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特開2024-153605多糖－タンパク質結合体の吸着を改善する方法及びその方法により得られる多価ワクチン製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024153605
(43)【公開日】2024-10-29
(54)【発明の名称】多糖－タンパク質結合体の吸着を改善する方法及びその方法により得られる多価ワクチン製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 39/09 20060101AFI20241022BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241022BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241022BHJP
A61K 39/05 20060101ALI20241022BHJP
A61K 39/08 20060101ALI20241022BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241022BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
A61K39/09
A61K9/08
A61K47/18
A61K47/12
A61K47/26
A61K47/02
A61K39/05
A61K39/08
A61K47/10
A61P31/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024066671
(22)【出願日】2024-04-17
(31)【優先権主張番号】202323028039
(32)【優先日】2023-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(71)【出願人】
【識別番号】513240205
【氏名又は名称】セルム・インスティテュート・オブ・インディア・プライベート・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＩｎｄｉａＰｒｉｖａｔｅ Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】２１２／２， Ｏｆｆ Ｓｏｌｉ Ｐｏｏｎａｗａｌｌａ Ｒｏａｄ， Ｈａｄａｐｓａｒ， Ｍａｈａｒａｓｈｔｒａ Ｐｕｎｅ ４１１ ０２８， ＩＮＤＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】プーナーウォラー・サイラス・ソリ
(72)【発明者】
【氏名】デレ・ラジーブ・マラサカント
(72)【発明者】
【氏名】ジャナ・スワパン・クマール
(72)【発明者】
【氏名】ジェイン・シータル・シャンティラール
(72)【発明者】
【氏名】マハジャン・アモール・ダッタトレヤ
(72)【発明者】
【氏名】ポール・ゴーラブ・シャンカール
(72)【発明者】
【氏名】マラビヤ・ヒテシュ・クマール
(72)【発明者】
【氏名】ジョーシー・チェタン・ビラス
(72)【発明者】
【氏名】ゴータム・マニシュ・マヘシュ
(72)【発明者】
【氏名】ケイル・プラタメッシュ・プラカシュ
(72)【発明者】
【氏名】ガイローラ・スニール・ジャグディシュ・プラサード
(72)【発明者】
【氏名】マルヤ・アシャ・ディネーシュ
(72)【発明者】
【氏名】ソニ・ディペン・ジャグディッシュバイ
(72)【発明者】
【氏名】パトニ・スシル・バルドマン
(72)【発明者】
【氏名】ガバード・ビナイ・ビジャイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076CC35
4C076DD09F
4C076DD23
4C076DD39
4C076DD42
4C076DD51
4C076EE23F
4C076FF36
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA10
4C085BA12
4C085BA14
4C085CC08
4C085DD86
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物の製造方法、及びワクチン組成物を提供する。
【解決手段】少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を有する、改善された、安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物、そのワクチン組成物の調製及び肺炎球菌を有する対象の予防及び／又は治療のための方法に特に関する。これらの多価肺炎球菌組成物は、キャリアが誘導するエピトープ抑制を克服し、新しい血清型に対する免疫応答を増強し（既存の承認済みワクチンと比較）、非ワクチン血清型の出現に対処するのにも役立つ。
【選択図】図２
【解決手段】少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を有する、改善された、安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物、そのワクチン組成物の調製及び肺炎球菌を有する対象の予防及び／又は治療のための方法に特に関する。これらの多価肺炎球菌組成物は、キャリアが誘導するエピトープ抑制を克服し、新しい血清型に対する免疫応答を増強し（既存の承認済みワクチンと比較）、非ワクチン血清型の出現に対処するのにも役立つ。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物の製造方法であって、前記方法は、
ｉ. １、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する肺炎球菌多糖をキャリアタンパク質に、１：０．５～１：１．５の比率、ｐＨ８．０～１０で、個別に結合させて、多糖－キャリアタンパク質結合体を得る工程、ここで、前記肺炎球菌多糖は、シアニル化試薬を使用してキャリアタンパク質と結合させ、前記ワクチン組成物は少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を含む；
ｉｉ. 工程（ｉ）で得た、４、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質結合体の第１のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１８時間～３０時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；
ｉｉｉ. 工程（ｉ）で得た、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１２時間～２４時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；並びに、
ｉｖ. 前記工程（ｉｉ）で得た第１のセットと、前記工程（ｉｉｉ）で得た第２のセットを、前記組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの界面活性剤の存在下、ラシュトンタービンフラットブレードインペラを使用して、４℃～１２℃で５０時間～８０時間混合する工程；
を含み、
ここで、前記組成物は、ｉ） アルミニウム塩アジュバントの総濃度が前記組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋２０～３７５μｇである、ｉｉ） 各多糖－キャリアタンパク質の吸着率が少なくとも３０％である、ｉｉｉ） 前記多糖－キャリアタンパク質結合体が望ましい物理化学的特性及び免疫原性を維持する、並びに、ｉｖ） 前記組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの前記界面活性剤が、凝集及び粒子形成を最小限にし、前記ワクチン組成物の流動性を改善する、
ことを含む、方法。
ｉ. １、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する肺炎球菌多糖をキャリアタンパク質に、１：０．５～１：１．５の比率、ｐＨ８．０～１０で、個別に結合させて、多糖－キャリアタンパク質結合体を得る工程、ここで、前記肺炎球菌多糖は、シアニル化試薬を使用してキャリアタンパク質と結合させ、前記ワクチン組成物は少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を含む；
ｉｉ. 工程（ｉ）で得た、４、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質結合体の第１のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１８時間～３０時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；
ｉｉｉ. 工程（ｉ）で得た、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１２時間～２４時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；並びに、
ｉｖ. 前記工程（ｉｉ）で得た第１のセットと、前記工程（ｉｉｉ）で得た第２のセットを、前記組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの界面活性剤の存在下、ラシュトンタービンフラットブレードインペラを使用して、４℃～１２℃で５０時間～８０時間混合する工程；
を含み、
ここで、前記組成物は、ｉ） アルミニウム塩アジュバントの総濃度が前記組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋２０～３７５μｇである、ｉｉ） 各多糖－キャリアタンパク質の吸着率が少なくとも３０％である、ｉｉｉ） 前記多糖－キャリアタンパク質結合体が望ましい物理化学的特性及び免疫原性を維持する、並びに、ｉｖ） 前記組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの前記界面活性剤が、凝集及び粒子形成を最小限にし、前記ワクチン組成物の流動性を改善する、
ことを含む、方法。
【請求項2】
前記肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットが、
－ １、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び３３Ｆ；
－ １、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び３３Ｆ；
－ １、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ；又は、
－ １、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ；
からなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む、請求項１に記載の方法。
－ １、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び３３Ｆ；
－ １、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び３３Ｆ；
－ １、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ；又は、
－ １、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ；
からなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のアルミニウム塩アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムカリウム並びにそれらの混合物を含む群から選択され；並びに、前記アルミニウム塩アジュバントの総濃度が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋１７０～２００μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質が、少なくとも１つの肺炎球菌多糖と結合した、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、髄膜炎菌外膜複合体、破傷風トキソイドフラグメントＣ、８アミノ酸変異を伴う組換え全長破傷風毒素（８ＭＴＴ）、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌プロテインＤ、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、ｆＨｂｐ、Ｐｏｒ Ａ、Ｐｏｒ Ｂ、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ－３及びＢＶＨ－１１、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ｕｓｐＡ、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）並びに無毒化浮腫因子（ＥＦ）及び致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、コレラ毒素サブユニットＢ、合成ペプチド、ヒートショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｎ１９などのさまざまな病原体抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル（C. difficile）及びＢ群連鎖球菌の毒素Ａ又はＢ、並びにそれらの等価物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としての破傷風トキソイドと結合させ、血清型４及び２４Ｆに由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としてのジフテリアトキソイドと結合させ、並びに、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ，７Ｄ，７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記肺炎球菌多糖を、シアニル化反応によりキャリアタンパク質と結合させ、前記シアニル化試薬が、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）、1-シアノ-4-ピロリジノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＰＰＴ）、1-シアノ-イミダゾール（1-ＣＩ）、1-シアノベンゾトリアゾール（1-ＣＢＴ）、2-シアノピリダジン-3(2H)オン（2-ＣＰＯ）、それらの機能的誘導体及び修飾体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記肺炎球菌多糖を、肺炎球菌多糖：1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）が１：０．３～１：２の重量比で混合したＣＤＡＰと、２２℃～２５℃で４分～１０分間反応させ、このＣＤＡＰ活性化多糖を、ＣＤＡＰ活性化肺炎球菌多糖：キャリアタンパク質が１：０．５～１：１．５の重量比で混合したキャリアタンパク質と接触させて、ｐＨ８．０～１０で３時間～５時間反応を行い、続いてグリシンでクエンチして多糖－キャリアタンパク質結合体を得ることを含むシアニル化反応により、前記肺炎球菌多糖をキャリアタンパク質と結合させる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
結合の前に、前記肺炎球菌多糖又はキャリアタンパク質を、カルボジイミド、還元的アミノ化又はシアニル化反応により、ヒドラジン、カルボヒドラジド、塩化ヒドラジン、ジヒドラジド、ε-アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、D-グルクロノラクトン、シスタミン及びp-ニトロフェニルエチルアミン、ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、1,6-ジアミノオキシヘキサン又はβ-プロピアミド、ニトロフェニルエチルアミン、ハロアルキルハライド、6-アミノカプロン酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるヘテロ又はホモ二官能性リンカーで誘導体化する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
結合工程の前に、血清型６Ａに由来する多糖以外の前記肺炎球菌多糖を、熱処理、音波処理、機械的手段、化学的加水分解、エンドライシス的酵素処理、物理的剪断、ガウリンホモジナイザー及び超音波処理の１つ以上を使用してサイジングし；サイジング後の血清型６Ａに由来する多糖以外の前記肺炎球菌多糖の分子量が、５０ｋＤａ～６００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）であり；並びに、血清型６Ａに由来する前記肺炎球菌多糖の分子量が、４００ｋＤａ～９００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは７００ｋＤａ～８００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記サイジング後の血清型４に由来する多糖の分子量が、１３０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１６５ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型２４Ｆに由来する多糖の分子量が、１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１２０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型６Ｂに由来する多糖の分子量が、１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１１０ｋＤａ～１７５ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型９Ｖに由来する多糖の分子量が、１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型１５Ｂに由来する多糖の分子量が、１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型１９Ａに由来する多糖の分子量が、１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）；前記サイジング後の血清型２２Ｆに由来する多糖の分子量が、１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１２０ｋＤａ～１４０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）又はこれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム及びそれらの組合せを含む群から選択され、前記塩の濃度が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２ｍｇ～１０ｍｇであり；
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のヒスチジンが、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇであり；
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のコハク酸が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇであり；並びに、
前記工程（ｉｖ）の界面活性剤が、ポリソルベート、ポリマーグリコール、ソルビタンエステル及びそれらの組合せを含む群から選択され、界面活性剤の濃度が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１２０μｇである、
請求項１に記載の方法。
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のヒスチジンが、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇであり；
工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のコハク酸が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇであり；並びに、
前記工程（ｉｖ）の界面活性剤が、ポリソルベート、ポリマーグリコール、ソルビタンエステル及びそれらの組合せを含む群から選択され、界面活性剤の濃度が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１２０μｇである、
請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記工程（ｉｖ）の界面活性剤がポリソルベート２０であり、ポリソルベート２０の濃度が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり９０μｇ～１２０μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の吸着を、2-フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム（フェメロール）、フェノール、m-クレゾール、チオメルサール、ホルムアルデヒド、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-クロロ-m-クレゾール、ベンジルアルコール及びそれらの組合せを含む群から選択される保存剤の存在下で行い、保存剤の濃度が前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり１ｍｇ～８ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記保存剤が、濃度が前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇの2-フェノキシエタノールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質複合型ワクチン組成物であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって製造され、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８からなる群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を有し；
ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、髄膜炎菌外膜複合体、破傷風トキソイドフラグメントＣ、８アミノ酸変異を伴う組換え全長破傷風毒素（８ＭＴＴ）、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌プロテインＤ、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、ｆＨｂｐ、Ｐｏｒ Ａ、Ｐｏｒ Ｂ、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ－３及びＢＶＨ－１１、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ｕｓｐＡ、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）並びに無毒化浮腫因子（ＥＦ）及び致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、コレラ毒素サブユニットＢ、合成ペプチド、ヒートショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｎ１９などのさまざまな病原体抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル（C. difficile）及びＢ群連鎖球菌の毒素Ａ又はＢ、並びにそれらの等価物からなる群から選択される少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を含み；
各キャリアタンパク質が少なくとも１つの肺炎球菌多糖と結合しており；
必要に応じて、前記組成物の各用量が、肺炎球菌の各血清型の多糖を１．０μｇ～１０μｇ含む；
ワクチン組成物。
ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、髄膜炎菌外膜複合体、破傷風トキソイドフラグメントＣ、８アミノ酸変異を伴う組換え全長破傷風毒素（８ＭＴＴ）、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌プロテインＤ、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、ｆＨｂｐ、Ｐｏｒ Ａ、Ｐｏｒ Ｂ、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ－３及びＢＶＨ－１１、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ｕｓｐＡ、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）並びに無毒化浮腫因子（ＥＦ）及び致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、コレラ毒素サブユニットＢ、合成ペプチド、ヒートショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｎ１９などのさまざまな病原体抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル（C. difficile）及びＢ群連鎖球菌の毒素Ａ又はＢ、並びにそれらの等価物からなる群から選択される少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を含み；
各キャリアタンパク質が少なくとも１つの肺炎球菌多糖と結合しており；
必要に応じて、前記組成物の各用量が、肺炎球菌の各血清型の多糖を１．０μｇ～１０μｇ含む；
ワクチン組成物。
【請求項16】
前記組成物が、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０価の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合型組成物である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項17】
前記ワクチン組成物が、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２０の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項18】
前記ワクチン組成物が、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２１の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項19】
前記ワクチン組成物が、それぞれが少なくとも１つの肺炎球菌多糖と結合している、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される３つの異なるキャリアタンパク質を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項20】
ＣＲＭ１９７と結合した前記肺炎球菌多糖が、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ，７Ｄ，７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択され；
前記ＴＴと結合した肺炎球菌多糖が、１、３、５、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択され；並びに、
前記ＤＴと結合した肺炎球菌多糖が、３、４、１５Ｂ及び２４Ｆを含む群から選択される、
請求項１９に記載のワクチン組成物。
前記ＴＴと結合した肺炎球菌多糖が、１、３、５、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択され；並びに、
前記ＤＴと結合した肺炎球菌多糖が、３、４、１５Ｂ及び２４Ｆを含む群から選択される、
請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項21】
３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としての破傷風トキソイドと結合し、血清型４及び２４Ｆに由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのジフテリアトキソイドと結合し、並びに、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ，７Ｄ，７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項22】
前記組成物が２０価の組成物であり、前記組成物が、
－ ２０の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
－ Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
