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特開2024-15245増殖細胞の生産方法、細胞生産物の生産方法、間葉系幹細胞集団およびその生産方法、幹細胞の培養上清およびその生産方法、並びに治療剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024015245
(43)【公開日】2024-02-01
(54)【発明の名称】増殖細胞の生産方法、細胞生産物の生産方法、間葉系幹細胞集団およびその生産方法、幹細胞の培養上清およびその生産方法、並びに治療剤
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240125BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240125BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240125BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20240125BHJP
C12M 3/00 20060101ALN20240125BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61K35/28
A61P9/00
A61K38/19
C12M3/00 A
C07K14/78
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023206347
(22)【出願日】2023-12-06
(62)【分割の表示】P 2022512159の分割
【原出願日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】P 2020063408
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】520113941
【氏名又は名称】Ｃｅｌｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】柳田 康友
(72)【発明者】
【氏名】李家 中豪
(72)【発明者】
【氏名】石田尾 武文
(72)【発明者】
【氏名】南 一成
(57)【要約】
【課題】低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる細胞培養技術に基づく、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率が７０％以下である間葉系幹細胞集団を提供すること。
【解決手段】０．００２～１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、培養前の間葉系幹細胞集団と比べて、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の比率が７０％以下に低下した間葉系幹細胞集団を得る。
【選択図】図１３
【解決手段】０．００２～１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、培養前の間葉系幹細胞集団と比べて、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の比率が７０％以下に低下した間葉系幹細胞集団を得る。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率が７０％以下である間葉系幹細胞集団。
【請求項2】
ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の比率が５０％以下である請求項１に記載の間葉系幹細胞集団。
【請求項3】
０．００２～１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、間葉系幹細胞の生産方法によって得られる、請求項１又は２に記載の間葉系幹細胞集団。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞集団を含む治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、増殖細胞の生産方法、細胞生産物の生産方法、間葉系幹細胞集団およびその生産方法、幹細胞の培養上清およびその生産方法、並びに治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞などの幹細胞は、再生医療への応用が世界的に注目されている。幹細胞を再生医療に応用するためには、これら細胞を安定に培養し増殖させる培養技術の開発が必要である。
【0003】
幹細胞を培養し増殖させ、大量生産するためには、まず一定の細胞密度で培養容器に播種し、培養容器表面の面積の８～９割以上が細胞で覆われる状態（所謂コンフルエントの状態）になるまで培養し、その後、トリプシン等の酵素で細胞を剥離し、得られた細胞を複数の新しい培養容器へ継代することが一般に行われている（例えば特許文献１を参照）。
【0004】
一方、間葉系幹細胞などの幹細胞は、各種サイトカインやエクソソーム等の細胞由来成分を分泌することが知られており、医療への応用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１４／０３５２１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
細胞培養技術を用いて増殖細胞や細胞由来成分を大量生産する場合、細胞を効率的に増殖させることや、細胞由来成分を含む培養上清を効率的に回収することが求められる。
【0007】
したがって、本発明は、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる細胞培養技術を提供することを目的とする。また、本発明は、上記細胞培養技術を更に発展させた細胞培養技術であって、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま、簡便な手法で多量の細胞生産物を生産することができる細胞培養技術を提供することを目的とする。
更に、本発明は、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、上述の細胞培養技術に基づいて、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することを目的とする。また、本発明は、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することを目的とする。
更に、本発明は、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、上述の細胞培養技術に基づいて、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することを目的とする。また、本発明は、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一つの側面によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法が提供される。
【0009】
別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
更に別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
更に別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
【0010】
更に別の側面によれば、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法が提供される。
更に別の側面によれば、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率が７０％以下である間葉系幹細胞集団が提供される。
更に別の側面によれば、
幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。
更に別の側面によれば、５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤が提供される。
更に別の側面によれば、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率が７０％以下である間葉系幹細胞集団が提供される。
更に別の側面によれば、
幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。
更に別の側面によれば、５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清が提供される。
更に別の側面によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤が提供される。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる細胞培養技術を提供することができる。また、本発明によれば、上記細胞培養技術を更に発展させた細胞培養技術であって、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま、簡便な手法で多量の細胞生産物を生産することができる細胞培養技術を提供することができる。
本発明によれば、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することができる。また、本発明によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することができる。
本発明によれば、上述の細胞培養技術に基づいて、新規特徴を有する間葉系幹細胞集団を提供すること、および、多量のサイトカインなどの細胞生産物を含む、幹細胞の培養上清を提供することができる。また、本発明によれば、上述の間葉系幹細胞集団または上述の培養上清を含む治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】増殖細胞の数を示すグラフ（比較例）。
【図2】播種密度10cells/cm2で20日間培養した後の細胞の顕微鏡画像（比較例）。
【図3】増殖細胞の数を示すグラフ（本発明の例）。
【図4】播種密度10cells/cm2で20日間培養した後の細胞の顕微鏡画像（本発明の例）。
【図5】増殖細胞の数を示すグラフ（参考例）。
【図6】播種密度10cells/cm2で20日間培養した後の細胞の顕微鏡画像（参考例）。
【図7A】生産培養を3日間行った後の細胞の顕微鏡画像（比較例）。
【図7B】生産培養を3日間行った後の細胞の顕微鏡画像（比較例）。
【図8A】生産培養を3日間行った後の細胞の顕微鏡画像（本発明の例）。
【図8B】生産培養を3日間行った後の細胞の顕微鏡画像（本発明の例）。
【図9】実施例３で行った培養工程を模式的に示す図。
【図10】サイトカインの定量結果を示すグラフ。
【図11】サイトカインの定量結果を示すグラフ。
【図12】サイトカインの定量結果を示すグラフ。
【図13】ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を示すグラフ。
【図14】ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の脂肪由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を示すグラフ。
【図15】ラミニンフラグメントの非存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を示すグラフ。
【図16】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＨＧＦ量を示すグラフ。
【図17】脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＨＧＦ量を示すグラフ。
【図18】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＭＣＰ－１量を示すグラフ。
【図19】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＧＲＯ／ＣＸＣＬ１量を示すグラフ。
【図20】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるフィブロネクチン量を示すグラフ。
【図21】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＰＤＧＦ－ＡＡ量を示すグラフ。
【図22】脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＶＥＧＦ量を示すグラフ。
【図23】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＴＧＦ－１ｂ量を示すグラフ。
【図24】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－４量を示すグラフ。
【図25】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１０量を示すグラフ。
【図26】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１３量を示すグラフ。
【図27】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－７量を示すグラフ。
【図28】脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１５量を示すグラフ。
【図29】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－９量を示すグラフ。
【図30】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１α量を示すグラフ。
【図31】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１β量を示すグラフ。
【図32】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＴＮＦ－α量を示すグラフ。
【図33】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－８量を示すグラフ。
【図34】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＥＯＴＡＸＩＮ量を示すグラフ。
【図35】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－６量を示すグラフ。
【図36】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＧ－ＣＳＦ量を示すグラフ。
【図37】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＧＭ－ＣＳＦ量を示すグラフ。
【図38】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＭＣＰ－３量を示すグラフ。
【図39】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＬ－１２Ｐ４０量を示すグラフ。
【図40】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＩＰ－１０量を示すグラフ。
【図41】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるＭＩＰ－１α量を示すグラフ。
【図42】臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるエクソソームマーカータンパク質量を示すグラフ。
【図43】下肢血流量比を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を詳説することを目的とし、本発明を限定することを意図していない。
【0014】
細胞を継代培養により増殖させる場合、播種時の細胞密度が低いほど、培養容器１枚の細胞から、次の代で培養される培養容器の枚数が増えることになる。いわゆるスプリット比率が１：１０であれば、１枚の培養容器でコンフルエントの状態になった細胞を、１０枚の培養容器に播種することが出来るし、スプリット比率が１：１００であれば、１枚の培養容器でコンフルエントの状態になった細胞を、１００枚の培養容器に播種することが可能である。しかしながら、幹細胞の一般的なスプリット比率は、１：５～１：２０くらいまでであり、幹細胞が、１：１００あるいは１：１０００などのスプリット比率となるように、低い細胞密度で播種されることはほとんどない。実際には、幹細胞は、２０００細胞/ｃｍ２を超える細胞密度で播種され、継代されている。
【0015】
一方、ヒト間葉系幹細胞を培養して、各種サイトカインやエクソソーム等の細胞由来成分（以下、細胞生産物ともいう）を生産させ、これを疾患治療のためにヒトに投与することが研究されている。この場合、幹細胞を、動物由来成分やヒト血清、また外来のサイトカインやインスリン等の組換えタンパク質を含む培養液で培養し、得られた上清成分を精製して用いることは望ましくない。なぜなら、細胞由来成分以外の上記外来成分がヒトの体内に入るリスクが懸念されるためである。したがって、幹細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養することにより得られた細胞培養上清を治療に使用することが望ましい。
【0016】
このような技術的背景の下で、本発明者らが、幹細胞を１００００細胞/ｃｍ２の細胞密度で播種して培養すると、コンフルエントの状態になるまで細胞を増殖させることができたが、幹細胞を１０００細胞/ｃｍ２以下の低い細胞密度で播種して培養すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができなかった（後述の実施例１、図１および２を参照）。また、本発明者らが、幹細胞を１０００細胞/ｃｍ２の細胞密度で播種して培養し、得られた増殖細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養した（すなわち、生産培養を行った）ところ、生産培養の途中で細胞が培養容器から剥離して、増殖細胞の接着状態を維持することができなかった（後述の実施例２、図７Ａおよび７Ｂを参照）。
【0017】
本発明者らは、これらの問題を解決することに取り組んだ。その結果、本発明者らは、第１に、幹細胞を、低い細胞密度で播種しても、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント（以下、単にラミニンフラグメントともいう）の存在下で培養すると、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができることを見出した（後述の実施例１、図３および４を参照）。第２に、本発明者らは、幹細胞を、ラミニンフラグメントの存在下で培養して増殖させると、その後、得られた増殖細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養しても、培養の途中で細胞が培養容器から剥離せず、増殖細胞の接着状態を維持することができることを見出した（後述の実施例２、図８Ａおよび８Ｂを参照）。第３に、本発明者らは、上述の増殖細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養した（すなわち、生産培養を行った）後、さらに細胞増殖用培養液で培養し（すなわち、回復培養を行い）、再度、生産培養を行ったところ、増殖細胞の接着状態を維持したまま、生産培養を繰り返し行うことができ、細胞由来成分を長期にわたって生産できることを見出した（後述の実施例３を参照）。
【0018】
これらの発見に基づいて、本発明らは、本発明を完成させるに至った。以下、本発明の方法、すなわち「増殖細胞の生産方法」および「細胞生産物の生産方法」について、この順に説明する。
【0019】
＜１．増殖細胞の生産方法＞
１つの側面によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法が提供される。
１つの側面によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法が提供される。
【0020】
好ましくは、培養は、前記培養基質（すなわち、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体）を含有する増殖培養液中で行うことができる。すなわち、好ましい態様によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント（以下、単にラミニンフラグメントともいう）またはその改変体を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法が提供される。
【0021】
具体的な例によれば、増殖細胞の生産方法は、
ラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液を予め調製し、細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように、予め調製された増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
ラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液を予め調製し、細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように、予め調製された増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
【0022】
あるいは、別の具体的な例によれば、増殖細胞の生産方法は、
細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加し、これを培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加し、これを培養容器に播種することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
【0023】
あるいは、別の具体的な例によれば、増殖細胞の生産方法は、
細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種し、播種された細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
細胞を、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度になるように増殖培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種し、播種された細胞懸濁液にラミニンフラグメントまたはその改変体を添加することと、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含むことができる。
【0024】
（細胞）
細胞としては、任意の細胞、例えば幹細胞を使用することができる。細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であり、より好ましくは間葉系幹細胞である。細胞は、より好ましくは、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞であり、更に好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である。
細胞としては、任意の細胞、例えば幹細胞を使用することができる。細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であり、より好ましくは間葉系幹細胞である。細胞は、より好ましくは、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞であり、更に好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である。
【0025】
好ましい態様において、細胞はヒト細胞である。すなわち、細胞は、例えばヒト幹細胞である。細胞は、好ましくは、ヒト間葉系幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、またはヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であり、より好ましくはヒト間葉系幹細胞である。細胞は、より好ましくは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞であり、更に好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞である。
【0026】
細胞は、凍結細胞であってもよい。すなわち、細胞は、凍結細胞を融解することにより準備された細胞であってもよい。増殖細胞や細胞由来成分を生産したいときに、凍結保存されている細胞を出発細胞として用いて本発明の方法に従って増殖させれば、必要なときに増殖細胞や細胞由来成分を生産することができる。
【0027】
（播種）
この方法では、細胞を０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で増殖培養液に播種する。
この方法では、細胞を０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で増殖培養液に播種する。
【0028】
細胞は、好ましくは０．００２～１９００細胞／ｃｍ２、より好ましくは０．００２～１８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。
【0029】
細胞がコンフルエントの状態になるまでの時間を考慮すると、細胞は、好ましくは１～２０００細胞／ｃｍ２、より好ましくは１～１９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。
【0030】
上述の細胞密度は、幹細胞を増殖培養する際に通常使用される播種密度より低い。細胞は、通常、単一細胞の状態で播種される。単一細胞の状態の細胞は、細胞塊をタンパク質分解酵素（例えばトリプシン）で処理することにより準備することができる。
【0031】
増殖培養液は、細胞の種類に応じて、細胞の増殖培養液として公知のものを使用することができる。例えば、ヒト幹細胞の場合、ヒト幹細胞の増殖用培地として市販されているものを使用することができる。
【0032】
増殖培養液は、培養細胞や培養液が疾患治療や再生医療などの治療用途に利用されることを考えると、血清フリーで、異種由来成分を含まない（ゼノフリー）タイプの培地であることが望ましい。
【0033】
