特開 2024-153640 マイクロＲＮＡ適合ＳＨＲＮＡ（ＳＨＲＮＡＭＩＲ）を含む遺伝子改変免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024153640

(43)【公開日】2024-10-29

(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡ適合ＳＨＲＮＡ（ＳＨＲＮＡＭＩＲ）を含む遺伝子改変免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241022BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241022BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241022BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20241022BHJP

   A61P 35/02 20060101ALN20241022BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/113 Z

A61K35/17

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024107199

(22)【出願日】2024-07-03

(62)【分割の表示】P 2023085262の分割

【原出願日】2020-04-03

(31)【優先権主張番号】62/828,794

(32)【優先日】2019-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/843,804

(32)【優先日】2019-05-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/900,126

(32)【優先日】2019-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/930,905

(32)【優先日】2019-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/000,774

(32)【優先日】2020-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508117721

【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マーティン，アーロン

(72)【発明者】

【氏名】チャタートン，ジョン イー．

(72)【発明者】

【氏名】ピレス，ミシェル ブレンダ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】特定の標的遺伝子の安定なノックダウンを可能にするマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子を含む遺伝子改変免疫細胞を提供する。
【解決手段】そのゲノム中に、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核酸配列を含む遺伝子改変免疫細胞であって、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞において発現され、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞における標的タンパク質の発現を低下させる、遺伝子改変免疫細胞である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

そのゲノム中に、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核
酸配列を含む遺伝子改変免疫細胞であって、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞
において発現され、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞における標的タンパク質
の発現を低下させる、遺伝子改変免疫細胞。

【請求項2】

遺伝子改変Ｔ細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項3】

遺伝子改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１
に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項4】

遺伝子改変Ｂ細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項5】

遺伝子改変された単球もしくはマクロファージ、またはそれに由来する細胞である、請
求項１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項6】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲが、５’から３’に：
（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；
（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；
（ｃ）パッセンジャー鎖；
（ｄ）ｍｉＲループドメイン；
（ｅ）ガイド鎖；
（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；および
（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメイン；
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項7】

前記ｍｉＲループドメインがｍｉＲ－３０ａループドメインである、請求項６に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項8】

前記ｍｉＲ－３０ａループドメインが、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を
有する核酸配列を含む、請求項７に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項9】

前記ｍｉＲ－３０ａループドメインが配列番号３の核酸配列を含む、請求項８に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項10】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲが、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ）足場、ｍｉＲ－３０（例
えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ－１６足場、ｍｉＲ－１５５足
場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場、またはｍｉＲ－１０７足場を含む、請求項
６～９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項11】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲがｍｉＲ－Ｅ足場を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変免疫細
胞。

【請求項12】

（ａ）前記５’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を
有する核酸配列を含み；
（ｂ）前記５’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％の配列同
一性を有する核酸配列を含み；
（ｃ）前記３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％の配列同
一性を有する核酸配列を含み；および
（ｄ）前記３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を
有する核酸配列を含む、
請求項６～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項13】

（ａ）前記５’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号１の核酸配列を含み；
（ｂ）前記５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号２の核酸配列を含み；
（ｃ）前記３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配列を含み；および
（ｄ）前記３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む、
請求項１２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項14】

そのゲノム中に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を
コードする核酸配列を含み、該ＣＡＲまたは該外因性ＴＣＲを発現させる、請求項１～１
３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項15】

そのゲノム中に、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合タン
パク質をコードする核酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変
免疫細胞。

【請求項16】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項17】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１５ま
たは請求項１６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項18】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列とは異なる遺伝子内に位置する、請求項１４～１７のいずれ
か一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項19】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列、または前記ＣＡＲもしくは前記外因
性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が、ＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常
領域遺伝子内に位置する、請求項１８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項20】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列と同じ遺伝子内に位置する、請求項１４～１７のいずれか一
項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項21】

前記遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である、請求
項２０に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項22】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲまたは前記外因性Ｔ
ＣＲをコードする前記核酸配列が前記遺伝子中のカセット内にある、請求項２０または請
求項２１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項23】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲまたは前記外因性Ｔ
ＣＲをコードする前記核酸配列が同じプロモータに作動可能に連結されている、請求項２
０～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項24】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項25】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項26】

前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列と、前記ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする前記核酸配列とが、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される、請求項
２０～２５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項27】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列と同じ向きである、請求項２０～２６のいずれか一項に記載
の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項28】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列と逆向きである、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項29】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項30】

前記カセットが、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲま
たは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含
む、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項31】

前記カセットが終結シグナルを含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項32】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする前記核酸配列と同じ遺伝子内に位置する、請求項１５～１７のいずれか一項に
記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項33】

前記遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である、請求
項３２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項34】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする前記核酸配列が、前記遺伝子中のカセット内にある、請求項３２または請求
項３３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項35】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列が、同じプロモータに作動可能に連結されている、請求項３２～３
４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項36】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項37】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項38】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列と、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする前記核酸配列とが、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される、請求項３２
～３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項39】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項40】

前記カセットがプロモータを含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列お
よび前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が該プロモータに作動可能に連
結されている、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項41】

前記カセットが終結シグナルを含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項42】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲ
をコードする前記核酸配列、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸
配列が同じ遺伝子内に位置する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項43】

前記遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である、請求
項４２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項44】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲ
をコードする前記核酸配列、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸
配列が、前記遺伝子中のカセット内にある、請求項４２または請求項４３に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項45】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲ
をコードする前記核酸配列、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸
配列が、同じプロモータに作動可能に連結されている、請求項４２～４４のいずれか一項
に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項46】

そのゲノム中に：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｃ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｄ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項47】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項48】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項49】

前記カセットが、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項４４～４８のい
ずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項50】

前記カセットが終結シグナルを含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項51】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；お
よび
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項52】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項53】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項54】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項55】

前記イントロン配列が合成イントロン配列である、請求項２９～３１、３９～４１、４
７～５０、または５１～５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項56】

前記イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配
列を含む、請求項２９～３１、３９～４１、４７～５０、または５１～５４のいずれか一
項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項57】

前記イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含む、請求項２９～３１、３９～４１
、４７～５０、または５１～５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項58】

前記終結シグナルがポリＡ配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルである
、請求項３１、４１、５０または５１～５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項59】

前記ポリＡ配列が、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項５８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項60】

前記ポリＡ配列が配列番号６８の核酸配列を含む、請求項５８に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項61】

前記ＢＧＨ終結シグナルが、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核
酸配列を含む、請求項５８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項62】

前記ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１の核酸配列を含む、請求項５８に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項63】

前記プロモータが、配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項２３～３１、３５～４１、または４５～６２のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項64】

前記プロモータが配列番号６７の核酸配列を含む、請求項２３～３１、３５～４１、ま
たは４５～６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項65】

前記２Ａ配列が、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
むＰ２Ａ／フューリン部位である、請求項２６～２８、３０、３１、３８、４０、４１ま
たは４６～６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項66】

前記２Ａ配列が、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である、請求
項２６～２８、３０、３１、３８、４０、４１または４６～６４のいずれか一項に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項67】

前記ＣＡＲが、配列番号７３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含むシグナルペプチドを含む、請求項１４～６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項68】

前記ＣＡＲが、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む、請求項１
４～６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項69】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むプロモー
タ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３と少
なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配
列；
（ｃ）配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／
フューリン部位；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内
に配置され、該イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する
核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内
に配置される核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前
記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該プロモータに
作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項70】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７の核酸配列を含むプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３のア
ミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；
（ｃ）配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、該イントロン配列が配列番
号６９の核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロ
ン配列内に配置される核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、配列番号６８の核酸配列を含む終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前
記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該プロモータに
作動可能に連結されているカセットを含む、請求項４５に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項71】

そのゲノム中に、配列番号７４と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
むカセットを含み、該カセットが、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置さ
れる、請求項６９または請求項７０に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項72】

そのゲノム中に、配列番号７４の核酸配列を含むカセットを含み、該カセットが、ＴＣ
Ｒアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置される、請求項６９または請求項７０に記
載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項73】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲまたは前記外因性Ｔ
ＣＲをコードする前記核酸配列が、異なるプロモータに作動可能に連結されている、請求
項２０～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項74】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項７３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項75】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項７３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項76】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列と同じ向きである、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の遺
伝子改変免疫細胞。

【請求項77】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列と逆向きである、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の遺伝
子改変免疫細胞。

【請求項78】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項７４～７７の
いずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項79】

前記第１のプロモータと前記第２のプロモータとが異なる、請求項７４～７７のいずれ
か一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項80】

前記カセットが１つまたは複数の終結シグナルを含む、請求項７４～７９のいずれか一
項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項81】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする前記核酸配列が、異なるプロモータに作動可能に連結されている、請求項２
０～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項82】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項８１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項83】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする前記核酸配列
を含むカセットを含む、請求項８１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項84】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項８０～８２の
いずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項85】

前記第１のプロモータと前記第２のプロモータとが異なる、請求項８０～８２のいずれ
か一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項86】

前記カセットが１つまたは複数の終結シグナルを含む、請求項８２～８５のいずれか一
項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項87】

そのゲノム内に：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｃ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が第１のプロモータに作
動可能に連結されており、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列およ
び前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結
されているカセットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細
胞。

【請求項88】

そのゲノム内に：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｃ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする前記核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記Ｈ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結
されているカセットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細
胞。

【請求項89】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項８７に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項90】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項８８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項91】

前記カセットが、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる
第１の終結シグナル、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることがで
きる第２の終結シグナルを含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項92】

前記カセットが、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第１
の終結シグナル、および前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲの転写を終結させることがで
きる第２の終結シグナルを含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項93】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；お
よび
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに
作動可能に連結されており、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列お
よび前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に
連結されているカセットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項94】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記ＣＡ
Ｒまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に
連結されているカセットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項95】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に
連結されているカセットを含む、請求項４２～４４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変
免疫細胞。

【請求項96】

そのゲノム内に、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可
能に連結されており、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列およ
び前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に連
結されているカセットを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項97】

前記イントロン配列が合成イントロン配列である、請求項８９～９６のいずれか一項に
記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項98】

前記イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配
列を含む、請求項８９～９６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項99】

前記イントロン配列が、配列番号６９の核酸配列を含む、請求項８９～９６のいずれか
一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項100】

前記１つまたは複数の終結シグナルがポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである、請
求項８０または請求項８６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項101】

前記第１の終結シグナルが前記第２の終結シグナルと同一である、請求項９１～９９の
いずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項102】

前記第１の終結シグナルおよび前記第２の終結シグナルがポリＡ配列またはＢＧＨ終結
シグナルである、請求項１０１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項103】

前記第１の終結シグナルが前記第２の終結シグナルとは異なる、請求項９１～９９のい
ずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項104】

前記第１の終結シグナルがポリＡ配列であり、前記第２の終結シグナルがＢＧＨ終結シ
グナルである、請求項１０３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項105】

前記第１の終結シグナルがＢＧＨ終結シグナルであり、前記第２の終結シグナルがポリ
Ａ配列である、請求項１０３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項106】

前記ポリＡ配列が、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項１００、１０２、１０４または１０５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項107】

前記ポリＡ配列が配列番号６８の核酸配列を含む、請求項１００、１０２、１０４また
は１０５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項108】

前記ＢＧＨ終結シグナルが、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核
酸配列を含む、請求項１００、１０２または１０４～１０７のいずれか一項に記載の遺伝
子改変免疫細胞。

【請求項109】

前記ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１の核酸配列を含む、請求項１００、１０２また
は１０４～１０７のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項110】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項７４～８０ま
たは８２～１０９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項111】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータがＪｅＴプロモータまたはＥＦ１ア
ルファコアプロモータである、請求項１１０に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項112】

前記第１のプロモータが前記第２のプロモータとは異なる、請求項７４～８０または８
２～１０９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項113】

前記第１のプロモータがＪｅＴプロモータであり、前記第２のプロモータがＥＦ１アル
ファコアプロモータである、請求項１１２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項114】

前記第１のプロモータがＥＦ１アルファコアプロモータであり、前記第２のプロモータ
がＪｅＴプロモータである、請求項１１２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項115】

前記ＪｅＴプロモータが、配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸
配列を含む、請求項１１１、１１３または１１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫
細胞。

【請求項116】

前記ＪｅＴプロモータが配列番号６７の核酸配列を含む、請求項１１１、１１３または
１１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項117】

前記ＥＦ１アルファコアプロモータが、配列番号７２と少なくとも８０％の配列同一性
を有する核酸配列を含む、請求項１１１または１１３～１１６のいずれか一項に記載の遺
伝子改変免疫細胞。

【請求項118】

前記ＥＦ１アルファコアプロモータが配列番号７２の核酸配列を含む、請求項１１１ま
たは１１３～１１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項119】

前記ＣＡＲが、配列番号７３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含むシグナルペプチドを含む、請求項７３～１１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免
疫細胞。

【請求項120】

前記ＣＡＲが、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む、請求項７
３～１１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項121】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプ
ロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３と少
なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配
列；
（ｃ）任意選択的に、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む第１の終結シグナル；
（ｄ）配列番号７２と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプ
ロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内
に配置され、該イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有す
る核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列
内に配置される核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に連結されているカセット
を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項122】

そのゲノム中に、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７の核酸配列を含む第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３のア
ミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；
（ｄ）配列番号７２の核酸配列を含む第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、該イントロン配列が配列番
号６９の核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロ
ン配列内に配置される核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核酸配列を含む第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする前記核酸配列が、該第２のプロモータに作動可能に連結されているカセッ
トを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項123】

そのゲノム中に、配列番号７５と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
むカセットを含み、該カセットが、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置さ
れる、請求項１２１または請求項１２２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項124】

そのゲノム中に、配列番号７５の核酸配列を含むカセットを含み、該カセットが、ＴＣ
Ｒアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に配置される、請求項１２１または請求項１２２
に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項125】

前記標的タンパク質の発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約
３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約
８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１～１２
４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項126】

前記標的タンパク質が、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＳ１、トランスフォーミング
増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５
２、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子、ＣＤ７、グルココルチコイ
ド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、核内受容体サブファミリー２
グループＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬ
Ａ－４）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）である、請求項１～１２５の
いずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項127】

前記標的タンパク質がベータ－２ミクログロブリンである、請求項１２６に記載の遺伝
子改変免疫細胞。

【請求項128】

ベータ－２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０
％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０
％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する
、請求項１２７に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項129】

ＭＨＣクラスＩ分子の発現が、対照細胞と比較して細胞表面上で少なくとも約１０％、
約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、
約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請
求項１２７または請求項１２８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項130】

対照細胞と比較して同種異系性が低下している、請求項１２７～１２９のいずれか一項
に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項131】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１８の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号
８の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号
１０の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１２の核酸配列を含む；
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１４の核酸配列を含む；または
（ｆ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１６の核酸配列を含む
請求項１２７～１３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項132】

前記パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号１８
の核酸配列を含む、請求項１２７～１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項133】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号４６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項134】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号４６の配列を含む、請求項
１３３に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項135】

前記標的タンパク質がＣＳ１である、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項136】

ＣＳ１の細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０
％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０
％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１３５に記載
の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項137】

ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する、請求項１３５または請求項１３６に
記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項138】

対照細胞と比較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫
細胞によるフラトリサイドを受けにくい、請求項１３５～１３７のいずれか一項に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項139】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２２の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２４の核酸配列を含む；または
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２６の核酸配列を含む、
請求項１３５～１３８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項140】

前記パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号２６
の核酸配列を含む、請求項１３５～１３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項141】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５０と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３５～１４０のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項142】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５０の配列を含む、請求項
１４１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項143】

前記標的タンパク質がＴＧＦＢＲ２である、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞
。

【請求項144】

ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、
約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、
約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１４３
に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項145】

対照細胞と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑
制を受けにくい、請求項１４３または請求項１４４に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項146】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２８の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３０の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３２の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３４の核酸配列を含む；または
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３６の核酸配列を含む、
請求項１４３～１４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項147】

前記パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号３２
の核酸配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項148】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５３と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４３～１４７のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項149】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５３の配列を含む、請求項
１４８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項150】

前記標的タンパク質がＣＢＬ－Ｂである、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項151】

ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約
３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約
８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１５０に
記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項152】

対照細胞と比較して、下流シグナリングタンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ
）シグナル伝達の抑制を受けにくい、請求項１５０または請求項１５１に記載の遺伝子改
変免疫細胞。

【請求項153】

前記標的タンパク質がＣＤ５２である、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項154】

ＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３
０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８
０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１５３に記
載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項155】

ＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい、請求項１５３または請求項１５４に記載の遺伝
子改変免疫細胞。

【請求項156】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３８の核酸配列を含む；または
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号４０の核酸配列を含む、
請求項１５３～１５５のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項157】

前記パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号３８
の核酸配列を含む、請求項１５３～１５６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項158】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５３～１５７のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項159】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５６の配列を含む、請求項
１５８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項160】

前記標的タンパク質がＤＣＫである、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項161】

ＤＣＫの細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０
％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０
％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１６０に記載
の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項162】

細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体の影響を受けにくい、請求項１６０または
請求項１６１に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項163】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号７７の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号７９の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８１の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８２の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８３の核酸配列を含む；または
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８４の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８５の核酸配列を含む、
請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項164】

前記パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号７７
の核酸配列を含む、請求項１６０～１６３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項165】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号８６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項１６０～１６４のいずれか一項に記載の遺伝子
改変免疫細胞。

【請求項166】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号８６の配列を含む、請求項
１６５に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項167】

前記標的タンパク質がＧＲである、請求項１２６に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項168】

ＧＲの細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％
、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％
、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１６７に記載の
遺伝子改変免疫細胞。

【請求項169】

細胞増殖に対するグルココルチコイドの影響を受けにくい、請求項１６７または請求項
１６８に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項170】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９２の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９４の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９６の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９８の核酸配列を含む；
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１００の核酸配列を含む；
（ｆ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０２の核酸配列を含む；
（ｇ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０４の核酸配列を含む；
（ｈ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０６の核酸配列を含む；または
（ｉ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０８の核酸配列を含む、
請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項171】

前記パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号９６
の核酸配列を含む、請求項１６７～１７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項172】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号１１１と少なくとも８０
％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１６７～１７１のいずれか一項に記載の遺伝
子改変免疫細胞。

【請求項173】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号１１１の配列を含む、請求
項１７２に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項174】

免疫細胞における内因性タンパク質の発現を低下させる方法であって、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を該免疫細胞に導入して、該鋳型核酸が該免疫細
胞のゲノムに挿入され、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該免疫細胞において内因性標的タンパク質
の発現を低下させることを含む、方法。

【請求項175】

前記免疫細胞がＴ細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１７４に記載の方法。

【請求項176】

前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれに由来する細胞である、請求
項１７４に記載の方法。

【請求項177】

前記免疫細胞がＢ細胞またはそれに由来する細胞である、請求項１７４に記載の方法。

【請求項178】

前記免疫細胞が単球もしくはマクロファージ、またはそれに由来する細胞である、請求
項１７４に記載の方法。

【請求項179】

前記鋳型核酸が、ランダムな組み込みによって前記免疫細胞のゲノムに挿入される、請
求項１７４～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項180】

レンチウイルスベクターを使用して前記鋳型核酸を前記免疫細胞に導入する、請求項１
７４～１７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項181】

前記免疫細胞がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する、請求項１７４～１８０のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項182】

前記免疫細胞のゲノム中の認識配列に特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコード
する第２の核酸を前記免疫細胞に導入し、該操作されたヌクレアーゼが前記免疫細胞にお
いて発現し、該認識配列に切断部位を生成し、前記鋳型核酸が該切断部位において前記免
疫細胞のゲノムに挿入されることをさらに含む、請求項１７４～１７８のいずれか一項に
記載の方法。

【請求項183】

前記鋳型核酸が、前記認識配列に隣接する配列と相同性を有する相同アームに隣接し、
前記鋳型核酸が相同組換えによって前記切断部位に挿入される、請求項１８２に記載の方
法。

【請求項184】

前記鋳型核酸がウイルスベクターによって前記免疫細胞に導入される、請求項１８２ま
たは請求項１８３に記載の方法。

【請求項185】

前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する、請求項１８５
に記載の方法。

【請求項187】

前記認識配列が標的遺伝子内にある、請求項１８２～１８６のいずれか一項に記載の方
法。

【請求項188】

前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が前記免疫細胞において破壊さ
れる、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

前記標的遺伝子が、ＴＣＲアルファ遺伝子およびＴＣＲアルファ定常領域遺伝子からな
る群から選択される、請求項１８７または請求項１８８に記載の方法。

【請求項190】

前記標的遺伝子がＴＣＲアルファ定常領域遺伝子であり、前記免疫細胞が内因性ＴＣＲ
の検出可能な細胞表面発現を有さない、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌク
レアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、ま
たはｍｅｇａＴＡＬである、請求項１８２～１９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項192】

前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項１８２～１
９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項193】

前記操作されたヌクレアーゼをコードする前記第２の核酸がｍＲＮＡを使用して導入さ
れる、請求項１８２～１９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項194】

前記免疫細胞が、そのゲノム中に、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を
含む、請求項１７４～１９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項195】

前記免疫細胞が、そのゲノム中にＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含
む、請求項１７４～１９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項196】

前記鋳型核酸が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲ
または前記外因性ＴＣＲが前記免疫細胞によって発現される、請求項１７４～１９３また
は１９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項197】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲまたは前記外因性Ｔ
ＣＲをコードする前記核酸配列が、前記切断部位に前記鋳型核酸を導入した後に、前記免
疫細胞中で同じプロモータに作動可能に連結される、請求項１９６に記載の方法。

【請求項198】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含む、請求項１９６または請求項１９７に記載の方法。

【請求項199】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列
を含む、請求項１９６または請求項１９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする前記核酸配列が、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される、請求項
１９６～１９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項201】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列と同じ向きである、請求項１９６～２００のいずれか一項に
記載の方法。

【請求項202】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列と逆向きである、請求項１９６～２００のいずれか一項に記
載の方法。

【請求項203】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項１９６または請求項１９７に記載の方法。

【請求項204】

前記鋳型核酸がプロモータを含み、該プロモータが、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣ
Ｒをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列に作
動可能に連結される、請求項１９６～２０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項205】

前記鋳型核酸が終結シグナルを含む、請求項１９６～２０４のいずれか一項に記載の方
法。

【請求項206】

前記鋳型核酸が、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が前記免疫細胞によって発現される、請求項１７４～１９４のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項207】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする前記核酸配列が、前記切断部位に前記鋳型核酸を導入した後、前記免疫細胞
中で同じプロモータに作動可能に連結される、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）前記前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含む、請求項２０６または請求項２０７に記載の方法。

【請求項209】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列；および
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列
を含む、請求項２０６または請求項２０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項210】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする前記核酸配列が、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される、請求項２０
６～２０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項211】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項２０６または請求項２０７に記載の方法。

【請求項212】

前記鋳型核酸がプロモータを含み、該プロモータが、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列に作動可
能に連結される、請求項２０６～２１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項213】

前記鋳型核酸が終結シグナルを含む、請求項２０６～２１２のいずれか一項に記載の方
法。

【請求項214】

前記鋳型核酸が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質をコードする核酸配列を含み、該ＣＡＲまたは該外因性ＴＣＲおよび該ＨＬ
Ａ－Ｅ融合タンパク質が前記免疫細胞によって発現される、請求項１７４～１９３のいず
れか一項に記載の方法。

【請求項215】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲ
をコードする前記核酸配列、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸
配列が、前記切断部位に前記鋳型核酸を導入した後に同じプロモータに作動可能に連結さ
れる、請求項２１４に記載の方法。

【請求項216】

前記鋳型核酸が：
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｃ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｄ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含む、請求項２１５に記載の方法。

【請求項217】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項２１６に記載の方法。

【請求項218】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項２１６に記載の方法。

【請求項219】

前記鋳型核酸が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項２１６に記載の
方法。

【請求項220】

前記鋳型核酸が終結シグナルを含む、請求項２１５～２１９のいずれか一項に記載の方
法。

【請求項221】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；お
よび
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項222】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項223】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項224】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）プロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；
（ｄ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；および
（ｅ）任意選択的に、終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする前記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸
配列が、該プロモータに作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項225】

前記イントロン配列が合成イントロン配列である、請求項２０３～２０５、２１１～２
１３または２１７～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項226】

前記イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配
列を含む、請求項２０３～２０５、２１１～２１３または２１７～２２４のいずれか一項
に記載の方法。

【請求項227】

前記イントロン配列が、配列番号６９の核酸配列を含む、請求項２０３～２０５、２１
１～２１３または２１７～２２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項228】

前記終結シグナルがポリＡ配列またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルである
、請求項２０５、２１３または２２０～２２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項229】

前記ポリＡ配列が、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項230】

前記ポリＡ配列が配列番号６８の核酸配列を含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項231】

前記ＢＧＨ終結シグナルが、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核
酸配列を含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項232】

前記ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１の核酸配列を含む、請求項２２８に記載の方法
。

【請求項233】

前記プロモータが、配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項１９７～２０５、２０７～２１３、または２１５～２３２のいずれか一項に
記載の方法。

【請求項234】

前記プロモータが配列番号６７の核酸配列を含む、請求項１９７～２０５、２０７～２
１３、または２１５～２３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項235】

前記２Ａ配列が、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
むＰ２Ａ／フューリン部位である、請求項２００～２０２、２０４、２０５、２１０、２
１２、２１３、または２１６～２３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項236】

前記２Ａ配列が、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である、請求
項２００～２０２、２０４、２０５、２１０、２１２、２１３、または２１６～２３４の
いずれか一項に記載の方法。

【請求項237】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む、請求項２０６～２３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項238】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項２０６
～２３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項239】

前記ＣＡＲが、配列番号７３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含むシグナルペプチドを含む、請求項１８１または１９４～２３８のいずれか一項に記載
の方法。

【請求項240】

前記ＣＡＲが、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む、請求項１
８１または１９４～２３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項241】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むプロモー
タ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３と少
なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配
列；
（ｃ）配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／
フューリン部位；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内
に配置され、該イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する
核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内
に配置される核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前
記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該プロモータに
作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項242】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７の核酸配列を含むプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３のア
ミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；
（ｃ）配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；
（ｄ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、該イントロン配列が配列番
号６９の核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロ
ン配列内に配置される核酸配列；および
（ｅ）任意選択的に、配列番号６８の核酸配列を含む終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前
記核酸配列、および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該プロモータに
作動可能に連結されている、請求項２１５に記載の方法。

【請求項243】

前記鋳型核酸が、配列番号７４と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
み、前記鋳型核酸が、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノムに挿入されている、請求
項２４１または請求項２４２に記載の方法。

【請求項244】

前記鋳型核酸が配列番号７４の核酸配列を含み、前記鋳型核酸がＴＣＲアルファ定常領
域遺伝子内のゲノムに挿入されている、請求項２４１または請求項２４２に記載の方法。

【請求項245】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＣＡＲまたは前記外因性Ｔ
ＣＲをコードする前記核酸配列が、前記切断部位に前記鋳型核酸を導入した後に、前記免
疫細胞中で異なるプロモータに作動可能に連結される、請求項１９６に記載の方法。

【請求項246】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコ
ードする前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
前記核酸配列
を含む、請求項２４５に記載の方法。

【請求項247】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコ
ードする前記核酸配列
を含む、請求項２４５に記載の方法。

【請求項248】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列と同じ向きである、請求項２４５～２４７のいずれか一項に記載
の方法。

【請求項249】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、前記ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを
コードする前記核酸配列と逆向きである、請求項２４５～２４７のいずれか一項に記載の
方法。

【請求項250】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項２４５～２４
９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項251】

前記第１のプロモータと前記第２のプロモータとが異なる、請求項２４５～２４９のい
ずれか一項に記載の方法。

【請求項252】

前記鋳型核酸が１つまたは複数の終結シグナルを含む、請求項２４５～２５１のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項253】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする前記核酸配列が、前記切断部位に前記鋳型核酸を導入した後、前記免疫細胞
中で異なるプロモータに作動可能に連結される、請求項２０６に記載の方法。

【請求項254】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコ
ードする前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
前記核酸配列
を含む、請求項２５３に記載の方法。

【請求項255】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）該第１のプロモータに作動可能に連結された前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
前記核酸配列；
（ｃ）第２のプロモータ；および
（ｄ）該第２のプロモータに作動可能に連結された前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコ
ードする前記核酸配列
を含む、請求項２５３に記載の方法。

【請求項256】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項２５３～２５
５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項257】

前記第１のプロモータと前記第２のプロモータとが異なる、請求項２５３～２５５のい
ずれか一項に記載の方法。

【請求項258】

前記鋳型核酸が１つまたは複数の終結シグナルを含む、請求項２５３～２５７のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項259】

前記鋳型核酸が、
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｃ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が第１のプロモータに作
動可能に連結されており、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列およ
び前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結
されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項260】

前記鋳型核酸が、
（ａ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｃ）前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする前記核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記Ｈ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結
されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項261】

イントロン配列が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置
され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配置さ
れる、請求項２５９に記載の方法。

【請求項262】

イントロン配列が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に
配置され、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、該イントロン配列内に配
置される、請求項２６０に記載の方法。

【請求項263】

前記鋳型核酸が、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる
第１の終結シグナル、および前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることがで
きる第２の終結シグナルを含む、請求項２５９～２６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項264】

前記鋳型核酸が、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第１
の終結シグナル、および前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲの転写を終結させることがで
きる第２の終結シグナルを含む、請求項２５９～２６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項265】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；お
よび
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに
作動可能に連結されおり、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列およ
び前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に連
結されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項266】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、イントロン
配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、前記ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記ＣＡ
Ｒまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に
連結されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項267】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されており、前記
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に
連結されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項268】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；
（ｄ）第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列であって、イント
ロン配列が前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列内に配置され、
前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列内に配置される核酸
配列；および
（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナル
を含み、
前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可
能に連結されており、前記ＣＡＲまたは前記外因性ＴＣＲをコードする前記核酸配列およ
び前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に連
結されている、請求項２１４に記載の方法。

