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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024153374
(43)【公開日】2024-10-29
(54)【発明の名称】ｉＰＳ細胞の作製方法およびｉＰＳ細胞作製システム
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20241022BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20241022BHJP
C12N 5/0786 20100101ALN20241022BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12M3/00 Z
C12N5/0786
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023067234
(22)【出願日】2023-04-17
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】000001007
【氏名又は名称】キヤノン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】出口 勝彰
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA27
4B029BB11
4B029FA15
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA21
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】 ドナーから採取した限られた量の血液を有効に利用してｉＰＳ細胞を作製する技術を提供すること。
【解決手段】 全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することとを含む、ｉＰＳ細胞の作製方法。
【選択図】 図１
【解決手段】 全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することとを含む、ｉＰＳ細胞の作製方法。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することと
を含む、ｉＰＳ細胞の作製方法。
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することと
を含む、ｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項2】
前記第１原料細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、前記第１原料細胞を前記ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離することと、
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製することと
を更に含む請求項１に記載の方法。
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製することと
を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２原料細胞を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製することを更に含む請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１培地が、血球前駆細胞を培養するための培地である請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第２培地が、Ｔ細胞増殖因子を含む請求項２に記載の方法。
【請求項6】
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離する単球抽出デバイスと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する単球初期化デバイスと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する非単球培養デバイスと
を含む、ｉＰＳ細胞作製システム。
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する単球初期化デバイスと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する非単球培養デバイスと
を含む、ｉＰＳ細胞作製システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書及び図面に開示の実施形態は、ｉＰＳ細胞の作製方法およびｉＰＳ細胞作製システムに関する。
【背景技術】
【0002】
現在、ドナーから採取した血液からｉＰＳ細胞を樹立する際、血液中の特定の細胞種からｉＰＳ細胞を樹立することが行われている。例えば、血液からＴ細胞を単離し、Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を樹立することが行われている。しかし、Ｔ細胞はＴ細胞受容体遺伝子に組換えが起こっているため、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞は、ＤＮＡ情報がドナーのＤＮＡ情報とは一部異なっている。このため、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞は、再度Ｔ細胞へ分化させて、ドナーの免疫を手助けするという用途で使用される。