また、増殖培養液は、後述される「生産培養液」がタンパク質を含まないことが好ましいのに対し、細胞の増殖を促進するタンパク質を含むことが好ましい。幹細胞の増殖を促進するタンパク質として、例えば、ｂFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）、TGFβ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、EGF（上皮細胞増殖因子）、IGF（インスリン様増殖因子）、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）、HGF（肝細胞増殖因子）、インスリン、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。より具体的には、増殖培養液は、細胞培養用基本培地（例えば、MEM、DMEM、IMDM、Ham’s F-12、DMEM/F12、RPMI1640など）に増殖因子を添加することにより調製された培地を使用してもよい。
【0034】
ヒト間葉系幹細胞の場合、増殖培養液として、例えば、MSC Expansion XSFM B培地（富士フイルム和光純薬株式会社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF（タカラバイオ株式会社）、MSC NutriStem XF Medium（Biological Industries社）などを使用することができる。これらの増殖培養液は、何れも、血清フリーで、異種由来成分を含まない（ゼノフリー）タイプの培地である。
【0035】
培養容器としては、細胞の接着培養のために使用される任意の容器を使用することができる。培養容器は、一般には平底容器、例えば培養フラスコ、培養皿、培養プレートなどを使用することができる。底面積の大きい培養容器を使用すると、１枚の培養容器から大量の増殖細胞や大量の細胞由来成分を生産することができる。例えば５００ｃｍ２以上、好ましくは５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器を使用することが望ましい。
【0036】
（増殖培養）
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の存在下で、接着培養により培養する。
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の存在下で、接着培養により培養する。
【0037】
上述のとおり、本発明では、「インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント（以下、単にラミニンフラグメントともいう）またはその改変体」の存在下で幹細胞を培養すると、幹細胞を、低い細胞密度で播種しても、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができる（後述の実施例１、図３および４を参照）。
【0038】
したがって、培養は、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われることが望ましい。本明細書において、「コンフルエントの状態」とは、細胞が、培養容器の底面積の８０％以上を覆っている状態を指す。より好ましくは、培養は、細胞が、培養容器の底面積の８０～９０％を覆っている状態に達するまで行うことができる。
【0039】
ラミニンフラグメントまたはその改変体の存在下での培養は、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液を用いて行ってもよいし、ラミニンフラグメントまたはその改変体をプレコーティングした培養容器を用いて行ってもよい。ラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液を用いた培養は、ラミニンフラグメントまたはその改変体をプレコーティングした培養容器を用いた培養と比較すると、ラミニンフラグメントまたはその改変体の使用量が少ないことや操作が簡便であることから、好ましい。
【0040】
したがって、好ましくは、培養は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液中で行うことができる。
【0041】
ラミニンフラグメントは、インテグリン結合活性を有することが知られているラミニンフラグメントを使用することができる。「インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント」は、培養容器にプレコーティングすると、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養できることが報告されている（例えば、Nakagawa et al., Scientific Reports 4, Article Number: 3594 (2014)および国際公開第２０１１／０４３４０５号）。フィーダー細胞を使用しない培養は、フィーダーフリー培養と呼ばれ、動物由来成分である異種由来成分を使用しないため、利用が広まっている。したがって、当該技術分野においてヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞をフィーダーフリー培養で増殖させる際に使用されるラミニンフラグメントを、本発明の方法でも使用することができる。
【0042】
ラミニンフラグメントは、増殖培養液が異種由来成分を含まないことが好ましいことから、ヒト由来のラミニンフラグメントであることが好ましい。
【0043】
ラミニンフラグメントは、好ましくはラミニンＥ８フラグメント、より好ましくはラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである。ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントは、商品名ｉＭａｔｒｉｘ－５１１として、株式会社ニッピから市販されており、これを好適に用いることができる。ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖から構成され、α鎖としてα１～α５の５種類、β鎖としてβ１～β３の３種類、γ鎖としてγ１～γ３の３種類が知られている。ラミニン５１１は、α５、β１およびγ１から構成されるラミニンを指す。
【0044】
その他のラミニンフラグメントとして、例えば、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントなどを使用することができる。
【0045】
ラミニンフラグメントの改変体として、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子とから構成される公知の複合体、例えば、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと細胞接着分子との複合体、またはインテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体を使用することができる（ＷＯ２０１２／１３７９７０、ＷＯ２０１４／１０３５３４、およびＷＯ２０１６／０１００８２を参照）。
【0046】
ラミニンフラグメントの改変体として、好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体を使用することができる。かかる複合体に含まれるラミニンフラグメントは、上記で説明したラミニンフラグメントとすることができる。かかる複合体に含まれる増殖因子結合分子は、好ましくは、ヘパラン硫酸である。かかる複合体は、インテグリン結合活性に加えて、増殖因子結合活性を有する。
【0047】
ラミニンフラグメントの改変体は、より好ましくは、ラミニンＥ８フラグメントと増殖因子結合分子との複合体である。かかる複合体に含まれるラミニンＥ８フラグメントは、好ましくは、上記で例示したラミニンＥ８フラグメントである。かかる複合体に含まれる増殖因子結合分子は、好ましくは、ヘパラン硫酸である。したがって、ラミニンフラグメントの改変体は、更に好ましくは、上記で例示したラミニンＥ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である。ラミニンフラグメントの改変体は、最も好ましくは、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体、またはラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である。
【0048】
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体は、公知の遺伝子組換え技術を用いることにより組換えタンパク質として製造することができる。
【0049】
例えば、増殖培養液中のラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度は、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇとすることができる。好ましくは、増殖培養液中のラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度は、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇとすることができる。より好ましくは、増殖培養液中のラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度は、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇとすることができる。
【0050】
ここで、増殖培養液の液量を、例えば２００μｌ／ｃｍ２（培養面積）とすれば、０．００５μｇ／ｃｍ２～２μｇ／ｃｍ２は、０．０２５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌに相当し、０．０１μｇ／ｃｍ２～０．５μｇ／ｃｍ２は、０．０５μｇ／ｍｌ～２．５μｇ／ｍｌに相当し、０．０５μｇ／ｃｍ２～０．２５μｇ／ｃｍ２は、０．２５μｇ／ｍｌ～１．２５μｇ／ｍｌに相当する。
【0051】
上述のとおり、培養は、任意の培養容器で行うことができ、例えば５００ｃｍ２以上、好ましくは５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行うことができる。培養の途中で、増殖培養液を、同じ組成を有する新しいものに適宜交換してもよい。
【0052】
（効果）
従来、細胞を低い細胞密度で播種すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができなかったのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる。これにより、培養容器１枚の細胞から、次の代で培養される培養容器の枚数を増やすことができ、増殖細胞や細胞由来成分を効率良く生産することができる。
従来、細胞を低い細胞密度で播種すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができなかったのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができる。これにより、培養容器１枚の細胞から、次の代で培養される培養容器の枚数を増やすことができ、増殖細胞や細胞由来成分を効率良く生産することができる。
【0053】
＜２．細胞生産物の生産方法＞
＜２－１．第１実施形態（１回の生産培養工程を行う実施形態）＞
別の側面によれば、上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
＜２－１．第１実施形態（１回の生産培養工程を行う実施形態）＞
別の側面によれば、上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
【0054】
すなわち、細胞生産物の生産方法は、
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む。
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む。
【0055】
以下の説明において、増殖培養液中での培養を「増殖培養」と呼び、生産培養液中での培養を「生産培養」と呼ぶ。
【0056】
上述のとおり、好ましくは、増殖培養は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液中で行うことができる。すなわち、好ましい態様によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法が提供される。
【0057】
（増殖培養）
増殖培養までの工程は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
増殖培養までの工程は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
【0058】
（生産培養）
増殖培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する」とは、増殖培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま生産培養を行うことを意味する。
増殖培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養する」とは、増殖培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま生産培養を行うことを意味する。
【0059】
生産培養は、増殖培養後に、培養容器中の増殖培養液を生産培養液に置き換えることにより行うことができる。これにより、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養することができる。
【0060】
生産培養の間に、細胞は細胞生産物を生産し、生産培養液中に放出することができる。細胞生産物は、細胞が生産培養液中に放出する任意の物質であり、例えば、アミノ酸、脂質、糖などの細胞代謝物；ホルモン；ペプチド；サイトカイン、細胞外マトリックスなどの分泌タンパク質；またはエクソソームなどが挙げられる。例えば、幹細胞は、各種サイトカインやエクソソームを生産し、生産培養液中に放出することができる。したがって、細胞生産物の生産方法は、生産培養の後に、生産培養液の上清を回収する工程を更に含んでいてもよい。
【0061】
回収工程で得られる生産培養液の上清は、疾患治療や再生医療などの治療用途に利用することが想定される。したがって、生産培養液は、異種由来成分を含まない培養液であることが望ましい。異種由来成分は、培養される細胞がヒト細胞である場合には、ヒト以外の動物由来成分を指す。また、生産培養液は、サイトカインやインスリンを含まない培養液であることが望ましい。また、生産培養液は、タンパク質を含まない培養液であることが望ましい。また、生産培養液は、血清を含まない培養液であることが望ましい。
【0062】
より好ましくは、生産培養液は、異種由来成分を含まず、かつ、サイトカインやインスリンを含まない細胞培養液である。更に好ましくは、生産培養液は、異種由来成分を含まず、かつ、サイトカインやインスリンを含まず、かつ、タンパク質を含まない細胞培養液である。更に好ましくは、生産培養液は、異種由来成分を含まず、かつ、サイトカインやインスリンを含まず、かつ、タンパク質を含まず、かつ、血清を含まない細胞培養液である。
【0063】
生産培養液は、細胞の種類に適した細胞培養液のうち、上記成分（すなわち、異種由来成分、サイトカイン、インスリン、タンパク質、およびヒト血清）を含まない細胞培養液を使用することができる。より具体的には、生産培養液は、細胞培養用基本培地（例えば、MEM、DMEM、IMDM、Ham’s F-12、DMEM/F12、RPMI1640など）を使用してもよいし、あるいは、細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地を使用してもよい。細胞培養用基本培地は、市販されており、一般的には、アミノ酸、ビタミン、無機塩および炭素源を含む。生産培養液は、ラミニンフラグメントやその改変体を含む必要はない。
【0064】
ヒト間葉系幹細胞の場合、生産培養液は、例えば、DMEM/F12培地にアミノ酸を添加したものを使用することができる。添加されるアミノ酸としては、市販の培地添加用アミノ酸溶液、例えばMEM必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）、MEM非必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）などを使用することができる。この生産培養液は、異種由来成分、サイトカインやインスリン、タンパク質、ヒト血清の何れも含まない。
【0065】
生産培養の期間は特に限定されないが、例えば０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行うことができる。
【0066】
（効果）
従来、増殖培養の途中で細胞の増殖が停止したり、生産培養の途中で細胞が培養容器から剥離して、細胞の接着状態を維持することができなかったりしたのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。これにより、簡便な手法で多量の細胞生産物を生産することができる。
従来、増殖培養の途中で細胞の増殖が停止したり、生産培養の途中で細胞が培養容器から剥離して、細胞の接着状態を維持することができなかったりしたのに対し、上述の方法によれば、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。これにより、簡便な手法で多量の細胞生産物を生産することができる。
【0067】
具体的には、上述の方法は、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができるため、少ない量の原料細胞から、多量の細胞生産物を生産することができる。また、上述の方法は、細胞の接着状態を維持することができるため、培養液を交換するだけで、増殖培養から生産培養に移行させることができる点で簡便である。すなわち、上述の方法は、細胞継代を行う必要がなく、これにより、継代によるロット差や継代にかかるコストをなくすこともできる。また、上述の方法は、細胞の接着状態を維持することができるため、細胞生産物を含有する培養上清を容易に回収することができる点で簡便である。
【0068】
＜２－２．第２実施形態（複数回の生産培養工程を行う実施形態）＞
別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
別の側面によれば、
上述の「増殖細胞の生産方法」に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
【0069】
すなわち、細胞生産物の生産方法は、
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される。
０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される。
【0070】
以下の説明において、増殖培養液中での培養を「増殖培養」と呼び、生産培養液中での培養を「生産培養」と呼び、回復培養液中での培養を「回復培養」と呼ぶ。
【0071】
上述のとおり、好ましくは、増殖培養は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液中で行うことができる。すなわち、好ましい態様によれば、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法が提供される。
【0072】
（増殖培養）
増殖培養までの工程は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
増殖培養までの工程は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、増殖細胞を接着状態で得ることができる。増殖培養を、細胞がコンフルエントの状態に達するまで行えば、増殖細胞をコンフルエントの状態で得ることができる。
【0073】
（生産培養）
生産培養の工程は、＜２－１．第１実施形態（１回の生産培養工程を行う実施形態）＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、細胞に細胞生産物を生産させることができる。
生産培養の工程は、＜２－１．第１実施形態（１回の生産培養工程を行う実施形態）＞の欄で説明したとおり行うことができる。これにより、細胞に細胞生産物を生産させることができる。
【0074】
（回復培養）
生産培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する」とは、生産培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま回復培養を行うことを意味する。
生産培養後、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する。「増殖細胞を、接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養する」とは、生産培養後、培養容器底面に接着している細胞を、培養容器底面から剥がさないで接着状態を維持したまま回復培養を行うことを意味する。
【0075】
回復培養は、生産培養後に、培養容器中の生産培養液を回復培養液に置き換えることにより行うことができる。これにより、増殖細胞を、接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養した後、さらに接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することができる。
【0076】
回復培養の間に、細胞を、再度、細胞生産物を十分な量で生産可能な状態に回復させることができる。すなわち、回復培養は、次の生産培養工程に向けて、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させるために行う培養である。
【0077】
回復培養は、細胞の増殖培養で用いられる培養液を用いて行うことができる。すなわち、回復培養液は、細胞の種類に応じて、細胞の増殖培養液として公知のものを使用することができる。例えば、ヒト幹細胞の場合、ヒト幹細胞の増殖用培地として市販されているものを使用することができる。
【0078】
回復培養液は、培養細胞や培養液が疾患治療や再生医療などの治療用途に利用されることを考えると、血清フリーで、異種由来成分を含まない（ゼノフリー）タイプの培地であることが望ましい。
【0079】
また、回復培養液は、上述の「生産培養液」がタンパク質を含まないことが好ましいのに対し、細胞の増殖を促進するタンパク質を含むことが好ましい。幹細胞の増殖を促進するタンパク質として、例えば、ｂFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）、TGFβ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、EGF（上皮細胞増殖因子）、IGF（インスリン様増殖因子）、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）、HGF（肝細胞増殖因子）、インスリン、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。より具体的には、回復培養液は、細胞培養用基本培地（例えば、MEM、DMEM、IMDM、Ham’s F-12、DMEM/F12、RPMI1640など）に増殖因子を添加することにより調製された培地を使用してもよい。
【0080】
回復培養液は、増殖培養液と同じ組成の培養液を使用してもよい。ただし、回復培養液は、ラミニンフラグメントやその改変体を含む必要はない。
【0081】
ヒト間葉系幹細胞の場合、回復培養液として、例えば、MSC Expansion XSFM B培地（富士フイルム和光純薬株式会社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF（タカラバイオ株式会社）、MSC NutriStem XF Medium（Biological Industries社）などを使用することができる。これらの回復培養液は、何れも、血清フリーで、異種由来成分を含まない（ゼノフリー）タイプの培地である。
【0082】
上述のとおり、生産培養と回復培養は、細胞の接着状態を維持したまま交互に繰り返すことができる。生産培養と回復培養のサイクルは、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させることができる限り、制限なく繰り返すことができる。生産培養と回復培養のサイクルは、例えば、２～１０回繰り返すことができる。これにより、生産培養を行う度に、細胞は細胞生産物を生産し、培養液中に放出することができる。したがって、細胞生産物の生産方法は、生産培養の後に、生産培養液の上清を回収する工程を更に含んでいてもよい。
【0083】
回復培養の期間は特に限定されないが、例えば０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行うことができる。
【0084】
（効果）
第２実施形態に係る方法は、第１実施形態に係る方法と同様、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。加えて、第２実施形態に係る方法は、生産培養を終えた細胞の接着状態を維持したまま回復培養を行い、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させることができる。これにより、細胞の接着状態を維持したまま複数回の生産培養工程を繰り返し行うことができ、その結果、簡便な手法で多量の細胞生産物を長期にわたって生産することができる。
第２実施形態に係る方法は、第１実施形態に係る方法と同様、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させ、その後、得られた増殖細胞の接着状態を維持したまま生産培養を行うことができる。加えて、第２実施形態に係る方法は、生産培養を終えた細胞の接着状態を維持したまま回復培養を行い、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させることができる。これにより、細胞の接着状態を維持したまま複数回の生産培養工程を繰り返し行うことができ、その結果、簡便な手法で多量の細胞生産物を長期にわたって生産することができる。
【0085】
具体的には、第２実施形態に係る方法は、低い細胞密度で播種された細胞を高い増殖倍率で増殖させることができるため、少ない量の原料細胞から、多量の細胞生産物を生産することができる。また、第２実施形態に係る方法は、細胞の接着状態を維持することができるため、培養液を交換するだけで、増殖培養から生産培養へ移行させたり、生産培養と回復培養のサイクルを繰り返したりすることができる点で簡便である。すなわち、第２実施形態に係る方法は、細胞継代を行う必要がなく、これにより、継代によるロット差や継代にかかるコストをなくすこともできる。また、第２実施形態に係る方法は、細胞の接着状態を維持することができるため、細胞生産物を含有する培養上清を容易に回収することができる点で簡便である。
【0086】
とりわけ第２実施形態に係る方法は、生産培養と回復培養のサイクルを繰り返す度に細胞生産物を生産することができるため、長期にわたる物質生産が可能であるという利点を有する。また第２実施形態に係る方法は、生産培養と回復培養のサイクルを繰り返しても、細胞生産物の生産量が低下しないため、多量の細胞生産物を継続して生産できるという利点を有する。
【0087】
＜３．好ましい実施形態＞
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