【請求項269】

前記イントロン配列が合成イントロン配列である、請求項２６１～２６８のいずれか一
項に記載の方法。

【請求項270】

前記イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配
列を含む、請求項２６１～２６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項271】

前記イントロン配列が、配列番号６９の核酸配列を含む、請求項２６１～２６８のいず
れか一項に記載の方法。

【請求項272】

前記１つまたは複数の終結シグナルがポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである、請
求項２５２または請求項２５８に記載の方法。

【請求項273】

前記第１の終結シグナルが前記第２の終結シグナルと同一である、請求項２６３～２７
１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項274】

前記第１の終結シグナルが前記第２の終結シグナルとは異なる、請求項２６３～２７１
のいずれか一項に記載の方法。

【請求項275】

前記第１の終結シグナルがポリＡ配列であり、前記第２の終結シグナルがＢＧＨ終結シ
グナルである、請求項２７４に記載の方法。

【請求項276】

前記第１の終結シグナルがＢＧＨ終結シグナルであり、前記第２の終結シグナルがポリ
Ａ配列である、請求項２７４に記載の遺伝子改変免疫細胞。

【請求項277】

前記ポリＡ配列が、配列番号６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を
含む、請求項２７２、２７５または２７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項278】

前記ポリＡ配列が配列番号６８の核酸配列を含む、請求項２７２、２７５または２７６
のいずれか一項に記載の方法。

【請求項279】

前記ＢＧＨ終結シグナルが、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核
酸配列を含む、請求項２７２、２７５または２７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項280】

前記ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１の核酸配列を含む、請求項２７２、２７５また
は２７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項281】

前記第１のプロモータおよび前記第２のプロモータが同一である、請求項２４６～２５
２または２５４～２８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項282】

前記第１のプロモータが前記第２のプロモータとは異なる、請求項２４６～２５２また
は２５４～２８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項283】

前記第１のプロモータがＪｅＴプロモータであり、前記第２のプロモータがＥＦ１アル
ファコアプロモータである、請求項２８２に記載の方法。

【請求項284】

前記第１のプロモータがＥＦ１アルファコアプロモータであり、前記第２のプロモータ
がＪｅＴプロモータである、請求項２８２に記載の方法。

【請求項285】

前記ＪｅＴプロモータが、配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸
配列を含む、請求項２８３または請求項２８４に記載の方法。

【請求項286】

前記ＪｅＴプロモータが配列番号６７の核酸配列を含む、請求項２８３または請求項２
８４に記載の方法。

【請求項287】

前記ＥＦ１アルファコアプロモータが、配列番号７２と少なくとも８０％の配列同一性
を有する核酸配列を含む、請求項２８３～２８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項288】

前記ＥＦ１アルファコアプロモータが配列番号７２の核酸配列を含む、請求項２８３～
２８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項289】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む、請求項２５３～２８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項290】

前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項２５３
～２８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項291】

前記ＣＡＲが、配列番号７３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含むシグナルペプチドを含む、請求項２４５～２９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項292】

前記ＣＡＲが、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む、請求項２
４５～２９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項293】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプ
ロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３と少
なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配
列；
（ｃ）任意選択的に、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む第１の終結シグナル；
（ｄ）配列番号７２と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプ
ロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内
に配置され、該イントロン配列が、配列番号６９と少なくとも８０％の配列同一性を有す
る核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロン配列
内に配置される核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列
を含む第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする前記核酸配列が該第２のプロモータに作動可能に連結されている、請求項
２１４記載の方法。

【請求項294】

前記鋳型核酸が、５’から３’に：
（ａ）配列番号６７の核酸配列を含む第１のプロモータ；
（ｂ）前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列であって、前記ＣＡＲが配列番号７３のア
ミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；
（ｃ）任意選択的に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；
（ｄ）配列番号７２の核酸配列を含む第２のプロモータ；
（ｅ）前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列であって、前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列が前記ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列内に配置され、該イントロン配列が配列番
号６９の核酸配列を含み、前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が該イントロ
ン配列内に配置される核酸配列；および
（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核酸配列を含む第２の終結シグナル
を含み、
前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が該第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、前記ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする前記核酸配列および前記ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする前記核酸配列が、該第２のプロモータに作動可能に連結されている、請求
項２１４に記載の方法。

【請求項295】

前記鋳型核酸が、配列番号７５と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含
み、前記カセットが、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノムに挿入されている、請求
項２９３または請求項２９４に記載の方法。

【請求項296】

前記鋳型核酸が配列番号７５の核酸配列を含み、前記カセットがＴＣＲアルファ定常領
域遺伝子内のゲノムに挿入されている、請求項２９３または請求項２９４に記載の方法。

【請求項297】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲが、５’から３’に：
（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；
（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；
（ｃ）パッセンジャー鎖；
（ｄ）ｍｉＲループドメイン；
（ｅ）ガイド鎖；
（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；および
（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメイン
を含む、請求項１７４～２９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項298】

前記ｍｉＲループドメインがｍｉＲ－３０ａループドメインである、請求項２９７に記
載の方法。

【請求項299】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号３と少なくとも８０％の
配列同一性を有するｍｉＲ－３０ａループドメインコード配列を含む、請求項２９８に記
載の方法。

【請求項300】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号３のｍｉＲ－３０ａルー
プドメインコード配列を含む、請求項２９８に記載の方法。

【請求項301】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲが、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ）足場、ｍｉＲ－３０（例
えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ－１６足場、ｍｉＲ－１５５足
場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場またはｍｉＲ－１０７足場を含む、請求項１
７４～３００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項302】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲがｍｉＲ－Ｅ足場を含む、請求項３０１に記載の方法。

【請求項303】

（ａ）前記５’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を
有する核酸配列を含み；
（ｂ）前記５’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％の配列同
一性を有する核酸配列を含み；
（ｃ）前記３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％の配列同
一性を有する核酸配列を含み；および
（ｄ）前記３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を
有する核酸配列を含む、
請求項２９７～３０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項304】

ａ）前記５’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号１の核酸配列を含み；
（ｂ）前記５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号２の核酸配列を含み；
（ｃ）前記３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配列を含み；および
（ｄ）前記３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む、
請求項２９７～３０３に記載の方法。

【請求項305】

前記標的タンパク質の発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、
約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、
約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項１７４
～３０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項306】

前記標的タンパク質が、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＳ１、トランスフォーミング
増殖因子受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５２、Ｔ
ＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子、ＣＤ７、グルココルチコイド受容
体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、核内受容体サブファミリー２グルー
プＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４
）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）である、請求項１７４～３０５のい
ずれか一項に記載の方法。

【請求項307】

前記標的タンパク質がベータ－２ミクログロブリンである、請求項３０６に記載の方法
。

【請求項308】

ベータ－２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１
０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７
０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下す
る、請求項３０７に記載の方法。

【請求項309】

ＭＨＣクラスＩ分子の発現が、対照細胞と比較して細胞表面上で少なくとも約１０％、
約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、
約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請
求項３０７または請求項３０８に記載の方法。

【請求項310】

前記免疫細胞が、対照細胞と比較して同種異系性が低下している、請求項３０７～３０
９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項311】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１８の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号
８の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号
１０の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１２の核酸配列を含む；
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１４の核酸配列を含む；または
（ｆ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１６の核酸配列を含む；
請求項３０７～３１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項312】

前記パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号１８
の核酸配列を含む、請求項３０７～３１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項313】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号４６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項３０７～３１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項314】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号４６の配列を含む、請求項
３０７～３１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項315】

前記標的タンパク質がＣＳ１である、請求項３０６に記載の方法。

【請求項316】

ＣＳ１の細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０
％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０
％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３１５に記載
の方法。

【請求項317】

前記免疫細胞が、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する、請求項３１５また
は請求項３１６に記載の方法。

【請求項318】

前記免疫細胞が、対照細胞と比較してＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する
免疫細胞によるフラトリサイドに対する感受性が低い、請求項３１５～３１７のいずれか
一項に記載の方法。

【請求項319】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２２の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２４の核酸配列を含む；または
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２６の核酸配列を含む、
請求項３１５～３１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項320】

前記パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号２６
の核酸配列を含む、請求項３１５～３１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項321】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５０と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項３１５～３２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項322】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５０の配列を含む、請求項
３１５～３２１に記載の方法。

【請求項323】

前記標的タンパク質がＴＧＦＢＲ２である、請求項３０６に記載の方法。

【請求項324】

ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％
、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％
、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３２
３に記載の方法。

【請求項325】

前記免疫細胞が、対照細胞と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ
１）による免疫抑制を受けにくい、請求項３２３または請求項３２４に記載の方法。

【請求項326】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号２８の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３０の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３２の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３４の核酸配列を含む；または
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３６の核酸配列を含む、
請求項３２３～３２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項327】

前記パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号３２
の核酸配列を含む、請求項３２３～３２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項328】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５３と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項３２３～３２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項329】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５３の配列を含む、請求項
３２３～３２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項330】

前記標的タンパク質がＣＢＬ－Ｂである、請求項３０６に記載の方法。

【請求項331】

ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、
約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、
約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３３０
に記載の方法。

【請求項332】

前記免疫細胞が、対照細胞と比較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴ細
胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい、請求項３３０または請求項３３１
に記載の方法。

【請求項333】

前記標的タンパク質がＣＤ５２である、請求項３０６に記載の方法。

【請求項334】

ＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約
３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約
８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３３３に
記載の方法。

【請求項335】

前記免疫細胞がＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい、請求項３３３または請求項３３
４に記載の方法。

【請求項336】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号３８の核酸配列を含む；または
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号４０の核酸配列を含む、
請求項３３３～３３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項337】

前記パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号３８
の核酸配列を含む、請求項３３３～３３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項338】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号５６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項３３３～３３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項339】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号５６の配列を含む、請求項
３３３～３３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項340】

前記標的タンパク質がＤＣＫである、請求項３０６に記載の方法。

【請求項341】

ＤＣＫの細胞表面発現が、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３
０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８
０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３４０に記
載の方法。

【請求項342】

前記免疫細胞が、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体の影響を受けにくい、請
求項３４０または請求項３４１に記載の方法。

【請求項343】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号７７の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号７９の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８１の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８２の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８３の核酸配列を含む；または
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号８４の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号８５の核酸配列を含む、
請求項３４０～３４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項344】

前記パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号７７
の核酸配列を含む、請求項３４０～３４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項345】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号８６と少なくとも８０％
の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４０～３４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項346】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号８６の配列を含む、請求項
３４０～３４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項347】

前記標的タンパク質がＧＲである、請求項３０６に記載の方法。

【請求項348】

ＧＲの細胞表面発現が、対照細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％
、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％
、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する、請求項３４７に記載の
方法。

【請求項349】

前記免疫細胞が、細胞増殖に対するグルココルチコイドの影響を受けにくい、請求項３
４７または請求項３４８に記載の方法。

【請求項350】

（ａ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９２の核酸配列を含む；
（ｂ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９４の核酸配列を含む；
（ｃ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９６の核酸配列を含む；
（ｄ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号９８の核酸配列を含む；
（ｅ）前記パッセンジャー鎖が配列番号９９の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番
号１００の核酸配列を含む；
（ｆ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０２の核酸配列を含む；
（ｇ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０４の核酸配列を含む；
（ｈ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０６の核酸配列を含む；または
（ｉ）前記パッセンジャー鎖が配列番号１０７の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列
番号１０８の核酸配列を含む、
請求項 ３４７～３４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項351】

前記パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、前記ガイド鎖が配列番号９６
の核酸配列を含む、請求項３４７～３５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項352】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が、配列番号１１１と少なくとも８０
％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４７～３５１のいずれか一項に記載の方法
。

【請求項353】

前記ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする前記核酸配列が配列番号１１１の配列を含む、請求
項３４７～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項354】

請求項１７４～３０６のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項355】

請求項３０７～３１４のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項356】

請求項３１５～３２２のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項357】

請求項３２３～３２９のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項358】

請求項３３０～３３２のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項359】

請求項３３３～３３９のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項360】

請求項３４０～３４６のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項361】

請求項３４７～３５３のいずれか一項に記載の方法によって作製された免疫細胞。

【請求項362】

複数の請求項１～１７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞または複数の請求
項３５４～３６１のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む、細胞の集団。

【請求項363】

前記集団中の細胞の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、
約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、
または最大１００％が、請求項１～１７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞ま
たは請求項３５４～３６１のいずれか一項に記載の免疫細胞である、請求項３６２に記載
の細胞の集団。

【請求項364】

薬学的に許容される担体と、請求項１～１７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫
細胞または請求項３５４～３６１のいずれか一項に記載の免疫細胞とを含む、医薬組成物
。

【請求項365】

薬学的に許容される担体と、請求項３６２または請求項３６３に記載の細胞の集団とを
含む、請求項３２６に記載の医薬組成物。

【請求項366】

それを必要とする対象において疾患を治療するための免疫療法の方法であって、有効量
の請求項３６４または請求項３６５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む
、方法。

【請求項367】

それを必要とする対象においてがんを治療するための免疫療法であって、前記遺伝子改
変免疫細胞または前記免疫細胞が、遺伝子改変ヒトＴ細胞もしくはそれに由来する細胞、
または遺伝子改変ＮＫ細胞もしくはそれに由来する細胞であり、前記遺伝子改変免疫細胞
または前記免疫細胞が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを含み、前記ＣＡＲまたは前記外因性
ＴＣＲが、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、
請求項３６６に記載の方法。

【請求項368】

前記遺伝子改変免疫細胞または前記免疫細胞が、不活性化ＴＣＲアルファ遺伝子または
不活性化ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子を含む、請求項３６６または請求項３６７に記載
の方法。

【請求項369】

前記遺伝子改変免疫細胞または前記免疫細胞が、内因性アルファ／ベータＴＣＲの検出
可能な細胞表面発現を有さない、請求項３６６～３６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項370】

前記がんが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病のがんからなる群から選択
される、請求項３６７～３６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項371】

前記がんが、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒
色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、およびホジ
キンリンパ腫からなる群から選択される、請求項３６７～３７０のいずれか一項に記載の
方法。

【請求項372】

前記Ｂ細胞起源のがんが、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血
病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項
３７１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍学、がん免疫療法、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。
特に、本発明は、特定の標的遺伝子の安定なノックダウンを可能にするマイクロＲＮＡ適
合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子を含む遺伝子改変免疫細胞に関する。本発明はさ
らに、対象における内因性タンパク質の発現を低下させ、がんを含む疾患を治療するため
の、このような遺伝子改変免疫細胞の使用に関する。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全
体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年４月３日に作成されたＡＳＣＩＩコ
ピーは、ＰＢＩＯ－０３７ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿４－２０と名付けられ、サイズが５
８，９１１バイトである。

【背景技術】

【0003】

Ｔ細胞養子免疫療法は、がん治療のための有望なアプローチである。本明細書に開示さ
れる免疫療法治療方法は、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変
された単離ヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をＴ細胞に移植するための
キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは
対照的に、キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体の可変ドメインからそれらの特異性
を得る。したがって、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、主要組
織適合遺伝子複合体非拘束性様式で腫瘍免疫反応性を誘導する。Ｔ細胞養子免疫療法は、
Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、急性骨
髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫
、進行性神経膠腫、卵巣がん、中皮腫、黒色腫、前立腺がん、膵臓がんなどを含む多くの
がんの臨床療法として利用されている。

【0004】

がん治療としての潜在的有用性にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞による養子免疫療法は
、部分的には、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の発現によって制限されてきた。内因性
Ｔ細胞受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、同種異系患者への投与後に主要組織適合抗原
および副組織適合抗原を認識し得、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症をもたらし得る。
結果として、臨床試験は、患者のＴ細胞を単離し、キメラ抗原受容体を組み込むように遺
伝子改変し、次いで同じ患者に再注入する自己ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に主に焦点を当てて
きた。自己アプローチは、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプ
ローチは、患者のがんが診断された後に患者特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに必要な
時間および費用の両方によって制約される。

【0005】

したがって、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の発現が
低下しているか、または検出可能な細胞表面発現を有さず、投与時にＧＶＨＤを発症しな
い、第三者健常ドナー由来のＴ細胞を使用して調製された「既製の」ＣＡＲ Ｔ細胞を開
発することが有利であると思われる。このような製品は、診断の前に作製および検証する
ことができ、必要に応じてすぐに患者に利用可能にすることができる。したがって、ＧＶ
ＨＤの発生を防止するために、内因性Ｔ細胞受容体を欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の開発
が必要とされている。

【0006】

この目的のために、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質発現の発現を完
全にノックアウトするために、ベータ－２ミクログロブリン遺伝子に特異性を有する操作
されたメガヌクレアーゼが生成されている（例えば、特許文献１を参照されたい）。Ｂ２
Ｍは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の成分であり、Ｂ２Ｍが存在しな
ければこの分子は細胞表面に構築されない。したがって、Ｂ２Ｍのノックアウトは、ＣＡ
Ｒ Ｔ細胞を同種異系患者に投与した場合にＧＶＨＤを軽減するはずの、ＭＨＣクラスＩ
分子を排除するための手段である。

【0007】

しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞表面上のＢ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ分子発現を
完全に排除した結果により、ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらを非自己と見なすナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞による標的化をより受けやすくなる。この現象を考慮して、Ｂ２Ｍの不完
全なノックダウンを生じるための、ＣＡＲ Ｔ細胞に対するノックダウンアプローチが開
発された（例えば、特許文献２を参照されたい）。本質的に、Ｂ２Ｍ標的ｓｈＲＮＡコー
ド配列を含むカセットが、ヌクレアーゼ媒介標的挿入によってＴ細胞のＴ細胞受容体アル
ファ定常領域遺伝子に導入された。ｓｈＲＮＡコード配列は、ＣＡＲコード配列も含むカ
セットに含まれ、ＴＣＲ陰性、ＣＡＲ陽性であり、細胞表面Ｂ２Ｍの部分的ノックダウン
を有するＣＡＲ Ｔ細胞の生成を可能にした。このプロジェクトのデータは、これらのＣ
ＡＲ Ｔ細胞が実際に、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを示したＣＡＲ Ｔ細胞よりもＮＫ
細胞による殺滅を受けにくいことを実証した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１７／１１２８５９号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０１８／２０８８３７号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、本明細書に記載されるように、さらなる実験は、ｓｈＲＮＡコード配列
を含むカセットが安定ではなく、Ｂ２Ｍノックダウンが一過性であることを示した。最終
的に、細胞はゲノムからｓｈＲＮＡコード配列を除去し、Ｂ２Ｍ発現の回復を引き起こし
た。したがって、Ｂ２Ｍなどの内因性タンパク質の安定なノックダウンを維持することが
できるＣＡＲ Ｔ細胞の作製が依然として必要とされている。当技術分野におけるこの問
題に対する答えの探求に際して、免疫細胞において目的のタンパク質のさまざまな程度の
遺伝子ノックダウンを生じさせるために使用できる技術が本明細書において発見された。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、標的タンパク質の発現を低下させるマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲ）を発現する遺伝子改変免疫細胞（およびその集団）を提供する。標的タンパ
ク質の発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用は、タンパク質発現の安定
なノックダウンを可能にし、これは、ノックアウトではなくノックダウンが好ましい標的
タンパク質に理想的である。例えば、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）標的ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲの発現を介して、Ｂ２Ｍの発現レベルが低下した免疫細胞は、Ｂ２Ｍ発現が遺
伝子不活性化によってノックアウトされた細胞よりもナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によ
る細胞溶解に対する感度が低い。したがって、細胞のゲノムに挿入され、内因性タンパク
質の発現を低下させるために発現されるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳
型核酸を導入することによって、免疫細胞における内因性タンパク質の発現を低下させる
方法がさらに提供される。

【0011】

したがって、一態様では、本発明は、そのゲノム中にマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（
ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核酸配列を含む遺伝子改変免疫細胞を提供する。ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲは、遺伝子改変免疫細胞中で発現され、遺伝子改変免疫細胞における標的タン
パク質の発現を低下させる。標的タンパク質発現の低下は、ｓｈＲＮＡｍｉＲガイド配列
が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡへ結合することによって媒介される。

【0012】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞、またはそれに由
来する細胞である。ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変ナチュラルキ
ラー（ＮＫ）細胞、またはそれに由来する細胞である。他の実施形態では、遺伝子改変免
疫細胞は、遺伝子改変Ｂ細胞、またはそれに由来する細胞である。さまざまな実施形態で
は、遺伝子改変免疫細胞は、遺伝子改変された単球もしくはマクロファージ、またはそれ
に由来する細胞である。

【0013】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、５’から３’に：（ａ）５’ｍｉＲ足
場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）ドメイン；（ｃ）パ
ッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底
ステムドメイン；および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０ａループドメイン、
ｍｉＲ－１５ループドメイン、ｍｉＲ－１６ループドメイン、ｍｉＲ－１５５ループドメ
イン、ｍｉＲ－２２ループドメイン、ｍｉＲ－１０３ループドメインまたはｍｉＲ－１０
７ループドメインである。特定の実施形態では、ｍｉＲループドメインはｍｉＲ－３０ａ
ループドメインである。

【0015】

ある実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインが、配列番号３と少なくとも８０％
、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同
一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインは、
配列番号３の核酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ）足
場、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ－１６足
場、ｍｉＲ－１５５足場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場、またはｍｉＲ－１０
７足場を含む。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはｍｉＲ－Ｅ足場を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足
場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、
少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（ｂ）５’
ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含
み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有す
る核酸配列を含み；および／または（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号５と少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを
超える配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0018】

ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメ
インが配列番号１の核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号２
の核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配列を含み
；および（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、キメラ抗原受容体
（ＣＡＲ）または外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲま
たは外因性ＴＣＲは遺伝子改変免疫細胞によって発現される。

【0020】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、ＨＬＡクラスＩ組
織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列
同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外
因性ＴＣＲをコードする核酸配列とは異なる遺伝子内に位置する。ある実施形態では、ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、またはＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする
核酸配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内に位置する。
特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、またはＣＡＲもしくは外
因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、配列番号５８を含む配列内のＴＣＲアルファ定常領
域遺伝子内に位置する。

【0022】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外
因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ遺伝子内に位置する。ある実施形態では、遺伝子
は、ＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。特定の実施形態
では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコード
する核酸配列は、配列番号５８を含む配列内のＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内に位置す
る。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸は、遺伝子中のカセット内にある。いくつかのこのような実施
形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコ
ードする核酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのよう
な実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ＣＡ
Ｒまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列を含むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は
、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；お
よび（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いく
つかのこのような実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と、ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される
。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲま
たは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。他のこのような実施形態では
、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核
酸配列と逆向きである。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲま
たは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核
酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセット
は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかのこのような実施形態で
は、カセットは終結シグナルを含む。

【0023】

ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパ
ク質をコードする核酸配列と同じ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子
はＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形
態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコー
ドする核酸配列は、遺伝子中のカセット内にある。いくつかのこのような実施形態では、
ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核
酸配列は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態
では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ融合
タンパク質をコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そ
のゲノム中に、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；および
（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつか
のこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と、ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。特
定のこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする
核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配
置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットはプロモータを含み、ｓｈＲＮ
ＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は
プロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、カセット
は終結シグナルを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列
は、同じ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子はＴＣＲアルファ遺伝子
またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬ
Ａ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子中のカセット内にある。いくつか
のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列
は、同じプロモータに作動可能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、
遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする
核酸配列；（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードす
る核酸配列；および（ｄ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む
。いくつかのこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコ
ードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配
列内に配置される。他のこのような実施形態では、イントロン配列は、ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は
、イントロン配列内に配置される。いくつかのこのような実施形態では、カセットは、Ｃ
ＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする
核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモ
ータを含む。いくつかのこのような実施形態では、カセットは終結シグナルを含む。

【0025】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列
であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置さ
れ、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；
および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0026】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列で
あって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され
、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（
ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；
および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0027】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列で
あって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され
、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（
ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；
および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0028】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）プロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；
（ｃ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列
であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置さ
れ、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；
および（ｅ）任意選択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0029】

上記のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。ある実
施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列
を含む。特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の核酸配列を含む。

【0030】

上記のいくつかの実施形態では、終結シグナルはポリＡ配列またはウシ成長ホルモン（
ＢＧＨ）終結シグナルである。ある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超
える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号
６８の核酸配列を含む。ある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを
超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは
配列番号７１の核酸配列を含む。

【0031】

上記のいくつかの実施形態では、プロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、プロモータは、配列番号６７の核酸配列
を含む。

【0032】

上記のいくつかの実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０と少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を
有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。特定の実施形態では、２Ａ配列は
、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。

【0033】

上記のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列
番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

【0034】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ
）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも
９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡ
Ｒをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０と少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超え
る配列同一性を有する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ
を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タン
パク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える
配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロ
ン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える
配列同一性を有する核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
核酸配列が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0035】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ
）配列番号６７の核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であっ
て、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ
）配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパ
ク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ
酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配
置され、イントロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列
番号６８の核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－
Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
が、プロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0036】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７４と少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超
える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に
配置されているカセットを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノ
ム中に、配列番号７４の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に
配置されているカセットを含む。

【0037】

上記のいくつかの実施形態では、カセットは、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上
の核酸を含む。ある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
ことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ標的タンパク質の発現
を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。他の実施形態では、２
つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする。ある実施形態では、カセットは、本明細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする２つ以上の核酸を含むことができる。特定の実施形態では、カセットは、Ｂ２
Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を
低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み得る。

【0038】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲまたは
外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、同じ遺伝子に位置し、異なるプロモータに作動可
能に連結されている。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、その
ゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動
可能に連結された、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロ
モータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする核酸配列を含むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫
細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロ
モータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２の
プロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列を含むカセットを含む。いくつかのこのような実施形態で
は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする
核酸配列と同じ向きである。他のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。あるこ
のような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。他の実
施形態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。いくつかのこのような実
施形態では、カセットは１つまたは複数の終結シグナルを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質をコードする核酸配列は、異なるプロモータに作動可能に連結されている。
いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から
３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結された、Ｈ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）
第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含
むカセットを含む。他のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中
に、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連
結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（
ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする
核酸配列を含むカセットを含む。あるこのような実施形態では、第１のプロモータおよび
第２のプロモータは同一である。他のこのような実施形態では、第１のプロモータと第２
のプロモータとは異なる。いくつかのこのような実施形態では、カセットは１つまたは複
数の終結シグナルを含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまた
は外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核
酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。いくつかのこのような
実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配
置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いく
つかの実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に：（ａ）ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列
；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣ
Ｒをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第１のプロモー
タに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第２
のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。いくつかのこのような実施形
態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され
、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。いくつかの
このような実施形態では、カセットは、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させるこ
とができる第１の終結シグナル、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させるこ
とができる第２の終結シグナルを含む。他のこのような実施形態では、カセットは、ＨＬ
Ａ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＣＡ
Ｒまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。

【0041】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸
配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬ
Ａ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合
タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグ
ナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動
可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮ
ＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセット
を含む。

【0042】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸
配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配
置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配
列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲ
または外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグ
ナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセット
を含む。

【0043】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸
配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配
置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配
列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグ
ナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセット
を含む。

【0044】

いくつかのこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム内に、５’か
ら３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸
配列；（ｃ）任意選択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡ
Ｒまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外
因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグ
ナルを含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第１のプロモータに作動
可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮ
ＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセット
を含む。

【0045】

上記のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。ある実
施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列
を含む。特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の核酸配列を含む。

【0046】

上記のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の終結シグナルは、ポリＡ配列または
ＢＧＨ終結シグナルである。

【0047】

上記のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルと同一であ
る。いくつかのこのような実施形態では、第１の終結シグナルおよび第２の終結シグナル
は、ポリＡ配列またはＢＧＨ終結シグナルである。

【0048】

上記のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルとは異なる
。いくつかの実施形態では、第１の終結シグナルはポリＡ配列であり、第２の終結シグナ
ルはＢＧＨ終結シグナルである。いくつかの実施形態では、第１の終結シグナルはＢＧＨ
終結シグナルであり、第２の終結シグナルはポリＡ配列である。

【0049】

上記のいくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有する核酸配列を含む。ある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を
含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列
同一性を有する核酸配列を含む。ある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルが配列番号７１
の核酸配列を含む。

【0050】

上記のいくつかの実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一であ
る。いくつかのこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは、
ＪｅＴプロモータまたはＥＦ１アルファコアプロモータである。

【0051】

上記のいくつかの実施形態では、第１のプロモータは第２のプロモータとは異なる。あ
る実施形態では、第１のプロモータはＪｅＴプロモータであり、第２のプロモータはＥＦ
１アルファコアプロモータである。ある実施形態では、第１のプロモータはＥＦ１アルフ
ァコアプロモータであり、第２のプロモータはＪｅＴプロモータである。

【0052】

上記のある実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７の核
酸配列を含む。ある実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２と少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ
を超える配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＦ１アルファ
コアプロモータは、配列番号７２の核酸配列を含む。

【0053】

上記のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列
番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

【0054】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ
）配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも
９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ
）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配
列番号７０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）
配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９
５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が
配列番号６６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９
５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が、配列番
号６９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、
またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番
号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、
またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡ
Ｒをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２
のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。

【0055】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、５’から３’に：（ａ
）配列番号６７の核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列
であって、ＣＡＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列
；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列
番号７２の核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコード
する核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み
、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イン
トロン配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が
イントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核
酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモー
タに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列および
ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が、第２のプロモータに作動可能に連結されてい
るカセットを含む。

【0056】

特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中に、配列番号７５と少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超
える配列同一性を有する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に
配置されているカセットを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノ
ム中に、配列番号７５の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に
配置されているカセットを含む。