【0003】
ドナーと同じＤＮＡ情報を有するｉＰＳ細胞を作製する必要がある場合には、血液からＣＤ３４陽性細胞を単離し、ＣＤ３４陽性細胞からｉＰＳ細胞を樹立することが行われている。ＣＤ３４陽性細胞は、未分化な血球細胞であり、血球前駆細胞ということもできる。また、ドナーと同じＤＮＡ情報を有するｉＰＳ細胞は、血液から単球を単離し、単球からｉＰＳ細胞を樹立することによっても作製されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１３－５２８３９７号公報
【特許文献2】特開２０２３－０２１０９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本明細書及び図面に開示の実施形態が解決しようとする課題の一つは、ドナーから採取した限られた量の血液を有効に利用してｉＰＳ細胞を作製する技術を提供することである。ただし、本明細書及び図面に開示の実施形態により解決しようとする課題は上記課題に限られない。後述する実施形態に示す各構成による各効果に対応する課題を他の課題として位置づけることもできる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一つの側面によれば、全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することとを含む、ｉＰＳ細胞の作製方法が提供される。
【0007】
別の側面によれば、全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離する単球抽出デバイスと、分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する単球初期化デバイスと、分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する非単球培養デバイスとを含む、ｉＰＳ細胞作製システムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明者は、ドナーから採取した血液は、限られた量であるため、血液中の一種類の細胞種を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、ｉＰＳ細胞を樹立できなかったり、ｉＰＳ細胞の樹立後に目的細胞へ分化できなかったりする場合があることに着目した。例えば、ＣＤ３４陽性細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、血液中のＣＤ３４陽性細胞の存在量が少ないため、初期化前に培養により増殖させても、ｉＰＳ細胞の樹立に十分な細胞数が得られない場合がある。また、単球を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、ｉＰＳ細胞の樹立効率が低いため、ｉＰＳ細胞を樹立できなかったり、ｉＰＳ細胞の樹立後に目的細胞へ分化できなかったりする場合がある。このような場合、ドナーから再度採血をしてｉＰＳ細胞を樹立し直す必要があるため、ドナーへの負担が大きい上に、ｉＰＳ細胞の樹立に時間がかかる。
【0010】
本発明者は、上記課題に新たに着目し、かかる新規課題を解決すること、すなわち、ドナーから採取した限られた量の血液を有効に利用してｉＰＳ細胞を作製することに取り組んだ。
【0011】
＜１＞ｉＰＳ細胞の作製方法
一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞の作製方法は、
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することと
を含む。
一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞の作製方法は、
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離することと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製することと
を含む。
【0012】
上記実施形態に係る方法は、
前記第１原料細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、前記第１原料細胞を前記ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離することと、
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製することと
を更に含んでいてもよい。
前記第１原料細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、前記第１原料細胞を前記ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離することと、
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製することと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製することと
を更に含んでいてもよい。
【0013】
更に、上記実施形態に係る方法は、
前記第２原料細胞を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製すること
を更に含んでいてもよい。
前記第２原料細胞を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製すること
を更に含んでいてもよい。
【0014】
