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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024151260
(43)【公開日】2024-10-24
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/10 20060101AFI20241017BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241017BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241017BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241017BHJP
【ＦＩ】
C07K16/10 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023064507
(22)【出願日】2023-04-11
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】河野 響
(72)【発明者】
【氏名】片山 飛鳥
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045BA10
4H045BA42
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）に結合する抗体を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であって、たとえばＶＨＨ等の単一ドメイン抗体、構造ドメインの１又は複数と該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体等である抗体、及び該抗体をコードする核酸を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であって、たとえばＶＨＨ等の単一ドメイン抗体、構造ドメインの１又は複数と該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体等である抗体、及び該抗体をコードする核酸を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項2】
Ｎ－タンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
単一ドメイン抗体又はその多量体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項4】
単一ドメイン抗体がＶＨＨである、請求項３記載の抗体。
【請求項5】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項6】
単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。また、ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる４つのタンパク質と、ＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する（非特許文献１、２）。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（以下、Ｎタンパク質）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムに結合するタンパク質である。ウイルスゲノムのフォールディング・ウイルスタンパク質のアセンブリ・ウイルスの出芽といったウイルス粒子形成に関与するほか、宿主細胞の応答を抑制する機能があることが報告されている（非特許文献３）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されており（非特許文献４）、Ｎタンパク質の数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されており（非特許文献４）、Ｎタンパク質の数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
【0005】
そして、近年のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる新型コロナウイルス感染症の世界的流行を受けて、イムノクロマト法を原理とした抗原検査の如く、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ：簡易迅速検査）の必要性が以前にも増して高まっている。イムノクロマト法では、予め用意された金コロイドやラテックス粒子等と結合した抗体（以下、標識抗体と呼ぶ）と被検体中に含まれる抗原が複合体を形成しながら毛細管現象によりニトロセルロース膜上を移動し、予めニトロセルロース膜上に固相化された抗体（以下、捕捉抗体と呼ぶ）が抗原－標識抗体複合体と結合することで呈色することを利用した免疫測定法である。現在、市販されているイムノクロマトキットの殆どはマウスやウサギ等に由来するモノクローナル、又はポリクローナルＩｇＧ抗体が用いられている。
【0006】
一方、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体は、通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）が重鎖と軽鎖の２つの可変領域で抗原と結合するのに対し、１つの可変領域のみで結合活性と抗原特異性を示す。この抗体の可変領域はＶＨＨ(Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ) と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量（通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）の１０分の１程度）とされる（非特許文献６）。
ＶＨＨはＩｇＧ抗体と同等の結合活性を示しながらも、（１）ＩｇＧ抗体と比較して分子量が１０分の１程度であり、従来の抗体では結合できない新規のエピトープが期待されること、（２）ＩｇＧ抗体とは異なり、可逆性の高いタンパク質構造をもち、熱や圧に対して優れた耐性を示すこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、酵母や細菌等の微生物を用いた生産が可能であること、等の特徴をもつ。さらに、（４）ＶＨＨは、ｃＤＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法等の試験管内の抗体選抜技術との親和性が非常に高く、マウスやウサギ等への免疫によって得られるＩｇＧ抗体と比較して、より短期間に開発することが可能である。
ＶＨＨはＩｇＧ抗体と同等の結合活性を示しながらも、（１）ＩｇＧ抗体と比較して分子量が１０分の１程度であり、従来の抗体では結合できない新規のエピトープが期待されること、（２）ＩｇＧ抗体とは異なり、可逆性の高いタンパク質構造をもち、熱や圧に対して優れた耐性を示すこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、酵母や細菌等の微生物を用いた生産が可能であること、等の特徴をもつ。さらに、（４）ＶＨＨは、ｃＤＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法等の試験管内の抗体選抜技術との親和性が非常に高く、マウスやウサギ等への免疫によって得られるＩｇＧ抗体と比較して、より短期間に開発することが可能である。
【0007】
また、検査薬の開発においても、ＶＨＨの優位性は明らかである。特に、ＶＨＨが有する特性から、（１）ＶＨＨは粒子やニトロセルロース膜に高密度に固相化することが可能であり、より多くのパラトープを基材上に提示することができること、（２）ＶＨＨはタンパク質としての安定性に優れており、製品のより優れた保存安定性が期待できること、（３）ＶＨＨは微生物によって大量かつ安価に生産可能であるため、製造原価をより低減させることが出来ること、（４）ＶＨＨはイムノクロマト法において非特異的反応の原因となりうるＦｃ領域を有さないこと、がＩｇＧ抗体と比較して優位であると考えられる。
【0008】
しかしながら、イムノクロマト法等の抗原検査法にＶＨＨを用いることには課題がある。可変領域のみからなるＶＨＨは、（１）ＩｇＧ抗体と比較して低分子量であるため、基材への物理的な吸着性能が低いこと、（２）基材への固相化時に受けるタンパク質変性効果により、結合活性が低下しやすいこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、ＶＨＨはＦｃ領域を持たないため、基材へのランダムな吸着において配向性の制御が困難であること、が知られている。このような理由から、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、結合活性が低下しやすいことが課題となる。すなわち、イムノクロマト法において、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、高感度に抗原を検出することが難しいことが知られている。
【0009】
この課題に対して、非特許文献７ではコンジュゲーションパッドに標識抗体としてのＶＨＨ及びビオチン標識化されたＶＨＨの２種類の抗体を含ませておき、そしてニトロセルロース膜上にはビオチンに対して結合活性を示すストレプトアビジンを固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜上で、標識抗体―抗原―ビオチン化ＶＨＨの複合体を形成させ、その複合体をストレプトアビジンにより捕捉する方法である（従来技術１）。
【0010】
また、非特許文献８では標識抗体にＶＨＨを用いており、捕捉抗体としては予め用意されたビオチン化ＶＨＨ―ストレプトアビジン複合体をニトロセルロース膜上に固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜におけるＶＨＨの固相化をストレプトアビジンとニトロセルロース膜間の相互作用に依存させる方法である（従来技術２）。
【0011】
また、非特許文献９ではＩｇＧ抗体が抗原を認識するための最小単位であるＶＨとＶＬから構成される可変領域をペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメントを、セルロース膜を用いたイムノクロマト法における捕捉抗体として用いている。単鎖可変領域フラグメントを捕捉抗体として用いた場合では検出感度に課題があるが、セルロース膜に対して結合する炭水化物結合モジュールを用いることで解決している（従来技術３）。すなわち、単鎖可変領域フラグメントと炭水化物結合モジュールを連結することにより、セルロース膜上の当該単鎖可変領域フラグメントの固定化量及び配向性が制御され、捕捉抗体として用いられた単鎖可変領域フラグメントの結合活性が向上したことを報告している。
【0012】
従来技術１及び従来技術２に関して、ＶＨＨをビオチン修飾する必要があり、多くの場合、アミンカップリング法等の化学的修飾法が用いられる。しかしながら、アミンカップリング法ではＶＨＨの部位特異的な修飾が難しいため、しばしば結合活性の低下を招くことが知られている。また、ビオチン修飾やストレプトアビジンを利用することは作業工程やコスト面において、好ましい方法でない。特に、ストレプトアビジンはアビジン以外のビタミン類とも結合する。そのようなビタミン類が被検体中に含まれている場合、ストレプトアビジンを捕捉抗体の一部として用いることは、競合による阻害を受けることで、捕捉抗体としての機能が低下することが課題となる。
【0013】