【0057】

上記のいくつかの実施形態では、カセットは、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上
の核酸を含む。ある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
ことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ標的タンパク質の発現
を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。他の実施形態では、２
つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする。ある実施形態では、カセットは、本明細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする２つ以上の核酸を含むことができる。特定の実施形態では、カセットは、Ｂ２
Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を
低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、対照細胞と比較して、少なくとも
約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、
約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低
下する。

【0059】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＳ１、
トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（
ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５２、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子、ＣＤ
７、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、核内受
容体サブファミリー２グループＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連
タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）である
。

【0060】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリンである。いく
つかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細
胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％
、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％
、または最大約９９％低下する。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の発現は、
対照細胞と比較して、細胞表面上で少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％
、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％
、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。いくつかのこのような実施形態で
は、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比較して同種異系性が低下している。

【0061】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１８の核酸配列
を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８
の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、ガイド鎖が
配列番号１０の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸配列を含
み、ガイド鎖が配列番号１２の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番号１３
の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１４の核酸配列を含む；または（ｆ）パッセンジ
ャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１６の核酸配列を含む。あ
るこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド
鎖は配列番号１８の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列は、配列番号４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さ
らなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４
６の配列を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＳ１である。いくつかのこのような実施
形態では、ＣＳ１の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０
％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５
％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。いくつか
のこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡ
Ｒを発現する。さらなるこのような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比
較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞によるフラ
トリサイドを受けにくい。

【0063】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２２の核酸配列
を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号
２４の核酸配列を含む；または（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配列を含み
、ガイド鎖が配列番号２６の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジ
ャー鎖は配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号２６の核酸配列を含む。特
定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５０と少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一
性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは配列番号
５０の配列を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかのこのよ
うな実施形態では、ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約
１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約
７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下
する。さらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞と比較して、トランスフ
ォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けにくい。

【0065】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２８の核酸配列
を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号
３０の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含み、ガイ
ド鎖が配列番号３２の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号３３の核酸配
列を含み、ガイド鎖が配列番号３４の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が
配列番号３５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３６の核酸配列を含む。あるこのよ
うな実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３１の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列
番号３２の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコード
する核酸配列は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも９５％、少なくとも９０
％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこ
のような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３の配列
を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂである。いくつかのこのような
実施形態では、ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％
、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％
、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。
さらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較して、下流シグナル伝達
タンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい。

【0067】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ５２である。いくつかのこのような実
施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約
２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約
７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さら
なる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい。

【0068】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３８の核酸配列
を含む；または（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配
列番号４０の核酸配列を含む。あるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番
号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３８の核酸配列を含む。特定のこのような
実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６と少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配
列同一性を有する配列を含む。さらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする核酸配列は、配列番号５６の配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫである。いくつかのこのような実施
形態では、ＤＣＫの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０
％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５
％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなる
このような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド
類似体（例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。

【0070】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７７の核酸配列
を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号
７９の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含み、ガイ
ド鎖が配列番号８１の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号８２の核酸配
列を含み、ガイド鎖が配列番号８３の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジャー鎖が
配列番号８４の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８５の核酸配列を含む。特定のこの
ような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖は配
列番号７７の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコー
ドする核酸配列は、配列番号８６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなる
このような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６の配
列を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＧＲである。いくつかのこのような実施形
態では、ＧＲの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、
約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、
約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。さらなるこの
ような実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、増殖の低下などのグルココルチコイド（例
えば、デキサメタゾン）の影響を受けにくい。

【0072】

いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する：（ａ）
パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９２の核酸配列
を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号
９４の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含み、ガイ
ド鎖が配列番号９６の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号９７の核酸配
列を含み、ガイド鎖が配列番号９８の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列番
号９９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１００の核酸配列を含む；（ｆ）パッセン
ジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０２の核酸配列を含
む；（ｇ）パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１
０４の核酸配列を含む；（ｈ）パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を含み、ガ
イド鎖が配列番号１０６の核酸配列を含む；または（ｉ）パッセンジャー鎖が配列番号１
０７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０８の核酸配列を含む。特定のこのような
実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号９５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号
９６の核酸配列を含む。特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
核酸配列は、配列番号１１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％
、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。さらなるこの
ような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１の配列
を含む。

【0073】

別の態様では、本発明は、免疫細胞における内因性タンパク質の発現を低下させる方法
であって、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を免疫細胞に導入して
、鋳型核酸が免疫細胞のゲノムに挿入されることを含む、方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲは、免疫細胞中で発現され、免疫細胞における内因性標的タンパク質の発現を低下さ
せる。標的タンパク質発現の低下は、ｓｈＲＮＡｍｉＲガイド配列が標的タンパク質をコ
ードするｍＲＮＡへ結合することによって媒介される。

【0074】

本方法のいくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞またはそれに由来する細胞である
。ある実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそれに由来する
細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはそれに由来する細胞である。
さまざまな実施形態では、免疫細胞は、単球もしくはマクロファージ、またはそれに由来
する細胞である。

【0075】

上記方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ランダムな組み込みによって免疫細
胞のゲノム内に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、
ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）、例えばレンチウイルスベクター（すな
わち、組換えレンチウイルス）を使用して免疫細胞に導入される。

【0076】

本方法のいくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する。

【0077】

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫細胞のゲノム中の認識配列に特異性を有する
操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む
。操作されたヌクレアーゼは、免疫細胞において発現され、認識配列に切断部位を生成す
る。ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸は、切断部位において免疫細
胞のゲノム内に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、
認識配列に隣接する配列と相同性を有する相同アームに隣接し、鋳型核酸は、相同組換え
によって切断部位に挿入される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸
は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を使用して免疫細胞に導入される。
いくつかのこのような実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクター（すなわ
ち、組換えＡＡＶ）である。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡ
ＡＶ６の血清型を有する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、認識配列は標的
遺伝子内にある。本方法のいくつかのこのような実施形態では、標的遺伝子によってコー
ドされるタンパク質の発現は、免疫細胞において破壊される。本方法のあるこのような実
施形態では、標的遺伝子がＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子で
あり、免疫細胞が内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表
面発現を有さない。本方法のいくつかのこのような実施形態では、操作されたヌクレアー
ゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コン
パクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬである。
本方法の特定のこのような実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌ
クレアーゼである。本方法のあるこのような実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコ
ードする第２の核酸は、ｍＲＮＡを使用して導入される。

【0078】

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸が導入される免疫細胞は、そのゲノム中に
、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列をさらに含む。本方法のある実施形態
では、鋳型核酸が導入される免疫細胞は、そのゲノム中に、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする核酸配列をさらに含む。

【0079】

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列をさらに含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲが免疫細胞によって発現される。い
くつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡＲ
または外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫
細胞中で同じプロモータに作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形
態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核
酸配列；および（ｂ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこの
ような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列および；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列を含む。本方
法のあるこのような実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と、
ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離され
る。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配
列は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。本方法の他の
このような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。本方法のいくつかのこのような実施形態
では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、
ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のある
このような実施形態では、鋳型核酸はプロモータを含み、プロモータがＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能
に連結される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は終結シグナルを
含む。

【0080】

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードす
る核酸配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は免疫細胞によって発現される。本方法の
いくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免疫細胞中で同じプロモ
ータに作動可能に連結される。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’
から３’に：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｂ）ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこのような実施形態では、鋳型
核酸は、５’から３’に：（ａ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；および（ｂ）
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。本方法のいくつかのこのような
実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする核酸配列とは、２Ａ配列またはＩＲＥＳ配列によって分離される。本方法のあ
るこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核
酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置
される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸はプロモータを含み、プ
ロモータがＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードする核酸配列に作動可能に連結される。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型
核酸は終結シグナルを含む。

【0081】

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまた
は外因性ＴＣＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は免疫細胞によって発現される。本方法
のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因
性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列
は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、同じプロモータに作動可能に連結される。本方
法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲ
をコードする核酸配列；（ｂ）２ＡまたはＩＲＥＳ配列；（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質をコードする核酸配列；および（ｄ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む。
本方法のあるこのような実施形態では、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコ
ードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配
列内に配置される。本方法の他のこのような実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまた
は外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸
配列はイントロン配列内に配置される。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳
型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列に作動可能に連結
されたプロモータを含む。本方法のあるこのような実施形態では、鋳型核酸は終結シグナ
ルを含む。

【0082】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プ
ロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩ
ＲＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロ
ン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列、および（ｅ）任意選
択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配
列は、プロモータに作動可能に連結されている。

【0083】

本法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プロ
モータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イントロン配
列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲＥ
Ｓ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；および（ｅ）任意選択
的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－
Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
は、プロモータに作動可能に連結されている。

【0084】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プ
ロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロン
配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩＲ
ＥＳ配列；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｅ）任意選
択的に、終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配
列は、プロモータに作動可能に連結されている。

【0085】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）プ
ロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）２ＡまたはＩ
ＲＥＳ配列；（ｄ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イントロ
ン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；および（ｅ）任意選
択的に終結シグナルを含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－
Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
は、プロモータに作動可能に連結されている。

【0086】

上記方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。本
方法のある実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の
核酸配列を含む。

【0087】

上記方法のいくつかの実施形態では、終結シグナルはポリＡ配列またはウシ成長ホルモ
ン（ＢＧＨ）終結シグナルである。本方法のある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号
６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、ま
たはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ポ
リＡ配列は、配列番号６８の核酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＢＧＨ終結シ
グナルは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定
の実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは配列番号７１の核酸配列を含む。

【0088】

上記方法のある実施形態では、プロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を
有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、プロモータは配列番号６７の核酸
配列を含む。

【0089】

上記方法のある実施形態では、２Ａ配列は、配列番号７０と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。本方法の特定の実施形態では、２Ａ
配列は、配列番号７０の核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位である。

【0090】

上記方法のある実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超え
る配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0091】

上記方法のある実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。本方法の特定の実施形態では、ＣＡＲは
、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

【0092】

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ
を超える配列同一性を有する核酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸
配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０と少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有す
る核酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードす
る核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする
核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する
核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置され
る核酸配列；および（ｅ）任意選択的に、配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する
核酸配列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タン
パク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモ
ータに作動可能に連結されている。

【0093】

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核
酸配列を含むプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが配列番
号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）配列番号７０の核
酸配列を含むＰ２Ａ／フューリン部位；（ｄ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核
酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イン
トロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン
配列が配列番号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイント
ロン配列内に配置される核酸配列；ならびに（ｅ）任意選択的に、配列番号６８の核酸配
列を含む終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、プロモータに
作動可能に連結されている。

【0094】

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７４と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。本方法
の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７４の核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定
常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。

【0095】

上記方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ
以上の核酸を含む。本方法のある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードすることができる。本方法のいくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ
標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。
本方法の他の実施形態では、２つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させ
る異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする。本方法のある実施形態では、鋳型核酸は、本明
細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含むことができる。
本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列を含むことができる。

【0096】

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＣＡ
Ｒまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、免
疫細胞中で異なるプロモータに作動可能に連結される。本方法のいくつかのこのような実
施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロ
モータに作動可能に連結されたＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）
第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結されたｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法の他のこのような実施形態では、鋳型核酸は、
５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能に連結さ
れたｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；および（ｄ）第
２のプロモータに作動可能に連結されたＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列
を含む。本方法のあるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列と同じ向きである。本方法の他のこ
のような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ＣＡＲまたは外因性
ＴＣＲをコードする核酸配列と逆向きである。本方法の特定のこのような実施形態では、
第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一である。本方法の他のこのような実施形
態では、第１のプロモータと第２のプロモータとは異なる。本方法のいくつかのこのよう
な実施形態では、鋳型核酸は、１つまたは複数の終結シグナルを含む。

【0097】

上記方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列およびＨ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列は、切断部位に鋳型核酸が導入された後、
免疫細胞中で異なるプロモータに作動可能に連結される。本方法の特定のこのような実施
形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモ
ータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）
第２のプロモータ；および（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲをコードする核酸配列を含む。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型
核酸は、５’から３’に：（ａ）第１のプロモータ；（ｂ）第１のプロモータに作動可能
に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列；（ｃ）第２のプロモータ；およ
び（ｄ）第２のプロモータに作動可能に連結された、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコード
する核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、第１のプロモータおよび第
２のプロモータは同一である。本方法の他のこのような実施形態では、第１のプロモータ
と第２のプロモータとは異なる。本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸
は、１つまたは複数の終結シグナルを含む。

【0098】

本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコ
ードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ
）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードす
る核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータ
に作動可能に連結されている。本方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列がＨＬ
Ａ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列はイントロン配列内に配置される。本方法のいくつかの実施形態では、鋳型核
酸は：（ａ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タ
ンパク質をコードする核酸配列；および（ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を
含み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコード
する核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。本方法のいく
つかの実施形態では、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列
内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列はイントロン配列内に配置される
。

【0099】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲ
の転写を終結させることができる第１の終結シグナル、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
の転写を終結させることができる第２の終結シグナルを含む。本方法のいくつかのこのよ
うな実施形態では、鋳型核酸は、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の転写を終結させることがで
きる第１の終結シグナル、およびＣＡＲまたは外因性ＴＣＲの転写を終結させることがで
きる第２の終結シグナルを含む。

【0100】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第
１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列；（ｃ）任意選
択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質をコードする核酸配列であって、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコード
する核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内
に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲ
または外因性ＴＣＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

【0101】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第
１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、イン
トロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択
的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲ
をコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列、およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配
列が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコード
する核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

【0102】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第
１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列であって、イン
トロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に配置される核酸配列；（ｃ）任意選択
的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲ
または外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
が第１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードす
る核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

【0103】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）第
１のプロモータ；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列；（ｃ）任意選
択的に、第１の終結シグナル；（ｄ）第２のプロモータ；（ｅ）ＣＡＲまたは外因性ＴＣ
Ｒをコードする核酸配列であって、イントロン配列がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコード
する核酸配列内に配置され、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内
に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、第２の終結シグナルを含み、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連結されてお
り、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

【0104】

上記方法のいくつかの実施形態では、イントロン配列は合成イントロン配列である。本
方法のある実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、イントロン配列は、配列番号６９の
核酸配列を含む。

【0105】

上記の方法のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の終結シグナルは、ポリＡ配列
またはＢＧＨ終結シグナルである。

【0106】

上記方法のいくつかの実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルと同一
である。本方法の他の実施形態では、第１の終結シグナルは第２の終結シグナルとは異な
る。本方法のある実施形態では、第１の終結シグナルはポリＡ配列であり、第２の終結シ
グナルはＢＧＨ終結シグナルである。本方法のある実施形態では、第１の終結シグナルは
ＢＧＨ終結シグナルであり、第２の終結シグナルはｐｏｌｙＡ配列である。

【0107】

上記方法のある実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８と少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を
有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８の核
酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＢＧＨ終結シグナルは、配列番号７１と少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを
超える配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＢＧＨ終結シ
グナルは配列番号７１の核酸配列を含む。

【0108】

上記方法のいくつかの実施形態では、第１のプロモータおよび第２のプロモータは同一
である。本方法の他の実施形態では、第１のプロモータは第２のプロモータとは異なる。
本方法のある実施形態では、第１のプロモータはＪｅＴプロモータであり、第２のプロモ
ータはＥＦ１アルファコアプロモータである。本方法のある実施形態では、第１のプロモ
ータはＥＦ１アルファコアプロモータであり、第２のプロモータはＪｅＴプロモータであ
る。

【0109】

上記方法のある実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列番号６７と少なくとも８０％
、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同
一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＪｅＴプロモータは、配列
番号６７の核酸配列を含む。本方法のある実施形態では、ＥＦ１アルファコアプロモータ
は、配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では
、ＥＦ１アルファコアプロモータは、配列番号７２の核酸配列を含む。

【0110】

上記方法のいくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、配列番号６６と少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ
を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ＨＬＡ
－Ｅ融合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0111】

上記方法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。本方法の特定の実施形態では、Ｃ
ＡＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む。

【0112】

本方法の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７と少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超え
る配列同一性を有する核酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸
配列であって、ＣＡＲが配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的に、配列番号７０と少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配
列同一性を有する核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２と少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える
配列同一性を有する核酸配列を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列であって、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６と少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える
配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、イントロン配列がＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を
コードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番号６９と少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一
性を有する核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内
に配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１と少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一
性を有する核酸配列を含む第２の終結シグナルを含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第
１のプロモータに作動可能に連結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核
酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連
結されている。

【0113】

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、５’から３’に：（ａ）配列番号６７の核
酸配列を含む第１のプロモータ；（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列であって、ＣＡＲが
配列番号７３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む核酸配列；（ｃ）任意選択的
に、配列番号７０の核酸配列を含む第１の終結シグナル；（ｄ）配列番号７２の核酸配列
を含む第２のプロモータ；（ｅ）ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列であっ
て、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質が配列番号６６のアミノ酸配列を含み、イントロン配列が
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列内に配置され、イントロン配列が配列番
号６９の核酸配列を含み、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列がイントロン配列内に
配置される核酸配列；および（ｆ）任意選択的に、配列番号７１の核酸配列を含む第２の
終結シグナル；を含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が第１のプロモータに作動可能に連
結されており、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列およびｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列が第２のプロモータに作動可能に連結されている。

【0114】

本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する核酸配列を含み、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子内のゲノム中に挿入される。本方法
の特定の実施形態では、鋳型核酸が配列番号７５の核酸配列を含み、カセットがＴＣＲア
ルファ定常領域遺伝子内のゲノムに挿入される。

【0115】

上記方法のいくつかの実施形態では、鋳型核酸は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ
以上の核酸を含む。本方法のある実施形態では、２つ以上の核酸は同じｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードすることができる。本方法のいくつかの実施形態では、２つ以上の核酸は、同じ
標的タンパク質の発現を低下させる異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードすることができる。
本方法の他の実施形態では、２つ以上の核酸は、異なる標的タンパク質の発現を低下させ
る異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする。本方法のある実施形態では、鋳型核酸は、本明
細書に記載の異なるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする２つ以上の核酸を含むことができる。
本方法の特定の実施形態では、鋳型核酸は、Ｂ２Ｍの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲ
をコードする核酸配列、およびＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列を含むことができる。

【0116】

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、５’から３’に：（ａ）５’
ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｃ）パッセンジャー鎖；
（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムドメイン；
および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

【0117】

本方法のいくつかの実施形態では、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０ａループド
メイン、ｍｉＲ－１５ループドメイン、ｍｉＲ－１６ループドメイン、ｍｉＲ－１５５ル
ープドメイン、ｍｉＲ－２２ループドメイン、ｍｉＲ－１０３ループドメインまたはｍｉ
Ｒ－１０７ループドメインである。本方法の特定の実施形態では、ｍｉＲループドメイン
はｍｉＲ－３０ａループドメインである。

【0118】

本方法のある実施形態では、ｍｉＲ－３０ａループドメインが、配列番号３と少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超え
る配列同一性を有する核酸配列を含む。本方法の特定の実施形態では、ｍｉＲ－３０ａル
ープドメインは、配列番号３の核酸配列を含む。

【0119】

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、マイクロＲＮＡ－Ｅ（ｍｉＲ
－Ｅ）足場、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）足場、ｍｉＲ－１５足場、ｍｉＲ
－１６足場、ｍｉＲ－１５５足場、ｍｉＲ－２２足場、ｍｉＲ－１０３足場、またはｍｉ
Ｒ－１０７足場を含む。本方法のある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはｍｉＲ－Ｅ足場
を含む。

【0120】

本方法のいくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’
ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含み；（
ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５
％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する核酸
配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが、配列番号４と少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一
性を有する核酸配列を含み；および／または（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが、配列番号
５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、また
はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0121】

本方法のある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を含む：（ａ）５’ｍｉＲ
足場ドメインが配列番号１の核酸配列を含み；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメインが配
列番号２の核酸配列を含み；（ｃ）３’ｍｉＲ基底ステムドメインが配列番号４の核酸配
列を含み；および（ｄ）３’ｍｉＲ足場ドメインが配列番号５の核酸配列を含む。

【0122】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、対照細胞と比較して、少
なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約
６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約
９９％低下する。

【0123】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリン、
ＣＳ１、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、Ｃｂｌ癌原遺
伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＤ５２、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝
子、ＣＤ７、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）
、核内受容体サブファミリー２グループＦメンバー６（ＮＲ２Ｆ６）、細胞傷害性Ｔリン
パ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、またはＣ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５
）である。

【0124】

上記方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリンで
ある。本方法のいくつかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリンの細胞
表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％
、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％
、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施
形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の発現は細胞表面において、対照細胞と比較して、少なく
とも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５
％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９
％低下する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比較
して同種異系性が低下している。

【0125】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号１７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１８の
核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配
列番号８の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９の核酸配列を含み、ガ
イド鎖が配列番号１０の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号１１の核酸
配列を含み、ガイド鎖が配列番号１２の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖が配列
番号１３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１４の核酸配列を含む；または（ｆ）パ
ッセンジャー鎖が配列番号１５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１６の核酸配列を
含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号１７の核酸配
列を含み、ガイド鎖は配列番号１８の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形
態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号４６と少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一
性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲを
コードする核酸配列は、配列番号４６の配列を含む。

【0126】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＳ１である。本方法のいくつか
のこのような実施形態では、ＣＳ１の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも
約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、
約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低
下する。本方法のいくつかのこのような実施形態では、免疫細胞は、ＣＳ１に対する特異
性を有するＣＡＲを発現する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、
対照細胞と比較して、ＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを発現する免疫細胞によるフ
ラトリサイドを受けにくい。

【0127】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２２の
核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２３の核酸配列を含み、ガイド鎖が
配列番号２４の核酸配列を含む；または（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号２５の核酸配
列を含み、ガイド鎖が配列番号２６の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態
では、パッセンジャー鎖は配列番号２５の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号２６の核
酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号
５０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、ま
たはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態
では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは配列番号５０の配列を含む。

【0128】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＴＧＦＢＲ２である。本方法のい
くつかのこのような実施形態では、ＴＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して
、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％
、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最
大約９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞
と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けに
くい。

【0129】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号２７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号２８の
核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号２９の核酸配列を含み、ガイド鎖が
配列番号３０の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号３１の核酸配列を含
み、ガイド鎖が配列番号３２の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号３３
の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３４の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジ
ャー鎖が配列番号３５の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３６の核酸配列を含む。本
方法のあるこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号３１の核酸配列を含み
、ガイド鎖は配列番号３２の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、
ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくと
も９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有す
る配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードす
る核酸配列は、配列番号５３の配列を含む。

【0130】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂである。本方法のいく
つかのこのような実施形態では、ＣＢＬ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少
なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約
６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約
９９％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、対照細胞と比
較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達
の抑制を受けにくい。

【0131】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ５２である。本方法のいくつ
かのこのような実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なく
とも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５
％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９
％低下する。本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ５２抗体誘導
細胞死を受けにくい。

【0132】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号３８の
核酸配列を含む；または（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号３９の核酸配列を含み、ガイ
ド鎖が配列番号４０の核酸配列を含む。本方法のあるこのような実施形態では、パッセン
ジャー鎖は配列番号３７の核酸配列を含み、ガイド鎖は配列番号３８の核酸配列を含む。
本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配
列番号５６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。本方法のさらなるこのような実
施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号５６の配列を含む。

【0133】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫである。いくつかのこのよ
うな実施形態では、ＤＣＫの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１０％
、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％
、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。
本方法のさらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレ
オシド類似体（例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。

【0134】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号７６の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号７７の
核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号７８の核酸配列を含み、ガイド鎖が
配列番号７９の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号８０の核酸配列を含
み、ガイド鎖が配列番号８１の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号８２
の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８３の核酸配列を含む；または（ｅ）パッセンジ
ャー鎖が配列番号８４の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号８５の核酸配列を含む。本
方法の特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号７６の核酸配列を含
み、ガイド鎖は配列番号７７の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では
、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号８６と少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有
する配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコード
する核酸配列は、配列番号８６の配列を含む。

【0135】

本方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質はＧＲである。本方法のいくつかの
このような実施形態では、ＧＲの細胞表面発現は、対照細胞と比較して、少なくとも約１
０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７
０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下す
る。さらなるこのような実施形態では、免疫細胞は、増殖の低下などのグルココルチコイ
ド（例えば、デキサメタゾン）の影響を受けにくい。

【0136】

本方法のいくつかのこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは以下の構造を有する
：（ａ）パッセンジャー鎖が配列番号９１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９２の
核酸配列を含む；（ｂ）パッセンジャー鎖が配列番号９３の核酸配列を含み、ガイド鎖が
配列番号９４の核酸配列を含む；（ｃ）パッセンジャー鎖が配列番号９５の核酸配列を含
み、ガイド鎖が配列番号９６の核酸配列を含む；（ｄ）パッセンジャー鎖が配列番号９７
の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号９８の核酸配列を含む；（ｅ）パッセンジャー鎖
が配列番号９９の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１００の核酸配列を含む；（ｆ）
パッセンジャー鎖が配列番号１０１の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０２の核酸
配列を含む；（ｇ）パッセンジャー鎖が配列番号１０３の核酸配列を含み、ガイド鎖が配
列番号１０４の核酸配列を含む；（ｈ）パッセンジャー鎖が配列番号１０５の核酸配列を
含み、ガイド鎖が配列番号１０６の核酸配列を含む；または（ｉ）パッセンジャー鎖が配
列番号１０７の核酸配列を含み、ガイド鎖が配列番号１０８の核酸配列を含む。本方法の
特定のこのような実施形態では、パッセンジャー鎖は配列番号９５の核酸配列を含み、ガ
イド鎖は配列番号９６の核酸配列を含む。本方法の特定のこのような実施形態では、ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、配列番号１１１と少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超える配列同一性を有する
配列を含む。本方法のさらなるこのような実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
核酸配列は、配列番号１１１の配列を含む。

【0137】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された免疫細
胞を提供する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はベータ－２ミクログロブリン
であり、本方法によって作製された免疫細胞は、ベータ－２ミクログロブリンおよび／ま
たはＭＨＣクラスＩタンパク質の細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では
、標的タンパク質はＣＳ１であり、本方法によって作製された免疫細胞はＣＳ１の細胞表
面発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＴＧＦＲＢ２であり
、本方法によって作製された免疫細胞は、ＴＧＦＢＲ２の発現が低下している。いくつか
の実施形態では、標的タンパク質はＣＢＬ－Ｂであり、本方法によって作製された免疫細
胞はＣＢＬ－Ｂの発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＣＤ
５２であり、本方法によって作製された免疫細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現が低下して
いる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はＤＣＫであり、本方法によって作製さ
れた免疫細胞は、ＤＣＫの発現が低下している。いくつかの実施形態では、標的タンパク
質はＧＲであり、本方法によって作製された免疫細胞はＧＲの発現が低下している。

【0138】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の複数の遺伝子改変免疫細胞、または複数の
免疫細胞を含む細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なく
とも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０
％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大１００％が、本明
細書に記載の遺伝子改変免疫細胞、または本明細書に記載の免疫細胞である。

【0139】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の複数の遺伝子
改変免疫細胞、または本明細書に記載の複数の免疫細胞とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の細胞の集団を含む。

【0140】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において疾患を治療するための免疫療
法の方法であって、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方
法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、それを必要とする対象においてがん
を治療するための免疫療法であって、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞が、遺伝子改変
ヒトＴ細胞もしくはそれに由来する細胞、または遺伝子改変ＮＫ細胞もしくはそれに由来
する細胞であり、遺伝子改変免疫細胞または免疫細胞が、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを含
み、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲが、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガン
ド結合ドメインを含む免疫療法である。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変免
疫細胞または免疫細胞は、不活性化ＴＣＲアルファ遺伝子または不活性化ＴＣＲアルファ
定常領域遺伝子を含む。本方法のさらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞または免疫
細胞は、内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を
有さない。本方法のいくつかの実施形態では、がんは、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫
および白血病のがんからなる群から選択される。本方法のある実施形態では、がんは、Ｂ
細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん
、結腸がん、腎細胞癌腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫から
なる群から選択される。本方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、Ｂ系列急性
リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および
多発性骨髄腫からなる群から選択される。

【0141】

本方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。

【0142】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんなどの疾患を治療する方
法であって、内因性デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）の発現を低下させるｓｈＲＮＡ
ｍｉＲをコードする核酸配列をそのゲノム中に含む本明細書に記載の任意の遺伝子改変免
疫細胞（例えば、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞またはＮＫ
細胞）の集団の治療有効量を、プリンヌクレオシドの投与前、投与中、または投与後に対
象に投与することを含む方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＤＣＫ発現の低下は、
遺伝子改変免疫細胞の増殖またはインビボ持続性に対するプリンヌクレオシドの効果を低
下させる。

【0143】

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の集団およびプリンヌクレオシドは
、プリンヌクレオシドが投与されるとき、またはプリンヌクレオシドが有効レベルで対象
中に存在する間に、遺伝子改変免疫細胞が対象中に存在する（すなわち、宿主によって除
去されていない）ように投与される。上記方法のいくつかの実施形態では、プリンヌクレ
オシドはフルダラビンである。本方法のいくつかのこのような実施形態では、フルダラビ
ンは、免疫療法のためのリンパ球枯渇レジメンの一部として、単独で、または別の化学療
法化合物と組み合わせて投与される。

【0144】

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、標的がん細胞上の抗原に対して
特異性を有するＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する、遺伝子改変ヒトＴ細胞または遺伝
子改変ＮＫ細胞である。

【0145】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんなどの疾患を治療する方
法であって、内因性グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍ
ｉＲをコードする核酸配列をゲノムに含む本明細書に記載の任意の遺伝子改変免疫細胞（
例えば、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞またはＮＫ細胞）の
集団の治療有効量を、コルチコステロイドの投与前、投与中、または投与後に対象に投与
することを含む方法を提供する。ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＧＲ発現の低下は、遺伝子改変
免疫細胞の増殖またはインビボ持続性に対するコルチコステロイドの効果を低下させる。

