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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024153570
(43)【公開日】2024-10-29
(54)【発明の名称】腫瘍を処置するための薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20241022BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241022BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241022BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241022BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241022BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20241022BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20241022BHJP
A61K 31/4035 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 Y
C07K16/28 ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/454
A61K47/68
A61K39/395 T
A61P43/00 121
A61K47/65
A61K47/60
A61K31/4035
A61K39/395 V
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024064306
(22)【出願日】2024-04-11
(31)【優先権主張番号】63/459,249
(32)【優先日】2023-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】517405987
【氏名又は名称】イミュンワーク インク．
【氏名又は名称原語表記】Ｉｍｍｕｎｗｏｒｋ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】朱▲シン▼懋
(72)【発明者】
【氏名】游▲約▼翔
(72)【発明者】
【氏名】田偉廷
(72)【発明者】
【氏名】張子文
(72)【発明者】
【氏名】林韋辰
(72)【発明者】
【氏名】程識軒
(57)【要約】 （修正有）
【課題】腫瘍を処置するための薬学的組成物を提供する。
【解決手段】薬学的組成物は分子構築物を備え、それは抗ＣＤ３８抗体及び抗ＣＤ３８抗体と結合された複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える。本開示の一部の実施形態によると、薬学的組成物の投与は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】薬学的組成物は分子構築物を備え、それは抗ＣＤ３８抗体及び抗ＣＤ３８抗体と結合された複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える。本開示の一部の実施形態によると、薬学的組成物の投与は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、抗ＣＤ３８抗体と、該抗ＣＤ３８抗体に結合される複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子と、を備える分子構築物を含み、前記薬学的組成物の投与が、前記腫瘍の処置のために単独で又は前記抗ＣＤ３８抗体との併用で使用される前記レナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１の前記レナリドミド分子又は前記加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する、薬学的組成物。
【請求項2】
前記レナリドミド分子又は前記加水分解レナリドミド分子の前記有効量は、前記腫瘍の処置のために単独で又は前記抗ＣＤ３８抗体との併用で使用される前記レナリドミド分子の前記有効量の約１００００分の１である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記薬学的組成物は、約０．１～１０ｍｇ／Ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記薬学的組成物は、４週間に１回投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記抗ＣＤ３８抗体は、
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントであって、リシン（Ｋ）及びシステイン（Ｃ）残基からなる群から独立して選択される複数の結合残基を備える一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、
を備え、
前記複数のレナリドミド分子は、それぞれ前記複数の結合残基に結合される、請求項１に記載の薬学的組成物。
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントであって、リシン（Ｋ）及びシステイン（Ｃ）残基からなる群から独立して選択される複数の結合残基を備える一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、
を備え、
前記複数のレナリドミド分子は、それぞれ前記複数の結合残基に結合される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記抗ＣＤ３８抗体は、
ＩｇＧの一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＣ末端にそれぞれ結合された一対の結合ペプチドであって、複数のＣ残基を備える一対の結合ペプチドと、
を備え、
前記複数のレナリドミド分子は、それぞれ前記一対の結合ペプチドの前記複数のＣ残基に結合される、請求項１に記載の薬学的組成物。
ＩｇＧの一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖと、
前記一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＣ末端にそれぞれ結合された一対の結合ペプチドであって、複数のＣ残基を備える一対の結合ペプチドと、
を備え、
前記複数のレナリドミド分子は、それぞれ前記一対の結合ペプチドの前記複数のＣ残基に結合される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記一対の結合ペプチドの各々は、「ＣＧＧＨＡ」（配列番号１）、「ＣＰＧＨＡ」（配列番号２）、「ＣＧＡＨＡ」（配列番号３）、「ＣＰＡＨＡ」（配列番号４）、「ＧＣＧＧＨＡ」（配列番号５）、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）又は「ＧＣＰＧＨＡ」（配列番号７）のアミノ酸配列を備える、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記一対の結合ペプチドの各々は、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）のアミノ酸配列を備える、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
前記分子構築物はリンカーユニットをさらに備え、該リンカーユニットは、
直線状である中心コアであって、
２～１０個のＫ残基と、
２個のＫ残基の間に独立して配置された少なくとも１つのフィラーと、
２つの末端を有する末端スペーサーであって、前記末端の一方が最初の前記Ｋ残基のＮ末端又は最後の前記Ｋ残基のＣ末端に結合され、前記末端の他方が前記抗ＣＤ３８抗体の前記結合ペプチドの前記Ｃ残基に結合される、末端スペーサーと、
を備え、
前記フィラー及び前記末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える、中心コアと、
２～１０個の結合アームであって、各結合アームの一端は前記中心コアの前記Ｋ残基のうちの１個に結合され、各結合アームの他端は各レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子に結合される、結合アームと、
を備える、請求項６に記載の薬学的組成物。
直線状である中心コアであって、
２～１０個のＫ残基と、
２個のＫ残基の間に独立して配置された少なくとも１つのフィラーと、
２つの末端を有する末端スペーサーであって、前記末端の一方が最初の前記Ｋ残基のＮ末端又は最後の前記Ｋ残基のＣ末端に結合され、前記末端の他方が前記抗ＣＤ３８抗体の前記結合ペプチドの前記Ｃ残基に結合される、末端スペーサーと、
を備え、
前記フィラー及び前記末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える、中心コアと、
２～１０個の結合アームであって、各結合アームの一端は前記中心コアの前記Ｋ残基のうちの１個に結合され、各結合アームの他端は各レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子に結合される、結合アームと、
を備える、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
前記末端スペーサーは、少なくとも３個の負電荷アミノ酸残基を備える、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
前記末端スペーサーは、「ＥＤＥＤＥＡＧＧ」（配列番号８）、「ＥＧＥＧＥＡＧＧ」（配列番号９）又は「ＥＧＥＧＥ」（配列番号１０）のアミノ酸配列を備える、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
前記中心コアは、「ＥＤＥＤＥＧＡＧＧＫＧＡＧＫＧＡＧＫＧ」（配列番号１１）のアミノ酸配列を備える、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
前記結合アームの各々は、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基、ＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又はそれらの組合せを備える、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
前記結合アームの各々は、前記Ｋ残基のε－アミノ基に結合される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項15】
前記腫瘍は、固形腫瘍又はびまん性腫瘍である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項16】
前記固形腫瘍が、黒色腫、食道癌、胃癌、脳腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌又は頭頸部扁平上皮癌である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項17】
前記びまん性腫瘍が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は多発性骨髄腫である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２３年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／４５９２４９号に関連しかつその利益を主張し、本出願の内容はその全体において参照によりここに取り込まれる。
本出願は、２０２３年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／４５９２４９号に関連しかつその利益を主張し、本出願の内容はその全体において参照によりここに取り込まれる。
【0002】
本開示は、概して、腫瘍処置の分野に関する。より詳細には、本開示は、抗ＣＤ３８抗体及び複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える分子構築物を使用することによる腫瘍を処置する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
骨髄腫又は形質細胞性骨髄腫としても知られている多発性骨髄腫（ＭＭ）は骨髄の癌の一種であり、癌性の形質細胞が骨髄に蓄積し、正常な血液細胞を押し出し、その結果、過剰なモノクローナルパラプロテイン（Ｍタンパク質；異常抗体）、骨の破壊及び他の造血細胞株の置換を引き起こす。癌性の形質細胞は体の様々な領域に影響を及ぼすため、多発性骨髄腫の症状及び徴候は患者によって大きく異なる。多発性骨髄腫に関連する一般的な症状及び徴候は、骨痛、骨折、脊髄圧迫、貧血、反復性感染症、高カルシウム血症、異常出血、血液過粘稠、疲労、腎障害及び神経障害を含む。
【0004】
ＲＶｄレジメン、すなわち、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））及びデキサメタゾンの併用は、多発性骨髄腫に対する一次処置として使用されることが多い。報告によると、骨髄腫患者の９０％超がこの処置によく反応する。しかしながら、この処置は単に患者の骨髄中の癌性細胞の数を減少させ、それによって多発性骨髄腫の症状を緩和するのみであり、根本的な疾患を治癒しない。さらに、併用レジメンにおける高用量のレナリドミド又は他の薬剤は、通常、重篤な悪影響（例えば、出血、呼吸困難又は努力性呼吸、血栓塞栓症、好中球減少、血小板減少症、発熱、けいれん、発作、不整脈、発語及び動作の問題並びに錯乱）を引き起こす。多発性骨髄腫患者のほとんどが高齢者（５０～７０歳）であるため、強い副作用が懸念される。
【0005】
上記に鑑みて、関連技術では、多発性骨髄腫を処置するための新規な方法へのニーズが存在する。
【発明の概要】
【0006】
以下では、読者に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は本開示の広範な概観ではなく、本発明の主要な／重要な要素を特定するものでも、本発明の範囲を境界付けるものでもない。その唯一の目的は、後で提示されるより詳細な説明の序章として、ここで開示される一部の概念を簡略化した形式で提示することである。
【0007】
ここで具体化されかつ広範に記載されるように、本開示の一態様は、被検体において腫瘍を処置する方法に向けられる。この方法は、抗ＣＤ３８抗体及び抗ＣＤ３８抗体に結合された複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える分子構築物を被検体に投与することを含む。
【0008】
本開示の一部の実施形態によると、分子構築物の投与が、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する。特定の好適な実施形態では、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の有効量は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の約１００００分の１である。
【0009】
好ましくは、分子構築物は、１回あたり約０．０１～１００ｍｇ／Ｋｇ体重；より好ましくは、１回あたり約０．１～１０ｍｇ／Ｋｇ体重の量で被検体に投与される。一部の好適な実施形態によると、分子構築物は、被検体に４週間ごとに１回投与される。
【0010】
特定の実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメント及び一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を備える。これらの実施形態において、一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントはリシン（Ｋ）残基及びシステイン（Ｃ）残基からなる群から独立して選択される複数の結合残基を備え、複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は複数の結合残基にそれぞれ結合される。
【0011】
代替の実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、ＩｇＧの一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメント、一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ及び一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＣ末端にそれぞれ結合された一対の結合ペプチドを備える。これらの実施形態では、一対の結合ペプチドは複数のＣ残基及びそれぞれ一対の結合ペプチドの複数のＣ残基に結合される複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える。
【0012】
好ましくは、抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドの各々は、「ＣＧＧＨＡ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（配列番号）１）、「ＣＰＧＨＡ」（配列番号２）、「ＣＧＡＨＡ」（配列番号３）、「ＣＰＡＨＡ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、「ＧＣＧＧＨＡ」（配列番号５）、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）又は「ＧＣＰＧＨＡ」（配列番号７）のアミノ酸配列を備える。例示的な一実施形態では、抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドの各々は、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）のアミノ酸配列を備える。
【0013】
一部の例示的な実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドの各々は、「ＣＧＧＨＡ」（配列番号１）、「ＣＰＧＨＡ」（配列番号２）、「ＣＧＡＨＡ」（配列番号３）、「ＣＰＡＨＡ」（配列番号４）、「ＧＣＧＧＨＡ」（配列番号５）、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）又は「ＧＣＰＧＨＡ」（配列番号７）のアミノ酸配列からなる。一具体例では、抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドの各々は、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）のアミノ酸配列からなる。
【0014】
任意選択的に、分子構築物は、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子及び結合ペプチドを結合するように構成されたリンカーユニットをさらに備える。その構造におけるリンカーユニットは中心コア及び複数の結合アームを備え、中心コアは２～１０個のＫ残基と、２個のＫ残基の間に独立して配置された少なくとも１個のフィラーと、２個の末端を有する末端スペーサーと、を備える。末端の一方は最初のＫ残基のＮ末端又は最後のＫ残基のＣ末端に結合され、末端の他方は抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。本開示の一部の任意選択的な実施形態によると、各結合アームの一方の末端は中心コアのＫ残基のうちの１個に結合され、各結合アームの他方の末端は各レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子に結合される。
【0015】
本開示の種々の実施形態によると、フィラー及び末端スペーサーの各々は、独立して、（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える。好ましくは、末端スペーサーは、少なくとも３個の負電荷アミノ酸残基を備える。一部の例示的な実施形態では、末端スペーサーは、「ＥＤＥＤＥＡＧＧ」（配列番号８）、「ＥＧＥＧＥＡＧＧ」（配列番号９）又は「ＥＧＥＧＥ」（配列番号１０）のアミノ酸配列を備える。一具体例によると、中心コアは、「ＥＤＥＤＥＧＡＧＧＫＧＡＧＫＧＡＧＫＧ」（配列番号１１）のアミノ酸配列を備える。
【0016】
結合アームは、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基、ＥＧユニットの２～２４個の反復を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又はそれらの組合せを備える。例示的な一実施形態では、結合アームは、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）ジペプチド及びＥＧユニットの３個の反復を有するＰＥＧ鎖を備える。
【0017】
特定の実施形態では、結合アームの各々は、Ｋ残基のε－アミノ基に結合される。
【0018】
