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特開2024-153471胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、及び胎盤様オルガノイドの評価方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024153471
(43)【公開日】2024-10-29
(54)【発明の名称】胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、及び胎盤様オルガノイドの評価方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241022BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02
C12N1/00 G
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023067387
(22)【出願日】2023-04-17
(71)【出願人】
【識別番号】304028726
【氏名又は名称】国立大学法人 大分大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】西田 欣広
(72)【発明者】
【氏名】塚本 善之
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS40
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BB23
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】出産後には不要となる胎盤から採取される絨毛細胞から胎盤様オルガノイドをよりも簡便かつ短期間に樹立できる胎盤様オルガノイドの製造方法を提供する。
【解決手段】ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法であって、前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法であって、前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法であって、
前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
ただし、ＣＨＩＲ９９０２１は６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９）を、Ａ８３－０１は３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）を意味する。
前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
ただし、ＣＨＩＲ９９０２１は６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９）を、Ａ８３－０１は３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）を意味する。
【請求項2】
前記細胞外マトリックスがマウスエンゲルブレスホルムスウォーム腫瘍から抽出された基底膜抽出物を含む、請求項１に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
【請求項3】
前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞を、基礎培地及び前記培地サプリメントを含む培養液中で浮遊培養する前培養工程を含む、請求項１に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
【請求項4】
前記前培養工程の後かつ前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞の凝集塊をセルストレーナーで単一細胞にふるいわける単一細胞化工程を含む、請求項３に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
【請求項5】
前記基礎培地がダルベッコ改変イーグル培地である、請求項１に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法により製造された、胎盤様オルガノイド。
【請求項7】
請求項６に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
【請求項8】
請求項６に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
前記胎盤様オルガノイドを被験物質と接触させ、メタボローム解析を行うことを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
前記胎盤様オルガノイドを被験物質と接触させ、メタボローム解析を行うことを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、及び胎盤様オルガノイドの評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
胎盤は、子宮における胎仔発生のために重要な臓器である。胎盤は、胎仔と母体環境とを、臍帯を介して連絡し、ガス、栄養、及び排泄物の交換を行い、さらに妊娠関連ホルモンの産生及び胎仔の免疫防御の支援を行っている。胎盤は、栄養膜系列の細胞から構成されている。
妊婦が摂取した物質は、胎盤を透過すると胎児に曝露される。物質が胎盤を透過するかどうかは、その物質による胎児への発生毒性の発現に大きく影響することから、物質が及ぼすヒト胎盤機能への影響やその物質の胎盤透過性を評価するためのイン・ビトロ試験系の開発が求められている。しかし、細胞を二次元の接着培養により栄養外胚葉、さらに栄養膜細胞系へと分化誘導した場合には、妊娠中に産生されるホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、略称：ｈＣＧ）の産生が２週間前後で停止し、長期の培養は困難である。
このように、ヒトの胎盤オルガノイドの作成は他の臓器に比べ困難で最も開発が遅れている。
妊婦が摂取した物質は、胎盤を透過すると胎児に曝露される。物質が胎盤を透過するかどうかは、その物質による胎児への発生毒性の発現に大きく影響することから、物質が及ぼすヒト胎盤機能への影響やその物質の胎盤透過性を評価するためのイン・ビトロ試験系の開発が求められている。しかし、細胞を二次元の接着培養により栄養外胚葉、さらに栄養膜細胞系へと分化誘導した場合には、妊娠中に産生されるホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、略称：ｈＣＧ）の産生が２週間前後で停止し、長期の培養は困難である。
このように、ヒトの胎盤オルガノイドの作成は他の臓器に比べ困難で最も開発が遅れている。
【0003】
特許文献１には、多能性幹細胞を骨形成蛋白質４（ＢＭＰ４）の存在下において浮遊培養することを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法が記載されている。
【0004】
非特許文献１には、絨毛細胞から胎盤様オルガノイドを樹立する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２２－０８１３７５号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｍ．Ａ．，外６名、“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０２０年１０月、第１５巻、ｐ．３４４１－３４６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
２０２０年にようやくヒト胎盤モデルが報告（非特許文献１）されたがその作成法は現実的には非常に難しいものであった。
特許文献１に記載された胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ４存在下で浮遊培養することを含む。特許文献１には、前記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）又はＩＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が好ましいことが記載されている。しかし、ＥＳ細胞を樹立するためにはヒト胚を壊す必要があることから倫理的問題があり、ＩＰＳ細胞はがん化のリスクがあることから、得られた胎盤様オルガノイドをミニ胎盤として利用できないおそれがある。
非特許文献１に記載された方法で得られる胎盤様オルガノイドは、絨毛細胞処理過程で大きさが均一でなく樹立まで複数回の継代が必要であり、適切な細胞濃度が不明であり研究応用が困難である。