［Ａ１］ ０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ２］ ０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ３］ 増殖培養液と、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度を達成する量の細胞と、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ４］ 増殖培養液と、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度を達成する量の細胞とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
播種された前記細胞懸濁液に、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を添加することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ５］ 前記細胞が幹細胞である［Ａ１］～［Ａ４］の何れか１に記載の方法。
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
［Ａ１］ ０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ２］ ０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された細胞を、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を含有する増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることを含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ３］ 増殖培養液と、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度を達成する量の細胞と、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ４］ 増殖培養液と、０．００２～２０００細胞／ｃｍ２の播種密度を達成する量の細胞とを含む細胞懸濁液を培養容器に播種することと、
播種された前記細胞懸濁液に、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質を添加することと、その後、
前記細胞を前記増殖培養液中で、接着培養により培養して、前記細胞を増殖させることと
を含む、増殖細胞の生産方法。
［Ａ５］ 前記細胞が幹細胞である［Ａ１］～［Ａ４］の何れか１に記載の方法。
【0088】
［Ａ６］ 前記細胞が、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である［Ａ１］～［Ａ５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ７］ 前記細胞が間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ８］ 前記細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ９］ 前記細胞が臍帯由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１０］ 前記細胞がヒト幹細胞である［Ａ１］～［Ａ５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ７］ 前記細胞が間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ８］ 前記細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ９］ 前記細胞が臍帯由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１０］ 前記細胞がヒト幹細胞である［Ａ１］～［Ａ５］の何れか１に記載の方法。
【0089】
［Ａ１１］ 前記細胞が、ヒト間葉系幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、またはヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である［Ａ１］～［Ａ６］および［Ａ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１２］ 前記細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ７］、［Ａ１０］および［Ａ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１３］ 前記細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ８］および［Ａ１０］～［Ａ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１４］ 前記細胞がヒト臍帯由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１５］ 前記細胞が凍結細胞である［Ａ１］～［Ａ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１２］ 前記細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ７］、［Ａ１０］および［Ａ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１３］ 前記細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ８］および［Ａ１０］～［Ａ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１４］ 前記細胞がヒト臍帯由来間葉系幹細胞である［Ａ１］～［Ａ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１５］ 前記細胞が凍結細胞である［Ａ１］～［Ａ１４］の何れか１に記載の方法。
【0090】
［Ａ１６］ 前記細胞が、凍結細胞を融解することにより準備された細胞である［Ａ１］～［Ａ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１７］ 前記細胞が、０．００２～１９００細胞／ｃｍ２、好ましくは０．００２～１８００細胞／ｃｍ２、より好ましくは０．００２～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される［Ａ１］～［Ａ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１８］ 前記細胞が、１～２０００細胞／ｃｍ２、好ましくは１～１９００細胞／ｃｍ２、より好ましくは１～１８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される［Ａ１］～［Ａ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１９］ 前記増殖培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ａ１］～［Ａ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２０］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ａ１］～［Ａ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１７］ 前記細胞が、０．００２～１９００細胞／ｃｍ２、好ましくは０．００２～１８００細胞／ｃｍ２、より好ましくは０．００２～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは０．００２～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される［Ａ１］～［Ａ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１８］ 前記細胞が、１～２０００細胞／ｃｍ２、好ましくは１～１９００細胞／ｃｍ２、より好ましくは１～１８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１１００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１０００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～９００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～８００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～７００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～６００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～５００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～４００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～３００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～２００細胞／ｃｍ２、更に好ましくは１～１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される［Ａ１］～［Ａ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１９］ 前記増殖培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ａ１］～［Ａ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２０］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ａ１］～［Ａ１９］の何れか１に記載の方法。
【0091】
［Ａ２１］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ａ１］～［Ａ２０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２２］ 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ａ１］～［Ａ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２３］ 前記培養が、５００ｃｍ２以上の底面積を有する培養容器で行われる［Ａ１］～［Ａ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２４］ 前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ａ１］～［Ａ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２５］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ａ１］～［Ａ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２２］ 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ａ１］～［Ａ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２３］ 前記培養が、５００ｃｍ２以上の底面積を有する培養容器で行われる［Ａ１］～［Ａ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２４］ 前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ａ１］～［Ａ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２５］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ａ１］～［Ａ２４］の何れか１に記載の方法。
【0092】
［Ａ２６］ 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである［Ａ２５］に記載の方法。
［Ａ２７］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ａ２５］または［Ａ２６］に記載の方法。
［Ａ２８］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ２５］～［Ａ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２９］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ａ２５］～［Ａ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３０］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ａ１］～［Ａ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２７］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ａ２５］または［Ａ２６］に記載の方法。
［Ａ２８］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ２５］～［Ａ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ２９］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ａ２５］～［Ａ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３０］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ａ１］～［Ａ２４］の何れか１に記載の方法。
【0093】
［Ａ３１］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である［Ａ３０］に記載の方法。
［Ａ３２］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ａ３０］または［Ａ３１］に記載の方法。
［Ａ３３］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ａ３１］または［Ａ３２］に記載の方法。
［Ａ３４］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］に記載の方法。
［Ａ３５］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］または［Ａ３４］に記載の方法。
［Ａ３６］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］または［Ａ３４］に記載の方法。
［Ａ３２］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ａ３０］または［Ａ３１］に記載の方法。
［Ａ３３］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ａ３１］または［Ａ３２］に記載の方法。
［Ａ３４］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］に記載の方法。
［Ａ３５］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］または［Ａ３４］に記載の方法。
［Ａ３６］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ａ３３］または［Ａ３４］に記載の方法。
【0094】
［Ａ３７］ 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である［Ａ３２］～［Ａ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３８］ 前記改変体が、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ａ３０］～［Ａ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３９］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ａ３０］～［Ａ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４０］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ａ１］～［Ａ３９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４１］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ａ１］～［Ａ４０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４２］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ａ１］～［Ａ４１］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３８］ 前記改変体が、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ａ３０］～［Ａ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ３９］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ａ３０］～［Ａ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４０］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ａ１］～［Ａ３９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４１］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ａ１］～［Ａ４０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ４２］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ａ１］～［Ａ４１］の何れか１に記載の方法。
【0095】
［Ｂ１］ ［Ａ１］～［Ａ４２］の何れか１に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法。
［Ｂ２］ ［Ａ１］～［Ａ４２］の何れか１に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法。
［Ｂ３］ 前記細胞生産物が、アミノ酸、脂質、糖などの細胞代謝物；ホルモン；ペプチド；サイトカイン、細胞外マトリックスなどの分泌タンパク質；またはエクソソームである［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］ 前記細胞生産物がサイトカインである［Ｂ１］～［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５］ 前記細胞生産物がエクソソームである［Ｂ１］～［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと
を含む、細胞生産物の生産方法。
［Ｂ２］ ［Ａ１］～［Ａ４２］の何れか１に記載の方法に従って細胞を増殖培養液中で培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返される、細胞生産物の生産方法。
［Ｂ３］ 前記細胞生産物が、アミノ酸、脂質、糖などの細胞代謝物；ホルモン；ペプチド；サイトカイン、細胞外マトリックスなどの分泌タンパク質；またはエクソソームである［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］ 前記細胞生産物がサイトカインである［Ｂ１］～［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５］ 前記細胞生産物がエクソソームである［Ｂ１］～［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
【0096】
［Ｂ６］ 前記生産培養液が、異種由来成分を含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ７］ 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ８］ 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ９］ 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１０］ 前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む［Ｂ１］～［Ｂ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ７］ 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ８］ 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ９］ 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である［Ｂ１］～［Ｂ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１０］ 前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む［Ｂ１］～［Ｂ９］の何れか１に記載の方法。
【0097】
［Ｂ１１］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地を含む培養液であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｂ１］～［Ｂ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１２］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ１］～［Ｂ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１３］ 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ１］～［Ｂ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１４］ 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｂ１］～［Ｂ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１５］ 前記生産培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｂ１］～［Ｂ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１２］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ１］～［Ｂ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１３］ 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ１］～［Ｂ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１４］ 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｂ１］～［Ｂ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１５］ 前記生産培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｂ１］～［Ｂ１４］の何れか１に記載の方法。
【0098】
［Ｂ１６］ 前記回復培養液が、前記細胞の増殖培養液である［Ｂ２］～［Ｂ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１７］ 前記回復培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む培養液である［Ｂ２］～［Ｂ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１８］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｂ２］～［Ｂ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１９］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ２］～［Ｂ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２０］ 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する［Ｂ２］～［Ｂ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１７］ 前記回復培養液が、前記細胞の増殖を促進するタンパク質を含む培養液である［Ｂ２］～［Ｂ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１８］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｂ２］～［Ｂ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１９］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｂ２］～［Ｂ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２０］ 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する［Ｂ２］～［Ｂ１９］の何れか１に記載の方法。
【0099】