（ｉＰＳ細胞の作製方法の一例）
ｉＰＳ細胞の作製方法の一例を図１に示す。以下、図１に示す工程順にｉＰＳ細胞の作製方法の一例を説明する。
採血工程（Ｓ１）
ドナーから血液を採取する。ドナーから採取された血液は、本明細書において全血ともいう。ドナーから採取された血液は、通常、末梢血である。ドナーの動物種は、特に限定されないが、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
ｉＰＳ細胞の作製方法の一例を図１に示す。以下、図１に示す工程順にｉＰＳ細胞の作製方法の一例を説明する。
採血工程（Ｓ１）
ドナーから血液を採取する。ドナーから採取された血液は、本明細書において全血ともいう。ドナーから採取された血液は、通常、末梢血である。ドナーの動物種は、特に限定されないが、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【0015】
ＰＢＭＣの抽出工程（Ｓ２）
採血工程（Ｓ１）で得た血液から末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）(以下、ＰＢＭＣともいう）を抽出する。単核細胞は、単一の丸い核を持つ血液細胞を指し、単核細胞には、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、単球、樹状細胞が含まれる。単核細胞には、赤血球、血小板、顆粒球は含まれない。ＰＢＭＣは、末梢血に由来する単核細胞を指す。
採血工程（Ｓ１）で得た血液から末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）(以下、ＰＢＭＣともいう）を抽出する。単核細胞は、単一の丸い核を持つ血液細胞を指し、単核細胞には、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、単球、樹状細胞が含まれる。単核細胞には、赤血球、血小板、顆粒球は含まれない。ＰＢＭＣは、末梢血に由来する単核細胞を指す。
【0016】
ＰＢＭＣの抽出は、例えば、ＰＢＭＣを分離可能な密度勾配媒体が充填された遠心チューブを用いて、密度勾配遠心法により行うことができる。遠心チューブとして、例えば、SepMate（Stemcell Technologies）を使用することができる。
【0017】
単球の抽出工程（Ｓ３）
ＰＢＭＣの抽出工程（Ｓ２）で得たＰＢＭＣから単球を抽出する。これにより、ＰＢＭＣを、単球と非単球とに分離する。単球の抽出は、サイズ分画により行うことができ、例えば、フローサイトメーターで、細胞の大きさを反映した前方散乱光（ＦＳＣ）の強度および細胞の内部構造を反映した側方散乱光（ＳＳＣ）の強度を測定することにより行うことができるが、この方法に限定されない。単球は、単球に特異的な蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより抽出することもできる。
ＰＢＭＣの抽出工程（Ｓ２）で得たＰＢＭＣから単球を抽出する。これにより、ＰＢＭＣを、単球と非単球とに分離する。単球の抽出は、サイズ分画により行うことができ、例えば、フローサイトメーターで、細胞の大きさを反映した前方散乱光（ＦＳＣ）の強度および細胞の内部構造を反映した側方散乱光（ＳＳＣ）の強度を測定することにより行うことができるが、この方法に限定されない。単球は、単球に特異的な蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより抽出することもできる。
【0018】
単球の初期化工程（Ｓ４）
単球の抽出工程（Ｓ３）で分離された単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する。単球の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子を単球に導入することにより行うことができる。「初期化因子」は、体細胞に導入することにより体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる遺伝子群を指す。初期化因子として、種々の遺伝子の組み合わせが公知であり、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃからなる４因子、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇからなる６因子などが知られている。
単球の抽出工程（Ｓ３）で分離された単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する。単球の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子を単球に導入することにより行うことができる。「初期化因子」は、体細胞に導入することにより体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる遺伝子群を指す。初期化因子として、種々の遺伝子の組み合わせが公知であり、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃからなる４因子、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇからなる６因子などが知られている。
【0019】
非単球の培養工程（Ｓ５）
単球の抽出工程（Ｓ３）で分離された非単球を、単球の初期化工程（Ｓ４）と並行して（すなわち、単球の初期化と同時期に）、培地で培養する。培地は、血球前駆細胞を培養するための培地を使用することが好ましい。血球前駆細胞を培養するための培地は、市販されており、例えばStemSpan SFEM II（Stemcell Technologies）が挙げられる。また、培地は、Ｔ細胞増殖因子を含んでいてもよい。Ｔ細胞増殖因子は、Ｔ細胞に増殖刺激を与える因子であり、例えばIL-2が挙げられる。培養は、例えば５～７日間行うことができる。