－ 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
－ 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；
を含み、
－ ｐＨ５～７、
の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
ｉ. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ｉｉ. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
ｉｉｉ. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
ｉｖ. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
ｖ. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
ｖｉ. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；
である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
－ ２０の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
－ Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
－ 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
－ 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；
を含み、
－ ｐＨ５～７、
の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
ｉ. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ｉｉ. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
ｉｉｉ. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
ｉｖ. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
ｖ. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
ｖｉ. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；
である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項23】
前記組成物が２１価の組成物であり、前記組成物が、
－ ２１の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
－ Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
－ 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
－ 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；
を含み、
－ ｐＨ５～７、
の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
ｉ. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ｉｉ. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
ｉｉｉ. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
ｉｖ. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
ｖ. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
ｖｉ. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；
である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
－ ２１の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
－ Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
－ 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
－ 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
－ 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；
を含み、
－ ｐＨ５～７、
の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
ｉ. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ｉｉ. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
ｉｉｉ. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
ｉｖ. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
ｖ. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
ｖｉ. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；
である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項24】
血清型１５Ｂに由来する肺炎球菌多糖が、ＤＴ及びＣＲＭ１９７から選択されるキャリアタンパク質と結合している、請求項１５～２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項25】
前記ワクチン組成物が、９Ａ、９Ｎ及び９Ｌから選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を更に含む、請求項１５～２３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項26】
各肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の分子量が、１５００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である、請求項１５～２５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項27】
前記ワクチン組成物における６Ａ－ＴＴ結合体の分子量が、７０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは８０００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における４－ＤＴ結合体の分子量が、３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは３０００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における２４Ｆ－ＤＴ結合体の分子量が、１５００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２０００ｋＤａ～６０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における６Ｂ－ＣＲＭ１９７結合体の分子量が、４０００ｋＤａ～１５０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは５０００ｋＤａ～１２０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における９Ｖ－ＴＴ結合体の分子量が、１５０００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２００００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における１５Ｂ－ＴＴ結合体の分子量が、６０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは７５００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における１９Ａ－ＴＴ結合体の分子量が、５０００ｋＤａ～８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは６０００ｋＤａ～７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における２２Ｆ－ＴＴ結合体の分子量が、９０００ｋＤａ～１８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは１００００ｋＤａ～１７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）又はそれらの組合せである、請求項２６に記載のワクチン組成物。
前記ワクチン組成物における４－ＤＴ結合体の分子量が、３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは３０００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における２４Ｆ－ＤＴ結合体の分子量が、１５００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２０００ｋＤａ～６０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における６Ｂ－ＣＲＭ１９７結合体の分子量が、４０００ｋＤａ～１５０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは５０００ｋＤａ～１２０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における９Ｖ－ＴＴ結合体の分子量が、１５０００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２００００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における１５Ｂ－ＴＴ結合体の分子量が、６０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは７５００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における１９Ａ－ＴＴ結合体の分子量が、５０００ｋＤａ～８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは６０００ｋＤａ～７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）；
前記ワクチン組成物における２２Ｆ－ＴＴ結合体の分子量が、９０００ｋＤａ～１８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは１００００ｋＤａ～１７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）又はそれらの組合せである、請求項２６に記載のワクチン組成物。
【請求項28】
前記組成物が、前記ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇの2-フェノキシエタノールを含む複数回投与用組成物である、請求項１５～２７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項29】
前記組成物が、２～８℃、２５℃及び４０℃で安定であり；必要に応じて前記肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体が、遊離の多糖が１５％未満で、遊離のタンパク質が１０％未満である、請求項１５～２８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項30】
前記血清型６Ａ、９Ｖ及び１９Ａに由来する肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合した場合と比較して、キャリアタンパク質としての破傷風トキソイド（ＴＴ）と結合した場合に、ＩｇＧ力価が上昇し；必要に応じて、血清型６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び１５Ｂが、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合した場合と比較して、キャリアタンパク質としてのＴＴに結合した場合に、総ＩｇＧ力価及び機能的ＩｇＧ力価が少なくとも２倍増加する、請求項１５～２９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連特許出願の参照
本出願は、インド特許法、１９７０、第５４条に基づき出願された追加特許であり、２０１５年６月８日に出願された、インド特許出願第2185/MUM/2015号に対する優先権を主張する。
本出願は、インド特許法、１９７０、第５４条に基づき出願された追加特許であり、２０１５年６月８日に出願された、インド特許出願第2185/MUM/2015号に対する優先権を主張する。
【0002】
分野
この開示は、ワクチン組成物を製造する方法及び当該方法によって得られるワクチン組成物に関する。特に、この開示は、ワクチン組成物、改善された製剤、新規の安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法、並びに肺炎球菌を有する対象の予防及び／又は治療のための方法に関する。
この開示は、ワクチン組成物を製造する方法及び当該方法によって得られるワクチン組成物に関する。特に、この開示は、ワクチン組成物、改善された製剤、新規の安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法、並びに肺炎球菌を有する対象の予防及び／又は治療のための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
本明細書における全ての刊行物は、個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。以下の説明は、本発明の理解に有用である可能性がある情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが従来技術であること若しくは現在特許請求されている発明に関連すること又は具体的に若しくは暗示的に参照される任意の刊行物が従来技術であることを承認するものではない。
【0004】
肺炎球菌は、小児及び成人における、肺炎、髄膜炎及び胸水の主な原因である。今日まで確認されている肺炎球菌の異なる血清型は、１００種を超える。肺炎球菌は、世界中で５歳未満の小児が毎年１００万人を超えて死亡する原因となっており、侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）（例．菌血症、菌血症性肺炎及び髄膜炎）及び非侵襲性疾患（例．非菌血症性肺炎、中耳炎及び副鼻腔炎）の主因である。まとめて、これらの病状は、他の病原体によって引き起こされる疾患よりも高い世界的罹患率及び死亡率の原因となっている。５歳未満の小児、高齢者、及び（ＨＩＶ感染症及び免疫不全に関連する他の病状のような）併存症の病状を有する成人は、肺炎球菌による疾患をより発症しやすい傾向にある。
【0005】
侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）のために、５歳未満の小児において、約４５００万件の下気道感染症の発症と、３０００００件を超える死亡が毎年起きていると推定される。
【0006】
２つのクラスの肺炎球菌ワクチンが現在利用可能である：１つは多糖をベースとしたものであり、もう１つはキャリアタンパク質と結合した多糖をベースとしたものである。
【0007】
ニューモバックス（登録商標）２３（Merck Sharp & Dohme Corp.）は、産業国において約９０％の侵襲性肺炎球菌感染症を引き起こす２３種の血清型（１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆ）からの精製莢膜多糖を含有する、多糖をベースとしたワクチンである。しかし、肺炎球菌多糖は、Ｔ細胞非依存性抗原であることから、２歳未満の乳幼児では免疫原性が低く、免疫記憶を誘導できない。したがって、乳幼児は、結合していない肺炎球菌多糖にあまり反応しない。
【0008】
世界の毎年の肺炎球菌による小児の死亡のおよそ５０％が、アフリカ及びアジアの４つの国：インド（約６８，７００人が死亡）；ナイジェリア（約４９，０００人）；コンゴ民主共和国（約１４，５００人）；及びパキスタン（約１４，４００人）で起きている。
【0009】
乳児及び小児における肺炎球菌多糖ワクチンに関連する免疫原性の低下という問題に対処するため、疫学的に最も重要な肺炎球菌の血清型をさまざまなタンパク質キャリアと結合させた、改善された多糖－タンパク質結合型ワクチンが開発されることが必要とされている。この手法は、免疫原性を高め、血清の抗体レベルを上昇させるために、多糖をタンパク質に共有結合的に連結することを含む。これらのタンパク質キャリアは、Ｔ細胞依存性抗原であり、ヘルパーＴ細胞応答を刺激し、ワクチン接種した個体を既往性又はブースター応答のために抗原刺激する。多糖抗原のタンパク質キャリアへの結合は、多糖をＴ細胞非依存性抗原から、幼児が免疫学的に反応できるＴ細胞依存性抗原に変換する。
【0010】
免疫原性タンパク質と結合した多糖からなる結合型ワクチンは、Ｂ細胞記憶及び長期免疫の構築とともに、Ｔ細胞依存性応答を誘発する。ＰＣＶの利点は、幼児におけるその活性と、その持続性の可能性があることを含む。ＷＨＯが事前に承認した、肺炎球菌に対する肺炎球菌結合型ワクチン（ＰＣＶ）は、当時、乳幼児において侵襲性肺炎球菌疾患を引き起こし最も頻繁に単離された７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ）を含有するプレベナー（登録商標）（Pfizer）を含み、これは２０００年２月に米国で初めて認可された。その後、１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ及び２３Ｆに加えて血清型６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、１９Ｆからの多糖の結合体を含有するプレベナー１３（登録商標）（Pfizer）が承認された。シンフロリックス（登録商標）（ＧＳＫ）は、別の承認された結合型ワクチンであり、１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆに対する防御、並びに１９Ａ及び６Ａに対する交差防御を提供する。PNEUMOSIL（登録商標）（Serum Institute of India Pvt Ltd（ＳＩＩＰＬ））は、ＷＨＯが事前に承認した１０価のワクチンであり、肺炎球菌の血清型１、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆに対する防御を与える（世界で最も負担の大きい地域－多くの中南米及びメキシコの国々を含むアフリカ及びアジアにおいて深刻な疾患を引き起こす可能性が最も高い１０種の最も関連する血清型に対して防御する）。
【0011】
世界中の小児の予防接種プログラム（ＮＩＰ）での肺炎球菌結合型ワクチン（ＰＣＶ）の使用は、肺炎球菌疾患に関連する死亡率及び罹患率を著しく減少させている。Serum InstituteのPNEUMOSIL（登録商標）は、少なくとも６０の低所得の国々で導入され、２億２，５００万人を超える小児がワクチン接種を受け、７００，０００人を超える死亡が阻止されている。また、２０１０～２０１９年に世界中で５歳未満の小児において、１億７，５００万件の肺炎球菌疾患及び６２５，０００人の死亡がＰＣＶ１３によって阻止されたと推定される。肺炎球菌疾患に対する防御を幼児に与えるのに加えて、通例の小児の予防接種は、ワクチン血清型の鼻咽頭保菌の減少を通じて、ワクチン接種を受けていない集団にも間接的な防御を提供し、これにより疾患の伝播を減少させてきた。より多くの国でＰＣＶの接種率が増加すれば、ＰＣＶワクチン接種は、地球全体で、５歳未満の小児において、肺炎球菌疾患による年間約５，４６０万人の発症及び３９９，０００人の死亡を阻止する可能性がある。
【0012】
しかし、既存の肺炎球菌結合型ワクチンの通例使用に伴う懸念の１つは、血清型が置きかわることである。世界保健機関（ＷＨＯ）は、非ワクチン血清型循環及び血清型の置きかわりが出現し、小児及び成人においてこれらの血清型の肺炎球菌疾患の割合の増加につながっていると報告している（WHO Position Paper-February 2019. Wkly. Epidemiol. Rec. 2019; 94:85-104及びWeinbergera M.Dら; Lancet. 2012; 378:1962-1973）。各ワクチンは、肺炎球菌の全ての血清型のうちのいくつかのみを標的とし、そのため、非ワクチン血清型（ＮＶＴ）の流行が増加してＮＶＴ保菌及び関連する臨床症候群の増加につながると予想される。調査研究は、ＰＣＶ－７の導入に引き続くＮＶＴの保菌の増加及びＮＶＴ肺炎球菌疾患の増加を実証している。さらに、置きかわりの本当の量を過小評価する可能性がある疾患調査システムにおけるバイアスを考慮する価値がある。
【0013】
２０１０年の予防接種プログラムにおけるプレベナー１３（登録商標）の導入は、小児においてＩＰＤを予防するのに効果的な方策であった。肺炎球菌の疾患負担は、プレベナー１３（登録商標）の適用以来、著しく減少している。プレベナー１３（登録商標）は、ＩＰＤの全体の発生率を５０％を超えて減少させている。しかし、肺炎球菌の血清型分布に明らかな変化が生じており、ＮＶＴの流行の増加は、ＰＣＶ１３の導入後のワクチン血清型の流行の減少という恩恵を相殺する可能性がある。したがって、血清型２、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆを含む肺炎球菌の最大の血清型に対して十分に防御できる高い価数のワクチンが必要とされている。
【0014】
さらに、個々の血清型の流行は、異なる地理的地域又は年齢層において経時的に変化する可能性がある。ＮＶＴの流行及び病原性の増加は、ＰＣＶワクチン接種の普及による恩恵であった肺炎球菌疾患の負担の軽減に新たな課題を投げかけている。ＮＶＴの中で、血清型２４Ｆは、欧州及び西太平洋地域において、最も流行しているＩＰＤの原因病原体の１つであると考えられる。（中東及び北アフリカ）さらに、血清型２４Ｆ並びに８、１２Ｆ及び３３Ｆのような他のＮＶＴは、ＰＣＶで免疫を付与された小児の中で侵襲性スペクトルの上端にあると考えられた。したがって、高い価数の肺炎球菌ワクチンを開発する際に、血清型分布の地理的なばらつき及び肺炎球菌の血清型の流行の発展が考慮されるべきである。
【0015】
近年、更に２つの多価肺炎球菌ワクチンが米国で使用のために承認された。バクニュバンス（登録商標）（Merck Sharp & Dohme Corp）は、１５種の肺炎球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに対する防御を提供する。別の承認された結合型ワクチンであるプレベナー２０（登録商標）（Pfizer）は、肺炎球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに対する防御を提供する。
【0016】
Pfizer１３価、Pfizer２０価、Merckの１５価、Pfizerの７価は全て、単一の種類のキャリアタンパク質、すなわちＣＲＭ１９７からなるワクチンである。結合型ワクチンの免疫原性に影響を与える可能性のある最も重要な要因の１つは、キャリアを介した抗体応答の抑制を回避するキャリアタンパク質の選択である。単一のキャリアタンパク質では、キャリアが誘導するエピトープ抑制がもたらされ、個々の血清型では、望ましい抗多糖抗体応答が達成されない場合がある。多糖及びペプチドのような化合物は、免疫原性が低く、単独では免疫応答を誘導できず、それらは、通常、キャリアに共有結合的に連結される必要があり、キャリアは通常、免疫原性が高い大きなタンパク質である。これらのキャリアタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合し、ヘルパーＴ細胞への提示のためのＭＨＣクラスＩＩを介してＴ細胞エピトープを提供し、免疫応答を高める。破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリア毒素の非毒性変異体（ＣＲＭ１９７）のようなタンパク質が、免疫原性を増強するための効果的なキャリアとして使用される。しかし、これらのキャリアタンパク質には、抗ペプチド／多糖応答と競合する抗体応答を誘導する；対象が以前にそのキャリアに曝露されたことがある場合、悪化する可能性がある問題がある。この状況は、以前の接種で同じ種類のキャリアタンパク質を使用したワクチンでは、より悪化し、別のワクチンで同じキャリアタンパク質が再び使用されたとき、免疫応答の抑制がもたらされる。したがって、キャリアタンパク質の選択は、ワクチンの製造の間、重要な基準である。そのため、キャリアが誘導するエピトープ抑制の問題に対処する、複数の種類のキャリアタンパク質を有する代わりの多価結合型ワクチンが必要とされている。
【0017】
さらに、前述のPfizer／GSK／Merckのワクチンは、今のところ先進国でのみ利用可能であり、肺炎球菌疾患に対して最も脆弱な低及び中所得の国々が地球全体で利用でき、最も流行している、新興の病原性肺炎球菌の血清型に対する防御を付与できる、手頃な肺炎球菌ワクチンの緊急の必要性が未だに存在する。
【0018】
上述のとおり、多糖が、乳児において防御的となるのに十分な抗体を誘導するためには、免疫原としての多糖は、Ｔ細胞の助けを誘発しなければならない。したがって、多糖は、幼児において十分に免疫原性にするために、キャリアタンパク質と共有結合的に結合させる必要がある。多糖とキャリアタンパク質の単なる混合物は、乳児において多糖をより免疫原性にするものではない。したがって、結合型ワクチンは、Ｔ細胞エピトープ含有ポリペプチド、一般にはキャリアタンパク質と共有結合的に結合している細菌多糖、サイズが縮小された多糖又はそれ由来のオリゴ糖で一般に構成される。結合体に対する免疫応答は、タンパク質に対するそれとよく似ている。これは、結合した多糖に対する強力なＩｇＧ応答の亢進をもたらし、幼児において免疫学的記憶を生じさせる。
【0019】
多糖は、結合効率／結合体収率を改善し、反応基の数を増やして結合体の免疫原性を増強するために、結合工程の前に、断片化／サイジングすることもできる。多糖の断片化／サイジングは、熱加水分解、化学的加水分解（酸性、アルカリ性、オゾン分解及びフリーラジカル）、酵素的サイジング（リアーゼ及びヒドロラーゼ）、超音波処理及びホモジナイゼーションのような異なる方法によって、ランダムにサイズを縮小してもよく、これにより、試料の多分散性の増加がしばしばもたらされ、これに続いてサイジングされて（クロマトグラフィー又は限外ろ過の工程によって）、キャリアタンパク質結合のためのより明確な長さの多糖を生じることができる。サイズが縮小された多糖は、一般に末端還元糖を使用することによってキャリアタンパク質と結合される。そのような選択的な手法は、糖鎖への化学修飾を回避し、より明確な構造を生じ、それは一貫性をもって製造しやすい。酵素的サイジングは、単純であるが、酵素の商業的利用可能性、費用及び変性に対する感受性によって制限される。化学的加水分解（酸性及びアルカリ性処理又はフリーラジカル機構）は、大量の単糖及び副生成物の生成をもたらし、これはワクチンの大規模生産において、望ましくない。
【0020】
通常、精製された多糖が、化学的に活性化／修飾されてキャリアタンパク質と結合／連結できる反応基を生成する。糖の構造的完全性を変えることなく、効率的な結合を可能にするために、糖鎖の最適な活性化度を特定する必要がある。多糖活性化のために最も一般的に使用される方法の２つは、過ヨウ素酸酸化及びシアニル化である。過ヨウ素酸酸化では、酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸のようなペルヨーデート）により多糖に存在する末端ヒドロキシル基がアルデヒドに酸化される。多糖の近接のヒドロキシル基が酸化剤によって切断され、その結果、反応性アルデヒド基が形成される。多糖を活性化するためのペルヨーデートの使用に伴い生じる可能性のある重要な問題は、重要なエピトープが喪失する多糖の物理的構造の変化である。低レベルの活性化でさえ、特定のエピトープを喪失させ、新しいエピトープを作り出す可能性があることが理解できる。特に、還元的アミノ化の前の過ヨウ素酸酸化工程は、糖の環構造を開くことができ、それは、血清型に応じて、開環結合体をもたらす可能性がある。そのような開環多糖は、いくつかの場合、結合方法の後に再び閉じ、多糖が更に新しい高次構造を形成し、新しいエピトープをもたらす可能性がある（Poolman J.らClin. Vaccine Immunol. 2011; 18:327-336）。
【0021】
選択する化学に応じて、多糖及び／又はタンパク質キャリアを、結合前に誘導体化する可能性がある。化学的誘導体化のレベルは、結合化学量論、Ｂ細胞及びＴ細胞のエピトープ維持への影響及び凝集形成を推進できる。化学的誘導体化のレベルは、多糖対タンパク質比、及び最終的には免疫原性に影響を与える。したがって、結合戦略の選択は、結合の効率、糖対タンパク質比、及び複合多糖の構造とサイズに影響し、結果として免疫原性に影響を及ぼす可能性がある。