本方法で処置可能な腫瘍は、固形腫瘍又はびまん性腫瘍であり得る。固形腫瘍の例は、黒色腫、食道癌、胃癌、脳腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、腎臓癌、肝細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌、頭頸部扁平上皮癌及びこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。例示的なびまん性腫瘍は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、リンパ球形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫）、多発性骨髄腫及びこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。本開示の一実施形態によると、腫瘍は、多発性骨髄腫である。
【0019】
本記載の付随する特徴及び有利な効果の多くは、添付図面と関連して考慮される以下の詳細な説明を参照することにより、より深く理解されるはずである。
【0020】
本記載は、添付図面に照らして読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図5B】図５Ｂは、本開示の実施例３に係る二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の非還元ラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析を示す。
【図8A】図８Ａは、本開示の実施例９に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルで処置されたＭＭ細胞からのレナリドミドの放出を示すＨＰＬＣの結果である。
【図8B(A)】図８Ｂは、本開示の実施例９に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルで処理されたＭＭ細胞からのレナリドミドの放出を示すＥＳＩ－ＭＳの結果である。図８Ｂ（Ａ）：ＭＭ細胞からの放出されたレナリドミドのＥＳＩ－ＭＳプロファイル。
【図8B(B)】図８Ｂは、本開示の実施例９に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルで処理されたＭＭ細胞からのレナリドミドの放出を示すＥＳＩ－ＭＳの結果である。図８Ｂ（Ｂ）：図８Ｂ（Ａ）で示されたＥＳＩ－ＭＳプロファイルのピーク（１）に対応する２つのレナリドミド代謝物及びレナリドミドのＥＳＩ－ＭＳの結果。
【図8B(C)】図８Ｂは、本開示の実施例９に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルで処理されたＭＭ細胞からのレナリドミドの放出を示すＥＳＩ－ＭＳの結果である。図８Ｂ（Ｃ）：図８Ｂ（Ａ）で示されたＥＳＩ－ＭＳプロファイルのピーク（２）に対応する２つのレナリドミド代謝物及びレナリドミドのＥＳＩ－ＭＳの結果。
【図8B(D)】図８Ｂは、本開示の実施例９に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルで処理されたＭＭ細胞からのレナリドミドの放出を示すＥＳＩ－ＭＳの結果である。図８Ｂ（Ｄ）：図８Ｂ（Ａ）で示されたＥＳＩ－ＭＳプロファイルのピーク（３）に対応する２つのレナリドミド代謝物及びレナリドミドのＥＳＩ－ＭＳの結果。
【図9】図９は、本発明の実施例１０に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）の結果を示す。
【図10】図１０は、本発明の実施例１３に係る二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（未結合）及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（安定化複合体）のヒトＣＤ３８発現細胞に対する結合親和性を示す酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果である。
【図11】図１１は、本開示の実施例１４に係る安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（安定化複合体）のＨ９２９及びＵ２６６－ＣＤ３８＋多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株に対する結合親和性を示すフローサイトメトリーの結果である。
【図12A】図１２Ａは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで５時間処置したＨ９２９細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12B】図１２Ｂは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで１日間処置したＨ９２９細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12C】図１２Ｃは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたラツムマブ又はレナリドミドで３日間処置したＨ９２９細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12D】図１２Ｄは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで５日間処置したＨ９２９細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12E】図１２Ｅは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体、抗ＣＤ３８ｍＡｂ、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで５日間処置したＭＭ．１Ｓ細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12F】図１２Ｆは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体、抗ＣＤ３８ｍＡｂ、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで５日間処置したＵ２６６－ＣＤ３８－細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図12G】図１２Ｇは、本開示の実施例１６に係る指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。安定化複合体、抗ＣＤ３８ｍＡｂ、ダラツムマブ、レナリドミドと併用されたダラツムマブ又はレナリドミドで５日間処置したＤａｕｄｉ細胞の細胞生存パーセント（％）を示す。
【図13】図１３は、本開示の実施例１８に係るヒト血漿中で指定薬剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を示し、ダラツムマブ、未結合（すなわち、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質）及び結合Ａｂ（安定化）（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）をそれぞれヒト血漿に溶解し、３７℃で７日間、１４日間、２１日間及び２８日間インキュベートし、続いて、安定化ＡＤＣ（総Ａｂ）：ＨＲＰ－結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体で検出された生成物、安定化ＡＤＣ（結合Ａｂ）：抗レナリドミドバンドル抗体及び抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体で検出された生成物についてＥＬＩＳＡ分析した。
【図14】図１４は、本開示の実施例２０に係る異種移植腫瘍モデルにおける指定処置の抗腫瘍効果を示し、担腫瘍マウス（腫瘍の平均サイズは１１５±１５ｍｍ３）はそれぞれ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：コントロール群としての役割を果たす）、安定化複合体（すなわち、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）及びダラツムマブ（Ｄａｒａ）を投与された。
【発明を実施するための形態】
【0022】
一般的な慣行に従って、記載された種々の特徴／要素は縮尺通りに描かれていないが、代わりに、本発明に関連する特定の特徴／要素を最もよく説明するように描かれている。また、種々の図面における符号及び指定は、要素／部分を示すために使用される。
【0023】
添付図面に関連して以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、本実施例の機能及び本実施例を構成して動作させるためのステップの順序を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び順序が、異なる実施例によって実現され得る。
【0024】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において採用される特定の用語をここにまとめる。ここに特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般に理解及び使用される意味を有するものである。また、文脈上特に要件とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つ」及び「１以上」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において採用される特定の用語をここにまとめる。ここに特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般に理解及び使用される意味を有するものである。また、文脈上特に要件とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つ」及び「１以上」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
【0025】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用するように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。運用／実施例以外においても、又は明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変わり得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効桁数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【0026】
本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」は、最も広義の意味として用いられ、完全にアセンブルされた抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ／Ｆａｂ´）、（ジスルフィド結合によって相互に結合された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を有する）Ｆ（ａｂ´）２フラグメント、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性一本鎖可変フラグメント（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、ナノボディ（単一ドメイン抗体ｓｄＡｂともいう）、ユニボディ及びダイアボディなど、抗原と結合する抗体フラグメントを包含する。「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域又は可変領域を備える。抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）由来の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端又はＣ末端に融合された一対のｓｃＦｖを備え得る。通常、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされた１以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。周知の免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それは同様に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。標準的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは四量体を備えることが知られ、それはポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ端末は、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれそれらの軽鎖及び重鎖をいう。本開示の一部の実施形態によると、抗体フラグメントは、天然抗体を修飾することによって又は組換えＤＮＡ法を用いるデノボ合成によって生成可能である。本開示の特定の実施形態では、抗体は二重特異性であってもよいし、種々の構成のものであってもよい。例えば、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を備え得る。種々の実施形態において、二重特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術によって生成可能である。
【0027】
ここで使用するように、用語「結合する（ｌｉｎｋ）」、「結合する（ｃｏｕｐｌｅ）」及び「結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、２つの構成要素間の直接の結合又は間接的結合のいずれかを介して２つの構成要素を接続する任意の手段を互換可能に指すのに使用される。
【0028】
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するポリマーを互換可能に指すのに用いられる。通常、ポリペプチドは２～約２００個の残基長を範囲とするアミノ酸残基を備え、それでも、それは２００個よりも多いアミノ酸残基を有する高分子も包含する。アミノ酸配列がここに与えられる場合、その配列のＬ－、Ｄ－又はベータアミノ酸バージョンも考慮される。ポリペプチドは、１以上のアミノ酸残基が対応の天然に存在するアミノ酸及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに対する人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含む。さらに、当該用語は、ペプチド結合によって、又は例えば、ペプチド結合がαエステル、βエステル、チオアミド、ホスホルアミド、カルボメート、ハイドロキシレートなどによって置換される他の「修飾結合」によって接合されたアミノ酸にも当てはまる。
【0029】
ここで使用するように、用語「フラグメント結晶化可能領域」又は「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ受容体といわれる細胞表面受容体及び／又は補体系の一部のタンパク質と相互作用する免疫グロブリンの尾部領域を指す。構造において、Ｆｃ領域は、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくともヒンジ領域（ＣＨ１及びＣＨ２ドメインを結合する重鎖の短い配列）、ＣＨ２ドメイン（重鎖の第２の定常ドメイン）及びＣＨ３ドメイン（重鎖の第３の定常ドメイン）を備える。ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、例えば、パパインによるＩｇＧ１抗体の消化によって生成され得る。
【0030】
ここで同定されるアミノ酸配列に関する「パーセンテージ（％）配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を得るように必要に応じて配列をアラインしてギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定参照配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセンテージ配列同一性を判定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを特定することができる。ここでの目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ）によって実行された。対象配列Ｂに対する所与の配列Ａのパーセンテージ配列同一性（あるいは、所与の配列Ｂに対して所定％の配列同一性を有する所与の配列Ａということもできる）は、以下の式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００％
なお、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる同一の一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、対象配列Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。
Ｘ／Ｙ×１００％
なお、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる同一の一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、対象配列Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。
【0031】
特定の実施形態では、ここに記載される配列のいずれかを備えるアミノ酸の保存的な置換が考慮される。種々の実施形態では、１、２、３、４又は５個の異なる残基が置換される。用語「保存的な置換」は、分子の活性（例えば、生物学的又は機能的な活性及び／又は特異性）を実質的に変更しないアミノ酸置換を反映するのに使用される。通常、保存的なアミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水度）を有する他のアミノ酸に置換することを伴う。ある保存的な置換は、親残基から最小限に異なる非標準（例えば、希少性、合成など）のアミノ酸によって標準アミノ酸が置換される「類似置換」を含む。アミノ酸類似体は、親構造に対する大きな変化なく標準アミノ酸に合成的に由来するものであり、異性体であり、又は代謝物質前駆体である。本出願では、アミノ酸残基の（１）その側鎖にアミン基を含むリシン、（２）その側鎖にチオール基を含むシステイン、（３）それらの側鎖にヒドロキシル基を含むセリン及びスレオニン、並びに（４）それらの側鎖にカルボキシル基を含むアスパラギン酸及びグルタミン酸が、アミノ酸の特徴的な４基とみなされる。アミノ酸のこれらの４基の各々は、それらの側鎖において、種々の化学成分に結合するために応用され得る固有の官能基を含む。側鎖に同じ官能基を含む非天然アミノ酸が、同様の目的のために置換されてもよい。
【0032】
特定の実施形態では、ここに記載する配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％の配列同一性を備えるポリペプチドも考慮される。
【0033】
ここで使用する用語「ＰＥＧ化アミノ酸」は、１つのアミノ基及び１つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖をいう。本開示の実施形態によると、ＰＥＧ化アミノ酸は、ＮＨ２－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＯ２Ｈの式を有する。本開示では、ｎの値は、１～２０の範囲であり、好ましくは２～１２の範囲である。
【0034】
ここで使用するように、ポリペプチドに関する用語「末端」とは、ポリペプチドのＮ端又はＣ端におけるアミノ酸残基のことをいう。ポリマーに関しては、用語「末端」とは、ポリマー骨格の端部に位置するポリマー（例えば、本開示のポリエチレングリコール）の構成ユニットのことをいう。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「遊離末端」は、末端アミノ酸残基又は構成ユニットが他のいずれの分子にも化学結合されていないことを意味するのに使用される。
【0035】
用語「適用」及び「投与」は、ここでは、その処置を必要とする被検体への本発明の分子構築物の適用を意味するのに互換可能に使用される。
【0036】
ここで使用する用語「処置／治療／処理する」、「処置／治療／処理している」又は「処置／治療／処理」は、予防的（例えば、予防の）治癒的又は緩和的な処置／治療／処理を含む。特に、ここで使用する用語「処置／治療／処理する」、「処置／治療／処理している」又は「処置／治療／処理」は、上記特定の疾患、障害及び／又は病状の１以上の症状又は特徴の部分的若しくは完全な軽減、改善、解放、発症の遅延、進行の阻害、重症度の低減及び／若しくは発症率の低減を目的で、医学的状態（例えば、癌）、医学的状態に関連する症状、医学的状態に対して二次的な疾患若しくは障害、又は医学的状態に対する素質を有する被検体への本分子構築物の適用又は投与をいう。処置／治療／処理は、疾患、障害及び／若しくは病状に関連する進展する病理のリスクを減少させる目的のために、疾患、障害及び／若しくは病状の兆候を示さない被検体、又は疾患、障害及び／又は病状の早期の兆候のみを示す被検体に施され得る。処置／治療／処理は、一般に、当該用語がここに定義されるように１以上の症状又は臨床的マーカーが低減される場合に「有効」である。あるいは、処置／治療／処理は、症状、障害又は病状が軽減又は停止される場合に「有効」である。