［Ｂ２１］ 前記回復培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｂ２］～［Ｂ２０］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２２］ 前記回復培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｂ２］～［Ｂ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２３］ 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、２～１０回繰り返される［Ｂ２］～［Ｂ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２２］ 前記回復培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｂ２］～［Ｂ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２３］ 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、２～１０回繰り返される［Ｂ２］～［Ｂ２２］の何れか１に記載の方法。
【0100】
以下に、「間葉系幹細胞集団およびその生産方法」、「幹細胞の培養上清およびその生産方法」、並びに「間葉系幹細胞集団または幹細胞の培養上清を含む治療剤」について説明する。
【0101】
＜４．間葉系幹細胞集団およびその生産方法＞
本発明者らは、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーであるＨＬＡ－ＡＢＣおよびＣＤ１０５の発現が低下することを新たに見出した（後述の実施例４を参照）。
本発明者らは、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーであるＨＬＡ－ＡＢＣおよびＣＤ１０５の発現が低下することを新たに見出した（後述の実施例４を参照）。
【0102】
当該技術分野において、間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性であり、ＣＤ１０５陽性であることが知られている。また、当該技術分野において、細胞表面マーカーが陽性であることは、細胞表面マーカーの陽性率の値により表すことができる。細胞表面マーカーの陽性率は、後述の実施例に記載されるとおり、細胞表面マーカーの蛍光標識抗体を用いてフローサイトメーターにより求めることができる。
【0103】
したがって、一つの実施形態によれば、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法が提供される。この方法において、得られた増殖細胞は、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する。「ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率」は、間葉系幹細胞集団におけるＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率（％）を表す。
【0104】
この方法によれば、培養前の間葉系幹細胞集団と比べて、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する間葉系幹細胞集団を得ることができる。例えば、この方法によれば、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率が７０％以下である間葉系幹細胞集団を得ることができる。この間葉系幹細胞集団において、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率は、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、更に好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【0105】
好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率および低下したＣＤ１０５陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法が提供される。この方法において、得られた増殖細胞は、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率および低下したＣＤ１０５陽性率を有する。「ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率」は、間葉系幹細胞集団におけるＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率（％）を表し、「ＣＤ１０５陽性率」は、間葉系幹細胞集団におけるＣＤ－１０５陽性の間葉系幹細胞の比率（％）を表す。
【0106】
この方法によれば、培養前の間葉系幹細胞集団と比べて、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率および低下したＣＤ１０５陽性率を有する間葉系幹細胞集団を得ることができる。例えば、この方法によれば、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率が７０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性率が５０％以下である間葉系幹細胞集団を得ることができる。この間葉系幹細胞集団において、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率は、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、更に好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。この間葉系幹細胞集団において、ＣＤ１０５陽性率は、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である。
【0107】
上述の「間葉系幹細胞集団の生産方法」は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明したとおり実施することができる。＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄では、培養開始時における細胞密度（すなわち、細胞の播種密度）は、通常より低い播種密度（０．００２～２０００細胞／ｃｍ２）を採用することを記載している。ただし、上述の「間葉系幹細胞集団の生産方法」では、通常より低い播種密度を採用する必要はなく、２０００細胞／ｃｍ２を超える播種密度を採用してもよい。すなわち、上述の「間葉系幹細胞集団の生産方法」では、増殖培養の開始時における細胞密度（すなわち、細胞の播種密度）は、例えば２００１～１００００００細胞／ｃｍ２、好ましくは５０００～２００００細胞／ｃｍ２とすることができる。もちろん、この方法において、通常より低い播種密度（０．００２～２０００細胞／ｃｍ２）を採用してもよい。
【0108】
ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率が低い間葉系幹細胞は、治療剤として投与された際にホストの免疫応答（免疫拒絶）を受けにくいため、細胞生存率が高く、高い治療効果を発揮することが期待できる。
ＣＤ１０５の陽性率が低い細胞は、ＴＧＦｂ１の発現量が高く、Ｔ細胞増殖を抑制するため、炎症疾患への治療効果が期待されている報告がある。
ＣＤ１０５の陽性率が低い細胞は、ＴＧＦｂ１の発現量が高く、Ｔ細胞増殖を抑制するため、炎症疾患への治療効果が期待されている報告がある。
【0109】
本明細書において、「間葉系幹細胞」の用語は、上述の方法で培養する前の間葉系幹細胞も、上述の方法で培養することにより得られた間葉系幹細胞も包含する。すなわち、本明細書において、「間葉系幹細胞」の用語は、ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性である間葉系幹細胞や、ＣＤ１０５陽性である間葉系幹細胞に加えて、ＨＬＡ－ＡＢＣ陰性である間葉系幹細胞や、ＣＤ１０５陰性である間葉系幹細胞も包含する。したがって、本明細書において、「間葉系幹細胞」の用語は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＨＬＡ－ＤＲが陰性である間葉系幹細胞と定義することができる。
【0110】
＜５．幹細胞の培養上清およびその生産方法＞
本発明者らは、＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養し、その後、生産培養液中での培養と回復培養液中での培養とを交互に繰り返し、生産培養液の上清を回収すると、生産培養の回数を重ねるにつれて、培養上清中のサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームの量が増加することを新たに見出した（後述の実施例５を参照）。
本発明者らは、＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養し、その後、生産培養液中での培養と回復培養液中での培養とを交互に繰り返し、生産培養液の上清を回収すると、生産培養の回数を重ねるにつれて、培養上清中のサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームの量が増加することを新たに見出した（後述の実施例５を参照）。
【0111】
したがって、一つの実施形態によれば、幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。この方法において、幹細胞は、例えば間葉系幹細胞である。
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法が提供される。この方法において、幹細胞は、例えば間葉系幹細胞である。
【0112】
本明細書において「細胞の培養上清」という表現は、細胞を培養液中で培養し、培養後に得られた細胞と培養液の混合物から、細胞や不純物を取り除くことにより得られる上澄み液を指し、細胞由来の培養上清ということもできる。細胞の培養上清は、滅菌処理などの処理を施された培養上清も包含する。「幹細胞の培養上清」、「間葉系幹細胞の培養上清」など「特定の細胞の培養上清」という表現も、同様の意味を有する。
【0113】
この方法は、＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄で説明したとおり実施することができる。＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄では、増殖培養の開始時における細胞密度（すなわち、細胞の播種密度）は、通常より低い播種密度（０．００２～２０００細胞／ｃｍ２）を採用することを記載している。ただし、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」では、通常より低い播種密度を採用する必要はなく、２０００細胞／ｃｍ２を超える播種密度を採用してもよい。すなわち、この方法では、増殖培養の開始時における細胞密度（すなわち、細胞の播種密度）は、例えば２００１～１００００００細胞／ｃｍ２、好ましくは５０００～２００００細胞／ｃｍ２とすることができる。もちろん、この方法において、通常より低い播種密度（０．００２～２０００細胞／ｃｍ２）を採用してもよい。
【0114】
上述のとおり、この方法に従って生産培養と回復培養を交互に繰り返し、生産培養液の上清を回収すると、生産培養の回数を重ねるにつれて、培養上清中のサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームの量を増大させることができる。したがって、この方法において、生産培養液の上清の回収は、生産培養液中での２回目以降の生産培養の後に行われることが好ましい。生産培養液の上清の回収は、生産培養液中での３回目以降の生産培養の後に行われることがより好ましい。
【0115】
生産培養液の上清の回収は、幹細胞によるサイトカインなどの細胞生産物の分泌量が維持されている限り、繰り返し行うことができる。すなわち、この方法において、生産培養の繰り返し回数は特に制限されない。例えば、生産培養液の上清の回収は、生産培養液中での２～１０回目の生産培養の後に行うことができる。
【0116】
上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」によれば、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームなどの細胞生産物を多量に含む、幹細胞の培養上清を得ることができる。
【0117】
具体的には、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」によれば、５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦ（hepatocyte growth factor）を含有する、幹細胞の培養上清を得ることができる（図１６および１７参照）。以下、この培養上清を、第１実施形態に係る培養上清ともいう。この培養上清は、例えば５０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１００００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する。この培養上清は、例えば５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する。ＨＧＦは、血管新生効果や創傷治癒効果を有することが知られている。
【0118】
また、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」によれば、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清を得ることができる（図４２参照）。以下、この培養上清を、第２実施形態に係る培養上清ともいう。この培養上清は、例えば５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する。この培養上清は、例えば５０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する。ＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質は、エクソソームのマーカータンパク質であり、培養上清中のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質の含量が高いことは、培養上清中のエクソソーム含量が高いことを表す。エクソソームは、血管新生効果や創傷治癒効果を有することが知られている。
【0119】
好ましい実施形態において、第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、３０００ｐｇ／ｍＬ以上のＭＣＰ－１（monocyte chemotactic protein-1）、１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＧＲＯ（growth-related oncogene）、および５μｇ/ｍＬ以上のフィブロネクチンを更に含有することができる（図１８～２０参照）。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、例えば３０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは４０００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは６０００ｐｇ／ｍＬ以上のＭＣＰ－１；例えば１０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２０００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４０００ｐｇ／ｍＬ以上のＧＲＯ；および、例えば５μｇ/ｍＬ以上、好ましくは６μｇ/ｍＬ以上、より好ましくは８μｇ/ｍＬ以上のフィブロネクチンを更に含有することができる。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、例えば３０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは６０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＭＣＰ－１；例えば１０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは２０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＧＲＯ；および、例えば５～１０００μｇ/ｍＬ、好ましくは６～１０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは８～１０００μｇ/ｍＬのフィブロネクチンを更に含有することができる。ＭＣＰ－１、ＧＲＯおよびフィブロネクチンは、いずれも、血管新生効果や創傷治癒効果を有することが知られている。なお、ＧＲＯは、ＣＸＣＬ１としても知られているため、本明細書では、ＧＲＯ／ＣＸＣＬ１とも表記する。
【0120】
好ましい実施形態において、第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、２００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ（transforming growth factor-1b）、５ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４（interleukin-4）、および１０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０（interleukin-10）を更に含有することができる（図２３～２５参照）。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、例えば２００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ；例えば５ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４；および、例えば８ｐｇ/ｍＬ以上、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１２ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０を更に含有することができる。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、例えば２００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは３００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは５００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ－１ｂ；例えば５～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２０～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－４；および、例えば８～１０００００ｐｇ/ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１２～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１０を更に含有することができる。ＴＧＦ－１ｂ、ＩＬ－４およびＩＬ－１０は、いずれも、抗炎症効果を有することが知られている。
【0121】
第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンの少なくとも１つを含まないことが好ましい。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンのいずれも含まないことがより好ましい。培養上清を得るための生産培養において、生産培養液として、上記成分を含まない培養液を使用することにより、上記成分を含まない培養上清を得ることができる。培養上清は、治療剤として使用されることを考えると、上記成分を含まないことが望ましい。
【0122】
また、第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、組換えタンパク質を含まないことが好ましい。幹細胞として、組換えタンパク質を産生するように遺伝子操作されていない幹細胞を使用することにより、組換えタンパク質を含まない培養上清を得ることができる。培養上清は、治療剤として使用されることを考えると、細胞の遺伝子操作により予期しない成分が培養上清に分泌されるリスクや産生された組換えタンパク質の未知の副作用が懸念されるため、組換えタンパク質を含まないことが望ましい。
【0123】
また、第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、異種由来成分を含まないことが好ましい。ここで「異種」とは、培養上清を得るために使用した幹細胞の生物種に対して異なる種を指す。培養上清は、治療剤として使用されることを考えると、異種由来成分を含まないことが望ましい。
【0124】
第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、ＩＬ－１α（interleukin-1α）、ＩＬ－１β（interleukin-1β）およびＴＮＦ－α（tumor necrosis factor-α）の少なくとも１つを０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含むことが好ましい（図３０～３２参照）。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの各々を、０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含むことがより好ましい。これらのサイトカインは、炎症症状を引き起こす因子として知られているため、培養上清に大量に含まれていないことが望ましい。
【0125】
第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、２０種類以上のサイトカインを含み、かつ、各サイトカインが１０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度を有することが好ましい。後述の実施例では、３回目の生産培養の後に回収された培養上清が、サイトカインとして、ＨＧＦ、ＭＣＰ－１、ＧＲＯ、ＰＤＧＦ－ＡＡ（platelet-derived growth factor-AA）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＴＧＦ－１ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－９、ＩＬ－８、エオタキシン、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor）、ＧＭ－ＣＳＦ（granulocyte macrophage-colony stimulating factor）、ＭＣＰ－３（monocyte chemotactic protein-3）、ＩＬ－１２Ｐ４０（interleukin-12の40kDaサブユニット）、ＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein-10）、およびＭＩＰ－１α（macrophage inflammatory protein-1α）を含み、かつ、これらサイトカインの各々が１０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度を有することが実証されている（図１６～１９、２１～２９、３３～４１参照）。２０種以上のサイトカインの各サイトカインの濃度は、サイトカインの種類によって異なるが、例えば１００００００ｐｇ／ｍＬ以下である。
【0126】
第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、間葉系幹細胞の培養上清であることが好ましい。第１実施形態に係る培養上清および第２実施形態に係る培養上清の各々は、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清であることがより好ましい。間葉系幹細胞の培養上清は、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームをより多くの量で含むことができる。臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清は、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームをとりわけ多量に含むことができる。
【0127】
後述の実施例では、間葉系幹細胞の培養上清について記載されるが、間葉系幹細胞以外の幹細胞、例えばＥＳ細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞や、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞といった体性幹細胞も、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームを培養液に分泌することが知られている。したがって、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」を、間葉系幹細胞以外の幹細胞、例えばＥＳ細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞や、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞といった体性幹細胞を用いて行った場合も、「間葉系幹細胞の培養上清」と同様、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームを多量に含む培養上清を得ることができる。
【0128】
また、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」を、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームを培養液に分泌することが知られている、幹細胞以外の細胞を用いて行った場合も、「幹細胞の培養上清」と同様、サイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームを多量に含む培養上清を得ることができる。したがって、上述の「幹細胞の培養上清の生産方法」は、「細胞の培養上清の生産方法」まで拡張することができ、「幹細胞の培養上清」は、「細胞の培養上清」まで拡張することができる。
【0129】
＜６．治療剤＞
本発明者らは、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、得られた間葉系幹細胞は、下肢虚血モデルのラットの虚血下肢の血流を有意に増加させることができることを新たに見出した（後述の実施例６を参照）。
