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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024150853
(43)【公開日】2024-10-24
(54)【発明の名称】ＲＮＡの検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6816 20180101AFI20241017BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20241017BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241017BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20241017BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6886 Z
C12N15/12
C12N9/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023063850
(22)【出願日】2023-04-11
(71)【出願人】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】若尾 摂
(72)【発明者】
【氏名】中寺 康仁
(72)【発明者】
【氏名】上田 洋二
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA12
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
(57)【要約】
【課題】本発明は、ＲＮＡを高感度かつ特異的に検出することを目的とする。
【解決手段】本発明は、５６℃で５分間加温することで活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素で検出対象となるＲＮＡの５’末端を脱リン酸化し、前記酵素を６０℃以上８０℃以下で失活させ、テトラアルキルアンモニウム塩存在下ハイブリダイゼーションを行う工程を経ることを特徴とするＲＮＡの検出方法である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、５６℃で５分間加温することで活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素で検出対象となるＲＮＡの５’末端を脱リン酸化し、前記酵素を６０℃以上８０℃以下で失活させ、テトラアルキルアンモニウム塩存在下ハイブリダイゼーションを行う工程を経ることを特徴とするＲＮＡの検出方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のＲＮＡを検出する方法であって
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法。
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
テトラアルキルアンモニウム塩及び５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキット。
【請求項5】
検出対象のＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項４に記載のキット。
【請求項6】
テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、請求項４または５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡの検出方法およびＲＮＡ検出用のキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡマイクロアレイは、支持体上に固相化したプローブＤＮＡと検出対象核酸とのハイブリダイゼーション反応を検出原理としている。より多くの検出対象核酸を捉えるため、複数のプローブＤＮＡを支持体上に固定化して用いるが、精度良く検出するためには、検出対象核酸に特異的な配列を持つように設計したプローブＤＮＡを用いる必要がある。ゲノムＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡの検出においては、塩基配列の相同性を指標に、他の分子と相同性の低い領域を選択し、２０塩基～１００塩基程度の長さのプローブＤＮＡを合成して用いることが行われている。また、プローブ設計時には、ハイブリダイゼーション強度の指標であるＴｍ値を計算し、複数のプローブＤＮＡ間でＴｍ値に差が生じないよう工夫されている。
【0003】
特異的に検出するための別のアプローチとして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めることで、類似配列のハイブリダイゼーションを抑える方法が行われている。具体的には、ハイブリダイゼーション反応温度や、ハイブリ反応溶液中の塩強度、ホルムアミドの添加等で、適宜調整することができる。
【0004】
また、ＲＮＡの検出における特異度向上の方法として、テトラメチルアンモニウム塩共存下でＬＡＭＰ法による検出を行うことにより、プライマーとのハイブリダイゼーション配列依存性を低下させることで、検出の特異度を向上させる方法が報告されている（特許文献１）。
【0005】
近年、ｍｉＲＮＡは、細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その存在量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。ｍｉＲＮＡはヒトにおいて２６００種以上が存在し、高感度なＤＮＡマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの１０００種を超えるｍｉＲＮＡの発現を血清・血漿中で同時に検出することが可能である。そこで、ＤＮＡマイクロアレイを用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されており、疾患を早期に発見できるバイオマーカー検査への展開が期待されている。ｍｉＲＮＡの検出精度について、マイクロアレイを含むいくつかの検出技術を用いた比較評価がなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００８－２７８７７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＲＮＡ検出の特異性を高めるため、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高くすると、Ｔｍ値の低いＲＮＡが検出できなくなる。このためマイクロアレイでＲＮＡを特異的に検出することと、多くのＲＮＡを検出できる感度を両立させることは、困難であった。特に、ｍｉＲＮＡは１５～２５塩基と短く、特異的な配列を選択してプローブＤＮＡを設計することは困難であることから、プローブ配列による特異性の確保やＴｍ値を揃えることが困難であった。