【0037】
ここで使用する用語「有効量」とは、所望の治療応答を得るのに充分な量の本分子構築物をいう。薬剤の有効量は、疾患又は病状を治癒するのに必要ではないが、疾患若しくは病状の発症が遅延、阻害若しくは予防され又は疾患若しくは病状が改善されるように疾患又は病状に対する処置を与える。有効量は、指定期間全体にわたって１回、２回又はそれ以上で投与される適切な形態の１回、２回又はそれ以上の用量に分割されてもよい。具体的な有効量又は充分な量は、処置されている特定の病状、患者の体調（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置されている被検体の種類、処置期間、（もしあれば）併用療法の性質、並びに化合物又はその誘導体の採用される具体的な配合及び構造のような要因によって変化する。有効量は、例えば、活性成分の総量（例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム）又は体重に対する活性成分の質量の比、例えば、キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）又はキログラムあたりのナノモル（ｎｍｏｌ／ｋｇ）として表現され得る。当業者であれば、動物モデルから決定される用量に基づいて（本分子構築物のような）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算し得る。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」と題された工業用ガイダンスに従うことができる。
【0038】
ここで使用する用語「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかにかかわらず、全ての腫瘍性細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織をいう。本明細書及び特許請求の範囲では、用語「腫瘍」は、固形腫瘍及びびまん性腫瘍を含む。
【0039】
ここで使用する用語「固形腫瘍」は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織の塊を示す。様々な種類の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の種類について命名されている。固形腫瘍の例は、これらに限定されないが、肉腫及び癌腫を含む。一般に、「肉腫」は、骨又は筋肉などの結合又は支持組織から発生する癌である。「癌腫」は、身体組織を覆う腺細胞及び上皮細胞から発生する癌である。
【0040】
ここで使用する用語「びまん性腫瘍」は、造血（血液形成）細胞から形成されて血液、骨髄又はリンパ節に影響を与える白血病及び／又は血液悪性腫瘍をいう。びまん性腫瘍の例は、これらに限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び骨髄腫を含む。
【0041】
ここで使用する用語「被検体」は、本発明の分子構築物及び／又は方法によって処置可能なヒト種を含む動物をいう。用語「被検体」は、一方の性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方の性別をいうものとする。したがって、用語「被検体」は、本開示の処置方法から利益を受け得る任意の哺乳動物を含む。「被検体」の例は、これらに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽を含む。例示的な実施形態では、被検体はヒトである。
【0042】
ＩＩ．本発明の説明
従来の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）構築物では、抗体は約１５００００ダルトンの分子量の非常に大きな高分子であり、薬物分子（ペイロード）は数百ダルトンの範囲内の分子量の小さな化合物である。ＡＤＣの標準的な投与量は、１００ｍｇ～数百ｍｇの範囲内である。したがって、細胞毒性若しくは免疫調節活性又は腫瘍に対する他の種類の効果を媒介するものを示すＡＤＣの構成に対する抗体との併用のために適用可能となる治療薬について、薬剤の効能はナノモル以下の範囲のＩＣ５０を有して非常に高くなければならない（例えば、Ｄａｖｉｄ Ｄａｈｌｇｒｅｎ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａ Ｄｒｕｇ－Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０２０）、２５、２８６１；又はＡｌａｉｎ Ｂｅｃｋ他、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）、１６：３１５－３３７参照）。例えば、微小管破壊剤（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＤＭ－１）及びエリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ））、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）及びＳＮ３８）及びＤＮＡ合成阻害剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）及びその誘導体）は、ナノモル以下の範囲において、すなわち、ナノモル以下の範囲のＥＣ５０で標的細胞に対して致死的な影響を及ぼす。サリドマイド類似体であるレナリドミドは、通常は他の薬剤との併用で、複数の疾患適応症、最も顕著には多発性骨髄腫において、臨床的に使用される薬剤である。これは、処置中のほとんどの日に１日あたり２０～４０ｍｇの投与量において経口的に摂取される。種々の研究では、レナリドミドは、３μＭ～３０μＭの範囲内のＥＣ５０を有することが分かっている（例えば、Ａ Ｌｏｐｅｚ－Ｇｉｒｏｎａ他、Ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ；Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１２）、２６：２３２６－２３３５参照）。そのため、レナリドミドがＡＤＣ構築物における治療薬として採用されるのには適さないことはよく知られている。
従来の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）構築物では、抗体は約１５００００ダルトンの分子量の非常に大きな高分子であり、薬物分子（ペイロード）は数百ダルトンの範囲内の分子量の小さな化合物である。ＡＤＣの標準的な投与量は、１００ｍｇ～数百ｍｇの範囲内である。したがって、細胞毒性若しくは免疫調節活性又は腫瘍に対する他の種類の効果を媒介するものを示すＡＤＣの構成に対する抗体との併用のために適用可能となる治療薬について、薬剤の効能はナノモル以下の範囲のＩＣ５０を有して非常に高くなければならない（例えば、Ｄａｖｉｄ Ｄａｈｌｇｒｅｎ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａ Ｄｒｕｇ－Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０２０）、２５、２８６１；又はＡｌａｉｎ Ｂｅｃｋ他、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）、１６：３１５－３３７参照）。例えば、微小管破壊剤（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＤＭ－１）及びエリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ））、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）及びＳＮ３８）及びＤＮＡ合成阻害剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）及びその誘導体）は、ナノモル以下の範囲において、すなわち、ナノモル以下の範囲のＥＣ５０で標的細胞に対して致死的な影響を及ぼす。サリドマイド類似体であるレナリドミドは、通常は他の薬剤との併用で、複数の疾患適応症、最も顕著には多発性骨髄腫において、臨床的に使用される薬剤である。これは、処置中のほとんどの日に１日あたり２０～４０ｍｇの投与量において経口的に摂取される。種々の研究では、レナリドミドは、３μＭ～３０μＭの範囲内のＥＣ５０を有することが分かっている（例えば、Ａ Ｌｏｐｅｚ－Ｇｉｒｏｎａ他、Ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ；Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１２）、２６：２３２６－２３３５参照）。そのため、レナリドミドがＡＤＣ構築物における治療薬として採用されるのには適さないことはよく知られている。
【0043】
本開示は、結合薬剤としてレナリドミドを採用するＡＤＣ構築物が腫瘍成長を減少させ又は排除することに対する治療効果を示すという発見に少なくともある程度基づく。本開示の実施形態によると、レナリドミド分子への抗ＣＤ３８抗体の結合は、２８日周期を伴う標準的なレナリドミド処置スケジュールと比較して、腫瘍（例えば、多発性骨髄腫）に対するレナリドミド分子の治療効果を大幅に向上する。当該２８日周期中、レナリドミド分子は、疾患の進行又は許容できない毒性のいずれかが起こるまで毎日投与され、単回用量の併用処置（すなわち、抗ＣＤ３８抗体及びレナリドミド分子のバイオコンジュゲート）は、被検体の腫瘍成長を抑制することについて満足のいく効果を与え、それはレナリドミド分子の繰り返しの投与を回避してその悪影響を大きく減少させる。
【0044】
したがって、本開示は、被検体の腫瘍を処置する方法を提供する。方法は、抗ＣＤ３８抗体、及び抗ＣＤ３８抗体に結合された複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える分子構築物を被検体に投与することを含む。
【0045】
本開示の一部の実施形態によると、分子構築物は、抗ＣＤ３８抗体に結合された複数のレナリドミド分子を備える。これらの実施形態では、分子構築物の投与は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で（すなわち、レナリドミド分子及び抗ＣＤ３８抗体が別個に被検体に投与される併用処置で）使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１のレナリドミド分子の有効量を実現する。例えば、レナリドミド分子の有効量は、治療目的を達成するために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００又はそれ以上分の１であり得る。一部の好適な実施形態によると、レナリドミド分子の有効量は、単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の約１００００分の１である。例示的な一実施形態では、レナリドミド分子の有効量は、単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の約１０６４０分の１である。
【0046】
本開示の一部の実施形態によると、分子構築物は、抗ＣＤ３８抗体に結合された複数の加水分解レナリドミド分子を備える。これらの実施形態では、分子構築物の投与は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１の加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する。例えば、加水分解レナリドミド分子の有効量は、治療目的を達成するために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００又はそれ以上分の１であり得る。一部の好適な実施形態によると、加水分解レナリドミド分子の有効量は、単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の約１００００分の１である。例示的な一実施形態では、加水分解レナリドミド分子の有効量は、単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の約１０６４０分の１である。
【0047】
一部の実施形態によると、レナリドミド分子は、
の構造を有し、加水分解レナリドミド分子は、
の構造を有する。
【化1】
【化2】
【0048】
特定の実施形態によると、被検体はマウスである。これらの実施形態では、分子構築物は、１用量につき体重あたり約１ｎｍｏｌ／Ｋｇ～１０００ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約０．１２ｍｇ／Ｋｇ～１２０ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与される。例えば、本分子構築物は、治療目的を達成するために、１用量につき体重あたり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ｎｍｏｌ／Ｋｇ（あるいは、約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０又は１２０ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与され得る。好ましくは、分子構築物は、１用量につき体重あたり約１ｎｍｏｌ／Ｋｇ～１００ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約０．１２ｍｇ／Ｋｇ～１２ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与される。より好ましくは、分子構築物は、１用量につき体重あたり約１０ｎｍｏｌ／Ｋｇ～５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約１．２ｍｇ／Ｋｇ～６ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与される。一部の例示的な実施形態では、１用量につき体重あたり約２０ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約２．３ｍｇ／Ｋｇ～２．４ｍｇ／Ｋｇ）の本分子構築物は、被検体における腫瘍成長を充分に阻害する。
【0049】
熟練者は、本出願の有効な実施例において与えられる動物での検討から決定された用量に基づいて本分子構築物のヒト等価用量（ＨＥＤ）を容易に決定し得る。したがって、ヒト被検体での使用に適した本分子構築物の有効量は、１用量につき体重あたり約０．０８ｎｍｏｌ／Ｋｇ～１００ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約０．０１ｍｇ／Ｋｇ～１２ｍｇ／Ｋｇ）の範囲、例えば、１用量につき体重あたり約０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ｎｍｏｌ／Ｋｇ（あるいは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９又は１２ｍｇ／Ｋｇ）となり得る。好ましくは、分子構築物は、１用量につき体重あたり約０．８ｎｍｏｌ／Ｋｇ～８３ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約０．１ｍｇ／Ｋｇ～１０ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与される。より好ましくは、分子構築物は、１用量につき体重あたり約０．８ｎｍｏｌ／Ｋｇ～３３ｎｍｏｌ／Ｋｇ（約０．１ｍｇ／Ｋｇ～４ｍｇ／Ｋｇ）の量で投与される。用量は、単一アリコート、あるいは２以上のアリコートで投与され得る。熟練者又は臨床医は、患者の体調又は疾患の重症度に応じて投与量又はレジームを調整し得る。
【0050】
好ましくは、分子構築物は、４週間に１回被検体に投与される。特定の例では、分子構築物は、所望の治療効果が達成されるまで、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回又はそれ以上の回数）にわたって４週間の間隔で被検体に投与される。理解できるように、熟練者は、患者の体調又は疾患の重症度に応じて投与量又はレジームを調整し得る。
【0051】
本開示の特定の実施形態によると、分子構築物は、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の形態であり、これは、当技術では周知であるように、通常は治療薬（例えば、細胞毒性剤）に共有結合的に付着したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）からなる。具体的には、実施形態では、分子構築物の抗ＣＤ３８抗体は、従来的な構造を有し、すなわち、一対の重鎖及び一対の軽鎖を備え、各重鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、重鎖可変（ＨＶ）ドメイン、ＣＨ１ドメイン（重鎖の第１の定常ドメイン）、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン（重鎖の第２の定常ドメイン）及びＣＨ３ドメイン（重鎖の第３の定常ドメイン）を備え、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及びＣＬドメイン（軽鎖の定常ドメイン）を備える。抗ＣＤ３８抗体は、その定常ドメインに、好ましくはＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（すなわち、ＣＨ２－ＣＨ３セグメント）に複数の結合残基を備え、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は抗ＣＤ３８抗体の結合残基にそれぞれ結合される。結合残基は、Ｋ及びＣ残基からなる群から独立して選択される。一実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、そのＣＨ２－ＣＨ３セグメントにおいて複数のＫ残基を備える。この場合、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は、それとアミド結合を形成することによってＫ残基にそれぞれ結合される。他の実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、そのＣＨ２－ＣＨ３セグメントにおいて複数のＣ残基を備える。この場合、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は、Ｃ残基のスルフヒドリル（ＳＨ）基と反応することによってＣ残基にそれぞれ結合される。
【0052】
ここで、本開示の一部の実施形態に係る分子構築物１０を示す模式図である図１Ａを参照する。図示するように、分子構築物１０の抗ＣＤ３８抗体は、上述したように一対の重鎖１１０ａ、１１０ｂ（ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを備える各重鎖１１０ａ、１１０ｂ）及び一対の軽鎖１２０ａ、１２０ｂ（各軽鎖１２０ａ、１２０ｂはＶＬドメイン及びＣＬドメインを備える）を備え、４個の結合残基（図１Ａの星印１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄ）はＣＨ２及びＣＨ３ドメインにそれぞれ配置される。したがって、４個の治療薬Ｔ（すなわち、４個のレナリドミド分子又は４個の加水分解レナリドミド分子）が、結合残基１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ、１３０ｄを介して抗ＣＤ３８抗体にそれぞれ結合される。
【0053】
意図する目的に応じて、レナリドミド分子及び加水分解レナリドミド分子の各々が、リンカーの存在下又は不存在下において結合残基に結合され得る。好ましくは、レナリドミド分子及び加水分解レナリドミド分子の各々は、リンカー、例えば、開裂性リンカー又は非開裂性リンカーを介して結合残基に結合される。例示的な開裂性リンカーは、これらに限定されないが、プロテアーゼ感受性リンカー（例えば、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、バリン－リシンジペプチド、バリン－アルギニンジペプチド及びグルタミン酸－バリン－シトルリントリペプチド）、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー、エステルリンカー及びアミドリンカー）及びグルタチオン感受性リンカー（例えば、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）及びＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ））を含む。非開裂性リンカーの非限定的な例は、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＭＣＣ）及びスクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を含む。あるいは、リンカーは、免疫複合体における２つの機能性モチーフを接続する（例えば、抗体及びＡＤＣのペイロードを接続する）ことが当技術分野で知られているリンカーであり得る。熟練者は、意図する目的に応じて本分子構築物を生成するための適切なリンカーを選択し得る。一部の例示的な実施形態によると、本抗ＣＤ３８抗体及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子を接続するリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖及びＰＥＧ鎖に接続されたプロテアーゼ感受性リンカーを備える。好ましくは、ＰＥＧ鎖は、ＥＧユニットの１～１０個の反復を有する。具体的な一実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ鎖及びＰＥＧ鎖に接続されたバリン－アラニンジペプチドを備え、ＰＥＧ鎖はＥＧユニットの３個の反復を有する。