単球の抽出工程（Ｓ３）で分離された非単球を、単球の初期化工程（Ｓ４）と並行して（すなわち、単球の初期化と同時期に）、培地で培養する。培地は、血球前駆細胞を培養するための培地を使用することが好ましい。血球前駆細胞を培養するための培地は、市販されており、例えばStemSpan SFEM II（Stemcell Technologies）が挙げられる。また、培地は、Ｔ細胞増殖因子を含んでいてもよい。Ｔ細胞増殖因子は、Ｔ細胞に増殖刺激を与える因子であり、例えばIL-2が挙げられる。培養は、例えば５～７日間行うことができる。
【0020】
培養により、非単球に含まれるＣＤ３４陽性細胞およびＴ細胞を増殖させることができる。すなわち、この培養工程により、この後のＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）およびＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）のための原料細胞を調製することができる。
【0021】
この培養工程でＣＤ３４陽性細胞が増殖してＣＤ３４陽性細胞の数が増えると、この後のＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）でｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができる。また、この培養工程で、Ｔ細胞が増殖して細胞周期の分裂期にいると、この後のＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）でｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができる。
【0022】
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）
非単球の培養工程（Ｓ５）で得た細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出する。これにより、非単球を、ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離する。ＣＤ３４陽性細胞は、血球前駆細胞である。非ＣＤ３４陽性細胞は、主にＴ細胞から構成される。非ＣＤ３４陽性細胞は、ＣＤ３４陰性細胞ということもできる。
非単球の培養工程（Ｓ５）で得た細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出する。これにより、非単球を、ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離する。ＣＤ３４陽性細胞は、血球前駆細胞である。非ＣＤ３４陽性細胞は、主にＴ細胞から構成される。非ＣＤ３４陽性細胞は、ＣＤ３４陰性細胞ということもできる。
【0023】
ＣＤ３４陽性細胞の抽出は、例えば、蛍光標識された抗ＣＤ３４抗体を用いてフローサイトメトリーにより行うことができるが、この方法に限定されない。ＣＤ３４陽性細胞は、フローサイトメーターでサイズ分画により抽出することや、自家蛍光のスペクトルや特定の数個の波長における強度を解析することでＣＤ３４陽性細胞を抽出することもできる（特許文献２）。
【0024】
ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）で分離されたＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。ＣＤ３４陽性細胞の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子をＣＤ３４陽性細胞に導入することにより行うことができる。
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）で分離されたＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。ＣＤ３４陽性細胞の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子をＣＤ３４陽性細胞に導入することにより行うことができる。
【0025】
非ＣＤ３４陽性細胞の培養工程（Ｓ８）
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）で分離された非ＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）と並行して（すなわち、ＣＤ３４陽性細胞の初期化と同時期に）、培地で培養する。培地は、Ｔ細胞を培養するための培地を使用することが好ましい。Ｔ細胞を培養するための培地は、市販されており、例えばX-Vivo 10（Lonza）が挙げられる。また、培地は、Ｔ細胞増殖因子を含んでいることが好ましい。Ｔ細胞増殖因子は、Ｔ細胞に増殖刺激を与える因子であり、例えばIL-2やCD3もしくはCD28モノクローナル抗体が挙げられる。培養は、例えば５～７日間行うことができる。
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）で分離された非ＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）と並行して（すなわち、ＣＤ３４陽性細胞の初期化と同時期に）、培地で培養する。培地は、Ｔ細胞を培養するための培地を使用することが好ましい。Ｔ細胞を培養するための培地は、市販されており、例えばX-Vivo 10（Lonza）が挙げられる。また、培地は、Ｔ細胞増殖因子を含んでいることが好ましい。Ｔ細胞増殖因子は、Ｔ細胞に増殖刺激を与える因子であり、例えばIL-2やCD3もしくはCD28モノクローナル抗体が挙げられる。培養は、例えば５～７日間行うことができる。