【0008】
発明者は、試料中のｍｉＲＮＡを、プローブＤＮＡの固定化された担体と接触させることで検出することを試みた。具体的には、一般的な脱リン酸化酵素であるタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を、試料に作用させて前記ｍｉＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去し、得られた反応液を、一般的なアルカリホスファターゼ失活処理温度である１００℃に加温することで、前記アルカリホスファターゼを失活させた。得られた反応液に含まれる当該ｍｉＲＮＡを、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼによって蛍光色素標識し、得られた反応液を、前記ｍｉＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて当該ｍｉＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせることによって、ｍｉＲＮＡを検出した（比較例１）。しかし、ハイブリダイゼーションの特異性が低いという問題があった。
【0009】
そこで、特許文献１を参考に、テトラアルキルアンモニウム塩を用いてハイブリダイゼーション配列依存性を低下させることで、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることを試みた。具体的には、前記プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの工程において、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）存在下でハイブリダイゼーションを行うことで検出の特異度の向上を試みた（比較例２）。しかし、この場合は検出感度が低下するという問題が生じた。
【0010】
このように、ＲＮＡの５’末端脱リン酸化を経る、ハイブリダイゼーションによるＲＮＡの検出において、特にｍｉＲＮＡの検出において、検出の特異度を向上させるためにテトラメチルアンモニウムクロリドを用いた場合、高感度での検出は困難であった。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、テトラアルキルアンモニウム塩を含む溶液を用いたハイブリダイゼーションによるＲＮＡの検出において、ｍｉＲＮＡの５’末端脱リン酸化のために、低温で失活する脱リン酸化酵素を用いることで、特異的かつ高感度に検出できることを見出した。
【0012】
すなわち、本発明は
（１）試料中のＲＮＡを検出する方法であって
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法。
（２）前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（１）に記載の方法。
（３）テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）テトラアルキルアンモニウム塩及び５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキット。
（５）検出対象のＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（４）に記載のキット。
（６）テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、（４）または（５）に記載のキット。
（１）試料中のＲＮＡを検出する方法であって
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法。
（２）前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（１）に記載の方法。
（３）テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）テトラアルキルアンモニウム塩及び５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキット。
（５）検出対象のＲＮＡがマイクロＲＮＡである、（４）に記載のキット。
（６）テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、（４）または（５）に記載のキット。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、ＲＮＡを高感度で検出することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、試料中のＲＮＡを検出する方法であって
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法である。
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法である。
【0015】
１．試料について
本発明を適用できる試料は検出対象となるＲＮＡを含むと期待されるものであればよい。本発明の試料としては、生物試料を用いることができる。
本発明を適用できる試料は検出対象となるＲＮＡを含むと期待されるものであればよい。本発明の試料としては、生物試料を用いることができる。
【0016】
生体試料は、例えば、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液や、各種組織、パラフィン包埋検体（FFPE）およびその切片、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。比較解析する複数の検体は、異なる組織に由来する複数の検体でもよいし、異なる生体から分離された同一の組織に由来する複数の検体でもよく、また、同一組織内の異なる部位（例えば、腫瘍等の病変部と非病変部）に由来する複数の検体でもよい。
【0017】