【0022】
結合方法は、免疫原性、及び誘導された抗体の機能性に影響を与える可能性がある。還元的アミノ化結合方法は、認可されている肺炎球菌結合型ワクチン（ＰＣＶ）の大部分（Pfizer７価１３価２０価／Merck１５価ＰＣＶ）で使用されており、糖由来アルデヒドとタンパク質中のアミンとの間のシッフ塩基形成と、これに続く還元による糖－タンパク質結合からなる。第１の工程は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いた部分的酸化による、多糖の鎖へのアルデヒド基の導入である。糖環のｃｉｓ－ジオール及びシアル酸残基が、過ヨウ素酸酸化によってアルデヒドを生成する最も反応しやすい区画である。その後、キャリアタンパク質が反応に加えられる。糖のアルデヒドは、通常、キャリアタンパク質のリジン残基と反応する。この方法は、炭水化物中のカルボニル基とタンパク質中のアミノ基との間の、シッフ塩基による最初の結合の形成からなる。その後、シッフ塩基は、弱い還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムで、より安定なアミンへと特異的に還元される。還元的アミノ化は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ）も利用する。しかし、還元的アミノ化には、低収率、低結合効率及び炭水化物構造の部分的分解のリスクを含む重要な欠点がある。さらに、ＤＭＳＯは、沸点が著しく高く、多糖及びキャリアタンパク質にとって有害である可能性があるため、実用的ではない。ＤＭＳＯは、有機溶媒であり、キャリアタンパク質を変性する可能性がある。また、ＤＭＳＯの主な欠点の１つは、反応後の除去が難しいことである；その高い沸点（１８９℃）が、ロータリーエバポレーターによる除去を非常に困難にしている。
【0023】
シアニル化化学では、当初は、ＣＮＢｒを利用して多糖に反応性シアノエステル基を生成し、John Robbins博士が１９８０年に報告した最初のＨｉｂ結合体で使用された。ＣＮＢｒを用いたシアニル化は、タンパク質－多糖結合型ワクチンを製造するために一般的に使用されている方法である。しかし、ＣＮＢｒによって調製された結合体の効率は低く、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）のような反応性リンカーの使用を必要とした。活性化収率はわずか０．５～２％であり、健康上のリスクを伴いながら、大量のＣＮＢｒを使用することになる。ＣＮＢｒは低コストの試薬であるが、高い毒性があり、その使用には特別な注意が必要とされる。さらに、影響を受けやすい多糖は、ＣＮＢｒ活性化に必要な高いｐＨ条件によって損傷を受ける可能性がある。これらの方法の別の不利な点は、活性化多糖が、異なる割合でシアン酸エステルとイミドカーボネート構造の両者を含有するということである。シアン酸エステル基は、高いｐＨで加水分解されるが、イミドカーボネートは、より酸性のｐＨでの加水分解で不活性なカーボネートを形成する。（Victor Moraisら; Bioengineering (Basel). 2022 Dec; 9(12): 774）。
【0024】
あるいは、ＣＤＡＰは、タンパク質－多糖結合型ワクチン（シンフロリックス、PNEUMOSIL（登録商標））で利用されており、可溶性多糖の活性化のためにシアニル化剤として使用されている。ＣＤＡＰは、ＣＮＢｒと比較して使用しやすく、多糖をＣＮＢｒよりも低いｐＨで、より少ない副反応で活性化できるという利点を有する。ＣＮＢｒとは異なり、ＣＤＡＰで活性化した多糖は、タンパク質と直接結合でき、より単純な方法となる。さらに、ＣＤＡＰで活性化した多糖は、ジアミン又はジヒドラジドで官能化してアミノ又はヒドラジドで誘導体化した多糖を作ることができる。
【0025】
ワクチン製剤は、長期保存の必要性と複数回用量容器の使用に適応するために、一般に安定で、均一な一貫性でなくてはならない。多糖－タンパク質結合体を含むタンパク質をベースとしたワクチンは、タンパク質凝集及び沈殿を受け、その結果、沈殿したタンパク質生成物が利用できないためにワクチンの有効総濃度が低くなる可能性がある。多糖－タンパク質結合型ワクチンは、特に、キャリアタンパク質単独よりも凝集する傾向が強いように思われる（Bertiら, 2004, Biophys J 86:3-9を参照されたい）。多糖－タンパク質結合体の製造の間、製剤は、多糖－多糖型、タンパク質－タンパク質型又は多糖－タンパク質型の凝集体を含む可能性がある。そのような凝集体は、最終製品でも観察され、多糖－タンパク質結合型ワクチンの充填されたバイアルの４％～１０％が不合格となり、そのため結合型ワクチンの安定性及び有効性に影響する。
【0026】
さらに、結合時及び保存中の結合していない又は「遊離の」糖のレベルは、多糖－キャリアタンパク質ワクチンにとって決定的な安定性の属性であると考えられ、ワクチンの有効性に大きな影響を及ぼす。結合していない／遊離の多糖は、結合体の不完全な精製又は最終生成物の不安定性のために生じる場合がある。遊離の多糖、遊離のキャリアタンパク質、多糖のO-アセチル化率及び多糖の分子サイズは、安定性を示す重要なパラメーターであり、ワクチンの質及び免疫原性に影響を及ぼし、最適化されるべきである。
【0027】
肺炎球菌の血清型の全てが等しく流行しているわけではないため、効果的な肺炎球菌結合型ワクチンは、肺炎球菌疾患に最も一般的に関連する血清型を含有する必要がある。血清型の置きかわり株の中での抗生物質抵抗性の増加及び結合型ワクチンの実施後の保菌と感染分離株の両者における血清型の置きかわりの発生は、肺炎球菌に対する適用範囲のより広い肺炎球菌ワクチンの必要性を与えている。
【0028】
各血清型は個別にキャリアタンパク質と結合しなければならないため、ワクチン血清型の数は一般に制限され、キャリアが誘導する耐性を制御するためにキャリアタンパク質の総用量を制限することへの懸念がある。これは、キャリアタンパク質に対する免疫応答を高める場合があり、それが全身性の過負荷を引き起こし、特定の血清型に対する免疫応答を低下させる可能性がある。他の制限には、より多くの結合した多糖が含まれる場合に、投与に必要なワクチン用量の容量が含まれる場合があり、それはワクチンの購入のしやすさにも影響を及ぼす可能性がある。したがって、多価ワクチンの開発の間、既存及び追加の血清型に対する免疫刺激を拡大し、従来の確立された結合方法に関与する全ての要因に取り組むことが重要である。血清型の数の増加に対する好適な防御を提供するのに加えて、血清型の数の増加にもかかわらず、キャリアタンパク質抗体を減少させる方法を開発する必要もある。
【0029】
出願人は、安定で免疫原性の多糖－タンパク質結合体を調製することが難題であることをこの明細書で強調する。多価結合型ワクチンは、再現可能に作り、特性を明らかにすることが非常に難しく、それが使用できる前に多くのリリース試験を必要とする。多糖抗原の物理化学的特性、多糖の断片化／サイジングの方法、サイジング後の多糖の回収、多糖の長さ／分子量、キャリアタンパク質に対する多糖比と使用する結合化学の種類、結合効率、各血清型に対する最適化吸着（ともに吸着される血清型の特定の組合せ）、凝集体を含まない製剤（賦形剤の種類、ポリソルベートの種類／濃度、アラムアジュバントの種類／濃度）、保存時の安定性（結合体重量、遊離の多糖の割合、遊離のタンパク質の割合）、これら全てが各多糖－キャリアタンパク質結合型ワクチンの構造と免疫応答の両者に影響を及ぼし、その上、各多糖－タンパク質結合体の製造方法と安定性は異なり、ある結合体から別の結合体を推定できないことを、出願人は見いだした。多糖抗原が結合する部位もワクチンの免疫原性に影響を及ぼす可能性がある。さらに、多価結合型ワクチンにおいて、単一の製剤中の異なる結合体の動的相互作用が、わずかな血清型の免疫応答をマスキング又は増強する可能性がある。免疫原性エピトープを確実に維持するために、精製、サイジング、結合及び調合段階にわたる多糖構造の完全性の維持も必須条件である。
【0030】
したがって、最適製造方法及び製剤を利用することによって製造され、最大数の肺炎球菌の血清型に対する防御が可能で、キャリアタンパク質が誘導する免疫抑制が低減された、高度に安定な、免疫原性が改善された、地球全体で入手／流通するのに手頃でもある、多価肺炎球菌結合型ワクチンに対する緊急の満たされていないニーズが未だに存在する。
【0031】
目的
本明細書における少なくとも一つの態様が満たすこの開示の目的のいくつかは、以下のとおりである。
本明細書における少なくとも一つの態様が満たすこの開示の目的のいくつかは、以下のとおりである。
【0032】
この開示の目的は、従来技術の１つ以上の問題を改善すること又は少なくとも有用な代替物を提供することである。
【0033】
この開示の別の目的は、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
【0034】
この開示の更に別の目的は、吸着が改善された多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
【0035】
この開示の更に別の目的は、ＣＤＡＰを利用することによって調製された、３種類のキャリアタンパク質（ＤＴ、ＴＴ、ＣＲＭ１９７）を含む結合体を有する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物（好ましくは２０価又は２１価）を製造する方法であって、ここで、血清型４及び２４Ｆからの多糖は個別にＤＴと結合され；血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆからの多糖は個別にＴＴと結合され；血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆからの多糖は個別にＣＲＭ１９７と結合する方法を提供することである。
【0036】
この開示の更に別の目的は、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法であって、ここで、全てのＣＲＭ１９７及びＤＴをベースとした結合体は、シアニル化化学を利用した直接結合の手法を使用して、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）で活性化することによって調製される方法を提供することである。
【0037】
この開示の別の目的は、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法であって、ここで、全てのＴＴをベースとした結合体は、最初にＡＤＨで誘導体化したＴＴ（ＥＤＡＣの存在下）を調製し続いてそれをＣＤＡＰで活性化した多糖と結合することによって得られる方法を提供することである。
【0038】
この開示の更に別の目的は、高い結合効率を有する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
【0039】
この開示の別の目的は、高い多糖回収率を有する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法を提供することである。
【0040】
この開示の更に別の目的は、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造する方法であって、ここで、多糖の構造的完全性は、（化学的サイジングに対して）高圧ホモジナイゼーションを利用することによって維持される方法を提供することである。
【0041】
この開示の更に別の目的は、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0042】
この開示の別の目的は、２つ以上のキャリアタンパク質が結合した肺炎球菌多糖を含む多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0043】
この開示の更に別の目的は、最も流行している肺炎球菌の血清型に対する防御を誘発する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0044】
この開示の更なる目的は、改善された免疫原性を有する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0045】
この開示の更に別の目的は、肺炎球菌の血清型の交差反応性を誘発する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0046】
この開示の更に別の目的は、凝集体がなく、広い温度範囲で長期間安定な多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0047】
この開示の別の目的は、アラムゲルの量を増加させ、最適な吸着をもたらし、それによりＢ細胞を介したＩｇＧ抗体応答が高まる、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0048】
この開示の更に別の目的は、凝集体を含まない組成物及び流動性を改善する多くのポリソルベート２０（Tween（登録商標）20）を有する多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0049】
この開示の別の目的は、血清型４（１００～２００ｋＤａ）、血清型２４Ｆ（１００～２００ｋＤａ）、血清型３（１００～２００ｋＤａ）、血清型６Ａ（４００～９００ｋＤａ）、血清型６Ｂ（１００～２００ｋＤａ）、血清型９Ｖ（１００～２００ｋＤａ）、血清型１５Ｂ（１００～２００ｋＤａ）、血清型１９Ａ（１００～２００ｋＤａ）、血清型２２Ｆ（１００～２００ｋＤａ）のサイジング後の多糖の分子量が最適であり、それらによるそれぞれの多糖－タンパク質結合体が（これらの多糖がＣＲＭ１９７と結合した場合と比較して）改善された免疫原性を確実にする、多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0050】
この開示の更に別の目的は、遊離の多糖の含有量が最小限である多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を提供することである。
【0051】
この開示の他の目的及び利点は、以下の説明からより明らかであり、それは、この開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【発明の概要】
【0052】
出願人は、１）アラムへの吸着が低いことは、ワクチン製剤が保存されているときにそれぞれの結合抗原が経時的に分解するリスクにあることが予想され、したがって、肺炎球菌の血清型４、６Ｂ、７Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２２Ｆでは、アラムゲルの量を１用量あたり１２５μｇから１８７．５μｇに増加すると、吸着の改善をもたらし（全ての血清型で少なくとも３０％）（血清型１、２、３、５、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆでは少なくとも８０％）、それによりＢ細胞を介したＩｇＧ抗体応答が高まること（少なくとも２倍高いＩｇＧ）；２）多価肺炎球菌結合型ワクチンにおける多くのポリソルベート２０は、凝集体を含まない製剤、改善された流動性をもたらすこと（特に、添加される抗原の数が多くなりゲル含有量が増加した場合）；３）ＣＤＡＰを利用することによって調製された、３種類のキャリアタンパク質（ＤＴ、ＴＴ、ＣＲＭ１９７）を含む結合体を有する、新規の改善された、安定で免疫原性の多価多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物（好ましくは２０価又は２１価）であって、ここで、血清型４及び２４Ｆは個別にＤＴと結合され；血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆは個別にＴＴと結合され、血清型（１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ）からの残りの多糖は個別にＣＲＭ１９７と結合される、ワクチン組成物；４）全てのＣＲＭ１９７及びＤＴをベースとした結合体が、シアニル化化学を利用した直接結合の手法を使用して、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）で活性化することによって調製され、一方で全てのＴＴをベースとした結合体が、最初にＡＤＨで誘導体化したＴＴ（ＥＤＡＣの存在下）を調製し続いてそれをＣＤＡＰで活性化した多糖と結合することによって得られること；５）血清型４のサイジング後の多糖の最適な分子量は１３０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型２４Ｆは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型３は１４０ｋＤａ～１８０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型６Ａは４００ｋＤａ～９００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型６Ｂは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型９Ｖは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型１５Ｂは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型１９Ａは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、２２Ｆは１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ））であり、血清型４の多糖－タンパク質結合体の最適な分子量が３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型２４Ｆが１５００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型３が３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型６Ａが７０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型６Ｂが４０００ｋＤａ～１５０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型９Ｖが１５０００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型１５Ｂが６０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型１９Ａが５０００ｋＤａ～８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型２２Ｆが９０００ｋＤａ～１８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）であり、それらにより改善された免疫原性を確実にすること（これらの多糖をＣＲＭ１９７と結合したときと比較して）；６）高い結合効率（血清型４及び２４Ｆでは４０％～４５％、血清型３では３０％～３５％、血清型６Ａでは４０％～４５％、血清型９Ｖでは２５％～３０％、血清型１５Ｂでは４５％～５５％、血清型１９Ａでは３０％～３５％、血清型２２Ｆでは４０％～４５％）；７）結合体の最適な吸着（少なくとも３０％）；８）全ての結合体で遊離の多糖の含有量１５％未満及び遊離のタンパク質（１０％未満）；及び９）高い多糖回収率と、（化学的サイジングに対して）高圧ホモジナイゼーションを利用することによって維持される構造的完全性を見いだした。
【0053】
さらに、ワクチン組成物は、２ブレンド法を使用して製造されており、ここで、血清型のいくつかは第１のセットとして個別に吸着され、残りの血清型は第２のセットとしてともに吸着され、続いて両者のセットを混合してワクチン組成物が得られる。
【0054】
次に、この開示を図面を使用して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【発明を実施するための形態】
【0056】
詳細な説明
この開示は、異なる態様に影響されやすい可能性があるが、この開示が、この開示の原理の例示と考えることができ、開示の範囲を、本明細書に例証され開示されるものに限定することを意図するものではないという理解とともに、いくつかの態様が図面及び以下の詳細な議論に示される。
この開示は、異なる態様に影響されやすい可能性があるが、この開示が、この開示の原理の例示と考えることができ、開示の範囲を、本明細書に例証され開示されるものに限定することを意図するものではないという理解とともに、いくつかの態様が図面及び以下の詳細な議論に示される。
【0057】
態様は、この開示の範囲を当業者に徹底的にかつ十分に伝えるように提供される。この開示の態様の完全な理解を提供するために、具体的な成分及び方法に関連する、数多くの詳細が記載される。態様で提供される詳細は、この開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは、当業者には明らかであろう。いくつかの態様では、周知の組成物、周知の方法、及び周知の技術は、詳細には説明されない。
【0058】
この開示における使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的のためだけであり、そのような専門用語は、この開示の範囲を限定するものと考えない。この明細書では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という形式は、文脈がそうでないことを明らかに示唆しない限り、複数形も同様に含むことが意図されてもよい。
【0059】
「含む、含有する（comprise、comprising、including）」及び「有する」は、オープンエンドの移行句であり、したがって、述べられた特徴、整数、工程、操作、要素、モジュール、単位及び／又は成分の存在を明記するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、成分及び／又はそれらの群の存在又は追加を禁じない。この開示の方法において開示される工程の特定の順番は、必ずしも記載又は例証されるとおりにそれらが実行される必要があると解釈されない。追加の又は代わりの工程を利用してもよいことも理解されたい。
【0060】
第１、第２、第３などの用語は、前述の用語が、１つの要素、成分、領域、層又は区画を別の成分、領域、層又は区画と区別するためにのみ使用してもよいため、この開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。第１、第２、第３などのような用語は、この明細書では、この開示によって明らかに示唆されない限り、具体的な順序又は順番を暗示しない。
【0061】
本明細書に記載される各特徴若しくは態様、又は組合せは、本発明の任意の側面の非限定的な説明的な例であり、そのようなものとして、本明細書に記載される任意の他の特徴若しくは態様、又は組合せと、組み合わせることができることを意味することが理解される。例えば、特徴が「一つの態様」、「いくつかの態様」、「ある態様」、「別の態様」、「具体的な代表的な態様」及び／又は「別の態様」のような言語によって説明される場合、これらの種類の態様のそれぞれは、本明細書に記載される任意の他の特徴又は特徴の組合せと組み合わせることが意図される特徴の非限定的な例であり、全ての可能な組合せを列挙する必要はない。そのような特徴又は特徴の組合せは、本発明の任意の側面に適用される。
【0062】
定義
この開示がより容易に理解されるために、いくつかの用語が初めに下記に定義される。以下の用語及び他の用語に関する追加の定義は、本明細書を通して記載されてもよい。
この開示がより容易に理解されるために、いくつかの用語が初めに下記に定義される。以下の用語及び他の用語に関する追加の定義は、本明細書を通して記載されてもよい。
【0063】
本明細書では、この開示を通して述べられる「血清型」は、別段に指示されない限り、肺炎球菌の血清型を指す。
【0064】
本明細書では、「多糖」は、肺炎球菌の血清型：１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８の細胞壁の外側にあるが隣接している多糖／糖類／糖／炭水化物を指す。
【0065】
本明細書では、「キャリアタンパク質」は、通常、免疫系による抗原の検出を増強又は促進する目的のために多糖と結合されたタンパク質を指す。この開示の組成物は、２つ以上の肺炎球菌多糖結合体を含み、各結合体は、肺炎球菌の異なる血清型の多糖と結合したキャリアタンパク質を含む。
【0066】
本明細書では、「結合体」又は「多糖－キャリアタンパク質結合体」は、ＣＤＡＰ結合化学を使用したキャリアタンパク質と結合した肺炎球菌多糖を指す。
【0067】
本明細書では、「分子量」は、重量平均分子量を指し、これはＨＰＬＣ－ＲＩ又はＨＰＬＣ－ＵＶ／ＲＩ又はＨＰＳＥＣ－ＵＶ／ＲＩ／ＭＡＬＳのいずれかによって推定される多糖の分子サイズの尺度である。肺炎球菌多糖の場合、分子量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算される。ＳＥＣ－ＨＰ－ＲＩ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣという用語は、本明細書を通して互換的に使用される。肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の場合、「分子量」又は「分子サイズ」は、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）と組み合わせた高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算される。
【0068】
本明細書では、「ワクチン組成物」は、少なくとも１種の肺炎球菌の血清型に対する活性な獲得免疫を提供する生物学的製剤を指し、「ワクチン」という用語と互換的に使用できる。
【0069】
本明細書では、この開示に記載される「有効量」は、組成物が投与される対象において免疫応答を誘発するのに必要とされる量を指す。免疫応答は、続く負荷の間に肺炎球菌の感染の可能性又は重症度を著しく減少させる、１つ以上の肺炎球菌抗原特異的抗体の宿主における存在によって特徴付けられる。
【0070】
本明細書では、「用量」は、この開示のワクチン組成物の１回／単回投与を指し、特に言及しない限り、通常０．５ｍｌである。
【0071】
本明細書では、「対象」は、マウス、ウサギ及びヒトを含む哺乳動物を指す。いくつかの態様では、対象は、成人、青少年又は乳児である。いくつかの態様では、「個体」又は「患者」という用語が使用され、「対象」と互換的であることが意図される。
【0072】
本明細書では、「ポリソルベート２０」及び「tween（登録商標）20」という用語は、本明細書を通して互換的に使用されている。
【0073】
この開示は、２ブレンド法を使用したワクチン組成物を製造するための方法を想定している。肺炎球菌多糖は、個別にキャリアタンパク質と結合され、シアニル化結合化学を使用して製造されてワクチン組成物に最適な免疫原性及び安定性を提供する。２種類以上のキャリアタンパク質がワクチン組成物に使用される。この開示は、肺炎球菌疾患を予防及び／又は治療することが可能な肺炎球菌多糖を含むワクチン組成物を更に想定している。
【0074】
この開示の側面では、安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物を製造するための方法が提供される。この方法は、肺炎球菌多糖を特定のキャリアタンパク質と個別に結合することを含む。得られた肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体は、ヒスチジン及びＮａＣｌと混合され、続いて特定の得られた肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２つの別々のブレンドとしてコハク酸塩の存在下アルミニウム塩アジュバントに吸着させる。２つのブレンドはその後混合されてこの開示のワクチン組成物を得る。この方法は、以下の段落で詳細に説明される。
【0075】
この開示の態様では、ワクチン組成物を製造するための方法は、
i. １、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する肺炎球菌多糖をキャリアタンパク質に、１：０．５～１：１．５の比率、ｐＨ８．０～１０で、個別に結合させて、多糖－キャリアタンパク質結合体を得る工程；
ii. 工程（ｉ）で得た、４、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質結合体の第１のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１８時間～３０時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；
iii. 工程（ｉ）で得た、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆを含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１２時間～２４時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；並びに、
iv. 工程（ｉｉ）で得た第１のセットと、工程（ｉｉｉ）で得た第２のセットを、組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの界面活性剤の存在下、ラシュトンタービンフラットブレードインペラを使用して、４℃～１２℃で５０時間～８０時間混合する工程を含む。
i. １、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する肺炎球菌多糖をキャリアタンパク質に、１：０．５～１：１．５の比率、ｐＨ８．０～１０で、個別に結合させて、多糖－キャリアタンパク質結合体を得る工程；