【0146】

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の集団およびコルチコステロイドは
、コルチコステロイドが投与されるとき、またはコルチコステロイドが有効レベルで対象
中に存在する間に、遺伝子改変免疫細胞が対象中に存在する（すなわち、宿主によって除
去されていない）ように投与される。本方法のいくつかの実施形態では、コルチコステロ
イドはデキサメタゾンまたはメチルプレドニゾロンである。本方法のいくつかのこのよう
な実施形態では、コルチコステロイドは、免疫療法中のサイトカイン放出症候群を低下さ
せるための治療の一部として、単独で、または別の化合物と組み合わせて投与される。

【0147】

本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、標的がん細胞上の抗原に対して
特異性を有するＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する、遺伝子改変ヒトＴ細胞または遺伝
子改変ＮＫ細胞である。

【0148】

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変免
疫細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の免疫細胞もしくはその集団を提供する
。本発明はさらに、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬の製造にお
ける、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の
免疫細胞もしくはその集団の使用を提供する。このような一態様では、医薬はがんの治療
に有用である。

【0149】

別の態様では、本発明は、疾患の治療、好ましくはがんの治療に使用するための、本明
細書に記載の遺伝子改変細胞もしくはその集団、または本明細書に記載の免疫細胞もしく
はその集団を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0150】

【図1】ｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーをＣＡＲと３’から５’への頭－尾（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）配置で発現する構築物７０５６を含むＡＡＶにより形質導入されたＴ細胞上のベータ－２ミクログロブリンの発現またはＨＬＡ－Ａ、Ｂ、およびＣの発現（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子発現）を示す。

【図1A】対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＢ２Ｍの表面レベルを示す。

【図1B】同じ培養物中のＣＤ３－／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＢ２Ｍレベルを示す。

【図1C】対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＨＬＡ－ＡＢＣ（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子）の表面レベルを示す。

【図1D】同じ培養物中のＣＤ３＋／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＨＬＡ－ＡＢＣレベルを示す。

【図2】ＡＡＶ７０５６を用いて産生された培養物におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図2A】４日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図2B】４日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図2C】７日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図2D】７日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図2E】１０日目のＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図2F】１０日目のＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図3】ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２による形質導入の３日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図3A】７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図3B】７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図3C】７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図3D】７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図3E】７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図3F】７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図4】ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２を用いた形質導入の７日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図4A】７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図4B】７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図4C】７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図4D】７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図4E】７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図4F】７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図5】ＡＡＶ７２０６、ＡＡＶ７０５６またはＡＡＶ７２８２による形質導入の１１日後に産生された培養物における、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度およびＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図5A】７２０６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図5B】７２０６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図5C】７２８２－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図5D】７２８２－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図5E】７０５６－形質導入細胞におけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度を示す。

【図5F】７０５６－形質導入細胞におけるＢ２Ｍのノックダウンを示す。

【図6】同種抗原特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはＮＫ細胞による細胞溶解に対するＣＡＲ Ｔ細胞の感受性についての、Ｂ２Ｍのノックアウトまたはノックダウン効果を示す。

【図6A】Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２ＭノックダウンＣＡＲ Ｔ細胞集団に対する、プライムされた同種抗原特異的ＣＴＬの細胞溶解活性を示す。

【図6B】Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２ＭノックダウンＣＡＲ Ｔ細胞集団に対するＮＫ細胞の細胞溶解活性を示す。

【図7】操作されたメガヌクレアーゼおよびＨＬＡ－Ｅポリペプチドのコード配列を含むドナー鋳型の標的挿入を用いた、Ｂ２Ｍのノックアウトを示す図である。

【図7A】標的挿入なしのＢ２Ｍノックアウトを示す。

【図7B】ＡＡＶ７３４６を使用したＢ２Ｍノックアウトおよびドナー鋳型の標的挿入を示す。

【図8】Ｂ２Ｍノックアウトおよび挿入されたドナー鋳型によってコードされるＨＬＡ－Ｅの細胞表面発現によるＴ細胞集団の精製を示す。

【図8A】Ｂ２Ｍ陰性の細胞集団を示す。

【図8B】精製されたＢ２Ｍ陰性集団を示す。

【図8C】ＨＬＡ－Ｅ陽性である細胞集団を示す。

【図8D】精製されたＨＬＡ－Ｅ陽性細胞集団を示す。

【図9】同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲ Ｔ細胞殺滅およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞殺滅を示す。

【図9A】エフェクター：標的比の漸増時の、同種抗原プライムＣＴＬによるＢ２Ｍ陽性、Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２Ｍノックアウト／ＨＬＡ－Ｅノックイン、ＣＡＲ Ｔ細胞の殺滅を示す。

【図9B】エフェクター：標的比の漸増時の、Ｂ２Ｍ陽性、Ｂ２ＭノックアウトおよびＢ２Ｍノックアウト／ＨＬＡ－Ｅノックイン、ＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞殺滅を示す。

【図10】ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＢ２ＭのｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導ノックダウンのインビボ有効性および安定性を示す。

【図10A】ＮＡＬＭ－６細胞を移植し、ビヒクルで処置したマウス（黒色の線で三角形を付して示す）、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウス（濃い灰色の線で丸を付して示す）、または統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含むＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウス（薄い灰色の線で三角形を付して示す）における経時的な総フラックスの生物発光イメージングを示す。

【図10B】統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含むＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞（薄い灰色のヒストグラムとして示される）または対照ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞（濃い灰色のヒストグラムとして示される）のいずれかを投与した１４日後のヒトＣＤ４５＋細胞におけるＢ２Ｍ発現についてのフローサイトメトリ染色を示す。

【図11】ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＳ１のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ ｓｈＲＮＡｍｉＲの３つの候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ７２１０１～７２１０３と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。

【図11A】ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするがｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物をコードしないＡＡＶによる形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。

【図11B】ＡＡＶ ７２１０１による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。

【図11C】ＡＡＶ ７２１０２による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。

【図11D】ＡＡＶ ７２１０３による形質導入の７日後のＣＡＲおよびＣＳ１染色を示す。

【図12】ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦＲＢ２のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲの複数の候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ ７２１１０～７２１１４と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。

【図12A】モック形質導入後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図12B】ＡＡＶ ７２１１０による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図12C】ＡＡＶ ７２１１１による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図12D】ＡＡＶ ７２１１２による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図12E】ＡＡＶ ７２１１３による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図12F】ＡＡＶ ７２１１４による形質導入の１４日後のＣＡＲおよびＴＧＦＢＲ２染色を示す。

【図13】２つの操作されたメガヌクレアーゼを使用したＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックアウトを検出するフローサイトメトリを示す。

【図13A】陰性染色対照を示す。

【図13B】モックトランスフェクトＴ細胞を示す。

【図13C】ＴＧＦ １－２ ｘ．５メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞を示す。

【図13D】ＴＧＦ １－２ Ｌ．２９６メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞を示す。

【図14】ＴＧＦＢ１で処理したＴＧＦＢＲ２陽性Ｔ細胞および陰性Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３のフローサイトメトリ染色を示す。

【図15】ＴＧＦＢＲ２陽性ＣＡＲ Ｔ細胞、タンパク質発現をノックダウンするために抗ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞、およびＴＧＦＢＲ２発現をノックアウトするために操作されたメガヌクレアーゼで処理されたＴ細胞におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３のフローサイトメトリを示す。

【図16】未処理対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ａ）、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｂ）、ＴＧＦ １－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２がノックアウトされた、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃ）、または７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＴＧＦＢＲ２がノックダウンされた、ＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｄ）、におけるリン酸化ＳＭＡＤ ２／３のフローサイトメトリを示す。

【図17】正常なＫ５６２細胞、ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ）、またはＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ－ＴＧＦ）と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞数を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦＢＲ ＫＤ）するか、またはｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（Ｃｔｒｌ ＫＤ）した。

【図18】ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ）、またはＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（ＫＢＣＭＡ－ＴＧＦ）と共培養した後の、経時的な標的細胞数を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦＢＲＫＤ）するか、またはｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（ＣｔｒｌＫＤ）した。

【図19】正常なＫ５６２細胞、ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞数を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。

【図20】ＢＣＭＡを安定に発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４：ＣＤ８比を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。

【図21】正常なＵ２６６細胞、または活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＵ２６６細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞数を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。

【図22】Ｕ２６６細胞、または活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＵ２６６細胞と共培養した後の、経時的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞数を示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（７２１５４）し、ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いてＢ２Ｍをノックダウンするように改変（７２１５５）し、または操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ｄＫＯ）した。

【図23】Ｕ２６６細胞と共培養した異なる時点での、ＣＤ４＋ＣＡＲ Ｔ細胞の数のフローサイトメトリプロットを示す。

【図23A】７２１５４構築物を組み込んだＣＡＲ Ｔ細胞を示す。

【図23B】７２１５５構築物を組み込んだＣＡＲ Ｔ細胞を示す。

【図23C】ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質がＢ２Ｍ遺伝子にノックインされたＣＡＲ Ｔ細胞を示す。

【図24】ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞変異体と１６日間共培養した後の、Ｕ２６６細胞の生細胞対死細胞のフローサイトメトリプロットを示す。

【図24A】Ｕ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦｂ ＲＫＤ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図24B】Ｕ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＢ２Ｍをノックダウンするように改変（Ｃｔｒｌ ＫＤ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図24C】Ｕ２６６細胞と、操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ＴＧＦｂＲ ＫＯ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図24D】活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＴＧＦＢＲ２をノックダウンするように改変（ＴＧＦｂ ＲＫＤ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図24E】活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＢ２Ｍをノックダウンするように改変（Ｃｔｒｌ ＫＤ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図24F】活性ＴＧＦβ１を分泌するＵ２６６細胞と、操作されたメガヌクレアーゼを用いてＴＧＦＢＲ２をノックアウトするように改変（ＴＧＦｂＲ ＫＯ）されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養を示す。

【図25】ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ５２のｓｈＲＮＡｍｉＲ誘導安定的ノックダウンを示す。ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲの複数の候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。構築物をＡＡＶ ７２１２３およびＡＡＶ ７２１２４と命名し、ドナーＴ細胞の形質導入に使用した。

【図25A】ＡＡＶ形質導入後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の染色を示す。

【図25B】ＡＡＶ ７２１２３による形質導入の１０日後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ５２のノックダウンを示す。

【図25C】ＡＡＶ ７２１２４による形質導入の１０日後のＣＤ３－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＣＤ５２のノックダウンを示す。

【図26】Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＴ細胞におけるＢ２ＭおよびＣＤ５２についてのフローサイトメトリ染色を示す。

【図27】Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔ集団のＣＤ５２枯渇後に回収されたＣＡＲ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

【図28】構築物７３１６１、７３１６２、７３１６３、および７３１６４の図を示す。

【図28A】ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子、Ｐ２Ａ／フューリン部位、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＳＶ４０双方向性ポリＡ配列を含む構築物７３１６１を示す。

【図28B】ＪｅＴプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向性ポリＡ配列、第２のＪｅＴプロモータ、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終結シグナルを含む構築物７３１６２を示す。

【図28C】ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向ポリＡ配列、ＥＦ１アルファコアプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＢＧＨ終結シグナルを含む構築物７３１６３を示す。

【図28D】ＪｅＴプロモータ、ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子、ＳＶ４０双方向ポリＡ配列、第２のＪｅＴプロモータ、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む合成イントロンを含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＢＧＨ終結シグナルを含む７３１６４構築物を示す。

【図29】同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＴ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯ ｄＫＩ）のＣＡＲ表現型を要約する表を示す。この表は、７２０６構築物を使用して導入されたＣＡＲと比較した場合の、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋であった細胞のパーセンテージ、ＣＡＲノックインを有したＣＤ３ノックアウト細胞のパーセンテージ、発現したＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、および各ＣＡＲのＭＦＩの比較を提供する。

【図30】同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＴ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯ ｄＫＩ）のＨＬＡ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅ表現型を要約する表を示す。この表は、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団における野生型と比較したＨＬＡ－ＡＢＣ発現のパーセンテージ、野生型ゲーティングアウトによるＨＬＡ－ＡＢＣノックダウンのパーセンテージ、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団におけるＨＬＡ－Ｅを発現する細胞のパーセンテージ、このような細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現のＭＦＩ、およびＣＡＲ－集団におけるＨＬＡ－Ｅ＋であった細胞のパーセンテージを提供する。

【図31】同定された構築物がＡＡＶによって導入され、ＴＲＡＣ遺伝子座のみに挿入されたＣＡＲ Ｔ細胞（７２０６および７３１６１～７３１６４）、またはＣＡＲ遺伝子がＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入された細胞（ｄＫＯ ｄＫＩ）の特徴を要約する表を示す。

【図32】２種の異なるドナー（Ｋ３２１２またはＫ２９１６）由来の同種抗原プライムＣＴＬと共培養した場合の、第１のドナー（ＨＣ６３６６）由来のＴ細胞を用いて調製したＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ変異体の細胞溶解を示す。

【図32A】Ｋ３２１２同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲ Ｔ細胞の殺滅を示す。

【図32B】Ｋ２９１６同種抗原プライムＣＴＬによるＣＡＲ Ｔ細胞の殺滅を示す。

【図33】１：１の比で共培養したＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ変異体のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による細胞溶解を複数の時点において示す。

【図33A】２４時間での細胞溶解を示す。

【図33B】４８時間での細胞溶解を示す。

【図33C】１２０時間での細胞溶解を示す。

【図34】ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免疫不全マウスにおけるＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ変異体のインビボ有効性を実証する発光測定を示す。

【図35】ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ変異体で処置した、ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免疫不全マウスの生存を示す。

【図36】異なる濃度のフルダラビンとインキュベーションした後のＣＤ３ノックアウトＴ細胞における、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ ＣＡＲ配列のノックインパーセントの変化を示す。

【図37】ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞変異体と共にインキュベートしたフルダラビンの濃度に対するＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬを示す。

【図38】ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まない異なるＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞変異体を異なる濃度のフルダラビンで処理した後４日目の生細胞数／ｍＬを示す。

【図39】ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まない異なるＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞変異体を異なる濃度のフルダラビンで処理した後８日目の生細胞数／ｍＬを示す。

【図40】異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを欠くＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。

【図41】異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲ（７２１３８）を含むＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。

【図42】異なる濃度のフルダラビンの存在下で、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲ（７２１３６）を含むＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養されたＣＤ１９発現ＨＥＫ２９３細胞（標的）の細胞溶解パーセントを示す。細胞を２：１、１：２、および１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。

【図43】異なる濃度のデキサメタゾンとのインキュベーション後のＣＤ３ノックアウトＴ細胞における、ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ ＣＡＲ配列のノックインパーセントの変化を示す。

【図44】ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含む、または含まないＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞変異体と共にインキュベートしたデキサメタゾンの濃度に対するＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬを示す図である。

【0151】

配列の簡単な説明

【0152】

配列番号１は、５’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメインコード配列の核酸配列を示す。

【0153】

配列番号２は、５’ｍｉｒ－Ｅ基底ステムドメインコード配列の核酸配列を示す。

【0154】

配列番号３は、ｍｉＲ－３０ａループドメインコード配列の核酸配列を示す。

【0155】

配列番号４は、３’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメインコード配列の核酸配列を示す。

【0156】

配列番号５は、３’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメインコード配列の核酸配列を示す。

【0157】

配列番号６は、ｓｈＲＮＡ ４７２をコードする核酸配列を示す。

【0158】

配列番号７は、７２８２ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ｓｈＲＮＡｍｉＲのパ
ッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

【0159】

配列番号８は、７２８２ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配列
を示す。

【0160】

配列番号９は、７２８５ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする
核酸配列を示す。

【0161】

配列番号１０は、７２８５ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0162】

配列番号１１は、７２８６ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0163】

配列番号１２は、７２８６ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0164】

配列番号１３は、７２８７ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0165】

配列番号１４は、７２８７ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0166】

配列番号１５は、７２８８ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0167】

配列番号１６は、７２８８ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0168】

配列番号１７は、７２８９ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0169】

配列番号１８は、７２８９ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0170】

配列番号１９は、７２９０ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0171】

配列番号２０は、７２９０ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0172】

配列番号２１は、７２１０１ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0173】

配列番号２２は、７２１０１ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0174】

配列番号２３は、７２１０２ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を設定する。

【0175】

配列番号２４は、７２１０２ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を設定する。

【0176】

配列番号２５は、７２１０３ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を設定する。

【0177】

配列番号２６は、７２１０３ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0178】

配列番号２７は、７２１１０トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢ
Ｒ２）ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードする核酸配列を示す。

【0179】

配列番号２８は、７２１１０ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0180】

配列番号２９は、７２１１１ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖を
コードする核酸配列を示す。

【0181】

配列番号３０は、７２１１１ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0182】

配列番号３１は、７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖を
コードする核酸配列を示す。

【0183】

配列番号３２は、７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0184】

配列番号３３は、７２１１３ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖を
コードする核酸配列を示す。

【0185】

配列番号３４は、７２１１３ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0186】

配列番号３５は、７２１１４ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖を
コードする核酸配列を示す。

【0187】

配列番号３６は、７２１１４ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0188】

配列番号３７は、７２１２３ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコー
ドする核酸配列を示す。

【0189】

配列番号３８は、７２１２３ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核
酸配列を示す。

【0190】

配列番号３９は、７２１２４ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコー
ドする核酸配列を示す。

【0191】

配列番号４０は、７２１２４ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核
酸配列を示す。

【0192】

配列番号４１は、７２８２ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0193】

配列番号４２は、７２８５ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0194】

配列番号４３は、７２８６ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0195】

配列番号４４は、７２８７ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0196】

配列番号４５は、７２８８ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0197】

配列番号４６は、７２８９ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0198】

配列番号４７は、７２９０ Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す。

【0199】

配列番号４８は、７２１０１ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0200】

配列番号４９は、７２１０２ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0201】

配列番号５０は、７２１０３ ＣＳ１ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0202】

配列番号５１は、７２１１０ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を示す。

【0203】

配列番号５２は、７２１１１ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を示す。

【0204】

配列番号５３は、７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を示す。

【0205】

配列番号５４は、７２１１３ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を示す。

【0206】

配列番号５５は、７２１１４ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列
を示す。

【0207】

配列番号５６は、７２１２３ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示
す。

【0208】

配列番号５７は、７２１２４ ＣＤ５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示
す。

【0209】

配列番号５８は、ＴＲＣ １－２認識配列（センス）の核酸配列を示す。

【0210】

配列番号５９は、ＴＲＣ １－２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

【0211】

配列番号６０は、Ｂ２Ｍ １３－１４認識配列（センス）の核酸配列を示す。

【0212】

配列番号６１は、Ｂ２Ｍ １３－１４認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

【0213】

配列番号６２は、ＴＧＦ １－２認識配列（センス）の核酸配列を示す。

【0214】

配列番号６３は、ＴＧＦ １－２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。

【0215】

配列番号６４は、ＴＧＦ １－２ｘ．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0216】

配列番号６５は、ＴＧＦ １－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【0217】

配列番号６６は、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0218】

配列番号６７は、ＪｅＴプロモータの核酸配列を示す。

【0219】

配列番号６８は、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルの核酸配列を示す。

【0220】

配列番号６９は、合成イントロンの核酸配列を示す。

【0221】

配列番号７０は、Ｐ２Ａ／フューリン部位の核酸配列を示す。

【0222】

配列番号７１は、ウシ成長ホルモン終結シグナルの核酸配列を示す。

【0223】

配列番号７２は、ＥＦ１アルファコアプロモータの核酸配列を示す。

【0224】

配列番号７３は、シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0225】

配列番号７４は、構築物７３１６１に含まれるカセットの核酸配列を示す。

【0226】

配列番号７５は、構築物７３１６３に含まれるカセットの核酸配列を示す。

【0227】

配列番号７６は、７２１３６ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0228】

配列番号７７は、７２１３６ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0229】

配列番号７８は、７２１３７ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0230】

配列番号７９は、７２１３７ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0231】

配列番号８０は、７２１３８ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0232】

配列番号８１は、７２１３８ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0233】

配列番号８２は、７２１３９ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0234】

配列番号８３は、７２１３９ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0235】

配列番号８４は、７２１４０ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0236】

配列番号８５は、７２１４０ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0237】

配列番号８６は、７２１３６ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0238】

配列番号８７は、７２１３７ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0239】

配列番号８８は、７２１３８ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0240】

配列番号８９は、７２１３９ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0241】

配列番号９０は、７２１４０ ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0242】

配列番号９１は、７２１４２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0243】

配列番号９２は、７２１４２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0244】

配列番号９３は、７２１４３ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0245】

配列番号９４は、７２１４３ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0246】

配列番号９５は、７２１４５ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0247】

配列番号９６は、７２１４５ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0248】

配列番号９７は、７２１４６ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0249】

配列番号９８は、７２１４６ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸配
列を示す。

【0250】

配列番号９９は、７２１４８ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコードす
る核酸配列を示す。

【0251】

配列番号１００は、７２１４８ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0252】

配列番号１０１は、７２１４９ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0253】

配列番号１０２は、７２１４９ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0254】

配列番号１０３は、７２１５０ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0255】

配列番号１０４は、７２１５０ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0256】

配列番号１０５は、７２１５１ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0257】

配列番号１０６は、７２１５１ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0258】

配列番号１０７は、７２１５２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖をコード
する核酸配列を示す。

【0259】

配列番号１０８は、７２１５２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖をコードする核酸
配列を示す。

【0260】

配列番号１０９は、７２１４２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0261】

配列番号１１０は、７２１４３ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0262】

配列番号１１１は、７２１４５ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0263】

配列番号１１２は、７２１４６ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0264】

配列番号１１３は、７２１４８ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0265】

配列番号１１４は、７２１４９ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0266】

配列番号１１５は、７２１５０ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0267】

配列番号１１６は、７２１５１ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0268】

配列番号１１７は、７２１５２ ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を示す
。

【0269】

配列番号１１８は、ＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質のアミノ酸配列を示す。

【0270】

配列番号１１９は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸配列を示す。

【0271】

配列番号１２０は、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0272】

配列番号１２１は、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0273】

配列番号１２２は、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0274】

配列番号１２３は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ
ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の野生型Ｉ－ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0275】

発明の詳細な説明
１．１ 参照および定義
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本
明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、および
ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれる
ことが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる
。

【0276】

本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定され
ると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全で
あり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関
して例示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例
示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書で提案され
る実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかである
と思われ、本発明から逸脱するものではない。

【0277】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細
書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのもの
であり、本発明を限定することを意図するものではない。

【0278】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その
全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0279】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（
ｔｈｅ）」は、１つまたは複数を意味することができる。例えば、「ａ」細胞は、単一の
細胞または多数の細胞を意味し得る。

【0280】

本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という単語は、「および
／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的な意味では使用さ
れない。

【0281】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して「外因性」
または「異種」という用語は、純粋に合成されている、外来種に由来する、または同じ種
に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座におい
てその天然の形態から実質的に改変されている配列を意味することを意図している。

【0282】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはタンパク質に関して「内因性」と
いう用語は、細胞内に天然に含まれるかまたは細胞によって発現される配列またはタンパ
ク質を意味することを意図している。

【0283】

本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」という用
語は互換的に使用され、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する、天然
に存在する酵素または操作された酵素を指す。

【0284】

本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」という用語
は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用可能なヘアピンを含
む人工ＲＮＡ分子を指す。

【0285】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲ
」という用語は、標的遺伝子の発現を転写後に低下させる約２２ｎｔ長の内因的にコード
される成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を指す。ｍｉＲＮＡは、植物、動物、および一
部のウイルスに見られ、一般に、高度に組織特異的または発達段階特異的な様式で発現さ
れる。

【0286】

「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドの領域（ループ部分）によって片側
に連結された二本鎖（ステム部分）を形成することが知られている、または予測されるヌ
クレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を指す。いくつかの場合、ループは非常に短
く、それによってＤｉｃｅｒによって認識されず、Ｄｉｃｅｒ非依存性ｓｈＲＮＡ（内因
性ｍｉＲ０４３１に匹敵する）をもたらし得る。用語「ヘアピン」はまた、ステムループ
構造を指すために本明細書で使用される。ステムループ構造内のヌクレオチドの実際の一
次配列は、二次構造が存在する限り、説明の実施にとって重要ではない。当技術分野で公
知のように、二次構造は、正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは、１
つまたは複数の塩基ミスマッチを含んでもよい。あるいは、塩基対形成は正確であり得る
（すなわち、いかなるミスマッチも含まない）。

【0287】

本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡｍｉＲ」および「マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲ
ＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡ足場にはめ込まれたｓｈＲＮＡ配列を指す。ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲ分子は、それらが効率的なプロセシングに必要な配列に隣接するヘアピンを含
むという点で、天然に存在するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ分子を模倣し、Ｄｒｏｓｈａ酵素によ
ってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによって切
断され、その後、成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣに入ることができる。マイクロＲＮＡ足場は
、天然に存在するマイクロＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、もしくはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡま
たはその変異体に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲが基づくｓｈ
ＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ（２２ヌクレオチド長である）とは異なる長さであり、したが
って、ｍｉＲＮＡ足場は、より長いまたはより短いｓｈＲＮＡ配列長に適応するために改
変されなければならない。

【0288】

本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ隣接配列」という用語は、マイクロＲＮ
Ａプロセシングエレメントを含むヌクレオチド配列を指す。マイクロＲＮＡプロセシング
エレメントは、一次マイクロＲＮＡまたは前駆体マイクロＲＮＡからの成熟マイクロＲＮ
Ａの生成に寄与する最小核酸配列である。多くの場合、これらのエレメントは、マイクロ
ＲＮＡステム－ループ構造に隣接する４０ヌクレオチド配列内に位置する。いくつかの例
では、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に
隣接する５～４，０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列のストレッチ内に見出される
。ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子に使用されるマイクロＲＮＡ隣接配列は、天然に存在するマイク
ロＲＮＡに隣接する天然に存在する配列であり得るか、またはその変異体であり得る。マ
イクロＲＮＡ隣接配列には、ｍｉＲ足場ドメインおよびｍｉＲ基底ステムドメインが含ま
れる。

【0289】

ここに開示される組成物および方法において使用されるｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、５’
から３’方向に：（ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン
；（ｃ）パッセンジャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’
ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメインを含む。

【0290】

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲ足場ドメイン」という
用語は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子中のマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの５’または３’末
端のいずれかに隣接することができ、天然に存在するマイクロＲＮＡ隣接配列またはその
変異体に由来し得るヌクレオチド配列を指す。一般に、ｍｉＲ基底ステムドメイン配列は
、ｓｈＲＮＡ配列（パッセンジャー鎖およびガイド鎖、ならびにｍｉＲループドメイン）
と足場ドメインとを分離する。５’ｍｉＲ足場ドメインは、その３’末端またはその近く
に制限酵素（例えば、ＩＩＳ型制限酵素）認識配列を含むことができ、３’ｍｉＲ足場ド
メインは、その５’末端またはその近くに制限酵素認識配列を含むことができ、したがっ
て、ｓｈＲＮＡ配列の挿入が容易になる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ足場ドメイン
の二次構造は、その実際の配列よりも重要である。

【0291】

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲ基底ステムドメイン」
という用語は、パッセンジャー：ガイド二重鎖の下のヘアピンステムの塩基を含む、パッ
センジャー鎖配列およびガイド鎖配列に直接隣接する配列を指す。したがって、５’およ
び３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、配列が互いに（完全にまたは部分的に）相補的であ
る。いくつかの実施形態では、５’および３’ｍｉＲ基底ステムドメインは、互いにハイ
ブリダイズした場合に、それぞれが１つまたは２つのミスマッチ塩基対を含む２つのミス
マッチバブルを形成する配列を含む。

【0292】

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「パッセンジャー鎖」という用
語は、ガイド配列に（完全にまたは部分的に）相補的であるｓｈＲＮＡｍｉＲの配列を指
す。

【0293】

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ガイド鎖」という用語は、発
現の低下が望まれる標的ｍＲＮＡ配列と（完全または部分的）相補性を有するｓｈＲＮＡ
ｍｉＲの配列を指す。

【0294】

本明細書で使用される場合、ｓｈＲＮＡｍｉＲに関する「ｍｉＲループドメイン」は、
ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー：ガイド二重鎖の一端における一本鎖ループ配列を指
す。ｍｉＲループドメインは、天然に存在するｐｒｅ－マイクロＲＮＡループ配列または
その変異体に由来し得る。

【0295】

本明細書で使用される場合、「切断する」または「切断」という用語は、標的配列内の
二本鎖切断をもたらす、本明細書で「切断部位」と呼ばれる標的配列内の認識配列骨格内
のホスホジエステル結合の加水分解を指す。

【0296】

本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える
認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形
態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは
、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１２３）に由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、Ｄ
ＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然
のＩ－ＣｒｅＩと比較して改変された、Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ
－ＣｒｅＩのこのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知で
ある（例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００７／０４７８５９号
）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合
する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用し
て単一のポリペプチドに連結されている「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミ
ングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である
。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒト免疫細胞で発現された場合実質的に非毒
性であり、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、細胞生存率への有害な影響ま
たはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく、細胞をトランスフェク
トし、３７℃で維持することができる。

【0297】

本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによっ
て連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌク
レアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。
２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一で
はないＤＮＡ配列に結合する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似
パリンドロームまたは非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、
実際には二量体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」または「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレ
アーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレ
アーゼ」という用語は、二量体または単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

【0298】

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニ
ットを単一のポリペプチドに連結するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リン
カーは、天然タンパク質に見られる配列を有していてもよく、またはいずれの天然タンパ
ク質にも見られない人工配列であってもよい。リンカーは、可動性であり、二次構造を欠
いていてもよく、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していて
もよい。リンカーは、限定するものではないが、米国特許第８，４４５，２５１号、同第
９，３４０，７７７号、同第９，４３４，９３１号および同第１０，０４１，０５３号明
細書に包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込ま
れる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６５の残基１５４～１９５と少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９
２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少
なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性
を有し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６５の残基１５４～１９５
を含むアミノ酸配列を有し得る。