従来技術３に関して、ＶＨＨに基材への吸着モジュールを連結する方法は、基材への固相化量、配向性、吸着時のタンパク質変性効果の回避の点から優れた方法である。しかしながら、用いられる基材毎に吸着モジュールを探す必要があり、汎用性に優れたものを見つけることは困難である。また、ＶＨＨに連結させる吸着モジュールの種類によっては、微生物による生産が困難になる場合もあることが課題である。また、非特許文献４に記載される当該炭水化物結合モジュールはニトロセルロース膜に対する結合活性を示さないことが記されており、従来技術３は捕捉抗体を固相化する基材としてセルロース膜に限定された抗体の固相化方法となる。
【0014】
したがって、従来技術１～３で用いられている方法を用いずとも、イムノクロマト法において抗原を高感度に検出可能なＶＨＨの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.
【非特許文献2】A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Mar;579(7798):265-269.
【非特許文献3】The Coronavirus Nucleocapsid Is a Multifunctional Protein. Viruses. Volume 6、Issue 8、August 2014、Pages 2991-3018.
【非特許文献4】The SARS-CoV nucleocapsid protein: A protein with multifarious activities. Infection, Genetics and Evolution. Volume 8、July 2008、Pages 397-405.
【非特許文献5】Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) by Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Antibodies in an Antigen-Capturing Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology. Volume 41、No. 12、December 2003、Pages 5781-5782.
【非特許文献6】The Therapeutic Potential of Nanobodies. BioDrugs. Volume 34、November 2019、Pages 11-26.
【非特許文献7】Development of a Nanobody-Based Lateral Flow Immunoassay for Detection of Human Norovirus. mSphere. 2016;1:e00219-16.
【非特許文献8】Development of a Nanobody-based lateral flow assay to detect active Trypanosoma congolense infections. Sci Rep. 2018;8:9019.
【非特許文献9】Carbohydrate binding module-fused antibodies improve the performance of cellulose-based lateral flow immunoassays. Sci Rep. 2021;11:7880.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に特異的に結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を検出することが可能な抗体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合するＶＨＨを得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨライブラリーから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して反応性の高いクローンを得ることに成功し、これがイムノクロマト法に適する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体となり得ることを見出した。
【0018】
すなわち、本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、反応性の高い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体を提供することができる。当該抗体はイムノクロマト法に用いられる抗体として有用であることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速な検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の簡易迅速診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】枯草菌で生産したＨｉｓタグ付きＶＨＨをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した結果。
【図2】Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法によるＨｉｓタグ付きＰＮ４及びＨｉｓタグ付きＰＮ１０及びＨｉｓタグ付きＰＮ２７及びＨｉｓタグ付きＰＮ４４及びＨｉｓタグ付きＰＮ４６及びＨｉｓタグ付きＰＮ６３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対する結合活性の評価。
【図3】Ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ法によるＨｉｓタグ付きＰＮ４及びＨｉｓタグ付きＰＮ１０及びＨｉｓタグ付きＰＮ２７及びＨｉｓタグ付きＰＮ４４及びＨｉｓタグ付きＰＮ４６及びＨｉｓタグ付きＰＮ６３のコロナウイルス属のＮタンパク質に対する結合特異性の評価。
【図4】標識抗体及び捕捉抗体にＨｉｓタグ付きＶＨＨを用いたイムノクロマトの構築可否の検討試験。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体である。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【0022】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体である。
【0023】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0024】
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴法、平衡乖離定数ＫＤ等を用いた方法によって評価できる。
【0025】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【0026】
ＦＲ１：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１７）
ＦＲ２：
ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１８）
ＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡ（配列番号１９）
ＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＡ（配列番号２０）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２１）
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２２）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶ（配列番号２３）
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２４）
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１７）
ＦＲ２：
ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１８）
ＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡ（配列番号１９）
ＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＡ（配列番号２０）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２１）
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２２）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＶ（配列番号２３）
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号２４）
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
【0027】
配列番号１７～２５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0028】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0029】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２６）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２７）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２８）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２９）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３０）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３１）を有する抗体はそれぞれ、後述する実施例においてｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（配列番号２６がＰＮ４、配列番号２７がＰＮ１０、配列番号２８がＰＮ２７、配列番号２９がＰＮ４４、配列番号３０がＰＮ４６、配列番号３１がＰＮ６３である。）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0030】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、単一ドメイン抗体や、単一ドメイン抗体が複数結合した多量体（例えば二量体）であり得る。多量体には、本発明の構造ドメインが複数連結した多量体の他、当該構造ドメインの１又は複数と、当該構造ドメインとは抗原特異性の異なる他の構造ドメインの１又は複数が連結した多量体が含まれる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【0031】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸をコドン最適化などの工程を経ることにより宿主細胞における目的の抗体の発現に最適化された人工遺伝子を設計し、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0032】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞又は酵母細胞等が挙げられる。 抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0033】