【0054】
本開示の一部の実施形態によると、分子構築物はｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質の形態であり、それは免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のＦｃ領域に融合されたｓｃＦｖを備える。これらの実施形態では、分子構築物の抗ＣＤ３８抗体は、免疫グロブリンの一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメント、及びヒンジドメインを介して一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを備える。抗ＣＤ３８抗体はＣＨ２－ＣＨ３セグメントに複数の結合残基を備え、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は抗ＣＤ３８抗体の結合残基にそれぞれ結合される。結合残基は、Ｋ及びＣ残基からなる群から独立して選択される。一実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、そのＣＨ２－ＣＨ３セグメントに複数のＫ残基を備える。この場合、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は、それとのアミド結合を形成することによってＫ残基にそれぞれ結合される。他の実施形態によると、抗ＣＤ３８抗体は、そのＣＨ２－ＣＨ３セグメントに複数のＣ残基を備える。この場合、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は、Ｃ残基のＳＨ基と反応することによってＣ残基にそれぞれ結合される。上述したように、各レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子は、好ましくは、リンカー、例えば、開裂性リンカー又は非開裂性リンカーを介して結合残基に結合される。
【0055】
図１Ｂは、本開示の一部の実施形態に係る分子構築物２０の模式図を与える。構造において、分子構築物２０の抗ＣＤ３８抗体は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン２２０ａ、２２０ｂ、一対のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン２２０ａ、２２０ｂのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ２１０ａ、２１０ｂを備え、６個の結合残基（図１Ｂの星印２３０ａ、２３０ｂ、２３０ｃ、２３０ｄ、２３０ｅ、２３０ｆ）がＣＨ２及びＣＨ３ドメイン２２０ａ、２２０ｂにそれぞれ配置される。したがって、６個の治療薬Ｔ（すなわち、６個のレナリドミド分子又は６個の加水分解レナリドミド分子）が、結合残基２３０ａ、２３０ｂ、２３０ｃ、２３０ｄ、２３０ｅ、２３０ｆを介して抗ＣＤ３８抗体にそれぞれ結合される。
【0056】
理解できるように（ＡＤＣ又はｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質の形態の）本分子構築物に担持されるレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の数は、抗ＣＤ３８抗体のＣＨ２－ＣＨ３セグメントからなる結合残基の数に応じる。したがって、熟練者は、必要に応じて結合残基の数を調整して治療効能を最適化し得る。
【0057】
本開示の代替の実施形態によると、分子構築物は、薬剤バンドルの形態である。これらの実施形態では、分子構築物は抗ＣＤ３８抗体及び抗ＣＤ３８抗体に結合された少なくとも１つのリンカーユニットを備え、各リンカーユニットは複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を担持する。具体的には、抗ＣＤ３８抗体は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメント、ヒンジドメインを介して一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、及び一対のＣＨ２－ＣＨ３セグメントのＣ末端にそれぞれ結合された一対の結合ペプチドを備える。一対の結合ペプチドは複数のＣ残基を備え、少なくとも１つのリンカーユニットは結合ペプチドのＣ残基を介して抗ＣＤ３８抗体に結合される。一部の好適な実施形態によると、一対の結合ペプチドの各々は、「ＣＧＧＨＡ」（配列番号１）、「ＣＰＧＨＡ」（配列番号２）、「ＣＧＡＨＡ」（配列番号３）、「ＣＰＡＨＡ」（配列番号４）、「ＧＣＧＧＨＡ」（配列番号５）、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）又は「ＧＣＰＧＨＡ」（配列番号７）のアミノ酸配列を備える。具体的な一実施形態では、結合ペプチドの各々は、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）のアミノ酸配列を備える。特定の例示的な実施形態によると、一対の結合ペプチドの各々は、「ＣＧＧＨＡ」（配列番号１）、「ＣＰＧＨＡ」（配列番号２）、「ＣＧＡＨＡ」（配列番号３）、「ＣＰＡＨＡ」（配列番号４）、「ＧＣＧＧＨＡ」（配列番号５）、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）又は「ＧＣＰＧＨＡ」（配列番号７）のアミノ酸配列からなる。例示的な一実施形態では、結合ペプチドの各々は、「ＡＣＰＧＨＡ」（配列番号６）のアミノ酸配列からなる。
【0058】
ここで、本開示の特定の実施形態に係る分子構築物３０の模式図を示す図１Ｃを参照する。図示するように、分子構築物３０の抗ＣＤ３８抗体は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の一対のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン３２０ａ、３２０ｂ、一対のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン３２０ａ、３２０ｂのＮ末端にそれぞれ結合された一対の抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ３１０ａ、３１０ｂ、及び一対のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン３２０ａ、３２０ｂのＣ末端にそれぞれ結合された一対の結合ペプチド３３０ａ、３３０ｂを備え、結合ペプチド３３０ａ、３３０ｂの各々はＣ残基を備える。この場合、２つのリンカーユニット３４０ａ、３４０ｂは、抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチド３３０ａ、３３０ｂのＣ残基にそれぞれ結合される。
【0059】
理解できるように、抗ＣＤ３８抗体に結合されたリンカーユニットの数は、結合ペプチドからなるＣ残基の数に応じる。例えば、結合ペプチドの各々が２個のＣ残基を備える場合には、４個のリンカーユニットが抗ＣＤ３８抗体に結合され得る。熟練者は、実際の用途に応じて結合ペプチドのＣ残基の数を調整し得る。
【0060】
本開示の一部の実施形態によると、リンカーユニットは、中心コア及びその中心コアに結合された複数の結合アームを備える。中心コアは、直線状であるポリペプチドであり、２～１０個のＫ残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＫ残基）及び末端スペーサーを備える。結合アームは中心コアのＫ残基にそれぞれ結合され、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は結合アームの遊離末端（すなわち、いずれの分子にも化学的に結合されていない末端）にそれぞれ結合される。
【0061】
一部の例示的な実施形態によると、「天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル」として指定される分子構築物は、抗ＣＤ３８抗体の一対の結合ペプチド（各結合ペプチドは「ＡＣＰＧＨＡ」のアミノ酸配列（配列番号６、Ｚｎ２＋－結合モチーフ、及びそれに従って本開示では「ＢＭ」として指定される）を有する）にそれぞれ結合された２個のリンカーユニットを備え、各リンカーユニットは結合アームを介して３個のレナリドミド分子を担持し、結果として抗ＣＤ３８抗体のＣ末端において薬剤バンドルを形成する。一部の例示的な実施形態によると、「安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル」として指定される分子構築物は、抗ＣＤ３８抗体の一対の結合ペプチド（各結合ペプチドは「ＡＣＰＧＨＡ」のアミノ酸配列（配列番号６）を有する）にそれぞれ結合された２個のリンカーユニットを備え、各リンカーユニットは結合アームを介して３個の加水分解レナリドミド分子を担持し、結果として抗ＣＤ３８抗体のＣ末端において薬剤バンドルを形成する。一実施形態では、加水分解レナリドミド分子は、
の構造を有する。他の実施形態では、加水分解レナリドミド分子は、
の構造を有する。
【化3】
【化4】
【0062】
リンカーユニットは、末端スペーサーを介して抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。本開示の種々の実施形態によると、末端スペーサーは、Ｎ末端スペーサー又はＣ末端スペーサーであり得る。一部の実施形態では、末端スペーサーは、２つの末端（すなわち、第１の末端及び第２の末端）を有するＮ末端スペーサーであり、当該末端の一方は中心コアの（中心コアのＮ末端から開始する）第１のＫ残基のＮ末端に結合され、当該末端の他方は抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。一部の例示的な実施形態によると、Ｎ末端スペーサーは、第１の末端にＣＯ２Ｈ基を有し、第２の末端にＳＨ反応基（例えば、マレイミド基、スルホン基、ハロアセチル基又はピリジルジスルフィド基）を有する。この場合、末端スペーサーの第１の末端は、Ｎ末端スペーサーのＣＯ２Ｈ基と第１のＫ残基のＮＨ２基との間のアミド結合を形成することによって第１のＫ残基のＮ末端に結合され、末端スペーサーの第２の末端は、Ｃ末端スペーサーのＳＨ反応基とＣ残基のＳＨ基との間に発生するチオール－マレイミド反応よって抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。
【0063】
一部の実施形態では、末端スペーサーは２つの末端（すなわち、第１の末端及び第２の末端）を有するＣ末端スペーサーであり、当該末端の一方は中心コアの（中心コアのＮ末端から開始する）最後のＫ残基のＣ末端に結合され、当該末端の他方は抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。一部の例示的な実施形態によると、Ｃ末端スペーサーは、第１の末端にＮＨ２基を有し、第２の末端にＳＨ反応基（例えば、マレイミド基、スルホン基、ハロアセチル基又はピリジルジスルフィド基）を有する。この場合、末端スペーサーの第１の末端は、Ｃ末端スペーサーのＮＨ２基と最後のＫ残基のＣＯ２Ｈ基との間のアミド結合を形成することによって最後のＫ残基のＣ末端に結合され、末端スペーサーの第２の末端は、Ｎ末端スペーサーのＳＨ反応基とＣ残基のＳＨ基との間に発生するチオール－マレイミド反応よって抗ＣＤ３８抗体の結合ペプチドのＣ残基に結合される。
【0064】
本開示の特定の実施形態によると、中心コアは３～１２０アミノ酸残基長を有し、少なくとも２つのリシン（Ｋ）残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のＫ残基）をそのアミノ酸配列に含み、Ｋ残基のいずれか２つが相互に隣接し、又はフィラーによって離隔される。
【0065】
フィラー及び末端スペーサーの各々は、独立して（１）１～１２個の非Ｋアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の非Ｋアミノ酸残基）又は（２）エチレングリコール（ＥＧ）ユニットの１～１２個の反復（例えば、ＥＧユニットの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の反復）を有するＰＥＧ化アミノ酸を備える。一般に、非Ｋアミノ酸残基の各々は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）残基からなる群から独立して選択される。好ましくは、末端スペーサーは、アスパラギン酸（Ｄ）及び／又はグルタミン酸（Ｅ）残基など、少なくとも３個の負電荷アミノ酸残基をｐＨ＝７において備える。一部の例示的な実施形態によると、末端スペーサーは、「ＥＤＥＤＥＡＧＧ」（配列番号８）、「ＥＧＥＧＥＡＧＧ」（配列番号９）又は「ＥＧＥＧＥ」（配列番号１０）のアミノ酸配列を備える。一具体例では、中心コアは、「ＥＤＥＤＥＧＡＧＧＫＧＡＧＫＧＡＧＫＧ」（配列番号１１）のアミノ酸配列を備える。
【0066】
本開示の特定の実施形態によると、結合アームは、２～１２個の非Ｋアミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の非Ｋアミノ酸残基）、ＥＧユニットの２～２４個の反復（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４個のＥＧユニット）を有するＰＥＧ鎖、又はこれらの組合せを備える。具体的な一実施形態では、結合アームはＰＥＧ鎖及びそのＰＥＧ鎖に接続されたバリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）ジペプチドを備え、ＰＥＧ鎖はＥＧユニットの３個の反復を有する。任意選択的に、結合アームのペプチド又はＰＥＧ鎖は、概ね同じ長さのポリマーに置換されてもよい。炭水化物又はその他の親水性ビルディングブロックを備えるポリマーが、結合アームとしての使用に適する。
【0067】
構造において、結合アームの各々は２つの末端（すなわち、第１の末端及び第２の末端）を有し、第１の末端は中心コアのＫ残基の１つに結合され、第２の末端はレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子に結合される。一部の実施形態によると、結合アームの第１の末端はそれとのアミド結合を形成することによってＫ残基のεアミノ基に結合され、結合アームの第２の末端はパラ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）試薬を介してレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子に結合される。
【0068】
あるいは、結合アームの第２の末端は、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を結合するための官能基を有する。意図する目的に応じて、官能基は、ＮＨ２基、ＣＯ２Ｈ基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基、アジド基、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基又はシクロオクテン基であり得る。レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子は、以下の化学反応のいずれかによって結合アームの第２の末端に結合される。
（１）その間のアミド結合を形成すること。この場合、官能基はＮＨ２基、ＣＯ２Ｈ基又はＮＨＳ基であり、レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子はＮＨ２基又はＣＯ２Ｈ基を有する（すなわち、レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子はＮＨ２基又はＣＯ２Ｈ基で修飾される）。
（２）銅（Ｉ）触媒によるアルキン－アジド環化付加反応（ＣｕＡＡＣ反応）。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がアジド基又はピコリルアジド基を有し、他方がアルキン基を有する。
（３）逆電子要請性Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ｉＥＤＤＡ）反応。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がテトラジン基を有し、他方がシクロオクテン基（例えば、ＴＣＯ基又はノルボルネン基）を有する。
（４）歪み促進型アジド－アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がアジド基を有し、他方がシクロオクチン基を有する。
（１）その間のアミド結合を形成すること。この場合、官能基はＮＨ２基、ＣＯ２Ｈ基又はＮＨＳ基であり、レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子はＮＨ２基又はＣＯ２Ｈ基を有する（すなわち、レナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子はＮＨ２基又はＣＯ２Ｈ基で修飾される）。
（２）銅（Ｉ）触媒によるアルキン－アジド環化付加反応（ＣｕＡＡＣ反応）。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がアジド基又はピコリルアジド基を有し、他方がアルキン基を有する。
（３）逆電子要請性Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ｉＥＤＤＡ）反応。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がテトラジン基を有し、他方がシクロオクテン基（例えば、ＴＣＯ基又はノルボルネン基）を有する。
（４）歪み促進型アジド－アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応。この反応において、官能基及びレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子の一方がアジド基を有し、他方がシクロオクチン基を有する。
【0069】
本開示の種々の実施形態によると、テトラジン基は１，２，３，４－テトラジン、１，２，３，５－テトラジン、１，２，４，５－テトラジン又はこれらの誘導体であり、シクロオクテン基はノルボルネン基又はトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）基であり、シクロオクチン基はジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、ジフルオロ化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）及びジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ又はＤＢＣＯ）からなる群から選択される。本開示の一実施形態によると、テトラジン基は、６－メチル－テトラジンである。
【0070】
理解できるように、本リンカーユニットに担持されるレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の数は、中心コアのＫ残基の数（及びしたがって結合アームの数）に応じる。例えば、中心コアが３個のＫ残基を備える場合には、３個の結合アームが中心コアのＫ残基にそれぞれ結合され、３個のレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子が結合アームの遊離末端にそれぞれ結合される。あるいは、中心コアが１０個のＫ残基を備える場合には、１０個の結合アームが中心コアのＫ残基にそれぞれ結合され、１０個のレナリドミド分子／加水分解レナリドミド分子が結合アームの遊離末端にそれぞれ結合される。したがって、当業者は、中心コアのＫ残基の数（及びしたがって結合アームの数）を所望の目的に応じて変更することによってリンカーユニットに担持されるレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の数を調整し得る。
【0071】
本開示の代替の実施形態によると、レナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子は、上述したように開裂性リンカー又は非開裂性リンカーであり得るリンカーを介して結合ペプチドのＣ残基のＳＨ基と反応することによって、抗ＣＤ３８抗体にそれぞれ結合される。
【0072】
本方法によって処置可能な腫瘍は、固形腫瘍又はびまん性腫瘍であり得る。固形腫瘍の例は、これらに限定されないが、黒色腫、食道癌、胃癌、脳腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、腎臓癌、肝細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌、頭頸部扁平上皮癌及びこれらの組合せを含む。例示的なびまん性腫瘍は、これらに限定されないが、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、リンパ球形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫）、多発性骨髄腫及びこれらの組合せを含む。本開示の一実施形態によると、腫瘍は多発性骨髄腫である。