特許文献１に記載された胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ４存在下で浮遊培養することを含む。特許文献１には、前記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）又はＩＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が好ましいことが記載されている。しかし、ＥＳ細胞を樹立するためにはヒト胚を壊す必要があることから倫理的問題があり、ＩＰＳ細胞はがん化のリスクがあることから、得られた胎盤様オルガノイドをミニ胎盤として利用できないおそれがある。
非特許文献１に記載された方法で得られる胎盤様オルガノイドは、絨毛細胞処理過程で大きさが均一でなく樹立まで複数回の継代が必要であり、適切な細胞濃度が不明であり研究応用が困難である。
【0008】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、出産後には不要となる胎盤から採取される絨毛細胞から胎盤様オルガノイドをよりも簡便かつ短期間に樹立できる胎盤様オルガノイドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ヒト絨毛細胞を特定の成分を含む培地サプリメント及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養することで、従来よりも簡便かつ短期間で胎盤様オルガノイドを樹立できることを知得し、本発明を完成させた。
本発明は以下の態様を含む。
本発明は以下の態様を含む。
【0010】
［１］ ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法であって、
前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
ただし、ＣＨＩＲ９９０２１は６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９）を、Ａ８３－０１は３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）を意味する。
［２］ 前記細胞外マトリックスがマウスエンゲルブレスホルムスウォーム腫瘍から抽出された基底膜抽出物を含む、［１］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［３］ 前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞を、基礎培地及び前記培地サプリメントを含む培養液中で浮遊培養する前培養工程を含む、［１］又は［２］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［４］ 前記前培養工程の後かつ前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞の凝集塊をセルストレーナーで単一細胞にふるいわける単一細胞化工程を含む、［３］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［５］ 前記基礎培地がダルベッコ改変イーグル培地である、［１］～［４］のいずれかに記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［６］ ［１］～［５］のいずれか１項に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法により製造された、胎盤様オルガノイド。
［７］ ［６］に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
［８］ ［６］に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
前記胎盤様オルガノイドを被験物質と接触させ、メタボローム解析を行うことを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
前記培地サプリメントが、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
ただし、ＣＨＩＲ９９０２１は６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９）を、Ａ８３－０１は３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）を意味する。
［２］ 前記細胞外マトリックスがマウスエンゲルブレスホルムスウォーム腫瘍から抽出された基底膜抽出物を含む、［１］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［３］ 前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞を、基礎培地及び前記培地サプリメントを含む培養液中で浮遊培養する前培養工程を含む、［１］又は［２］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［４］ 前記前培養工程の後かつ前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞の凝集塊をセルストレーナーで単一細胞にふるいわける単一細胞化工程を含む、［３］に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［５］ 前記基礎培地がダルベッコ改変イーグル培地である、［１］～［４］のいずれかに記載の胎盤様オルガノイドの製造方法。
［６］ ［１］～［５］のいずれか１項に記載の胎盤様オルガノイドの製造方法により製造された、胎盤様オルガノイド。
［７］ ［６］に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
［８］ ［６］に記載の胎盤様オルガノイドの評価方法であって、
前記胎盤様オルガノイドを被験物質と接触させ、メタボローム解析を行うことを含む、胎盤様オルガノイドの評価方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、出産後には不要となる胎盤から採取される絨毛細胞から胎盤様オルガノイドをよりも簡便かつ短期間に樹立できる胎盤様オルガノイドの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】１回目の継代後の培養細胞の光学顕微鏡による観察結果である。Ａ，継代０日目ｌＢ，継代３日目；Ｃ，継代６日目；Ｄ，継代１０日目。
【図2】絨毛組織（妊娠９週）の蛍光観察像である。Ａ（左上），Ｓｙｎｄｅｃａｎ染色；Ｂ（左下），ＩＴＧＡ６染色；Ｃ（右上），ＤＡＰＩ染色；Ｄ（右下），全合成写真。
【図3】製造した胎盤様オルガノイドの蛍光観察像である。Ａ（左上），Ｓｙｎｄｅｃａｎ染色；Ｂ（左下），ＩＴＧＡ６染色；Ｃ（右上），ＤＡＰＩ染色；Ｄ（右下），全合成写真。
【図4】ＦＡＣＳ解析の結果である。Ａ，全細胞；Ｂ，ＩＴＧＡ６染色細胞（５２．４４％）。
【図5】ＦＡＣＳ解析の結果である。Ａ，全細胞；Ｂ，Ｓｙｎｄｅｃａｎ染色細胞（３９．０４％）。
【図6】メタボローム解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下では本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、及び胎盤様オルガノイドの評価方法の実施形態を詳細に説明する。ただし、本発明は後述する実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り種々の改変が可能である。
【0014】
［胎盤様オルガノイドの製造方法］
＜培養工程＞
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む。
基礎培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地等の従来細胞培養に使用されている基礎培地が挙げられる。
培養は、ＣＯ２インキュベーターを用いて、５％ＣＯ２濃度、３７℃で行うことが好ましい。
培養時間は、１０～１４日間とすることが好ましい。
細胞外マトリックス中で細胞を培養することにより、三次元の構造を形成することができる。
＜培養工程＞
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、ヒト絨毛細胞を、基礎培地、培地サプリメント、及び細胞外マトリックスを含む培地と接触させて培養する培養工程とを含む。
基礎培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地等の従来細胞培養に使用されている基礎培地が挙げられる。
培養は、ＣＯ２インキュベーターを用いて、５％ＣＯ２濃度、３７℃で行うことが好ましい。
培養時間は、１０～１４日間とすることが好ましい。
細胞外マトリックス中で細胞を培養することにより、三次元の構造を形成することができる。