【0299】

本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ」という用語は、限定するものではないが、
制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビ
ーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、および酵母ＨＯ
エンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来するヌク
レアーゼドメインまたはその活性部分に融合された複数のＴＡＬドメインリピートを含む
ＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅ
ｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６：７５７－７６１を参照されたい（当該
文献は参照によりその全体が組み込まれる）。ＴＡＬＥＮの設計に有用なヌクレアーゼド
メインには、限定するものではないが、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、ＳｔｓＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、およびＡｌｗＩを含むＩＩ型制
限エンドヌクレアーゼに由来するものが含まれる。さらなるＩＩ型制限エンドヌクレアー
ゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットに記載されており、当該文献は
参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアー
ゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその活性部分である。ＴＡＬドメイン
リピートは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体による感染過程
で使用されるタンパク質のＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）ファミリーに由来
し得る。ＴＡＬドメインリピートは、１２番目および１３番目に多様なアミノ酸を有する
３３～３４個のアミノ酸配列である。リピート可変ジペプチド（ＲＶＤ）と呼ばれるこれ
らの２つの位置は非常に可変的であり、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す。ＤＮ
Ａ標的配列中の各塩基対は、ＲＶＤから生じる特異性を有する単一のＴＡＬリピートに接
触される。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１６～２２個のＴＡＬドメインリピ
ートを含む。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断は、非特異的中央領域（すなわち、「スペーサ
」）に隣接する２つのＤＮＡ認識領域（すなわち、「ハーフサイト」）を必要とする。Ｔ
ＡＬＥＮに関して「スペーサ」という用語は、ＴＡＬＥＮを構成する各モノマーによって
認識および結合される２つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。ＴＡＬドメインリピー
トは、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質由来の天然配列であり得るか、または所定のＤ
ＮＡ配列に結合するタンパク質を生成するために合理的または実験的手段によって再設計
することができる（例えば、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６
（５９５９）：１５０９－１５１２およびＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（
２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１、これらはそれぞれその全体が
参照により組み込まれる）。特定の配列を認識して結合するようにＴＡＬＥＮを操作する
方法、ならびにＲＶＤおよびそれらの対応する標的ヌクレオチドの例については、米国特
許出願公開第２０１１０１４５９４０号および国際公開第２０１０／０７９４３０号パン
フレットも参照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ
）モノマーは、異なるＤＮＡ配列を認識して結合するＴＡＬエフェクター配列に融合する
ことができ、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって
機能性酵素を生成する。用語「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬＥＮスペーサ配列に隣接する上流
および下流のハーフサイトに結合し、スペーサ配列内に切断部位を生成するために協調し
て働く、単一のＴＡＬＥＮタンパク質、あるいは、一対のＴＡＬＥＮタンパク質（すなわ
ち、左ＴＡＬＥＮタンパク質および右ＴＡＬＥＮタンパク質）を指し得ることが理解され
よう。所定のＤＮＡ遺伝子座またはスペーサ配列が与えられると、上流および下流のハー
フサイトは、当技術分野で公知のいくつかのプログラム（Ｋｏｒｎｅｌ Ｌａｂｕｎ；Ｔ
ｅｓｓａ Ｇ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｇａｇｎｏｎ；Ｓｕｍｍｅｒ Ｂ．
Ｔｈｙｍｅ；Ｅｉｖｉｎｄ Ｖａｌｅｎ．（２０１６）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ ｖ２：ａ
ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳ
ＰＲ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８；Ｔｅｓｓａ Ｇ．Ｍｏｎｔ
ａｇｕｅ；Ｊｏｓｅ Ｍ．Ｃｒｕｚ；Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｇａｇｎｏｎ；Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ
．Ｃｈｕｒｃｈ；Ｅｉｖｉｎｄ Ｖａｌｅｎ．（２０１４）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ：ａ Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ＴＡＬＥＮ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ
ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２．Ｗ４０１－Ｗ４０７）
を使用して同定することができる。ＴＡＬＥＮ認識配列は、単一のＴＡＬＥＮタンパク質
のＤＮＡ結合配列（すなわち、ハーフサイト）として、または代替的に、上流ハーフサイ
ト、スペーサ配列、および下流ハーフサイトを含むＤＮＡ配列として定義され得ることも
理解されよう。

【0300】

本明細書で使用される場合、「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ－ＴｅｖＩホ
ーミングエンドヌクレアーゼの任意の部分、または米国特許出願公開第２０１３０１１７
８６９号明細書（その全体が参照により組み込まれる）の表２に列挙されているエンドヌ
クレアーゼのいずれかに任意の方向で融合した１つまたは複数のＴＡＬドメインリピート
を有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指し、ＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅ
ｎｄ１、Ｉ－ＢａｓＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、
ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ、およびＮｕｃＭを含むがこれらに限定されない。コンパクトＴＡＬ
ＥＮは、ＤＮＡプロセシング活性のために二量体化を必要とせず、介在するＤＮＡスペー
サを有する二重標的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトＴＡ
ＬＥＮは、１６～２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。

【0301】

本明細書で使用される場合、「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、転写活性化因子様エフ
ェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインおよび操作された配列特異的ホーミングエンド
ヌクレアーゼを含む単鎖エンドヌクレアーゼを指す。

【0302】

本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」とい
う用語は、限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレ
アーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ Ｉ、ミクロコ
ッカスヌクレアーゼ、および酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼまた
はエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤ
ＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼの設計
に有用なヌクレアーゼドメインには、限定するものではないが、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、およ
びＳｔｓＩ制限酵素を含むＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものが含まれる。さ
らなるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレ
ットに記載されており、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる。ジンクフィンガ
ードメインの構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。１つまたは複数のジンク
フィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的にＤＮＡに結合する。ジ
ンクフィンガードメインは、天然配列であり得るか、２～１０塩基対で分離された一対の
９塩基対ハーフサイトを含む長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク
質を産生するように、合理的または実験的手段によって再設計されてもよい。例えば、米
国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号
、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書、および国際公開第９５
／１９４３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３
１１号、同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号、
同第０２／０９９０８４号パンフレットを参照されたく、これらの各々はその全体が参照
により組込まれる。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌ
クレアーゼドメインに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的化
することが可能である。標的部位、ジンクフィンガータンパク質の選択、ならびにジンク
フィンガーヌクレアーゼの設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特
許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５
０６４４７４号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６０１８８９８７号明細書
および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに詳細に記載されており、これらの
各々は、その全体が参照により組み込まれる。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメ
インは、典型的には、２～１０塩基対の「スペーサ配列」によって分離された一対の９塩
基対「ハーフサイト」を含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平
滑末端または可変長の５’オーバーハング（多くの場合、４塩基対）を作り出す。「ジン
クフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼスペーサ配列
に隣接する上流および下流のハーフサイトに結合し、スペーサ配列内に切断部位を生成す
るために協調して働く、単一のジンクフィンガータンパク質、あるいは、一対のジンクフ
ィンガータンパク質（すなわち、左ＺＦＮタンパク質および右ＺＦＮタンパク質）を指し
得ることが理解されよう。所定のＤＮＡ遺伝子座またはスペーサ配列が与えられると、上
流および下流のハーフサイトは、当技術分野で公知の多くのプログラム（Ｍａｎｄｅｌｌ
ＪＧ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ ３ｒｄ．Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｔｏｏｌｓ：ｃｕｓｔ
ｏｍ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．２００６ Ｊｕｌ １；３４（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５１６－２３
）を使用して同定することができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼ認識配列は、
単一のジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質のＤＮＡ結合配列（すなわち、ハーフサ
イト）、または代替的に、上流ハーフサイト、スペーサ配列、および下流ハーフサイトを
含むＤＮＡ配列として定義され得ることも理解されよう。

【0303】

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲシス
テムヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド中の認識部位にハイブリダイズする
ことによって関連エンドヌクレアーゼによる核酸切断を指示する、ガイドＲＮＡと会合す
るＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短いパリンドロームリ
ピート）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼまたはその変異体を指す。ある実施形態では
、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはクラス２ ＣＲＩＳＰＲ酵素である。これらの実施形態の
いくつかでは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはクラス２のＩＩ型酵素、例えばＣａｓ９であ
る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２のＶ型酵素、例えばＣｐ
ｆ１である。ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートと、標的認識部位に相補的なガイド配
列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではしばしばスペーサと呼ばれる）とを含む。あ
る実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドＲＮＡ上に存在するダイレクトリピー
ト（ｔｒａｃｒ－メイト配列と呼ばれることもある）に（完全にまたは部分的に）相補的
であるｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）をさらに含む。特定の
実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、酵素が、標的ポリヌクレオチドの一本の鎖
を切断する能力を欠き、ニッカーゼとして機能して、標的ＤＮＡの単一の鎖のみを切断す
るように、対応する野生型酵素に対して変異させることができる。ニッカーゼとして機能
するＣＲＩＳＰＲ酵素の非限定的な例としては、ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン内にＤ１０Ａ
変異を有するか、またはＨ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡもしくはＮ８６３Ａ変異を有するＣａｓ
９酵素が挙げられる。所定のＤＮＡ遺伝子座が与えられると、認識配列は、当技術分野で
公知のいくつかのプログラム（Ｋｏｒｎｅｌ Ｌａｂｕｎ；Ｔｅｓｓａ Ｇ．Ｍｏｎｔａ
ｇｕｅ；Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｇａｇｎｏｎ；Ｓｕｍｍｅｒ Ｂ．Ｔｈｙｍｅ；Ｅｉｖｉｎｄ
Ｖａｌｅｎ．（２０１６）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ ｖ２：ａ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ｄｏｉ：１０．
１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８；Ｔｅｓｓａ Ｇ．Ｍｏｎｔａｇｕｅ；Ｊｏｓｅ Ｍ．
Ｃｒｕｚ；Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｇａｇｎｏｎ；Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ；Ｅｉｖｉ
ｎｄ Ｖａｌｅｎ．（２０１４）．ＣＨＯＰＣＨＯＰ：ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａ
ｎｄ ＴＡＬＥＮ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２．Ｗ４０１－Ｗ４０７）を使用して同定することが
できる。

【0304】

本明細書で使用される場合、「鋳型核酸」は、細胞のゲノム内の切断部位に挿入される
ことが望ましい核酸（すなわち、ポリヌクレオチド）を指す。

【0305】

本明細書で使用される場合、タンパク質に関して「組換え」または「操作された」とい
う用語は、タンパク質をコードする核酸およびタンパク質を発現する細胞または生物への
遺伝子操作技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。核
酸に関して、「組換え」または「操作された」という用語は、遺伝子操作技術の適用の結
果として変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術には、限定するも
のではないが、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換
および他の遺伝子移入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；および遺伝子融合が
挙げられる。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有す
るが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換えま
たは操作されていると見なされない。

【0306】

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコー
ドされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団に
おける最も一般的な天然対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生
型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野
生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型配列と比
較して１つまたは複数の突然変異および／または置換を含む突然変異体または変異体の対
立遺伝子およびポリペプチドとは区別可能である。野生型対立遺伝子またはポリペプチド
は生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体または変異体の対立
遺伝子またはポリペプチドは、場合によっては、変更された表現型を付与し得る。野生型
ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能で
ある。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生
物、および／または対象、または比較目的で使用される細胞、生物、および／または対象
を指すことができる。

【0307】

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え
技術によって意図的に改変されている、またはその先祖においてゲノムＤＮＡ配列が組換
え技術によって意図的に改変されている細胞または生物を指す。本明細書で使用される場
合、「遺伝子改変」という用語は、「遺伝子導入」という用語を包含する。

【0308】

組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配
列（例えば、野生型配列または天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の
挿入、欠失、または置換を意味する。

【0309】

本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、ヌクレア
ーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配
列は、４塩基対によって分離された一対の逆位９塩基対「ハーフサイト」を含む。単鎖メ
ガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトと接触し、タ
ンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトと接触する。メガヌクレアーゼによる切
断は、４塩基対の３’オーバーハングを生じる。「オーバーハング」または「粘着末端」
は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって生成することができる短い一本
鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼおよび単鎖メガヌクレ
アーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。コン
パクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第１の
ＣＮＮＮＧＮ配列、それに続く長さ４～１６塩基対の非特異的スペーサ、それに続くＴＡ
Ｌ－エフェクタードメインによって認識される長さ１６～２２ｂｐの第２の配列（この配
列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）を含む。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は、２塩
基対の３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの場合、認識配列は、ガ
イドＲＮＡが結合して切断を指示する、典型的には１６～２４塩基対の配列である。ガイ
ド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断をもたらすために必ずしも必要ではない
。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて、平滑末
端（例えばクラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる）またはオーバーハング末
端（例えばクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる）を生じ得る。ＣｐｆＩ Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼが利用される実施形態では、ＣｐｆＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は、５’オーバーハングをもたらし、ある実施形
態では、５ヌクレオチドの５’オーバーハングをもたらす。各ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
酵素はまた、ガイドＲＮＡに相補的な認識配列の近くにあるＰＡＭ（プロトスペーサ隣接
モチーフ）配列の認識も必要とする。ＰＡＭの正確な配列、長さ要件、および標的配列か
らの距離は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、
標的／認識配列に隣接する２～５塩基対の配列である。特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
酵素に対するＰＡＭ配列は当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第８，６９７，３
５９号および米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書を参照されたい、これ
らの各々は、参照によりその全体が組み込まれる）、新規または操作されたＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼ酵素に対するＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイなどの当技術分野で公知の
方法を使用して同定することができる（例えば、Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０
１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１－１２２：３－８を参照されたい、当該文献はその全体が本
明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、典型的には
、２～１０塩基対によって分離された一対の９塩基対「ハーフサイト」を含む１８ｂｐの
認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端または可変長の５’オーバーハ
ング（多くの場合、４塩基対）を作り出す。

【0310】

本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、ヌクレア
ーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

【0311】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は
、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合す
る傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用さ
れる場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計
的に有意なパーセント変化で増加または減少する場合、ヌクレアーゼは「変更された」結
合親和性を有する。

【0312】

本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、認識配列と呼ばれる塩基対の特
定の配列においてのみ、または認識配列の特定のセットにおいてのみ、ヌクレアーゼが二
本鎖ＤＮＡ分子に結合して切断する能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存さ
れた位置または配列モチーフを共有するが、１つまたは複数の位置で縮重し得る。高度に
特異的なヌクレアーゼは、１つのみまたはごく少数の認識配列を切断することができる。
特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。

【0313】

本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、二本鎖ＤＮ
Ａ切断が、修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して修復される天然の細胞プロセスを指
す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１
１：１９５８－１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性
染色体配列または外因性核酸であり得る。

【0314】

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、２
本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細
胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ
修復はエラーを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型なしの付加または欠失を頻
繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断が、標的認識部位においてＮＨ
ＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断とそれに続く
ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊する突然変異、例えばフレームシフト突
然変異をコード配列に導入し得る。したがって、操作されたヌクレアーゼを使用して、細
胞集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。

【0315】

本明細書で使用される場合、「破壊された」または「破壊する」または「発現を破壊す
る」または「標的配列を破壊すること」という用語は、遺伝子機能に干渉し、ポリペプチ
ド／それによってコードされる発現産物の発現および／または機能を妨げる突然変異（例
えばフレームシフト突然変異）の導入を指す。例えば、遺伝子のヌクレアーゼ媒介破壊は
、切断型タンパク質の発現および／または野生型機能を保持しないタンパク質の発現をも
たらし得る。さらに、遺伝子への鋳型核酸の導入は、コードされたタンパク質の非発現、
切断型タンパク質の発現、および／または野生型機能を保持していないタンパク質の発現
をもたらし得る。

【0316】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免
疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）上に抗原に対する特異性を付与または移植す
る操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、少なくとも１つの細胞外リガンド結合
ドメインまたは部分、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数のシグナル伝達ドメイン
および／または共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。

【0317】

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、抗体または抗体
断片である。これに関連して、「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと、（例え
ば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力
を保持する、抗体の少なくとも一部を指すことができる。抗体断片の例には、限定するも
のではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジス
ルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体
、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨド
メイン、抗体断片から形成された多重特異性抗体、例えばヒンジ領域でジスルフィド架橋
によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、および抗体の単離されたＣＤＲま
たは他のエピトープ結合断片が含まれる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキ
シボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テ
トラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌ
ｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２
３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片はまた、ＩＩＩ型フ
ィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に移植することもできる（フ
ィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細
書を参照されたい）。

【0318】

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、特定のエピトー
プまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子などの、
細胞表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を提供する、モノク
ローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態である。いくつかの実施形態で
は、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して結合している。いくつかの実施形態では、ｓｃＦ
ｖは、ネズミ、ヒト化、または完全ヒトである。

【0319】

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異
的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を含むことができ（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい
）、したがって抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的化し
て殺滅するようにＴ細胞に指示する。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡ
Ｒ）と呼ぶことができ、それらの使用は本発明に包含される。キメラ抗原受容体の細胞外
リガンド結合ドメインはまた、目的の抗原に対する天然に存在するリガンド、または目的
の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含むことができる。

【0320】

細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する１つまたは複
数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインと
しては、限定するものではないが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを挙げることがで
きる。

【0321】

細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖および／または細胞生存シグナルを
伝達する１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。このような細胞内共刺激ド
メインは、当技術分野で公知のもののいずれかであり得、限定するものではないが、例え
ば、Ｎｏｖｅｌ６などの国際公開第２０１８／０６７６９７号パンフレットに開示されて
いる共刺激ドメインを挙げることができる。共刺激ドメインのさらなる例としては、４－
１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、
ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩ
ＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれら
の任意の組み合わせを挙げることができる。

【0322】

キメラ抗原受容体は、ヒンジまたはスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメイン
に結合している膜貫通ドメインを含む、さらなる構造エレメントをさらに含む。膜貫通ド
メインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫
通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはζ
ポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容
体（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）のサブユニット鎖、またはＣＤ８アルファ鎖などのＣ
Ｄタンパク質のサブユニットであり得る。ある例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルフ
ァドメインである。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、ロイシンおよびバリンな
どの疎水性残基を主に含み得る。

【0323】

ヒンジ領域は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能す
る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００
個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のア
ミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えばＣＤ
８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全
部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対
応する合成配列であってもよく、または完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特
定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体または
ＩｇＧ１の一部を含み得る。ある例では、ヒンジ領域はＣＤ８アルファドメインであり得
る。

【0324】

本明細書で使用される場合、「外因性Ｔ細胞受容体」または「外因性ＴＣＲ」という用
語は、その配列が免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムに導入されるＴＣＲを指し、
ＴＣＲは内因的に発現されてもされなくてもよい。免疫細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、
特定のエピトープまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしく
は粒子の表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を付与すること
ができる。このような外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含むことがで
き、あるいはガンマ鎖およびデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用な外因性
ＴＣＲは、目的の任意の抗原またはエピトープに対する特異性を有し得る。

【0325】

本明細書で使用される場合、「ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ融合タンパ
ク質」または「ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質」という用語は、細胞表面上でのＨＬＡ－Ｅタ
ンパク質の発現を可能にする少なくとも１つのさらなるタンパク質に融合したＨＬＡ－Ｅ
タンパク質を含むタンパク質を指す。ＨＬＡ－Ｅタンパク質としては、例えば、ＨＬＡ－
Ｅ－０１：０１またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質（例えば、配列番号１１８）を
挙げることができる。ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、例えば、細胞表面上でのＨＬＡ－Ｅ
タンパク質の発現を可能にするベータ－２ミクログロブリンタンパク質（例えば、配列番
号１１９）に融合したＨＬＡ－Ｅタンパク質を含み得る。さらなる例では、ＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質と、例えば、ＨＬＡ－Ｇリーダ
ーペプチド（例えば、配列番号１２０）および当技術分野で公知の他のものなどの提示の
ためにＨＬＡ－Ｅタンパク質にロードされるさらなるタンパク質との両方に融合したＨＬ
Ａ－Ｅタンパク質を含み得る。ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質のタンパク質は、ポリペプチド
リンカー、例えば、配列番号１２１（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列
番号１２２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー）などを含むリンカーによって融合さ
れ得る。

【0326】

本明細書で使用される場合、標的タンパク質（すなわち、内因的に発現されるタンパク
質）に関して「発現低下」という用語は、対照細胞と比較した場合の、遺伝子改変細胞に
よる内因性タンパク質の発現の任意の低下を指す。低下したという用語はまた、対照細胞
集団と比較した場合の、本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲによって標的化される内因性タンパク
質を野生型レベルで発現する細胞の、細胞集団中のパーセンテージの低下を指すことがで
きる。標的内因性タンパク質を完全に発現する細胞の、集団中のパーセンテージのこのよ
うな低下は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％であり得
る。本開示の文脈において、「低下した」という用語は、標的または内因性タンパク質の
部分的または不完全なノックダウンを包含し、ヌクレアーゼによる遺伝子不活性化によっ
て達成されるものなどの完全なノックダウンとは区別されることが理解されよう。

【0327】

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して、「同一性パ
ーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセンテージ」、「配列類似性」などの用語は
、アライメントしたアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にし、同一または
類似の残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチドの総数、ならびに配列アラ
インメントにおけるギャップの存在および長さの関数である、配列のアラインメントに基
づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性
を決定するために、さまざまなアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能で
ある。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐ
プログラムおよび核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これ
らは両方とも国立生物工学情報センターを介し利用可能であり（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９
３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（
１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ
ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－
３４０２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７
（１－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ
酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに
基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝－１１；ギ
ャップ拡張ペナルティ＝－１；およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用さ
れる場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての
以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペ
ナルティ＝５；ギャップ拡張ペナルティ＝２；マッチリワード＝１；およびミスマッチペ
ナルティ＝－３。

【0328】

本明細書で使用される場合、２つのタンパク質またはアミノ酸配列の改変に関する「に
対応する」という用語は、第１のタンパク質の指定の改変が第２のタンパク質の改変と同
じアミノ酸残基の置換であること、および２つのタンパク質が標準的な配列アラインメン
トに（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）供される場合、第１のタンパク質の
改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するか整列すること
を示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸
「Ａ」への改変は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、
ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における
残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。

【0329】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子」または「ＴＣＲアルファ
遺伝子」という用語は、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするＴ細胞内の遺伝
子座を指す。Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、再編成の前後に、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号
６９５５を指し得る。再編成に続いて、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、内因性プロモー
タ、再編成されたＶセグメントおよびＪセグメント、内因性スプライスドナー部位、イン
トロン、内因性スプライスアクセプター部位、ならびにサブユニットコードエクソンを含
むＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座を含む。

【0330】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域」または「ＴＣＲアルフ
ァ定常領域」という用語は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子のコード配列を指す。ＴＣＲア
ルファ定常領域は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号２８７５５によって同定される野生型配列お
よびその機能的変異体を含む。

【0331】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子」または「ＴＣＲベータ遺伝
子」という用語は、Ｔ細胞受容体ベータサブユニットをコードするＴ細胞内の遺伝子座を
指す。Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号６９５７を指し得る。

【0332】

本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「カセット
」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換
えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一本鎖または二本鎖ポリヌ
クレオチドである。組換え構築物は、限定するものではないが、天然には一緒に見られな
い調節配列およびコード配列を含む核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換
えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給
源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で編成された調節配列およびコード配列
を含み得る。このような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと併せて使
用されてもよい。

【0333】

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」という用語
は、所与の宿主細胞においてポリペプチドコード配列の転写および翻訳が可能な複製シス
テムおよび配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は
、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベ
クターとしては、限定するものではないが、プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶベク
ター、または遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベク
ターを挙げることができる。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチドまたは核酸配列
のいずれかを含む、宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるためにベクター上
に存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に認識している。

【0334】

本明細書で使用される場合、「ベクター」はウイルスベクター（すなわち、組換えウイ
ルス）を指すこともできる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、レト
ロウイルスベクター（すなわち、組換えレトロウイルス）、レンチウイルスベクター（す
なわち、組換えレンチウイルス）、アデノウイルスベクター（すなわち、組換えアデノウ
イルス）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（すなわち、組換えＡＡＶ）を
挙げることができる。

【0335】

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫系（自然および／または
適応）の一部であり、造血起源の任意の細胞を指す。免疫細胞の非限定的な例としては、
リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、巨核球、単球、
マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、骨髄系由来サプレッサー細胞、自然リンパ球系
細胞、血小板、赤血球、胸腺細胞、白血球、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球および
顆粒球が挙げられる。

【0336】

本明細書で使用される場合、「ヒトＴ細胞」または「Ｔ細胞」または「単離ヒトＴ細胞
」は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞およびそれに由来す
る細胞には、培養で継代されていない単離Ｔ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代お
よび維持されたＴ細胞、ならびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＴ
細胞が含まれる。

【0337】

本明細書で使用される場合、「ヒトＮＫ細胞」または「ＮＫ細胞」は、ドナー、特にヒ
トドナーから単離されたＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞およびそれに由来する細胞には、培養
で継代されていない単離ＮＫ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持された
ＮＫ細胞、ならびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＮＫ細胞が含ま
れる。

【0338】

本明細書で使用される場合、「ヒトＢ細胞」または「Ｂ細胞」は、ドナー、特にヒトド
ナーから単離されたＢ細胞を指す。Ｂ細胞およびそれに由来する細胞には、培養で継代さ
れていない単離Ｔ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持されたＢ細胞、な
らびに不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＢ細胞が含まれる。

【0339】

本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」という用語は、遺伝子改変細
胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細
胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子変更の
ための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であ
るが、ヌル構築物を用いて（すなわち、目的の形質に公知の影響を及ぼさない構築物を用
いて）形質転換された細胞；または（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更
された遺伝子型または表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激またはさらなる遺伝子改
変に曝露されていない細胞を含み得る。

【0340】

本明細書で使用される場合、「治療」または「対象を治療する」という用語は、疾患を
有する対象への本発明の遺伝子改変免疫細胞または遺伝子改変免疫細胞の集団の投与を指
す。例えば、対象はがんなどの疾患を有することができ、治療は疾患を治療するための免
疫療法を表し得る。治療の望ましい効果としては、限定するものではないが、疾患の発症
または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少
、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙
げられる。いくつかの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞または遺伝子改変
免疫細胞の集団は、治療中に本発明の医薬組成物の形態で投与される。

【0341】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益または望ましい生物学的および／
または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または
組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、体調および応答
性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の本発明の遺伝子改変免疫細胞もしく
は遺伝子改変免疫細胞の集団、または本明細書に開示の医薬組成物は、対象における疾患
の少なくとも１つの症状を軽減する。疾患ががんである実施形態では、本明細書に開示の
医薬組成物の有効量は、がんの増殖もしくは転移のレベルを低下させ、がんの部分的もし
くは完全な応答もしくは寛解を引き起こし、または対象におけるがんの少なくとも１つの
症状を軽減する。

【0342】

本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、悪性の増殖または腫瘍を引き起こ
す異常で制御されない細胞分裂を特徴とする任意の新生物性疾患（浸潤性または転移性に
かかわらず）を包含すると理解されるべきである。

【0343】

本明細書で使用される場合、「癌腫」という用語は、上皮細胞で構成される悪性増殖を
指す。

【0344】

本明細書で使用される場合、「白血病」という用語は、造血器官／造血系の悪性腫瘍を
指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびその前駆体の異常な増殖および発達
を特徴とする。

【0345】

本明細書で使用される場合、「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質で構成
され、一般に線維性、不均一または均一な物質に埋め込まれた密集した細胞で構成される
腫瘍を指す。

【0346】

本明細書で使用される場合、「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン
細胞系から生じる腫瘍を指す。

【0347】

本明細書で使用される場合、「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血液細
胞腫瘍の群を指す。

【0348】

本明細書で使用される場合、「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞または芽球（未成熟
または胚性組織）の悪性腫瘍によって引き起こされるがんのタイプを指す。

【0349】

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等
しい変数で本発明が実施され得ることを伝えることを意図している。したがって、本質的
に離散的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等し
くなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値
範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。例として、限定するものではないが、０と２と
の間の値を有すると記載されている変数は、その変数が本質的に離散的である場合、０、
１または２の値をとることができ、その変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．
１、０．０１、０．００１の値、または０以上２以下の任意の他の実数値をとることがで
きる。

【0350】

２．１ 発明の原理
本発明は、一部には、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子が、内
因性タンパク質の発現の安定した低下を有する遺伝子改変免疫細胞を作製するために使用
することができるという発見に基づく。本明細書では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核
酸配列をＴ細胞のゲノムに挿入することにより、例えば、ベータ－２ミクログロブリン（
Ｂ２Ｍ）、ＣＳ１、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、
Ｃｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、グルココル
チコイド（ＧＲ）、および分化抗原群５２（ＣＤ５２）の安定かつ効果的なノックダウン
を含む、一連の内因性タンパク質の安定なノックダウンが提供されることが実証される。
内因性タンパク質のノックダウンは、いくつかの例では、遺伝子不活性化によるノックア
ウトと比較して有利であり得る特性を付与し得る。例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２
Ｍノックダウンは、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを示すＣＡＲ Ｔ細胞よりも同種異系で
なく、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による殺滅を受けにくいＣＡＲ Ｔ細胞を産生する
。さらに、免疫細胞のゲノムへのｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の組み込みは、ｓｈＲＮＡ分子を
コードするカセットの挿入により観察される安定性および毒性の問題を解決することが実
証されている。

【0351】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子が複数の内因性タンパク質の発現を低下させるために使用され得
るという実証を考慮すると、本開示の組成物および方法は、免疫細胞内のＢ２Ｍタンパク
質だけでなく任意の目的の内因性タンパク質の発現をさまざまな程度で安定にノックダウ
ンするために使用することができる。