ii. 工程（ｉ）で得た、４、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質結合体の第１のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１８時間～３０時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；
iii. 工程（ｉ）で得た、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ｆを含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する多糖を含む肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットを、塩、ヒスチジン及びコハク酸の存在下、１８℃～３０℃、ｐＨ５．０～７．０で、１２時間～２４時間かけて、アルミニウム塩アジュバントに吸着させる工程；並びに、
iv. 工程（ｉｉ）で得た第１のセットと、工程（ｉｉｉ）で得た第２のセットを、組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの界面活性剤の存在下、ラシュトンタービンフラットブレードインペラを使用して、４℃～１２℃で５０時間～８０時間混合する工程を含む。
【0076】
この開示の態様では、肺炎球菌多糖は、シアニル化反応によりキャリアタンパク質と結合させ、ワクチン組成物は少なくとも３つの異なるキャリアタンパク質を含む。
【0077】
この開示の態様によれば、ワクチン組成物は、ｉ） アルミニウム塩アジュバントの総濃度が組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋２０～３７５μｇである、ｉｉ） 各多糖－キャリアタンパク質の吸着率が少なくとも３０％である、ｉｉｉ） 多糖－キャリアタンパク質結合体が望ましい物理化学的特性及び免疫原性を維持する、並びに、ｉｖ） 組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１５０μｇの界面活性剤が、凝集及び粒子形成を最小限にし、ワクチン組成物の流動性を改善する、ことを含む。
【0078】
別の態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む。
【0079】
好ましい態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、１、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆからなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む。
【0080】
ある態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び３３Ｆからなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む。
【0081】
ある態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、１、２、３、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆからなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む。
【0082】
ある態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆからなる群から選択される血清型に由来する肺炎球菌多糖を含む。
【0083】
別の態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、血清型９Ａ、９Ｎ及び９Ｌに由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を含む。
【0084】
更に別の態様では、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の第２のセットは、血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まない。
【0085】
この開示のワクチン組成物の肺炎球菌多糖は、既知の方法を使用して肺炎球菌から抽出される。肺炎球菌の血清型の発酵、精製、サイジングは、786/MUM/2007、1075/MUM/2009、282/MUM/2012、国際公開第2012/127485号、国際公開第2013/088448号、2889/MUM/2014、IN201623002962、国際公開第2016/199003号、IN201921036006又は国際公開第2021/229604号に開示されている方法のとおりに行ってもよい。簡潔に説明すると、肺炎球菌多糖は、個々の肺炎球菌の血清型を０～０．５ｖｖｍの空気流量で５０～１５０ＲＰＭで撹拌しながら、ｐＨ７～８、３５～３８℃の培地中で増殖させることによって得られる。得られた回収物を濃縮し、透析ろ過し、通常、続いて酵素処理及び化学処理を行って多糖を抽出する。続いて遠心分離及び不純物の除去のための１つ以上のクロマトグラフィー工程が行われ、更に透析ろ過して精製された天然の多糖を得る。
【0086】
ある態様では、上記で得られた肺炎球菌の血清型の清澄化された発酵ブロスを濃縮し、透析ろ過する（１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜；中性ｐＨの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に続く、注入用水（ＷＦＩ）を用いた透析ろ過）。多糖を含有する濃縮し透析ろ過したブロスを撹拌しながら３７℃で１０±２時間酵素処理（ヌクレアーゼ）する。酵素処理した多糖溶液を硫酸アンモニウムのような化学薬品で処理し、遠心分離し、続いて透析ろ過する。多糖を含有する透析ろ過した溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムにかけ、続いて濃縮し、透析ろ過する。続いてイオン交換クロマトグラフィーカラムを必要とする別のクロマトグラフィー工程が行われる。カラム上の多糖を塩（ＮａＣｌ）を使用して溶出する（さまざまな多糖を異なるイオン強度の塩で溶出した）。その後、多糖溶液を濃縮し、透析ろ過する。透析ろ過した多糖溶液を更にろ過し、更に使用するまで凍結保存する。
【0087】
ある態様では、この開示の方法は、多糖の精製の間、マルチモーダルクロマトグラフィー工程がない。
【0088】
別の態様では、この開示の方法は、多糖の精製の間、綿状沈殿工程（アルミニウム、鉄、カルシウム及びマグネシウムからなる群から選択される多価カチオン）がない。
【0089】
多糖を調製するために使用される細菌株は、Centers for Disease Control and Prevention（CDC）, Atlanta, ＵＳＡ；ＣＢＥＲ／ＦＤＡ、ＵＳＡ；ＡＴＣＣ、ＵＳＡ；ＮＩＨ、ＵＳＡ；ＮＩＡＩＤ、ＵＳＡ；ＰＨＥ、ＵＫなどのような、確立された培養収集センター（culture collection center）から入手してもよい。同様に、この開示で使用するキャリアタンパク質は、確立された供給源から調達してもよい。
【0090】
この開示の態様によれば、（ｉ）肺炎球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆは、Centers for Disease Control and Prevention（CDC）, Atlanta, USAから入手し；（ｉｉ）肺炎球菌の血清型２４Ｆは、Kempegowda Institute of Medical Sciences（KIMS）, Bangalore, Indiaから入手し；（ｉｉｉ）蛍光菌（ＣＲＭ１９７に関する）は、Pfenex Inc, USAから入手し；（ｉｖ）ジフテリアトキソイド（ＤＴ）に関するジフテリア菌（ＣＮ２０００株）は、National Control Authority Central Research Institute（C.R.I.）Kasauli, HP, IndiaがWellcome Research Laboratory, London, UKから入手し、この菌株は１９７３年にSerum Institute of India Private Limitedが提供し；（ｖ）破傷風菌（Harvard49205）は、National Control Authority Central Research Institute（C.R.I.）, Kasauli, HP, IndiaがNetherlands Vaccine Institute （NVI）から入手し、この菌株は１９７３年にSerum Institute of India Private Limitedが提供した。
【0091】
この開示の態様によれば、精製された多糖中の総窒素含有量（％）は、既知の方法を使用して決定／測定される。総窒素含有量は、ＴＯＣ ＴＮＭ技術、ケルダール法、ＣＨＮＳ法、ＮＭＲ、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ又は任意の他の方法を使用して決定／測定してもよい。好ましい態様では、総窒素含有量は、ＴＯＣ ＴＮＭ技術を使用して決定／測定してもよい。
【0092】
ある態様では、抽出及び精製された肺炎球菌多糖は、天然の形態で使用される。
【0093】
別の態様では、抽出及び精製された肺炎球菌多糖は、肺炎球菌多糖の１以上部を得るためにサイジングされる。サイジング後の多糖の分子量は、抽出及び精製された天然の形態の肺炎球菌多糖の分子量未満である。
【0094】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖は、それぞれのキャリアタンパク質との結合の前に、熱処理、音波処理、機械的手段、化学的加水分解、エンドライシス的酵素処理、物理的剪断、ガウリンホモジナイザー及び超音波処理の１つ以上を使用してサイジングされ、分子量が、５０ｋＤａ～６００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である、サイジング後の肺炎球菌多糖を得る。好ましい態様では、サイジング後の肺炎球菌多糖の分子量は、１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。ある態様では、サイジングは、ＦｅＣｌ３、Ｈ２Ｏ２、メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム処理の１つ以上を使用した化学的加水分解を使用して行う。
【0095】
部分的にサイズが縮小された多糖から調製された結合体の結合効率／結合体収率、免疫原性は、全長（天然）の多糖から調製された結合体と比較して高いことが理解できる。また、多糖のサイズ縮小は、溶液の粘度を減少させ、反応性末端基の数を増加させ、共有結合形成の頻度の増加に寄与する。
【0096】
ある態様では、サイジングは、高圧ホモジナイザーを使用した機械的手段を使用して行う。ある態様では、サイジングは、２０～３０ＫＰＳＩ（キロポンド／平方インチ）、好ましくは２４～３０ＫＰＳＩで、少なくとも１回のパスで行う。別の態様では、望ましい分子量のサイジング後の多糖を得るために、１～３回のパスが使用される。更に別の態様では、望ましい分子量のサイジング後の多糖を得るために、３回を超えるパスも使用してもよい。ＫＰＳＩは、多糖が由来する肺炎球菌の血清型に応じて変動してもよい。この開示の態様によれば、高圧ホモジナイゼーションが多糖のサイジングに使用されるとき、化学的サイジング法が多糖のサイジングに使用されるときと比較して、高い多糖回収率及び多糖の構造的完全性の維持が観察される。
【0097】
別の態様では、肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質との結合の前にサイジングされない。ある態様では、血清型６Ａに由来する多糖は、キャリアタンパク質との結合の前にサイジングされない。ある態様では、血清型６Ａに由来する多糖は、天然の形態で使用され、分子量が４００ｋＤａ～９００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは７００ｋＤａ～８００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0098】
ある態様では、サイジング後の血清型４に由来する多糖の分子量は１３０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１６５ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0099】
ある態様では、サイジング後の血清型３に由来する多糖の分子量は１４０ｋＤａ～１８０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１５０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0100】
ある態様では、サイジング後の血清型２４Ｆに由来する多糖の分子量は１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１２０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、より好ましくは１３０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0101】
ある態様では、サイジング後の血清型６Ｂに由来する多糖の分子量は１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１１０ｋＤａ～１７５ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、より好ましくは１３０ｋＤａ～１６０ｋＤａである。
【0102】
ある態様では、サイジング後の血清型９Ｖに由来する多糖の分子量は１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0103】
ある態様では、サイジング後の血清型１５Ｂに由来する多糖の分子量は１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0104】
ある態様では、サイジング後の血清型１９Ａに由来する多糖の分子量は１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１３０ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0105】
ある態様では、サイジング後の血清型２２Ｆに由来する多糖の分子量は１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１２０ｋＤａ～１４０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0106】
別の態様では、肺炎球菌の血清型２４Ｆに由来する多糖は、高圧ホモジナイザーを使用してサイジングされる。ある態様では、肺炎球菌の血清型２４Ｆに由来する多糖は、酸加水分解（酢酸、ＨＣｌ、リン酸、クエン酸又は混合物）を使用してサイジングされない。
【0107】
別の態様では、肺炎球菌の血清型６Ｂに由来する天然の多糖の分子量は、２００ｋＤａ超（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）であり、ホモジナイザーを使用してサイズ縮小した後は２００ｋＤａ未満（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。更に別の態様では、この開示のワクチン組成物は、分子量が５００～１８００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である肺炎球菌の血清型６Ｂに由来する多糖を含まない。
【0108】
この開示の態様では、肺炎球菌の血清型に由来する多糖は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してサイジングされ、分子量が１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）であるサイジング後の多糖を得る。
【0109】
ある態様では、肺炎球菌の血清型１８Ｃに由来する多糖のO-アセチル化は８０％を超える。
【0110】
この開示の態様によれば、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム及びそれらの組合せを含む群から選択され、ワクチン組成物における塩の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２ｍｇ～１０ｍｇである。ある態様では、塩は、塩化ナトリウムである。好ましい態様では、ワクチン組成物における塩の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり４．５ｍｇである。
【0111】
別の態様では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のヒスチジンは、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇである。更に別の態様では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のコハク酸は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．１ｍｇ～１０ｍｇである。好ましくは、多価結合型ワクチンの最終製剤のコハク酸の濃度は、２０ｍＭ（２．３６ｍｇ／ｍＬ）である。
【0112】
通常、工程（ｉｖ）の界面活性剤は、ポリソルベート、ポリマーグリコール、ソルビタンエステル及びそれらの組合せを含む群から選択され、界面活性剤の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり９０μｇ～１２０μｇである。好ましい態様では、工程（ｉｖ）の界面活性剤は、ポリソルベート２０であり、ポリソルベート２０の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり８０μｇ～１２０μｇである。
【0113】
ある態様では、肺炎球菌多糖は、カルボジイミド、還元的アミノ化又はシアニル化結合反応によりキャリアタンパク質と個別に結合される。
【0114】
多糖は、異なる手法を使用してそれぞれのキャリアタンパク質と結合できる。多糖との化学的連結に最も適したアミノ酸残基は、キャリアタンパク質表面に露出し、その側鎖がリジンの第１級アミノ基及びグルタミン酸又はアスパラギン酸残基のカルボン酸基のような反応性官能基を有するものである。キャリアタンパク質のカルボキシル基は、カルボジイミドを介した縮合によって多糖のアミノ又はヒドラジド誘導体と結合でき；リジンアミノ基は、スクシンイミドエステル若しくはシアノエステル、スクアレートのような活性基を含有するそれらの誘導体との反応によって、又は直接的な還元的アミノ化によって多糖と結合できる。
【0115】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、髄膜炎菌外膜複合体、破傷風トキソイドフラグメントＣ、８アミノ酸変異を伴う組換え全長破傷風毒素（８ＭＴＴ）、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌プロテインＤ、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、ｆＨｂｐ、Ｐｏｒ Ａ、Ｐｏｒ Ｂ、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ－３及びＢＶＨ－１１、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ｕｓｐＡ、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）並びに無毒化浮腫因子（ＥＦ）、及び致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、コレラ毒素サブユニットＢ、合成ペプチド、ヒートショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｎ１９などのさまざまな病原体抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル（C. difficile）及びＢ群連鎖球菌の毒素Ａ又はＢ、並びにそれらの等価物を含む群から選択される１つ以上のキャリアタンパク質と結合している。
【0116】
キャリアタンパク質は、選択された結合方法の標的となる十分な数の露出したアミノ酸を含有するべきであり、結合反応が起きる緩衝液及び濃度で安定で溶解性が良好であるべきである。
【0117】
ある態様では、この開示の方法は、３種類のキャリアタンパク質、すなわち、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）及びＣＲＭ１９７を使用する。肺炎球菌多糖を、個別にそれぞれのキャリアタンパク質と結合させる。
【0118】
この開示の好ましい態様では、３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としての破傷風トキソイドと結合させ、血清型４及び２４Ｆに由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としてのジフテリアトキソイドと結合させ、並びに、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合させる。
【0119】
この開示の態様では、血清型１９Ａ及び１９Ｆに由来する肺炎球菌多糖を、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ１９７から選択される同じ種類のキャリアタンパク質と個別に結合させる。
【0120】
この開示の態様では、血清型１９Ａ及び１９Ｆに由来する肺炎球菌多糖を、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ１９７から選択される異なる種類のキャリアタンパク質と個別に結合させる。
【0121】
免疫原性多糖－キャリアタンパク質結合体を生じるために一般に使用される２つの結合方法がある：（１）多糖とキャリアタンパク質の直接的な結合、及び（２）二官能性リンカー又はスペーサー試薬を介した多糖とキャリアタンパク質の非直接的な結合である。通常、直接的な結合方法と非直接的な結合方法の両者が、キャリアタンパク質との結合の前に炭水化物部分の化学的活性化を必要とする。
【0122】
通常、精製された多糖が、化学的に活性化／修飾されてキャリアタンパク質と結合／連結できる反応基を生成する。多糖活性化のために最も一般的に使用される方法の２つは、過ヨウ素酸酸化及びシアニル化である。過ヨウ素酸酸化では、酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸のようなペルヨーデート）を使用して多糖に存在する末端ヒドロキシル基がアルデヒドに酸化される。多糖の近接のヒドロキシル基が酸化剤によって切断され、その結果反応性アルデヒド基が形成される。
【0123】
多糖を活性化するためのペルヨーデートの使用に伴う起こる可能性のある重要な問題は、重要なエピトープが喪失する多糖の物理的構造の変化である。低レベルの活性化さえ、特定のエピトープを喪失させ、新しいエピトープを作り出す可能性があることが理解できる。
【0124】
シアニル化化学は、反応性シアノエステル基を多糖に作り出すことを含む。臭化シアン（ＣＮＢｒ）がシアニル化剤として当初は使用されていたが、シアニル化剤として1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）にほとんど置きかえられている。シアニル化化学は、John Robbins博士によって１９８０年に報告された最初のＨｉｂ結合体で使用された多糖に反応性シアノエステル基を作り出すために、当初はＣＮＢｒを利用した。
【0125】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、カルボジイミド化学、ＣＮＢｒ化学、及び還元的アミノ化化学からなる群から選択される結合反応／化学によりキャリアタンパク質と結合してもよい。
【0126】
この開示の態様では、好ましい結合反応は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）、ＣＤＡＰ－ｇｒｅｅｎ、1-シアノ-4-ピロリジノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＰＰＴ）、1-シアノ-イミダゾール（1-ＣＩ）、1-シアノベンゾトリアゾール（1-ＣＢＴ）、2-シアノピリダジン-3(2H)オン（2-ＣＰＯ）、それらの機能的誘導体及び修飾体からなる群から選択されるシアニル化試薬を使用して行う。
【0127】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖を、シアニル化反応によりキャリアタンパク質と結合させる。肺炎球菌多糖を、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）と反応させ、肺炎球菌多糖：ＣＤＡＰが１：０．３～１：２の重量比で、２２℃～２５℃で４分～１０分間混合し、このＣＤＡＰ活性化多糖を、ＣＤＡＰ活性化肺炎球菌多糖：キャリアタンパク質が１：０．５～１：１．５の重量比で混合したキャリアタンパク質と接触させて、ｐＨ８．０～１０で３時間～５時間反応を行い、続いてグリシンでクエンチして多糖－キャリアタンパク質結合体を得る。
【0128】
この開示の好ましい態様では、肺炎球菌多糖の活性化は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を使用して行う。ＣＤＡＰは、多糖と反応し、シアノ基を、多糖に豊富に見られるヒドロキシル水素と交換し、その結果シアノエステルを作り出す。このシアノエステルは反応性が高い。活性化は、通常ｐＨ９～１０で行い、実際、ＣＤＡＰ ＰＳ活性化効率には強いｐＨ依存性がある。その後、シアノエステルは、リジンのεアミンと反応し、安定なＯ－アルキル－イソ尿素連結を形成する。ＣＤＡＰ活性化は数分だけかかり、結合は数時間で完了する。その後、反応を、グリシンのようなアミノ含有試薬を使用してクエンチする。
【0129】
この開示の態様によれば、以下の血清型の多糖対ＣＤＡＰ（Ｐｓ：ＣＤＡＰ）比（wt/wt基準）は：血清型４－１：０．８；血清型２４Ｆ－１：１±０．２５；血清型３－１：０．３；血清型６Ａ－１：１；血清型９Ｖ－１：１；血清型１５Ｂ－１：１．２；血清型１９Ａ－１：１；及び血清型２２Ｆ－１：１である。
【0130】
この開示の態様によれば、以下の血清型の多糖対キャリアタンパク質（Ｐｓ：Ｐｒ）比（wt/wt基準）は：血清型４－１：０．９；血清型２４Ｆ－１：１±０．２５；血清型３－１：１；血清型６Ａ－１：１．２；血清型９Ｖ－１：１；血清型１５Ｂ－１：１；血清型１９Ａ－１：１；及び血清型２２Ｆ－１：１である。
【0131】
さらに、過ヨウ素酸ナトリウムは、ジオール（ヒドロキシル基を有する２つの隣接する炭素）をアルデヒド（ＲＨＣ＝Ｏ）へと酸化し、この過程でＣ－Ｃ結合を切断する。このように、多糖構造に応じて、ペルヨーデート活性化は、鎖内ジオールを含有する多糖を断片化（ダウンサイジング）又は単糖繰り返し単位の環構造を開くことができ、それにより高次構造が変化し、潜在的に多糖の免疫原性も変化する可能性がある。1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を使用したシアニル化化学は、多糖抗原のタンパク質との直接的な結合（スペーサーを使用しない）を可能にする。ＣＤＡＰは、多糖の遊離ＯＨ基と鎖切断を伴わずに反応し、タンパク質のアミノ基との反応性が高いシアノエステル基を作り出して共有結合的連結を形成する。これは、天然の多糖のエピトープのより良い維持も可能にし、ワクチン組成物の免疫原性に好影響を及ぼす。
【0132】
この開示は、結合前にＣＤＡＰをベースにした肺炎球菌多糖の活性化を使用し、したがって、還元的アミノ化及びＣＮＢｒをベースにした結合化学に関連する欠点を克服する。
【0133】
ある態様では、この開示の結合方法は、酢酸ナトリウムを使用した多糖の活性化、これに続く還元剤（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）を使用したキャリアタンパク質との結合を含まない。ある態様では、血清型２３Ｆに由来する多糖とキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７は、酢酸ナトリウムを使用した多糖の活性化、これに続く還元剤（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）を使用した結合に関与しない。
【0134】
ある態様では、この開示の方法は、多糖とキャリアタンパク質の結合のためのｅＴＥＣスペーサーの使用を含まない。ある態様では、結合の前に、キャリアタンパク質を、ヒドラジン、カルボヒドラジド、塩化ヒドラジン、ジヒドラジド、ε-アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、D-グルクロノラクトン、シスタミン及びpニトロフェニルエチルアミン、ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、1,6-ジアミノオキシヘキサン又はβ-プロピアミド、ニトロフェニルエチルアミン、ハロアルキルハライド、6-アミノカプロン酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるヘテロ又はホモ二官能性リンカーを介してアミノ及び／又はカルボキシル基を含むように誘導体化する。誘導体化は、カルボジイミド、還元的アミノ化又はシアニル化反応により行ってもよい。
【0135】
好ましい態様では、ヘテロ又はホモ二官能性リンカーは、ジヒドラジドである。代表的な態様では、ヘテロ又はホモ二官能性リンカーは、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。
【0136】