本発明者らは、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養すると、得られた間葉系幹細胞は、下肢虚血モデルのラットの虚血下肢の血流を有意に増加させることができることを新たに見出した（後述の実施例６を参照）。
【0130】
したがって、別の側面によれば、本発明の間葉系幹細胞集団を含む治療剤が提供される。上述のとおり、本発明の間葉系幹細胞集団は、＜１．増殖細胞の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養することにより得ることができる。本発明の間葉系幹細胞集団は、上述のとおり、間葉系幹細胞集団に関する従来の知見と異なり、特定の細胞表面マーカーＨＬＡ－ＡＢＣの陽性率が低いという特徴を有する。
【0131】
また、別の側面によれば、本発明の培養上清を含む治療剤が提供される。上述のとおり、本発明の培養上清は、＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養し、その後、生産培養液中での培養を行い、生産培養液の上清を回収することにより得ることができる。また、本発明の培養上清は、＜２．細胞生産物の生産方法＞の欄で説明した方法に従って、間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの存在下において培養し、その後、生産培養液中での培養と回復培養液中での培養とを繰り返し、生産培養液の上清を回収することにより得ることができる。本発明の培養上清は、上述のとおり、従来の培養上清と比べて、サイトカイン、細胞外マトリックスおよびエクソソームを多量に含んでいるという特徴を有する。
【0132】
本発明の間葉系幹細胞集団は、サイトカイン（例えば、HGF、MCP-1、GRO/CXCL1、PDGF-AA、VEGF、TGF-1b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-7、IL-15、IL-9、IL-8、EOTAXIN、IL-6、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、IL-12P40、IP-10、およびMIP-1α）、細胞外マトリックス（例えば、Fibronectin）およびエクソソームを分泌することが実証されており、本発明の培養上清は、間葉系幹細胞により分泌された、サイトカイン、細胞外マトリックスおよびエクソソームを含むことが実証されている。したがって、本発明の間葉系幹細胞集団または本発明の培養上清を含む治療剤は、間葉系幹細胞が治療効果を奏することが知られている疾患、間葉系幹細胞の培養上清が治療効果を奏することが知られている疾患に加えて、サイトカインが治療効果を奏することが知られている疾患、細胞外マトリックスが治療効果を奏することが知られている疾患、およびエクソソームが治療効果を奏することが知られている疾患を治療するために使用することができる。
【0133】
例えば、本発明の間葉系幹細胞集団または本発明の培養上清を含む治療剤は、HGF、MCP-1、MCP-3、GRO/CXCL1、Fibronectin、PDGF-AA、VEGF、IL-8、EOTAXIN、IL-6、IP-10、エクソソームが、血管新生効果を持つことが知られていることから、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニアの治療のために使用することができる。
【0134】
また、本発明の間葉系幹細胞集団または本発明の培養上清を含む治療剤は、TGF-1ｂ、IL-4、IL-10、IL-13が、抗炎症効果を持つサイトカインとして知られていることから、リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；腎炎、角膜炎、サイトカインストームなどの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患の治療のために使用することができる。
【0135】
また、本発明の間葉系幹細胞集団または本発明の培養上清を含む治療剤は、IL-7、IL-15、GM-CSF、G-CSFが、免疫調節に関わると考えらえていることから、GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；がん疾患の治療のために使用することができる。
【0136】
間葉系幹細胞集団を治療剤の有効成分として使用した場合、本発明の間葉系幹細胞は、サイトカインなどの細胞生産物を継続して分泌することができるため、長期的な治療効果を期待することができる。一方、間葉系幹細胞の培養上清を治療剤の有効成分として使用した場合、本発明の培養上清は、サイトカインなどの細胞生産物を多量に含んでいるため、十分な治療効果を期待することができる。
【0137】
本発明の間葉系幹細胞集団を含む治療剤および本発明の培養上清を含む治療剤（以下、両者をまとめて治療剤という）は、例えば液剤であり、好ましくは、注射用液剤または外用液剤である。治療剤は、薬学的に許容し得る媒体により希釈されていてもよい。薬学的に許容し得る媒体は、例えば、間葉系幹細胞の培地または輸液製剤である。治療剤は、保存安定性、等張性、吸収性、および／または粘性を増加するための添加剤を含んでいてもよい。あるいは、治療剤は、間葉系幹細胞集団を含む場合、細胞シートの形態であってもよい。
【0138】
治療剤の用量は、対象疾患、年齢、体重および症状などに応じて適宜決定することができる。治療剤が間葉系幹細胞集団を含む場合、治療剤の１回の用量は、例えば１０００～１００００００００細胞／ｋｇ、好ましくは１０００００～１０００００００細胞／ｋｇである。この用量を１回量として、複数回投与してもよいし、あるいはこの用量を複数回に分けて投与してもよい。治療剤が培養上清を含む場合、治療剤の１回の用量は、希釈前の培養上清の量（ｍＬ）で表すと、例えば０．０１～１００ｍＬ／ｋｇ、好ましくは０．１～１０ｍＬ／ｋｇである。この用量を１回量として複数回投与してもよいし、あるいはこの用量を複数回に分けて投与してもよい。
【0139】
治療剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、リンパ節内注射、腹腔内注射、液剤の組織への塗布、細胞シートの添付、または局所への直接注射もしくは直接移植などが挙げられる。
【0140】
＜７．好ましい実施形態＞
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
＜７－１．間葉系幹細胞集団およびその生産方法＞
［Ｃ１］ 間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法。
［Ｃ２］ 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］ 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］または［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］ 前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ５］ 前記間葉系幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］または［Ｃ２］に記載の方法。
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
＜７－１．間葉系幹細胞集団およびその生産方法＞
［Ｃ１］ 間葉系幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において培養して、増殖細胞を得ることを含む、低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率を有する間葉系幹細胞集団の生産方法。
［Ｃ２］ 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］ 前記間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］または［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］ 前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ５］ 前記間葉系幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］または［Ｃ２］に記載の方法。
【0141】
［Ｃ６］ 前記間葉系幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞またはヒト脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞である［Ｃ１］～［Ｃ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ７］ 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ｃ１］～［Ｃ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ８］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｃ１］～［Ｃ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ９］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｃ１］～［Ｃ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１０］ 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ｃ１］～［Ｃ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ７］ 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ｃ１］～［Ｃ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ８］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｃ１］～［Ｃ７］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ９］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｃ１］～［Ｃ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１０］ 前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ｃ１］～［Ｃ９］の何れか１に記載の方法。
【0142】
［Ｃ１１］ 前記培養が、５００ｃｍ２以上の底面積を有する培養容器で行われる［Ｃ１］～［Ｃ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１２］ 前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ｃ１］～［Ｃ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１３］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ｃ１］～［Ｃ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１４］ 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである［Ｃ１３］に記載の方法。
［Ｃ１５］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｃ１３］または［Ｃ１４］に記載の方法。
［Ｃ１２］ 前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ｃ１］～［Ｃ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１３］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ｃ１］～［Ｃ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１４］ 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである［Ｃ１３］に記載の方法。
［Ｃ１５］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｃ１３］または［Ｃ１４］に記載の方法。
【0143】
［Ｃ１６］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ１３］～［Ｃ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１７］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ１３］～［Ｃ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１８］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ｃ１］～［Ｃ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１９］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である［Ｃ１８］に記載の方法。
［Ｃ２０］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ｃ１８］または［Ｃ１９］に記載の方法。
［Ｃ１７］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ１３］～［Ｃ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１８］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ｃ１］～［Ｃ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ１９］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である［Ｃ１８］に記載の方法。
［Ｃ２０］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ｃ１８］または［Ｃ１９］に記載の方法。
【0144】
［Ｃ２１］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｃ１９］または［Ｃ２０］に記載の方法。
［Ｃ２２］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］に記載の方法。
［Ｃ２３］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］または［Ｃ２２］に記載の方法。
［Ｃ２４］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］または［Ｃ２２］に記載の方法。
［Ｃ２５］ 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である［Ｃ２０］～［Ｃ２４］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２２］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］に記載の方法。
［Ｃ２３］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］または［Ｃ２２］に記載の方法。
［Ｃ２４］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ｃ２１］または［Ｃ２２］に記載の方法。
［Ｃ２５］ 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である［Ｃ２０］～［Ｃ２４］の何れか１に記載の方法。
【0145】
［Ｃ２６］ 前記改変体が、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｃ１８］～［Ｃ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２７］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｃ１８］～［Ｃ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２８］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２９］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３０］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３１］ 前記低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率が、７０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、更に好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｃ１］～［Ｃ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２７］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｃ１８］～［Ｃ２５］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２８］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２７］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ２９］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２８］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３０］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ｃ１］～［Ｃ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｃ３１］ 前記低下したＨＬＡ－ＡＢＣ陽性率が、７０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、更に好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｃ１］～［Ｃ３０］の何れか１に記載の方法。
【0146】
［Ｄ１］ ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の比率が７０％以下である間葉系幹細胞集団。
［Ｄ２］ ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、６０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｄ１］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ３］ 前記間葉系幹細胞集団は、ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の比率が５０％以下である［Ｄ１］または［Ｄ２］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ４］ ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｄ３］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ５］ ［Ｃ１］～［Ｃ３１］の何れか１に記載の方法によって得られる間葉系幹細胞集団。
［Ｄ６］ 前記間葉系幹細胞集団が、［Ｃ１］～［Ｃ３１］の何れか１に記載の方法によって得られる［Ｄ１］～［Ｄ４］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ２］ ＨＬＡ－ＡＢＣ陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、６０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、更に好ましくは３０％以下、更に好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｄ１］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ３］ 前記間葉系幹細胞集団は、ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の比率が５０％以下である［Ｄ１］または［Ｄ２］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ４］ ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の前記比率が、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下である［Ｄ３］に記載の間葉系幹細胞集団。
［Ｄ５］ ［Ｃ１］～［Ｃ３１］の何れか１に記載の方法によって得られる間葉系幹細胞集団。
［Ｄ６］ 前記間葉系幹細胞集団が、［Ｃ１］～［Ｃ３１］の何れか１に記載の方法によって得られる［Ｄ１］～［Ｄ４］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団。
【0147】
＜７－２．幹細胞の培養上清およびその生産方法＞
［Ｅ１］ 幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法。
［Ｅ２］ 前記生産培養液の上清の回収が、前記生産培養液中での２回目以降の前記培養の後、好ましくは、前記生産培養液中での３回目以降の前記培養の後、に行われる［Ｅ１］に記載の方法。
［Ｅ３］ 前記幹細胞が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞；または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞である［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
［Ｅ４］ 前記幹細胞が間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５］ 前記幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１］ 幹細胞の培養上清の生産方法であって、
幹細胞を、増殖培養液中で、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよびその改変体から選ばれる培養基質の存在下において、接着培養により培養して、増殖細胞を接着状態で得ることと、
前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、生産培養液中で培養して、前記細胞に細胞生産物を生産させることと、
前記生産培養液中での前記培養の後、前記増殖細胞を、前記接着状態を維持したまま、回復培養液中で培養することと
を含み、
前記生産培養液中での前記培養と、前記回復培養液中での前記培養とが、細胞の前記接着状態を維持したまま交互に繰り返され、前記方法が、前記生産培養液中での前記培養の後に、前記生産培養液の上清を回収することを更に含む、方法。
［Ｅ２］ 前記生産培養液の上清の回収が、前記生産培養液中での２回目以降の前記培養の後、好ましくは、前記生産培養液中での３回目以降の前記培養の後、に行われる［Ｅ１］に記載の方法。
［Ｅ３］ 前記幹細胞が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞；または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞である［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
［Ｅ４］ 前記幹細胞が間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５］ 前記幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ４］の何れか１に記載の方法。
【0148】
［Ｅ６］ 前記幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ７］ 前記幹細胞がヒト幹細胞である［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
［Ｅ８］ 前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト皮膚幹細胞、ヒト肝幹細胞、ヒト筋幹細胞、ヒト脂肪幹細胞などのヒト体性幹細胞；またはヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）などのヒト多能性幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ９］ 前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１０］ 前記幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ７］ 前記幹細胞がヒト幹細胞である［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
［Ｅ８］ 前記幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト皮膚幹細胞、ヒト肝幹細胞、ヒト筋幹細胞、ヒト脂肪幹細胞などのヒト体性幹細胞；またはヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）などのヒト多能性幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ９］ 前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１０］ 前記幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ５］の何れか１に記載の方法。
【0149】
