙｐのアミノ酸の組合せ、ＨｙｐおよびＧｌｙのアミノ酸の組合せも、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有していた。これにより上記アミノ酸およびペプチド、ならびにこれらを含むコラーゲンペプチド混合物は、育毛剤として、具体的には毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤として有効であることが示唆された。
表１～２によれば、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｐｈｅ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙならびにＳｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸、またはペプチドは、いずれも毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有することが分かった。これらのアミノ酸、またはペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物も、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有していた。さらにＰｒｏおよびＨｙｐのアミノ酸の組合せ、ＨｙｐおよびＧｌｙのアミノ酸の組合せも、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有していた。これにより上記アミノ酸およびペプチド、ならびにこれらを含むコラーゲンペプチド混合物は、育毛剤として、具体的には毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤、頭髪における発毛または育毛の促進剤、あるいは脱毛進行予防剤として有効であることが示唆された。
【0072】
［実施例２：ヘアレスマウスを用いた発毛効果および育毛効果の確認試験（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）］
生後８週齢の雌雄が混在したヘアレスマウス３０匹を、星野実験動物株式会社から入手することにより準備した。上記ヘアレスマウスについて、雌雄を区別することなく６匹ずつ次の５群に分けた。すなわち上記の複数群は、通常飼料（商品名：「ラボＭＲストック」、日本農産工業株式会社製）を与えたノーマル群と、マグネシウム欠乏特殊飼料（商品名：「ＨＲ－ＡＤ飼料」、日本農産工業株式会社製）を与えたコントール群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料にＰｒｏ－Ｈｙｐを、その含有量が０．３質量％となるように加えた混餌を与えた第１群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料に上記コラーゲンペプチド混合物Ａを、その含有量が５質量％となるように加えた混餌を与えた第２群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料に後述する組成からなるコラーゲンペプチド混合物Ｃを、その含有量が２．５質量％となるように加えた混餌を与えた第３群とからなる。
生後８週齢の雌雄が混在したヘアレスマウス３０匹を、星野実験動物株式会社から入手することにより準備した。上記ヘアレスマウスについて、雌雄を区別することなく６匹ずつ次の５群に分けた。すなわち上記の複数群は、通常飼料（商品名：「ラボＭＲストック」、日本農産工業株式会社製）を与えたノーマル群と、マグネシウム欠乏特殊飼料（商品名：「ＨＲ－ＡＤ飼料」、日本農産工業株式会社製）を与えたコントール群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料にＰｒｏ－Ｈｙｐを、その含有量が０．３質量％となるように加えた混餌を与えた第１群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料に上記コラーゲンペプチド混合物Ａを、その含有量が５質量％となるように加えた混餌を与えた第２群と、上記マグネシウム欠乏特殊飼料に後述する組成からなるコラーゲンペプチド混合物Ｃを、その含有量が２．５質量％となるように加えた混餌を与えた第３群とからなる。
【0073】
上記コラーゲンペプチド混合物Ｃは、新田ゼラチン株式会社が開発中のコラーゲンペプチド混合物であって、上述した条件で実行したＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析において、以下の組成を含んでいた。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：１２７７２ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：６３５３ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：３２０１０ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４５４ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：２４ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：２３９ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：２６３８７ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２１８３ｐｐｍ、合計：８０４２２ｐｐｍ。
Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：１２７７２ｐｐｍ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：６３５３ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：３２０１０ｐｐｍ、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：４５４ｐｐｍ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：２４ｐｐｍ、Ｓｅｒ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：２３９ｐｐｍ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：２６３８７ｐｐｍ、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ：２１８３ｐｐｍ、合計：８０４２２ｐｐｍ。