発現させた本発明の抗体を培養菌体又は培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体又は培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体又は細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法又は等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法又は等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0034】
本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、又は含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0035】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液，咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。被験試料は、Ｎタンパク質への結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0036】
また、本発明の抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。特に、本発明の抗体はイムノクロマト法（ラテラルフローアッセイ）に用いられる捕捉抗体又は標識抗体として有用であることから、ラテラルフローアッセイにおけるストリップの構成成分として好適である。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板、ラテラルフローアッセイにおけるストリップ等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板、ラテラルフローアッセイにおけるストリップ等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0037】
また、本発明の抗体は、細胞膜透過性ペプチドを導入する等して細胞内に移行させることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合し、細胞内でのウイルスの複製を阻害することが考えられる。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することも可能である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0038】
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0039】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞単一ドメイン抗体又はその多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体がＶＨＨである、＜３＞の抗体。
＜５＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜６＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）から選択されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＲＴＦＳＤＹＤＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＳＧＧＳＴＫ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＨＤＹＦＹＶＤＮＷＥＳＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＲＹＤＭＳ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＤＷＬＱＷＤＷＡＹ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＱＨＨＱＥＬＱＨＷＹＡＷＤＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＷＮＧＧＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＱＤＨＮＳＶＬＡＤＡＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＲＳＩＦＳＧＮＡＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＤＳＴＨ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＥＩＤＧＬＥＥＮＤＹ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＧ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＲＮＧＧＳＴＹ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＧＱＮＫＥＨＶＧＫＲＩＥＤＹ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞単一ドメイン抗体又はその多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体がＶＨＨである、＜３＞の抗体。
＜５＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜６＞単一ドメイン抗体の多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【0040】
＜７＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞～＜６＞のいずれかの抗体。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号１８、１９又は２０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号２５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２７）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２８）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２９）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３０）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３１）を有する、＜７＞の抗体。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号１８、１９又は２０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号２５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２７）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２８）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号２９）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３０）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号２５で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号３１）を有する、＜７＞の抗体。
【0041】
＜１５＞＜１＞～＜１４＞のいずれかの抗体をコードする核酸。
【実施例0042】
（実施例１）新型コロナウイルスＮタンパク質に結合するＶＨＨのスクリーニング
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
【0043】
２．ｃＤＮＡディスプレイの合成
（１）初期ＤＮＡライブラリーの合成
人工合成ＶＨＨライブラリーであるＰｈａｒｍａＬｏｇｉｃａｌライブラリー（ＰＬライブラリー）であるＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６－Ｙ，ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ１２－Ｙ， ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６－Ｖ，ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ１２－Ｖ， ＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿１２， ＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿１５を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ用溶液の組成は５００μＬ反応スケールに調製した。テストチューブ１本あたり、鋳型ＤＮＡとして１５０μＬの各ＶＨＨライブラリーと７．５μＬの２０μＭ Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー（５’―ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ―３’、配列番号３２）、７．５μＬの２０μＭ ＮｅｗＹｔａｇ＿ｆｏｒ＿ｐｏｌｙＡ＿ｃｎｖｋ－ｌｉｎｋｅｒプライマー（５’―ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ―３’、配列番号３３）、２５０μＬ ２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ（タカラバイオ）、８５μＬのＨ2Ｏを添加した。ＰＣＲは９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６０℃で５秒間、７２℃で１０秒間を５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり等量のビーズを加え、ピペッティングして混合し、２分間静置した後に上清を除去し、４００μＬの７０％エタノールを用いてビーズを３回洗浄した。ビーズを風乾させた後、５００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ＮＦＷ）を添加してビーズを懸濁させ、上清を回収した。その後、吸光度測定（Ａ２６０／Ａ２８０）によりＤＮＡ濃度を定量した。
（１）初期ＤＮＡライブラリーの合成