［Ｅ１１］ 前記幹細胞が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞またはヒト脂肪由来間葉系幹細胞、好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞である［Ｅ１］～［Ｅ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１２］ 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ｅ１］～［Ｅ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１３］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１４］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１５］ 前記増殖培養液中での前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ｅ１］～［Ｅ１４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１２］ 前記増殖培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む増殖培養液である［Ｅ１］～［Ｅ１１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１３］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１４］ 前記増殖培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１５］ 前記増殖培養液中での前記培養が、前記細胞がコンフルエントの状態に達するまで行われる［Ｅ１］～［Ｅ１４］の何れか１に記載の方法。
【0150】
［Ｅ１６］ 前記増殖培養液中での前記培養が、５００ｃｍ２以上の底面積を有する培養容器で行われる［Ｅ１］～［Ｅ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１７］ 前記増殖培養液中での前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ｅ１］～［Ｅ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１８］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ｅ１］～［Ｅ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１９］ 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである［Ｅ１８］に記載の方法。
［Ｅ２０］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｅ１８］または［Ｅ１９］に記載の方法。
［Ｅ１７］ 前記増殖培養液中での前記培養が、５００～１００００ｃｍ２の底面積を有する培養容器で行われる［Ｅ１］～［Ｅ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１８］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントである［Ｅ１］～［Ｅ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ１９］ 前記ラミニンフラグメントが、ヒト由来のラミニンフラグメントである［Ｅ１８］に記載の方法。
［Ｅ２０］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｅ１８］または［Ｅ１９］に記載の方法。
【0151】
［Ｅ２１］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ１８］～［Ｅ２０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２２］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ１８］～［Ｅ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２３］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ｅ１］～［Ｅ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２４］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である［Ｅ２３］に記載の方法。
［Ｅ２５］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ｅ２３］または［Ｅ２４］に記載の方法。
［Ｅ２２］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ１８］～［Ｅ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２３］ 前記培養基質が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントの改変体である［Ｅ１］～［Ｅ１７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２４］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと他の機能性分子との複合体である［Ｅ２３］に記載の方法。
［Ｅ２５］ 前記改変体が、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントと増殖因子結合分子との複合体である［Ｅ２３］または［Ｅ２４］に記載の方法。
【0152】
［Ｅ２６］ 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである［Ｅ２４］または［Ｅ２５］に記載の方法。
［Ｅ２７］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］に記載の方法。
［Ｅ２８］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］または［Ｅ２７］に記載の方法。
［Ｅ２９］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］または［Ｅ２７］に記載の方法。
［Ｅ３０］ 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である［Ｅ２５］～［Ｅ２９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ２７］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３３２ Ｅ８フラグメント、ラミニン３１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン３２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２２１ Ｅ８フラグメント、ラミニン２１３ Ｅ８フラグメント、ラミニン１１１ Ｅ８フラグメント、またはラミニン１２１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］に記載の方法。
［Ｅ２８］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］または［Ｅ２７］に記載の方法。
［Ｅ２９］ 前記ラミニンＥ８フラグメントが、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントである［Ｅ２６］または［Ｅ２７］に記載の方法。
［Ｅ３０］ 前記増殖因子結合分子が、ヘパラン硫酸である［Ｅ２５］～［Ｅ２９］の何れか１に記載の方法。
【0153】
［Ｅ３１］ 前記改変体が、ラミニン５１１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｅ２３］～［Ｅ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３２］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｅ２３］～［Ｅ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３３］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３４］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３５］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３２］ 前記改変体が、ラミニン４２１ Ｅ８フラグメントとヘパラン硫酸との複合体である［Ｅ２３］～［Ｅ３０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３３］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．００５μｇ～２μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３４］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０１μｇ～０．５μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３５］ 前記増殖培養液中の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が、培養容器の培養面積１ｃｍ２あたり０．０５μｇ～０．２５μｇである［Ｅ１］～［Ｅ３４］の何れか１に記載の方法。
【0154】
［Ｅ３６］ 前記生産培養液が、異種由来成分を含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３７］ 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３８］ 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３９］ 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４０］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地を含む培養液であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３７］ 前記生産培養液が、サイトカインやインスリンを含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３８］ 前記生産培養液が、タンパク質を含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ３９］ 前記生産培養液が、血清を含まない培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４０］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地を含む培養液であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ３９］の何れか１に記載の方法。
【0155】
［Ｅ４１］ 前記生産培養液が、細胞培養用基本培地であるか、または細胞の栄養成分を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ４０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４２］ 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ４１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４３］ 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｅ１］～［Ｅ４２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４４］ 前記生産培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｅ１］～［Ｅ４３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４５］ 前記回復培養液が、前記幹細胞の増殖培養液である［Ｅ１］～［Ｅ４４］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４２］ 前記生産培養液が、細胞の栄養成分、好ましくはアミノ酸を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ４１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４３］ 前記生産培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｅ１］～［Ｅ４２］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４４］ 前記生産培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｅ１］～［Ｅ４３］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４５］ 前記回復培養液が、前記幹細胞の増殖培養液である［Ｅ１］～［Ｅ４４］の何れか１に記載の方法。
【0156】
［Ｅ４６］ 前記回復培養液が、前記幹細胞の増殖を促進するタンパク質を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ４５］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４７］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ４６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４８］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ４７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４９］ 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する［Ｅ１］～［Ｅ４８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５０］ 前記回復培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｅ１］～［Ｅ４９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５１］ 前記回復培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｅ１］～［Ｅ５０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５２］ 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、２～１０回繰り返される［Ｅ１］～［Ｅ５１］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４７］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地を含む培養液である［Ｅ１］～［Ｅ４６］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４８］ 前記回復培養液が、増殖因子を追加した細胞培養用基本培地である［Ｅ１］～［Ｅ４７］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ４９］ 前記回復培養液が、前記増殖培養液と同じ組成を有する［Ｅ１］～［Ｅ４８］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５０］ 前記回復培養液が、ラミニンフラグメントまたはその改変体を含まない［Ｅ１］～［Ｅ４９］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５１］ 前記回復培養液中での前記培養が、０．５～１０日間、好ましくは２～５日間にわたって行われる［Ｅ１］～［Ｅ５０］の何れか１に記載の方法。
［Ｅ５２］ 前記生産培養液中での前記培養と前記回復培養液中での前記培養とのサイクルが、２～１０回繰り返される［Ｅ１］～［Ｅ５１］の何れか１に記載の方法。
【0157】
［Ｆ１］ ５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する、幹細胞の培養上清。
［Ｆ２］ 前記培養上清が、１００００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する［Ｆ１］に記載の培養上清。
［Ｆ３］ 前記培養上清が、５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する［Ｆ１］または［Ｆ２］に記載の培養上清。
［Ｆ４］ ５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清。
［Ｆ５］ 前記培養上清が、１００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する［Ｆ４］に記載の培養上清。
［Ｆ２］ 前記培養上清が、１００００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１５０００ｐｇ／ｍＬ以上のＨＧＦを含有する［Ｆ１］に記載の培養上清。
［Ｆ３］ 前記培養上清が、５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する［Ｆ１］または［Ｆ２］に記載の培養上清。
［Ｆ４］ ５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する、幹細胞の培養上清。
［Ｆ５］ 前記培養上清が、１００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する［Ｆ４］に記載の培養上清。
【0158】
［Ｆ６］ 前記培養上清が、５０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を含有する［Ｆ４］または［Ｆ５］に記載の培養上清。
［Ｆ７］ 前記培養上清が、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ８］ 前記培養上清が、１００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ９］ 前記培養上清が、５０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１０］ 前記培養上清が、３０００ｐｇ／ｍＬ以上のＭＣＰ－１、１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＧＲＯ、および５μｇ/ｍＬ以上のフィブロネクチンを更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ７］ 前記培養上清が、５０ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ８］ 前記培養上清が、１００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上のＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ９］ 前記培養上清が、５０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＣＤ９／ＣＤ６３ ＥＣドメイン 融合タンパク質を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１０］ 前記培養上清が、３０００ｐｇ／ｍＬ以上のＭＣＰ－１、１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＧＲＯ、および５μｇ/ｍＬ以上のフィブロネクチンを更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の培養上清。
【0159】
［Ｆ１１］ 前記培養上清が、４０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは６０００ｐｇ／ｍＬ以上のＭＣＰ－１；２０００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは４０００ｐｇ／ｍＬ以上のＧＲＯ；および、６μｇ/ｍＬ以上、好ましくは８μｇ/ｍＬ以上のフィブロネクチンを更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１２］ 前記培養上清が、３０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは６０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＭＣＰ－１；１０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは２０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＧＲＯ；および、５～１０００μｇ/ｍＬ、好ましくは６～１０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは８～１０００μｇ/ｍＬのフィブロネクチンを更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１３］ 前記培養上清が、２００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ、５ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４、および８ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１４］ 前記培養上清が、３００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは５００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ；１０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４；および、１０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１２ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１５］ 前記培養上清が、２００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは３００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは５００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ－１ｂ；５～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２０～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－４；および、８～１０００００ｐｇ/ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１２～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１２］ 前記培養上清が、３０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは６０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＭＣＰ－１；１０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは２０００～１００００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４０００～１００００００ｐｇ／ｍＬのＧＲＯ；および、５～１０００μｇ/ｍＬ、好ましくは６～１０００μｇ/ｍＬ、より好ましくは８～１０００μｇ/ｍＬのフィブロネクチンを更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１３］ 前記培養上清が、２００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ、５ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４、および８ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１４］ 前記培養上清が、３００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは５００ｐｇ／ｍＬ以上のＴＧＦ－１ｂ；１０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－４；および、１０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１２ｐｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１５］ 前記培養上清が、２００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは３００～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは５００～１０００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ－１ｂ；５～１０００００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは２０～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－４；および、８～１０００００ｐｇ/ｍＬ、好ましくは１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１２～１０００００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１０を更に含有する［Ｆ１］～［Ｆ１２］の何れか１に記載の培養上清。
【0160】