【0026】
培養により、非ＣＤ３４陽性細胞に含まれるＴ細胞を増殖させることができる。すなわち、この培養工程により、この後のＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）のための原料細胞を調製することができる。
【0027】
この培養工程で、Ｔ細胞が増殖して細胞周期の分裂期にいると、この後のＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）でｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができる。
【0028】
Ｔ細胞の初期化工程（Ｓ９）
非ＣＤ３４陽性細胞の培養工程（Ｓ８）で得た細胞（Ｔ細胞を含む）を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。Ｔ細胞の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子をＴ細胞に導入することにより行うことができる。
非ＣＤ３４陽性細胞の培養工程（Ｓ８）で得た細胞（Ｔ細胞を含む）を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。Ｔ細胞の初期化は、エレクトロポレーション法やリポフェクション法などの公知のトランスフェクション法により、初期化因子をＴ細胞に導入することにより行うことができる。
【0029】
Ｔ細胞の初期化工程（Ｓ９）で使用される細胞は、２回の培養工程（Ｓ５およびＳ８）を経ており、採血工程（Ｓ１）から例えば１０～１４日経過しているが、ｉＰＳ細胞の作製に成功したことが実験により実証されている。
【0030】
（初期化の順序）
上記の方法では、非単球の培養（Ｓ５）を、単球の初期化（Ｓ４）と並行して行い、単球の初期化（Ｓ４）の後に、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）を行う。その後、非ＣＤ３４陽性細胞の培養（Ｓ８）を、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）と並行して行い、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）の後に、Ｔ細胞の初期化（Ｓ９）を行う。すなわち、上記の方法では、単球の初期化（Ｓ４）、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）、およびＴ細胞の初期化（Ｓ９）を、一連のプロセスでこの順序で行う。
上記の方法では、非単球の培養（Ｓ５）を、単球の初期化（Ｓ４）と並行して行い、単球の初期化（Ｓ４）の後に、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）を行う。その後、非ＣＤ３４陽性細胞の培養（Ｓ８）を、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）と並行して行い、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）の後に、Ｔ細胞の初期化（Ｓ９）を行う。すなわち、上記の方法では、単球の初期化（Ｓ４）、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）、およびＴ細胞の初期化（Ｓ９）を、一連のプロセスでこの順序で行う。
【0031】
上記の方法で、単球、ＣＤ３４陽性細胞、Ｔ細胞の順に初期化を行う理由を以下に説明する。単球は、in vitroで培養によって維持することが難しいことから、最初に初期化を行うことが望ましい。ＣＤ３４陽性細胞およびＴ細胞は、in vitroで培養によって維持することができるが、ＣＤ３４陽性細胞は、血液中の存在量が少なく貴重であるため、ＣＤ３４陽性細胞の分離後、速やかに初期化を行うことが望ましい。また、Ｔ細胞は、非ＣＤ３４陽性細胞の分離後に培養して、ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることができるため、最後に初期化を行うことが望ましい。
【0032】
（第１変形例）
例示した上述の方法では、単球の初期化工程（Ｓ４）、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）、およびＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）を、この順序で行うが、第１変形例では、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）とＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）の順序を逆にしてもよい。
例示した上述の方法では、単球の初期化工程（Ｓ４）、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）、およびＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）を、この順序で行うが、第１変形例では、ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）とＴ細胞の初期化工程（Ｓ９）の順序を逆にしてもよい。
【0033】