【0015】
＜前培養工程＞
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞を、基礎培地及び培地サプリメントを含む培養液中で浮遊培養する前培養工程を含むことが好ましい。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、前記前培養工程の後かつ前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞の凝集塊をセルストレーナーで均一細胞塊に分離する工程を含むことが好ましい。
セルストレーナーは特に限定されない。セルストレーナーの容量は、最大６ｍＬと制限されるため１～５ｍＬであることがより好ましく、２～４ｍＬであることがさらに好ましく、約３ｍＬでことが特に好ましい。セルストレーナーのポアサイズは、特に限定されないが、７０～１００μｍであることが好ましい。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞を、基礎培地及び培地サプリメントを含む培養液中で浮遊培養する前培養工程を含むことが好ましい。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法は、前記前培養工程の後かつ前記培養工程の前に、ヒト絨毛細胞の凝集塊をセルストレーナーで均一細胞塊に分離する工程を含むことが好ましい。
セルストレーナーは特に限定されない。セルストレーナーの容量は、最大６ｍＬと制限されるため１～５ｍＬであることがより好ましく、２～４ｍＬであることがさらに好ましく、約３ｍＬでことが特に好ましい。セルストレーナーのポアサイズは、特に限定されないが、７０～１００μｍであることが好ましい。
【0016】
＜細胞外マトリックス＞
前記細胞外マトリックスは、マウスエンゲルブレスホルムスウォーム腫瘍から抽出された基底膜抽出物を含むことが好ましく、Ｃｏｒｎｉｎｇ マトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社製）又はその相当品を用いることがより好ましい。Ｃｏｒｎｉｎｇ マトリゲル基底膜マトリックスは、ラミニン（主成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン及び数々の増殖因子を含むＥＣＭタンパク質が豊富なＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製品である。
前記細胞外マトリックスは、マウスエンゲルブレスホルムスウォーム腫瘍から抽出された基底膜抽出物を含むことが好ましく、Ｃｏｒｎｉｎｇ マトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社製）又はその相当品を用いることがより好ましい。Ｃｏｒｎｉｎｇ マトリゲル基底膜マトリックスは、ラミニン（主成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン及び数々の増殖因子を含むＥＣＭタンパク質が豊富なＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製品である。
【0017】
＜培地サプリメント＞
前記培地サプリメントの一実施形態は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む培地サプリメントである。
前記培地サプリメントの一実施形態は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、プリモシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒト上皮成長因子、ＣＨＩＲ９９０２１、ヒトＲ－スポンジン－１、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト肝細胞増殖因子、Ａ８３－０１、及びプロスタグランジンＥ２を含む培地サプリメントである。
【0018】
Ｎ２サプリメントは、神経細胞をはじめとするさまざまな細胞の無血清培養を行うことを可能としたサプリメントである。Ｎ２サプリメントにより、従来、血清添加の条件で培養されていた細胞が既知の因子により培養できるようになった。Ｎ２サプリメントは、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、２－メルカプトエタノール、及び亜セレン酸ナトリウムの５因子を含み、これらの５因子に加えてさらにオレイン酸を含んでもよい。
Ｎ２サプリメントとしては、例えばＧｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１７５０２０４８）、ＮＤｉｆｆ Ｎｅｕｒｏ－２ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２００×）（メルク社製、製品番号：ＳＣＭ０１２）、Ｎ２サプリメント〔トランスフェリン（ホロ）含有）〕（×１００）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１４１－０８９４１）、又はＮ２サプリメント〔トランスフェリン（アポ）含有〕（×１００）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１４１－０９０４１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＮ２サプリメントの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、１００×濃度のＧｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）を基準として、０．７～１．３×濃度となることが好ましく、０．８～１．２×濃度となることがより好ましく、１×濃度となることがより好ましい。
Ｎ２サプリメントとしては、例えばＧｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１７５０２０４８）、ＮＤｉｆｆ Ｎｅｕｒｏ－２ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２００×）（メルク社製、製品番号：ＳＣＭ０１２）、Ｎ２サプリメント〔トランスフェリン（ホロ）含有）〕（×１００）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１４１－０８９４１）、又はＮ２サプリメント〔トランスフェリン（アポ）含有〕（×１００）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１４１－０９０４１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＮ２サプリメントの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、１００×濃度のＧｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）を基準として、０．７～１．３×濃度となることが好ましく、０．８～１．２×濃度となることがより好ましく、１×濃度となることがより好ましい。
【0019】
Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡは、インスリン等の２０因子を含むＢ２７サプリメントの組成からビタミンＡを抜いたものである。
Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡとしては、例えばＧｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１２５８７０１０）、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（Ｔｒｉｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、製品番号：ＴＢＳ８０８０）、又はＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＳＭ１ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（５０×）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：０５７３１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＢ２７サプリメントマイナスビタミンＡの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、５０×濃度のＧｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａを基準として、０．７～１．３×濃度となることが好ましく、０．８～１．２×濃度となることがより好ましく、１×濃度となることがさらに好ましい。
Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡとしては、例えばＧｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１２５８７０１０）、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（Ｔｒｉｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、製品番号：ＴＢＳ８０８０）、又はＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＳＭ１ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（５０×）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：０５７３１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＢ２７サプリメントマイナスビタミンＡの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、５０×濃度のＧｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａを基準として、０．７～１．３×濃度となることが好ましく、０．８～１．２×濃度となることがより好ましく、１×濃度となることがさらに好ましい。
【0020】
プリモシンは、マイコプラズマ、細菌、及び菌類（酵母、黴）に対する抗菌剤である。マイコプラズマは、細菌であるが、細胞壁を持たず細胞の形状に可塑性があり、０．２２μｍフィルターを通過する。そのため、細胞培養に用いる培地は、ろ過滅菌してもマイコプラズマによるコンタミネーションを回避することが難しい。また、細胞壁を持たないので、細胞壁合成酵素を標的とするβ－ラクタム系（ペニシリン系、セフェム系）の抗菌剤は効果がない。プリモシンには４種類の抗菌剤が含まれており、そのうち３種類は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、及びマイコプラズマのＤＮＡとタンパク質合成を阻害する。４種類目の抗菌剤は、菌類（酵母、黴）の細胞膜を介したイオン交換を妨害する。
プリモシンとしては、Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、製品番号：ａｎｔ－ｐｍ－１、製品濃度：５０ｍｇ／ｍＬ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のプリモシンの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７０～１３０μｇ／ｍＬとなることが好ましく、９０～１１０μｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１００μｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
プリモシンとしては、Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、製品番号：ａｎｔ－ｐｍ－１、製品濃度：５０ｍｇ／ｍＬ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のプリモシンの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７０～１３０μｇ／ｍＬとなることが好ましく、９０～１１０μｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１００μｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
【0021】
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（略称：ＮＡＣ、ＣＡＳ登録番号：６１６－９１－１）は、抗酸化物質である。細胞内のフリーラジカルスカベンジャー蓄積量を増加させる。神経細胞のアポトーシスを防止する働きが知られている。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＮ－アセチル－Ｌ－システインの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、１．０～１．５ｍＭとなることが好ましく、１．１～１．４ｍＭとなることがより好ましく、１．２５ｍＭとなることがさらに好ましい。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＮ－アセチル－Ｌ－システインの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、１．０～１．５ｍＭとなることが好ましく、１．１～１．４ｍＭとなることがより好ましく、１．２５ｍＭとなることがさらに好ましい。
【0022】
ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、略称：ｈＥＧＦ、ＣＡＳ登録番号：６２２２９－５０－９）は、５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合からなる分子量６０４５のタンパク質である。細胞表面に存在する上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、略称：ＥＧＦＲ）にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割をする。ｈＥＧＦとしては、組換え体を使用してもよい。
ｈＥＧＦとしては、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０５９－０７８７３）、ｒｈＥＧＦ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（東京化成工業社製、製品番号：Ｒ０２６２）、又はＥＧＦ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｅ． ｃｏｌｉ（メルク社製、製品番号：３２４８３１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｈＥＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７５～１２５ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、９０～１１０ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１００ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
ｈＥＧＦとしては、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０５９－０７８７３）、ｒｈＥＧＦ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（東京化成工業社製、製品番号：Ｒ０２６２）、又はＥＧＦ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｅ． ｃｏｌｉ（メルク社製、製品番号：３２４８３１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｈＥＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７５～１２５ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、９０～１１０ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１００ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
【0023】
ＣＨＩＲ９９０２１〔ＩＵＰＡＣ名：６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル、ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９〕は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（。ＧＳＫ３、ＧＳＫ３α及びＧＳＫ３β）の阻害剤である。ＧＳＫ３、ＧＳＫ３α及びＧＳＫ３βのＩＣ５０値は、それぞれ１０及び６．７ｎＭである。
ＣＨＩＲ９９０２１としては、例えばＣＨＩＲ９９０２１（ケイマンケミカル社製、製品番号：１３１２２）、Ｌａｄｕｖｉｇｌｕｓｉｂ（ＭｅｄＥｘｐｒｅｓｓ社製、製品番号：ＨＹ－１０１８２）、Ｌａｄｕｖｉｇｌｕｓｉｂ（ＣＨＩＲ－９９０２１）（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、製品番号：Ｓ１２６３）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、２．７～３．３μＭとなることが好ましく、２．８５～３．１５μＭとなることがより好ましく、３μＭとなることがさらに好ましい。