本発明において検出対象となるＲＮＡは複数のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合したリボ核酸であって、その分子量、塩基数や由来によって限定されない。本発明において検出対象となるＲＮＡは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（低分子一過性ＲＮＡ）を含むｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｈｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連ＲＮＡ）を含む。本発明において検出対象となるＲＮＡは細胞外液ＲＮＡ、循環ＲＮＡのほか、生物試料中に存在し得る微生物、寄生生物またはＲＮＡウイルスから得られるＲＮＡも含む。また、本発明において検出対象となるＲＮＡは、生体試料から分離したＲＮＡおよび化学的に合成したＲＮＡを含む。好ましくは、検出対象となるＲＮＡは、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ群から選択される。ハイブリダイゼーションで高感度に検出することが困難であるｍｉＲＮＡの検出において特に本発明が有効であることから、検出対象となるＲＮＡはさらに好ましくはｍｉＲＮＡである。
【0018】
２．脱リン酸化酵素について
本発明において用いる脱リン酸化酵素は、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去できる酵素である。本発明において用いる脱リン酸化酵素は、アルカリホスファターゼを含む。
本発明において用いる脱リン酸化酵素は、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去できる酵素である。本発明において用いる脱リン酸化酵素は、アルカリホスファターゼを含む。
【0019】
本発明において用いる脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする。例えば、一般的な脱リン酸化酵素として子牛胸腺由来アルカリホスファターゼを用いた場合には、失活のためには１００℃、５分での加温処理といった、高温での処理を要する。これに対して本発明で用いる脱リン酸化酵素は、一般的な脱リン酸化酵素より低温である、例えば７５℃、５分間の加温処理で失活する。これによって、後述する失活工程（工程ｂ））での温度を低下させることが可能となる。このため、当該失活工程における、検出対象となるＲＮＡの分解を防ぐことができ、結果として高い感度にてＲＮＡを検出できるという利点がある。また、本発明に用いる脱リン酸化酵素は、当該失活工程において、短時間の加温処理で失活させられることから、操作が簡便であるという利点も有する。
【0020】
本発明において用いる５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素の例としては、ロシュ社のrAPidアルカリホスファターゼ（型番４８９８１３３００１）、ニッポンジーン社のAlkaline Phosphatase, recombinant (Calf intestine)（型番３１２－０８０１１）、ニューイングランドバイオラボ社のQuick CIP（型番Ｍ０５２５Ｓ）を挙げることができる。
【0021】
任意の脱リン酸化酵素が本発明において用いる脱リン酸化酵素に該当するか否かを判定するためには、以下のような試験を行う。
【0022】
市販されている脱リン酸化酵素の活性を評価する場合には、当該酵素に添付されている反応緩衝液、またはメーカー推奨の反応緩衝液を用いて加温する。自ら製造した脱リン酸化酵素を評価する場合には、適宜、当該酵素を用いた反応に適した反応緩衝液を用いて加温する。加温の際の酵素濃度は、１ユニット／μＬとする。脱リン酸化酵素活性を評価するために、酵素溶液を希釈して用いる場合には前述の反応緩衝液を用いて希釈する。
【0023】
脱リン酸化酵素活性の低下を評価するためには上記緩衝液中で５６℃で５分間加温する。５６℃で加温することで失活反応が緩やかに進み、脱リン酸化酵素の活性低下を正確に評価することができる。
【0024】
上記加温後の酵素活性の評価は、市販の脱リン酸化酵素の活性定量キットであるAttoPhos（登録商標） AP Fluorescent Substrate System（プロメガ社、型番Ｓ１０００）を用いて実施する。励起光：４４４ｎｍ、蛍光：５５５ｎｍでの蛍光測定によって酵素活性を測定し、酵素活性が５０％であれば、評価対象の酵素は本発明において用いる脱リン酸化酵素に該当すると判断される。
【0025】
３．５’末端脱リン酸化工程（工程ａ））について
本発明の工程ａ）は、試料に脱リン酸化酵素を作用させることで、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程である。
本発明の工程ａ）は、試料に脱リン酸化酵素を作用させることで、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程である。
【0026】
例えば後述するＲＮＡ検出のためにＴ４ ＲＮＡ リガーゼを用いて検出対象となるＲＮＡを標識する場合、５’末端にリン酸基が残存していると、所望の標識化反応の他に、検出対象のＲＮＡが分子間で結合する、望まない副反応を起こすという問題がある。このような場合には、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去してから当該標識を行う必要がある。
【0027】
本発明の工程ａ）において、脱リン酸化酵素は、検出対象となるＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する反応に用いる。
【0028】
リン酸基の除去反応の後、後の工程において脱リン酸化酵素が標識体に作用することを防ぐため、加温等により脱リン酸化酵素の酵素活性を失わせる必要がある。
【0029】
４．脱リン酸化酵素失活工程（工程ｂ））について
本発明の工程ｂ）は、工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程である。
本発明の工程ｂ）は、工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程である。
【0030】
前述の通り、本発明において用いる脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴としている。当該酵素を、後述の好ましい反応時間、６０℃以上８０℃以下に加温すると、５６℃の場合より速やかに酵素活性の低下が進み、失活する。
【0031】
このように失活工程を行うことで、前述のような失活工程における検出対象となるＲＮＡの加水分解によるＲＮＡ検出感度の低下の問題は回避でき、後の工程における、残存する脱リン酸化酵素が引き起こす標識体への副反応も抑制することができる。
【0032】
失活工程における好ましいｐＨは、７．０以上１２．０以下であり、好ましくは７．０以上１１．０以下であり、最も好ましくは７．５以上９．０以下である。
【0033】