【0352】

２．２ マイクロＲＮＡ適応ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングは、遺伝子発現がマイクロＲＮＡ
などの非コードＲＮＡによって負に調節されるプロセスを指す。負の調節は、以下の３つ
の可能な機序のうちの１つまたは複数により生じ得る：（１）標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制
することによる、（２）転写産物の脱アデニル化および不安定化による、および（３）ｍ
ＲＮＡの切断および分解による。ＲＮＡｉは、通常、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または
内因性マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）によって誘発
される。

【0353】

内因性マイクロＲＮＡ分子の生成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモ
ータからの一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍＲＮＡ）の転写から始まる。各ｐｒｉ－ｍｉＲＮ
Ａは、１～６個のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含有し得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、約７０ヌク
レオチドで構成されるヘアピンループ構造であり、各ヘアピンは、効率的なプロセシング
に必要な配列に隣接している。酵素Ｄｒｏｓｈａは、ヘアピン塩基から約１１ヌクレオチ
ドのＲＮＡを切断することによって、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡからヘアピンを遊離させる。Ｄ
ｒｏｓｈａ切断によって生成されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチドの
オーバーハングを含む。この２ヌクレオチドのオーバーハングは、核から細胞質へのｐｒ
ｅ－ｍｉＲＮＡの搬出を媒介するＥｘｐｏｒｔｉｎ－５タンパク質によって結合される。
細胞質において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンは、ヘアピンの５’末端および３’末端と
の相互作用を介してＤｉｃｅｒによって切断される。Ｄｉｃｅｒは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ
ヘアピンをループ領域において切断して、約２２ヌクレオチド長である不完全なｍｉＲＮ
Ａ：ｍｉＲＮＡ二重鎖を生成する。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二重鎖（成熟ｍｉＲＮＡ）の
単一の鎖は、ｍｉＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ標的が相互作用するＲＮＡ誘導サイレンシン
グ複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。

【0354】

その発見以来、ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制するための強力な
遺伝子ツールとして浮上した。遺伝子ノックダウンは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを模倣し、Ｄ
ｉｃｅｒによってプロセシングされ、ＲＩＳＣに供給される合成短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓ
ｈＲＮＡ）の発現によって達成され得る。しかしながら、本明細書に記載のように、ｓｈ
ＲＮＡは、免疫細胞におけるタンパク質発現を長期低下させることができない。対照的に
、本発明のマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）分子の発現は、タンパク
質発現の持続的な低下および毒性効果の低下をもたらす。ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、それ
らが効率的なプロセシングに必要な配列に隣接するヘアピンを含むという点でｐｒｉ－ｍ
ｉＲＮＡ分子を模倣し、Ｄｒｏｓｈａ酵素によってｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにプロセシングさ
れ、細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによって切断され、その後、成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳ
Ｃに入ることができる。

【0355】

本発明は、内因性タンパク質の存在量を減少させる、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子を発現する
遺伝子改変免疫細胞を提供する。

【0356】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の構造が天然に存在するマイクロＲＮ
Ａ（またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）またはその変異体の構造を
模倣することができるという点で、マイクロＲＮＡ足場を含むことができる。マイクロＲ
ＮＡ（ならびにｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）の配列は、当技術分野で
公知である。本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲのための好適なｍｉＲ足場の非限定的な例として
は、ｍｉＲ－Ｅ、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１
６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－１０３およびｍｉＲ－１０７が挙げられる
。特定の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用されるｓｈＲＮＡｍｉＲは、ｍ
ｉｒ－Ｅ足場を含む。ｍｉｒ－Ｅ足場は、ｍｉＲ－３０ａの合成由来変異体であり、その
起源は国際公開第２０１４／１１７０５０号パンフレットに記載されており、当該文献は
参照によりその全体が組み込まれる。

【0357】

本開示のｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、５’から３’方向に以下のドメインを含み得る：（
ａ）５’ｍｉＲ足場ドメイン；（ｂ）５’ｍｉＲ基底ステムドメイン；（ｃ）パッセンジ
ャー鎖；（ｄ）ｍｉＲループドメイン；（ｅ）ガイド鎖；（ｆ）３’ｍｉＲ基底ステムド
メイン；および（ｇ）３’ｍｉＲ足場ドメイン。ｍｉＲ足場ドメインおよび基底ステムド
メインは、ｍｉＲＮＡステム－ループに隣接し、本明細書では、マイクロＲＮＡプロセシ
ングエレメント（一次マイクロＲＮＡまたは前駆体マイクロＲＮＡからの成熟マイクロＲ
ＮＡの生成に寄与する最小核酸配列）を含むマイクロＲＮＡ隣接配列と称される。多くの
場合、これらのエレメントは、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する４０ヌクレ
オチド配列内に位置する。いくつかの例では、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは
、マイクロＲＮＡステム－ループ構造に隣接する５～４，０００ヌクレオチド長のヌクレ
オチド配列のストレッチ内に見出される。

【0358】

いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ隣接配列は、約３～約４，０００ｎｔ長であり、
ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の５’末端および３’末端のいずれか、または両方に存在し得る。
他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子のマイクロＲＮＡ隣接配列の最小長は、約１０
、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１
２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１
３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１
５０、約２００、およびその間の任意の整数である。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒ分子のマイクロＲＮＡ隣接配列の最大長は、約２，０００、約２，１００、約２，２０
０、約２，３００、約２，４００、約２，５００、約２，６００、約２，７００、約２，
８００、約２，９００、約３，０００、約３，１００、約３，２００、約３，３００、約
３，４００、約３，５００、約３，６００、約３，７００、約３，８００、約３，９００
、約４，０００、およびそれらの間の任意の整数である。

【0359】

マイクロＲＮＡ隣接配列は、天然マイクロＲＮＡ隣接配列または人工マイクロＲＮＡ隣
接配列であり得る。天然マイクロＲＮＡ隣接配列は、マイクロＲＮＡ配列と共に天然に存
在する系内に通常含まれるヌクレオチド配列である（すなわち、これらの配列は、インビ
ボで最小マイクロＲＮＡヘアピンを取り囲むゲノム配列内に見出される）。人工マイクロ
ＲＮＡ隣接配列は、天然に存在する系においてマイクロＲＮＡ配列に隣接していることが
見出されないヌクレオチド配列である。人工マイクロＲＮＡ隣接配列は、他のマイクロＲ
ＮＡ配列との関連において天然に見出される隣接配列であり得る。あるいは、それらは、
天然に存在する隣接配列内に見出され、天然には隣接配列として存在しないか、または天
然の隣接配列として部分的にのみ存在する他のランダム核酸配列に挿入される最小のマイ
クロＲＮＡプロセシングエレメントから構成され得る。

【0360】

いくつかの実施形態では、５’ｍｉＲ足場ドメインは、約１０～約１５０ヌクレオチド
長であり、限定するものではないが、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０
、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０および
約１５０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉＲ足場ドメ
インは約１１１ヌクレオチド長である。５’ｍｉＲ足場ドメインは、ＩＩＳ型制限酵素に
対する認識配列である３’配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉ
Ｒ足場ドメインは、その３’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む。特定の実施形態では、５’
ｍｉＲ足場ドメインは、配列番号１として示される配列と少なくとも約５０％、少なくと
も約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくと
も約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくと
も約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくと
も約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、５’ｍｉＲ足
場ドメインは、配列番号１として示される配列を有する。

【0361】

ｓｈＲＮＡｍｉＲの５’ｍｉＲ基底ステムドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であ
り得、いくつかの実施形態では、限定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約
９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１
９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２
９および約３０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、５’ｍｉＲ基
底ステムドメインは約２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、５’ｍｉＲ基底
ステムドメインは、配列番号２として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約
５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約
７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約
９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、５’ｍｉＲ基底ス
テムドメインは、配列番号２として示される配列を有する。

【0362】

本開示の組成物および方法のｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ステム－ループ構造を含み、ス
テムはハイブリダイズしたパッセンジャー鎖およびガイド鎖から構成され、ループは一本
鎖である。ｍｉＲループドメインは、天然に存在するｐｒｅ－マイクロＲＮＡまたはｐｒ
ｉ－マイクロＲＮＡループ配列またはその変異体に由来し得る。いくつかの実施形態では
、ｍｉＲループドメインは、ｍｉＲ－３０（例えば、ｍｉＲ－３０ａ）、ｍｉＲ－１５、
ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－１０３およびｍｉＲ－１０７の
いずれか１つに由来するループドメインの配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮ
ＡｍｉＲはｍｉＲ－３０ａループドメインを含み、その配列は配列番号３として示される
。

【0363】

ある実施形態では、ｍｉＲループドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であり得、限
定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１
３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２
３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９および約３０ヌクレオチド長を含
む。これらの実施形態のいくつかでは、ｍｉＲループドメインは約１５ヌクレオチド長で
ある。特定の実施形態では、ｍｉＲループドメインは、配列番号３として示される配列と
少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、
少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、
少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、
少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、
少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。あ
る実施形態では、ｍｉＲループドメインは、配列番号３として示される配列を有する。

【0364】

ｓｈＲＮＡｍｉＲの３’ｍｉＲ基底ステムドメインは約５～約３０ヌクレオチド長であ
り得、いくつかの実施形態では、限定するものではないが、約５、約６、約７、約８、約
９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１
９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２
９および約３０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、３’ｍｉＲ基
底ステムドメインは約１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、３’ｍｉＲ基底
ステムドメインは、配列番号４として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約
５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約
７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約
９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、３’ｍｉＲ基底ス
テムドメインは、配列番号４として示される配列を有する。

【0365】

いくつかの実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは、約５０～約１５０ヌクレオチド
長であり、限定するものではないが、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０
、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０または
約１５０ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、３’ｍｉＲ足場ドメ
インは約１１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは
、配列番号５として示される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくと
も約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくと
も約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくと
も約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくと
も約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそ
れを超える配列同一性を有する。ある実施形態では、３’ｍｉＲ足場ドメインは、配列番
号５として示される配列を有する。

【0366】

ｓｈＲＮＡｍｉＲのガイド鎖は、ｍＲＮＡを標的とする配列であり、ｍＲＮＡによって
コードされるタンパク質の存在量の減少をもたらす。ガイド鎖がその標的ｍＲＮＡに結合
した後、ＲＩＳＣは、標的転写物を分解するか、および／または標的転写物が翻訳のため
にリボソームに取り込まれるのを防ぐ。ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡの発現の低下をもたら
すために、標的ｍＲＮＡと十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は
、標的ｍＲＮＡ配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７
０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９
７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％相補的である。ある実施
形態では、ガイド鎖は、コード配列内の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする。ガイド鎖は
、標的ｍＲＮＡ配列と１、２、３、４、５またはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを
含み得る。他の実施形態では、ガイド鎖は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの
非コード領域において標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ガ
イド鎖は、約１５～約２５ヌクレオチド長であり、限定するものではないが、約１５、約
１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４および約２５
ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ガイド鎖は約２２ヌクレオチ
ド長である。ｓｈＲＮＡｍｉＲが由来するｓｈＲＮＡ配列が、ほとんどの天然に存在する
マイクロＲＮＡの長さである２２ヌクレオチド長未満である特定の実施形態では、追加の
ヌクレオチドがｓｈＲＮＡ配列に付加され、ある実施形態では、この追加のヌクレオチド
は、標的ｍＲＮＡ内の対応する位置と相補的なものである。

【0367】

ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖は、ガイド鎖配列と完全または部分的に相補的な
配列である。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、約１５～約２５ヌクレオチ
ド長であり、限定するものではないが、約１５～約２５ヌクレオチド長を含み、限定する
ものではないが、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、
約２３、約２４および約２５ヌクレオチド長を含む。これらの実施形態のいくつかでは、
パッセンジャー鎖は約２２ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対し
て少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％
、少なくとも約９９％または１００％相補的であり得る。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖
と１、２、３、４、５またはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。しかしな
がら、ある実施形態では、ガイド：パッセンジャー鎖二重鎖は、いかなるミスマッチヌク
レオチドも含まない。一般に、ガイド／パッセンジャー鎖配列は、それ自体の中にいかな
る二次構造も形成しないように選択されるべきである。さらに、一塩基多型を含むｍＲＮ
Ａ内の部位を標的とするガイド／パッセンジャー鎖配列の使用は避けるべきである。標的
ｍＲＮＡに特異的なガイド／パッセンジャー鎖配列は、オフターゲット効果（すなわち、
非標的ｍＲＮＡの発現の低下）を回避するために好ましい。

【0368】

適切なｓｈＲＮＡｍｉＲガイド／パッセンジャー鎖、または他のｓｈＲＮＡｍｉＲドメ
インの配列の選択を助けるために、ＲＮＡ分子の予測二次構造をモデル化する当技術分野
で公知の任意のプログラム、限定するものではないが、Ｍｆｏｌｄ、ＲＮＡｆｏｌｄ、お
よびＵＮＡＦｏｌｄなどを使用することができる。特定のｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮ
ＡまたはｍｉＲＮＡガイド／パッセンジャー配列の効率を予測することができる当技術分
野で公知の任意のプログラム、限定するものではないが、例えば、以下に開示されている
ものを使用して適切なガイド／パッセンジャー鎖配列を選択することができる：Ａｇａｒ
ｗａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ｅＬｉｆｅ４：ｅ０５００５；およびＫｎｏｔｔ ｅ
ｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ５６（６）：７９６－８０７、これらの各文献
はその全体が本明細書に組み込まれる。

【0369】

２．３ 遺伝子改変免疫細胞
本発明は、遺伝子改変免疫細胞およびその集団、ならびにそれらを作製するための方法
を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞
はヒト免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞、またはそれに由来
する細胞である。他の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはそ
れに由来する細胞である。さらに他の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞、またはそれに
由来する細胞である。さらに他の実施形態では、免疫細胞は、単球もしくはマクロファー
ジ細胞、またはそれに由来する細胞である。

【0370】

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺
組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの供給源から得
ることができる。本開示のある実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞
株、ＮＫ細胞株、Ｂ細胞株、単球細胞株またはマクロファージ細胞株を使用することがで
きる。本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、当業者に公知
の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液単位から得られる。一実施形態で
は、個体の循環血液由来の細胞はアフェレーシスによって得られる。本発明の免疫細胞は
また、機能的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）に分化した人工多能性幹細
胞（ｉＰＳＣ）由来細胞であり得る。

【0371】

本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞は、細胞のゲノム中にｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒをコードする核酸配列を含み、標的タンパク質の発現の低下をもたらす。

【0372】

内因性タンパク質の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかにお
いて、内因性タンパク質の発現は、対照細胞（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細
胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５
５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９
５％、または最大約９９％低下する。当技術分野で公知の任意の方法、限定するものでは
ないが、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、免疫細胞化学および免
疫沈降などを使用して、ｓｈＲＮＡｍｉＲによって標的化される内因性タンパク質の発現
レベルを決定することができる。

【0373】

集団内の細胞によってｓｈＲＮＡｍｉＲを発現させると、対照細胞の集団と比較した場
合、ｓｈＲＮＡｍｉＲが標的とする内因性タンパク質を完全に発現する細胞の、集団中の
細胞のパーセンテージの低下をもたらし得る。このような低下は、集団中の細胞の最大５
％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％であり得る。

【0374】

ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、遺伝子改変免疫細胞のゲノム、例えばカセ
ットに存在し得る。このようなカセットは、例えば、ランダムな組み込み（例えば、レン
チウイルス形質導入）、または選択された部位への標的挿入（例えば、ヌクレアーゼ媒介
標的挿入によって）のいずれかによって本発明の鋳型核酸を導入することによって、ゲノ
ムに内に挿入することができる。ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列を含むカセットは、例えば
、本明細書に記載されるもの（例えば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲ、融合タンパク質）などの
追加のタンパク質をコードする核酸配列を含むことができ、プロモータおよび終結配列な
どの制御配列も含み得る。ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ
の発現を可能にするカセットまたは鋳型核酸内の任意の数の位置に配置することができる
。いくつかの例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、別の導入遺伝子（例え
ば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする核酸配列）の終止コドンと
終結シグナルとの間に配置される。他の例では、カセットまたは鋳型核酸中に存在する別
の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、外因性ＴＣＲまたは融合タンパク質をコードする核酸配
列）は、導入遺伝子配列内に配置されるイントロンを含む。ここで、「配置される」とは
、得られた配列が導入遺伝子の５’部分、イントロン配列および導入遺伝子の３’部分を
含むように、イントロン配列が導入遺伝子配列に挿入されることを意味することを意図し
ている。いくつかのこのような例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列は、この
ようなイントロン内に配置することができる。ここで、「配置される」とは、得られた配
列がイントロン配列の５’部分、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列、およびイントロン配列の
３’部分を含むように、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列がイントロン配列に挿入されること
を意味することを意図している。このような場合、導入遺伝子が発現されると、ｓｈＲＮ
ＡｍｉＲが発現され、イントロン配列が細胞によってスプライシングで切り出される。こ
の様式で含めることができるイントロンは、天然に存在するイントロンまたは代替的に合
成イントロンであり得る。本発明に有用な合成イントロンの特定の例は、配列番号６９に
よってコードされる。

【0375】

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、そのゲノム中にＣＡＲまたは外因性ＴＣＲ
をコードする核酸配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変
免疫細胞は、そのゲノム中に、免疫細胞表面上に発現され得るＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質
をコードする核酸配列をさらに含むことができる。

【0376】

ＣＡＲ／ＴＣＲコード核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする
核酸配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列と同じ遺伝子内に位置し得る。あるいは、ＣＡ
Ｒ／ＴＣＲコード核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配
列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列とは異なる遺伝子内に位置し得る。

【0377】

各コード配列は、異なるプロモータに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲコード配列は、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列および
／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列と同じプロモータに作動可能に
連結されている。いくつかの具体例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡ
Ｒまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコード
する核酸配列がすべて同じ遺伝子内に位置する場合、核酸配列の２つは第１のプロモータ
に作動可能に連結されており、第３の核酸配列は第２のプロモータに作動可能に連結され
ている。他の具体例では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列、ＣＡＲまたは外因性
ＴＣＲをコードする核酸配列、およびＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列が
すべて同じ遺伝子内に位置する場合、核酸配列の３つすべてが同じプロモータに作動可能
に連結されている。さまざまな実施形態では、核酸配列は、ゲノム内への挿入後に内因性
プロモータに作動可能に連結され得る。いくつかのこのような場合、本発明のカセットま
たは鋳型核酸は、コードされた配列を発現させるために外因性プロモータを必要としない
場合がある。さらに、このような場合、カセットまたは鋳型核酸は、核酸が内因性プロモ
ータに作動可能に連結されるのに必要なエレメント（例えば、スプライスアクセプター配
列、２ＡまたはＩＲＥＳ配列など）を含み得る。他の実施形態では、本発明のカセットま
たは鋳型核酸は、核酸配列に作動可能に連結された、ｓｈＲＮＡｍｉＲ、ＣＡＲもしくは
外因性ＴＣＲ、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質の発現を駆動する１つまたは複
数の外因性プロモータを含む。

【0378】

コード配列の各々は、ゲノム中に同じ向きで、または互いに異なる向きで存在し得る。
例えば、１つのコード配列は二本鎖ＤＮＡのプラス鎖上にあり得、別のコード配列はマイ
ナス鎖上にあり得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード核酸配列は、Ｃ
ＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質をコードする核酸配列の３’下流にある。代替的な実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲコ
ード配列は、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコー
ドする核酸配列の５’上流にある。

【0379】

ある実施形態では、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲ、ｓｈＲＮＡｍｉＲ、および／または
ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードする核酸配列などの核酸配列は、同じプロモータに作
動可能に連結され、同じ核酸分子からの２つ以上の遺伝子（すなわち、シストロン）の翻
訳を可能にするために当技術分野で公知の任意のエレメントによって分離される。このよ
うな要素としては、限定するものではないが、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、
Ｐ２Ａエレメント（例えば、Ｐ２Ａ／フューリン）、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエ
レメントを挙げることができる。

【0380】

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、免疫細胞をＮＫ細胞殺滅から保護する細胞
表面タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの例では、核酸配列は、非古典的
ＭＨＣ Ｉタンパク質をコードする。非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質としては、限定
するものではないが、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－ＧおよびＨＬＡ－Ｈを挙げるこ
とができる。特定の例では、核酸配列はＨＬＡ－Ｅタンパク質をコードする。ＨＬＡ－Ｅ
タンパク質の例としては、限定するものではないが、ＨＬＡ－Ｅ－０１：０１タンパク質
またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質（例えば、配列番号１１８）が挙げられる。本
発明の特定の例では、核酸配列は、非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ
－Ｅ）と、免疫細胞の細胞表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を可能にする少なく
とも１つの追加のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、
例えば、細胞表面上でのＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を可能にするベータ－２ミクロ
グロブリンタンパク質（例えば、配列番号１１９）に融合したＭＨＣクラスＩタンパク質
（ＨＬＡ－Ｅ）を含み得る。内因性ベータ－２ミクログロブリンの発現を阻害し、ベータ
２ミクログロブリンを含む融合タンパク質の発現を阻害しないために、融合タンパク質中
のベータ－２ミクログロブリンコード配列を、変更された配列に対してｓｈＲＮＡｍｉＲ
が特異性を有さないように変更することができる（例えば、コドン最適化）。さらなる例
では、融合タンパク質は、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質と非古典的ＭＨＣによ
って細胞外に提示される追加のタンパク質との両方に融合した非古典的ＭＨＣクラスＩタ
ンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ）を含み得る。このような追加のタンパク質としては、例
えば、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチド（例えば、配列番号１２０）を挙げることができる。
融合タンパク質の個々のタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、配列番号１２１
（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列番号１２２（すなわち、（ＧＧＧＧ
Ｓ）４リンカー）などを含むリンカーによって融合され得る。

【0381】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質、ベータ－２ミクログ
ロブリンタンパク質、およびＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ融合タンパク
質である。いくつかのこのような実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質はＨＬＡ－Ｅ－０
１：０１タンパク質またはＨＬＡ－Ｅ－０１：０３タンパク質であり、特定の実施形態で
は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質は配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｅ－０１：
０３タンパク質である。いくつかのこのような実施形態では、ベータ－２ミクログロブリ
ンタンパク質は、配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチドは
、配列番号１２０のアミノ酸配列を有する。さらなるこのような実施形態では、ＨＬＡ－
Ｅタンパク質、ベータ－２ミクログロブリンタンパク質、およびＨＬＡ－Ｇリーダータン
パク質は、配列番号１２１（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）または配列番号１２
２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー）を含むポリペプチドリンカーによって融合さ
れる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９
３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少
なくとも９８％、または最大少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0382】

ある実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする
核酸配列を含む。一般に、本開示のＣＡＲは、少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、および細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外
リガンド結合ドメインまたは部分とも称される標的特異的結合エレメントを含む。いくつ
かの実施形態では、細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激ド
メインおよび１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む。

【0383】

いくつかの実施形態では、本発明において有用なＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイ
ンを含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプ
および数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的
細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。した
がって、ＣＡＲにおいてリガンド結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表
面マーカーのいくつかの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患、
ならびにがん細胞に関連するものが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、が
ん（すなわち、腫瘍）細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド結合部分を操作す
ることによって、目的のがん特異的抗原を標的とするように操作される。本開示の文脈に
おいて、「がん抗原」、「腫瘍抗原」、「がん特異的抗原」または「腫瘍特異的抗原」は
、がんなどの特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。

【0384】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原
またはエピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原またはエピトープに特異的である。非限定
的な例として、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、主要関連表面抗原、例えば、Ｅ
ｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡ
Ｍ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ｂ、ＩＬ１ＲＡＰ、グリ
ピカン３（ＧＰＣ３）、ＣＬＬ－１、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇ
ｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴ脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂ－ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロ
ブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ
２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロ
スターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－
ｌａ、ｐ５３、プロスタイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ
、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ
、エフリンＢ２、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）－１、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体
、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（Ｍ
ＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネク
チンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）とエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン
ＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ Ａｌ）、および線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）；系列
特異的または組織特異的抗原、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、
ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、
Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合
体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ １７）、ＣＳ１；またはウイ
ルス特異的表面抗原、例えば、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ ｇｐｌ２０など）、ＥＢＶ特
異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、Ｅ６もしくはＥ７腫瘍性タンパク質などのＨＰＶ特異的抗
原、ラッセウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの
表面マーカーの誘導体または変異体である。

【0385】

いくつかの例において、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、抗体または抗体断
片である。抗体断片は、例えば、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化
／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくと
も一部であり得る。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ
およびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ
（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、抗体断片から形成された多重
特異性抗体、例えばヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片
を含む二価断片、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が含まれ
る。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、
イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－
ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ
，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を
参照されたい）。抗原結合断片はまた、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリ
ペプチドに基づく足場に移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボデ
ィを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。

【0386】

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、特定のエピトー
プまたは抗原（例えば、がん細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子などの、
細胞表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を提供する、モノク
ローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態である。いくつかのこのような
実施形態では、ｓｃＦｖは、抗原に対する特異性を有するモノクローナル抗体由来の重鎖
可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むことができる。いくつかの
実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して結合している。いくつかの実施形態で
は、ｓｃＦｖは、ネズミ、ヒト化、または完全ヒトである。

【0387】

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異
的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を含むことができ（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい
）、したがって抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的化し
て殺滅するようにＴ細胞に指示する。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡ
Ｒ）と呼ぶことができ、それらの使用は本発明に包含される。

【0388】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対する
天然に存在するリガンド、または目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリ
ガンドの断片を含むことができる。

【0389】

ＣＡＲは、ヒンジ領域またはスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインを細胞
内シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインと連結する膜貫通ドメインを含み得る。膜
貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば
、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γま
たはζポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆ
ｃ受容体（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）のサブユニット鎖、またはＣＤ８アルファ鎖な
どのＣＤタンパク質のサブユニットであり得る。ある例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８
アルファドメインである。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、ロイシンおよびバ
リンなどの疎水性残基を主に含み得る。

【0390】

ヒンジ領域は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能す
る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００
個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のア
ミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えばＣＤ
８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全
部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対
応する合成配列であってもよく、または完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特
定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体または
ＩｇＧ１の一部を含み得る。ある例では、ヒンジ領域はＣＤ８アルファドメインであり得
る。

【0391】

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された細胞の正常なエフェクタ
ー機能の少なくとも１つの活性化ならびに／または増殖および細胞生存経路の活性化を担
う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフ
ェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性で
あり得る。細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する１つ
または複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ド
メインとしては、限定するものではないが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを挙げる
ことができる。

【0392】

細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖および／または細胞生存シグナルを
伝達する１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。場合によっては、共刺激ド
メインは、１つまたは複数のＴＲＡＦ結合ドメインを含み得る。このような細胞内共刺激
ドメインは、当技術分野で公知のもののいずれかであり得、限定するものではないが、例
えば、Ｎｏｖｅｌ ６（「Ｎ６」）などの国際公開第２０１８／０６７６９７号パンフレ
ットに開示されている共刺激ドメインを挙げることができる。共刺激ドメインのさらなる
例としては、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ
３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ
２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガン
ド、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態では、共刺
激ドメインはＮ６ドメインである。別の特定の実施形態では、共刺激ドメインは４－１Ｂ
Ｂ共刺激ドメインである。

【0393】

他の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードす
る核酸配列を含む。このような外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含む
ことができ、あるいはガンマ鎖およびデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用
な外因性ＴＣＲは、限定するものではないが、本明細書に開示の任意の抗原またはエピト
ープなどの目的の任意の抗原またはエピトープに対する特異性を有し得る。

【0394】

特定の実施形態では、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲは、任意のタイプのがん細胞に特異的
であり得る。このようながんとしては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、肉腫
、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺が
ん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病および
ホジキンリンパ腫を挙げることができる。特定の実施形態では、がんおよび障害としては
、限定するものではないが、プレＢ ＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞
リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後のサルベージなどが挙げら
れる。これらのがんは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２および／またはＲＯＲ１
を標的とするＣＡＲの組み合わせを使用して治療することができる。いくつかの非限定的
な例では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団は、癌種、リンパ腫、肉腫、黒色
腫、芽細胞腫、白血病、および胚細胞腫瘍を標的とし、限定するものではないが、Ｂ細胞
起源のがん、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺がん、腎細胞癌腫、肝がん、胃がん、骨がん
、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、腎
がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、
精巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部
の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん
、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形
腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経
系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠
腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、アスベストによって誘発され
るがんを含む環境誘発がん、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急
性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫
、急性リンパ芽球性白血病、真菌症、未分化大細胞リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫、な
らびに前記がんの任意の組み合わせなどを標的とする。ある実施形態では、Ｂ細胞起源の
がんには、限定するものではないが、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ
球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、プレＢ ＡＬＬ（小児
適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ
腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫が含まれる。いくつかの例では、がん
には、限定するものではないが、Ｂ細胞起源のがんまたは多発性骨髄腫が含まれ得る。い
くつかの例では、Ｂ細胞起源のがんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ
球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、または非ホジキンリンパ腫（
ＮＨＬ）である。いくつかの例では、Ｂ細胞起源のがんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣ
Ｌ）またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。

【0395】

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、不活性化ＴＣＲアルファ遺
伝子および／または不活性化ＴＣＲベータ遺伝子を含む。本発明の遺伝子改変細胞を作製
するためのＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子の不活性化は、ＴＣ
Ｒアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子が発現されている少なくとも一方ま
たは両方の対立遺伝子において起こる。したがって、一方または両方の遺伝子の不活性化
は、内因性ＴＣＲアルファ鎖または内因性ＴＣＲベータ鎖タンパク質の発現を妨げる。こ
れらのタンパク質の発現は、細胞表面上の内因性アルファ／ベータＴＣＲの構築に必要で
ある。したがって、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子の不活性化
は、内因性アルファ／ベータＴＣＲの検出可能な細胞表面発現を有さない遺伝子改変免疫
をもたらす。内因性アルファ／ベータＴＣＲはＣＤ３を組み込んでいる。したがって、不
活性化ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ鎖を有する細胞は、ＣＤ３の検
出可能な細胞表面発現を有し得ない。特定の実施形態では、不活性化遺伝子は、ＴＣＲア
ルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子である。