【0073】
本方法で処置可能な被検体は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウサギである。好ましくは、被検体はヒトである。
【0074】
本開示の分子構築物は、経口、経腸、経鼻、局所、経粘膜又は非経口投与などの適切な経路によって被検体に投与され得る。意図する目的に応じて、非経口投与は、腫瘍内、筋肉内、静脈内、腹腔内又は動脈内注射であり得る。
【0075】
腫瘍（例えば、固形腫瘍又はびまん性腫瘍）を処置するための薬学的組成物も、ここに開示される。本開示の一部の実施形態によると、薬学的組成物は、上述したように、抗ＣＤ３８抗体及びその抗ＣＤ３８抗体に結合された複数のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子を備える本分子構築物を備える。これらの実施形態では、薬学的組成物の投与は、腫瘍の処置のために単独で又は抗ＣＤ３８抗体との併用で使用されるレナリドミド分子の有効量の少なくとも１０００分の１のレナリドミド分子又は加水分解レナリドミド分子の有効量を実現する。
【0076】
一部の好適な実施形態によると、薬学的組成物は、約０．１～１０ｍｇ／Ｋｇの量で投与される。好ましくは、薬学的組成物は、４週間に１回投与される。
【0077】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を明らかにして当業者が本発明を実施するのを補助するために与えられる。これらの実施例は、いかなる態様でも本発明の範囲を限定するものとみなされてはならない。更なる詳述がなくても、当業者は、ここでの説明に基づいて、本発明を最大限に利用可能であると考えられる。ここで引用される全ての刊行物は、それらの全体において参照によりここに取り込まれる。
【実施例0078】
実施例１ Ｍａｌ－レナリドミドバンドルの合成
３個のレナリドミド分子を含有する薬剤バンドルを、本実施例において合成した。図２に示す構造のように、中心コアは「ＥＤＥＤＥＧＡＧＧＫＧＡＧＫＧＡＧＫＧ」の配列（Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１１）を有していた。マレイミド－エチル－ＣＯ２Ｈ基（コンジュゲート基としての役割を果たす）を第１のアミノ酸残基のＮＨ２基（すなわち、配列番号１１の最初の「Ｅ」残基）とコンジュゲート基のＣＯ２Ｈ基との間のアミド結合を形成することによって中心コアのＮ末端に結合させた。３個の結合アームを中心コアのリシン（Ｋ）残基のεアミノ基にそれぞれ結合させた。各結合アームはエチレングリコール（ＥＧ）ユニットの３個の反復、カテプシンＢによって認識及び開裂されるＶａｌ－Ａｌａジペプチド、並びにレナリドミド分子を結合するためのパラ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）からなっていた。
３個のレナリドミド分子を含有する薬剤バンドルを、本実施例において合成した。図２に示す構造のように、中心コアは「ＥＤＥＤＥＧＡＧＧＫＧＡＧＫＧＡＧＫＧ」の配列（Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１１）を有していた。マレイミド－エチル－ＣＯ２Ｈ基（コンジュゲート基としての役割を果たす）を第１のアミノ酸残基のＮＨ２基（すなわち、配列番号１１の最初の「Ｅ」残基）とコンジュゲート基のＣＯ２Ｈ基との間のアミド結合を形成することによって中心コアのＮ末端に結合させた。３個の結合アームを中心コアのリシン（Ｋ）残基のεアミノ基にそれぞれ結合させた。各結合アームはエチレングリコール（ＥＧ）ユニットの３個の反復、カテプシンＢによって認識及び開裂されるＶａｌ－Ａｌａジペプチド、並びにレナリドミド分子を結合するためのパラ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）からなっていた。
【0079】
マレイミド含有レナリドミドバンドル（以下、「Ｍａｌ－レナリドミドバンドル」）を、中心コアを合成して薬剤バンドルをアセンブルするために標準Ｆｍｏｃベースの固相合成を実行し、ビルディングブロックを合成するために液相合成を行う併用法を用いて合成した。製造をＷｕＸｉ ＳＴＡ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国、上海）に外注した。本Ｍａｌ－レナリドミドバンドルの合成は、（ｉ）ビルディングブロック合成、（ｉｉ）中心コア合成及び（ｉｉｉ）薬剤バンドルアセンブリを含む３ステップからなっていた。簡潔には、Ｂｏｃ保護Ｖａｌ－Ａｌａジペプチド（化合物１）を溶液中で（４－アミノフェニル）メタノール（化合物２）及びビス（４－ニトロフェニル）カーボネートに順次結合して化合物３を得て、それを同様にレナリドミドに結合して化合物４とした。Ｂｏｃ保護基を除去した後に、結果として得られた化合物５を固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって（ＥＧ）３に結合して化合物６を生成し、それをＳＰＰＳによってＦｍｏｃ保護Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－ＧｌｙトリペプチドのＬｙｓのεアミノ基に結合してビルディングブロック７とした。中心コア８を標準ＦｍｏｃベースのＳＰＰＳによって合成し、その後に溶液中でＣ末端において２，３，４，５，６－ペンタフルオロフェノールに結合して化合物９を得た。ビルディングブロック７、化合物９、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ及びＮ－スクシンイミジル３－マレイミドプロピオネートを用いて、レナリドミドバンドル１０をＳＰＰＳによってアセンブルした。
【0080】
結果として生成されたＭａｌ－レナリドミドバンドルの精製サンプルを逆相分析高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。図３はＭａｌ－レナリドミドバンドルの逆相ＨＰＬＣプロファイルを示し、これは、Ｍａｌ－レナリドミドバンドルのピークが１３．７７７分の滞留時間を有することを示していた。
【0081】
Ｍａｌ－レナリドミドバンドルの同定を質量分析法ＥＳＩ－ＭＳによって実行した。図４は、質量分析法ＥＳＩ－ＭＳの結果を示し、本分子構築物は［Ｍ＋３Ｈ］３＋に対応する１３７９．２３５において強い分子イオンを有していた。これは、Ｍａｌ－レナリドミドバンドルの実際の分子量（Ｍ．Ｗ．）は、計算した４１３５．１４７４に合致した１３７９．２３５×３－３＝４１３４．７０５ダルトンであることを示す。
【0082】
実施例２ 組換え二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の構築
ヒトＣＤ３８に特異なｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨは、ダラツムマブ由来であった。抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子配列を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子配列（フレキシブルなヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを備えるｈＩｇＧ．Ｆｃ）の上流側に融合することによって構築した。Ｚｎ２＋結合モチーフをコードする遺伝子配列ＡＣＰＧＨＡ（配列番号６、結合ペプチドとしての役割を果たし、本検討では「ＢＭ」として指定される）を、ｈＩｇＧ１．ＦｃのＣＨ３ドメイン（Ｃ末端のＬｙｓが欠如）及び短い（Ｇｌｙ）３リンカーをコードする遺伝子配列の下流側に融合した。結果として得られた遺伝子配列構築物をＦＲＥＥＤＯＭ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０発現カセットに入れた。結果として生成した融合タンパク質は（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭの二量体の形態であり、それは配列番号１２のアミノ酸配列を有し、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖはＶＬ－リンカー－ＶＨを有し、ＶＬ及びＶＨは親水性リンカーＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１３）によって接続されていた。
ヒトＣＤ３８に特異なｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨは、ダラツムマブ由来であった。抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子配列を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする遺伝子配列（フレキシブルなヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを備えるｈＩｇＧ．Ｆｃ）の上流側に融合することによって構築した。Ｚｎ２＋結合モチーフをコードする遺伝子配列ＡＣＰＧＨＡ（配列番号６、結合ペプチドとしての役割を果たし、本検討では「ＢＭ」として指定される）を、ｈＩｇＧ１．ＦｃのＣＨ３ドメイン（Ｃ末端のＬｙｓが欠如）及び短い（Ｇｌｙ）３リンカーをコードする遺伝子配列の下流側に融合した。結果として得られた遺伝子配列構築物をＦＲＥＥＤＯＭ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０発現カセットに入れた。結果として生成した融合タンパク質は（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭの二量体の形態であり、それは配列番号１２のアミノ酸配列を有し、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖはＶＬ－リンカー－ＶＨを有し、ＶＬ及びＶＨは親水性リンカーＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１３）によって接続されていた。
【0083】
調製した二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の構成を図５Ａに与える。
【0084】
実施例３：組換え二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の発現及び精製
安定的に融合タンパク質を発現させるために、発現プラスミドをＳｓｐＩ消化によって線状化し、その後にＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃でトランスフェクション後４０～４８時間オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍ）でインキュベートし、続いて安定プール選択のために１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有する選択培地中でインキュベートした。選択培地を毎週２回変え、組換え二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の発現を毎週確認した。２～３週間後、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質について安定的に発現する細胞を凍結保存した。融合タンパク質を、安定したＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞の上清から回収して、タンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて精製した。緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換し、融合タンパク質の濃度をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて特定及び分析した。図５Ｂのデータは分析結果を示し、融合タンパク質を、予想サイズと一致する約１１０ｋＤａにおける主要なバンド（図５Ｂのレーン１）として確認した。Ｍは、タンパク質マーカーの略である。抗体を、５０％グリセロールとともにＰＢＳ中に溶解し、以降の検討のために約－２０℃で保存した。
安定的に融合タンパク質を発現させるために、発現プラスミドをＳｓｐＩ消化によって線状化し、その後にＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃でトランスフェクション後４０～４８時間オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍ）でインキュベートし、続いて安定プール選択のために１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有する選択培地中でインキュベートした。選択培地を毎週２回変え、組換え二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の発現を毎週確認した。２～３週間後、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質について安定的に発現する細胞を凍結保存した。融合タンパク質を、安定したＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞の上清から回収して、タンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて精製した。緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換し、融合タンパク質の濃度をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて特定及び分析した。図５Ｂのデータは分析結果を示し、融合タンパク質を、予想サイズと一致する約１１０ｋＤａにおける主要なバンド（図５Ｂのレーン１）として確認した。Ｍは、タンパク質マーカーの略である。抗体を、５０％グリセロールとともにＰＢＳ中に溶解し、以降の検討のために約－２０℃で保存した。
【0085】
実施例４ 組換え二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質及び２つのレナリドミドバンドルを含有する分子構築物の合成
本実施例では、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭのＢＭ（すなわち、ＡＣＰＧＨＡ、配列番号６）の２つのシステイン残基にそれぞれ結合された２つのレナリドミドバンドルを有する分子構築物を調製した。この分子構築物の構造を示す模式図を図６Ａに与える。実施例３の精製した二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質をコンジュゲーションバッファー（１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、３０ｍＭのスクロース、ｐＨ６．０）中に調製した。最終濃度を１５μＭに調整し、その後に６当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とともに３７℃で３０分間インキュベートすることによって還元して、培地中のＣｙｓ又はグルタチオンとの無用なジスルフィド結合を形成し得るＺｎ２＋結合Ｃｙｓを遊離させた。還元したタンパク質を、６０μＭのＺｎＣｌ２を含有するコンジュゲーションバッファーに対してｓｌｉｄｅ－Ａ－ｌｙｚｅｒ透析カセットによって２５℃で２時間透析して（ｉ）ヒンジジスルフィド結合を再構築し、（ｉｉ）Ｚｎ２＋結合モチーフをＺｎ２＋と結合させた。実施例１の３当量のＭａｌ－レナリドミドバンドル（１０ｍＭのコハク酸ナトリウムバッファー、３０ｍＭのスクロース、６０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ６．０において４５μＭの最終濃度）を添加し、融合タンパク質とともに丸底フラスコ内で撹拌（６００ｒｐｍ）しながら２５℃で１０分間インキュベートした。生成物を可溶化するために、等量の１００％（ｗ／ｖ）スクロースを、結果として得られた溶液に添加し、２５℃で１６～１８時間撹拌した。結合生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
本実施例では、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭのＢＭ（すなわち、ＡＣＰＧＨＡ、配列番号６）の２つのシステイン残基にそれぞれ結合された２つのレナリドミドバンドルを有する分子構築物を調製した。この分子構築物の構造を示す模式図を図６Ａに与える。実施例３の精製した二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質をコンジュゲーションバッファー（１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、３０ｍＭのスクロース、ｐＨ６．０）中に調製した。最終濃度を１５μＭに調整し、その後に６当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とともに３７℃で３０分間インキュベートすることによって還元して、培地中のＣｙｓ又はグルタチオンとの無用なジスルフィド結合を形成し得るＺｎ２＋結合Ｃｙｓを遊離させた。還元したタンパク質を、６０μＭのＺｎＣｌ２を含有するコンジュゲーションバッファーに対してｓｌｉｄｅ－Ａ－ｌｙｚｅｒ透析カセットによって２５℃で２時間透析して（ｉ）ヒンジジスルフィド結合を再構築し、（ｉｉ）Ｚｎ２＋結合モチーフをＺｎ２＋と結合させた。実施例１の３当量のＭａｌ－レナリドミドバンドル（１０ｍＭのコハク酸ナトリウムバッファー、３０ｍＭのスクロース、６０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ６．０において４５μＭの最終濃度）を添加し、融合タンパク質とともに丸底フラスコ内で撹拌（６００ｒｐｍ）しながら２５℃で１０分間インキュベートした。生成物を可溶化するために、等量の１００％（ｗ／ｖ）スクロースを、結果として得られた溶液に添加し、２５℃で１６～１８時間撹拌した。結合生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
【0086】
図６Ｂに示すデータのように、２つのレナリドミドバンドルを備える分子構築物は約１２０ｋＤａのＭ．Ｗ．を有し（レーン２において「＃１」としてラベル付けしたタンパク質バンド参照）、それは予想サイズよりも幾らか大きかった。未結合分子構築物は、図６Ｂではレーン１であり、＃２としてラベル付けした。Ｍは、タンパク質マーカーの略である。図６Ｂに示すように、２つのレナリドミドバンドルとの二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（以下、「天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル」）の複合体の収率は、約８５％であった。
【0087】
実施例５ 塩基性溶液中の天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの安定化
チオエーテル結合のβ脱離反応を防止するため、１／１０の体積の加水分解バッファー（１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン及び５０％のスクロース（ｗ／ｖ）、ｐＨ９．０）を実施例４の二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルに添加することによって、チオール－マレイミド複合体を加水分解してマレイミド環の開環を誘発した。そして、結果として得られた溶液を２５℃で２日間撹拌してマレイミド環を加水分解した。
チオエーテル結合のβ脱離反応を防止するため、１／１０の体積の加水分解バッファー（１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン及び５０％のスクロース（ｗ／ｖ）、ｐＨ９．０）を実施例４の二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルに添加することによって、チオール－マレイミド複合体を加水分解してマレイミド環の開環を誘発した。そして、結果として得られた溶液を２５℃で２日間撹拌してマレイミド環を加水分解した。
【0088】
実施例４で得られた分子構築物の反応生成物を、カラムを用いてバッファー交換してトリスバッファー（ｐＨ９．０において１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＬ－アルギニン及び１００ｍＭの塩化ナトリウム）とした。そして、結果として得られた溶液を３７℃で５時間加熱した。溶液を冷却し、遠心分離によってバッファー交換してｐＨ５．５の５０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓバッファーとした。最終サンプルを約１～３ｍｇ／ｍＬのタンパク質まで濃縮した。結果として生成された生成物を「安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル」として指定した。
【0089】
実施例６ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの精製