前述の通り本発明の失活工程における温度は６０℃以上８０℃以下であるが、好ましくは６５℃以上７５℃以下である。失活工程の好ましい反応時間は１分以上１５分以下であり、さらに好ましくは２分以上１０分以下であり、最も好ましくは３分以上７分以下である。
【0034】
脱リン酸化酵素が完全に失活できているか評価する方法は、失活処理した後に残存する活性を測定すればよい。酵素活性の評価方法は、当業者が適宜設定することができるが、例えば、米国特許第５７７３２２６号明細書に記載の方法や、市販の脱リン酸化酵素の活性定量キットであるAttoPhos（登録商標） AP Fluorescent Substrate System（プロメガ社、型番Ｓ１０００）を用いて実施することができる。本発明においては、このような酵素活性評価によって定量した酵素活性が加温処理前と比較して０．１％以下に低下していれば、脱リン酸化酵素は失活したと判断する。
【0035】
５．ハイブリダイゼーションの工程（工程ｃ））について
本発明の工程ｃ）は、前記工程ｂ）にて得られた検出対象となるＲＮＡを含む反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡと接触させて当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程である。
本発明の工程ｃ）は、前記工程ｂ）にて得られた検出対象となるＲＮＡを含む反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡと接触させて当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程である。
【0036】
核酸のハイブリダイゼーション方法は、ハイブリダイゼーションをテトラアルキルアンモニウム存在下で行うこと以外は、周知の方法で行うことができ、例えば、「Sambrook,J.ら、(1998) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York」に記載された方法を用いることができる。具体的には、予め相補鎖核酸を有するプローブＤＮＡが固定化された支持体に、検出対象となる核酸とテトラアルキルアンモニウム塩を含む溶液を添加し、一定温度にてインキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。テトラアルキルアンモニウム塩の添加前に、検出対象となるＲＮＡを高温にて一定時間熱変性させることで、より核酸結合の特異性を向上させることも可能である。また、検出対象となるＲＮＡ、プローブＤＮＡおよびハイブリダイゼーション用試薬を混合し、一定温度にてインキュベートすることによりハイブリダイゼーションを行った後に、相補鎖核酸プローブを支持体に固定化することも可能である。
【0037】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション溶液中のカオトロピック剤の濃度等によって調整できることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望するＲＮＡの検出のために用意した核酸プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
【0038】
テトラアルキルアンモニウム塩としては、カウンターアニオンとして塩化物イオンを有するものが好ましく、特にテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡＣ）が好ましい。ハイブリダイゼーション溶液中のテトラアルキルアンモニウム塩の終濃度は、適宜決定することができるが、１Ｍ以上４Ｍ以下の範囲が好ましく、より好ましくは２．５Ｍ以上３．５Ｍ以下である。
【0039】
本発明のプローブＤＮＡは、検出対象のＲＮＡと直接的に、かつ選択的に結合し得る物質であり、ＤＮＡからなるものの他、ＤＮＡ誘導体を含むものでもよい。ここでの誘導体は、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【0040】
プローブＤＮＡの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、２０塩基以上とすることが好ましい。そのような鎖長の核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
【0041】
本発明において、プローブＤＮＡとの接触方法は、検出対象となるＲＮＡとプローブＤＮＡとがハイブリダイゼーションを行える温度、濃度および時間で行われるものであれば特に制限はない。
【0042】
プローブＤＮＡは、支持体に固定化されているものが好ましい。支持体に固定化されているプローブＤＮＡとしては、支持体表面の複数の領域に、複数の異なる組成のプローブＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイが好ましい。ＤＮＡマイクロアレイを使用する核酸検出法では、工程ｂ）で得られた反応液に含まれる検出対象となるＲＮＡと、当該ＲＮＡにハイブリダイズし得るプローブを備えるＤＮＡマイクロアレイとを接触させ、プローブＤＮＡにハイブリダイズした当該ＲＮＡを検出することができる。サンプルに検出対象となるＲＮＡ以外の核酸が含まれる場合、当該ＲＮＡとＤＮＡマイクロアレイとを接触させた後、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズしなかった核酸を洗浄等により除去することが好ましい。複数のプローブを備えるＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、２種以上の検出対象となるＲＮＡを同時に検出することができる。
【0043】
ハイブリダイゼーションは、通常のハイブリダイズの条件下において行えばよく、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、5 x SSPE、50％ホルムアミド、5 x Denhardt's solution、0.1～0.5％SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、32℃以上65℃以下程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なえばよい。ただし、適当なアニーリング温度又はハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブとして用いる癌検出用ポリヌクレオチドのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。
【0044】