人工合成ＶＨＨライブラリーであるＰｈａｒｍａＬｏｇｉｃａｌライブラリー（ＰＬライブラリー）であるＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６－Ｙ，ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ１２－Ｙ， ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６－Ｖ，ＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ１２－Ｖ， ＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿１２， ＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿１５を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ用溶液の組成は５００μＬ反応スケールに調製した。テストチューブ１本あたり、鋳型ＤＮＡとして１５０μＬの各ＶＨＨライブラリーと７．５μＬの２０μＭ Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー（５’―ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ―３’、配列番号３２）、７．５μＬの２０μＭ ＮｅｗＹｔａｇ＿ｆｏｒ＿ｐｏｌｙＡ＿ｃｎｖｋ－ｌｉｎｋｅｒプライマー（５’―ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ―３’、配列番号３３）、２５０μＬ ２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ（タカラバイオ）、８５μＬのＨ2Ｏを添加した。ＰＣＲは９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６０℃で５秒間、７２℃で１０秒間を５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり等量のビーズを加え、ピペッティングして混合し、２分間静置した後に上清を除去し、４００μＬの７０％エタノールを用いてビーズを３回洗浄した。ビーズを風乾させた後、５００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ＮＦＷ）を添加してビーズを懸濁させ、上清を回収した。その後、吸光度測定（Ａ２６０／Ａ２８０）によりＤＮＡ濃度を定量した。
【0044】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２×Ｂｕｆｆｅｒ，１０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、３００μＬのＮＦＷを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２×Ｂｕｆｆｅｒ，１０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、３００μＬのＮＦＷを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
【0045】
（３）ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーの連結
２０μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｐｍｏｌの（２）で調製したｍＲＮＡ、１００ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、ＮＦＷで１００μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
２０μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｐｍｏｌの（２）で調製したｍＲＮＡ、１００ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、ＮＦＷで１００μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
【0046】
（４）無細胞翻訳
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標） １．０（ジーンフロンティア）を用いた。１２μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、３７．５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ジーンフロンティア）、３．７５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ジーンフロンティア）、３．７５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３（ジーンフロンティア）、１８μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ2）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標） １．０（ジーンフロンティア）を用いた。１２μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、３７．５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ジーンフロンティア）、３．７５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ジーンフロンティア）、３．７５μＬのＰｕｒｅｆｒｅｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３（ジーンフロンティア）、１８μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ2）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0047】
（５）ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
【0048】
（６）逆転写反応
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ、１５μＬの５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ニッポンジーン）、１．５μＬのＧｅｎｅＡｃｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｅ（２００Ｕ／μＬ）（ニッポンジーン）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ、１５μＬの５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ニッポンジーン）、１．５μＬのＧｅｎｅＡｃｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｅ（２００Ｕ／μＬ）（ニッポンジーン）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0049】
（７）ビーズからの切り出し
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
【0050】
（８）精製
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
【0051】
３．セレクション
（１）標的分子の固相化とブロッキング
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を本研究では使用した。Ｎｕｎｃ－ＩｍｍｕｎｏＴＭ Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにＰＢＳで濃度調製した標的分子を固相化した。具体的には、セレクションラウンド１（Ｒ１）では５０μｇ／ｍＬ，Ｒ２では１０μｇ／ｍＬ（Ｒ２），Ｒ３以降のラウンドでは１μｇ／ｍＬに調製した標的因子を１００μＬずつ添加して、４℃で一晩インキュベートした。ピペットを用いて標的因子を除去した後、５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去した。最後に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬ添加して除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。
（１）標的分子の固相化とブロッキング
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を本研究では使用した。Ｎｕｎｃ－ＩｍｍｕｎｏＴＭ Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにＰＢＳで濃度調製した標的分子を固相化した。具体的には、セレクションラウンド１（Ｒ１）では５０μｇ／ｍＬ，Ｒ２では１０μｇ／ｍＬ（Ｒ２），Ｒ３以降のラウンドでは１μｇ／ｍＬに調製した標的因子を１００μＬずつ添加して、４℃で一晩インキュベートした。ピペットを用いて標的因子を除去した後、５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去した。最後に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬ添加して除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。
【0052】
（２）セレクションラウンド１（Ｒ１）におけるスクリーニング手順
Ｒ１では合成した２００ｐｍｏｌのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結ライブラリ―に、３５μＬのＨＢＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）と４０μＬのＨＢＳＴを加えた１００μＬのライブラリー溶液を用いた。標的分子の固相化が完了したウェルにライブラリー溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ライブラリー溶液を丁寧に除去した。次に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬを添加して除去する操作（洗浄）を６回繰り返した。最後に、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬ添加して、丁寧に１０回ピペッティングした後に常温で１０分インキュベートした。その後、再度丁寧に１０回ピペッティングし、溶出液を新しいチューブに回収した。
Ｒ１では合成した２００ｐｍｏｌのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結ライブラリ―に、３５μＬのＨＢＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）と４０μＬのＨＢＳＴを加えた１００μＬのライブラリー溶液を用いた。標的分子の固相化が完了したウェルにライブラリー溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ライブラリー溶液を丁寧に除去した。次に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬを添加して除去する操作（洗浄）を６回繰り返した。最後に、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬ添加して、丁寧に１０回ピペッティングした後に常温で１０分インキュベートした。その後、再度丁寧に１０回ピペッティングし、溶出液を新しいチューブに回収した。
【0053】
（３）Ｒ２以降におけるスクリーニング手順