精製の前に、実施例５の安定化生成物をバッファーＡ（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と交換した。未結合分子又は１つの薬剤バンドルのみとの複合体を除去するために、混合物を、予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に適用し、続いて１０、２０及び１５カラム体積についてそれぞれ０、５０及び６５％のバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）による３回の洗浄ステップを行った。２つの薬剤バンドルとの複合体を、１００％のバッファーＢで２０カラム体積について流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。先行するＨＩＣ精製の回収サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに適用してタンパク質凝集物から分子構築物を分離した。ＨＩＣ及びＳＥＣ精製後、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを取得した。
精製の前に、実施例５の安定化生成物をバッファーＡ（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と交換した。未結合分子又は１つの薬剤バンドルのみとの複合体を除去するために、混合物を、予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に適用し、続いて１０、２０及び１５カラム体積についてそれぞれ０、５０及び６５％のバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）による３回の洗浄ステップを行った。２つの薬剤バンドルとの複合体を、１００％のバッファーＢで２０カラム体積について流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。先行するＨＩＣ精製の回収サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに適用してタンパク質凝集物から分子構築物を分離した。ＨＩＣ及びＳＥＣ精製後、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを取得した。
【0090】
図７Ａは安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示し、１でラベル付けしたレーン及び２でラベル付けしたレーンは、それぞれ未結合分子構築物及び２つのレナリドミドバンドルと結合した分子構築物に対応する。サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロファイルの結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは９５％超の純度を有することを示した（図７Ｂ）。
【0091】
実施例７ 天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの精製
天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを得るために、精製前に、実施例４の生成物をバッファーＡ（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）と交換した。簡潔には、反応混合物を、予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に適用し、続いて１０、２０及び１５カラム体積についてそれぞれ０、５０及び６５％のバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）による３回の洗浄ステップを行った。２つのレナリドミドバンドルとの複合体を、１００％のバッファーＢで２０カラム体積について流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。先行するＨＩＣ精製の回収サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用してタンパク質凝集物から分子構築物を分離した。ＨＩＣ及びＳＥＣ精製後、天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを高純度で取得した。
天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを得るために、精製前に、実施例４の生成物をバッファーＡ（５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）と交換した。簡潔には、反応混合物を、予め平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に適用し、続いて１０、２０及び１５カラム体積についてそれぞれ０、５０及び６５％のバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）による３回の洗浄ステップを行った。２つのレナリドミドバンドルとの複合体を、１００％のバッファーＢで２０カラム体積について流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。先行するＨＩＣ精製の回収サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用してタンパク質凝集物から分子構築物を分離した。ＨＩＣ及びＳＥＣ精製後、天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを高純度で取得した。
【0092】
実施例８ ＨＰＬＣベースのレナリドミド放出アッセイの確立
内在化後の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルからの遊離レナリドミドの放出を評価するために、薬剤放出アッセイを確立した。簡潔には、ＰＢＳ又はＲＰＭＩ培地中に溶解したレナリドミド（１μＭ）、ＲＰＭＩ培地中に溶解した安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（１μＭ）、ＲＰＭＩ培地中で培養したＨ９２９細胞、及びＲＰＭＩ培地中で１×１０６個のＨ９２９細胞と共培養した安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（１μＭ）をそれぞれ３７℃で５日間インキュベートした。全ての上清を上記の条件により回収し、遠心分離して細胞の残骸を除去した。３ｋＤａ未満のＭ．Ｗ．の分子をカラムによって回収した。調製したサンプルをＨＰＬＣ分析のためのＣ８カラムに注入した。ＨＰＬＣシステムを１ｍＬ／ｍｉｎの流量の勾配モードで動作させた。溶媒Ａを０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水で構成し、溶媒Ｂを０．１％のＴＦＡのアセトニトリルで構成した。０％の溶媒Ｂから開始したＨＰＬＣプログラムを８分間維持し、その後、線形勾配を０％の溶媒Ｂで開始し、２０分以内に１００％の溶媒Ｂまで増加させた。純溶媒Ｂを１０分間維持した後、カラムを７分以内に１００％の溶媒Ａで再生した。注入体積は１００ｍＬであり、カラムのオーブン温度を２５℃に設定した。合計稼働時間は４５分であった。
内在化後の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルからの遊離レナリドミドの放出を評価するために、薬剤放出アッセイを確立した。簡潔には、ＰＢＳ又はＲＰＭＩ培地中に溶解したレナリドミド（１μＭ）、ＲＰＭＩ培地中に溶解した安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（１μＭ）、ＲＰＭＩ培地中で培養したＨ９２９細胞、及びＲＰＭＩ培地中で１×１０６個のＨ９２９細胞と共培養した安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（１μＭ）をそれぞれ３７℃で５日間インキュベートした。全ての上清を上記の条件により回収し、遠心分離して細胞の残骸を除去した。３ｋＤａ未満のＭ．Ｗ．の分子をカラムによって回収した。調製したサンプルをＨＰＬＣ分析のためのＣ８カラムに注入した。ＨＰＬＣシステムを１ｍＬ／ｍｉｎの流量の勾配モードで動作させた。溶媒Ａを０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水で構成し、溶媒Ｂを０．１％のＴＦＡのアセトニトリルで構成した。０％の溶媒Ｂから開始したＨＰＬＣプログラムを８分間維持し、その後、線形勾配を０％の溶媒Ｂで開始し、２０分以内に１００％の溶媒Ｂまで増加させた。純溶媒Ｂを１０分間維持した後、カラムを７分以内に１００％の溶媒Ａで再生した。注入体積は１００ｍＬであり、カラムのオーブン温度を２５℃に設定した。合計稼働時間は４５分であった。
【0093】
実施例９ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルから放出されたレナリドミド分子の構造の分析
放出レナリドミド分子の構造を分析する検討では、ＰＢＳ中で５日間インキュベートしたレナリドミドをコントロール群として作用させ、それは長期インキュベーション後にレナリドミド分子に対応するピーク（ｐ３という）及びその２つの加水分解形態にそれぞれ対応する２つの更なるピーク（ｐ２及びｐ１）を示した（図８Ａ、グループ（１）：レナリドミド）。ＨＰＬＣプロファイルにおける３個のピークを質量分析法によって確認した。図８Ｂに示す分析結果によると、３個のピーク（それぞれ（１）、（２）及び（３）という）を、ＰＢＳ中のレナリドミドをＲＰＭＩ培地に置換した後に検出し、ピーク（１）は、
の構造を有する加水分解レナリドミドに対応し（図８Ｂのパネル（Ａ）及び（Ｂ））、ピーク（２）は、
の構造を有する加水分解レナリドミドに対応し（図８Ｂのパネル（Ａ）及び（Ｃ））、ピーク（３）は、
の構造を有するレナリドミドに対応した（図８Ｂのパネル（Ａ）及び（Ｄ））。２つの加水分解形態のレナリドミド（ｐ１及びｐ２）は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルとともに５日間インキュベートしたＨ９２９細胞の培養上清中に検出することができ、元のレナリドミド（ｐ３）は検出されなかった（図８Ａ、グループ（６）：Ｈ９２９細胞＋複合体）。ｐ１、ｐ２又はｐ３のピークは、ＲＰＭＩ培地単体（図８Ａ、グループ（２）：ＲＰＭＩ）、ＲＰＭＩ培地中で５日間インキュベートした安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（図８Ａ、グループ（４）：ＲＰＭＩ＋複合体）又はＲＰＭＩ培地中で５日間培養したＨ９２９細胞の上清（図８Ａ、グループ（５）：Ｈ９２９細胞）では見られなかった。
放出レナリドミド分子の構造を分析する検討では、ＰＢＳ中で５日間インキュベートしたレナリドミドをコントロール群として作用させ、それは長期インキュベーション後にレナリドミド分子に対応するピーク（ｐ３という）及びその２つの加水分解形態にそれぞれ対応する２つの更なるピーク（ｐ２及びｐ１）を示した（図８Ａ、グループ（１）：レナリドミド）。ＨＰＬＣプロファイルにおける３個のピークを質量分析法によって確認した。図８Ｂに示す分析結果によると、３個のピーク（それぞれ（１）、（２）及び（３）という）を、ＰＢＳ中のレナリドミドをＲＰＭＩ培地に置換した後に検出し、ピーク（１）は、
【化5】
【化6】
【化7】
【0094】
したがって、これらの結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質に担持されるレナリドミド分子が加水分解形態（ｐ１及びｐ２）で放出されることを示した。
【0095】
実施例１０ ＤＡＲの特定のための安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）によって分析した。脱離マトリックスとして飽和シナピン酸（アセトニトリル：水が３０：７０（ｖ／ｖ）の０．１％のＴＦＡ中に２ｍｇ／ｍＬ）を用いてＭＡＬＤＩ標的プレート上に直接スポットした。各スポットを、２００Ｈｚレーザーが装備されたＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦにおいて分析した。データ取得及び処理をソフトウェアによって行った。分析結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルはｍ／ｚ（ｚ＝１）：［Ｍ＋Ｈ］＋及びｍ／ｚ（ｚ＝２）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋にそれぞれ対応する５８３８２及び１１６７０５ダルトンのＭ．Ｗ．を有し（図９の下側パネル）、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（薬剤なし、コントロールとしての役割を果たす）は５４３００及び１０８５３７ダルトンのＭ．Ｗ．を有し、それらはｍ／ｚ（ｚ＝１）：［Ｍ＋Ｈ］＋及びｍ／ｚ（ｚ＝２）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋に対応する（図９の上側パネル）。
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）によって分析した。脱離マトリックスとして飽和シナピン酸（アセトニトリル：水が３０：７０（ｖ／ｖ）の０．１％のＴＦＡ中に２ｍｇ／ｍＬ）を用いてＭＡＬＤＩ標的プレート上に直接スポットした。各スポットを、２００Ｈｚレーザーが装備されたＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦにおいて分析した。データ取得及び処理をソフトウェアによって行った。分析結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルはｍ／ｚ（ｚ＝１）：［Ｍ＋Ｈ］＋及びｍ／ｚ（ｚ＝２）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋にそれぞれ対応する５８３８２及び１１６７０５ダルトンのＭ．Ｗ．を有し（図９の下側パネル）、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（薬剤なし、コントロールとしての役割を果たす）は５４３００及び１０８５３７ダルトンのＭ．Ｗ．を有し、それらはｍ／ｚ（ｚ＝１）：［Ｍ＋Ｈ］＋及びｍ／ｚ（ｚ＝２）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋に対応する（図９の上側パネル）。
【0096】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析において、一重（Ｚ＝１）及び二重（Ｚ＝２）に帯電した安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの確認されたｍ／ｚ値は、それぞれ１１６８２０及び５８５０１Ｄａであり、薬剤なしの二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の対応するｍ／ｚ値は、それぞれ１０８５３４及び５４３１１Ｄａであった（データ不図示）。レナリドミドバンドルは４２０５ＤａのＭ．Ｗ．を有するので、Ｚ＝１種に対する未結合の二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの８２８６ＤａのＭ．Ｗ．の増加は、２つのレナリドミドバンドルのＭ．Ｗ．を示した。したがって、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル分子の薬剤抗体比（ＤＡＲ）は６である。
【0097】
実施例１１ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルに対する薬剤バンドル結合部位の分析
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－Ｆｃ－ＢＭ－レナリドミドバンドルにおけるシステイン残基を同定するために、ＬＣ－ＭＳを用いてサンプルを消化及び分析した。簡潔には、ジスルフィド結合を減少させるために、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（２μｇ）をｐＨ７．４においてＰＢＳ中に溶解し、１７ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）バッファー中で１８ｍＭのＴＣＥＰとともに５５℃で１０分間遮光してインキュベートした。暗所での室温における３０分間の最終濃度１５．６ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によるアルキル化の後に、各検体をトリプシン（０．２μｇ）とともに３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを、質量分析計において液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ－ＭＳによって検出した。消化溶液（５μｌ）を流量１μｌ／ｍｉｎで毛細管カラム（Ｃ１８、０．０７５ｍｍ×１５０ｍｍ、ＩＤ３μｍ）に注入した。以下の勾配プログラムをクロマトグラフ分離に使用した。最初に１００％移動相Ａ（水中の０．１％のギ酸）を用いて流量３００ｎＬ／ｍｉｎとし、それを２分において２％移動相Ｂ（８０％のアセトニトリル中の０．１％のギ酸）によって９８％まで低下させ、さらに４０分において４０％移動相Ｂによって６０％まで低下させた。フルスキャン質量分析を記録し、標的ｍ／ｚをＮＣＥ３５及び最大注入時間１００ｍｓによって衝突誘起解離のために単離した。ＬＣ－ＭＳスペクトルを、カルバミドメチル基（５８ダルトン）又はレナリドミドバンドル（４２０５ダルトン）の追加のＭ．Ｗ．によってペプチド（１３６６ダルトン）の予想分子量に対して検索した。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを用いてシステイン含有ペプチド配列を同定した。
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－Ｆｃ－ＢＭ－レナリドミドバンドルにおけるシステイン残基を同定するために、ＬＣ－ＭＳを用いてサンプルを消化及び分析した。簡潔には、ジスルフィド結合を減少させるために、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（２μｇ）をｐＨ７．４においてＰＢＳ中に溶解し、１７ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）バッファー中で１８ｍＭのＴＣＥＰとともに５５℃で１０分間遮光してインキュベートした。暗所での室温における３０分間の最終濃度１５．６ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によるアルキル化の後に、各検体をトリプシン（０．２μｇ）とともに３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを、質量分析計において液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ－ＭＳによって検出した。消化溶液（５μｌ）を流量１μｌ／ｍｉｎで毛細管カラム（Ｃ１８、０．０７５ｍｍ×１５０ｍｍ、ＩＤ３μｍ）に注入した。以下の勾配プログラムをクロマトグラフ分離に使用した。最初に１００％移動相Ａ（水中の０．１％のギ酸）を用いて流量３００ｎＬ／ｍｉｎとし、それを２分において２％移動相Ｂ（８０％のアセトニトリル中の０．１％のギ酸）によって９８％まで低下させ、さらに４０分において４０％移動相Ｂによって６０％まで低下させた。フルスキャン質量分析を記録し、標的ｍ／ｚをＮＣＥ３５及び最大注入時間１００ｍｓによって衝突誘起解離のために単離した。ＬＣ－ＭＳスペクトルを、カルバミドメチル基（５８ダルトン）又はレナリドミドバンドル（４２０５ダルトン）の追加のＭ．Ｗ．によってペプチド（１３６６ダルトン）の予想分子量に対して検索した。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを用いてシステイン含有ペプチド配列を同定した。
【0098】
質量分析の分析結果は、ＭＳスペクトルにおけるフラグメントのｍ／ｚ値が５５７１．２９ダルトンに対応することを示し（データ不図示）、これは、分子構築物のアミノ酸配列「ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＡＣＰＧＨＡ」（配列番号１４、配列番号１２のアミノ酸残基４７２－４８７）（１３６６ダルトン）及び１つのレナリドミドバンドル（４２０５ダルトン）を含有するフラグメントの分子量と一致した。
【0099】
実施例１２ 安定的ヒトＣＤ３８過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成
完全長ヒトＣＤ３８のｃＤＮＡをｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－Ｅｆ１α－Ｐｕｒｏ発現ベクターにクローニングしてレンチウイルスベースのＣＤ３８発現プラスミドｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＣＤ３８を生成した。レンチウイルスを、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＣＤ３８、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ及びｐＣＭＶδＲ８．９１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトすることによってパッケージ化した。ヒトＣＤ３８過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、レンチウイルス感染によって形質導入し、感染３日後に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンとともに培養した。ヒトＣＤ３８の発現をフローサイトメトリーによって確認した。