クロスハイブリダイゼーションとは、検出対象のＲＮＡが、検出対象のＲＮＡに合わせて設計した核酸プローブとは別の核酸プローブに結合する現象のことである。
【0045】
支持体上に固定化されるプローブＤＮＡの種類の数は特に限定されない。例えばｍｉＲＮＡが測定対象である場合、配列が同定されている公知のｍｉＲＮＡの全てを網羅する数の、対応する相補的な配列のプローブＤＮＡを、それぞれ支持体表面上の表面上の異なる領域に固定化したＤＮＡマイクロアレイを用いて、ｍｉＲＮＡの発現量を測定してもよい。
【0046】
ＤＮＡマイクロアレイが、特異的にハイブリダイゼーション可能なものであるか評価するためには、当該ＤＮＡマイクロアレイの、合成ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを用いることができる。
【0047】
すなわち、特異性の評価は、合成したＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイで検出し、検出対象のＲＮＡに対応したプローブＤＮＡでの検出シグナル強度に対して、クロスハイブリダイゼーションによって生じる非捕捉プローブ（すなわち、非検出対象のＲＮＡに対応したプローブＤＮＡ）の検出シグナル強度を比較することで行える。比較の方法は当業者が適宜設定すればよいが、例えば、Ｓ／Ｎ比（捕捉プローブのシグナル強度／非捕捉プローブの検出シグナル強度）を計算することで、測定条件ごとの特異性を比較評価することが容易になる。
【0048】
上記評価で用いる合成ＲＮＡは、１種類のものでもよいし、複数種類の合成ＲＮＡを混和したものでもよい。複数種類の合成ＲＮＡを混和して評価に用いる場合には、検出した複数種類の合成ＲＮＡに対応したプローブＤＮＡの検出シグナル強度の中央値、クロスハイブリダイゼーションによって生じる非捕捉プローブの検出シグナルの中央値を代表値として用いることができる。
【0049】
６．検出工程（工程ｄ））について
本発明の検出工程（工程ｄ））は、工程ｃ）においてプローブＤＮＡに対してハイブリダイズした検出対象のＲＮＡを検出する工程である。
本発明の検出工程（工程ｄ））は、工程ｃ）においてプローブＤＮＡに対してハイブリダイズした検出対象のＲＮＡを検出する工程である。
【0050】
前述の工程ｂ）において脱リン酸化酵素を失活させた後に、検出対象となるＲＮＡを、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体などの標識体によって標識してから工程ｃ）に付してもよい（工程ｂ’））。この場合は、当該標識が発する光や放射線を検出することで当該ＲＮＡを検出することができる。
【0051】
本発明において使用できる標識体としては、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられる。あるいはビオチンを含む標識体を用いて標識し、上述した蛍光色素を結合したストレプトアビジンと反応させて検出することもできる。
【0052】
蛍光色素によって検出対象のＲＮＡが標識されている場合、当該ＲＮＡの検出には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどを用いることができる。
【0053】
検出対象となるＲＮＡが蛍光色素によって標識されている場合の定量方法の一例は、次のとおりである。最初に、脱リン酸化酵素の一種であるアルカリホスファターゼを用いてＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去し、続いてＴ４ ＲＮＡ リガーゼを用いて、３’末端に標識体を取り込ませる。標識したサンプルにハイブリダイゼーション溶液を加えた上で、ＤＮＡマイクロアレイと反応させる。その後、蛍光リーダーを用いて、検出する。
【0054】
上記のＴ４ ＲＮＡ リガーゼを用いた検出対象となるＲＮＡの標識方法は、当該ＲＮＡ一分子に対して標識体が一分子結合するため、標識を定量することによって当該ＲＮＡを定量できることから、例えばＤＮＡマイクロアレイを用いた検出において好ましい。
【0055】
検出対象となるＲＮＡの５’末端を脱リン酸化せずに、ＲＮＡリガーゼを作用させることで、標識が結合したヌクレオチドによって当該ＲＮＡを標識しようとした場合、所望の標識化反応の他に、望まない副反応として検出対象となるＲＮＡ同士が結合するという反応が競合する。この副反応を防ぐためには、前述の脱リン酸化酵素による５’末端脱リン酸化工程（工程ａ））を行う必要がある。このようにして得られた反応液に対して、当該脱リン酸化酵素の活性が残った状態で標識化反応を行った場合、残存する脱リン酸化酵素が標識体への副反応を引き起こすため、本発明の失活工程（工程ｂ））を行う必要がある。
【0056】
検出対象となるＲＮＡが標識されていない場合は、表面プラズモン共鳴による測定方法や、核酸が有する吸収極大である２６０ｎｍの波長の吸光度を測定することでも当該ＲＮＡを検出することができる。
【0057】
７．キットについて
本発明は、前述のテトラアルキルアンモニウム塩および、本発明において用いる脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキットを含む。
本発明は、前述のテトラアルキルアンモニウム塩および、本発明において用いる脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキットを含む。
【0058】
本発明のキットが検出対象とするＲＮＡは、前述の「１．試料について」において検出対象となるＲＮＡとして説明したＲＮＡであればよく、最も好ましくはｍｉＲＮＡである。
【0059】
本発明のキットにおけるテトラアルキルアンモニウム塩は、前述の「５．ハイブリダイゼーションの工程（工程ｃ））について」において説明したテトラアルキルアンモニウム塩であればよく、最も好ましくはテトラメチルアンモニウムクロリドである。
【0060】
本発明のキットにはプローブＤＮＡを含めることができ、プローブＤＮＡは、当該プローブＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイとしてキットに含めることもできる。検出対象となるＲＮＡを当該ＤＮＡマイクロアレイと接触させた後に当該ＤＮＡマイクロアレイを洗浄するための洗浄液をキットに含めることもできる。
【0061】
本発明のキットには、ハイブリダイゼーションの工程（工程ｃ））において、工程ｂ）で得られた反応液を希釈してハイブリダイゼーションに付すための溶液を含めることもできる。前述のテトラアルキルアンモニウム塩は、当該溶液に含有させることで本発明のキットに含ませてもよい。
【0062】
本発明のキットには、検出対象となるＲＮＡを標識するための標識体または標識化のための試薬を含ませてもよい。
【0063】