【0396】

いくつかの例では、ＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、またはＴＣＲベータ遺伝
子は、遺伝子の切断部位への鋳型核酸の挿入によって不活性化される。鋳型核酸の挿入は
、内因性ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖の発現を破壊し、したがってＴ細胞表面
上の内因性アルファ／ベータＴＣＲの構築を妨げる。いくつかの例において、鋳型核酸は
、ＴＲＡＣ遺伝子内に挿入される。特定の例では、鋳型核酸は、配列番号５８（すなわち
、ＴＲＣ １－２認識配列）を含む操作されたメガヌクレアーゼ認識配列においてＴＲＡ
Ｃ遺伝子内に挿入される。特定の例では、ＣＡＲ導入遺伝子は、配列番号５８内のヌクレ
オチド位置１３と１４との間に挿入される。

【0397】

遺伝子改変免疫細胞がＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する実施形態のいくつかでは、
このような細胞は内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の検出
可能な細胞表面発現を有さない。したがって、本発明はさらに、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現
し、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の検出可能な細胞表
面発現を有さず、いくつかの実施形態ではさらにＣＡＲまたは外因性ＴＣＲを発現する遺
伝子改変免疫細胞の集団を提供する。例えば、この集団は、ＣＡＲを発現し（すなわち、
ＣＡＲ＋である）、または外因性Ｔ細胞受容体を発現し（すなわち、ｅｘｏＴＣＲ＋）、
内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を有さない（すなわち、ＴＣＲ－である）、本発明の
複数の遺伝子改変免疫細胞を含み得る。

【0398】

本明細書で使用される場合、「内因性ＴＣＲの検出可能な細胞表面発現」とは、標準的
な実験方法を使用して免疫細胞の細胞表面上のＴＣＲ複合体（例えば、アルファ／ベータ
ＴＣＲ複合体）の１つまたは複数の成分を検出する能力を指す。このような方法としては
、例えば、ＴＣＲアルファ鎖もしくはＴＣＲベータ鎖などのＴＣＲ自体の成分、またはＣ
Ｄ３などの構築された細胞表面ＴＣＲ複合体の成分に特異的な免疫染色および／またはフ
ローサイトメトリを挙げることができる。免疫細胞上の内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ
／ベータＴＣＲ）の細胞表面発現を検出する方法としては、本明細書の実施例に記載の方
法、および例えば、ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ２５（４）：９４９－９６１に記載されている方法が挙げられる。

【0399】

２．４ ｓｈＲＮＡｍｉＲ標的タンパク質
本開示の組成物および方法の遺伝子改変免疫細胞は、任意の内因性タンパク質の発現を
低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを含み、発現することができる。ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いて
発現を低下させることができる内因性タンパク質の非限定的な例には、ベータ－２ミクロ
グロブリン（Ｂ２Ｍ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）
、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＳ１、ＣＤ５２、デオキシシチジンキナーゼ
（ＤＣＫ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子、および
Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子が含まれる。

【0400】

Ａ．ベータ－２ミクログロブリン
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、Ｂ２Ｍである。Ｂ２Ｍは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）
クラスＩ分子の成分であり、Ｂ２Ｍが存在しなければこの分子は細胞表面に構築されない
。ＭＨＣクラスＩ分子は、Ｂ２Ｍに加えて、α１、α２、およびα３タンパク質から構成
される。ＭＨＣクラスＩ分子内で、Ｂ２Ｍタンパク質は、α３タンパク質の横に位置し、
細胞表面のα１タンパク質の下に位置する。Ｂ２Ｍは膜貫通領域を欠き、ＭＨＣクラスＩ
分子のペプチド結合溝の安定性に必要である。

【0401】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＢ
２Ｍ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ
配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０４８．３であり、Ｂ
２Ｍタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４０３９．１である。

【0402】

Ｂ２Ｍの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下するそれらの実施形態のいくつかでは、
Ｂ２Ｍの細胞表面発現は、対照細胞（例えば、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しな
い細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、
約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、
約９５％、または最大約９９％低下する。

【0403】

Ｂ２Ｍが細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の構築に必要であることを考えると、Ｂ２Ｍ
の発現が低下した細胞はまた、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の減少を示す。これらの
実施形態のいくつかでは、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の発現は、対照細胞（例えば
、Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、
約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、
約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

【0404】

Ｂ２Ｍを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、Ｂ２Ｍ遺伝子内の配列に（完全または部
分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それ
ぞれ配列番号１７および１８として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ ７２８９ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列および
ガイド配列は、それぞれ配列番号７および８として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ
７２８２ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャ
ー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９および１０として示される配列を含む（
例えば、Ｂ２Ｍ ７２８５ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１１および１２とし
て示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ ７２８６ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実
施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列
番号１３および１４として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ ７２８７ ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配
列は、それぞれ配列番号１５および１６として示される配列を含む（例えば、Ｂ２Ｍ ７
２８８ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配
列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１９および２０として示される配列を含む（例
えば、Ｂ２Ｍ ７２９０ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

【0405】

Ｂ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１～４７のいずれか１つに示される核酸
配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少
なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、
少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくと
も９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では
、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１～４７のいずれか１つに示される配列を含む。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４１に示される配列を含む。いくつ
かの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４２に示される配列を含む。いくつか
の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４３に示される配列を含む。いくつかの
実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４４に示される配列を含む。いくつかの実
施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４５に示される配列を含む。いくつかの実施
形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形
態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４７に示される配列を含む。

【0406】

Ｂ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ分子のレベルが低下した細胞は、対照細胞（例えば、Ｂ２
Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、同種異系性の低下を示し得る
。本明細書で使用される場合、「同種異系性」という用語は、細胞が「他の」または自己
ではないものとして免疫系によって認識され作用される能力を指す。同種異系性は、プラ
イミングされた同種異系抗原特異的ＣＴＬまたはＮＫ細胞とのインキュベーション後に生
細胞のパーセンテージを定量した本明細書の他の箇所に記載される方法を含む、当技術分
野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

【0407】

Ｂ．ＣＳ１
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、ＣＳ１（ＣＣＮＤ３サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ３１９、
およびＳＬＡＭＦ７としても知られている）である。ＣＳ１は、シグナル伝達リンパ球活
性化分子（ＳＬＡＭ）関連受容体ファミリーのメンバーであり、正常なＮＫ細胞、Ｂ細胞
、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、および単球の表面上に発現される。ＣＳ１は、多発
性骨髄腫細胞によって過剰発現され、多発性骨髄腫の免疫療法標的として機能する。

【0408】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＳ１ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＣ
Ｓ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＳ１ ｍＲＮＡ
配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１８１であり、ＣＳ１
タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６７００４．３である。

【0409】

ＣＳ１の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＳ１の
細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）
と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％
、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％
、または最大約９９％低下する。

【0410】

ＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＳ１遺伝子内の配列に（完全または部
分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それ
ぞれ配列番号２１および２２として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２３および２
４として示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジ
ャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２５および２６として示される配列を含
む。

【0411】

ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８～５０のいずれか１つに示される核酸
配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少
なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、
少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくと
も９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では
、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８～５０のいずれか１つに示される配列を含む。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４８に示される配列を含む。いくつ
かの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号４９に示される配列を含む。いくつか
の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５０に示される配列を含む。

【0412】

遺伝子改変細胞がＣＳ１の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態のい
くつかでは、遺伝子改変免疫細胞はＣＳ１に対する特異性を有するＣＡＲを含む。ＣＳ１
に対する特異性を有するＣＡＲの非限定的な例としては、限定するものではないが、国際
公開第２０１４／１７９７５９号パンフレット、国際公開第２０１５１２１４５４号パン
フレットおよび国際公開第２０１６／０９０３６９号パンフレットに記載のものが挙げら
れる。

【0413】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ発現を介してＣＳ１の発現がノックダウンされた細胞は、対照細胞（
例えば、ＣＳ１標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、ＣＳ１に対する
特異性を有するＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞によるフラトリサイドを受けにくい
可能性がある。これは、多発性骨髄腫などの疾患の治療のためにＣＳ１に対する特異性を
有するＣＡＲ発現細胞を使用する場合に有用であり、この場合、ＣＡＲ発現細胞の長期存
在、したがって、疾患細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞）の殺滅が望まれる。本明細書で
使用される場合、「フラトリサイド」という用語は、同様の遺伝子型および／または表現
型の細胞による細胞の殺滅を指す。ＣＳ１特異的ＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞に
よるフラトリサイドは、限定するものではないが、ＣＳ１特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現
する免疫細胞とＣＳ１特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞とのインキュベーション、および
生存ｓｈＲＮＡｍｉＲ発現細胞の数の定量を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用
して測定することができる。

【0414】

Ｃ．ＴＧＦＢＲ２
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２
）である。ＴＧＦＢＲ２は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦＢ）に結合す
る膜貫通受容体である。ＴＧＦＢＲ２は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼドメイ
ンを含み、他のＴＧＦＢ受容体とヘテロ二量体化する。

【0415】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＴＧＦＢＲ２ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表
的なＢ２Ｍ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＴＧＦＢＲ
２ ｍＲＮＡ配列の非限定的な例はＮＭ＿００１０２４８４７．２であり、ＴＧＦＢＲ２
タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０２００１８．１である。

【0416】

ＴＧＦＢＲ２の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、Ｔ
ＧＦＢＲ２の細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＴＧＦＢＲ２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲ
を発現しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、
約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、
約９０％、約９５％、または最大約９９％低下する。

【0417】

ＴＧＦＢＲ２を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の配列に（
完全または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含
み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド
配列は、それぞれ配列番号２７および２８として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢ
Ｒ２ ７２１１１０ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッ
センジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号２９および３０として示される配
列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２ ７２１１１１ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施
形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番
号３１および３２として示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２ ７２１１１２ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲ）。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列お
よびガイド配列は、それぞれ配列番号３３および３４として示される配列を含む（例えば
、ＴＧＦＢＲ２ ７２１１１３ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号３５および３６とし
て示される配列を含む（例えば、ＴＧＦＢＲ２ ７２１１１４ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

【0418】

ＴＧＦＢＲ２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１～５５のいずれか１つに示され
る核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５
％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９
４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少
なくとも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形
態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１～５５のいずれか１つに示される配列を含む
。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５１に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５２に示される配列を含む。い
くつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５３に示される配列を含む。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５４に示される配列を含む。いくつ
かの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５５に示される配列を含む。

【0419】

遺伝子改変免疫細胞がＴＧＦＢＲ２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実
施形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞（例えば、ＴＧＦＢＲ２標的化
ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない免疫細胞）と比較して、トランスフォーミング増殖因子Ｂ
１（ＴＧＦＢ１）による免疫抑制を受けにくい。本明細書で使用される場合、「免疫抑制
」という用語は、免疫系の活性化または有効性の低下を指す。ＴＧＦＢ１による免疫抑制
は、限定するものではないが、Ｔ細胞の分化および／またはサイトカイン産生に対するＴ
ＧＦＢ１の効果の測定を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することが
できる。

【0420】

Ｄ．ＣＢＬ－Ｂ
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）である。ＣＢＬ－Ｂは、
ユビキチンのタンパク質への結合を触媒し、したがって分解のためにタンパク質を標的化
するＥ３ユビキチンリガーゼである。

【0421】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＢＬ－Ｂ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的
なＣＢＬ－Ｂ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＢＬ－
Ｂ ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７０６６２．
５であり、ＣＢＬ－Ｂタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿７３３７６２
．２である。

【0422】

ＣＢＬ－Ｂの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＢ
Ｌ－Ｂの細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＢＬ－Ｂ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現
しない細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０
％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０
％、約９５％、または最大約９９％低下する。

【0423】

ＣＢＬ－Ｂを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子内の配列に（完全
または部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得
る。

【0424】

遺伝子改変免疫細胞がＣＢＬ－Ｂの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施
形態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、対照細胞（例えば、ＣＢＬ－Ｂ標的化ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲを発現しない免疫細胞）と比較して、下流シグナル伝達タンパク質の分解に
よるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の抑制を受けにくい。ＣＢＬタンパク質は、ｐ
８５（ＰＩ３Ｋの調節サブユニット）、ホスホリパーゼＣ－ｇ、ならびにＬｃｋ、Ｆｙｎ
およびＺＡＰ７０などのチロシンキナーゼのターンオーバーを調節し、これらはすべてＴ
ＣＲシグナル伝達に関与する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０
２：１２１８－１２２２）。下流シグナル伝達タンパク質の分解によるＴＣＲシグナル伝
達の抑制に対する感受性は、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ
、ウェスタンブロット、免疫細胞化学、および免疫沈降を含む当技術分野で公知の任意の
方法を使用して測定することができる。

【0425】

Ｅ．ＣＤ５２
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、ＣＡｍＰＡＴＨ－１抗原としても知られているＣＤ５２（分化
抗原群５２）である。ＣＤ５２は、成熟リンパ球の表面ならびに単球および樹状細胞上に
存在する糖タンパク質である。可溶性ＣＤ５２分子は、シアル酸結合免疫グロブリン様レ
クチン１０（Ｓｉｇｌｅｃ１０）と相互作用して、Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害する
（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ ６６（７）：５７１－
５７８）。

【0426】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＤ５２ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的な
ＣＤ５２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＣＤ５２ ｍ
ＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１８０３．３であ
り、ＣＤ５２タンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１７９４．２であ
る。

【0427】

ＣＤ５２の発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＣＤ５
２の細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない
細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約
５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約
９５％、または最大約９９％低下する。

【0428】

ＣＤ５２を標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＣＤ５２遺伝子内の配列に（完全また
は部分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、
それぞれ配列番号３７および３８として示される配列を含む（例えば、ＣＤ５２ ７２１
２３ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列
およびガイド配列は、それぞれ配列番号３９および４０として示される配列を含む（例え
ば、ＣＤ５２ ７２１２４ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

【0429】

ＣＤ５２標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６または５７として示される核酸配列
と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なく
とも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９
９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では、ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６または５７として示される配列を含む。いくつかの実施
形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５６に示される配列を含む。いくつかの実施形
態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号５７に示される配列を含む。

【0430】

遺伝子改変免疫細胞がＣＤ５２の発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形
態のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞はＣＤ５２抗体誘導細胞死を受けにくい。

【0431】

Ｆ．デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）である。ＤＣＫは、主に
デオキシシチジンをリン酸化し、デオキシシチジン一リン酸に変換する。

【0432】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＤＣＫ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＤ
ＣＫ ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＤＣＫ ｍＲＮＡ
配列の非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００７８８．３であり、Ｄ
ＣＫタンパク質配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００７７９．１である。

【0433】

ＤＣＫの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＤＣＫの
細胞表面発現は、対照細胞（例えば、ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）
と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％
、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％
、または最大約９９％低下する。

【0434】

ＤＣＫを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＤＣＫ遺伝子内の配列に（完全または部
分的に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それ
ぞれ配列番号７６および７７として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ ７２１３６
ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列および
ガイド配列は、それぞれ配列番号７８および７９として示される配列を含む（例えば、Ｄ
ＣＫ ７２１３７ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセ
ンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号８０および８１として示される配列
を含む（例えば、ＤＣＫ ７２１３８ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号８２および８３
として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ ７２１３９ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実
施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列
番号８４および８５として示される配列を含む（例えば、ＤＣＫ ７２１４０ ｓｈＲＮ
ＡｍｉＲ）。

【0435】

ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６～９０のいずれか１つに示される核酸
配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少
なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、
少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくと
も９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態では
、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６～９０のいずれか１つに示される配列を含む。いく
つかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８６に示される配列を含む。いくつ
かの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８７に示される配列を含む。いくつか
の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８８に示される配列を含む。いくつかの
実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号８９に示される配列を含む。いくつかの実
施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号９０に示される配列を含む。

【0436】

遺伝子改変免疫細胞がＤＣＫの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態
のいくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、細胞増殖に対するプリンヌクレオシド類似体（
例えば、フルダラビン）の影響を受けにくい。実際、ＤＣＫの発現が低下した遺伝子改変
免疫細胞は、細胞集団と、フルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体とのインキュベ
ーションによって濃縮することができる。さらに、ＤＣＫの発現が低下した遺伝子改変免
疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、治療の経過中にフルダラビンなどのプリンヌクレ
オシド類似体を投与した場合、免疫療法中にインビボでより高い持続性を有し得る。

【0437】

Ｇ．グルココルチコイド受容体（ＧＲ）
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子の発現の結果として発現レベルが低下
する内因性タンパク質は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）である。コルチゾールまた
はデキサメタゾンなどのグルココルチコイドの結合は、細胞におけるトランス活性化また
はトランス抑制につながり得る、ヒートショックタンパク質などのタンパク質の放出を誘
導する可能性がある。

【0438】

ｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＧＲ ｍＲＮＡの任意の領域を標的とし得る。代表的なＧＲ
ｍＲＮＡおよびタンパク質の配列は、当技術分野で公知である。ＧＲ ｍＲＮＡ配列の
非限定的な例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＭ１８３２６２．１である。

【0439】

ＧＲの発現がｓｈＲＮＡｍｉＲによって低下する実施形態のいくつかでは、ＧＲの発現
は、対照細胞（例えば、ＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現しない細胞）と比較して、少
なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約
６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または最大約
９９％低下する。

【0440】

ＧＲを標的とするｓｈＲＮＡｍｉＲ分子は、ＧＲ遺伝子内の配列に（完全または部分的
に）相補的な任意のパッセンジャー配列および対応するガイド配列を含み得る。いくつか
の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ
配列番号９１および９２として示される配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１４２ ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド
配列は、それぞれ配列番号９３および９４として示される配列を含む（例えば、ＧＲ ７
２１４３ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー
配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９５および９６として示される配列を含む（
例えば、ＧＲ ７２１４５ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲ
のパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９７および９８として示さ
れる配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１４６ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、
ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号９９およ
び１００として示される配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１４８ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。
他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞ
れ配列番号１０１および１０２として示される配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１４９
ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列および
ガイド配列は、それぞれ配列番号１０３および１０４として示される配列を含む（例えば
、ＧＲ ７２１５０ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッ
センジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０５および１０６として示され
る配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１５１ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。他の実施形態では、ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー配列およびガイド配列は、それぞれ配列番号１０７およ
び１０８として示される配列を含む（例えば、ＧＲ ７２１５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）。

【0441】

ＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９～１１７のいずれか１つに示される核
酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、
少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％
、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なく
とも９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み得る。特定の実施形態で
は、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９～１１７のいずれか１つに記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１０９に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１０に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１１に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１２に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１３に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１４に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１５に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１６に示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡｍｉＲは、配列番号１１７に示される配列を含む。

【0442】

遺伝子改変免疫細胞がＧＲの発現を低下させるｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する実施形態の
いくつかでは、遺伝子改変免疫細胞は、コルチゾールまたはデキサメタゾンなどのグルコ
コルチコイドの影響、例えば増殖の低下を受けにくい。実際、ＧＲの発現が低下した遺伝
子改変免疫細胞は、細胞集団とグルココルチコイドとのインキュベーションによって濃縮
することができる。さらに、ＧＲの発現が低下した遺伝子改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ
Ｔ細胞）は、治療の経過中にグルココルチコイド（例えば、ステロイド）を投与した場
合、免疫療法中にインビボでより高い持続性を有し得る。

【0443】

２．５ 内因性タンパク質の発現を低下させる方法
本発明は、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を細胞に導入し、そ
れによって鋳型核酸がゲノムに挿入され、発現されることによって、免疫細胞において内
因性タンパク質の発現を低下させる方法を提供する。

【0444】

鋳型核酸は、ランダムな組み込みによって免疫細胞のゲノム内に挿入することができる
。あるいは、鋳型核酸は、ヌクレアーゼ媒介標的挿入によって標的遺伝子内に挿入するこ
とができ、操作されたヌクレアーゼは、免疫細胞のゲノム内の認識配列に対して特異性を
有し、認識配列に切断部位を生成し、免疫細胞のゲノム内への鋳型核酸の挿入を切断部位
において可能にする。

【0445】

操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパク
トＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬを含む任意の
操作されたヌクレアーゼを、鋳型核酸の標的挿入に使用することができる。

【0446】

例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム中の所定の部位を認識お
よび切断するように操作することができる。ＺＦＮは、エンドヌクレアーゼまたはエキソ
ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ制限酵素などのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）由来の
ヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタ
ンパク質である。ジンクフィンガードメインは、天然配列であり得るか、長さが約１８塩
基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生するように、合理的または実験的手
段によって再設計されてもよい。この操作されたタンパク質ドメインをヌクレアーゼドメ
インに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的化することが可能
である。ＺＦＮは、広範囲の真核生物における遺伝子の付加、除去および置換を標的とす
るために広く使用されている（Ｓ．Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ ３３，５９７８（２００５）に概説されている）。

【0447】

同様に、ＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を作製して、ゲノムＤＮＡ
の特定の部位を切断することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレア
ーゼまたはエキソヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ制限酵素などのＩＩ型制限エンドヌク
レアーゼ）に融合された操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍａｋ，ｅｔ
ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２３：９３－９に
概説されている）。しかしながら、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが単一の
ＤＮＡ塩基対を特異的に認識するＴＡＬ－エフェクタードメインのタンデムアレイを含む
。

【0448】

コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を回避する代替的なエンドヌクレアーゼア
ーキテクチャである（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍ
ｕｎ．４：１７６２）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ－ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレ
アーゼまたは米国特許出願公開第２０１３０１１７８６９号明細書の表２に列挙されてい
るエンドヌクレアーゼのいずれかに由来するヌクレアーゼドメインに融合された、操作さ
れた部位特異的ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。コンパクトＴＡＬＥＮ
は、ＤＮＡプロセシング活性のために二量体化を必要としないので、コンパクトＴＡＬＥ
Ｎは単量体として機能的である。

【0449】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく操作されたエンドヌクレアーゼも当技術分野で
公知である（Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１－
２３０８；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：９５７
－６３）。ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの構成要素：（１）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
；（２）ヌクレアーゼをゲノム中の目的の位置に指向させる約２０ヌクレオチドの標的化
配列を含む短鎖「ガイドＲＮＡ」、を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ｔｒａｃｒＲ
ＮＡを含み得る。各々が異なる標的化配列を有する複数のガイドＲＮＡを同じ細胞内で発
現させることにより、ＤＮＡ切断をゲノム内の複数の部位に同時に標的化することが可能
である。

【0450】

１２塩基対を超える認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合する操作されたメガヌクレア
ーゼを、本開示の方法に使用することができる。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに由
来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮ
Ａ結合親和性、または二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩと比較して改変された、
Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのこのような改変された変異
体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０
４７８５９号パンフレット、当該文献は参照によりその全体が組み込まれる）。本明細書
で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌ
クレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリ
ペプチドに連結されている「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。

【0451】

ｍｅｇａＴＡＬと呼ばれるヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ
）ＤＮＡ結合ドメインおよび操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを含む
単鎖エンドヌクレアーゼである。

【0452】

特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼの認識配列は標的遺伝子内にある。標的
遺伝子は、配列が変更されること（例えば、ヌクレオチドの付加もしくは削除、ヌクレオ
チドの置換、または異種もしくは外因性配列の挿入）が望ましい任意の遺伝子であり得る
。例えば、遺伝子不活性化による標的遺伝子のノックアウトが望ましい場合がある。いく
つかの実施形態では、標的遺伝子はＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＣＲベータ遺伝子であ
る。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＴＣＲアルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子で
あり得る。いくつかの具体的な実施形態では、標的遺伝子はＴＲＡＣ遺伝子であり、認識
配列は配列番号５８に示されるＴＲＣ １－２認識配列である。

【0453】

これらの実施形態のいくつかでは、鋳型核酸の標的遺伝子への挿入は、標的遺伝子によ
ってコードされる完全長内因性タンパク質の発現の破壊をもたらす。したがって、標的遺
伝子がＴＣＲアルファ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、またはＴＣＲベータ遺伝子である実施形
態のいくつかでは、内因性ＴＣＲが、これらの遺伝子によってコードされる内因性タンパ
ク質の非存在下で細胞表面に適切に構築されないので、遺伝子改変免疫細胞は、アルファ
／ベータＴＣＲなどの内因性ＴＣＲの検出可能な細胞表面発現を有さない。

【0454】

遺伝子改変免疫細胞が、アルファ／ベータＴＣＲの成分をコードする遺伝子の不活性化
に起因して、内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲ）の検出可能な細胞表面発
現を有さない特定の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲお
よび／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をさらに発現する。ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲお
よび／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質は、鋳型核酸内に含まれる配列によってコードさ
れ得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨ
ＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列とは異なるプロモー
タに作動可能に連結されている。代替的な実施形態では、ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列およ
び／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配列と同じ
プロモータまたは異なるプロモータに作動可能に連結されている。ＣＡＲ／ＴＣＲコード
配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、ｓｈＲＮＡｍｉＲコード配
列の５’または３’であり得、コード配列は、同じ向きまたは異なる向き、例えば５’か
ら３’または３’から５’であり得る。さらに、コード配列は、同じ核酸分子からの２つ
以上の遺伝子（すなわち、シストロン）の翻訳を可能にするために、当技術分野で公知の
エレメント、限定するものではないが、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａ
エレメント（例えば、Ｐ２Ａ／フューリン）、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエレメン
トなどによって分離され得る。

【0455】

内因性ＴＣＲの発現を破壊するためのヌクレアーゼの使用、例えば、ジンクフィンガー
ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
メガＴＡＬ、およびＣＲＩＳＰＲシステムの使用が開示されている（例えば、Ｏｓｂｏｒ
ｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（３）：５
７０－５８１；Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１
３－１１７；米国特許第８，９５６，８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４／０
３０１９９０号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号明細書）。ヒト
ＴＲＡＣ遺伝子のＤＮＡ標的を切断するための操作されたメガヌクレアーゼの具体的な使
用も以前に開示されている。例えば、国際公開第２０１４／１９１５２７号パンフレット
があり、これはＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１内の認識配列を標的とするよ
うに操作されたＩ－ＯｎｕＩメガヌクレアーゼの変異体を開示した。

【0456】

さらに、国際公開第２０１７／０６２４３９号パンフレットおよび国際公開第２０１７
／０６２４５１号パンフレットにおいて、出願人らは、ＴＣＲアルファ定常領域（ＴＲＡ
Ｃ）遺伝子のエクソン１中の認識配列に対して特異性を有する操作されたメガヌクレアー
ゼを開示した。これらには、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中のＴＲＣ １－２認識配列（
配列番号５８）に特異性を有する「ＴＲＣ １－２メガヌクレアーゼ」が含まれた。公報
’４３９および’４５１はまた、ＣＡＲコード配列または外因性ＴＣＲコード配列をＴＣ
Ｒ １－２メガヌクレアーゼ切断部位へ標的挿入するための方法を開示した。

【0457】

特定の実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、単鎖メガヌ
クレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結されたＮ末
端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列の
半分（すなわち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニッ
トの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ
切断が一対の４塩基対の３’一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって
オフセットされる。

【0458】

操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは操作されたヌクレ
アーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。このような核酸は、ＤＮＡ（例えば
、環状または線状化プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮ
Ａ）であり得る。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態
の場合、それは、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連
結されなければならない。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイル
ス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）またはＳＶ４０初期
プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２
９０（５８０４）：３０４－１０）などの構成的プロモータ、ならびにテトラサイクリン
誘導性プロモータなどの誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９
９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）が含まれる。操作
されたヌクレアーゼをコードする核酸はまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る
。合成プロモータとしては、限定するものではないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２
００２／０１２５１４号パンフレット）を挙げることができる。

【0459】

ある実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列は、組換えＤＮＡ構
築物または発現カセット上に送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと
本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含む発現カセット（
すなわち、「カセット」）を含むことができる。

【0460】

いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、これが、
操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに統合される可能性を低減す
るので、細胞に送達される。

【0461】

操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で
公知の方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、改
変された５’キャップを含む。このような改変５’キャップは当技術分野で公知であり、
限定するものではないが、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）（米国特許第７０
７４５９６号）、７－メチル－グアノシン、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）類似体、例え
ばＣａｐ １類似体（Ｔｒｉｌｉｎｋ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を挙げることができ
、または例えばワクシニアキャップ酵素などを使用して酵素的にキャップされる。いくつ
かの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、コードされた操作
されたヌクレアーゼの発現および／またはｍＲＮＡ自体の安定性を増強するために、さま
ざまな５’および３’非翻訳配列エレメントを含有し得る。このようなエレメントには、
例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメントなどの翻訳後調節エレメント
が含まれ得る。

【0462】

ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－
メチルウリジンまたは２－チオウリジンなどのヌクレオシド類似体または天然に存在する
ヌクレオシドを含有し得る。さらなるヌクレオシド類似体としては、例えば、米国特許第
８，２７８，０３６号明細書に記載のものが挙げられる。

【0463】

別の特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ
鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌクレアーゼ
をコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’ＡＡＶ逆位末端反
復配列（ＩＴＲ）をさらに含むことができる。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、操作
されたヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３
’相同アームをさらに含むことができる。

【0464】

別の特定の実施形態では、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡ鋳型を使
用して細胞に導入することができる。いくつかの例では、ヌクレアーゼをコードするプラ
スミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１
つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。

【0465】

精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞内に送達してゲノムＤＮＡを切断することが
でき、これにより、本明細書で以下にさらに詳述するものを含む、当技術分野で公知のさ
まざまな異なる機序によって、切断部位における目的の配列との相同組換えまたは非相同
末端結合が可能になる。