ヒドラジド基は、カルボジイミド、還元的アミノ化、シアニル化、反応、例えば、ヒドラジン、カルボヒドラジド、スクシニルジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、塩化ヒドラジン（例えば、ヒドラジン二塩酸塩）又は1-エチル-3(3ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドの存在下で任意の他のジヒドラジドを用いた反応により、タンパク質のアスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシル基を通してタンパク質に導入できる。ＥＤＣは、触媒として利用され、タンパク質反応物を、ヒドラジン又はジヒドラジドで活性化し、修飾する。
【0137】
ある態様では、肺炎球菌の血清型６Ａ、９Ｖ、１９Ａ、２２Ｆ、１５Ｂに由来する多糖をキャリアタンパク質としてのＴＴと独立して結合させる。ＴＴを、最初にＡＤＨを使用して（ＥＤＡＣの存在下で）誘導体化し、次いでＣＤＡＰを使用して活性化されたそれぞれの多糖と結合させる。
【0138】
別の態様では、肺炎球菌の血清型３に由来する多糖を、キャリアタンパク質としてのＴＴと独立して結合させる。
【0139】
ある態様では、肺炎球菌多糖をリンカーなしでキャリアタンパク質と結合させる。
【0140】
ある態様では、この開示のワクチン組成物の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体は、還元的アミノ化化学により調製されない。さらに、この開示によればワクチン組成物を製造するための方法は、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、二酸化ケイ素、酢酸、ＤＭＳＯ、酸化剤（ペルヨーデート、過ヨウ素酸ナトリウム又はメタペルヨーデート）及び水素化ホウ素ナトリウムのような試薬／化学薬品／酵素を使用しない。別の態様では、この開示の方法は、血清型１に由来する肺炎球菌に由来する多糖の精製のために重炭酸塩／炭酸塩緩衝液を使用しない。
【0141】
ある態様では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）のアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムカリウム並びにそれらの混合物を含む群から選択される。アルミニウム塩アジュバントの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋２０～３７５μｇである。好ましい態様では、アルミニウム塩アジュバントの総濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋１７０～２００μｇである。
【0142】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体は、遊離の多糖が１５％未満で、遊離のタンパク質が１０％未満である。
【0143】
ある態様では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の吸着は、保存剤の存在下で行う。保存剤の量はワクチン組成物０．５ｍｌあたり１ｍｇ～８ｍｇである。保存剤は、2-フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム（フェメロール）、フェノール、m-クレゾール、チオメルサール、ホルムアルデヒド、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-クロロ-m-クレゾール、ベンジルアルコール及びそれらの組合せを含む群から選択される。好ましい態様では、保存剤は、濃度がワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇの2-フェノキシエタノールであり、好ましくは０．５ｍｌあたり５ｍｇ以下である。この開示の代表的な態様では、2-フェノキシエタノールの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり４ｍｇである。
【0144】
この開示の別の側面では、少なくとも１つの肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む安定で免疫原性の多価肺炎球菌多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物が提供される。
【0145】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖は、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される肺炎球菌の血清型に由来する。
【0146】
この開示の態様によれば、組成物は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０価の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合型組成物である。
【0147】
この開示の態様では、血清型６Ａに由来する多糖以外の肺炎球菌多糖の分子量は、５０ｋＤａ～６００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、好ましくは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0148】
別の態様では、血清型６Ａに由来する肺炎球菌多糖の分子量は、４００ｋＤａ～９００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。
【0149】
この開示の別の態様では、ワクチン組成物に存在する各肺炎球菌多糖は、個別にキャリアタンパク質と結合している。
【0150】
この開示の態様によれば、肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、髄膜炎菌外膜複合体、破傷風トキソイドフラグメントＣ、８アミノ酸変異を伴う組換え全長破傷風毒素（８ＭＴＴ）、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、百日咳トキソイド、インフルエンザ菌プロテインＤ、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、ｆＨｂｐ、Ｐｏｒ Ａ、Ｐｏｒ Ｂ、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、肺炎球菌ＰｈｔＤ、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ－３及びＢＶＨ－１１、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）ｕｓｐＡ、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）並びに無毒化浮腫因子（ＥＦ）及び致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ａ群又はＢ群連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、コレラ毒素サブユニットＢ、合成ペプチド、ヒートショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｎ１９などのさまざまな病原体抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル（C. difficile）及びＢ群連鎖球菌の毒素Ａ又はＢ、並びにそれらの等価物を含む群から選択される１つ以上のキャリアタンパク質と結合している。
【0151】
この開示の態様によれば、各肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の分子量は、１５００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0152】
ある態様では、ワクチン組成物における６Ａ－ＴＴ結合体の分子量は、７０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは８０００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0153】
ある態様では、ワクチン組成物における４－ＤＴ結合体の分子量は、３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは３０００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0154】
ある態様では、ワクチン組成物における３－ＴＴ結合体の分子量は、３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは４０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0155】
ある態様では、ワクチン組成物における２４Ｆ－ＤＴ結合体の分子量は、１５００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２０００ｋＤａ～６０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0156】
ある態様では、ワクチン組成物における６Ｂ－ＣＲＭ１９７結合体の分子量は、４０００ｋＤａ～１５０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは５０００ｋＤａ～１２０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0157】
ある態様では、ワクチン組成物における９Ｖ－ＴＴ結合体の分子量は、１５０００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは２００００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0158】
ある態様では、ワクチン組成物における１５Ｂ－ＴＴ結合体の分子量は、６０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは７５００ｋＤａ～９０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0159】
ある態様では、ワクチン組成物における１９Ａ－ＴＴ結合体の分子量は、５０００ｋＤａ～８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは６０００ｋＤａ～７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0160】
通常、この開示のワクチン組成物における２２Ｆ－ＴＴ結合体の分子量は、１２５００ｋＤａ超（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。ある態様では、ワクチン組成物における２２Ｆ－ＴＴ結合体の分子量は、９０００ｋＤａ～１８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、好ましくは１００００ｋＤａ～１７０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）である。
【0161】
この開示のワクチン組成物は、特定の肺炎球菌多糖と個別に結合した２種類以上のキャリアタンパク質の使用を含む。
【0162】
同じキャリアタンパク質を含有する結合型ワクチンが、多糖に対する免疫応答の抑制に関連することが知られている。これは、（ｉ）キャリアタンパク質上のエピトープに特異的な表面免疫グロブリンを有するＢ細胞と、多糖に特異的なＢ細胞との間の抗原捕捉及び提示の競合、（ｉｉ）遊離のタンパク質キャリアによる結合型ワクチンの多糖特異的Ｂ細胞への結合の阻止、及び（ｉｉｉ）Ｂ細胞との多糖の結合を阻止するキャリアタンパク質の以前の注入によって誘導されたキャリア特異的Ｂ細胞の数の増大による多糖に対する応答の抑制によるものである可能性がある。
【0163】
この開示のワクチン組成物は、複数のキャリアタンパク質を使用し、それにより結合型ワクチン組成物における単一の種類のキャリアタンパク質の使用に関連する本明細書の上述の欠点を克服する。
【0164】
この開示の態様では、肺炎球菌多糖は、３種類のキャリアタンパク質と結合している。この開示の代表的な態様では、３種類のキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）及びＣＲＭ１９７である。
【0165】
この開示の態様によれば、少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合し、少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。
【0166】
この開示の態様によれば、少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合し、血清型４及び２４Ｆから選択される少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。
【0167】
この開示の態様によれば、少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも２つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合し、少なくとも１つの肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。
【0168】
この開示の別の態様では、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも３つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと結合し、１つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と結合している。
【0169】
この開示の更に別の態様では、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも４つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと結合し、１つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と結合している。
【0170】
この開示の態様では、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆから選択される少なくとも５つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと結合し、１つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と結合している。
【0171】
この開示の別の態様では、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆに由来する６つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと結合し、１つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と結合している。
【0172】
この開示の更に別の態様では、６つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと結合し、２つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と結合している。
【0173】
この開示の態様では、５つの肺炎球菌多糖は、ＴＴと独立して結合し、２つの肺炎球菌多糖は、ＤＴと独立して結合し、残りの肺炎球菌多糖は、ＣＲＭ１９７と独立して結合している。
【0174】
この開示の態様によれば、ＣＲＭ１９７と結合した肺炎球菌多糖は、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される。
【0175】
この開示の態様では、ＴＴと結合した肺炎球菌多糖は、１、３、５、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択される。
【0176】
この開示の別の態様では、ＤＴと結合した肺炎球菌多糖は、３、４、１５Ｂ及び２４Ｆを含む群から選択される。
【0177】
ある態様では、血清型１に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。
【0178】
ある態様では、血清型３に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。
【0179】
ある態様では、血清型９Ｖに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。
【0180】
ある態様では、血清型９Ａに由来する肺炎球菌多糖は、ＤＴ、ＴＴ及びＣＲＭ１９７から選択されるキャリアタンパク質と結合していてもよい。
【0181】
ある態様では、血清型９Ｌに由来する肺炎球菌多糖は、ＤＴ、ＴＴ及びＣＲＭ１９７から選択されるキャリアタンパク質と結合していてもよい。
【0182】
ある態様では、血清型９Ｎに由来する肺炎球菌多糖は、ＤＴ、ＴＴ及びＣＲＭ１９７から選択されるキャリアタンパク質と結合していてもよい。この開示の態様では、血清型４に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。ある態様では、血清型５に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。
【0183】
別の態様では、血清型１及び５に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と独立して結合し；血清型３に由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。
【0184】
更に別の態様では、ワクチン組成物は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と独立して結合した血清型１及び５に由来する肺炎球菌多糖を含み、血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まない。ある態様では、血清型６Ａに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。ある態様では、血清型９Ｖに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。ある態様では、血清型１５Ｂに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。ある態様では、血清型１８Ｃに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。ある態様では、血清型１９Ａに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している。ある態様では、血清型１９Ｆに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。ある態様では、血清型２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。この開示の態様では、３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ及び２２Ｆを含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としての破傷風トキソイドと結合し、血清型４及び２４Ｆに由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのジフテリアトキソイドと結合し、並びに、１、２、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８を含む群から選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。
【0185】
この開示のワクチン組成物は、肺炎球菌多糖のためのキャリアタンパク質としてのプロテインＤ、ＰｓａＡ、肺炎球菌表面タンパク質Ａ及びジフテリア毒素フラグメントを含まない。
【0186】
この開示の態様では、ワクチン組成物は、血清型２に由来する肺炎球菌多糖を含み；残りの肺炎球菌多糖は、１、３、４、５、６、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８からなる群から選択される血清型に由来する。
【0187】
この開示の態様では、ワクチン組成物は、血清型６Ａ及び６Ｂに由来する肺炎球菌多糖を含み、残りの肺炎球菌多糖は、１、２、３、４、５、６、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｆ、１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１３Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１６、１６Ａ、１６Ｆ、１７Ａ、１７Ｆ、１８、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、２７、２８Ａ、２８Ｆ、２９、３１、３２Ａ、３２Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄ、３５Ｆ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ａ、４１Ｆ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ａ、４７Ｆ及び４８からなる群から選択される血清型に由来する。
【0188】
この開示の態様では、血清型６Ａ及び６Ｂに由来する肺炎球菌多糖は、ともにキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。この開示の別の態様では、血清型６Ａに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合し、血清型６Ｂに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合している。
【0189】
この開示の態様によれば、本発明のワクチン組成物は、血清型６Ｃ、２０Ｂ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、３１、９Ａ、９Ｎ、９Ｌ、３５Ｂ、２３Ａ、２３Ｂ、１７Ｆ、２９、３４、３９に由来する肺炎球菌多糖を更に含んでもよい。
【0190】
この開示の態様によれば、ワクチン組成物は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０価の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合型組成物である。
【0191】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２０の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２０価の組成物である。
【0192】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２０の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２０価の組成物である。
【0193】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２０の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２０価の組成物である。
【0194】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２１の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２１価の組成物である。
【0195】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２１の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２１価の組成物である。
【0196】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する多糖を有する２２の異なる肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含む２２価の組成物である。
【0197】
この開示の態様によれば、ワクチン組成物は、肺炎球菌の各血清型の多糖を１．０μｇ～１０μｇ、好ましくは２．２μｇ～３．３μｇ含む。別の態様では、ワクチン組成物は、血清型６Ｂに由来する多糖を４．４μｇ～６．６μｇ含む。
【0198】
この開示のワクチン組成物は、界面活性剤、安定剤、緩衝剤、希釈剤、アジュバント、保存剤、塩及び溶媒から選択される薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0199】
ある態様では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムカリウムからなる群から選択されるアルミニウム塩アジュバントである。通常、アジュバントの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり１．１５ｍｇ以下である。ある態様では、アジュバントの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．５ｍｇ～１ｍｇである。この開示の態様によれば、アジュバントの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり１．１３ｍｇ以下である。好ましい態様では、アジュバントの濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり０．８４７ｍｇである。
【0200】
別の態様では、アジュバントは、ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋２０～３７５μｇを含む。
【0201】
ある態様では、アジュバントは、ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋１７０～２００μｇを含有するリン酸アルミニウムである。
【0202】
好ましい態様では、アジュバントは、ワクチン組成物０．５ｍｌあたりＡｌ３＋１８７．５μｇを含む。
【0203】
緩衝剤は、ヒスチジン、コハク酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、トリス－酢酸－エチレンジアミン四酢酸（ＴＡＥ）及び4-(2-ヒドロキシエチル)-1ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む群から選択される。緩衝剤の濃度は、０．１ｍｇ～１０ｍｇである。
【0204】
ある態様では、ワクチン組成物は、緩衝剤としてのヒスチジンを含む。
【0205】
別の態様では、ワクチン組成物は、緩衝剤としてのコハク酸塩を含む。
【0206】
更に別の態様では、ワクチン組成物は、緩衝剤としてのヒスチジン０．１ｍｇ～１０ｍｇ及びコハク酸塩０．１ｍｇ～１０ｍｇを含む。好ましい態様では、ワクチン組成物は、緩衝剤としてのヒスチジン１．５５ｍｇ及びコハク酸塩１．１８ｍｇを含む。
【0207】
界面活性剤は、ポリソルベート、ポリマーグリコール、ソルビタンエステル及びそれらの組合せを含む群から選択され、ワクチン組成物における界面活性剤の濃度は、８０μｇ～１２０μｇである。この開示の態様では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である（ポリソルベート８０ではない）。好ましい態様では、ワクチン組成物における界面活性剤の濃度は、１００μｇである。
【0208】
ポリソルベート２０のＨＬＢ（親水性－親油性バランス）値は１６．７であり、ポリソルベート８０のＨＬＢ値は１５である。ポリソルベート２０は、より親水性な性質である。ポリソルベート２０のＨＬＢ値１６．７は、比較的強い親水性の性質を与える。これは、製剤における粒子の湿潤特性を改善することにより、水性懸濁液及びエマルジョン系の良好な乳化剤及び安定剤としてのその特性を確実にする。したがって、アラム懸濁液をベースとしたワクチン製剤、特に肺炎球菌ワクチンを安定化させるのにより適している可能性がある。この側面は、アラムゲル及びヒスチジンのような他の賦形剤が存在する製剤において２２の１価の結合体が混合されるときに、より関連する。ポリソルベート２０は、多価肺炎球菌ワクチン製剤（ＰＣＶ２０及びＰＣＶ２１）にとってその安定性を確実にするのに有利であることが見いだされた。ポリソルベート２０は、界面が誘導するストレスによって引き起こされる凝集からワクチン製剤を保護する。そのようなストレス（空気／液体又は液体から表面／容器）は、製造段階中に生じており、望ましくない吸着、凝集又は沈殿につながる可能性がある。
【0209】
ポリソルベート８０は、ワクチン組成物において界面活性剤として使用されることが知られている。しかし、この開示のワクチン組成物は、界面活性剤としてポリソルベート２０を使用し、これは、以下に示すように、ポリソルベート８０とは異なる。
【0210】
(i) この開示で使用するポリソルベート２０は、ポリソルベート８０とは構造的に異なる。
【0211】
【化1】
【0212】
ポリソルベート２０及び８０の化学構造。ｗ、ｘ、ｙ及びｚは、各界面活性剤分子のオキシエチレンサブユニットの総数を指し、２０を超えない。
【0213】
(ii) ポリソルベート２０の脂肪酸含有量は、ポリソルベート８０の脂肪酸含有量とは異なる。
【表A】
【0214】