本発明のキットには、上記の他に試料から検出対象となるＲＮＡを抽出するための試薬、当該抽出物を精製するためのカラム、当該抽出や精製のための遠心用チューブ、使用説明書等を含ませてもよい。
【実施例0064】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例により技術的範囲が限定されるものではない。
【0065】
＜参考例１、２＞
本発明に適した酵素は、次の手順で評価できる。評価対象酵素の反応緩衝液（参考例１は50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH8.5、参考例２は50mM Tris-HCl, 1mM MgCl2,pH9.0）を用いて１ユニット／μＬに希釈したアルカリホスファターゼを、５６℃で５分間加温した加温処理品と、未処理品を用意した。酵素活性測定には、AttoPhos AP Fluorescent Substrate System（プロメガ社、型番Ｓ１０００）を用い、マニュアルに従って実施した。加温処理品及び未処理品について、それぞれ１０－４ユニット／μＬとなるよう希釈した上で、９６well blackプレートに１０μＬずつ分注し、AttoPhos AP Fluorescent Substrateを１５０μＬ添加した。混合した後、室温遮光下で１５分インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した（励起光：４４４ｎｍ、蛍光：５５５ｎｍ）。
本発明に適した酵素は、次の手順で評価できる。評価対象酵素の反応緩衝液（参考例１は50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH8.5、参考例２は50mM Tris-HCl, 1mM MgCl2,pH9.0）を用いて１ユニット／μＬに希釈したアルカリホスファターゼを、５６℃で５分間加温した加温処理品と、未処理品を用意した。酵素活性測定には、AttoPhos AP Fluorescent Substrate System（プロメガ社、型番Ｓ１０００）を用い、マニュアルに従って実施した。加温処理品及び未処理品について、それぞれ１０－４ユニット／μＬとなるよう希釈した上で、９６well blackプレートに１０μＬずつ分注し、AttoPhos AP Fluorescent Substrateを１５０μＬ添加した。混合した後、室温遮光下で１５分インキュベートした後、プレートリーダーで蛍光を測定した（励起光：４４４ｎｍ、蛍光：５５５ｎｍ）。
【0066】
表１に測定結果を示す。参考例１はニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）を測定した結果である。加温処理することにより、酵素活性が２４%まで低下しており、５０％以下であることから、本発明において用いる脱リン酸化酵素に該当する。参考例２として示したタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）は、加温処理後であっても７０％の活性が残っており、５０％を上回っていることから、本発明において用いる脱リン酸化酵素に該当しない。
【0067】
【表1】
【0068】
＜実施例１、比較例１、２＞
（合成ＲＮＡ溶液の調製）
実施例１および比較例１、２においては、ヒトｍｉＲＮＡの配列が登録されているｍｉＲＢａｓｅから無作為に選択した１０７種のｍｉＲＮＡ配列を核酸合成メーカーで合成した。この時、生体内のｍｉＲＮＡと同様になるよう、５’末端にはリン酸基を付与した。合成ＲＮＡはＴＥバッファーに溶解し、各ｍｉＲＮＡの濃度が１００ａｍｏｌ／μＬになるように混和した合成ｍｉＲＮＡカクテルを、本発明の試料として調製した。
（合成ＲＮＡ溶液の調製）
実施例１および比較例１、２においては、ヒトｍｉＲＮＡの配列が登録されているｍｉＲＢａｓｅから無作為に選択した１０７種のｍｉＲＮＡ配列を核酸合成メーカーで合成した。この時、生体内のｍｉＲＮＡと同様になるよう、５’末端にはリン酸基を付与した。合成ＲＮＡはＴＥバッファーに溶解し、各ｍｉＲＮＡの濃度が１００ａｍｏｌ／μＬになるように混和した合成ｍｉＲＮＡカクテルを、本発明の試料として調製した。
【0069】
（ＤＮＡマイクロアレイによる核酸の測定）
実施例１および比較例１、２においては、東レ株式会社製の「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２２対応、２６３２種のｍｉＲＮＡを検出可能）を用いて、以下の実験を行った。
実施例１および比較例１、２においては、東レ株式会社製の「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２２対応、２６３２種のｍｉＲＮＡを検出可能）を用いて、以下の実験を行った。
【0070】
（実施例１）
合成ｍｉＲＮＡカクテル（各合成ｍｉＲＮＡの量は１００ａｍｏｌ）にニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）を４ユニット添加し（工程ａ））、３７℃で３０分反応させた後、酵素を失活させるため７５℃で５分間加温した（工程ｂ））。次にＴ４ ＲＮＡ リガーゼを含む「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（東レ社製）を用いて蛍光標識した（工程ｂ’））。
合成ｍｉＲＮＡカクテル（各合成ｍｉＲＮＡの量は１００ａｍｏｌ）にニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）を４ユニット添加し（工程ａ））、３７℃で３０分反応させた後、酵素を失活させるため７５℃で５分間加温した（工程ｂ））。次にＴ４ ＲＮＡ リガーゼを含む「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（東レ社製）を用いて蛍光標識した（工程ｂ’））。
【0071】
蛍光標識したサンプルは、ＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液（３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１重量％サルコシル、１０容量％ホルムアミド）に添加し、“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐで測定した。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１６時間行った（工程ｃ））。
【0072】
ハイブリダイゼーション後は、“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｍｉＲＮＡ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐのプロトコールに従い、ＤＮＡチップを洗浄した後、蛍光スキャナを用いて測定した（工程ｄ））。