合成したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結ライブラリ―に、３５μＬのＨＢＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）と４０μＬのＨＢＳＴを加えて、１００μＬになるように調製した。Ｒ２では９ｐｍｏｌ，Ｒ３以降では１８ｐｍｏｌのライブラリ―溶液を用いた。Ｒ２以降では、予め各ウェルに１００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを加えて常温で１時間インキュベートしたのち、２００μＬのＨＢＳＴで３回洗浄することで、ウェルのブロッキングを行った。ブロッキングしたウェルにライブラリー溶液を添加し、常温で３０分間インキュベートした。この操作によりブロッキング剤親和性のＶＨＨクローンの除去を行った。その後、標的分子の固相化が完了したウェルにライブラリ―溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ライブラリー溶液を丁寧に除去した。次に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬ添加して除去する操作（洗浄）を６回繰り返した。最後に、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬ添加して丁寧に１０回ピペッティングした後、常温で１０分インキュベートした。その後、再度丁寧に１０回ピペッティングし、溶出液を新しいチューブに回収した。
合成したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結ライブラリ―に、３５μＬのＨＢＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）と４０μＬのＨＢＳＴを加えて、１００μＬになるように調製した。Ｒ２では９ｐｍｏｌ，Ｒ３以降では１８ｐｍｏｌのライブラリ―溶液を用いた。Ｒ２以降では、予め各ウェルに１００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを加えて常温で１時間インキュベートしたのち、２００μＬのＨＢＳＴで３回洗浄することで、ウェルのブロッキングを行った。ブロッキングしたウェルにライブラリー溶液を添加し、常温で３０分間インキュベートした。この操作によりブロッキング剤親和性のＶＨＨクローンの除去を行った。その後、標的分子の固相化が完了したウェルにライブラリ―溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ライブラリー溶液を丁寧に除去した。次に、ＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬ添加して除去する操作（洗浄）を６回繰り返した。最後に、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を１００μＬ添加して丁寧に１０回ピペッティングした後、常温で１０分インキュベートした。その後、再度丁寧に１０回ピペッティングし、溶出液を新しいチューブに回収した。
【0054】
（４）ＰＣＲ増幅
Ｒ１では全量、Ｒ２では半量、Ｒ３以降では１／４量のセレクション後の溶出液をＰＣＲに供した。１ＰＣＲチューブあたり２５μＬのＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（×２）（ＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）， １．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’―ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣ―３’,配列番号３４），１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ―３’，配列番号３５），１２．５μＬのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体、９．５μＬのＮＦＷを混合し調製した。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９５℃で２分，［９８℃で２０秒，６８℃で１５秒，７２℃で２０秒］を２２サイクル（Ｒ１）又は２８サイクル（Ｒ２以降）、７２℃で５分間の条件のＰＣＲを行った。次に、ＰＣＲ産物の精製をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加えて、ピペッティングによる混合後に５分間静置した。磁気プレート上で透明になるまで静置したのち、上清を除去した。次に、１ｍＬの７０％エタノールを加えて３０秒間静置したのち、上清を除去した。この操作は２回繰り返した。上清を除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮＦＷでよく懸濁したのち、５分間静置した。最後に、磁気プレート上で１分間静置したのち、上清を回収した。次のｒｏｕｎｄに進む場合には、精製したＤＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｃＤＮＡディスプレイの合成、セレクションと操作を進めた。
Ｒ１では全量、Ｒ２では半量、Ｒ３以降では１／４量のセレクション後の溶出液をＰＣＲに供した。１ＰＣＲチューブあたり２５μＬのＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（×２）（ＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）， １．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５’―ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣ―３’,配列番号３４），１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ―３’，配列番号３５），１２．５μＬのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体、９．５μＬのＮＦＷを混合し調製した。ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９５℃で２分，［９８℃で２０秒，６８℃で１５秒，７２℃で２０秒］を２２サイクル（Ｒ１）又は２８サイクル（Ｒ２以降）、７２℃で５分間の条件のＰＣＲを行った。次に、ＰＣＲ産物の精製をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加えて、ピペッティングによる混合後に５分間静置した。磁気プレート上で透明になるまで静置したのち、上清を除去した。次に、１ｍＬの７０％エタノールを加えて３０秒間静置したのち、上清を除去した。この操作は２回繰り返した。上清を除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮＦＷでよく懸濁したのち、５分間静置した。最後に、磁気プレート上で１分間静置したのち、上清を回収した。次のｒｏｕｎｄに進む場合には、精製したＤＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｃＤＮＡディスプレイの合成、セレクションと操作を進めた。
【0055】
４．ＶＨＨ候補配列の抽出
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標） ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標） ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0056】
（２）シーケンスライブラリーの調製
１st ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮＦＷを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧ－３’（配列番号３６）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＣＣＴＴＧ－３’（配列番号３７）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＦＷを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮＦＷを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＦＷで希釈することで４ｎＭに調製した。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０6＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
１st ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮＦＷを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧ－３’（配列番号３６）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＣＣＴＴＧ－３’（配列番号３７）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＦＷを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮＦＷを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＦＷで希釈することで４ｎＭに調製した。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０6＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
【0057】
（３）シーケンス
４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
【0058】
（４）シーケンスデータからＶＨＨのアミノ酸配列の抽出と重複数の計測
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨがコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。その結果、ＰＮ４（配列番号２６）、ＰＮ１０（配列番号２７）、ＰＮ２７（配列番号２８）、ＰＮ４４（配列番号２９）、ＰＮ４６（配列番号３０）、ＰＮ６３（配列番号３１）の出現頻度が高く、Ｎタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された。
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨがコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。その結果、ＰＮ４（配列番号２６）、ＰＮ１０（配列番号２７）、ＰＮ２７（配列番号２８）、ＰＮ４４（配列番号２９）、ＰＮ４６（配列番号３０）、ＰＮ６３（配列番号３１）の出現頻度が高く、Ｎタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された。
【0059】
ＰＮ４（配列番号２６）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号１)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号１８）、５０～５８番目がＣＤＲ２（配列番号２）、５９～９７番目がＦＲ３（配列番号２１）、９８～１０９番目がＣＤＲ３（配列番号３）、１１０～１２０番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0060】