ＣＨＩＲ９９０２１としては、例えばＣＨＩＲ９９０２１（ケイマンケミカル社製、製品番号：１３１２２）、Ｌａｄｕｖｉｇｌｕｓｉｂ（ＭｅｄＥｘｐｒｅｓｓ社製、製品番号：ＨＹ－１０１８２）、Ｌａｄｕｖｉｇｌｕｓｉｂ（ＣＨＩＲ－９９０２１）（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、製品番号：Ｓ１２６３）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、２．７～３．３μＭとなることが好ましく、２．８５～３．１５μＭとなることがより好ましく、３μＭとなることがさらに好ましい。
【0024】
ヒトＲ－スポンジン－１（略称：Ｒｓｐｏ－１）は、ＷｎｔモジュレーターのＲｓｐｏファミリー（Ｒｓｐｏ１－４）に属するタンパク質である。Ｒｓｐｏ－１は副腎、卵巣、精巣、甲状腺及び気管と同様に中枢神経発生の特定部位で発現される。ＲｓｐｏはＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達パスウェイ刺激において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ６レセプター複合体と相互作用する。
Ｒｓｐｏ－１としては、例えばＲ－スポンジン－１，ヒト，組換え体（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１８１－０２８０１）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ １ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｑｋｉｎｅ社製、製品番号：Ｑｋ００６－０１００）、又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ １，Ｃａｒｒｉｅｒ－ｆｒｅｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号：４６４５－ＲＳ－０２５／ＣＦ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＲｓｐｏ－１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７０～９０ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、７５～８５ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、８０ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
Ｒｓｐｏ－１としては、例えばＲ－スポンジン－１，ヒト，組換え体（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１８１－０２８０１）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ １ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｑｋｉｎｅ社製、製品番号：Ｑｋ００６－０１００）、又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ １，Ｃａｒｒｉｅｒ－ｆｒｅｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号：４６４５－ＲＳ－０２５／ＣＦ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＲｓｐｏ－１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７０～９０ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、７５～８５ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、８０ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
【0025】
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、略称：ｂＦＧＦ、ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ、ＦＧＦ２、ＣＡＳ登録番号：１０６０９６－９３－９）は多面的な作用を示す成長因子であり、血管新生に加えて神経系、肺、筋肉、骨、皮膚の発生への関与が示唆されている。ｂＦＧＦはヒト胚性幹細胞の培地の重要な構成要素である。ＦＧＦ２は細胞を未分化状態に維持するために必要である。
ｂＦＧＦとしては、線維芽細胞成長因子（塩基性）（ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ ／ ｂＦＧＦ ／ ＦＧＦ２），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（１５４ａａ）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０６０－０５３８３）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＨＹＧＩＥＩＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製、製品番号：１６０００１０１）、又はＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｂａｓｉｃ，ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ａｎｉｍａｌ－ｆｒｅｅ（メルク社製、製品番号：ＧＦ００３ＡＦ－１００ＵＧ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｂＦＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７～１３ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、８．５～１１．５ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１０ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
ｂＦＧＦとしては、線維芽細胞成長因子（塩基性）（ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ ／ ｂＦＧＦ ／ ＦＧＦ２），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（１５４ａａ）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０６０－０５３８３）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＨＹＧＩＥＩＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製、製品番号：１６０００１０１）、又はＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｂａｓｉｃ，ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ａｎｉｍａｌ－ｆｒｅｅ（メルク社製、製品番号：ＧＦ００３ＡＦ－１００ＵＧ）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｂＦＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７～１３ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、８．５～１１．５ｎｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１０ｎｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
【0026】
ヒト肝細胞増殖因子（ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、略称：ｈＨＧＦ）は、初代培養肝細胞の増殖を強く促進する因子として精製されたサイトカインである。ｈＨＧＦは増殖因子としては大きく、分子量約６万の重鎖と約３．５万の軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマーの構造をもつ。