【0073】
各条件で測定した結果は、バックグラウンドノイズを減算し、底が２のログに変換した。その上で、合成ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値、クロスハイブリダイゼーションしたプローブ数及びそれらのシグナル強度中央値、およびＳ／Ｎ比を算出した（表２）。
【0074】
（比較例１）
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例１と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例１と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））は実施例１と同様に、ハイブリダイゼーション（工程ｃ））は、前述のＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液の代わりに、ＴＭＡＣを含まないハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）を用いた点以外は実施例１と同様に行った。
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例１と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例１と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））は実施例１と同様に、ハイブリダイゼーション（工程ｃ））は、前述のＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液の代わりに、ＴＭＡＣを含まないハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）を用いた点以外は実施例１と同様に行った。
【0075】
ハイブリダイゼーション後は、実施例１と同様の方法で測定・計算を行った（工程ｄ））（表２）。
【0076】
（比較例２）
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例１と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例１と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））およびハイブリダイゼーション（工程ｄ））は、実施例１と同様の方法で行った。
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例１と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例１と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））およびハイブリダイゼーション（工程ｄ））は、実施例１と同様の方法で行った。
【0077】
ハイブリダイゼーション後は、実施例１と同様の方法で測定・計算を行った（表２）。
【0078】
（実施例１、比較例１、２の結果）
比較例１は、合成ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値は９．１１、クロスハイブリダイゼーションしたプローブ数が２１５種あり、またＳ／Ｎ比が１．４６であった。
比較例１は、合成ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値は９．１１、クロスハイブリダイゼーションしたプローブ数が２１５種あり、またＳ／Ｎ比が１．４６であった。
【0079】
比較例２は、クロスハイブリダイゼーションしたプローブの数は少ない、すなわち特異度は向上したものの、合成ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値が８．４４まで低下、すなわち感度は低下している。比較例２においてハイブリダイゼーション時にＴＭＡＣを共存させたことにより、検出の特異度が向上したものと考えられる。
【0080】
一方で、実施例１では、クロスハイブリダイゼーションしたプローブ数は比較例１と比べて少なく抑えられた、すなわち特異度が向上した。さらに、合成ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値が１１．６９と高く、またＳ／Ｎ比も２．２４となっている、すなわち感度も向上しており、比較例１、２に比べて良好であることから、本発明の効果が示されたと考える。
【0081】
実施例１では、ＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液を用いることに加え、低温での加温処理で速やかに失活する性質を持つアルカリホスファターゼを用いたために７５℃で失活工程を行うことが可能となった。これによって失活工程におけるｍｉＲＮＡのアルカリ加水分解を防ぐことができ、結果としてシグナル強度中央値が向上、すなわちＲＮＡ検出感度が向上したものと考えられる。
【0082】
【表2】
【0083】
＜実施例２、比較例３、４＞
（ヒト血清中の核酸抽出）
実施例２および比較例３、４においては、「Isogen LS」（ニッポンジーン社）を用い、ヒト血清３００μＬから核酸を含む溶液を取得し、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社、型番217004）を用いてＲＮＡを精製した。ＲＮＡ溶液は遠心濃縮器を用いて４μＬになるように調製した。
（ヒト血清中の核酸抽出）
実施例２および比較例３、４においては、「Isogen LS」（ニッポンジーン社）を用い、ヒト血清３００μＬから核酸を含む溶液を取得し、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社、型番217004）を用いてＲＮＡを精製した。ＲＮＡ溶液は遠心濃縮器を用いて４μＬになるように調製した。
【0084】
（ＤＮＡマイクロアレイによる核酸の測定）
実施例２および比較例３、４においては、東レ株式会社製の「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２２対応、２６３２種のｍｉＲＮＡを検出可能）を用いて、以下の実験を行った。
実施例２および比較例３、４においては、東レ株式会社製の「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」（ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２２対応、２６３２種のｍｉＲＮＡを検出可能）を用いて、以下の実験を行った。