ＰＮ１０（配列番号２７）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号４)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号１９）、５０～５９番目がＣＤＲ２（配列番号５）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２２）、９９～１０８番目がＣＤＲ３（配列番号６）、１０９～１１９番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0061】
ＰＮ２７（配列番号２８）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号７)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号１９）、５０～５９番目がＣＤＲ２（配列番号８）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２３）、９９～１１３番目がＣＤＲ３（配列番号９）、１０９～１２４番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0062】
ＰＮ４４（配列番号２９）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号１０)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号２０）、５０～５９番目がＣＤＲ２（配列番号１１）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２１）、９９～１１０番目がＣＤＲ３（配列番号１２）、１０９～１２１番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0063】
ＰＮ４６（配列番号３０）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号１０)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号２０）、５０～５９番目がＣＤＲ２（配列番号１３）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２１）、９９～１１０番目がＣＤＲ３（配列番号１４）、１０９～１２１番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0064】
ＰＮ６３（配列番号３１）のアミノ酸配列において、１～２５番目がＦＲ１（配列番号１７）、２６～３５番目がＣＤＲ１(配列番号１５)、３６～４９番目がＦＲ２（配列番号２０）、５０～５９番目がＣＤＲ２（配列番号８）、６０～９８番目がＦＲ３（配列番号２４）、９９～１１３番目がＣＤＲ３（配列番号１６）、１０９～１２４番目がＦＲ４（配列番号２５）である。
【0065】
（実施例２）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
（１）ＶＨＨ生産用プラスミドの構築
実施例１により取得されたＰＮ４（配列番号２６），ＰＮ１０（配列番号２７），ＰＮ２７（配列番号２８），ＰＮ４４（配列番号２９），ＰＮ４６（配列番号３０），ＰＮ６３（配列番号３１）の生産を行った。本実施例で合成される各ＶＨＨのアミノ酸配列は、そのＣ末端側にリンカー配列（配列番号３８）を介したＨｉｓタグ配列（配列番号３９）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＰＮ４（配列番号４０）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０（配列番号４１）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７（配列番号４２）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４４（配列番号４３）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４６（配列番号４４）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ６３（配列番号４５）と呼ぶ。これら配列番号４０～４５で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するためにまず、ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号４６）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号４７ ）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号４８）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号４９）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの配列を、先に構築したＶＨＨ発現用プラスミドの配列番号５０と配列番号５１の間に組み込む形で、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドを合成した。構築したプラスミドは下記（２）に示す手順に従って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ８７４株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）を欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ）に導入した。
（１）ＶＨＨ生産用プラスミドの構築
実施例１により取得されたＰＮ４（配列番号２６），ＰＮ１０（配列番号２７），ＰＮ２７（配列番号２８），ＰＮ４４（配列番号２９），ＰＮ４６（配列番号３０），ＰＮ６３（配列番号３１）の生産を行った。本実施例で合成される各ＶＨＨのアミノ酸配列は、そのＣ末端側にリンカー配列（配列番号３８）を介したＨｉｓタグ配列（配列番号３９）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＰＮ４（配列番号４０）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０（配列番号４１）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７（配列番号４２）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４４（配列番号４３）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４６（配列番号４４）、Ｈｉｓタグ付きＰＮ６３（配列番号４５）と呼ぶ。これら配列番号４０～４５で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するためにまず、ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号４６）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号４７ ）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号４８）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号４９）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの配列を、先に構築したＶＨＨ発現用プラスミドの配列番号５０と配列番号５１の間に組み込む形で、Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドを合成した。構築したプラスミドは下記（２）に示す手順に従って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ８７４株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）を欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ）に導入した。
【0066】
（２）組換え枯草菌の作製
枯草菌株への上記プラスミド導入は、以下に示すプロトプラスト法によって行った。枯草菌の培養は９６穴ディープウェルプレートで行った。０．８ｍＬのＬＢ液体培地を入れたウェル中に、グリセロールを含む溶液中でストックしておいた枯草菌を植菌し、３０℃、１，５００ｒ／ｍｉｎにて一晩振とう培養した。次に、培養液８μＬを新鮮な０．８ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、１，５００ｒ／ｍｉｎで約２時間振とう培養した。培養終了後、この培養液を２ｍＬチューブに回収し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰを加えて、得られたペレットを懸濁させ、このチューブを３７℃で１時間インキュベートした。
枯草菌株への上記プラスミド導入は、以下に示すプロトプラスト法によって行った。枯草菌の培養は９６穴ディープウェルプレートで行った。０．８ｍＬのＬＢ液体培地を入れたウェル中に、グリセロールを含む溶液中でストックしておいた枯草菌を植菌し、３０℃、１，５００ｒ／ｍｉｎにて一晩振とう培養した。次に、培養液８μＬを新鮮な０．８ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、１，５００ｒ／ｍｉｎで約２時間振とう培養した。培養終了後、この培養液を２ｍＬチューブに回収し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰを加えて、得られたペレットを懸濁させ、このチューブを３７℃で１時間インキュベートした。
【0067】
インキュベート終了後、このチューブを３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。４００μＬのＳＭＭＰをこのチューブに加え、得られたペレットを懸濁させて懸濁液とした。別のチューブに得られた懸濁液３３μＬを加え、そこに上記のようにして作製した各プラスミドを加えて混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを添加し、ボルテックスして混合液とした。この混合液に３５０μＬのＳＭＭＰを加えて転倒混和し、３０℃、２時間インキュベートした。その後、あらかじめ準備しておいたＤＭ３寒天培地を含むプレートの寒天培地上に、インキュベート後の培養液を２００μＬ塗布し、３０℃にて２～３日間インキュベートし、組換え枯草菌を得た。
【0068】
（３）ＶＨＨの産生
（２）で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３０℃で一晩振とう培養を行うことで、前培養液を得た。前培養液を９６穴ディープウェルプレートの各ウェルに入れた１ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に全ての培養物を１５ｍＬチューブに回収し、４℃、７，５００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清中に含まれる各ＶＨＨには、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットに添付されたプロトコルに従って精製した。精製時の溶出液としては、３０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いた。