【0074】
上記の各群のヘアレスマウスを、温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、照明サイクル１２時間、明期７：００～１９：００、自由摂食の条件の下で３週間飼育し、生後１１週齢としたときの頭部を観察した。ここでヘアレスマウスは、生後２週齢を経過すると脱毛が始まり、生後４週齢頃には無毛になることが知られる。入手時において、上記ヘアレスマウスの頭部は無毛であった。図１は、マグネシウム欠乏特殊飼料を与えたコントール群の生後１１週齢のヘアレスマウスの頭部を示す。図２は、Ｐｒｏ－Ｈｙｐを含むマグネシウム欠乏特殊飼料を与えた第１群の生後１１週齢のヘアレスマウスの頭部を示す。
【0075】
【0076】
さらに脱毛が始まる前である生後２週齢のヘアレスマウスを星野実験動物株式会社から入手し、当該ヘアレスマウスの頭髪量を１０とした場合において、各群の生後１１週齢におけるヘアレスマウスの頭髪量を目視により測定した。結果を、表３に示す。表中の数値は、各群における６匹のヘアレスマウスの頭髪量の平均値を表す。
【0077】
【表3】
【0078】
〔考察〕
上記によれば、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、コラーゲンペプチド混合物Ａおよびコラーゲンペプチド混合物Ｃは、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって育毛剤として、具体的には毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤、頭髪における発毛および育毛の促進剤、ならびに脱毛進行予防剤として有効であることが示唆された。
上記によれば、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、コラーゲンペプチド混合物Ａおよびコラーゲンペプチド混合物Ｃは、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有し、もって育毛剤として、具体的には毛乳頭細胞の細胞増殖促進剤、頭髪における発毛および育毛の促進剤、ならびに脱毛進行予防剤として有効であることが示唆された。
【0079】
［実施例３：対照試験（細胞生物学的試験：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）］
〔試料の準備〕
＜アミノ酸、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物の準備＞
毛乳頭細胞に対する細胞増殖促進作用を評価する試料として、市販のアミノ酸であるアラニン（商品名：「Ｌ－アラニン」、関東化学株式会社製、カタログ番号：０１１０１－３０）、アルギニン（商品名：「Ｌ－アルギニン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：０１５－０４６１３）、グルタミン（商品名：「Ｌ－グルタミン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：０７４－００５２２）およびプロリン（商品名：「Ｌ－プロリン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：１６１－０４６０２）を準備した。
〔試料の準備〕
＜アミノ酸、ペプチドおよびコラーゲンペプチド混合物の準備＞
毛乳頭細胞に対する細胞増殖促進作用を評価する試料として、市販のアミノ酸であるアラニン（商品名：「Ｌ－アラニン」、関東化学株式会社製、カタログ番号：０１１０１－３０）、アルギニン（商品名：「Ｌ－アルギニン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：０１５－０４６１３）、グルタミン（商品名：「Ｌ－グルタミン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：０７４－００５２２）およびプロリン（商品名：「Ｌ－プロリン」、富士フィルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：１６１－０４６０２）を準備した。
【0080】
＜毛乳頭細胞の準備＞
上述した実施例１における＜毛乳頭細胞の準備＞の項目で説明したことと同じ方法により、毛乳頭細胞を準備した。
上述した実施例１における＜毛乳頭細胞の準備＞の項目で説明したことと同じ方法により、毛乳頭細胞を準備した。
【0081】
〔細胞増殖試験〕
上述した実施例１における〔細胞増殖試験〕の項目で説明したことと同じ要領により、各試料（アミノ酸）が有する毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用およびその有意性を評価した。結果を表４に示す。いずれの試料においても、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有意に示すとは認められなかった。
上述した実施例１における〔細胞増殖試験〕の項目で説明したことと同じ要領により、各試料（アミノ酸）が有する毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用およびその有意性を評価した。結果を表４に示す。いずれの試料においても、毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有意に示すとは認められなかった。
【0082】
【表4】
【0083】
〔考察〕
表４によれば、アラニン、アルギニン、グルタミンおよびプロリンは毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用がネガティブであり、Ｈｙｐなどの特定のアミノ酸に限って毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有することが示唆された。
表４によれば、アラニン、アルギニン、グルタミンおよびプロリンは毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用がネガティブであり、Ｈｙｐなどの特定のアミノ酸に限って毛乳頭細胞の細胞増殖促進作用を有することが示唆された。
【0084】
以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
【0085】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