［Ｆ１６］ 前記培養上清が、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンの少なくとも１つを含まない［Ｆ１］～［Ｆ１５］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１７］ 前記培養上清が、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンのいずれも含まない［Ｆ１］～［Ｆ１６］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１８］ 前記培養上清が、組換えタンパク質を含まない［Ｆ１］～［Ｆ１７］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１９］ 前記培養上清が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの少なくとも１つを０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含む［Ｆ１］～［Ｆ１８］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２０］ 前記培養上清が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの各々を０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含む［Ｆ１］～［Ｆ１９］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１７］ 前記培養上清が、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンのいずれも含まない［Ｆ１］～［Ｆ１６］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１８］ 前記培養上清が、組換えタンパク質を含まない［Ｆ１］～［Ｆ１７］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ１９］ 前記培養上清が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの少なくとも１つを０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含む［Ｆ１］～［Ｆ１８］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２０］ 前記培養上清が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αの各々を０～１５ｐｇ／ｍＬの量で含む［Ｆ１］～［Ｆ１９］の何れか１に記載の培養上清。
【0161】
［Ｆ２１］ 前記培養上清が、２０種類以上のサイトカインを含み、各サイトカインが１０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度を有する［Ｆ１］～［Ｆ２０］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２２］ 前記培養上清が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞の培養上清；または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２１］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２３］ 前記培養上清が、間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２４］ 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、または臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２５］ 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清または脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２４］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２２］ 前記培養上清が、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞などの体性幹細胞の培養上清；または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２１］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２３］ 前記培養上清が、間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２２］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２４］ 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、または臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２５］ 前記培養上清が、臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清または脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくは臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２４］の何れか１に記載の培養上清。
【0162】
［Ｆ２６］ 前記培養上清が、ヒト間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２３］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２７］ 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２４］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２８］ 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清またはヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２５］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２９］ ［Ｅ１］～［Ｅ５２］の何れか１に記載の方法によって得られる培養上清。
［Ｆ３０］ 前記培養上清が、［Ｅ１］～［Ｅ５２］の何れか１に記載の方法によって得られる［Ｆ１］～［Ｆ２８］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２７］ 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、ヒト胎盤由来間葉系幹細胞の培養上清、またはヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２４］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２８］ 前記培養上清が、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清またはヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清、好ましくはヒト臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清である［Ｆ１］～［Ｆ２５］の何れか１に記載の培養上清。
［Ｆ２９］ ［Ｅ１］～［Ｅ５２］の何れか１に記載の方法によって得られる培養上清。
［Ｆ３０］ 前記培養上清が、［Ｅ１］～［Ｅ５２］の何れか１に記載の方法によって得られる［Ｆ１］～［Ｆ２８］の何れか１に記載の培養上清。
【0163】
＜７－３．治療剤＞
［Ｇ１］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団または［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を含む治療剤。
［Ｇ２］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団を含む治療剤。
［Ｇ３］ ［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を含む治療剤。
［Ｇ４］ 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；腎炎、角膜炎、サイトカインストームなどの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患を治療するためのものである［Ｇ１］～［Ｇ３］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ５］ 前記治療剤が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである［Ｇ１］～［Ｇ４］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ１］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団または［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を含む治療剤。
［Ｇ２］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団を含む治療剤。
［Ｇ３］ ［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を含む治療剤。
［Ｇ４］ 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；腎炎、角膜炎、サイトカインストームなどの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患を治療するためのものである［Ｇ１］～［Ｇ３］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ５］ 前記治療剤が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである［Ｇ１］～［Ｇ４］の何れか１に記載の治療剤。
【0164】
［Ｇ６］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団または［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
［Ｇ７］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
［Ｇ８］ ［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
［Ｇ９］ 前記傷病が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患である［Ｇ６］～［Ｇ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１０］ 前記傷病が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血である［Ｇ６］～［Ｇ９］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ１１］ 前記被検体が、哺乳類、好ましくはヒトである［Ｇ６］～［Ｇ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ７］ ［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
［Ｇ８］ ［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清を被検体に投与することを含む、傷病の治療方法。
［Ｇ９］ 前記傷病が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患である［Ｇ６］～［Ｇ８］の何れか１に記載の方法。
［Ｇ１０］ 前記傷病が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血である［Ｇ６］～［Ｇ９］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ１１］ 前記被検体が、哺乳類、好ましくはヒトである［Ｇ６］～［Ｇ１０］の何れか１に記載の方法。
【0165】
［Ｇ１２］ 治療剤の製造のための［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団または［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清の使用。
［Ｇ１３］ 治療剤の製造のための［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団の使用。
［Ｇ１４］ 治療剤の製造のための［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清の使用。
［Ｇ１５］ 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患を治療するためのものである［Ｇ１２］～［Ｇ１４］の何れか１に記載の使用。
［Ｇ１６］ 前記治療剤が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである［Ｇ１２］～［Ｇ１５］の何れか１に記載の治療剤。
［Ｇ１３］ 治療剤の製造のための［Ｄ１］～［Ｄ６］の何れか１に記載の間葉系幹細胞集団の使用。
［Ｇ１４］ 治療剤の製造のための［Ｆ１］～［Ｆ３０］の何れか１に記載の培養上清の使用。
［Ｇ１５］ 前記治療剤が、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、慢性動脈閉塞症などの虚血性疾患；上皮創傷、熱傷などの傷；老化に伴うサルコペニア；リウマチ、椎間板ヘルニア、変形性関節症などの関節炎；サイトカインストーム、腎炎、角膜炎などの炎症性疾患；神経炎症が原因の一つと考えられる自閉症や不眠症などの精神疾患；GVHD（移植片対宿主病）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、膠原病、多発性硬化症、自己免疫性疾患などの免疫疾患；またはがん疾患を治療するためのものである［Ｇ１２］～［Ｇ１４］の何れか１に記載の使用。
［Ｇ１６］ 前記治療剤が、虚血性疾患；好ましくは、下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄梗塞、または慢性動脈閉塞症；より好ましくは下肢虚血を治療するためのものである［Ｇ１２］～［Ｇ１５］の何れか１に記載の治療剤。
【実施例0166】
［実施例１］ 増殖培養
（１）方法
実施例１では、幹細胞の増殖培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
（１）方法
実施例１では、幹細胞の増殖培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
【0167】
実験１－１（コントロール）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。それぞれの条件ごとに、４枚のフラスコに播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。それぞれの条件ごとに、４枚のフラスコに播種した。
【0168】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から5日後（day5）、10日後（day10）、15日後（day15）、20日後（day20）に、それぞれのフラスコをTrypLETM Select（Thermo Fisher Scientific社）で10～20分処理し、単一細胞に分散させた後、セルカウンターで細胞数を計測した。
【0169】
【0170】
実験１－２（本発明の例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。それぞれの条件ごとに、４枚のフラスコに播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。それぞれの条件ごとに、４枚のフラスコに播種した。
【0171】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から5日後に、再度iMatrix-511ラミニンフラグメントを50μl/100mlで添加した。なお、播種から10日後、15日後、20日後には、ラミニンフラグメントの添加は行わなかった。
【0172】
播種から5日後（day5）、10日後（day10）、15日後（day15）、20日後（day20）に、それぞれのフラスコをTrypLETM Select（Thermo Fisher Scientific社）で10～20分処理し、単一細胞に分散させた後、セルカウンターで細胞数を計測した。
【0173】
【0174】
実験１－３（参考例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、予めゼラチンコーティングしたピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。ゼラチンコーティングは、ゼラチン溶液（StemSure 0.1w/v% Gelatin Solution、富士フイルム和光純薬株式会社）で2時間処理することより行った。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e3の細胞数（播種密度10cells/cm2）、5x10e4の細胞数（播種密度100cells/cm2）、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）、および5x10e6の細胞数（播種密度10000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、予めゼラチンコーティングしたピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。ゼラチンコーティングは、ゼラチン溶液（StemSure 0.1w/v% Gelatin Solution、富士フイルム和光純薬株式会社）で2時間処理することより行った。
【0175】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から5日後（day5）、10日後（day10）、15日後（day15）、20日後（day20）に、それぞれのフラスコをTrypLETM Select（Thermo Fisher Scientific社）で10～20分処理し、単一細胞に分散させた後、セルカウンターで細胞数を計測した。
【0176】
【0177】
（２）結果
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）が増殖してT512フラスコでコンフルエントの状態に達すると、約3×10e7個の細胞（すなわち、約60000cells/cm2）が回収できた。したがって、図１、３および５において、約60000cells/cm2がコンフルエントの状態を表す。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）が増殖してT512フラスコでコンフルエントの状態に達すると、約3×10e7個の細胞（すなわち、約60000cells/cm2）が回収できた。したがって、図１、３および５において、約60000cells/cm2がコンフルエントの状態を表す。
【0178】
図１の結果から、ラミニンフラグメントの非存在下では、幹細胞を１００００細胞/ｃｍ２の播種密度で播種して培養すると、コンフルエントの状態になるまで細胞を増殖させることができるが、幹細胞を１０００細胞/ｃｍ２以下の低い細胞密度で播種して培養すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができないことが示された。また、図２の顕微鏡写真から、ラミニンフラグメントの非存在下では、幹細胞を１０細胞/ｃｍ２の低い細胞密度で播種して培養すると、細胞がコンフルエントの状態になるまで増殖せず、コロニー状態で増殖が停止していることが示された。
【0179】
図３の結果から、ラミニンフラグメントの存在下では、幹細胞を１０００細胞/ｃｍ２以下の低い細胞密度で播種して培養しても、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができることが示された。また、図４の顕微鏡写真から、ラミニンフラグメントの存在下では、幹細胞を、１０細胞/ｃｍ２の低い細胞密度で播種して培養しても、細胞がコンフルエントの状態になるまで増殖できることが示された。
【0180】
更に、本発明者らは、実験１－２と同様の手法に従って、臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、２細胞/ｃｍ２の細胞密度で播種して、iMatrix-511ラミニンフラグメントを含む増殖培養液中で培養した場合も、細胞がコンフルエントの状態になるまで増殖できることを実証している。
【0181】
図５の結果から、ゼラチンの存在下では、幹細胞を１００００細胞/ｃｍ２の播種密度で播種して培養すると、コンフルエントの状態になるまで細胞を増殖させることができるが、幹細胞を１０００細胞/ｃｍ２以下の低い細胞密度で播種して培養すると、細胞の増殖が停止し、コンフルエントの状態になるまで増殖させることができないことが示された。また、図６の顕微鏡写真から、ゼラチンの存在下では、幹細胞を１０細胞/ｃｍ２の低い細胞密度で播種して培養すると、細胞がコンフルエントの状態になるまで増殖せず、コロニー状態で増殖が停止していることが示された。
【0182】
これらの結果から、幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養すると、低い細胞密度で播種された幹細胞であっても、コンフルエントの状態になるまで増殖できることが分かる。
【0183】
［実施例２］ 生産培養
（１）方法
実施例２では、幹細胞の増殖培養を行った後、生産培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
（１）方法
実施例２では、幹細胞の増殖培養を行った後、生産培養を行った。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
【0184】
実験２－１（比較例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5（播種密度1000cells/cm2）の細胞数で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5（播種密度1000cells/cm2）の細胞数で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
【0185】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から15日後（day15）に、培地をPBSで2回置換して残存培地を洗浄し、その後、DMEM/F12培地をベースにアミノ酸を追加したタンパク質不含培地（以下、ＭＳＣ培地Ａともいう）を120ml添加した。ここで追加されたアミノ酸は、MEM必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）およびMEM非必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）である。ＭＳＣ培地Ａを添加して3日間培養（生産培養）を行った。3日間の培養後に、オリンパス顕微鏡で細胞の画像を２枚撮影した。２枚の画像は、フラスコ内の異なる位置で撮影した。顕微鏡写真を図７Ａおよび７Ｂに示す。
【0186】
実験２－２（本発明の例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5（播種密度1000cells/cm2）の細胞数で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5（播種密度1000cells/cm2）の細胞数で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
【0187】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から5日後に、再度iMatrix-511ラミニンフラグメントを50μl/100mlで添加した。なお、播種から10日後には、ラミニンフラグメントの添加は行わなかった。
【0188】
播種から15日後（day15）に、培地をPBSで2回置換して残存培地を洗浄し、その後、DMEM/F12培地をベースにアミノ酸を追加したタンパク質不含培地（以下、ＭＳＣ培地Ａともいう）を120ml添加した。ここで追加されたアミノ酸は、MEM必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）およびMEM非必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）である。ＭＳＣ培地Ａを添加して3日間培養（生産培養）を行った。3日間の培養後に、オリンパス顕微鏡で細胞の画像を２枚撮影した。２枚の画像は、フラスコ内の異なる位置で撮影した。顕微鏡写真を図８Ａおよび８Ｂに示す。
【0189】
（２）結果
図７Ａでは、一部の細胞が剥がれて細胞塊になっていた。図７Ａにおいて細胞塊が存在する箇所を矢印で示した。図７Ｂでは、大部分の細胞が剥がれて残っていなかった。一方、図８Ａおよび図８Ｂのどちらの画像においても、細胞は剥がれておらず接着状態を保っていた。
図７Ａでは、一部の細胞が剥がれて細胞塊になっていた。図７Ａにおいて細胞塊が存在する箇所を矢印で示した。図７Ｂでは、大部分の細胞が剥がれて残っていなかった。一方、図８Ａおよび図８Ｂのどちらの画像においても、細胞は剥がれておらず接着状態を保っていた。
【0190】
これらの結果から、幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養して増殖させた後、得られた増殖細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養すると、培養の途中で細胞が培養容器から剥離することなく、増殖細胞の接着状態を維持することができることが分かる。
【0191】
［実施例３］ 長期の生産培養
（１）方法
実施例３では、幹細胞の増殖培養を行った後、長期の生産培養を行った。実施例３で行った培養工程を模式的に図９に示す。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
（１）方法
実施例３では、幹細胞の増殖培養を行った後、長期の生産培養を行った。実施例３で行った培養工程を模式的に図９に示す。幹細胞として、凍結保存液Stem Cell Banker（ゼノアック）で凍結保存された臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を使用した。
【0192】
実験３－１（本発明の例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（以下、ＭＳＣ培地Ｂともいう）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。
【0193】
増殖培養の間、培地交換は5日ごとに行った。播種から5日後に、再度iMatrix-511ラミニンフラグメントを50μl/100mlで添加した。なお、播種から10日後には、ラミニンフラグメントの添加は行わなかった。