ｈＨＧＦとしては、例えばＨｕｍａｎ ＨＧＦ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（プロテインテック社製、製品番号：ＨＺ－１０８４）又は肝細胞増殖因子 ヒト（メルク社製、製品番号：Ｈ５７９１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｈＨＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７～１３ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、８．５～１１．５ｍｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１０ｍｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
ｈＨＧＦとしては、例えばＨｕｍａｎ ＨＧＦ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（プロテインテック社製、製品番号：ＨＺ－１０８４）又は肝細胞増殖因子 ヒト（メルク社製、製品番号：Ｈ５７９１）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のｈＨＧＦの濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、７～１３ｎｇ／ｍＬとなることが好ましく、８．５～１１．５ｍｇ／ｍＬとなることがより好ましく、１０ｍｇ／ｍＬとなることがさらに好ましい。
【0027】
Ａ８３－０１（別名：３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）は、ＴＧＦ－βｔｙｐｅ Ｉ／ａｃｔｉｖｉｎ受容体様キナーゼ（ＡＬＫ５）、ｔｙｐｅ Ｉ ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ受容体様キナーゼ（ＡＬＫ４）、ｔｙｐｅ Ｉ ｎｏｄａｌ受容体様キナーゼ（ＡＬＫ７）の選択的阻害剤である。Ｓｍａｄ２／３のリン酸化やＴＧＦ－β誘導性の上皮間充織転換を阻害する。
Ａ８３－０１としては、例えばＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０３５－２４１１３）、Ａ８３－０１（メルク社製、製品番号：ＳＭＬ０７８８）、又はＡ８３－０１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号：２９３９／１０）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＡ８３－０１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、４００～６００ｎＭとなることが好ましく、４５０～５５０ｎＭとなることがより好ましく、５００ｎＭとなることがさらに好ましい。
Ａ８３－０１としては、例えばＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０３５－２４１１３）、Ａ８３－０１（メルク社製、製品番号：ＳＭＬ０７８８）、又はＡ８３－０１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号：２９３９／１０）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＡ８３－０１の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、４００～６００ｎＭとなることが好ましく、４５０～５５０ｎＭとなることがより好ましく、５００ｎＭとなることがさらに好ましい。
【0028】
プロスタグランジンＥ２（略称：ＰＧＥ２、ＣＡＳ登録番号：３６３－２４－６）は。生理活性物質であるプロスタグランジンの一種であり、ＰＧＥ受容体を介して発熱や破骨細胞による骨吸収、分娩などに関与している。ＰＧＥ２の命名法はプロスタグランジン類に共通するものであり、五員環部分の９位にオキソ基と１１位にヒドロキシル基、側鎖部分の１５位にヒドロキシル基を有するので“Ｅ”、５位、１３位の２箇所に二重結合を有するので“２”とされる。
ＰＧＥ２としては、例えばプロスタグランジンＥ２（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１６５－１０８１３）、プロスタグランジンＥ２（ナカライテスク社製、製品番号：２９３３４－３４）、又はプロスタグランジンＥ２（東京化成工業社製、製品番号：Ｐ１８８４）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＰＧＥ２の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、０．７～１．３μＭとなることが好ましく、０．８５～１．１５μＭとなることがより好ましく、１．０μＭとなることがさらに好ましい。
ＰＧＥ２としては、例えばプロスタグランジンＥ２（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１６５－１０８１３）、プロスタグランジンＥ２（ナカライテスク社製、製品番号：２９３３４－３４）、又はプロスタグランジンＥ２（東京化成工業社製、製品番号：Ｐ１８８４）などの市販品を使用することができる。
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメント中のＰＧＥ２の濃度は、特に限定されないが、本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントを添加した培地中の終濃度で、０．７～１．３μＭとなることが好ましく、０．８５～１．１５μＭとなることがより好ましく、１．０μＭとなることがさらに好ましい。
【0029】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントは、０．７～１．３×濃度 Ｎ２サプリメント、０．７～１．３×濃度 Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ、７０～１３０μｇ／ｍＬ プリモシン、１．０～１．５ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、７５～１２５ｎｇ／ｍＬ ヒト上皮成長因子、２．７～３．３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、７０～９０ｎｇ／ｍＬ ヒトＲ－スポンジン－１、７～１３ｎｇ／ｍＬ ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５０～６０ｎｇ／ｍＬヒト肝細胞増殖因子、４００～６００ｎＭ Ａ８３－０１、及び０．７～１．３μＭ プロスタグランジンＥ２を、各濃度の比で含むことが好ましい。但し、前記Ｎ２サプリメントの前記培地サプリメント中の濃度は、Ｇｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１７５０２０４８）を基準とする濃度であり、前記Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡの前記培地サプリメント中の濃度は、５０×濃度のＧｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１２５８７０１０）を基準とする濃度である。
【0030】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントは、本発明の効果を妨げない範囲で、上述した成分以外の成分を含んでもよい。
【0031】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントは、各成分を水に溶解又は分散することによって調製することができる。
【0032】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントの調製に用いる水は、精製された水が好ましく、例えば蒸留水、ＲＯ水（ＲＯ膜（逆浸透膜）によるろ過処理がされた水）、イオン交換水（イオン交換樹脂によりイオン性の不純物を除去した水）、Ｅｌｉｘ水（ＲＯ膜とＥＤＩ膜（連続イオン交換膜）により精製された水）などを使用することができる。
【0033】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントのｐＨは、特に限定されないが、６．５～７．５であることが好ましく、６．８～７．４であることがより好ましく、７．１～７．３であることがさらに好ましい。なお、前記ｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定して得られる測定値である。
【0034】
本実施形態の胎盤様オルガノイドの製造方法において用いる培地サプリメントは、濃縮液の形態で提供され、使用時に希釈するようにしてもよい。