第１変形例では、上述の方法と同様に、採血（Ｓ１）からＣＤ３４陽性細胞の抽出（Ｓ６）までを行う。その後、分離された非ＣＤ３４陽性細胞の培養（Ｓ８）を行い、Ｔ細胞の初期化（Ｓ９）を行った後に、ＣＤ３４陽性細胞の初期化（Ｓ７）を行う。すなわち、第１変形例では、単球、Ｔ細胞、ＣＤ３４陽性細胞の順にｉＰＳ細胞の作製を行う。
【0034】
（第２変形例）
例示した上述の方法では、非単球の培養工程（Ｓ５）を行うが、第２変形例では、非単球の培養工程（Ｓ５）は省略してもよい。
例示した上述の方法では、非単球の培養工程（Ｓ５）を行うが、第２変形例では、非単球の培養工程（Ｓ５）は省略してもよい。
【0035】
第２変形例は、非単球の培養工程（Ｓ５）を省略したこと以外は、例示した上述の方法と同様に行うことができる。すなわち、第２変形例では、単球の抽出工程（Ｓ３）で分離した非単球を、培養することなく、ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）に移す。
【0036】
（効果）
実施形態に係る方法によれば、ドナーの血液から３種類の血球細胞（すなわち、単球、ＣＤ３４陽性細胞、およびＴ細胞）を分離し、３種類の血球細胞を順番に初期化してｉＰＳ細胞を作製する一連のプロセスを行う。一方、従来法では、ドナーの血液から１種類の血球細胞を分離し、１種類の血球細胞のみをｉＰＳ細胞の作製に利用する。
実施形態に係る方法によれば、ドナーの血液から３種類の血球細胞（すなわち、単球、ＣＤ３４陽性細胞、およびＴ細胞）を分離し、３種類の血球細胞を順番に初期化してｉＰＳ細胞を作製する一連のプロセスを行う。一方、従来法では、ドナーの血液から１種類の血球細胞を分離し、１種類の血球細胞のみをｉＰＳ細胞の作製に利用する。
【0037】
実施形態に係る方法は、３種類の血球細胞を順番に初期化してｉＰＳ細胞を作製する一連のプロセスを行うため、従来法と比べて、ｉＰＳ細胞を樹立できる確率が高く、ｉＰＳ細胞を樹立できないリスクを減らすことができる。このため、実施形態に係る方法は、従来法と比べて、必要な量のｉＰＳ細胞を確保し易い。
【0038】
また、実施形態に係る方法は、従来法でｉＰＳ作製をした場合に起こる各血球細胞のデメリット、すなわち、ｉＰＳ細胞の樹立効率が低いという単球のデメリットや、血液中のＣＤ３４陽性細胞の細胞数が少ないというデメリットや、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＤＮＡ情報が変化しているというデメリットを他の血球細胞によって補うことができる。
【0039】
また、ｉＰＳ細胞は、原料細胞の種類によって、分化し易い細胞の種類が異なる場合がある。このため、複数の原料細胞種に由来するｉＰＳ細胞を作製しておくと、ｉＰＳ細胞の樹立後に目的細胞へ分化できないリスク（分化抵抗性）を減らすとともに、分化細胞のバリエーションを増やすことができる。すなわち、複数の原料細胞種に由来するｉＰＳ細胞を作製しておくと、ｉＰＳ細胞の用途の幅を広げることができる。
【0040】
以上述べたとおり、実施形態に係る方法は、ドナーから採取した限られた量の血液を有効利用し、これにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率および目的細胞への分化効率を高めることができる。
【0041】
また、ｉＰＳ細胞を樹立できなかった場合や目的細胞へ分化させることができなった場合、ドナーから再度採血をして、ｉＰＳ細胞の作製や目的細胞への分化をやり直す必要がある。しかし、実施形態に係る方法は、ｉＰＳ細胞の樹立効率および目的細胞への分化効率を高めることができるため、ドナーから再度採血をする可能性を減らし、採血に伴うドナーへの負担を軽減することができる。
【0042】
加えて、実施形態に係る方法は、３種類の血球細胞を順番に初期化してｉＰＳ細胞を作製し、初期化プロセスを同時並行で行わないため、サンプルの取り違いや混入のリスクが少ない点でも優れている。
【0043】
＜２＞ｉＰＳ細胞作製システム
上述の「ｉＰＳ細胞の作製方法」を実施するシステムを以下に説明する。一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞作製システムは、
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離する単球抽出デバイスと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する単球初期化デバイスと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する非単球培養デバイスと
を含む。
上述の「ｉＰＳ細胞の作製方法」を実施するシステムを以下に説明する。一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞作製システムは、
全血から分離された単核細胞から単球を抽出して、前記単核細胞を前記単球と非単球とに分離する単球抽出デバイスと、
分離された前記単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する単球初期化デバイスと、
分離された前記非単球を第１培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する非単球培養デバイスと
を含む。
【0044】
上記実施形態に係るシステムは、
前記第１原料細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、前記第１原料細胞を前記ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離するＣＤ３４陽性細胞抽出デバイスと、