さらに、ポリソルベート２０は、ポリソルベート８０と比較してより親水性である（ＰＳ－２０のＨＬＢ値は１６．７１であり、一方でＰＳ－８０のＨＬＢ値は１５である；界面活性剤ＨＬＢ値が高いほど、より親水性である。界面活性剤ＨＬＢ値が低いほど、より親油性である）。ポリソルベート２０のモノラウレート画分は、混合物の４０～６０％のみを占める。一方で、ポリソルベート８０のモノオレエート画分は、混合物の５８％超を占める。ポリソルベート２０の分子量は、１，２２５ダルトンである。ポリソルベート８０の分子量は、１．３１ｋＤａである。ポリソルベート８０は、ポリソルベート８０中の不飽和アルキル側鎖の含有量が多い結果として、ポリソルベート２０と比較して活性酸素種をより生成しがちである。
【0215】
この開示のワクチン組成物における界面活性剤（ポリソルベート２０）の量が多いほど、組成物に含まれる抗原（肺炎球菌多糖）の数が多くなりアラムゲル含有量が増加した場合でも、流動性が改善された凝集体を含まない組成物を得るのに役立つ。
【0216】
塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム及びそれらの組合せを含む群から選択され、ワクチン組成物における塩の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２ｍｇ～１０ｍｇである。ある態様では、塩は、塩化ナトリウムである。好ましい態様では、ワクチン組成物における塩の濃度は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり４．５ｍｇである。
【0217】
ある態様では、ワクチン組成物は、単回投与用組成物の形態であり、保存剤を含まない。
【0218】
別の態様では、ワクチン組成物は、複数回投与用組成物の形態であり、2-フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム（フェメロール）、フェノール、m-クレゾール、チオメルサール、ホルムアルデヒド、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-クロロ-m-クレゾール、ベンジルアルコール及びそれらの組合せを含む群から選択される保存剤を含む。
【0219】
ある態様では、保存剤の濃度はワクチン組成物０．５ｍｌあたり１ｍｇ～８ｍｇである。
【0220】
別の態様では、保存剤の濃度はワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇである。
【0221】
更に別の態様では、保存剤は、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇの濃度の2-フェノキシエタノールである。
【0222】
通常、ワクチン組成物のｐＨは５～７、好ましくは５～６である。
【0223】
ある態様では、ワクチン組成物は、２０価の組成物であり、
a. ２０の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
b. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
d. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
e. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
f. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
g. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇである。
a. ２０の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
b. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
d. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
e. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
f. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
g. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇである。
【0224】
ある態様では、ワクチン組成物は、２１価の組成物であり、
a. ２１の異なる血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
b. Ａｌ３＋１７０～２００を含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
c. 濃度１～２ｍｇのヒスチジン；
d. 濃度１～２ｍｇのコハク酸塩；
e. 濃度８０～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
f. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
g. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ，１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、残りの肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；このワクチン組成物は、
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖２．２～３．３μｇ；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖４．４～６．６μｇ；
iv. ＣＲＭ１９７、１０μｇ～２００μｇ；
v. 破傷風トキソイド５μｇ～７０μｇ；並びに、
vi. ジフテリアトキソイド１μｇ～２５μｇ；を含む。
a. ２１の異なる血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
b. Ａｌ３＋１７０～２００を含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
c. 濃度１～２ｍｇのヒスチジン；
d. 濃度１～２ｍｇのコハク酸塩；
e. 濃度８０～１２０μｇのポリソルベート２０；及び、
f. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
g. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４に由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ，１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、残りの肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；このワクチン組成物は、
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖２．２～３．３μｇ；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖４．４～６．６μｇ；
iv. ＣＲＭ１９７、１０μｇ～２００μｇ；
v. 破傷風トキソイド５μｇ～７０μｇ；並びに、
vi. ジフテリアトキソイド１μｇ～２５μｇ；を含む。
【0225】
ある態様では、ワクチン組成物は、２１価の組成物であり、
a. ２１の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
a. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
b. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
d. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
e. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
f. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；である。
a. ２１の異なる血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
a. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
b. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
d. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
e. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
f. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；である。
【0226】
ある態様では、ワクチン組成物は、２２価の組成物であり、
a. ２２の異なる血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
a. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
b. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
d. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
e. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
f. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型３、１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；である。
a. ２２の異なる血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖；
a. Ａｌ３＋１７０μｇ～２００μｇを含有するアジュバントとしてのリン酸アルミニウム；
b. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのヒスチジン；
c. 濃度１ｍｇ～２ｍｇのコハク酸塩；
d. 濃度８０μｇ～１２０μｇのポリソルベート２０；及び
e. 濃度２ｍｇ～１０ｍｇの塩化ナトリウム；を含み、
f. ｐＨ５～７、の０．５ｍｌ用量として製剤化され、
i. 血清型４及び２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合し；血清型３、１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合し；
ii. 血清型６Ｂ以外の各肺炎球菌多糖が、２．２μｇ～３．３μｇであり；
iii. 血清型６Ｂの肺炎球菌多糖が、４．４μｇ～６．６μｇであり；
iv. ＣＲＭ１９７が、１０μｇ～２００μｇであり；
v. 破傷風トキソイドが、５μｇ～７０μｇであり；並びに、
vi. ジフテリアトキソイドが、１μｇ～２５μｇ；である。
【0227】
ある態様では、血清型１５Ｂに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＤＴと結合している。別の態様では、血清型１５Ｂに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合していてもよい。
【0228】
ある態様では、ワクチン組成物は、９Ａ、９Ｎ及び９Ｌから選択される血清型に由来する少なくとも１つの肺炎球菌多糖を含んでもよい。
【0229】
ある態様では、ワクチン組成物は、血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含んでもよい。
【0230】
別の態様では、ワクチン組成物は、血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まない。
【0231】
別の態様では、２１価のワクチン組成物は、組成物０．５ｍｌあたり破傷風トキソイド８μｇ～４５μｇを含む。更に別の態様では、ワクチン組成物は、組成物０．５ｍｌあたりジフテリアトキソイド１μｇ～１５μｇを含む。ある態様では、ワクチン組成物は、組成物０．５ｍｌあたりジフテリアトキソイド１μｇ～８μｇを含む。
【0232】
上述のこの開示のワクチン組成物は、複数回投与用組成物として製剤化されるとき、ワクチン組成物０．５ｍｌあたり２．５ｍｇ～５ｍｇの濃度の2-フェノキシエタノールを含む。
【0233】
この開示のワクチン組成物は、２～８℃、２５℃及び４０℃で安定である。この開示の態様によれば、ワクチン組成物は、２～８℃、及び２５℃で少なくとも３カ月の期間安定である。
【0234】
この開示の態様によれば、ワクチン組成物肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体は、遊離の多糖が１５％未満で、遊離のタンパク質が１０％未満である。
【0235】
ある態様では、ワクチン組成物は、マンニトール、グリシン、ラクトース、トレハロース、スクロース、ラフィノース、ポリマー（カルボキシメチルセルロース、ポロキサマー、ＰＥＧなど）のような賦形剤を任意に含んでもよい。
【0236】
この開示のワクチン組成物は、予防のためにヒト対象に投与するために製剤化され、有効量のワクチン組成物の投与によって、肺炎球菌によって引き起こされる感染症の発症を低減又は予防する。
【0237】
この開示の態様によれば、ヒト対象は、乳児（１歳未満）、歩き始めの子（生後約１２カ月～２４カ月）、幼児（約２歳～５歳）、より年長の子（約５歳～１３歳）、青少年（約１３歳～１８歳）、成人（約１８歳～６５歳）又は年配者（６５歳超）から選択される。
【0238】
ある態様では、この開示のワクチン組成物の用量中の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の量は、重大な有害作用なしに免疫保護応答を誘導するのに十分な量で存在する。各肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の量は、肺炎球菌の血清型に応じて変動してもよいが、ワクチン組成物の各用量は、各キャリアタンパク質と結合した各肺炎球菌多糖を１．０μｇ～１０μｇ含む。
【0239】
ある態様では、免疫原性的有効量のこの開示のワクチン組成物を投与することによって、肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体に対する免疫応答をヒト対象において誘導するための方法が提供される。本明細書の上述のワクチン組成物は、経口経路、粘膜経路、鼻経路、鼻腔内経路及び針注入（筋肉内、皮内、皮下、静脈内など）を含むがこれらに限定されない、ワクチンの分野で使用されている従来の経路のいずれかによって、必要とする対象に投与されてもよい。
【0240】
本明細書では、この開示に記載される組成物の「有効量」は、ワクチン組成物が投与される対象において免疫応答を誘発するのに必要とされる量を指す。免疫応答は、続く負荷の間に肺炎球菌の感染の可能性又は重症度を著しく減少させる、１つ以上の肺炎球菌抗原特異的抗体の対象における存在によって特徴付けられる。
【0241】
この開示の態様では、血清型３、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び１５Ｂが、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合した場合と比較して、キャリアタンパク質としてのＴＴに結合した場合に、総ＩｇＧ力価及び機能的ＩｇＧ力価は少なくとも２倍増加する。
【0242】
この開示の態様によれば、血清型３、６Ａ、９Ｖ及び１９Ａに由来する肺炎球菌多糖が、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合した場合と比較して、それらがキャリアタンパク質としての破傷風トキソイド（ＴＴ）と結合した場合に、ＩｇＧ力価が上昇する。
【0243】
さらに、血清型６Ａ、６Ｂ及び１９Ａ、１９Ｆに由来する肺炎球菌多糖は、血清型４、２４Ｆに由来する肺炎球菌多糖がキャリアタンパク質としてのＤＴと結合した場合に、交差反応性（おそらく、それぞれ６Ａ及び１９Ａから）を誘発し；血清型３、１５Ｂ、６Ａ、９Ｖ、１９Ａ及び２２Ｆに由来する肺炎球菌多糖は、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合し；並びに、血清型１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する肺炎球菌多糖はキャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と結合する。
【0244】
この開示のワクチン組成物のマウス及びウサギにおける免疫原性研究は、血清型６Ｂに対する免疫応答の改善を示し、これは６Ａ－ＴＴからの交差反応性によるものである可能性がある。さらに、キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７に代えて、キャリアタンパク質としてのＴＴと結合した血清型３、６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ及び１９Ａを有するワクチン組成物は、より良い免疫応答（ＩｇＧ力価）を誘発した。同様の傾向がオプソニン化アッセイ（ＯＰＡ）応答でも観察される。
【0245】
（キャリアタンパク質としてのＣＲＭ１９７と比較して）キャリアタンパク質としてのＤＴと結合した血清型４を有するワクチン組成物は、より良い免疫応答（ＩｇＧ力価）を誘発した。
【0246】
この開示のワクチン組成物が血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まない場合にも、同様の結果が予想される。
【0247】
この開示は、ワクチン組成物及びそれを製造するための方法を提供する。この開示のワクチン組成物は、１つ以上の肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体を含み、ここで、結合体のそれぞれは、キャリアタンパク質と結合した肺炎球菌の異なる血清型の多糖を含有する。ワクチン組成物は、２種類以上のキャリアタンパク質を含み、個別に異なる多糖と結合している。ワクチン組成物は、賦形剤として、最適な濃度の緩衝剤としてのヒスチジン及びコハク酸塩、アルミニウム塩アジュバント、ポリソルベート２０及び塩化ナトリウムを更に含む。複数回投与用製剤の場合、保存剤が組成物に加えられる。さらに、ワクチン組成物は、２ブレンド法を使用して製造されており、ここで、血清型のいくつかは第１のセットとしてともに吸着され、残りの血清型は第２のセットとしてともに吸着され、続いて両者のセットを混合してワクチン組成物が得られる。この開示のワクチン組成物は、凝集体がなく；広い温度範囲で長期安定性を示し、そのため、複数の肺炎球菌結合体の望ましい特性を維持し、最も流行している肺炎球菌の血清型に対する防御を提供する。
【0248】
この開示は、１）１用量あたり１２５μｇから１８７．５μｇに量を増加したアラムゲルを使用し、その結果吸着が改善され（全ての血清型で少なくとも３０％）（血清型１、２、３、５、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆでは少なくとも８０％）、それによりＢ細胞を介したＩｇＧ抗体応答が高まる（血清型１、１０Ａ、１５Ｂ及び２２Ｆでは少なくとも２倍高いＩｇＧ力価が得られた）；２）多価肺炎球菌結合型ワクチンにおける多くのポリソルベート２０は、凝集体を含まない製剤、改善された流動性をもたらす（特に、添加される抗原の数が多くなりゲル含有量が増加した場合）；３）ＣＤＡＰを利用することによって調製された、３種類のキャリアタンパク質（ＤＴ、ＴＴ、ＣＲＭ１９７）を含む結合体を有する、新規の改善された、安定で免疫原性の多価多糖－タンパク質結合型ワクチン組成物（好ましくは２０価又は２１価）であって、ここで、血清型４及び２４Ｆは個別にＤＴと結合され；血清型６Ａ、９Ｖ、１５Ｂ、１９Ａ、２２Ｆは個別にＴＴと結合され、血清型（１、２、５、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ）からの残りの多糖は個別にＣＲＭ１９７と結合される、ワクチン組成物；４）全てのＣＲＭ１９７及びＤＴをベースとした結合体が、シアニル化化学を利用した直接結合の手法を使用して、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）で活性化することによって調製され、一方で全てのＴＴをベースとした結合体が、最初にＡＤＨで誘導体化したＴＴ（ＥＤＡＣの存在下）を調製し続いてそれをＣＤＡＰで活性化した多糖と結合することによって得られる；５）血清型４のサイジング後の多糖の最適な分子量は１３０ｋＤａ～１７０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型２４Ｆは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型３は１４０ｋＤａ～１８０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型６Ａは４００ｋＤａ～９００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型６Ｂは１００ｋＤａ～２００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型９Ｖは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型１５Ｂは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、血清型１９Ａは１２０ｋＤａ～１６０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、２２Ｆは１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ））であり、それぞれ、血清型４の多糖－タンパク質結合体の最適な分子量が３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型２４Ｆが１５００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型３が３０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型６Ａが７０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型６Ｂが４０００ｋＤａ～１５０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型９Ｖが１５０００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型１５Ｂが６０００ｋＤａ～１００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型１９Ａが５０００ｋＤａ～８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、血清型２２Ｆが９０００ｋＤａ～１８０００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）であり、それらにより改善された免疫原性を確実にする（これらの多糖をＣＲＭ１９７と結合したときと比較）；６）高い結合効率（血清型４及び２４Ｆでは４０％～４５％、血清型３では３０％～３５％、血清型６Ａでは４０％～４５％、血清型９Ｖでは２５％～３０％、血清型１５Ｂでは４５％～５５％、血清型１９Ａでは３０％～３５％、血清型２２Ｆでは４０％～４５％）；７）結合体の最適な吸着（少なくとも３０％）；８）全ての結合体で遊離の多糖の含有量１５％未満及び遊離のタンパク質（１０％未満）；及び９）高い多糖回収率と、（化学的サイジングに対して）高圧ホモジナイゼーションを利用することによって維持される構造的完全性。
【0249】
さらに、ワクチン組成物は、２ブレンド法を使用して製造されており、ここで、血清型のいくつかは第１のセットとして個別に吸着され、残りの血清型は第２のセットとしてともに吸着され、続いて両者のセットを混合してワクチン組成物が得られる。
【0250】
さらに、本発明の製剤は、シリコン処理又は非シリコン処理容器に充填できる。
【実施例0251】
態様のこれまでの説明は、説明の目的のために提供されており、この開示の範囲を限定することを意図していない。特定の態様の個々の構成要素は、その特定の態様に一般には限定されず、互換的である。そのような多様性は、この開示からの逸脱とみなされるべきではなく、全てのそのような改変は、この開示の範囲内と考えられる。
【0252】
この開示は、説明目的のためにのみ記載し、開示の範囲を限定するために解釈されるものではない、以下の実施例に照らして更に説明される。
【0253】
この開示で使用する生物資源の供給源
肺炎球菌の血清型、すなわち、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆは、Centers for Disease Control and Prevention（CDC）, Atlanta, USAから供給された。肺炎球菌の血清型２４Ｆは、Kempegowda Institute of Medical Sciences（KIMS）, Bangalore, Indiaから入手した。
肺炎球菌の血清型、すなわち、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆは、Centers for Disease Control and Prevention（CDC）, Atlanta, USAから供給された。肺炎球菌の血清型２４Ｆは、Kempegowda Institute of Medical Sciences（KIMS）, Bangalore, Indiaから入手した。
【0254】
キャリアタンパク質
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）：ジフテリア菌ＰＷ８ ＣＮ２０００株は、National Control Authority Central Research Institute（C.R.I.）Kasauli, Himachal Pradesh, IndiaがWellcome Research Laboratory, London, United Kingdomから凍結乾燥形態で１９７３年に入手した。この株を復活させ、C.R.I. Kasauliのマスターシードロット－ジフテリア菌ＣＮ２０００ Ａ１のもとで更に凍結乾燥した。
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）：ジフテリア菌ＰＷ８ ＣＮ２０００株は、National Control Authority Central Research Institute（C.R.I.）Kasauli, Himachal Pradesh, IndiaがWellcome Research Laboratory, London, United Kingdomから凍結乾燥形態で１９７３年に入手した。この株を復活させ、C.R.I. Kasauliのマスターシードロット－ジフテリア菌ＣＮ２０００ Ａ１のもとで更に凍結乾燥した。
【0255】
破傷風トキソイド（ＴＴ）：破傷風菌Harvard株No.49205は、the National Control Authority C.R.I. KasauliがThe Rijks Institute Voor de Volksgezondheid（Netherlands）から凍結乾燥形態で入手した。
【0256】
ＣＲＭ１９７：ＣＲＭ１９７は、Pfenex USAから調達した蛍光菌の組換え株ＣＳ４６３－００３（ＭＢ１０１）から入手する。
【0257】
実施例１ ３種類のキャリアタンパク質を使用した多価ワクチン組成物の製造
(i) 発酵
肺炎球菌の血清型（２１価のワクチン組成物の場合、以下の肺炎球菌の血清型を使用した：１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ）の接種菌液を０～０．５ｖｖｍの空気流量で４０～１００ＲＰＭで撹拌しながら、ｐＨ７．１±０．５、３５～３８℃で増殖させた。あらかじめ調整したｐＨ（７．１）を維持するために、供給培地添加の速度はアルカリ混合物添加の速度と同等であった。粘度低下のために硫酸マンガンを使用した。（血清型３では、供給培地は使用しなかった）。
(i) 発酵
肺炎球菌の血清型（２１価のワクチン組成物の場合、以下の肺炎球菌の血清型を使用した：１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ）の接種菌液を０～０．５ｖｖｍの空気流量で４０～１００ＲＰＭで撹拌しながら、ｐＨ７．１±０．５、３５～３８℃で増殖させた。あらかじめ調整したｐＨ（７．１）を維持するために、供給培地添加の速度はアルカリ混合物添加の速度と同等であった。粘度低下のために硫酸マンガンを使用した。（血清型３では、供給培地は使用しなかった）。
【0258】
(ii) 精製
上記の工程で得られた肺炎球菌の血清型の清澄化された発酵ブロスを１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用して濃縮し、透析ろ過した。１５４ｍＭのＮａＣｌを使用して透析ろ過を遂行し、続いて注入用水（ＷＦＩ）を用いて透析ろ過した。
上記の工程で得られた肺炎球菌の血清型の清澄化された発酵ブロスを１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用して濃縮し、透析ろ過した。１５４ｍＭのＮａＣｌを使用して透析ろ過を遂行し、続いて注入用水（ＷＦＩ）を用いて透析ろ過した。
【0259】
多糖を含有する濃縮し透析ろ過したブロスを撹拌しながら３７℃で１０±２時間酵素（ヌクレアーゼ）処理した。
【0260】