【0035】
［胎盤様オルガノイド］
本発明の胎盤様オルガノイドは、上述した本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法により製造される胎盤様オルガノイドである。
本発明の胎盤様オルガノイドは、ヒト胎盤の絨毛組織と同様に、細胞性栄養膜細胞（ＶＣＴ）及び合胞体性栄養膜細胞（ＳＣＴ）の二層構造となっている。ただし、ヒト胎盤の絨毛組織とは逆に、細胞性栄養膜細胞（ＶＣＴ）が外側、合胞体性栄養膜細胞（ＳＣＴ）が内側となっている。中の間質は疎なマトリックス構造と毛細血管から構築されている。オルガノイドを樹立すると反転する。すなわち外側にあるＶＣＴのさらに外側のＢＭ（基底膜）がマトリゲルと接する構造となっている。
本発明の胎盤様オルガノイドは、上述した本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法により製造される胎盤様オルガノイドである。
本発明の胎盤様オルガノイドは、ヒト胎盤の絨毛組織と同様に、細胞性栄養膜細胞（ＶＣＴ）及び合胞体性栄養膜細胞（ＳＣＴ）の二層構造となっている。ただし、ヒト胎盤の絨毛組織とは逆に、細胞性栄養膜細胞（ＶＣＴ）が外側、合胞体性栄養膜細胞（ＳＣＴ）が内側となっている。中の間質は疎なマトリックス構造と毛細血管から構築されている。オルガノイドを樹立すると反転する。すなわち外側にあるＶＣＴのさらに外側のＢＭ（基底膜）がマトリゲルと接する構造となっている。
【0036】
［胎盤様オルガノイドの評価方法］
本発明の胎盤様オルガノイドの評価方法の一実施形態は、合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む。
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法としては、例えばＳｙｄｅｃａｎ染色が挙げられる。
細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法としては、例えばＩＴＧＡ６染色が挙げられる。
本発明の胎盤様オルガノイドの評価方法の一実施形態は、合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法と細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法とを組み合わせることを含む。
合胞体性栄養膜細胞に特異的な検出方法としては、例えばＳｙｄｅｃａｎ染色が挙げられる。
細胞性栄養膜細胞に特異的な検出方法としては、例えばＩＴＧＡ６染色が挙げられる。
【0037】
本発明の胎盤様オルガノイドの評価方法の別の一実施形態は、本発明の胎盤様オルガノイドを被験物質と接触させ、メタボローム解析を行うことを含む。メタボローム解析の方法は特に限定されない。
【実施例0038】
以下では本発明を実施例によってより具体的に説明する。ただし、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。
【0039】
［製造例１］培地サプリメントの調製
＜材料＞
・Ｎ２サプリメント
Ｇｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１７５０２０４８）
・Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ
Ｇｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１２５８７０１０）
・プリモシン
Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、製品番号：ａｎｔ－ｐｍ－１、製品濃度：５０ｍｇ／ｍＬ）
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０１５－０５１３２）
・ヒト上皮成長因子
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０５９－０７８７３）
・ＣＨＩＲ９９０２１
ＣＨＩＲ９９０２１（ケイマンケミカル社製、製品番号：１３１２２）
・ヒトＲ－スポンジン－１
Ｒ－スポンジン－１，ヒト，組換え体（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１８１－０２８０１）
・ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子
線維芽細胞成長因子（塩基性）（ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ ／ ｂＦＧＦ ／ ＦＧＦ２），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（１５４ａａ）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０６０－０５３８３）
・ヒト肝細胞増殖因子
肝細胞増殖因子 ヒト（メルク社製、製品番号：Ｈ５７９１）
・Ａ８３－０１
ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０３５－２４１１３）
・プロスタグランジンＥ２
プロスタグランジンＥ２（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１６５－１０８１３）
・水
イオン交換水
＜材料＞
・Ｎ２サプリメント
Ｇｉｂｃｏ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１７５０２０４８）
・Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ
Ｇｉｂｃｏ Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製、製品番号：１２５８７０１０）
・プリモシン
Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、製品番号：ａｎｔ－ｐｍ－１、製品濃度：５０ｍｇ／ｍＬ）
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０１５－０５１３２）
・ヒト上皮成長因子
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０５９－０７８７３）
・ＣＨＩＲ９９０２１
ＣＨＩＲ９９０２１（ケイマンケミカル社製、製品番号：１３１２２）
・ヒトＲ－スポンジン－１
Ｒ－スポンジン－１，ヒト，組換え体（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１８１－０２８０１）
・ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子
線維芽細胞成長因子（塩基性）（ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ ／ ｂＦＧＦ ／ ＦＧＦ２），ヒト，組換え体，動物由来物フリー（１５４ａａ）（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０６０－０５３８３）
・ヒト肝細胞増殖因子
肝細胞増殖因子 ヒト（メルク社製、製品番号：Ｈ５７９１）
・Ａ８３－０１
ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：０３５－２４１１３）
・プロスタグランジンＥ２
プロスタグランジンＥ２（富士フイルム和光純薬社製、製品番号：１６５－１０８１３）
・水
イオン交換水
【0040】
＜調製方法＞
各成分を以下の濃度となるように水に溶解して、１０倍濃度の濃縮液を調製した。
Ｎ２サプリメント １０×濃度
Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ １０×濃度
プリモシン １ｍｇ／ｍＬ
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン １２．５ｍＭ
ヒト上皮成長因子 １μｇ／ｍＬ
ＣＨＩＲ９９０２１ ３０μＭ
ヒトＲ－スポンジン－１ ８００ｎｇ／ｍＬ
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 １００ｎｇ／ｍＬ
ヒト肝細胞増殖因子 ５００ｎｇ／ｍＬ
Ａ８３－０１ ５μＭ
プロスタグランジンＥ２ １０μＭ
各成分を以下の濃度となるように水に溶解して、１０倍濃度の濃縮液を調製した。
Ｎ２サプリメント １０×濃度
Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンＡ １０×濃度
プリモシン １ｍｇ／ｍＬ
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン １２．５ｍＭ
ヒト上皮成長因子 １μｇ／ｍＬ
ＣＨＩＲ９９０２１ ３０μＭ
ヒトＲ－スポンジン－１ ８００ｎｇ／ｍＬ