完全長ヒトＣＤ３８のｃＤＮＡをｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－Ｅｆ１α－Ｐｕｒｏ発現ベクターにクローニングしてレンチウイルスベースのＣＤ３８発現プラスミドｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＣＤ３８を生成した。レンチウイルスを、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＣＤ３８、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ及びｐＣＭＶδＲ８．９１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトすることによってパッケージ化した。ヒトＣＤ３８過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、レンチウイルス感染によって形質導入し、感染３日後に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンとともに培養した。ヒトＣＤ３８の発現をフローサイトメトリーによって確認した。
【0100】
実施例１３ ヒトＣＤ３８過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合活性
抗体Ｃ末端で結合した２つのレナリドミドバンドルが抗体の標的能力を変化させなかったことを確かめるため、ヒトＣＤ３８に対する二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合活性を、ヒトＣＤ３８過剰発現２９３Ｔ細胞を用いて細胞ベースのＥＬＩＳＡによって特定した。安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）及び二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（「未結合」としてラベル付けされる）は、ヒトＣＤ３８への同様の結合活性を示した（図１０）。結果によると、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及び二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質のＥＣ５０値は、それぞれ０．６５及び０．８４ｎＭであった。したがって、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質への２つのレナリドミドバンドルの結合は、ヒトＣＤ３８に対する結合親和性を悪化させなかった。
抗体Ｃ末端で結合した２つのレナリドミドバンドルが抗体の標的能力を変化させなかったことを確かめるため、ヒトＣＤ３８に対する二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合活性を、ヒトＣＤ３８過剰発現２９３Ｔ細胞を用いて細胞ベースのＥＬＩＳＡによって特定した。安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）及び二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（「未結合」としてラベル付けされる）は、ヒトＣＤ３８への同様の結合活性を示した（図１０）。結果によると、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及び二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質のＥＣ５０値は、それぞれ０．６５及び０．８４ｎＭであった。したがって、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質への２つのレナリドミドバンドルの結合は、ヒトＣＤ３８に対する結合親和性を悪化させなかった。
【0101】
実施例１４ ヒト多発性骨髄腫Ｈ９２９細胞株に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合活性
生存ヒトＣＤ３８＋多発性骨髄腫Ｈ９２９細胞（Ｈ９２９及びＵ２６６－ＣＤ３８＋細胞を含む）に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合親和性を本実施例において検証した。
生存ヒトＣＤ３８＋多発性骨髄腫Ｈ９２９細胞（Ｈ９２９及びＵ２６６－ＣＤ３８＋細胞を含む）に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合親和性を本実施例において検証した。
【0102】
簡潔には、約２×１０５個のＨ９２９細胞又はＵ２６６－ＣＤ３８＋細胞をフローサイトメトリー染色（ＦＡＣＳ）バッファー（１％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ）で３回洗浄し、異なる濃度（１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ及び１ｐＭ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及びダラツムマブとともに２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーを用いて洗浄した後、細胞を、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体でラベル付けして細胞面における安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及びダラツムマブのレベルを検出した。染色のない細胞及び二次抗体のみで処置した細胞を陰性コントロールとして用いた。細胞関連蛍光を、フローサイトメトリーを用いて特定し、ソフトウェアによって分析した。
【0103】
「親」ダラツムマブ（「ｄａｒａ」としてラベル付けされる）と同様に、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）は、特異的かつ用量依存的態様でＨ９２９及びＵ２６６－ＣＤ３８＋細胞に対する結合活性を示した（図１１）。ただし、Ｈ９２９細胞（４．０６ｎＭ）及びＵ２６６－ＣＤ３８＋細胞（１．６６ｎＭ）に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルについてのＥＣ５０値は「親」ダラツムマブについてのもの（それぞれ１．０２及び０．１３ｎＭ）よりも大きく、ヒトＣＤ３８に対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの結合活性はダラツムマブのものよりも低いことを示した。
【0104】
実施例１５ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの細胞内在化
内在化アッセイを実施例において実行してＨ９２９細胞への安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの内在化の程度を検証した。
内在化アッセイを実施例において実行してＨ９２９細胞への安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの内在化の程度を検証した。
【0105】
簡潔には、２×１０５個／ウェルのＨ９２９細胞を、１μＭの安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（ＦＡＣＳバッファー中）とともに氷上で２０分間インキュベートした。新鮮な培地によって洗浄及び再懸濁した後、細胞を３７℃で０．５、１、２又は３時間インキュベートした。細胞を、洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体とともに氷上で２０分間インキュベートした。洗浄後、細胞関連蛍光を、フローサイトメトリーを用いて特定し、ソフトウェアによって分析した。内在化パーセンテージを、式（１）に従って、背景平均蛍光強度に対する所与の時間ｔにおける平均蛍光強度であるｄＭから計算した。
％内在化＝［ｄＭ（ｔ＝０）－ｄＭ（ｔ＝ｘ）］×１００／ｄＭ（ｔ＝０） （１）
％内在化＝［ｄＭ（ｔ＝０）－ｄＭ（ｔ＝ｘ）］×１００／ｄＭ（ｔ＝０） （１）
【0106】
生存Ｈ９２９細胞の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの信号強度は、３０分間のインキュベーション後に約１５％低下し、３時間後にさらに６０％低下し（表１、生存細胞）、これは、より少ない安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの分子が細胞面に結合し続けたことを示す。これに対して、３時間のインキュベーション後、固定細胞の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの信号強度の損失は検出されず（表１、固定細胞）、これは、生存細胞における信号強度の低下はインキュベーション中に分子構築物の乖離から生じたものではないことを示す。
表１ Ｈ９２９細胞における安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの内在化の動力学
表１ Ｈ９２９細胞における安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの内在化の動力学
【表1】
【0107】
実施例１６ 加水分解レナリドミド分子放出を通じた安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性を評価するために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性アッセイを行った。簡潔には、Ｈ９２９、Ｕ２６６－ＣＤ３８－、ＭＭ．１Ｓ及びＤａｕｄｉ細胞を、９６ウェルプレートに５０００個の細胞／ウェルで播種し、指示された濃度の異なる被験物質を含有する新鮮な培地とともに３７℃で５時間、１日、３日又は５日間共培養した。細胞の生存率をａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬によって特定した。約１０μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬を最終濃度１０％ｖ／ｖで細胞に添加し、それに続いて、３７℃で１．５時間インキュベートした。蛍光を、５６０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光に続いて任意の蛍光単位でマイクロプレートリーダーにおいて測定した。
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性を評価するために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性アッセイを行った。簡潔には、Ｈ９２９、Ｕ２６６－ＣＤ３８－、ＭＭ．１Ｓ及びＤａｕｄｉ細胞を、９６ウェルプレートに５０００個の細胞／ウェルで播種し、指示された濃度の異なる被験物質を含有する新鮮な培地とともに３７℃で５時間、１日、３日又は５日間共培養した。細胞の生存率をａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬によって特定した。約１０μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬を最終濃度１０％ｖ／ｖで細胞に添加し、それに続いて、３７℃で１．５時間インキュベートした。蛍光を、５６０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光に続いて任意の蛍光単位でマイクロプレートリーダーにおいて測定した。
【0108】
多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞のパネルに対する安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞殺傷効果を、（１）ダラツムマブ、（２）安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルにおけるレナリドミドと併用される二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質に類似したモル比１：６でレナリドミドと併用されるダラツムマブ、及び（３）（ダラツムマブ／レナリドミドの併用で使用されるレナリドミドの量に等しい）レナリドミドを含む他の３個の抗ＭＭ薬剤と比較した。異なるＭＭ細胞を、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（未結合、「α－ＣＤ３８ｍＡｂ」としてラベル付けされる）、ダラツムマブ、ダラツムマブ及びレナリドミドの併用（「ダラツムマブ／レナリドミド」としてラベル付けされる）並びにレナリドミドの段階希釈とともにインキュベートした。Ｈ９２９細胞を５時間、１日、３日又は５日間インキュベートし（図１２Ａ～１２Ｄ）、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ２６６－ＣＤ３８－及びＤａｕｄｉ細胞を５日間インキュベートした（図１２Ｅ～１２Ｇ）。その後、細胞生存率を特定した。
【0109】
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「安定化複合体」）の処置は、Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ細胞の双方に対して約０．４５μＭのＥＣ５０での用量依存的細胞毒性効果を示した（図１２Ｂ～１２Ｅ）。これに対して、ダラツムマブ媒介細胞死はナチュラルキラー細胞などの他の免疫細胞の存在に依存するため、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（未結合、すなわち「抗ＣＤ３８ｍＡｂ」）及び親ダラツムマブは、２０μＭ超の用量であっても、同じ細胞に対する細胞死の効果を示さなかった（図１２Ｂ～１２Ｅ）。１０μＭ超の用量でのレナリドミド又はダラツムマブ／レナリドミドの併用は、Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ細胞の弱い殺傷力しか示さず（図１２Ｂ～１２Ｅ）、これは、ごく一部のみのレナリドミドが標的ＭＭ細胞に侵入し、一旦内部に入ると、ＭＭ細胞に対して細胞毒性効果を示したことを示す。加水分解レナリドミド（レナリドミドではなく）の分子は安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「安定化複合体」）から放出されたが、図１２Ｄ及び１２Ｅでの結果は安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは、単体又はダラツムマブとの併用でのレナリドミドよりも１００倍以上有効であることを示した。Ｕ２６６－ＣＤ３８－細胞について、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「安定化複合体」）、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合、すなわち「抗ＣＤ３８ｍＡｂ」）及びダラツムマブには殺傷効果はないが、レナリドミド及びそのダラツムマブとの併用は、レナリドミドの効果に起因する可能性のある高い濃度で殺傷効果を示した（図１２Ｆ）。ＤａｕｄｉＢリンパ腫細胞はＣＤ３８を発現したが、これらの細胞がおそらくはレナリドミドに対する耐性を有するため、５種類の処置はいずれも殺傷効果を示さなかった（図１２Ｇ）。
【0110】
またさらに、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは、ＭＭ細胞表面上でＣＤ３８に密に結合してＣＤ３８の複合体を形成することによって腫瘍細胞に対する所望の毒性を示し、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルをエンドサイトーシスによって効率的に内在化させ、リソソームカテプシンＢによって開裂させて細胞毒性レナリドミドを放出させ、細胞死をもたらした。レナリドミド、ダラツムマブ又はそれらの併用はこの作用の機序を有さず、ダラツムマブに未結合のレナリドミドは容易には細胞に侵入することはできないが、ダラツムマブはＣＤ３８発現腫瘍細胞を殺傷するＦｃ依存性エンドエフェクター機能を必要とした。したがって、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは、レナリドミド、ダラツムマブ又はそれらの併用よりもｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでの有効な細胞毒性効果を有していた。
【0111】
実施例１７ 天然レナリドミド分子の放出を通じた天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性
ヒト多発性骨髄腫Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ細胞に対する実施例４の天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性のアッセイを、上記実施例で説明したように実行した。
ヒト多発性骨髄腫Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ細胞に対する実施例４の天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性活性のアッセイを、上記実施例で説明したように実行した。
【0112】
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「安定化複合体」）を陽性コントロールとして用いるが、表２の結果は、天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「天然複合体」）はＨ９２９細胞に対して２時間の処置に対して０．７２２μＭ及び５日間の処置に対して０．２０７μＭのＥＣ５０値で有効な細胞毒性を示すことを示した。
表２ Ｈ９２９細胞における指定処置のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性
表２ Ｈ９２９細胞における指定処置のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性
【表2】
【0113】
また、表３の結果は、天然二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（すなわち「天然複合体」）はＭＭ．１Ｓ細胞に対して２時間の処置に対して０．６６１μＭ及び５日間の処置に対して０．１９０μＭのＥＣ５０値で有効な細胞毒性を示すことを実証した。
表３ ＭＭ．１Ｓ細胞における指定処置のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性
表３ ＭＭ．１Ｓ細胞における指定処置のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性
【表3】
【0114】
実施例１８ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの血漿安定性
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの血漿安定性を評価するために、必要量の二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを、最終濃度２ｍｇ／ｍＬで９０％ヒト血漿中に溶解させ、その後３７℃で２８日間インキュベートした。サンプルアリコートを０、３、７、１０、１４、２１及び２８日目に回収し、ＥＬＩＳＡによって分析した。組換えヒトＣＤ３８タンパク質を抗原として被覆してダラツムマブ、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを捕捉した。二次抗体であるＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体を用いて３個のＣＤ３８結合抗体を検出した。２つのレナリドミドバンドルが安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの抗体に結合したままであるか否かを判定するために、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体によってさらに検出可能な抗レナリドミドバンドルｓｃＦｖ－マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体を用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、組換えヒトＣＤ３８タンパク質（０．１μｇ／１００μＬ／ウェル）によって１６時間４℃で被覆した。ＰＢＳＴバッファー（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰＢＳ）によって洗浄した後、各ウェルをブロッキングバッファー（１％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ）で３０分間ブロックした。標準物を、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルをヒト血漿とともに溶解し、それをブロッキングバッファー中に希釈することによって調製した。全てのサンプルを、計算曲線の線形性に合わせるようにブロッキングバッファー中に希釈することによって調製した。標準及び希釈サンプルを各ウェルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ブロッキングバッファー中の適切な希釈による二次抗体を対応するウェルに添加した。安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを検出するために、抗レナリドミドバンドルｓｃＦｖマウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体を洗い流した後に、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体をさらに添加した。最後に、各抗体の濃度を、テトラメチルベンジジン試薬及びマイクロプレートリーダーを用いて定量化した。半減期（Ｔ１／２）をソフトウェアによって計算した。データを、平均±ＳＤで示した。