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製するＣＤ３４陽性細胞初期化デバイスと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製する非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイスと
を更に含んでいてもよい。
前記第１原料細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、前記第１原料細胞を前記ＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離するＣＤ３４陽性細胞抽出デバイスと、
分離された前記ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製するＣＤ３４陽性細胞初期化デバイスと、
分離された前記非ＣＤ３４陽性細胞を第２培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製する非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイスと
を更に含んでいてもよい。
【0045】
更に、上記実施形態に係るシステムは、
前記第２原料細胞を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製するＴ細胞初期化デバイス
を更に含んでいてもよい。
前記第２原料細胞を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製するＴ細胞初期化デバイス
を更に含んでいてもよい。
【0046】
（ｉＰＳ細胞作製システムの一例）
ｉＰＳ細胞作製システムの一例を図２に示す。図２に示すように、ｉＰＳ細胞作製システム１は、ＰＢＭＣ抽出デバイス２と、単球抽出デバイス３と、単球初期化デバイス４と、非単球培養デバイス５と、ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス６と、ＣＤ３４陽性細胞初期化デバイス７と、非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイス８と、Ｔ細胞初期化デバイス９とを備えている。なお、各デバイスの間の細胞の搬送は、自動で行ってもよいし手動で行ってもよい。
ｉＰＳ細胞作製システムの一例を図２に示す。図２に示すように、ｉＰＳ細胞作製システム１は、ＰＢＭＣ抽出デバイス２と、単球抽出デバイス３と、単球初期化デバイス４と、非単球培養デバイス５と、ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス６と、ＣＤ３４陽性細胞初期化デバイス７と、非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイス８と、Ｔ細胞初期化デバイス９とを備えている。なお、各デバイスの間の細胞の搬送は、自動で行ってもよいし手動で行ってもよい。
【0047】
ＰＢＭＣ抽出デバイス２は、全血からＰＢＭＣを抽出する。ＰＢＭＣ抽出デバイス２として、例えば、ＰＢＭＣを分離可能な密度勾配媒体が充填された遠心チューブと、遠心分離機とを使用することができる。遠心チューブとして、例えば、SepMate（Stemcell Technologies）を使用することができる。
【0048】
単球抽出デバイス３は、ＰＢＭＣから単球を抽出して、ＰＢＭＣを単球と非単球とに分離する。単球抽出デバイス３として、例えば、フローサイトメーターを使用することができる。
【0049】
単球初期化デバイス４は、単球を初期化して、単球由来のｉＰＳ細胞を作製する。単球初期化デバイス４として、例えば、単球と培地を収容するための培養容器と；培養容器に収容された単球を、制御された環境下で培養するための培養空間を内部に有する第１インキュベータとを使用することができる。第１インキュベータは、培養空間の雰囲気条件（温度、湿度、ガス組成など）を制御するように構成されている。例えば、第１インキュベータは、ヒータ、調湿器、ガス供給器、培養空間のガスを循環させるファン、培養空間の雰囲気条件を測定するセンサなどを備えていてもよい。
【0050】
非単球培養デバイス５は、非単球を培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第１原料細胞を調製する。非単球培養デバイス５として、例えば、非単球と培地を収容するための培養容器と；培養容器に収容された非単球を、制御された環境下で培養するための培養空間を内部に有する第２インキュベータとを使用することができる。第２インキュベータとして、上記の第１インキュベータを使用してもよい。
【0051】
ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス６は、第１原料細胞（非単球）からＣＤ３４陽性細胞を抽出して、原料細胞をＣＤ３４陽性細胞と非ＣＤ３４陽性細胞とに分離する。ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス６として、例えば、フローサイトメーターを使用することができる。ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス６としてフローサイトメーターを使用する場合、単球抽出デバイス３のフローサイトメーターを使用してもよい。
【0052】
ＣＤ３４陽性細胞初期化デバイス７は、ＣＤ３４陽性細胞を初期化して、ＣＤ３４陽性細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。ＣＤ３４陽性細胞初期化デバイス７として、例えば、ＣＤ３４陽性細胞と培地を収容するための培養容器と；培養容器に収容されたＣＤ３４陽性細胞を、制御された環境下で培養するための培養空間を内部に有する第３インキュベータとを使用することができる。第３インキュベータとして、上記の第１インキュベータを使用してもよい。