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 １００ｎｇ／ｍＬ
ヒト肝細胞増殖因子 ５００ｎｇ／ｍＬ
Ａ８３－０１ ５μＭ
プロスタグランジンＥ２ １０μＭ
【0041】
［実施例１］胎盤様オルガノイドの製造
＜材料＞
基礎培地 Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ/Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）
培地サプリメント 製造例１で調製したもの
洗浄用培養液 ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク社製）
消化用培養液 ０．１７％コラゲナーゼＢ（ロシュ社製）
ＲＯＣＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２）（メルク社製、製品番号：ＳＣＭ０７５）
マトリゲル Ｃｏｒｎｉｎｇマトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社製）
セルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、容量：３ｍＬ、ポアサイズ：７０μｍもしくは１００μｍ）
＜材料＞
基礎培地 Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ/Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）
培地サプリメント 製造例１で調製したもの
洗浄用培養液 ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク社製）
消化用培養液 ０．１７％コラゲナーゼＢ（ロシュ社製）
ＲＯＣＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２）（メルク社製、製品番号：ＳＣＭ０７５）
マトリゲル Ｃｏｒｎｉｎｇマトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社製）
セルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、容量：３ｍＬ、ポアサイズ：７０μｍもしくは１００μｍ）
【0042】
＜手順＞
以下の手順でヒト絨毛細胞から胎盤様オルガノイドを製造した。
（１） 分娩等で得られたヒト絨毛細胞（約１ｇ）を細切した。
（２） 洗浄用培養液約１０ｍＬとともに１５ｍＬチューブへ入れた。
（３） 組織の自然沈下後に上清を除いた。
（４） 再度、洗浄用培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地）約１０ｍＬでピペッティングした。
（５） （３）を繰り返した。
（６） 消化用培養液４ｍＬ及び４μＬの１０ｍＭ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０００倍希釈）を添加した。
（７） ３７℃で３０分間振盪した。セルストレーナーで細胞塊を均一サイズに調整した。
（８） 組織の自然沈下後に上清を別の１５ｍＬチューブ（氷上）へ移した。
（９） 残ったペレットに対して（６）～（７）を繰り返した。
（１０） 全量を先ほどの氷上の１５ｍＬチューブへ混注した。
（１１） ４℃で５分間遠心（２００ｒｐｍした）。
（１２） 上清を捨て、ペレットをマトリゲル（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメントで膨潤）で包埋し２４ウェルのプレート上に１ウェルあたり６ドロップ程度（２０μＬ／ドロップ）播いた。
（１３）培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメント）を１ｍＬ／１ウェル添加した。
（１４）ＣＯ２インキュベーター（３７℃）に入れ培養を行った。
１ウェルあたりのマトリゲル組成：マトリゲル９０μＬ、培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメント）３０μＬ、１０ｍＭ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μＬ
以下の手順でヒト絨毛細胞から胎盤様オルガノイドを製造した。
（１） 分娩等で得られたヒト絨毛細胞（約１ｇ）を細切した。
（２） 洗浄用培養液約１０ｍＬとともに１５ｍＬチューブへ入れた。
（３） 組織の自然沈下後に上清を除いた。
（４） 再度、洗浄用培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地）約１０ｍＬでピペッティングした。
（５） （３）を繰り返した。
（６） 消化用培養液４ｍＬ及び４μＬの１０ｍＭ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０００倍希釈）を添加した。
（７） ３７℃で３０分間振盪した。セルストレーナーで細胞塊を均一サイズに調整した。
（８） 組織の自然沈下後に上清を別の１５ｍＬチューブ（氷上）へ移した。
（９） 残ったペレットに対して（６）～（７）を繰り返した。
（１０） 全量を先ほどの氷上の１５ｍＬチューブへ混注した。
（１１） ４℃で５分間遠心（２００ｒｐｍした）。
（１２） 上清を捨て、ペレットをマトリゲル（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメントで膨潤）で包埋し２４ウェルのプレート上に１ウェルあたり６ドロップ程度（２０μＬ／ドロップ）播いた。
（１３）培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメント）を１ｍＬ／１ウェル添加した。
（１４）ＣＯ２インキュベーター（３７℃）に入れ培養を行った。
１ウェルあたりのマトリゲル組成：マトリゲル９０μＬ、培養液（１×ダルベッコ改変イーグル培地＋培地サプリメント）３０μＬ、１０ｍＭ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μＬ
【0043】
【0044】
＜免疫染色＞
絨毛組織（妊娠９週）及び製造した胎盤様オルガノイドを、合胞体性栄養膜細胞選択的なＳｙｎｄｅｃａｎ、細胞性栄養膜細胞選択的なＩＴＧＡ６、及び核選択的なＤＡＰＩで染色し、撮影した。
図２に絨毛組織の蛍光観察像を、図３に製造した胎盤様オルガノイドの蛍光観察像を示す。
Ａ（左上）：Ｓｙｎｄｅｃａｎ染色
Ｂ（左下）：ＩＴＧＡ６染色
Ｃ（右上）：ＤＡＰＩ染色
Ｄ（右下）：全合成写真
絨毛組織（妊娠９週）及び製造した胎盤様オルガノイドを、合胞体性栄養膜細胞選択的なＳｙｎｄｅｃａｎ、細胞性栄養膜細胞選択的なＩＴＧＡ６、及び核選択的なＤＡＰＩで染色し、撮影した。
図２に絨毛組織の蛍光観察像を、図３に製造した胎盤様オルガノイドの蛍光観察像を示す。
Ａ（左上）：Ｓｙｎｄｅｃａｎ染色
Ｂ（左下）：ＩＴＧＡ６染色
Ｃ（右上）：ＤＡＰＩ染色
Ｄ（右下）：全合成写真
【0045】
＜ＦＡＣＳによる細胞分布の解析＞
ＦＡＣＳ解析により分画比を確認した。結果を図４、図５に示す。
図４のＡは全細胞、ＢはＩＴＧＡ６染色細胞を表す（５２．４４％）。
図５のＡは全細胞、ＢはＳｙｎｄｅｃａｎ染色細胞を表す（３９．０４％）。
ＦＡＣＳ解析により分画比を確認した。結果を図４、図５に示す。
図４のＡは全細胞、ＢはＩＴＧＡ６染色細胞を表す（５２．４４％）。
図５のＡは全細胞、ＢはＳｙｎｄｅｃａｎ染色細胞を表す（３９．０４％）。
【0046】
＜メタボローム解析＞
４８ウェルを用いて１つのマトリゲルに同濃度の製造した胎盤様オルガネを播き、低酸素下で時間依存性に上清中に分布される一次代謝産物をメタボローム解析した。時間は（０、１、３，６、２４時間）に上清２００ｕＬを採取して解析した。
図６に示すようにＯＰＬＳ－ＤＡ解析で時間ごとに明確にクラスター化して均一に増殖していた（Ｎ＝３）。
４８ウェルを用いて１つのマトリゲルに同濃度の製造した胎盤様オルガネを播き、低酸素下で時間依存性に上清中に分布される一次代謝産物をメタボローム解析した。時間は（０、１、３，６、２４時間）に上清２００ｕＬを採取して解析した。
図６に示すようにＯＰＬＳ－ＤＡ解析で時間ごとに明確にクラスター化して均一に増殖していた（Ｎ＝３）。
【産業上の利用可能性】
【0047】
本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法を用いて製造されるヒト胎盤モデルである胎盤様オルガノイド（ミニ胎盤）を使用することで、これまでほとんど解明できなかった生の組織として胎盤研究が飛躍的に進歩することが予想される。今後の強力な胎盤研究ツールの１つとなることが期待できる。具体的な応用例としてヒトにおいて妊娠時の胎盤のおける毒性検査、流産、早産の医学モデルによる病態解明、不妊症領域の受精卵の着床メカニズムの解明など医学的な進歩と病気治療のための創薬など多岐にわたって貢献できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】