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの血漿安定性を評価するために、必要量の二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを、最終濃度２ｍｇ／ｍＬで９０％ヒト血漿中に溶解させ、その後３７℃で２８日間インキュベートした。サンプルアリコートを０、３、７、１０、１４、２１及び２８日目に回収し、ＥＬＩＳＡによって分析した。組換えヒトＣＤ３８タンパク質を抗原として被覆してダラツムマブ、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを捕捉した。二次抗体であるＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体を用いて３個のＣＤ３８結合抗体を検出した。２つのレナリドミドバンドルが安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの抗体に結合したままであるか否かを判定するために、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体によってさらに検出可能な抗レナリドミドバンドルｓｃＦｖ－マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体を用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、組換えヒトＣＤ３８タンパク質（０．１μｇ／１００μＬ／ウェル）によって１６時間４℃で被覆した。ＰＢＳＴバッファー（０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰＢＳ）によって洗浄した後、各ウェルをブロッキングバッファー（１％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ）で３０分間ブロックした。標準物を、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルをヒト血漿とともに溶解し、それをブロッキングバッファー中に希釈することによって調製した。全てのサンプルを、計算曲線の線形性に合わせるようにブロッキングバッファー中に希釈することによって調製した。標準及び希釈サンプルを各ウェルに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ブロッキングバッファー中の適切な希釈による二次抗体を対応するウェルに添加した。安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを検出するために、抗レナリドミドバンドルｓｃＦｖマウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体を洗い流した後に、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体をさらに添加した。最後に、各抗体の濃度を、テトラメチルベンジジン試薬及びマイクロプレートリーダーを用いて定量化した。半減期（Ｔ１／２）をソフトウェアによって計算した。データを、平均±ＳＤで示した。
【0115】
図１３に示す結果は、ダラツムマブ、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質（「未結合」としてラベル付けされる）及び安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルはヒト血漿中で約６～７日の同等の半減期（Ｔ１／２）を２８日間共有することを示した。二次抗体、すなわち、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルと、１以下のレナリドミドバンドルに結合された二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質とを区別できない。そのため、二次抗体、すなわち、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体によって検出された抗レナリドミドバンドルｓｃＦｖ－マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体を用いて、２つのレナリドミドバンドルが抗ＣＤ３８抗体に結合したままであるか否かを判定した。種々の時点でのレナリドミドバンドル結合抗体の濃度は、そのＴ１／２（７．７日）（「安定化ＡＤＣ（結合Ａｂ）」としてラベル付けされ、すなわち、抗レナリドミドバンドル抗体及びＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体によって検出された二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル）が、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体によって検出された合計の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのＴ１／２（７．５日）（二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及び１以下のレナリドミドバンドルに結合された二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ融合タンパク質の双方を含有する「安定化ＡＤＣ（合計Ａｂ）」としてラベル付けされる）とほぼ同一であることを示した（図１３）。これは、２つのレナリドミドバンドルがヒト血漿中で抗ＣＤ３８抗体に安定的に結合されたことを示唆する。またさらに、抗ＣＤ３８抗体のｓｃＦｖの減少にかかわらず、そのＴ１／２はダラツムマブのＴ１／２と比較して減少しなかった。
【0116】
実施例１９ 安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルの確立
皮下腫瘍を生成するために、ＰＢＳ中の２×１０７個のＨ９２９細胞を５０％（ｖ／ｖ）細胞外マトリクスゲルに混合し、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの両脇腹に皮下注射した。腫瘍サイズ及び体重を２～３日ごとに記録した。ｉｎ ｖｉｖｏ皮下異種移植腫瘍の体積を、外部ノギスを用いて特定し、腫瘍体積を修正楕円体の公式、１／２×（長さ×幅×幅）によって計算した。腫瘍の平均サイズが１１５±１５ｍｍ３（移植後７日）又は１５０±２０ｍｍ３（移植後１４日）の範囲であった場合、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）及びダラツムマブをＰＢＳ中にそれぞれ調製し、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。実験の全てにおいて、単回用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを投与した。実験の終わりに、腫瘍を回収及び重量測定した。データをソフトウェアによって分析し、図面に示すように平均±ＳＤ又は平均±ＳＥＭとして表した。統計分析をスチューデントｔ検定で行い、グループ間の統計的差をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較後検定による一元ＡＮＯＶＡで分析した。
皮下腫瘍を生成するために、ＰＢＳ中の２×１０７個のＨ９２９細胞を５０％（ｖ／ｖ）細胞外マトリクスゲルに混合し、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの両脇腹に皮下注射した。腫瘍サイズ及び体重を２～３日ごとに記録した。ｉｎ ｖｉｖｏ皮下異種移植腫瘍の体積を、外部ノギスを用いて特定し、腫瘍体積を修正楕円体の公式、１／２×（長さ×幅×幅）によって計算した。腫瘍の平均サイズが１１５±１５ｍｍ３（移植後７日）又は１５０±２０ｍｍ３（移植後１４日）の範囲であった場合、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル、二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ（未結合抗体）及びダラツムマブをＰＢＳ中にそれぞれ調製し、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。実験の全てにおいて、単回用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを投与した。実験の終わりに、腫瘍を回収及び重量測定した。データをソフトウェアによって分析し、図面に示すように平均±ＳＤ又は平均±ＳＥＭとして表した。統計分析をスチューデントｔ検定で行い、グループ間の統計的差をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較後検定による一元ＡＮＯＶＡで分析した。
【0117】
実施例２０ マウス異種移植腫瘍モデルにおける安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及びダラツムマブの抗腫瘍効能
Ｈ９２９細胞を用いるパイロット研究では、腫瘍が１１５±１５ｍｍ３の平均サイズに成長すると、単回用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを移植後７日でｉ．ｐ．投与した。２１日間にわたって２～３日ごとに測定した腫瘍サイズの変化は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルが腫瘍サイズを効果的に縮小させることができるが、ダラツムマブ（「Ｄａｒａ」としてラベル付けされる）はＰＢＳと比較して腫瘍の成長を減速可能であるにすぎないことを実証した。薬剤投与後２１日目に全てのマウスからの腫瘍を摘出して重量測定した。結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）はダラツムマブと比較してＨ９２９腫瘍に対する非常に良好な成長阻害活性を示すことを示した。
Ｈ９２９細胞を用いるパイロット研究では、腫瘍が１１５±１５ｍｍ３の平均サイズに成長すると、単回用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブを移植後７日でｉ．ｐ．投与した。２１日間にわたって２～３日ごとに測定した腫瘍サイズの変化は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルが腫瘍サイズを効果的に縮小させることができるが、ダラツムマブ（「Ｄａｒａ」としてラベル付けされる）はＰＢＳと比較して腫瘍の成長を減速可能であるにすぎないことを実証した。薬剤投与後２１日目に全てのマウスからの腫瘍を摘出して重量測定した。結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）はダラツムマブと比較してＨ９２９腫瘍に対する非常に良好な成長阻害活性を示すことを示した。
【0118】
実施例２１ マウス異種移植腫瘍モデルにおける安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル、ダラツムマブ、レナリドミド及びダラツムマブ／レナリドミドの併用の抗腫瘍効能
さらに数日間腫瘍をより大きく成長させた場合に腫瘍成長を阻害するその能力について、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを引き続き検討した。Ｈ９２９細胞の移植後１４日目に、腫瘍が約１５０±２０ｍｍ３の平均体積に達すると、マウスに（１）単回用量のダラツムマブ（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、（２）毎日のレナリドミド（４６ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ）のｉ．ｐ．注射、（３）ダラツムマブ／レナリドミドの併用（単回用量の２０ｎｍｏｌ／ｋｇのダラツムマブ＋４６ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙのレナリドミド）及び（４）単回用量の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ投与した。図１５Ａの結果は、ＰＢＳ処置と比較して、ダラツムマブ（Ｄａｒａ）又はレナリドミド（Ｌｅｎａ）の処置が腫瘍成長を阻害し、ダラツムマブ／レナリドミドの併用（Ｄａｒａ／Ｌｅｎａ）処置は腫瘍成長に対してより大きな阻害効果を示すことを実証した。薬剤投与後２８日目に全てのマウスからの腫瘍を摘出して重量測定した（図１５Ｂ）。驚くべきことに、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（安定化複合体）の処置はマウスの腫瘍成長を完全に抑制し、マウスのうちの一匹に微小結節を残した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルはダラツムマブ、レナリドミド又はダラツムマブ／レナリドミドの併用の処置のものと比較してＨ９２９腫瘍に対して非常に良好な抗腫瘍効果を示すことを示した。
さらに数日間腫瘍をより大きく成長させた場合に腫瘍成長を阻害するその能力について、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルを引き続き検討した。Ｈ９２９細胞の移植後１４日目に、腫瘍が約１５０±２０ｍｍ３の平均体積に達すると、マウスに（１）単回用量のダラツムマブ（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、（２）毎日のレナリドミド（４６ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ）のｉ．ｐ．注射、（３）ダラツムマブ／レナリドミドの併用（単回用量の２０ｎｍｏｌ／ｋｇのダラツムマブ＋４６ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙのレナリドミド）及び（４）単回用量の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（「安定化複合体」としてラベル付けされる）（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ投与した。図１５Ａの結果は、ＰＢＳ処置と比較して、ダラツムマブ（Ｄａｒａ）又はレナリドミド（Ｌｅｎａ）の処置が腫瘍成長を阻害し、ダラツムマブ／レナリドミドの併用（Ｄａｒａ／Ｌｅｎａ）処置は腫瘍成長に対してより大きな阻害効果を示すことを実証した。薬剤投与後２８日目に全てのマウスからの腫瘍を摘出して重量測定した（図１５Ｂ）。驚くべきことに、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル（安定化複合体）の処置はマウスの腫瘍成長を完全に抑制し、マウスのうちの一匹に微小結節を残した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルはダラツムマブ、レナリドミド又はダラツムマブ／レナリドミドの併用の処置のものと比較してＨ９２９腫瘍に対して非常に良好な抗腫瘍効果を示すことを示した。
【0119】
特に、２８日間の経過にわたって４６ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙの処置で採用されたレナリドミドの合計量は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの単回用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）によって与えられるレナリドミドの量の１０６４０倍であった。
【0120】
実施例２２ 患者由来の多発性骨髄腫細胞を用いた安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル及びダラツムマブ／レナリドミドの併用の抗腫瘍効能
患者由来の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞における安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの有効性を評価するために、新たにＭＭ患者と診断された５名の患者（Ｎｏ．１～Ｎｏ．５）の骨髄から単離したＭＭ細胞を、種々の濃度（０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μＭ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブ及びレナリドミドの併用（すなわち、ダラツムマブ／レナリドミドの併用、コントロールグループとしての役割を果たす）を５日間３７℃で処置した。細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬を用いて特定した。
患者由来の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞における安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルの有効性を評価するために、新たにＭＭ患者と診断された５名の患者（Ｎｏ．１～Ｎｏ．５）の骨髄から単離したＭＭ細胞を、種々の濃度（０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μＭ）の安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドル又はダラツムマブ及びレナリドミドの併用（すなわち、ダラツムマブ／レナリドミドの併用、コントロールグループとしての役割を果たす）を５日間３７℃で処置した。細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬を用いて特定した。
【0121】
安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルによって処置したＭＭ細胞の細胞生存率の結果は、生存率の大幅な低下を明らかとした。安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルに対する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値は０．０７～０．２７μＭの範囲となり、各併用処置グループのＩＣ５０値は１００μＭを超えた（表４）。
表４ 指定処置のＩＣ５０値
表４ 指定処置のＩＣ５０値
【表4】
【0122】
またさらに、ＩＣ５０値の分析は、ダラツムマブ／レナリドミドの併用処置における遊離レナリドミドと比較して、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルによるＩＣ５０値の１００倍を超える減少を実証した。この結果は、安定化複合体に担持されるレナリドミドはＭＭ細胞を殺傷する際により一層効果的であり、ＭＭ細胞によって内在化されるとその有効性を強調することを示す。
【0123】
結果は、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは患者由来のＭＭ細胞における有効な抗腫瘍効能を示すことを示唆する。レナリドミドなしと比較したＩＣ５０値の大幅な低下は、レナリドミドバンドル結合の高められた有効性を強調している。
【0124】
まとめると、安定化二本鎖（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）－ｈＩｇＧ１．Ｆｃ－（Ｇｌｙ）３－ＢＭ－レナリドミドバンドルは、レナリドミド、ダラツムマブ又はそれらの併用よりもｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて有効な細胞毒性効果を示した。
【0125】
実施形態の上記説明は例示としてのみ与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な記載を与える。本発明の種々の実施形態がある程度の特殊性を以て又は１以上の個々の実施形態を参照して上述されてきたが、当業者は、本発明の主旨又は範囲から逸脱することなく、開示される実施形態に対して多数の変更を行い得る。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B(A)】
【図8B(B)】
【図8B(C)】
【図8B(D)】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【配列表】
【外国語明細書】