（２）で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３０℃で一晩振とう培養を行うことで、前培養液を得た。前培養液を９６穴ディープウェルプレートの各ウェルに入れた１ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に全ての培養物を１５ｍＬチューブに回収し、４℃、７，５００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清中に含まれる各ＶＨＨには、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットに添付されたプロトコルに従って精製した。精製時の溶出液としては、３０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いた。
【0069】
（４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる確認
２μＬの各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの水溶液（共に１ｍｇ／ｍＬ）、２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ （１０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４．５μＬのＨ2Ｏを混合し、１００℃で加熱した。その後、１０μＬのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、５μＬのＮｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もゲルのウェルにアプライした。ゲルはＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，１．０ｍｍ，Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ，１２－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を水で２０倍希釈して調製した緩衝液を用いた。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を泳動槽として用い、ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）９０Ｗ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続して２００Ｖの電圧で４０分間電気泳動を行った。その後、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、目的タンパク質のバンドの有無を確認した。結果を図１に示すが、いずれのサンプルも１５ｋＤａ付近にバンドが確認でき、各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨが生産出来ていることが確認された。
２μＬの各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの水溶液（共に１ｍｇ／ｍＬ）、２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ （１０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４．５μＬのＨ2Ｏを混合し、１００℃で加熱した。その後、１０μＬのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、５μＬのＮｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もゲルのウェルにアプライした。ゲルはＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，１．０ｍｍ，Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ，１２－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を水で２０倍希釈して調製した緩衝液を用いた。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を泳動槽として用い、ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）９０Ｗ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続して２００Ｖの電圧で４０分間電気泳動を行った。その後、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、目的タンパク質のバンドの有無を確認した。結果を図１に示すが、いずれのサンプルも１５ｋＤａ付近にバンドが確認でき、各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨが生産出来ていることが確認された。
【0070】
（実施例３）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法によるＶＨＨの結合活性評価
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）ＰｌａｔｅＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに調製した各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートし固相化を行った。その後、ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ溶液を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＮタンパク質，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を希釈用ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で０，１０，１００, １０００ｎｇ／ｍＬに調製した。各ウェルに調製済みのＮタンパク質を１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去し、洗浄の操作を３回繰り返した。Ｇｏａｔ ｐＡｂ ｔｏ Ｈｕ ＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ）をそれぞれＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを検出抗体として、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で３０分間インキュベートし、４５０ｎｍの吸光度をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）ＰｌａｔｅＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに調製した各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨを１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートし固相化を行った。その後、ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ溶液を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＮタンパク質，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を希釈用ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で０，１０，１００, １０００ｎｇ／ｍＬに調製した。各ウェルに調製済みのＮタンパク質を１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去し、洗浄の操作を３回繰り返した。Ｇｏａｔ ｐＡｂ ｔｏ Ｈｕ ＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ）をそれぞれＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを検出抗体として、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で３０分間インキュベートし、４５０ｎｍの吸光度をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【0071】
ＥＬＩＳＡの結果を図２に示すが、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０，Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７，Ｈｉｓタグ付きＰＮ４４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ４６，Ｈｉｓタグ付きＰＮ６３のいずれもがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に明瞭な結合活性を示すことが確認された。
【0072】
（実施例４）Ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ法によるＶＨＨの結合特異性の評価
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２， ＳＡＲＳ－ＣｏＶ，ＭＥＲＳ－ＣｏＶ，ＨＣｏＶ－２２９Ｅ，ＨＣｏＶ－ＮＬ６３，ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１，ＨＣｏＶ－ＯＣ４３由来のＮタンパク質を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートし固相化を行った。なお、用いたＮタンパク質は表１に示した。その後、ピペットを用いて丁寧にＮタンパク質溶液を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨをＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ添加した後室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去し、洗浄の操作を３回繰り返した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ，ＶＨＨ ｄｏｍａｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを検出抗体として、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレットをＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で３０分間インキュベートし、４５０ｎｍの吸光度をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２， ＳＡＲＳ－ＣｏＶ，ＭＥＲＳ－ＣｏＶ，ＨＣｏＶ－２２９Ｅ，ＨＣｏＶ－ＮＬ６３，ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１，ＨＣｏＶ－ＯＣ４３由来のＮタンパク質を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートし固相化を行った。なお、用いたＮタンパク質は表１に示した。その後、ピペットを用いて丁寧にＮタンパク質溶液を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（洗浄）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。各Ｈｉｓタグ付きＶＨＨをＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ添加した後室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去し、洗浄の操作を３回繰り返した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ，ＶＨＨ ｄｏｍａｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを検出抗体として、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレットをＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で３０分間インキュベートし、４５０ｎｍの吸光度をＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。