硫酸アンモニウムをヌクレアーゼ処理済み多糖溶液に５０％飽和まで加え、２～８℃で１２±２時間インキュベートした（血清型５を除く）。混合物を深層ろ過して沈殿物を取り除き、廃棄した。溶液を、ＮａＣｌを使用し、続いて冷ＷＦＩを使用して１００ｋＤａ透析ろ過した。多糖と緩衝液を含有する高塩濃度のこの透析ろ過した溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに負荷した。
【0261】
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）をｐＨ６．８のリン酸緩衝液中５ＭのＮａＣｌで平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ６～８、好ましくはｐＨ６～７でカラムに負荷した。カラムをｐＨ６．８のリン酸緩衝溶液中５ＭのＮａＣｌで更に洗浄した。これらの条件下で、カラムからのフロースルー及び平衡化洗浄で多糖を回収した。その後１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用して多糖溶液を濃縮し、次いでＮａＣｌ及び注入用水（ＷＦＩ）を用いて透析ろ過した。
【0262】
イオン交換クロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ）（強力アニオン交換体）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液（５００ｍｌ）をｐＨ６～８、好ましくはｐＨ６．５～７．５でカラムに負荷した。同じ緩衝液でカラムを更に洗浄した。吸着した多糖を１．０ＭのＮａＣｌを使用した段階的な勾配溶出で溶出した（さまざま多糖を異なるイオン強度のＮａＣｌで溶出した）。
【0263】
その後１００ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用して多糖溶液を濃縮し、次いで注入用水（ＷＦＩ）を用いて透析ろ過した。
【0264】
透析ろ過した多糖溶液を０．２２μ膜フィルターを通してポリプロピレン瓶にろ過した。精製された多糖を凍結保存した。この工程を血清型１、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ，１４、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆについて行った。
【0265】
血清型２、４、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆでは、ＨＩＣ法のみを使用した。これらの血清型には、ＩＥＣクロマトグラフィーは使用しなかった。全ての血清型について、硫酸アンモニウム沈殿に代えてｐＨ沈殿を使用し、その後ＷＦＩ法を用いた透析ろ過を使用した。血清型３をワクチン組成物に使用した場合、ＨＩＣ法のみを使用した。
【0266】
これらの血清型のｐＨ沈殿の工程条件は、ｐＨが２０％ＨＣｌを使用して５．８±０．２、時間が６±２時間、温度が７±２℃である。
【0267】
(iii) サイジング
血清型６Ａの多糖を除いて、活性化工程の前に高圧ホモジナイザー装置（Microfluidics Inc.、モデルM-110EH-30）を使用して多糖の分子量を減少させた。サイズ縮小は２０～３０ＫＰＳＩ（キロポンド／平方インチ）で行い、３～３０回のパスを使用した。ＫＰＳＩ及びパスの数（表１）は、多糖が由来する血清型に応じて変化した。表－１に、この開示の組成物で使用する各血清型についての使用した圧力及びパスの数を示す。
血清型６Ａの多糖を除いて、活性化工程の前に高圧ホモジナイザー装置（Microfluidics Inc.、モデルM-110EH-30）を使用して多糖の分子量を減少させた。サイズ縮小は２０～３０ＫＰＳＩ（キロポンド／平方インチ）で行い、３～３０回のパスを使用した。ＫＰＳＩ及びパスの数（表１）は、多糖が由来する血清型に応じて変化した。表－１に、この開示の組成物で使用する各血清型についての使用した圧力及びパスの数を示す。
【0268】
【表1】
【0269】
(iv) 結合
全ての血清型の一般の結合工程： この開示の態様による結合パラメーターを表－２に示し、一般の工程の流れを図１に示す。
全ての血清型の一般の結合工程： この開示の態様による結合パラメーターを表－２に示し、一般の工程の流れを図１に示す。
【0270】
分子量が１００ｋＤａ～２００ｋＤａである精製しホモジナイズした多糖（分子量が４００ｋＤａ～９００ｋＤａである天然の形態で使用する精製した血清型６Ａの多糖を除く）を結合に用いた。多糖の出発濃度は、濃縮前に調整した。表－２に示すように、異なる血清型には異なる多糖濃度が使用される。1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）による多糖の活性化では、新たに調製したＣＤＡＰ化学溶液（アセトニトリル中約１００ｍｇ／ｍｌ）を、マグネチックスターラーによって混合しながら（２２±３℃で１１０±２５ＲＰＭ）、表－１で述べた多糖：ＣＤＡＰ比のとおりに加えた。撹拌しながらＣＤＡＰを完全に混合した後、ｐＨが９．０±０．３である血清型１９Ａを除いて、水酸化ナトリウム／酢酸を使用してｐＨを９．５±０．３に調整した。多糖の活性化のための時間は、血清型に応じて３～１０分であり、活性化時間はｐＨ調整から開始する。
【0271】
活性化が完了した後、同じ撹拌及び温度条件を使用して、各多糖に対して特定のキャリアタンパク質を活性化多糖に加えて（多糖：キャリアタンパク質＝１：０．５～１：１．５）結合反応を開始した。キャリアタンパク質を特定の血清型に応じて３～１０分の活性化後に加えた。ｐＨが９．０±０．３であった血清型１９Ａを除いて、結合のためのｐＨを９．５±０．３に維持した。結合時間は、異なる血清型で変動し、結合反応を行う血清型に応じて、通常２０分～９時間行った。血清型６Ａでは、結合は、４±１．５時間まで継続した。結合が完了した後、ｐＨを８．１±０．３に調整した２Ｍグリシンを１０部以上使用し、反応をクエンチした。反応を２２±３℃で１時間以上、続いて１２±３℃で１０～２０時間、撹拌しながら継続する。
【0272】
結合体は、０．４５μｍろ過、続いてタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により精製した。望まれていない反応残基（遊離の多糖、タンパク質、ＣＮ－、ＡＣＮ、ＤＭＡＰ）及び低分子量結合体を、主に０．９％ＮａＣｌ溶液中２０以上ＣＶＤを用いた３００ｋＤａ（一次精製）膜のＴＦＦによって除去し、続いて最終精製工程として、一次精製と同様の方法工程を使用して１００ｋＤａ透析ろ過を行った。
【0273】
精製した個々の結合体の分子量は、１５００ｋＤａ～３００００ｋＤａ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）であった。
【0274】
精製結合体は、その最終濃度を２０ｍＭのL-ヒスチジンにするために、０．９％w/v ＮａＣｌ中２００ｍＭのL-ヒスチジンの原液を加えることによって希釈／安定化させた。最終的な０．２２μろ過を行い、１価のバルク結合体（ＭＢＣ）を得て、これは更に使用するまで２～８℃で保存した。
【0275】
【表2-1】
【0276】
【表2-2】
【0277】
表－３に、この開示のワクチン組成物に存在する肺炎球菌多糖及び肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体の特性を示す。
【0278】
【表3-1】
【0279】
【表3-2】
【0280】
遊離の多糖及び遊離のタンパク質の推定
１．遊離のタンパク質の推定
a. ＢＢＣＩＡ／サンドイッチＥＬＩＳＡによる遊離のＴＴ／ＤＴ推定のプロトコル
２工程プロトコル
工程１：遊離のＴＴ／ＤＴの単離
それぞれの血清型に特異的なモノクローナル抗体をプロテインＡ樹脂とインキュベートする。プロテインＡ樹脂は、ＡｂのＦｃ領域に対して親和性を有し、ＡｂのＦａｂ領域が特定の抗原と相互作用するのを可能にする。結合したＰｓは、Ａｂでタグ付けされたプロテインＡ樹脂とインキュベートしたとき、結合したＰｓ及び結合体に存在する遊離のＰｓと結合する。Ａｂでタグ付けされた樹脂を結合体とともに遠心分離して、樹脂をペレット化する。遊離のＴＴ／ＤＴを含有する上清を別のチューブに回収する。遊離のＴＴは、ビーズベースの競合阻害アッセイ（ＢＢＣＩＡ）を使用して推定する。遊離のＤＴは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して推定する。
１．遊離のタンパク質の推定
a. ＢＢＣＩＡ／サンドイッチＥＬＩＳＡによる遊離のＴＴ／ＤＴ推定のプロトコル
２工程プロトコル
工程１：遊離のＴＴ／ＤＴの単離
それぞれの血清型に特異的なモノクローナル抗体をプロテインＡ樹脂とインキュベートする。プロテインＡ樹脂は、ＡｂのＦｃ領域に対して親和性を有し、ＡｂのＦａｂ領域が特定の抗原と相互作用するのを可能にする。結合したＰｓは、Ａｂでタグ付けされたプロテインＡ樹脂とインキュベートしたとき、結合したＰｓ及び結合体に存在する遊離のＰｓと結合する。Ａｂでタグ付けされた樹脂を結合体とともに遠心分離して、樹脂をペレット化する。遊離のＴＴ／ＤＴを含有する上清を別のチューブに回収する。遊離のＴＴは、ビーズベースの競合阻害アッセイ（ＢＢＣＩＡ）を使用して推定する。遊離のＤＴは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して推定する。
【0281】
工程２：ＢＢＣＩＡによるＴＴの推定
マイクロスフェアビーズをＢＢＣＩＡで使用するためにＴＴと結合させる。上清、すなわち、遊離のＴＴを有すると予想されるものは、マイクロタイタープレートで抗ＴＴモノクローナル抗体を使用してあらかじめ中和する。あらかじめ中和した試料をＴＴと結合したマイクロスフェアビーズに移す。あらかじめ中和した工程の後に利用できる遊離のＡｂは、ＴＴ結合ビーズと相互作用する。Ａｂ－Ａｇ結合ビーズ反応は、抗マウスＩｇＧ（ｆｃ－特異的）－フィコエリトリン結合体を使用して検出する。プレートは、ＢｉｏＰｌｅｘ －２００タンパク質懸濁液アレイシステムを使用して読み取る。ＭＦＩ（蛍光強度中央値）は、試料に存在する濃度に反比例する。
マイクロスフェアビーズをＢＢＣＩＡで使用するためにＴＴと結合させる。上清、すなわち、遊離のＴＴを有すると予想されるものは、マイクロタイタープレートで抗ＴＴモノクローナル抗体を使用してあらかじめ中和する。あらかじめ中和した試料をＴＴと結合したマイクロスフェアビーズに移す。あらかじめ中和した工程の後に利用できる遊離のＡｂは、ＴＴ結合ビーズと相互作用する。Ａｂ－Ａｇ結合ビーズ反応は、抗マウスＩｇＧ（ｆｃ－特異的）－フィコエリトリン結合体を使用して検出する。プレートは、ＢｉｏＰｌｅｘ －２００タンパク質懸濁液アレイシステムを使用して読み取る。ＭＦＩ（蛍光強度中央値）は、試料に存在する濃度に反比例する。
【0282】
工程２：サンドイッチＥＬＩＳＡによるＤＴの推定
ＥＬＩＳＡプレートを抗ＤＴウマポリクローナル血清でコートする。上清、すなわち、遊離のＤＴを有すると予想されるものをウェルに加える。抗ＤＴマウスモノクローナル抗体（自社製）をＨＲＰ結合キットを使用してＨＲＰと結合する。ＤＴ抗原をＤＴに特異的なポリクローナル抗体と抗ＤＴマウスモノクローナル抗体－ＨＲＰ結合体の間に挟む。基質とともにＴＭＢを加えて反応を検出する。反応を、１ＮのＨＣｌ溶液を使用してクエンチする。マイクロプレート分光光度計を使用して吸光度を４５０ｎｍで測定する。吸光度は、試料に存在するＤＴの濃度に正比例する。
ＥＬＩＳＡプレートを抗ＤＴウマポリクローナル血清でコートする。上清、すなわち、遊離のＤＴを有すると予想されるものをウェルに加える。抗ＤＴマウスモノクローナル抗体（自社製）をＨＲＰ結合キットを使用してＨＲＰと結合する。ＤＴ抗原をＤＴに特異的なポリクローナル抗体と抗ＤＴマウスモノクローナル抗体－ＨＲＰ結合体の間に挟む。基質とともにＴＭＢを加えて反応を検出する。反応を、１ＮのＨＣｌ溶液を使用してクエンチする。マイクロプレート分光光度計を使用して吸光度を４５０ｎｍで測定する。吸光度は、試料に存在するＤＴの濃度に正比例する。
【0283】
b. ＣＺＥによる遊離のタンパク質推定のための代替方法
ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＣＫ）は、動電クロマトグラフィーの方法の１つであり、ランニングバッファー中でイオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度よりも十分に高い濃度で使用することに基づく。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、最も一般的な界面活性剤の１つであり、ＭＥＫＣに広く使用されている。ＳＤＳミセルは、電気泳動によって陽極に向かって移動する。電気浸透流は陰極の方向であり、これは５を超えるｐＨでのＳＤＳミセルの電気泳動の移動よりも強力である。したがって、ＳＤＳミセルは、電気浸透速度と電気泳動速度の差に等しい速度で陰極に向かって移動もする。中性の分析物は、ミセルから遊離しているときは電気浸透速度で、ミセルに取り込まれているときはミセルの速度でミセル溶液中を移動する。したがって、溶質の分離は、ミセル相（ミセル）及び水相における相対的分配係数の結果となる。
ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＣＫ）は、動電クロマトグラフィーの方法の１つであり、ランニングバッファー中でイオン性界面活性剤をその臨界ミセル濃度よりも十分に高い濃度で使用することに基づく。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、最も一般的な界面活性剤の１つであり、ＭＥＫＣに広く使用されている。ＳＤＳミセルは、電気泳動によって陽極に向かって移動する。電気浸透流は陰極の方向であり、これは５を超えるｐＨでのＳＤＳミセルの電気泳動の移動よりも強力である。したがって、ＳＤＳミセルは、電気浸透速度と電気泳動速度の差に等しい速度で陰極に向かって移動もする。中性の分析物は、ミセルから遊離しているときは電気浸透速度で、ミセルに取り込まれているときはミセルの速度でミセル溶液中を移動する。したがって、溶質の分離は、ミセル相（ミセル）及び水相における相対的分配係数の結果となる。
【0284】
遊離のＣＲＭ１９７は、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＣＫ）モードのキャピラリー電気泳動によって結合体から分離する。２００ｎｍで吸光度を監視し、標準品を使用して、遊離のＣＲＭ１９７、ＤＴ又はＴＴを定量化する。遊離のタンパク質を推定するための、この開示による特定の多糖－キャリアタンパク質の組合せを、表－４に示す。
【0285】
【表4】
【0286】
２．遊離の多糖の推定
原理
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）は、イオン性界面活性剤であり、複合溶液中のタンパク質の選択的沈殿に使用される。ＤＯＣのこの特性を、多糖結合体試料中の遊離の糖の推定のために本明細書で使用する。
原理
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）は、イオン性界面活性剤であり、複合溶液中のタンパク質の選択的沈殿に使用される。ＤＯＣのこの特性を、多糖結合体試料中の遊離の糖の推定のために本明細書で使用する。
【0287】
結合体試料では、ＤＯＣは、遊離のタンパク質も結合タンパク質も沈殿させる。沈殿物はろ過によって取り除くことができ、ろ液は糖含有量の推定に使用できる。
【0288】
実験手順
方法Ａ：血清型１、３、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆの場合
ブランクの調製：試料に代えて２０ｍＭヒスチジン緩衝液６００μＬを用い、下記と同じ手順に従う。
試料６００μＬを各エッペンドルフチューブに２連でとる。
１０％ＤＯＣ溶液２０４μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を室温で１０分間インキュベートする。
１Ｎ塩酸７７μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を室温で１０分間インキュベートする。
穏やかにボルテックスし、全体積を０．２２μシリンジフィルターで新しいエッペンドルフチューブにろ過するか、スピンフィルターに移して５０００ＲＰＭで２分間遠心分離する。
０．５Ｍ重炭酸ナトリウム３０μＬを含有する新しいエッペンドルフチューブにろ液５００μＬを速やかに移し、穏やかにボルテックスする。
方法Ａ：血清型１、３、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆの場合
ブランクの調製：試料に代えて２０ｍＭヒスチジン緩衝液６００μＬを用い、下記と同じ手順に従う。
試料６００μＬを各エッペンドルフチューブに２連でとる。
１０％ＤＯＣ溶液２０４μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を室温で１０分間インキュベートする。
１Ｎ塩酸７７μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を室温で１０分間インキュベートする。
穏やかにボルテックスし、全体積を０．２２μシリンジフィルターで新しいエッペンドルフチューブにろ過するか、スピンフィルターに移して５０００ＲＰＭで２分間遠心分離する。
０．５Ｍ重炭酸ナトリウム３０μＬを含有する新しいエッペンドルフチューブにろ液５００μＬを速やかに移し、穏やかにボルテックスする。
【0289】
方法Ｂ：血清型２、４、６Ａ、１９Ａ、１９Ｆの場合
ブランクの調製：試料に代えて２０ｍＭヒスチジン緩衝液６５０μＬを用い、下記と同じ手順に従う。
試料６５０μＬを各エッペンドルフチューブに２連でとる。
１０％ＤＯＣ溶液２２１μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を氷浴で２分間インキュベートする。
１Ｎ塩酸６２μＬを各試料に加える。
穏やかにボルテックスし、全体積を０．２２μシリンジフィルターで新しいエッペンドルフチューブにろ過するか、スピンフィルターに移して５０００ＲＰＭで２分間遠心分離する。
０．５Ｍ重炭酸ナトリウム２０μＬを含有する新しいエッペンドルフチューブにろ液５００μＬを速やかに移し、穏やかにボルテックスする。
ブランクの調製：試料に代えて２０ｍＭヒスチジン緩衝液６５０μＬを用い、下記と同じ手順に従う。
試料６５０μＬを各エッペンドルフチューブに２連でとる。
１０％ＤＯＣ溶液２２１μＬを各試料に加え、穏やかにボルテックスする。
試料を氷浴で２分間インキュベートする。
１Ｎ塩酸６２μＬを各試料に加える。
穏やかにボルテックスし、全体積を０．２２μシリンジフィルターで新しいエッペンドルフチューブにろ過するか、スピンフィルターに移して５０００ＲＰＭで２分間遠心分離する。
０．５Ｍ重炭酸ナトリウム２０μＬを含有する新しいエッペンドルフチューブにろ液５００μＬを速やかに移し、穏やかにボルテックスする。
【0290】
(v) 製剤
この開示による２０／２１価のワクチン組成物を製造するための一般方法を図２に提供する。
この開示による２０／２１価のワクチン組成物を製造するための一般方法を図２に提供する。
【0291】
ブレンドＡ： 肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体４－ＤＴ、６Ａ－ＴＴ、９Ｖ－ＴＴ、１５Ｂ－ＴＴ、２２Ｆ－ＴＴ及び２３Ｆ－ＣＲＭ、ヒスチジン、ＮａＣｌ及び２－ＰＥ（複数回投与用製剤の場合）を、リン酸アルミニウム；及びコハク酸塩と１８℃～３０℃で混合し、続いてｐＨを６±０．５に調整し（２時間以上後）、６．０±２時間後にポリソルベート２０を加えた。
【0292】
ブレンドＢ： 肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体１－ＣＲＭ、２－ＣＲＭ、５－ＣＲＭ、６Ｂ－ＣＲＭ、７Ｆ－ＣＲＭ、８－ＣＲＭ、１０Ａ－ＣＲＭ、１１Ａ－ＣＲＭ，１２Ｆ－ＣＲＭ，１４－ＣＲＭ、１８Ｃ－ＣＲＭ，１９Ａ－ＴＴ、１９Ｆ－ＣＲＭ、３３Ｆ－ＣＲＭ（２１価の組成物の場合２４Ｆ－ＤＴも）、ヒスチジン、ＮａＣｌ及び２－ＰＥ（複数回投与用製剤の場合）を、リン酸アルミニウム及びコハク酸塩と１８℃～３０℃で混合し、続いてｐＨを６±０．５に調整し（２時間以上後）、６．０±２時間後にポリソルベート２０を加えた。肺炎球菌多糖－キャリアタンパク質結合体３－ＴＴを使用する場合は、ブレンド－Ｂに存在した。
【0293】
ブレンドＡ（２４±６時間後）及びブレンドＢ（１８±６時間後）を撹拌しながら４～１２℃で７２時間混合した。必要な場合、ｐＨを６±０．５に調整し、最終体積を注入用水（ＷＦＩ）で調整してワクチン組成物（ＰＣＶ－２０／２１製剤バルク）を得た。必要に応じてこれを（ガラスバイアル、シリコン処理バイアル、プレフィルドシリンジのような）好適な容器に充填した。シリコン処理バイアルは、（ｉ）Muller＋Muller-Joh, Germany；（ｉｉ）Nuova Ompi, Italy；及び（ｉｉｉ）Schott Kaisha, Indiaから購入した。プレフィルドシリンジは、BD Medical Pharmaceuticalsから購入した。
【0294】
表－５に示すように、この開示の方法を使用してさまざまな製剤を製造した。
【0295】
【表5-1】
【0296】
破傷風トキソイド（ＴＴ）と結合した血清型の数が増えると、免疫抑制が生じる可能性があるため、それぞれ２０価及び２１価の組成物を含み、血清型３（キャリアタンパク質としてのＴＴと結合している血清型３）を含まない１３１ｃ（表－５ａを参照）及び１３５ａ（表－５ｂを参照）の製剤も研究した。
【0297】
【表5-2】
【0298】
【表5-3】
【0299】
表－６は、この開示に従って製造した２０価の組成物（実験１３１ｃ）の吸着率を示す。２０価の組成物（実験１３１ｃ）は、２０種の肺炎球菌の血清型に由来する多糖と個別に結合した３種類のキャリアタンパク質を含む。
【0300】
【表6】
【0301】
この開示に従って製造した２０価の組成物（実験１３１ｃ）が全ての血清型で少なくとも２０％の吸着率を有することが表－６から理解できる。さらに、血清型１、３、５、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆでは９０％以上の吸着がみられる。組成物が血清型３の結合体を含まない場合でも、同様の吸着が予想される。
【0302】
凝集体／白色粒子又はいかなる種類のフロキュールがいずれのＰＣＶ製剤においても観察されなかったことから、製剤が非常に安定で一貫していることを示している。凝集体が存在しないのは、１００～２００ｋＤａのサイジング後の多糖の使用し、多糖対ＣＤＡＰ（シアニル化試薬）比を１：０．３～１．５としたための可能性がある。
【0303】
２１価の組成物（実験１３５及び実験１３５ａ）は、結合体（２４－ＤＴ）を更に含有し、残りの成分は実験１３１及び実験１３５ｃと同じである。表－６から理解できるように、ＴＴ／ＣＲＭと結合した多糖のほとんどは良好な吸着（５０％超）を示し、同様に、ＤＴと結合した血清型２４は、２１価の製剤に含まれる場合、良好な吸着を示すことが予想される。
【0304】
実施例２ 精製した多糖の総窒素含有量の決定
血清型：２、３、４、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ
血清型：２、３、４、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２４Ｆ及び３３Ｆ
【0305】
【表7】
【0306】
この開示のワクチン組成物で使用する多糖の総窒素含有量が十分に規格範囲内にあることが表－７から理解できる。
【0307】
ＴＮＭ法は、化学発光検出器を使用した総窒素の検出及び定量化に基づく。ＴＮＭが提供する検出は、ケルダール法のような既存の方法よりも以下の点で優れている：
a) ハイスループット。
b) ケルダールに基づく方法のように濃酸を使用しない。
c) ペプチド、アミノ酸、核酸、アミノ糖、ナイトレート及びナイトライトのような全ての種類の窒素連結を検出できる。ケルダールに基づく方法には、ナイトレート及びナイトライトのような窒素形態を決定できないという限界がある。
d) 非常に高感度である。ｐｐｂレベルまで窒素を検出でき、これはケルダールでは不可能である（ｐｐｍ単位の感度）。
e) ケルダール又はＣＨＮＳ法と比較して、必要な試料の量は最小限である。
a) ハイスループット。
b) ケルダールに基づく方法のように濃酸を使用しない。
c) ペプチド、アミノ酸、核酸、アミノ糖、ナイトレート及びナイトライトのような全ての種類の窒素連結を検出できる。ケルダールに基づく方法には、ナイトレート及びナイトライトのような窒素形態を決定できないという限界がある。
d) 非常に高感度である。ｐｐｂレベルまで窒素を検出でき、これはケルダールでは不可能である（ｐｐｍ単位の感度）。
e) ケルダール又はＣＨＮＳ法と比較して、必要な試料の量は最小限である。
【0308】
この開示で使用する窒素含有量を推定するためのＴＮＭ法は、表－８に記載するように、ＣＨＮＳ法に対して以下の利点を示す。
【0309】
【表8】
【0310】
実施例３ リン酸アルミニウムゲル及びポリソルベート２０の最適化
リン酸アルミニウムゲル
アルミニウム塩は、一般にワクチンで使用されており、その安全性プロフィール、調製の容易さ、安定性及び強力な免疫刺激能力は十分に確立されている。
リン酸アルミニウムゲル
アルミニウム塩は、一般にワクチンで使用されており、その安全性プロフィール、調製の容易さ、安定性及び強力な免疫刺激能力は十分に確立されている。
【0311】
この開示のワクチン組成物をさまざまな濃度のリン酸アルミニウムゲル（アラムゲル）で評価し、個々の血清型の吸着に及ぼす影響を研究した。組成物の詳細及び得られた結果を表－９に示す。
【0312】
【表9】
【0313】
アラムゲルを増加すると、２１価のワクチン組成物の多くの血清型の吸着に好影響を及ぼすことが表－９から理解できる。アラムゲルを１用量あたり１２５μｇから１８７．５μｇ（Ａｌ３＋）に増加すると、多くの血清型の吸着を著しく改善した。アラム含有量を増加させると７０％を超える血清型結合体の吸着が改善した。さらに、アラム含有量が多い製剤（１用量あたりＡｌ３＋１８７．５μｇ）では、血清型１、３、５、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆで９０％以上の吸着がみられる。この開示のワクチン組成物で肺炎球菌の血清型３の多糖を含まない場合にも、同様の結果が予想される。
【0314】
キャリアタンパク質としてのＤＴを有する結合体血清型４は、アラムゲル１２５μｇ／用量（Ａｌ３＋）で吸着は少なかった（５４％）。アラムゲル含有量を１８７．５μｇ／用量（Ａｌ３＋）に増加させると吸着はかなり改善された（７９％）。同様の傾向が残りの血清型の大半でも観察される。出願人の１０価の肺炎球菌ワクチン（PNEUMOSIL（登録商標））に存在しない追加の血清型は、アラムゲルの使用量が少ない場合、吸着が少ないことが観察された。しかし、１用量あたり多くのアラムゲル（１８７．５μｇ（Ａｌ３＋））を使用した場合、吸着が大幅に改善した。
【0315】
この開示の多価ワクチン組成物の比較吸着データ
【0316】
【表10】
【0317】
【表11】
【0318】
６Ｂ、７Ｆ及び１５Ｂを含む多くの血清型では低いアラム含有量で吸着が比較的低く、一方でアラム含有量を増加させるとより高い吸着が観察されたことが表－１０及び表－１１から理解できる。したがって、更なる研究ではＡｌ３＋１８７．５μｇ／０．５ｍｌを使用した。
【0319】
血清型の吸着に与える製剤中のアルミニウム含有量の影響に関する比較研究
表－１２は製剤の詳細並びに異なるアルミニウム含有量が吸着及び抗原含有量に与える影響を示す。
表－１２は製剤の詳細並びに異なるアルミニウム含有量が吸着及び抗原含有量に与える影響を示す。
【0320】
【表12-1】
【0321】
表－１２ａは、ＩｇＧ力価に与える多価組成物中のアルミニウム含有量の影響を示す。
【0322】
【表12-2】
【0323】
アラムゲルの量を更に増加してもワクチン組成物の抗原性に悪影響を及ぼさなかったことが理解できる。表－１２ａのほとんど全ての血清型のウサギ免疫原性研究データから明らかなように、免疫原性の製剤中のアラムゲルが多いと、Ｂ細胞を介したＩｇＧ抗体応答を高めるのにも有益であることが理解できる。全ての血清型について数値的優位性という点でＩｇＧ抗体応答が観察された。さらに、血清型１、１０Ａ、１５Ｂ及び２２Ｆでは、少なくとも２倍高いＩｇＧ力価が得られた。
【0324】
個々の結合体血清型の高い吸着は、ワクチン組成物にとってプラスの品質特性としてみなされ、安定性を示すパラメーターである。結合体の吸着の増加は、臨床材料及び商業材料の製造において、個々の抗原の安定性及び製剤バッチのロット間の一貫性を更に改善する。これは、少ない血清型、例えば４、６Ｂ、７Ｆ、１５Ｂ、１８Ｃでは、特により重要である。吸着が少ないと、ワクチン組成物の保存中に、抗原が経時的に分解する危険性があることが予想される。
【0325】
個々の吸着及び動物免疫原性データからは、この開示の多価ワクチン組成物において、アラムゲルを多く使用する利点を確認した。免疫応答が高いこれらの組成物は、より一貫している強力な結果を提供する可能性があり、大規模なワクチン製造において有用である。
【0326】
ポリソルベート２０
この開示のワクチン組成物は、水性媒体に懸濁されたリン酸アルミニウム粒子を含み、非イオン性界面活性剤ポリソルベート２０は安定剤として使用される。界面活性剤は、液体－空気、固体－液体の界面張力を減らし、懸濁液ベースの製剤の安定性及び流動性を改善することによって製剤を安定化させるのに重要な役割を果たす。
この開示のワクチン組成物は、水性媒体に懸濁されたリン酸アルミニウム粒子を含み、非イオン性界面活性剤ポリソルベート２０は安定剤として使用される。界面活性剤は、液体－空気、固体－液体の界面張力を減らし、懸濁液ベースの製剤の安定性及び流動性を改善することによって製剤を安定化させるのに重要な役割を果たす。
【0327】