【0194】
播種から15日後（day15）に、細胞がコンフルエントの状態に達したことを確認し、培地をPBSで2回置換して残存培地を洗浄した。その後、DMEM/F12培地をベースにアミノ酸を追加したタンパク質不含培地（以下、ＭＳＣ培地Ａともいう）を120ml添加した。ここで追加されたアミノ酸は、MEM必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）およびMEM非必須アミノ酸溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）である。ＭＳＣ培地Ａを添加してから4日間培養を行った。この培養を、図９で「１回目の生産培養」と表す。
【0195】
１回目の生産培養後に、ＭＳＣ培地Ａの培養上清を回収した。培養上清に含まれるサイトカインを、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。サイトカインとして、血管内皮増殖因子（VEGF）、インターロイキン－７（IL-7）、および肝細胞増殖因子（HGF）の３種類を解析した。
【0196】
また、１回目の生産培養後に、ＭＳＣ培地Ｂに戻して3日間培養（回復培養）を行った。3日間の回復培養後に、再びＭＳＣ培地Ａに置換し、4日間培養を行った。この培養を、図９で「２回目の生産培養」と表す。
【0197】
２回目の生産培養後に、ＭＳＣ培地Ａの培養上清を回収した。培養上清に含まれるサイトカイン（VEGF、IL-7、およびHGF）を、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。
【0198】
また、２回目の生産培養後に、ＭＳＣ培地Ｂに戻して3日間培養（回復培養）を行った。3日間の回復培養後に、再びＭＳＣ培地Ａに置換し、4日間培養を行った。この培養を、図９で「３回目の生産培養」と表す。
【0199】
３回目の生産培養後に、ＭＳＣ培地Ａの培養上清を回収した。培養上清に含まれるサイトカイン（VEGF、IL-7、およびHGF）を、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。
【0200】
以上述べたとおり、計3回の生産培養を行い、計3回の培養上清回収とサイトカイン解析を行った。
【0201】
実験３－２（比較例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、1.5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）でMSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（ＭＳＣ培地Ｂ）20mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでT150フラスコ（コーニング）に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験３－１と同様の手順で増殖培養を行った。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、1.5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）でMSC Expansion XSFM B（富士フイルム和光純薬株式会社）（ＭＳＣ培地Ｂ）20mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでT150フラスコ（コーニング）に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験３－１と同様の手順で増殖培養を行った。
【0202】
播種から15日後（day15）に、細胞がコンフルエントの状態に達したことを確認し、実験３－１と同様、ＭＳＣ培地Ａに置換した。その後、2日間培養して、ＭＳＣ培地Ａの培養上清を回収した。培養上清に含まれるサイトカイン（VEGF、IL-7、およびHGF）を、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。
【0203】
この実験では、ラミニンフラグメントを添加していないため、ＭＳＣ培地Ａに置換してから3日後に細胞が培養容器から剥がれ始めるため、ＭＳＣ培地Ａに置換してから2日後に培養上清を回収した。
【0204】
（２）結果
サイトカインの定量結果を図１０～１２に示す。図１０～１２のそれぞれのグラフは、左から順に、
本発明の例で１回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で２回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で３回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、および
比較例で回収された培養上清中のサイトカインの量
を示す。
サイトカインの定量結果を図１０～１２に示す。図１０～１２のそれぞれのグラフは、左から順に、
本発明の例で１回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で２回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、
本発明の例で３回目の生産培養後に回収された培養上清中のサイトカインの量、および
比較例で回収された培養上清中のサイトカインの量
を示す。
【0205】
図１０～１２の結果から、本発明の方法に従って長期の生産培養を行うと、比較例と同程度以上の量のサイトカインを生産することができ、その生産量は、生産培養を繰り返しても低下しないか、または増大することが示された。VEGFやHGFは、血管新生作用を有するサイトカインである。VEGFは、比較例と比べると、生産量が僅かに少ない場合も見られるが、VEGFの生産量は絶対量が多いため、十分な量で生産されていると言うことができる。HGFは、生産培養を繰り返すと生産量が増加する傾向が見られた。また、IL-7は、免疫細胞の活性化や炎症に関わるサイトカインである。IL-7は、生産培養を繰り返すと生産量が増加する傾向が見られた。
【0206】
なお、実施例３では、計3回の生産培養を行い、計3回の培養上清回収とサイトカイン解析を行ったが、本発明者らは、計6回の生産培養を行って、サイトカインを生産可能であることを実証している。
【0207】
これらの結果から、以下のことが分かる。幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養して増殖させた後、得られた増殖細胞を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養すると、増殖細胞の接着状態を維持したまま、生産培養を行うことができる。また、この生産培養後に、細胞の接着状態を維持したまま回復培養を行い、細胞が細胞生産物を生産する能力を回復させることができる。これにより、細胞の接着状態を維持したまま複数回の生産培養を繰り返し行うことができ、その結果、簡便な手法で多量の細胞生産物を長期にわたって生産することができる。
【0208】
［実施例４］ 間葉系幹細胞集団
実施例４では、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカー陽性率を解析した。また、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカーの発現を免疫染色画像により確認した。
実施例４では、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカー陽性率を解析した。また、間葉系幹細胞をラミニンフラグメントの存在下で培養し、得られた間葉系幹細胞集団の細胞表面マーカーの発現を免疫染色画像により確認した。
【0209】
（１）方法
実験４－１（本発明の例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）または脂肪由来間葉系幹細胞（ADMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。臍帯由来間葉系幹細胞は、１週間、２週間、３週間の期間にわたって培養し、脂肪由来間葉系幹細胞は、１週間、２週間の期間にわたって培養した。
実験４－１（本発明の例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）または脂肪由来間葉系幹細胞（ADMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメント（株式会社ニッピ）を50μl/100mlで添加し、得られた細胞懸濁液をピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。臍帯由来間葉系幹細胞は、１週間、２週間、３週間の期間にわたって培養し、脂肪由来間葉系幹細胞は、１週間、２週間の期間にわたって培養した。
【0210】
培養後、TrypLE Select溶液（Thermo Fisher Scientific）で処理することによって細胞を剥離した。得られた細胞を、細胞表面マーカーであるCD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABCのPE（phycoerythrin）付き抗体（BioLegend）で染色し、フローサイトメーター（Sony）を用いて、各マーカーの陽性率を解析した。
【0211】
また、臍帯由来間葉系幹細胞を、ラミニンフラグメントの存在下で、２４ウェルプレート（コーニング）に播種し、１週間培養を行った。その後、２４ウェルに接着した間葉系幹細胞に対し、細胞表面マーカーであるCD73、CD90、CD105、HLA-ABCのPE付き抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス）で明視野撮影と蛍光撮影を行った。
【0212】
実験４－２（比較例）
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験４－１と同様の手順で培養を行った。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、5x10e5の細胞数（播種密度1000cells/cm2）で、MSC Expansion XSFM B 培地（富士フイルム和光純薬株式会社）100mlに懸濁し、iMatrix-511ラミニンフラグメントを添加しないでピールオフT512フラスコ（住友ベークライト株式会社）に播種した。ラミニンフラグメントを添加しなかったこと以外は実験４－１と同様の手順で培養を行った。
【0213】
培養後、実験４－１と同様の手順で、細胞表面マーカーCD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABCの陽性率を解析した。また、実験４－１と同様の手順で、細胞表面マーカーCD73、CD90、CD105、HLA-ABCの発現を免疫染色画像により確認した。
【0214】
（２）結果
ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１３に示し、ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の脂肪由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１４に示し、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１５に示す。
ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１３に示し、ラミニンフラグメントの存在下で培養した場合の脂肪由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１４に示し、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した場合の臍帯由来間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの陽性率を図１５に示す。
【0215】
ラミニンフラグメントの存在下で臍帯由来および脂肪由来間葉系幹細胞を培養した場合、CD105とHLA-ABCは、陽性率が顕著に低下したが、CD105とHLA-ABC以外のマーカーは、陽性率が低下しなかった。一方、ラミニンフラグメントの非存在下で臍帯由来間葉系幹細胞を培養した場合、CD105とHLA-ABCは、陽性率の顕著な低下が見られなかった。
【0216】
ラミニンフラグメントの存在下で臍帯由来間葉系幹細胞を培養した場合、免疫染色画像の結果においても、フローサイトメーターの結果と同様、ほとんどすべての細胞においてCD73およびCD90は陽性であったが、CD105陽性細胞やHLA-ABC陽性細胞はほとんど観察されなかった。免疫染色画像は、間葉系幹細胞をタンパク質分解酵素処理することなく撮影されているため、この結果は、フローサイトメーター解析のために行ったタンパク質分解酵素処理が、CD105やHLA-ABCの発現を低下させていないことを実証している。
【0217】
［実施例５］ 間葉系幹細胞の培養上清
実施例５では、実施例３に記載の方法に従って、間葉系幹細胞の増殖培養を行った後に複数回の生産培養を行い、各々の生産培養の後に培養上清を回収した。得られた間葉系幹細胞の培養上清に含まれるサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームマーカーの量を解析した。
実施例５では、実施例３に記載の方法に従って、間葉系幹細胞の増殖培養を行った後に複数回の生産培養を行い、各々の生産培養の後に培養上清を回収した。得られた間葉系幹細胞の培養上清に含まれるサイトカイン、細胞外マトリックス、およびエクソソームマーカーの量を解析した。
【0218】
（１）方法
培養上清に含まれるサイトカインおよび細胞外マトリックスの量を、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。サイトカインとして、HGF（肝細胞増殖因子）、MCP-1、GRO/CXCL1、PDGF-AA、VEGF（血管内皮増殖因子）、TGF-1b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-7、IL-15、IL-9、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-8、EOTAXIN、IL-6、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、IL-12P40、IP-10、MIP-1αの24種類を解析し、細胞外マトリックスとしてFibronectinを解析した。また、培養上清に含まれるエクソソームの量を、CD9/CD63 ELISAキット（コスモバイオ）を用いて、エクソソームマーカータンパク質（CD9/CD63融合タンパク質）を指標として解析した。本明細書において、サイトカインの量、細胞外マトリックスの量、エクソソームマーカータンパク質の量は、特異的な抗体を用いてELISA法により測定される値を指す。
培養上清に含まれるサイトカインおよび細胞外マトリックスの量を、ELISA解析キット（R＆D Systems社）を用いて解析した。サイトカインとして、HGF（肝細胞増殖因子）、MCP-1、GRO/CXCL1、PDGF-AA、VEGF（血管内皮増殖因子）、TGF-1b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-7、IL-15、IL-9、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-8、EOTAXIN、IL-6、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、IL-12P40、IP-10、MIP-1αの24種類を解析し、細胞外マトリックスとしてFibronectinを解析した。また、培養上清に含まれるエクソソームの量を、CD9/CD63 ELISAキット（コスモバイオ）を用いて、エクソソームマーカータンパク質（CD9/CD63融合タンパク質）を指標として解析した。本明細書において、サイトカインの量、細胞外マトリックスの量、エクソソームマーカータンパク質の量は、特異的な抗体を用いてELISA法により測定される値を指す。
【0219】
（２）結果
この実施例においても、実施例３と同様、本発明の例では、ラミニンフラグメントの存在下で増殖培養を行ったのに対し、比較例では、ラミニンフラグメントの非存在下で増殖培養を行った。このため、本発明の例では、複数回の生産培養を繰り返し行うことができたが、比較例では、１回目の生産培養の間に細胞が培養容器から剥がれ始めたため、１回目の生産培養しか行うことができなかった。
この実施例においても、実施例３と同様、本発明の例では、ラミニンフラグメントの存在下で増殖培養を行ったのに対し、比較例では、ラミニンフラグメントの非存在下で増殖培養を行った。このため、本発明の例では、複数回の生産培養を繰り返し行うことができたが、比較例では、１回目の生産培養の間に細胞が培養容器から剥がれ始めたため、１回目の生産培養しか行うことができなかった。
【0220】
培養上清に含まれるサイトカインの量の結果を図１６～１９、２１～４１に示し、培養上清に含まれるフィブロネクチンの量の結果を図２０に示し、培養上清に含まれるエクソソームマーカータンパク質の量の結果を図４２に示す。
【0221】
図１６～４２において、「１回目」は、本発明の例で１回目の生産培養（４日間）を行った後に回収された培養上清中のサイトカイン、フィブロネクチン、またはエクソソームマーカータンパク質の量を示し、「２回目」は、本発明の例で２回目の生産培養（４日間）を行った後に回収された培養上清中のサイトカイン、フィブロネクチン、またはエクソソームマーカータンパク質の量を示し、「３回目」、「４回目」、「５回目」も同様の意味である。また、図１６～４２において、「比較例」は、比較例で１回目の生産培養を開始してから２日後に回収された培養上清中のサイトカイン、フィブロネクチン、またはエクソソームマーカータンパク質の量を示す。
【0222】
図１６～４２の結果から、本発明の方法に従って繰り返し生産培養を行って培養上清を繰り返し回収すると、IL-1α、IL-1β、TNF-α以外のタンパク質（すなわち、HGF、MCP-1、GRO/CXCL1、PDGF-AA、VEGF、TGF-1b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-7、IL-15、IL-9、IL-8、EOTAXIN、IL-6、G-CSF、GM-CSF、MCP-3、IL-12P40、IP-10、MIP-1α、Fibronectin、およびエクソソームマーカータンパク質）の量が増える傾向が見られた。したがって、本発明の方法に従って繰り返し生産培養を行って培養上清を繰り返し回収すると、多量のサイトカイン、多量の細胞外マトリックス、および多量のエクソソームを含む培養上清を得ることができることが示された。
【0223】
この実施例で示したように、間葉系幹細胞の培養上清を、外来成分を含まない、タンパク質フリーの培養液で培養することによって得た場合、この培養上清に含まれるタンパク質は全て間葉系幹細胞由来のものであるため、治療剤として適用しやすいという利点を有する。しかも、間葉系幹細胞の培養上清は、繰り返し回収することによって、HGF等のサイトカイン、フィブロネクチンおよびエクソソームの含量を増大させることができるため、これらのタンパク質やエクソソームによる治療効果が期待できる点で優れている。また、間葉系幹細胞の培養上清は、炎症を引き起こすことが知られているIL-1α、IL-1β、TNF-αの含量が、培養上清を繰り返し回収した場合に増加しないため、炎症系サイトカインの含量が比較的少ないという点で優れている。
【0224】
［実施例６］ 治療剤
実施例６では、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞を下肢虚血モデルのラットに投与し、治療効果を確認した。
実施例６では、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞を下肢虚血モデルのラットに投与し、治療効果を確認した。
【0225】
（１）方法
＜下肢虚血モデルのラットの準備＞
12週齢のSprague Dawley（SD）雄ラット（CLEA Japan（大阪、日本）から購入）を使用した。SDラットを5ml/kgの用量でコンビネーション麻酔薬（M/M/B：0.3/4/5）を腹腔内投与して麻酔した。下肢虚血は、外腸骨動脈と内腸骨静脈、足首直下レベルの伏在動脈と静脈、および全枝を露出させて結紮し、結紮した血管のうち全血管を切除することにより誘導した。
＜下肢虚血モデルのラットの準備＞
12週齢のSprague Dawley（SD）雄ラット（CLEA Japan（大阪、日本）から購入）を使用した。SDラットを5ml/kgの用量でコンビネーション麻酔薬（M/M/B：0.3/4/5）を腹腔内投与して麻酔した。下肢虚血は、外腸骨動脈と内腸骨静脈、足首直下レベルの伏在動脈と静脈、および全枝を露出させて結紮し、結紮した血管のうち全血管を切除することにより誘導した。
【0226】
下肢虚血誘導の３日後に、レーザードップラー灌流画像法（LDPI）を用いて血流量を測定した。下肢虚血誘導に成功したことを保証するために、また、自己再生能力が顕著なラットを除外して、細胞治療の実際の効果を評価できるようにするために、非虚血下肢の血流量に対する虚血下肢の血流量の相対値（％）が60％以下のラットのみを治療のために登録した。登録したラットを、臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）投与群、脂肪由来間葉系幹細胞（ADMSC）投与群、DMEM/F12投与群の3群に無作為に割り付けた。
【0227】
＜間葉系幹細胞の準備および投与＞
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、実施例４と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。また、脂肪由来間葉系幹細胞（ADMSC）を、実施例４と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。得られた間葉系幹細胞（すなわち、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞、およびラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞）を、1mlのDMEM/F12培地（Sigma）に1.25x10e6の細胞数で懸濁した。
臍帯由来間葉系幹細胞（UCMSC）を、実施例４と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。また、脂肪由来間葉系幹細胞（ADMSC）を、実施例４と同様の方法で、ラミニンフラグメントの存在下および非存在下のそれぞれで培養した。得られた間葉系幹細胞（すなわち、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞、およびラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞）を、1mlのDMEM/F12培地（Sigma）に1.25x10e6の細胞数で懸濁した。
【0228】
細胞懸濁液を尾静脈から27ゲージの針で静脈内投与した。投与は、下肢虚血の誘導後、４日目、５日目、６日目、１０日目の計４回行った。コントロールとしてDMEM/F12培地のみの投与を行った。
【0229】
＜血流量の測定＞
下肢の血流量をMoor LDI 2.0システム（Moor instruments, Devon, UK）を用いて評価した。血流量は、下肢虚血の誘導から１４日後に測定した。血流量の測定時には、ラットにイソフルラン吸入麻酔を行った。血流量比（％）は、下記式により相対値で算出した。
血流量比（％）＝（左虚血下肢の血流量／右非虚血下肢の血流量）×１００
下肢の血流量をMoor LDI 2.0システム（Moor instruments, Devon, UK）を用いて評価した。血流量は、下肢虚血の誘導から１４日後に測定した。血流量の測定時には、ラットにイソフルラン吸入麻酔を行った。血流量比（％）は、下記式により相対値で算出した。
血流量比（％）＝（左虚血下肢の血流量／右非虚血下肢の血流量）×１００
【0230】
（２）結果
下肢血流量比の結果を図４３に示す。図４３において、「Control」は、DMEM/F12培地を投与した群、「UCMSC laminin－」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「UCMSC laminin＋」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin－」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin＋」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群を表す。図４３において、エラーバーは標準誤差を表す。
下肢血流量比の結果を図４３に示す。図４３において、「Control」は、DMEM/F12培地を投与した群、「UCMSC laminin－」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「UCMSC laminin＋」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した臍帯由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin－」は、ラミニンフラグメントの非存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群、「ADMSC laminin＋」は、ラミニンフラグメントの存在下で培養した脂肪由来間葉系幹細胞を投与した群を表す。図４３において、エラーバーは標準誤差を表す。
【0231】
「UCMSC laminin＋」および「ADMSC laminin＋」は、コントロールと比べて、有意に血流量比が増加しており、Ｔ検定によりコントロールに対する有意差が認められた。一方、「UCMSC laminin－」および「ADMSC laminin－」は、コントロールと比べて、血流量比がわずかに増加する傾向は見られたが、Ｔ検定によりコントロールに対する有意差は認められなかった。
【0232】
これらの結果は、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞が、下肢虚血に対する治療剤として有効であることを示す。この治療効果は、間葉系幹細胞が分泌するサイトカイン、細胞外マトリックス、エクソソームによりもたらされていると考えられるため、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞の培養上清も同様の治療効果を有すると考えられる。また、この治療効果は、間葉系幹細胞が分泌するサイトカイン、細胞外マトリックス、エクソソームによりもたらされていると考えられるため、本発明の方法に従って得られた間葉系幹細胞や間葉系幹細胞の培養上清は、サイトカインが治療効果を奏することが知られている疾患、細胞外マトリックスが治療効果を奏することが知られている疾患、およびエクソソームが治療効果を奏することが知られている疾患に対しても治療効果を有すると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】