【0053】
非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイス８は、非ＣＤ３４陽性細胞を培地で培養して、ｉＰＳ細胞作製のための第２原料細胞を調製する。非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイス８として、例えば、非ＣＤ３４陽性細胞と培地を収容するための培養容器と；培養容器に収容された非ＣＤ３４陽性細胞を、制御された環境下で培養するための培養空間を内部に有する第４インキュベータとを使用することができる。第４インキュベータとして、上記の第１インキュベータを使用してもよい。
【0054】
Ｔ細胞初期化デバイス９は、第２原料細胞（Ｔ細胞を含む）を初期化して、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する。Ｔ細胞初期化デバイス９として、例えば、Ｔ細胞と培地を収容するための培養容器と；培養容器に収容されたＴ細胞を、制御された環境下で培養するための培養空間を内部に有する第５インキュベータとを使用することができる。第５インキュベータとして、上記の第１インキュベータを使用してもよい。
【0055】
いくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更、実施形態同士の組み合わせを行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【実施例0056】
上述の「ｉＰＳ細胞の作製方法の一例」に示された態様にて実験による実証を行った。以下に実証された例を記す。
【0057】
採血工程（Ｓ１）において、ドナーから採取された血液としてヒトの末梢血を使用した。
ＰＢＭＣの抽出工程（Ｓ２）において、遠心チューブとしてSepMate（Stemcell Technologies）を用いた。
単球の抽出工程（Ｓ３）は、フローサイトメーターにおいて、細胞の大きさを反映した前方散乱光（ＦＳＣ）の強度および細胞の内部構造を反映した側方散乱光（ＳＳＣ）の強度を測定することによるサイズ分画により実施した。
ＰＢＭＣの抽出工程（Ｓ２）において、遠心チューブとしてSepMate（Stemcell Technologies）を用いた。
単球の抽出工程（Ｓ３）は、フローサイトメーターにおいて、細胞の大きさを反映した前方散乱光（ＦＳＣ）の強度および細胞の内部構造を反映した側方散乱光（ＳＳＣ）の強度を測定することによるサイズ分画により実施した。
【0058】
単球の初期化工程（Ｓ４）は、センダイウイルス法（CytoTune-iPS 2.0L）により、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ－Ｍｙｃからなる４因子を単球に導入することにより実施した。
非単球の培養工程（Ｓ５）において血球前駆細胞を培養するための培地としては、StemSpan SFEM II（Stemcell Technologies）に、Ｔ細胞増殖因子としてIL-2を添加したものを使用した。
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）は、蛍光標識された抗ＣＤ３４抗体を用いたフローサイトメトリーにより実施した。
非単球の培養工程（Ｓ５）において血球前駆細胞を培養するための培地としては、StemSpan SFEM II（Stemcell Technologies）に、Ｔ細胞増殖因子としてIL-2を添加したものを使用した。
ＣＤ３４陽性細胞の抽出工程（Ｓ６）は、蛍光標識された抗ＣＤ３４抗体を用いたフローサイトメトリーにより実施した。
【0059】
ＣＤ３４陽性細胞の初期化工程（Ｓ７）は、センダイウイルス法（CytoTune-iPS 2.0L）により、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃからなる４因子をＣＤ３４陽性細胞に導入することにより実施した。
非ＣＤ３４陽性細胞の培養工程（Ｓ８）においてＴ細胞を培養するための培地としては、X-Vivo 10（Lonza）に、Ｔ細胞増殖因子としてIL-2並びにCD3及びCD28モノクローナル抗体を添加したものを使用した。
Ｔ細胞の初期化工程（Ｓ９）は、センダイウイルス法（CytoTune-iPS 2.0L）により、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃからなる４因子をＴ細胞に導入することにより行った。
非ＣＤ３４陽性細胞の培養工程（Ｓ８）においてＴ細胞を培養するための培地としては、X-Vivo 10（Lonza）に、Ｔ細胞増殖因子としてIL-2並びにCD3及びCD28モノクローナル抗体を添加したものを使用した。
Ｔ細胞の初期化工程（Ｓ９）は、センダイウイルス法（CytoTune-iPS 2.0L）により、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃからなる４因子をＴ細胞に導入することにより行った。
【0060】
以上の条件において、培養工程を経て順番に初期化を行っても、３種類の血球細胞のそれぞれから、従来と同程度のiPS細胞樹立効率を達成できた。すなわち、単球由来のiPS細胞、CD34陽性細胞由来のiPS細胞、およびT細胞由来のiPS細胞のそれぞれを、従来と同程度の樹立効率で作製することができた。
【符号の説明】
【0061】
１…ｉＰＳ細胞作製システム、２…ＰＢＭＣ抽出デバイス、３…単球抽出デバイス、４…単球初期化デバイス、５…非単球培養デバイス、６…ＣＤ３４陽性細胞抽出デバイス、７…ＣＤ３４陽性細胞初期化デバイス、８…非ＣＤ３４陽性細胞培養デバイス、９…Ｔ細胞初期化デバイス
【図1】
【図2】