出願人は、自社で販売した１０価の肺炎球菌ワクチン組成物（PNEUMOSIL（登録商標））に５０μｇのポリソルベート２０を以前使用していた。しかし、この開示のワクチン組成物で使用する抗原（肺炎球菌多糖）の数が増加し、アラムゲルの量が増加したため、ポリソルベート２０の量を増加した（１００μｇ）。本ワクチン組成物のポリソルベート２０の量を増加させると、特に、添加する抗原（肺炎球菌多糖）の数が多くなりアラムゲル含有量が増加した場合、流動特性の改善を示す。さらに、製品の凝集体又はフロキュールは、２℃～８℃で保存した場合、ワクチン組成物のポリソルベート２０濃度を増加させると観察されなかった。また、ポリソルベート２０含有量を多くした場合、動物研究（マウス及びウサギ）で観察された結合体血清型の個々の吸着、個々の抗原含有量及び免疫応答に関して、有害作用は観察されなかった。
【0328】
この開示のワクチン組成物における界面活性剤（ポリソルベート２０）の量が多いほど、組成物に含まれる抗原（肺炎球菌多糖）の数が多くなり、アラムゲル含有量が増加した場合でも、流動性が改善された凝集体を含まない組成物を得るのに役立つ。
【0329】
実施例４ 免疫原性研究
(a) Serum Institute／ＳＩＩＰＬの多価肺炎球菌製剤、実験１３１、実験１０６及び実験１１９並びに市販の比較基準（プレベナー１３）に関するＮＺＷウサギの免疫原性データの比較。
研究目的： この研究の目的は、マルチプレックスビーズベースアッセイによって総ＩｇＧ力価を評価し、ＯＰＡ又はマルチプレックスオプソニン化貪食アッセイ（ＭＯＰＡ）のいずれかによって機能的ＩｇＧ力価を評価することで、ＳＩＩＰＬが開発した多価肺炎球菌製剤である実験１３１の免疫原性を確認し、実験１０６、実験１１９及び市販の比較基準（プレベナー１３）と比較することであった。
(a) Serum Institute／ＳＩＩＰＬの多価肺炎球菌製剤、実験１３１、実験１０６及び実験１１９並びに市販の比較基準（プレベナー１３）に関するＮＺＷウサギの免疫原性データの比較。
研究目的： この研究の目的は、マルチプレックスビーズベースアッセイによって総ＩｇＧ力価を評価し、ＯＰＡ又はマルチプレックスオプソニン化貪食アッセイ（ＭＯＰＡ）のいずれかによって機能的ＩｇＧ力価を評価することで、ＳＩＩＰＬが開発した多価肺炎球菌製剤である実験１３１の免疫原性を確認し、実験１０６、実験１１９及び市販の比較基準（プレベナー１３）と比較することであった。
【0330】
研究詳細： 出願人の開発したＰＣＶ２１製剤である実験１３１を、ニュージーランド白色ウサギ８匹（オス４匹、メス４匹）にリン酸アルミニウムアジュバントとともに注入し、続いて研究開始の日から０日目、１４日目及び２８日目に３回筋肉内接種を行った。研究の０日目、２８日目及び４２日目に回収した血液から血清を分離し、ビーズベースアッセイによって総ＩｇＧを、マルチプレックスオプソニン化貪食アッセイによって機能的ＩｇＧを確認した。
【0331】
４２日目の力価を、プレベナー１３及び以前試験したＰＣＶ２１実験１０６、実験１１９の４２日目のデータと比較した。この研究で使用した製剤の詳細を、表－１３に記載し、結果を、表－１４に示す。
【0332】
【表13】
【0333】
結果
【0334】
【表14】
【0335】
比較のための全体的推論
ＴＴとの結合の影響 表－１４に示すように、実験１３１において、ＴＴ結合体を使用する血清型３、６Ａ、９Ｖ及び１９Ａでは、実験１０６のＣＲＭ結合体と比較して、総ＩｇＧ（ＢＢＡによる）及び機能的ＩｇＧ（ＭＯＰＡによる）の両者の力価が著しく増加した。
ＴＴとの結合の影響 表－１４に示すように、実験１３１において、ＴＴ結合体を使用する血清型３、６Ａ、９Ｖ及び１９Ａでは、実験１０６のＣＲＭ結合体と比較して、総ＩｇＧ（ＢＢＡによる）及び機能的ＩｇＧ（ＭＯＰＡによる）の両者の力価が著しく増加した。
【0336】
さらに、同様の血清型の交差反応性（すなわち６Ａ－６Ｂ及び１９Ａ－１９Ｆ）も、実験１０６と比較して実験１３１で観察される。抗体は、それを刺激した抗原以外の抗原と反応する。この現象は、交差反応又は交差反応性と呼ばれる。交差反応は、抗原上の共有エピトープ又はエピトープの立体構造的類似性によって生じる。本研究では、６Ａ及び１９Ａの免疫応答が増加（キャリアタンパク質の変化による）し、６Ｂ及び１９Ｆに対する免疫応答も、おそらく交差反応性によって増加したことが、データから判明した。
【0337】
実験１３１の力価（総ＩｇＧ及び機能的ＩｇＧの両者）は、市販の比較基準（プレベナー１３）で得られた力価と同等である。
【0338】
血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まないワクチン組成物の免疫原性研究は進行中であり、同様の結果が予想される。
【0339】
ビーズベースアッセイによる総ＩｇＧ
Luminexフローベースシステムでのマルチプレックスビーズベースアッセイは、ｘＭＡＰ（多分析物プロファイリング）技術に基づいて設定される。Luminexアッセイの特有のマルチプレックスな能力（１００プレックスまで）は、異なる強度の赤色及び赤外蛍光物質で内部を染色したマイクロスフェアの使用に基づく。各ビーズは、固有の番号、すなわち「ビーズ領域」が与えられ、１つのビーズと別のビーズを区別するのを可能にする。
Luminexフローベースシステムでのマルチプレックスビーズベースアッセイは、ｘＭＡＰ（多分析物プロファイリング）技術に基づいて設定される。Luminexアッセイの特有のマルチプレックスな能力（１００プレックスまで）は、異なる強度の赤色及び赤外蛍光物質で内部を染色したマイクロスフェアの使用に基づく。各ビーズは、固有の番号、すなわち「ビーズ領域」が与えられ、１つのビーズと別のビーズを区別するのを可能にする。
【0340】
マルチプレックスビーズベースアッセイは、抗体応答を推定するために広く使用されているＥＬＩＳＡの有効な代替手段であることを証明した。このアッセイは、より感度が高く、特異的で強いため、ＥＬＩＳＡよりも多くの利点を有する。一度に単一の抗原に対する応答を評価するために、ＥＬＩＳＡ及びＯＰＡなどのセルベースアッセイの能力では、多価ワクチンのデータを作成するのにより労力と時間がかかる。ハイスループットアプリケーションでのマルチプレックスビーズベースアッセイは、総ＩｇＧ力価を推定するのに要する時間ははるかに短い。ビーズベースアッセイがより単純でどこでも再現しやすいのに対して、複雑なセルベースアッセイを実施するためのリソース及び装置を有する研究室はごくわずかである。多価ワクチン候補を試験する場合、ＥＬＩＳＡ及びＯＰＡでは、血清試料の利用可能な体積が大きな問題であるが、ビーズベースアッセイでは比較的少ない体積の試料を必要とし、１価のアッセイと同様に精密で正確なデータを作成できる。血清希釈に肺炎球菌細胞壁多糖を使用することによって、抗体が交差反応して目的の抗原と結合するのを回避するように注意が払われている。マルチプレックスアッセイによって作成されたデータが従来のＯＰＡ力価とよく相関することをさまざまな報告及び発表論文が示している。
【0341】
このアッセイでは、自社で開発した結合法を使用して、個々のビーズセットを２１価のワクチン群の各肺炎球菌莢膜多糖（ＰｎＰＳ）抗原と結合させる。血清試料のさまざまな連続希釈中の抗体を、ビーズに結合した多糖抗原と反応させ、蛍光色素（Ｒ－フィコエリトリン）タグ付け抗体結合体を使用して検出する。各抗原のビーズタイプ別に生じた蛍光をLuminexシステム（Bio-Plex200, Bio-Rad）で測定する。
【0342】
この結果を抗体価の形態で分析した。総ＩｇＧ力価を計算するカットオフは、特定抗原のバックグラウンド値を差し引いた後、ＭＦＩが１００以上の血清試料の最高希釈度の逆数として設定した。１：１００希釈のブランクを引いたＭＦＩが１００未満である場合、２倍減／以前の希釈１：１００、すなわち５０を力価とみなす。同様に、ブランク値を差し引いた後、最終希釈度のＭＦＩが２００以上である場合、次のそれぞれの２倍の希釈度を力価とみなす。
【0343】
オプソニン化貪食アッセイ（ＯＰＡ）又はマルチプレックスオプソニン化貪食アッセイ（ＭＯＰＡ）による抗体の機能推定
オプソニン化貪食殺傷アッセイ（ＯＰＡ）及び酵素結合免疫測定法（ＥＩＡ）は、ワクチンの有効性を評価する最も一般的な方法である。ＥＩＡは、肺炎球菌ワクチンのために産生された抗体数についての有用な情報を提供するが、免疫応答の間に産生された機能的ＩｇＧに関する情報を実際に提供することはない。肺炎球菌に対する宿主防御が、細菌のオプソニン化を引き起こす食細胞によって媒介されるため、オプソニン化貪食殺傷アッセイ（ＯＰＡ）は、オプソニン化の過程に機能的に関与する抗肺炎球菌抗体の評価の好ましい生物分析アッセイであることを証明する。肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するために標準化された血清免疫グロブリンＧ抗肺炎球菌莢膜多糖酵素免疫測定法を補助するものとして、細菌のオプソニン化貪食による殺傷を媒介する抗体及び補体を用いたin vitroオプソニン化貪食アッセイ（ＯＰＡ）が計画され開発された。ＯＰＡは、肺炎球菌ワクチンの開発の間、基盤となる。ワクチン製剤の調節又は変更は、徹底的に評価し、その後のワクチン開発中の製剤の改善につなげることができるため、ワクチン認可の前にＯＰＡを行うのは極めて重要である。
オプソニン化貪食殺傷アッセイ（ＯＰＡ）及び酵素結合免疫測定法（ＥＩＡ）は、ワクチンの有効性を評価する最も一般的な方法である。ＥＩＡは、肺炎球菌ワクチンのために産生された抗体数についての有用な情報を提供するが、免疫応答の間に産生された機能的ＩｇＧに関する情報を実際に提供することはない。肺炎球菌に対する宿主防御が、細菌のオプソニン化を引き起こす食細胞によって媒介されるため、オプソニン化貪食殺傷アッセイ（ＯＰＡ）は、オプソニン化の過程に機能的に関与する抗肺炎球菌抗体の評価の好ましい生物分析アッセイであることを証明する。肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するために標準化された血清免疫グロブリンＧ抗肺炎球菌莢膜多糖酵素免疫測定法を補助するものとして、細菌のオプソニン化貪食による殺傷を媒介する抗体及び補体を用いたin vitroオプソニン化貪食アッセイ（ＯＰＡ）が計画され開発された。ＯＰＡは、肺炎球菌ワクチンの開発の間、基盤となる。ワクチン製剤の調節又は変更は、徹底的に評価し、その後のワクチン開発中の製剤の改善につなげることができるため、ワクチン認可の前にＯＰＡを行うのは極めて重要である。
【0344】
ＭＯＰＡはマルチプレックスＯＰＡであり、４種の細菌に対するＯＰＡ力価を１つのウェルで分析できる。モノプレックスＯＰＡは非常に時間と労力がかかるため、ＭＯＰＡを行うことは、ＯＰＡに対し、ワクチン製剤に含まれる多くの血清型を試験するための血清体積が少なくて済むこと、及びアッセイのハイスループットの性質により迅速で正確な分析が可能なこと、といった複数の利点を有する。
【0345】
ＭＯＰＡの株は、肺炎球菌免疫原性分析の研究室でもあるＵＡＢ（University of Alabama－Moon Nahm教授の研究室）から調達した。全ての主要な肺炎球菌ワクチン製造会社は、ワクチンの研究及び臨床評価に、ＵＡＢが提供した同じＭＯＰＡ手順及び株を現在使用している。
【0346】
ＭＯＰＡは、特定の抗生物質に対する抗生物質抵抗性を有する、改変された肺炎球菌臨床株を使用し（抗生物質は、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム及びオプトヒンを含む）、細菌のセット（１セットあたり４種の細菌）で使用される。血清試料のさまざまな希釈を分析し、補体対照ウェルと比較して５０％以上の細菌を殺傷する血清の最高希釈度をＭＯＰＡ力価とみなす。
【0347】
抗原含有量を推定するための改変アミン結合 Luminex xMAPは２種類の蛍光物質で内部をラベルしたカルボキシル化ビーズ（マイクロスフェア）を利用する新しい技術であり、各ビーズセットをビーズ領域と呼ばれる固有のＩＤで指定する。この工程は、所与の試料において複数（１００まで）の異なる分析物を同時に評価するのに利用できるという重要な応用をこの方法に与える。このためには、分析物を、ビーズに存在するＣＯＯＨ基を使用してビーズに結合させる必要がある。細菌多糖の結合には多くの方法が報告されており、ほとんどが２日間かかるプロトコルである。ＤＭＴＭＭ－ＣＯＯＨ、ＤＭＴＭＭ－ＮＨ２、ＰＬＬのように以前開発された方法をＳＩＩＰＬの６Ｂ、９Ｖ及び１９Ａ型多糖の結合に適用したところ、得られた結合ビーズは、ＩｇＧ滴定アッセイに適していたが、抗原含有量を推定するための競合阻害アッセイにおいて直線状の曲線が得られないことが明らかになった。ビーズのダイナミックレンジは非常に狭く、開発されたビーズベースの競合阻害アッセイ（ＢＢＣＩＡ）に必要な全部で８点の標準点のうち、直線状の範囲に入ることができた標準濃度はほとんど４～６点であった。アッセイはＳＳＩウサギ血清からの抗体を含むため、ポリクローナル血清中の交差反応抗体の程度が大きいことによりビーズが適さないことが何度も明らかになった。ＢＢＣＩＡはマルチプレックスアッセイ（１０プレックス）であるため、各血清型に特異的な抗体は混合物で使用されている。ＳＳＩ血清の交差反応パターンが可変であることから、各血清型に特異的な抗体の希釈を最適化することは困難であった。このため、多糖結合を高める、それにより抗体希釈の容易な最適化の機会を増やし、ＢＢＣＩＡの８種類の標準濃度で直線状の曲線を有することができる新しい結合方法を導入せざるを得なくなった。
【0348】
新しく開発した結合方法は、タンパク質分析物だけでなく多糖の結合に磁気ビーズを使用する場合、遠心分離の代わりにビーズ洗浄工程に磁気ＥＬＩＳＡ洗浄機を利用するという独自の方法で構築された。
【0349】
改変アミン結合のプロトコル
１． １×スケールの結合反応では、適切に混合した単分散の１００μｌ（およそ１．２５×１０６）ビーズからのビーズペレットをビーズ活性化緩衝液に再懸濁する。ビーズを、新たに作製した５０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ及びＳ－ＮＨＳ（ｐＨ６の１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液のビーズ活性化緩衝液中）各１０μｌで、暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで振とうしながら室温で２０～３０分間活性化させる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でビーズを２回洗浄し、ビーズペレットを水に再懸濁する。
２． 結合する多糖を新たに調製した２００ｍｇ／ｍｌのＥＤＣと混合することによって活性化し、混合物を活性化ビーズに加える。ビーズ－多糖－ＥＤＣ混合物を、結合のために暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで、室温で２～３時間インキュベートし、次いで１６５００×ｇで５分間遠心分離することによってＰＢＳで３回洗浄する。
３． 開いている活性基（アッセイ中に非特異的結合を引き起こす可能性がある）をマスクするために、ビーズを２５０ｍＭグルコース及びグリシンで、それぞれ３０～４５分間、暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで、室温でブロッキングした。ビーズをＰＢＳで再度洗浄し、最初のビーズ体積と同量の保存緩衝液中で保存する。
４． 磁気ビーズを結合に使用しながら、以下を変更して、ポリスチレンプレート及び磁気洗浄機を使用するという異なる手法に従った。
－ ビーズを丸底９６ウェルプレートに取った。遠心分離の代わりに、磁気ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用して３サイクル、２回の洗浄サイクルの間に、ビーズを沈ませる／磁石によって底に維持するために１分間の間隔を置いて洗浄した（３００μｌ緩衝液／ウェル；結合反応前、ＰＢＳ及び結合反応後、０．２％ＢＳＡ、０．１％tween（登録商標）20及び０．０５％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ）。
－ ビーズの活性化、結合及びビーズのブロッキングでは、インキュベーションはオービタルシェーカーで行った。
１． １×スケールの結合反応では、適切に混合した単分散の１００μｌ（およそ１．２５×１０６）ビーズからのビーズペレットをビーズ活性化緩衝液に再懸濁する。ビーズを、新たに作製した５０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ及びＳ－ＮＨＳ（ｐＨ６の１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液のビーズ活性化緩衝液中）各１０μｌで、暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで振とうしながら室温で２０～３０分間活性化させる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でビーズを２回洗浄し、ビーズペレットを水に再懸濁する。
２． 結合する多糖を新たに調製した２００ｍｇ／ｍｌのＥＤＣと混合することによって活性化し、混合物を活性化ビーズに加える。ビーズ－多糖－ＥＤＣ混合物を、結合のために暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで、室温で２～３時間インキュベートし、次いで１６５００×ｇで５分間遠心分離することによってＰＢＳで３回洗浄する。
３． 開いている活性基（アッセイ中に非特異的結合を引き起こす可能性がある）をマスクするために、ビーズを２５０ｍＭグルコース及びグリシンで、それぞれ３０～４５分間、暗所でロトスピン（商標）で３０ＲＰＭで、室温でブロッキングした。ビーズをＰＢＳで再度洗浄し、最初のビーズ体積と同量の保存緩衝液中で保存する。
４． 磁気ビーズを結合に使用しながら、以下を変更して、ポリスチレンプレート及び磁気洗浄機を使用するという異なる手法に従った。
－ ビーズを丸底９６ウェルプレートに取った。遠心分離の代わりに、磁気ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用して３サイクル、２回の洗浄サイクルの間に、ビーズを沈ませる／磁石によって底に維持するために１分間の間隔を置いて洗浄した（３００μｌ緩衝液／ウェル；結合反応前、ＰＢＳ及び結合反応後、０．２％ＢＳＡ、０．１％tween（登録商標）20及び０．０５％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ）。
－ ビーズの活性化、結合及びビーズのブロッキングでは、インキュベーションはオービタルシェーカーで行った。
【0350】
改変アミン結合の利点
これまで利用可能であった方法によって結合した６Ｂ、９Ｖ及び１９Ａ型ＳＩＩＰＬ多糖ビーズは、感度の高い他の血清型と比較して、効率が低く一貫性がなかったため、アッセイ感度が制限された。これにより、ＰＣＶ１０の全ての多糖について同様の標準範囲で曲線を最適化するのが困難となり、これを回避するために、ＢＢＣＩＡの結合にはＡＴＣＣから調達した多糖を使用した。
これまで利用可能であった方法によって結合した６Ｂ、９Ｖ及び１９Ａ型ＳＩＩＰＬ多糖ビーズは、感度の高い他の血清型と比較して、効率が低く一貫性がなかったため、アッセイ感度が制限された。これにより、ＰＣＶ１０の全ての多糖について同様の標準範囲で曲線を最適化するのが困難となり、これを回避するために、ＢＢＣＩＡの結合にはＡＴＣＣから調達した多糖を使用した。
【0351】
改変アミン結合方法の利点は、上述の血清型について高効率のＳＩＩＰＬ多糖結合ビーズを製造でき、それは直線状の範囲の標準点の数が増加することによって間接的にアッセイの感度を高めるのに役立つことである。これらのビーズは、抗原含有量を推定するためにＢＢＣＩＡでこれらのビーズを使用するための必要条件であった抗体希釈の容易な最適化（ビーズ適格性確認）も促進した。
【0352】
３つの異なる結合ロットでこれらの血清型に使用された改変アミン結合方法は、うまく適格であることが確認され、ビーズ結合の一貫性及びＢＢＣＩＡでのそれらの適格性を示していることが明らかになった。
【0353】
上記の利点に加えて、改変アミン結合方法は、以下に述べるように、以前の方法に対していくつかの他の利点を有する。
－ 結合に必要な多糖の量が少ない（通常、最大２５μｇ）
－ この方法はより労力がかからず、より時間がかからない
－ ビーズの適格性確認及び抗体希釈の最適化のための時間／実験数の減少
－ 結合反応にポリスチレン管を使用する場合、ビーズが管の内壁に結合する。これらの結合ビーズは、廃棄のために上清を回収する時に廃棄されるため、ビーズ数が少なくなる。ビーズの喪失を減らすために、多糖と磁気ビーズの結合にポリスチレン９６ウェルプレートを使用し、ビーズ洗浄工程に磁気ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用する方法でアッセイを開発した。
－ 結合に必要な多糖の量が少ない（通常、最大２５μｇ）
－ この方法はより労力がかからず、より時間がかからない
－ ビーズの適格性確認及び抗体希釈の最適化のための時間／実験数の減少
－ 結合反応にポリスチレン管を使用する場合、ビーズが管の内壁に結合する。これらの結合ビーズは、廃棄のために上清を回収する時に廃棄されるため、ビーズ数が少なくなる。ビーズの喪失を減らすために、多糖と磁気ビーズの結合にポリスチレン９６ウェルプレートを使用し、ビーズ洗浄工程に磁気ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用する方法でアッセイを開発した。
【0354】
改変アミン結合方法によって結合した６Ｂ、９Ｖ、及び１９Ａ型多糖ビーズは、以前の方法の１つによって結合した他の多糖のビーズと組み合わせて使用し、ＢＢＣＩＡに適していることが明らかになった。３種の多糖全てについて３つの異なるビーズロットがＢＢＣＩＡに適格であることが確認され、最終ロットの抗原含有量の回収率は、表示の含有量の７０～１３０％である設定規格以内であることが明らかになった。
【0355】
これらの多糖を６０倍の結合スケールで結合しても、小規模の結合の３つのロットと同様の結果が得られ、結合スケールは更に増大できる。
【0356】
(b) 出願人の開発したＰＣＶ２１製剤である実験１２１；実験１１９；実験１３１及び市販の比較基準（プレベナー１３及びシンフロリックス）のマウス免疫原性比較データ
研究目的：この研究の目的は、ＳＩＩＰＬが開発したＰＣＶ２１製剤である実験１２１、実験１１９、実験１３１が強い免疫応答を引き起こす可能性を評価し、市販の比較基準（プレベナー１３及びシンフロリックス）の免疫原性と比較することであった。総ＩｇＧ力価は、マルチプレックスビーズベースアッセイ（Luminex 200）によって評価した。
研究目的：この研究の目的は、ＳＩＩＰＬが開発したＰＣＶ２１製剤である実験１２１、実験１１９、実験１３１が強い免疫応答を引き起こす可能性を評価し、市販の比較基準（プレベナー１３及びシンフロリックス）の免疫原性と比較することであった。総ＩｇＧ力価は、マルチプレックスビーズベースアッセイ（Luminex 200）によって評価した。
【0357】
研究詳細：ＳＩＩＰＬのＰＣＶ－２１開発製剤である実験１２１、実験１１９及び実験１３１、並びに比較基準（プレベナー１３及びシンフロリックス）を、マウス（Ｈａｒｌａｎマウス）の皮下に１／１００希釈で注入した。マウスに０日目、１４日目及び２８日目に注入し、４２日目にエンドポイント力価推定のために採血した。４２日目（最終採血）に回収した血液から血清を分離し、ビーズベースマルチプレックスアッセイによって総ＩｇＧ力価を確認した。
【0358】
ＩｇＧ力価推定に使用した方法：総ＩｇＧ力価をLuminex 200プラットフォームを使用したマルチプレックスビーズベースアッセイを使用して決定した。力価は、ＭＦＩが１００以上（カットオフ値）である血清試料の最高希釈度を決定することによって計算した。
【0359】
この研究で使用した製剤の詳細を、表－１５に示す。
【0360】
【表15】
【0361】
出願人の開発製剤について、４２日目の力価を表－１６に概説し、プレベナー１３及びシンフロリックスと比較する。
【0362】
【表16-1】
【0363】
【表16-2】
【0364】
比較のための全体的推論
ＴＴとの結合の影響－ 総ＩｇＧ力価は、実験１１９；実験１３１においてＴＴ結合体が使用されている血清型３、６Ａ、９Ｖ及び１９Ａで、実験１２１におけるＣＲＭ結合体製剤 実と比較して、著しく増加した。
ＴＴとの結合の影響－ 総ＩｇＧ力価は、実験１１９；実験１３１においてＴＴ結合体が使用されている血清型３、６Ａ、９Ｖ及び１９Ａで、実験１２１におけるＣＲＭ結合体製剤 実と比較して、著しく増加した。
【0365】
さらに、同様の血清型の交差反応性（すなわち６Ａ－６Ｂ及び１９Ａ－１９Ｆ）も、実験１２１と比較して実験１３１で観察される。
【0366】
血清型３に由来する肺炎球菌多糖を含まないワクチン組成物の免疫原性研究は進行中であり、同様の結果が予想される。
【0367】
抗体は、それを刺激した抗原以外の抗原と反応する。この現象は、交差反応又は交差反応性と呼ばれる。交差反応は、抗原上の共有エピトープ又はエピトープの立体構造的類似性によって起こる。本研究では、６Ａ及び１９Ａの免疫応答が増加（キャリアタンパク質の変化による）し、６Ｂ及び１９Ｆに対する免疫応答も、おそらく交差反応性によって増加したことが、データから判明した。
【0368】
技術的進歩
明細書に開示したワクチン組成物及びワクチン組成物の製造方法は、以下の点を含むがこれらには限定されない技術的利点を有する：
－ 凝集体のないワクチン組成物は、広い温度範囲で長期安定性を示す
－ ＴＴをキャリアタンパク質として使用した場合、ＣＲＭ１９７をキャリアタンパク質として使用した場合と比較して、血清型６Ａ、９Ｖ、１９Ａに対する免疫応答が改善される
－ 高い免疫応答を確実にする、最適な分子量のサイジング後の多糖及び結合体
－ 多糖断片化に関して、高い多糖回収率と、（化学的サイジングに対して）高圧ホモジナイゼーションを利用することによって維持される構造的完全性
－ 安定した製剤（低遊離多糖、低遊離タンパク質含有量）
－ 最も流行している肺炎球菌の血清型に対する防御を提供する
－ 多くのアルミニウム塩アジュバントの使用が肺炎球菌多糖の吸着の改善を可能にする
－ 多くのポリソルベート２０の使用が凝集体／フロキュールの形成を回避する
－ ６Ａ－ＴＴとの交差反応性による血清型６Ｂに対する免疫応答の増強
－ 多糖のＣＤＡＰ活性化の使用により、多糖エピトープのより良い維持とともにより速い結合反応がもたらされる
－ 複数のキャリアタンパク質の使用が、単一の種類のキャリアタンパク質を使用した結果としての免疫抑制を回避する。
明細書に開示したワクチン組成物及びワクチン組成物の製造方法は、以下の点を含むがこれらには限定されない技術的利点を有する：
－ 凝集体のないワクチン組成物は、広い温度範囲で長期安定性を示す
－ ＴＴをキャリアタンパク質として使用した場合、ＣＲＭ１９７をキャリアタンパク質として使用した場合と比較して、血清型６Ａ、９Ｖ、１９Ａに対する免疫応答が改善される
－ 高い免疫応答を確実にする、最適な分子量のサイジング後の多糖及び結合体
－ 多糖断片化に関して、高い多糖回収率と、（化学的サイジングに対して）高圧ホモジナイゼーションを利用することによって維持される構造的完全性
－ 安定した製剤（低遊離多糖、低遊離タンパク質含有量）
－ 最も流行している肺炎球菌の血清型に対する防御を提供する
－ 多くのアルミニウム塩アジュバントの使用が肺炎球菌多糖の吸着の改善を可能にする
－ 多くのポリソルベート２０の使用が凝集体／フロキュールの形成を回避する
－ ６Ａ－ＴＴとの交差反応性による血清型６Ｂに対する免疫応答の増強
－ 多糖のＣＤＡＰ活性化の使用により、多糖エピトープのより良い維持とともにより速い結合反応がもたらされる
－ 複数のキャリアタンパク質の使用が、単一の種類のキャリアタンパク質を使用した結果としての免疫抑制を回避する。
【0369】
特定の態様の前述の説明は、本明細書の態様の一般的性質を十分に明らかにするものであり、他者は、現在の知識を適用することにより、包括的な概念から逸脱することなく、このような特定の態様をさまざまな応用のために容易に改変及び／又は適合させることができ、したがって、このような適合及び改変は、開示される態様の意味及び等価物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書で利用される言い回し又は専門用語は、説明の目的のためのものであり、限定のためのものではないことを理解されたい。したがって、本明細書の態様は、好ましい態様の観点から説明されており、当業者であれば、本明細書の態様は、本明細書に記載される態様の趣旨及び範囲内で改変を加えて実施できることを認識するであろう。
【0370】
この明細書を通して、「含む（comprise）」という用語、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」のような変形は、述べられた要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を除外することを意味しないと理解される。
【0371】
「少なくとも」又は「少なくとも１つ」という表現の使用は、望ましい目的又は結果の１つ以上を達成するために本開示の態様で使用されてもよい、１つ以上の要素又は成分又は量の使用を示唆する。
【0372】
この明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などのいずれの考察も、本開示の文脈を提供する目的のみのためである。これらの事項のいずれか又は全てが、従来技術の基盤の一部を形成していること、又は、本出願の優先日以前のどこかで存在した、本開示に関連する分野における一般的な一般知識であったことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0373】
さまざまな物理的パラメーター、寸法又は量について言及された数値は、近似値に過ぎず、本明細書において具体的に反対の記述がない限り、パラメーター、寸法又は量に割り当てられた数値よりも１０％高い／低い数値が本開示の範囲内にあることが想定される。
【0374】
本明細書では、好ましい態様の構成要素及び構成要素部分にかなりの重点が置かれているが、本開示の原理から逸脱することなく、多くの態様を作ることができ、好ましい態様に多くの変更を加えることができることが理解されよう。好ましい態様におけるこれら及び他の変更並びに本開示の別の態様が本明細書の開示から当業者には明らかであり、これにより、前述の説明的事項が単に本開示の説明として解釈され、限定として解釈されないことがはっきりと理解される。
【図1】
【図2】
【外国語明細書】