【0073】
【表1】
【0074】
Ｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ法の結果を図３に示すが、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０，Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に特異的に結合することが明らかになった。また、Ｈｉｓタグ付きＰＮ４４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ４６，Ｈｉｓタグ付きＰＮ６３はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質にも若干の結合活性を示すものの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に特異的かつ明瞭な結合活性を示すことが確認された。
【0075】
（実施例５）ラテラルフローアッセイ
（１）標識抗体の色素粒子への感作
色素粒子として着色セルロース粒子ＮａｎｏＡｃｔ（化学結合型，旭化成）を用いた。添付のプロトコルに沿って、標識抗体の感作を行った。以下に概要を記す。１５ｍＬ遠沈管に６０μＬのＮａｎｏＡｃｔを分注し、そこに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を５４０μＬ、４ｗｔ％のＥＤＣを７．５μＬ、４ｗｔ％のＮＨＳを１５μＬ加え、室温で１５分静置してカルボキシル基のエステル化を行った。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。標識抗体として特願２０２２－０６５９３４に記載のＥＮ２及びＥＮ１２，国際公開第２０２２／１８１５５０号に記載のＣｏＶＨＨ－Ｎ２,本発明のＰＮ４，ＰＮ１０，ＰＮ２７，ＰＮ４６及びＰＮ６３のいずれかを６０μｇ加えたのちボルテックスし、３７℃で１２０分間インキュベートした。次に、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１００ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，ｐＨ８．５）を７．２ｍＬ加えたのちボルテックスし、３７℃で６０分間インキュベートした。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。再度１３，０００×ｇで１５分間遠心して上清を除去し、保存液（３３ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，０．２ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１５ｗｔ％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ９．２）を１．３ｍＬ加えて超音波処理し、使用時まで４℃で保存した。
（１）標識抗体の色素粒子への感作
色素粒子として着色セルロース粒子ＮａｎｏＡｃｔ（化学結合型，旭化成）を用いた。添付のプロトコルに沿って、標識抗体の感作を行った。以下に概要を記す。１５ｍＬ遠沈管に６０μＬのＮａｎｏＡｃｔを分注し、そこに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を５４０μＬ、４ｗｔ％のＥＤＣを７．５μＬ、４ｗｔ％のＮＨＳを１５μＬ加え、室温で１５分静置してカルボキシル基のエステル化を行った。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。標識抗体として特願２０２２－０６５９３４に記載のＥＮ２及びＥＮ１２，国際公開第２０２２／１８１５５０号に記載のＣｏＶＨＨ－Ｎ２,本発明のＰＮ４，ＰＮ１０，ＰＮ２７，ＰＮ４６及びＰＮ６３のいずれかを６０μｇ加えたのちボルテックスし、３７℃で１２０分間インキュベートした。次に、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１００ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，ｐＨ８．５）を７．２ｍＬ加えたのちボルテックスし、３７℃で６０分間インキュベートした。１３，０００×ｇで２０分間遠心して上清を除去し、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を６００μＬ加えて超音波処理した。再度１３，０００×ｇで１５分間遠心して上清を除去し、保存液（３３ｍＭ Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ，０．２ｗｔ％ Ｃａｓｅｉｎ，１５ｗｔ％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ９．２）を１．３ｍＬ加えて超音波処理し、使用時まで４℃で保存した。
【0076】
（２）ハーフストリップの組み立て
５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したＨｉ－Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０（Ｍｅｒｃｋ）をニトロセルロースメンブレンとして用いた。５ｍｍ×２０ｍｍに裁断したＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ）を吸水パッドとして用いた。ニトロセルロースメンブレンと吸水パッドが１０ｍｍ重なり合うように張り合わせ、バッキングシート（ＧＬ－５７８８８，Ｌｏｈｍａｎｎ）で接着させることで、ハーフストリップを組み立てた。
５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したＨｉ－Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０（Ｍｅｒｃｋ）をニトロセルロースメンブレンとして用いた。５ｍｍ×２０ｍｍに裁断したＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ）を吸水パッドとして用いた。ニトロセルロースメンブレンと吸水パッドが１０ｍｍ重なり合うように張り合わせ、バッキングシート（ＧＬ－５７８８８，Ｌｏｈｍａｎｎ）で接着させることで、ハーフストリップを組み立てた。
【0077】
（３）捕捉抗体のニトロセルロースメンブレン膜への固定化
捕捉抗体であるＨｉｓタグ付きＥＮ２，Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２，Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２，Ｈｉｓタグ付きＰＮ４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０，Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７は予め３０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍＬに調製しておいた。上記（２）で組み立てたストリップの下端から２ｃｍの箇所に、抗体をピペットで１μＬスポットした。その後、３７℃で２０分間乾燥することで固定化を行った。以下では、捕捉抗体を固定化した部位をテストラインと表記する。
捕捉抗体であるＨｉｓタグ付きＥＮ２，Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２，Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ－Ｎ２，Ｈｉｓタグ付きＰＮ４，Ｈｉｓタグ付きＰＮ１０，Ｈｉｓタグ付きＰＮ２７は予め３０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍＬに調製しておいた。上記（２）で組み立てたストリップの下端から２ｃｍの箇所に、抗体をピペットで１μＬスポットした。その後、３７℃で２０分間乾燥することで固定化を行った。以下では、捕捉抗体を固定化した部位をテストラインと表記する。
【0078】
（４）展開液の調製
まず２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７を調製した。終濃度が５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０となるようにそれぞれを添加してＨＢＳＴ溶液を調製し、展開液として用いた。
まず２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７を調製した。終濃度が５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０となるようにそれぞれを添加してＨＢＳＴ溶液を調製し、展開液として用いた。
【0079】
（５）イムノクロマトの構築可否検討
評価する展開液にＦｃタグ付きＮタンパク質を加えて、１０μｇ／ｍＬ希釈した陽性検体を調製した。陰性検体として、Ｎタンパク質を含まないＨＢＳＴを用いた。９６穴プレートの１ウェルに、５０μＬの陽性検体液と２０μＬの（１）で調製した色素粒子を添加し、ピペッティングでよく混合した。その後、（３）で調製した捕捉抗体固定化メンブレンをウェルに浸漬して、液が流れ切るまで静置した。陽性検体を流した場合にのみ呈色が見られた場合にはイムノクロマトが「構築可能」と、呈色が見られなかった場合には「構築不可」と判定した。
評価する展開液にＦｃタグ付きＮタンパク質を加えて、１０μｇ／ｍＬ希釈した陽性検体を調製した。陰性検体として、Ｎタンパク質を含まないＨＢＳＴを用いた。９６穴プレートの１ウェルに、５０μＬの陽性検体液と２０μＬの（１）で調製した色素粒子を添加し、ピペッティングでよく混合した。その後、（３）で調製した捕捉抗体固定化メンブレンをウェルに浸漬して、液が流れ切るまで静置した。陽性検体を流した場合にのみ呈色が見られた場合にはイムノクロマトが「構築可能」と、呈色が見られなかった場合には「構築不可」と判定した。
【0080】
各ＶＨＨを用いたイムノクロマト構築の可否を図４に示す。ＥＮ２，ＥＮ１２，ＣｏＶＨＨ－Ｎ２の３種のＶＨＨ同士ではイムノクロマトを構築することが出来なかった。本発明のＰＮ４，ＰＮ１０，ＰＮ２７，ＰＮ４４，ＰＮ４６，ＰＮ６３を用いると、１０種の組合せ（標識抗体／捕捉抗体: ＥＮ１２／ＰＮ４，ＣｏＶＨＨ－Ｎ２／ＰＮ２７，ＰＮ１０／ＰＮ４，ＰＮ１０／ＰＮ２７，ＰＮ２７／ＰＮ４，ＰＮ４４／ＰＮ４，ＰＮ４４／ＰＮ２７，ＰＮ４６／ＰＮ４，ＰＮ４６／ＰＮ２７，ＰＮ６３／ＰＮ２７）でイムノクロマトを構築可能になった。つまり、本発明のＶＨＨを採用することで、標識抗体及び捕捉抗体の双方にＶＨＨを用いたイムノクロマトを構築可能になることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】