【0085】
（実施例２）
前述のヒト血清中の核酸抽出の工程によって調整した、ヒト血清由来ＲＮＡ２μＬにニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）を４ユニット添加し、３７℃で３０分反応させた後（工程ａ））、酵素を失活させるため７５℃で５分間加温した（工程ｂ））。次にＴ４ ＲＮＡ リガーゼを含む「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（東レ社製）を用いて蛍光標識した（工程ｂ’））。
前述のヒト血清中の核酸抽出の工程によって調整した、ヒト血清由来ＲＮＡ２μＬにニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）を４ユニット添加し、３７℃で３０分反応させた後（工程ａ））、酵素を失活させるため７５℃で５分間加温した（工程ｂ））。次にＴ４ ＲＮＡ リガーゼを含む「“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ」（東レ社製）を用いて蛍光標識した（工程ｂ’））。
【0086】
蛍光標識したサンプルは、ＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液（３Ｍ テトラメチルアンモニウムクロリド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１重量％サルコシル、１０容量％ホルムアミド）に添加し、“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”ｍｉＲＮＡ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐで測定した。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１６時間行った（工程ｃ））。
【0087】
ハイブリダイゼーション後は、“３Ｄ－Ｇｅｎｅ” ｍｉＲＮＡ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐのプロトコールに従い、ＤＮＡチップを洗浄した後、蛍光スキャナを用いて測定した（工程ｄ））。
【0088】
各条件で測定した結果は、バックグラウンドノイズを減算し、底が２のログに変換した。その上で、ヒト血清由来ｍｉＲＮＡのシグナル強度中央値、及び検出したｍｉＲＮＡ数を算出した（表３）。
【0089】
（比較例３）
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例２と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例２と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））は実施例２と同様に、ハイブリダイゼーション（工程ｃ））は、前述のＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液の代わりにＴＭＡＣを含まないハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）を用いた点以外は実施例２と同様に行った。
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例２と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例２と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））は実施例２と同様に、ハイブリダイゼーション（工程ｃ））は、前述のＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液の代わりにＴＭＡＣを含まないハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）を用いた点以外は実施例２と同様に行った。
【0090】
ハイブリダイゼーション後は、実施例２と同様の方法で測定・計算を行った（工程ｄ））（表３）。
【0091】
（比較例４）
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例２と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例２と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））およびハイブリダイゼーション（工程ｃ））は実施例２と同様の方法で行った。
アルカリホスファターゼ処理（工程ａ））は、アルカリホスファターゼとしてニッポンジーン社製アルカリホスファターゼ（型番３１２－０８０１１）の代わりにタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を用いた点以外は実施例２と同様に、アルカリホスファターゼの失活（工程ｂ））は、７５℃ではなく１００℃にて行った点以外は実施例２と同様に、蛍光標識（工程ｂ’））およびハイブリダイゼーション（工程ｃ））は実施例２と同様の方法で行った。
【0092】
ハイブリダイゼーション後は、実施例２と同様の方法で測定・計算を行った（表３）。
【0093】
（実施例２、比較例３、４の結果）
比較例３は、ヒト血清由来ｍｉＲＮＡのシグナル強度中央値が高くまた検出したｍｉＲＮＡ数も多いことがわかる。しかし、比較例１と実施例１の比較から、本測定条件はクロスハイブリダイゼーションが多く生じていることが推察される。実施例２において比較例３と比べてｍｉＲＮＡ数が少ないのは、ハイブリダイゼーション時にＴＭＡＣを共存させたことにより、検出の特異度が向上したことによるものと推察される。
比較例３は、ヒト血清由来ｍｉＲＮＡのシグナル強度中央値が高くまた検出したｍｉＲＮＡ数も多いことがわかる。しかし、比較例１と実施例１の比較から、本測定条件はクロスハイブリダイゼーションが多く生じていることが推察される。実施例２において比較例３と比べてｍｉＲＮＡ数が少ないのは、ハイブリダイゼーション時にＴＭＡＣを共存させたことにより、検出の特異度が向上したことによるものと推察される。
【0094】
ＴＭＡＣ含有ハイブリダイゼーション溶液を用いた比較例４と実施例２を比べると、実施例２ではヒト血清由来ｍｉＲＮＡカクテルのシグナル強度中央値が大きくなっている。実施例２では、低温での加温処理で速やかに失活する性質をもつアルカリホスファターゼを使うことにより７５℃で失活工程を行うことが可能となった。これによって失活工程におけるｍｉＲＮＡのアルカリ加水分解を防ぐことができ、結果としてシグナル強度中央値が向上、すなわちＲＮＡ検出感度が向上したものと考えられる。
【0095】
【表3】