【0466】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために細胞透過性ペプチドまたは標的化リ
ガンドに結合される。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギ
ニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈ
ｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅ
ｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（
Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１
：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６）、およびＨＳＶ－１ ＶＰ－２２
（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．
６２：１８３９－４９）が挙げられる。代替的な実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質
、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞上に発現される特異的
細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合または非共有結合して、ヌクレアーゼタンパク
質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内在化されるようにする。
あるいは、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような細胞表面受容体の
天然リガンド（または天然リガンドの一部）に共有結合または非共有結合することができ
る。（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（
４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃ
ｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎ ｅ
ｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。

【0467】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４
）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）を使用して、ナノ粒子に共有結合もしくは
好ましくは非共有結合されるか、またはこのようなナノ粒子内に封入される。ナノ粒子は
、長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システ
ムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、または生物学的高分子で構成
されたコアを使用して設計することができ、複数コピーのヌクレアーゼタンパク質、ｍＲ
ＮＡ、またはＤＮＡをナノ粒子コアに付着させる、または封入することができる。これは
、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって
、各ヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大に
する。このようなナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えば、キトサン、カチオン
性ポリマーまたはカチオン性脂質）でさらに改変されて、コア－シェルナノ粒子を形成す
ることができ、その表面に細胞送達およびペイロードの取り込みを増強するための追加の
機能性が付与される（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．
３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に指向させるた
め、および／または細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子にさらに有利に結
合され得る。このような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体および
細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）が挙げられる。

【0468】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質またはヌクレアーゼをコードするＤ
ＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、またはカチオン性脂質を使用して複合
体化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１
５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（
２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポ
ソームおよびリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的細胞の細胞膜と
の融合および／または細胞膜の破壊を通じて細胞取り込みおよび送達効率を促進すること
ができる。

【0469】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内に封入されるか、またはカチ
オン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉ
ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリ
マー担体は、ポリマー侵食および薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供
するように設計することができ、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送
達まで治療用ペイロードの保護を提供することができる。

【0470】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、または組換えヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセル内に自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔ
ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）
。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減
することができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセ
ルシェルを含み得る。

【0471】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコード
するＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与および／または送達のためにエマルジョンま
たはナノエマルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化される。「
エマルジョン」という用語は、限定するものではないが、水不混和性相が水相と混合され
た場合に、無極性残基（例えば、長鎖炭化水素）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向け
る疎水力の結果として形成することができる脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型
、水中油中水型、または油中水中油型の分散液または液滴を指す。これらの他の脂質構造
としては、限定するものではないが、単層、少層、および多層の脂質小胞、ミセル、およ
びラメラ相が挙げられる。エマルジョンは、水相および親油性相（典型的には油および有
機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１つまたは複数の界面活性剤
を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は周知であり、例えば、米国特許出願公開第２
００２／００４５６６７号および同第２００４／００４３０４１号明細書、ならびに米国
特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号お
よび同第６，５５９，１８９号明細書に記載されており、これらの各々は、その全体が参
照により本明細書に組み込まれる。

【0472】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードする
ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、およびポリ
マーデンドリマーに共有結合または非共有結合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ
．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマー
生成は、ペイロードの容量およびサイズを制御することができ、高い薬物ペイロード容量
を提供することができる。さらに、複数の表面基の表示を利用して、安定性を改善し、非
特異的相互作用を低減させ、細胞特異的標的化および薬物放出を増強することができる。

【0473】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベクター（す
なわち、組換えウイルス）を使用して送達される。このようなベクターは当技術分野で公
知であり、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター
、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ
ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）。本発明で有用な組
換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入および細胞ゲノムへのヌクレアーゼ
遺伝子の挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組
換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する。ＡＡＶベクターはま
た、自己相補的であり得、したがって、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としな
い（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５
４）。本明細書に開示の鋳型核酸を送達するものを含む組換えＡＡＶベクターによって送
達されるポリヌクレオチドは、左（５’）および右（３’）逆位末端反復配列を含み得る
。

【0474】

ヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）で、および／またはウイルス
ベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連
結されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター（例えば
レンチウイルスベクターのＬＴＲ）由来の内因性プロモータ、または周知のサイトメガロ
ウイルスプロモータもしくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどのウイルスプロモータ
であり得る。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞
）において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結される。

【0475】

ＣＡＲ／ＴＣＲコード配列および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質コード配列は、さ
らなる制御配列をさらに含むことができる。例えば、配列は、相同組換えエンハンサー配
列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、選択マーカー配列（例えば、抗
生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。操作されたヌクレアーゼをコードする配
列はまた、少なくとも１つの核局在化シグナルを含み得る。核局在化シグナルの例は、当
技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２００７，２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。

【0476】

本発明はさらに、標的遺伝子への鋳型核酸の導入を提供する。いくつかの実施形態では
、鋳型核酸は、インサートの要素に隣接する５’相同アームおよび３’相同アームを含む
。このような相同アームは、切断部位が生成されるヌクレアーゼ認識配列の５’上流およ
び３’下流の対応する配列と配列相同性を有する。一般に、相同アームは、少なくとも５
０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対以上の長さを有する
ことができ、ゲノム中のそれらの対応する配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくと
も９５％、またはそれを超える配列相同性を有することができる。

【0477】

本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードするもの、ＣＡＲもし
くは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコード
する核酸）は、前述の手段のいずれかによって細胞に導入することができる。特定の実施
形態では、鋳型核酸は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）、例えば組換え
レンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、または好ましくは組換
えＡＡＶベクター（すなわち、組換えＡＡＶ）によって導入される。外因性核酸（例えば
、鋳型核酸）を導入するのに有用な組換えＡＡＶベクターは、ウイルスの細胞への形質導
入および外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することが
できる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清
型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、自己相補的であり得、したがって、宿主細胞
において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としない。

【0478】

別の特定の実施形態では、本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードするもの、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－
Ｅ融合タンパク質をコードする核酸）は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入するこ
とができる。一本鎖ＤＮＡは、目的の外因性配列を含むことができ、好ましい実施形態で
は、相同組換えによってメガヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために
５’および３’相同アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同アームの５’
上流に５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、および３’相同アームの３’下流に３’
ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含むことができる。

【0479】

別の特定の実施形態では、本明細書に開示の鋳型核酸（例えば、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコ
ードするもの、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをコードする核酸、および／またはＨＬＡ－
Ｅ融合タンパク質をコードする核酸）は、線状化ＤＮＡ鋳型を用いて細胞に導入すること
ができる。いくつかの例では、プラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞にトラ
ンスフェクトされる前に線状化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化さ
れ得る。

【0480】

本発明によって改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、目的のヌクレアーゼおよび
／または外因性配列の導入前に活性化を必要とし得る。例えば、Ｔ細胞は、可溶性である
か、または支持体（すなわち、ビーズ）にコンジュゲートされている抗ＣＤ３および抗Ｃ
Ｄ２８抗体と、細胞を活性化するのに十分な期間接触させることができる。

【0481】

本発明の遺伝子改変免疫細胞は、１つまたは複数の誘導性自殺遺伝子を発現するように
さらに改変することができ、その誘導は細胞死を引き起こし、インビトロまたはインビボ
での細胞の選択的破壊を可能にする。いくつかの例では、自殺遺伝子は、細胞傷害性ポリ
ペプチド、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する能力を有するポリペプチド、
および／または細胞内の細胞傷害性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードするこ
とができる。すなわち、自殺遺伝子は、単独で、または他の化合物の存在下で細胞死を引
き起こす産物をコードする核酸である。このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペス
ウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘帯状疱疹ウイ
ルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子および５－フルオロシトシンを高毒性化合物
５－フルオロウラシルに変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼである。
自殺遺伝子には、非限定的な例として、カスパーゼ－９、カスパーゼ－８またはシトシン
デアミナーゼをコードする遺伝子も含まれる。いくつかの例では、カスパーゼ－９は、特
定の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子はまた、治
療用および／または細胞傷害性モノクローナル抗体に対して細胞を敏感にする、細胞の表
面で発現されるポリペプチドをコードし得る。さらなる例では、自殺遺伝子は、抗ＣＤ２
０ ｍＡｂのリツキシマブによって認識される抗原モチーフおよび自殺遺伝子を発現する
細胞の選択を可能にするエピトープを含む組換え抗原性ポリペプチドをコードすることが
できる。例えば、２つのリツキシマブ結合エピトープおよびＱＢＥｎｄ１０結合エピトー
プを含む、国際公開第２０１３１５３３９１号パンフレットに記載のＲＱＲ８ポリペプチ
ドを参照されたい。このような遺伝子の場合、リツキシマブを対象に投与して、必要に応
じて細胞枯渇を誘導することができる。さらなる例では、自殺遺伝子は、切断型ＥＧＦＲ
ポリペプチドと組み合わせて発現されるＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含み得る。

【0482】

天然に存在するヌクレアーゼおよびマイクロＲＮＡ配列（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよびｐ
ｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列を含む）の変異体を、本開示の組成物および方法に使用することが
できる。本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味すること
を意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つまたは複数の内部部
位での１つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または天然ポリペプチド
の１つまたは複数の部位での１つまたは複数のアミノ酸の置換による、「天然」ポリペプ
チドに由来するポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合
、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実
施形態に包含される変異体ポリペプチドは、生物学的に活性である。すなわち、それらは
天然タンパク質の所望の生物学的活性を保持し続ける。このような変異体は、例えば、ヒ
トの操作により生じ得る。天然ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他
の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定さ
れる場合、天然ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％
、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％
、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％
、または約９９％の配列同一性を有すると思われる。ポリペプチドの生物学的に活性な変
異体は、そのポリペプチドまたはサブユニットと、わずか約１～４０個のアミノ酸残基、
わずか約１～２０個、わずか約１～１０個、わずか約５個、わずか４個、３個、２個、ま
たはさらには１個のアミノ酸残基だけ異なり得る。

【0483】

ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含むさまざまな方法で変更
され得る。このような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば
、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異
誘発およびポリヌクレオチド変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋ
ｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８
－４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ
ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目
的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、
Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎ
ｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、当該文献は参照
により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交
換するなどの保存的置換が最適であり得る。

【0484】

ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の
部位における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および／または付加を含む。当業者は
、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築さ
れることを認識されよう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重の
ために、実施形態のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。
変異体ポリヌクレオチドには、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生
成されるが、依然としてポリペプチドまたはＲＮＡをコードするものなどの合成由来ポリ
ヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明
細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによっ
て決定される場合、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、約４５％、約５
０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９
０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９
８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有すると思われる。特定のポリヌクレ
オチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の変異体は、変異体ポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドとの間の配列同一性パーセントの比較によって評価することもできる。

【0485】

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特徴
に根本的な変化をもたらすことは予期されない。しかしながら、置換、欠失または挿入の
正確な効果を事前に予測することが困難である場合、当業者は、ポリペプチドをその生物
学的活性についてスクリーニングすることによって、その効果が評価されることを理解さ
れよう。

【0486】

２．６ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子改変免疫細胞、または本発明の遺
伝子改変免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。こ
のような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃ
ｙ（２１ｓｔ ｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造では、細
胞を典型的には薬学的に許容される担体と混合し、得られた組成物を対象に投与する。担
体は、当然のことながら、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容され
なければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医
薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含むことが
できる。さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、遺伝子改変Ｔ細胞のインビボ細
胞増殖および生着を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５お
よび／またはＩＬ－２１）などの生物学的分子をさらに含むことができる。本発明の遺伝
子改変免疫細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤または生物学的分子と同じ組成物中で投
与することができ、あるいは別個の組成物で同時投与することができる。

【0487】

本開示はまた、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞また
はその集団を提供する。本開示はさらに、それを必要とする対象において疾患を治療する
ための医薬の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の使用
を提供する。このような一態様では、医薬は、それを必要とする対象におけるがん免疫療
法に有用である。

【0488】

本発明の医薬組成物は、養子免疫療法、特にＴ細胞養子免疫療法によって標的化され得
る任意の疾患状態を治療するのに有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の医薬組
成物および医薬は、がんの治療に有用である。本開示の医薬組成物および医薬で治療する
ことができるがんの非限定的な例には、限定するものではないが、ＣＡＲまたは外因性Ｔ
ＣＲによって標的とされ得る本明細書に記載のさまざまな種類のがんが含まれる。

【0489】

がんが本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団で治療される実施形態のいくつかで
は、遺伝子改変免疫細胞またはその集団を投与された対象に、放射線、外科手術、または
化学療法剤などの追加の治療法をさらに投与する。

【0490】

本発明はさらに、そのゲノム中にｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする核酸配列を含む本明細
書に記載の複数の遺伝子改変免疫細胞を含む遺伝子改変免疫細胞の集団であって、ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲをコードする外因性核酸分子をＴＣＲアルファ遺伝子またはＴＲＡＣ遺伝子な
どの標的遺伝子に挿入し、したがって細胞が内因性ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴ
ＣＲ）の検出可能な細胞表面発現を有さないようにすることができる遺伝子改変免疫細胞
の集団を提供する。したがって、本発明のさまざまな実施形態では、免疫細胞の集団であ
って、集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なく
とも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５
％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少
なくとも９９％、または最大１００％が、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免
疫細胞の集団が提供される。本発明のいくつかの実施形態では、免疫細胞の集団であって
、集団中の細胞の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４
０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８
０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、また
は最大１００％が、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供さ
れる。本発明のさらなる実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の少なく
とも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０
％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少な
くとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７
５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少
なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大
１００％が、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲをさらに発現し、および／またはＨＬＡ－Ｅ融
合タンパク質をさらに発現する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集
団が提供される。本発明のある実施形態では、免疫細胞の集団であって、集団中の細胞の
約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、
約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、
約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または最大１００％が
、ＣＡＲもしくは外因性ＴＣＲ、および／またはＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をさらに発現
する本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞である免疫細胞の集団が提供される。

【0491】

２．７ 遺伝子改変免疫細胞の投与方法
本明細書に開示の別の態様は、有効量の本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の
、それを必要とする対象への投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組
成物は、それを必要とする対象に投与される。例えば、有効量の細胞集団を、疾患を有す
る対象に投与することができる。特定の実施形態では、疾患はがんであり得、本発明の遺
伝子改変免疫細胞の投与は免疫療法を表す。投与された細胞は、レシピエントにおける標
的細胞の増殖を低下させ、数を減少させ、または殺滅することができる。抗体療法とは異
なり、本開示の遺伝子改変免疫細胞は、インビボで複製および増殖することができ、疾患
の持続的制御につながり得る長期持続性をもたらす。

【0492】

可能な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮
内、皮下（ＳＣ）、または注入）投与が挙げられる。さらに、投与は、連続注入によって
、または単回もしくは複数回のボーラス投与によるものであり得る。特定の実施形態では
、薬剤は、約１２時間未満、６時間、４時間、３時間、２時間、または１時間の期間にわ
たって注入される。さらに他の実施形態では、注入は最初はゆっくり行われ、次いで経時
的に増加される。

【0493】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団は、がんを治療
する目的で腫瘍抗原を標的とする。このようながんとしては、限定するものではないが、
ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲによって標的とされ得る本明細書に記載のさまざまな種類のが
んを挙げることができる。

【0494】

「有効量」または「治療量」が示される場合、投与される正確な量は、患者（対象）の
年齢、体重、腫瘍サイズ（存在する場合）、感染または転移の程度、および状態の個人差
を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺
伝子改変免疫細胞またはその集団を含む医薬組成物は、それらの範囲内のすべての整数値
を含めて、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重の投与量で投与される。さらなる実施形態では
、投与量は、それらの範囲内のすべての整数値を含めて、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重
である。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与される。
細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することによって投与する
ことができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ
Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投
与量および治療計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整する
ことによって、医学の当業者が容易に決定することができる。

【0495】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変免疫細胞またはその集団の投与は、標的
疾患または状態の少なくとも１つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞
またはその集団の投与は、がんの少なくとも１つの症状を軽減することができる。がんの
症状は当技術分野で周知であり、公知の技術によって決定することができる。

【実施例0496】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈される
べきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質お
よび手順に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。こ
のような等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0497】

実施例１
ｓｈＲＮＡカセットを抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のゲノムに挿入した場合の、ベータ
－２ミクログロブリンの一過性ノックダウン

【0498】

これらの実験では、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座にＣＡＲ遺伝子と
同時送達されるｓｈＲＮＡの単一コピーを使用して、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２
Ｍ）を効率的にノックダウンできるかどうかを評価した。アフェレーシスサンプルを健常
ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、Ｉｍｍｕ
ｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）におい
て活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺
伝子中のＴＲＣ １－２認識配列（配列番号５８）を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ
．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ １μｇをエレクトロポレーションし、
構築物７０５６をパッケージングしたＡＡＶを２５，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯ
Ｉで用いて形質導入した。ＡＡＶ ７０５６は、ＴＲＡＣオープンリーディングフレーム
と反対向きのＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ド
メイン、Ｎｏｖｅｌ ６（Ｎ６）共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ細胞内シグナル
伝達ドメインから構成される）をコードする。転写はＪｅＴプロモータによって開始され
、双方向ポリＡ配列によって終結される。ＣＡＲ発現を制御するＪｅＴプロモータの上流
には、やはりＴＲＡＣ ＯＲＦに対して反対の転写配向でｓｈＲＮＡ発現カセットが位置
している。ｓｈＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモータによって開始され、中央ポリピリミジン
トラクトによって終結される。いくつかのｓｈＲＮＡ配列を、Ｂ２Ｍ発現のノックダウン
効力について評価した。ＡＡＶ ７０５６は、ｓｈＲＮＡ４７２と略されるｓｈＲＮＡ配
列ＴＲＣＮ００００３８１４７２を含み、その配列は配列番号６として示される。

【0499】

細胞培養物を、５％ ＦＢＳおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２を補充したＸ－ＶＩＶＯ
（商標）１５培地中でさらに最大ｘ日間維持した。ヌクレオフェクション後４、７および
／または１０日目に、培養物をサンプリングし、ＣＤ３（抗ＣＤ３－ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇ
ｅｎｄ）、ＣＡＲ（抗ＦＭＣ６３抗ＣＡＲ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲ
ートされたクローンＶＭ１６）、Ｂ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ－ＡＰＣまたはＰＥ、クローンＴＵ－
９９ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＨＬＡ－Ａ、ＢおよびＣ（クローンＷ６
／３２、ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の表面発現について分析した。フローサイト
メトリデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸで取得した
。細胞表面ＣＤ３の検出は、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の指標である。したがって
、ＣＤ３＋またはＣＤ３－である遺伝子改変細胞は、それぞれＴＣＲ＋およびＴＣＲ－で
あることが理解されよう。

【0500】

Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－ＡＢＣレベルを、構築物７０５６を発現するサンプルおよび対照
集団において測定した。図１Ａは、対照培養物由来のｓｈＲＮＡを発現しないＴＲＡＣ編
集細胞と比較した、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞におけるＢ２Ｍの表面レベルを示す。図１Ｂ
は、同じ培養物中のＣＤ３－／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団のＢ２Ｍレベルを示す
。図１Ｃおよび１Ｄは、ＨＬＡ－ＡＢＣ表面レベルの表示において同じそれぞれの比較を
行う。ＡＡＶ－７０５６により形質導入された細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋画分は、対照集
団と比較して９０％超低下したＢ２ＭおよびＨＬＡ－ＡＢＣのレベルを示した。

【0501】

導入遺伝子送達後の最も早い時点で、ＣＡＲ＋細胞は、マーカーおよび比較によって、
ＨＬＡ－ＡＢＣおよびＢ２Ｍの表面レベルの９０～９５％の低下を示す。培養をより長期
間行うと、ＣＡＲ＋事象の頻度が低下し、Ｂ２Ｍ表面発現がほぼ正常レベルまで回復する
（図２Ａ～２Ｆ）。

【0502】

このノックダウン効力の喪失の根本原因を明らかにするために、生存ＣＡＲ＋細胞のゲ
ノム中の遺伝子導入インサートを形質導入の１０日後（ｄ１０）に配列決定した。７０５
６配列のＴＲＡＣ相同アームにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して、配列
決定反応をプライミングした。Ｂ２Ｍ転写産物を標的とすることを意図した自己相補的ヘ
アピン構造の配列は、ｄ１０ゲノムでは回収されなかった。しかし、この配列は、ＡＡＶ
調製物またはパッケージングプラスミドを鋳型として使用した反応から回収した。Ｕ６プ
ロモータおよびｃＰＰＴを含む隣接配列が乱されなかったので、配列喪失はヘアピン配列
に限定されるように見えた。

【0503】

これらの研究は、事前スクリーニングされたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡが、（Ｔ細胞受容
体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を介して）構築物が送達された細胞の表面上の
Ｂ２Ｍ発現レベルをノックダウンできることを示している。この効果はＣＡＲ＋集団（す
なわち、ＴＲＡＣ遺伝子座への標的化された組み込みが起こった細胞）に特異的である。
この実験は、ＴＲＡＣ遺伝子座および同じＡＡＶ鋳型上のＣＡＲ遺伝子に同時送達された
ｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーを使用して、Ｂ２Ｍを効率的にノックダウンできることを
実証する。結果は初期の時点で有望であるように見えたが、ノックダウン効果は一過性で
あり、ＣＡＲ＋集団における毒性または成長停止に関連すると判定された。ノックダウン
効果が弱まるにつれて、生存Ｔ細胞のゲノムからのｓｈＲＮＡ配列の喪失が観察された。
これは、ｓｈＲＮＡ４７２がゲノムから切除され、統合された単一コピーにより媒介され
るＢ２Ｍまたは潜在的に他の内因性タンパク質のノックダウンには適していないことを示
唆した。

【0504】

実施例２
ベータ－２ミクログロブリンｓｈＲＮＡｍｉＲの設計、構築および特性評価

【0505】

ｓｈＲＮＡを使用したＢ２Ｍ発現の標的化は、おそらくゲノムからのヘアピン配列の喪
失のために、ＣＡＲ Ｔ産物における一過性ノックダウン効果および毒性によって妨げら
れた。短鎖ヘアピンを含むガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列を、より大きく、より
高度に構造化されたマイクロＲＮＡ足場（ｍｉＲ）に適合させた。ｓｈＲＮＡおよびｍｉ
ＲＮＡの技術のこの組み合わせは、本明細書ではマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡまたはｓ
ｈＲＮＡｍｉＲと呼ばれる。

【0506】

ｓｈＲＮＡｍｉＲを作製するために選択されるｍｉＲ足場はｍｉＲ－Ｅと呼ばれ、ｍｉ
Ｒ－３０と呼ばれるヒトゲノム中の天然に存在するｍｉＲの操作された誘導体である（国
際公開第２０１４／１１７０５０号パンフレットを参照されたく、当該文献は参照により
その全体が本明細書に組み込まれる）。マイクロＲＮＡは核内の細胞のＲＮＡｉ経路に入
り、そこでＤｒｏｓｈａによってプロセシングされ、エキスポーチン複合体によってサイ
トゾルに輸送され、その後ＤｉｃｅｒおよびＡｒｇｏｎａｕｔと相互作用して、ＲＮＡ誘
導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。

【0507】

この研究において使用されるｍｉＲ－Ｅ足場の配列は、配列番号１（５’ｍｉＲ－Ｅ足
場ドメイン）、配列番号２（５’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメイン）、配列番号３（ｍｉｒ
－３０ａループドメイン）、配列番号４（３’ｍｉＲ－Ｅ基底ステムドメイン）および配
列番号５（３’ｍｉＲ－Ｅ足場ドメイン）として示される。それぞれ配列番号７および８
として示されるＢ２Ｍ標的化パッセンジャー鎖配列およびガイド鎖配列を、終止コドンの
下流であるがポリＡ転写ターミネータの上流である抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（実施例１に記載
されるものと同じ）ベクター内にクローニングした。このベクター（７２８２）をＡＡＶ
６キャプシドにパッケージングし、Ｂ２Ｍノックダウンの規模および持続期間を決定する
ための研究に使用した。

【0508】

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キッ
トＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使
用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（
抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用
して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－
ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収
集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ １－２認識配列を認識
して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ １μｇ
をエレクトロポレーションし、構築物 ７２８２をパッケージングしたＡＡＶを２５，０
００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで用いて形質導入した。ＲＮＡｉの特徴を有さないＣ
ＡＲ Ｔ細胞（７２０６）またはｓｈＲＮＡ－４７２を有するＣＡＲ Ｔ細胞（７０５６
）を対照として含めた。

【0509】

編集およびＡＡＶ形質導入の３、７、および１１日後に、これらの培養物由来の細胞を
、ＴＣＲノックアウト（抗ＣＤ３－ＢＢ５１５クローンＳＫ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓを使用）について、ＣＡＲ導入遺伝子ノックイン（抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌ
ｕｏｒ６４７、クローンＶＭ１６、自社生産を使用）について、および抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ（
クローンＴＵ－９９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢ２Ｍノックダウンに
ついて分析した。Ｂ２Ｍレベル（ＰＥチャネル中の平均蛍光強度によって測定）を、同じ
培養物由来の細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団とＣＤ３＋／ＣＡＲ－集団との間で比較した
。

【0510】

編集／形質導入の３日後、ＡＡＶ ７２８２を使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞は、
ＣＡＲ＋の頻度に関してＡＡＶ ７２０６に比肩したが、ＡＡＶ ７０５６を使用して産
生された培養物は、ＣＡＲ＋細胞の頻度がより低かった。ＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の頻度
は、ＡＡＶ ７２０６またはＡＡＶ ７２８２を用いて産生された培養物では増加または
同じままであったが、ＡＡＶ ７０５６により形質導入された培養物では全細胞の５％未
満に減少した。

【0511】

ｓｈＲＮＡ（ＡＡＶ ７０５６）を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、３日目にＢ２Ｍの表面
レベルを急速に９１．９％下方制御した。Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲは、この時点でＢ２
Ｍ表面レベルを７７．４％下方制御した（図３）。培養物をさらに数日間保持すると、ｓ
ｈＲＮＡによって媒介されるノックダウンの規模は、７および１１日目にそれぞれ８４．
３％および６５．１％に低下した（図４および５）。さらに、これらの時点で、正常レベ
ルまたはほぼ正常レベルのＢ２Ｍを再発現し始めたＣＡＲ＋事象がＡＡＶ ７０５６形質
導入培養物に存在した。比較すると、ｓｈＲＮＡｍｉＲによって媒介されるノックダウン
の大きさは、驚くべきことに、７日目および１１日目に、両方の時点で約８５％に増加し
、Ｂ２Ｍ発現の上方制御は観察されなかった。

【0512】

したがって、Ｂ２Ｍ発現に干渉するためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用は、実施例１に記載
の以前に評価されたｓｈＲＮＡと比較した場合、より遅いノックダウン速度論およびわず
かに低いノックダウン規模を有利にもたらしたが、より安定な表現型および毒性の大幅な
低下をもたらした。この研究で観察された優れた結果は、ＣＡＲ Ｔ細胞における内因性
タンパク質発現を下方制御するためのｓｈＲＮＡｍｉＲの使用のための初期概念実証を提
供し、これは特定の状況における遺伝子ノックアウトよりも有利であり得る。

【0513】

実施例３
さらなるＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の設計および特性評価

【0514】

６つのさらなるＢ２Ｍガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ
骨格にクローニングし、実施例２に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物のＣＡＲの終止コド
ンとポリＡ転写ターミネータとの間に挿入した。Ｂ２Ｍ ７２８５ ｓｈＲＮＡｍｉＲの
パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号９および１０として示される。Ｂ
２Ｍ ７２８６ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列
番号１１および１２として示される。Ｂ２Ｍ ７２８７ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジ
ャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１３および１４として示される。Ｂ２Ｍ ７
２８８ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１５
および１６として示される。Ｂ２Ｍ ７２８９ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖お
よびガイド鎖は、それぞれ配列番号１７および１８として示される。Ｂ２Ｍ ７２９０
ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号１９および２
０として示される。これらのさらなるＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、Ｂ２Ｍ発現をノ
ックダウンする能力について試験した。

【0515】

この研究では、アフェレーシスサンプルをドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩ
Ｉを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用し
て、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗Ｃ
Ｄ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して
、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩ
ＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し
、１×１０^６細胞のサンプルに、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子座のＴＲＣ １－２認
識配列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲ
ＮＡ １μｇをエレクトロポレーションした。６つのＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物（
構築物７２８５～７２９０）を、ヌクレオフェクション中にＴＲＣ１－２ ＲＮＡと同時
に線状化ＤＮＡ（２μｇ／サンプル）としてＴ細胞に送達した。あるいは、Ｔ細胞に、ヒ
トＢ２Ｍ遺伝子中のＢ２Ｍ １３－１４認識配列（配列番号６０）を認識して切断するＢ
２Ｍ １３－１４ｘ．４７９ヌクレアーゼをヌクレオフェクトした（国際公開第２０１７
１１２８５９号パンフレットを参照されたい）。これは、Ｂ２Ｍノックアウト細胞上に存
在するバックグラウンドシグナルを定義することによって、ｓｈＲＮＡｍｉＲノックダウ
ンに存在するＢ２Ｍ表面シグナルの量の状況を説明するために含めた。

【0516】

ヌクレオフェクション後４および１１日目に、培養物のサンプルを抗ＣＤ３－ＢＢ５１
５（クローンＳＫ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌ
ｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）、抗Ｂ２Ｍ－ＰＥ（クローンＴＵ－９９、
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを使用）で染色した。Ｂ２Ｍレベル（ＰＥチャネル中の平
均蛍光強度によって測定）を、同じ培養物由来の細胞のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団とＣＤ３
＋／ＣＡＲ－集団との間で比較した。

【0517】

ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団およびＣＤ３＋ＣＡＲ－集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、下
記の表１において対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの横に列挙する。ノックダウンのパーセント
を、（ｓｈＲＮＡｍｉＲ＋集団のＭＦＩ／参照集団のＭＦＩ）×１００として定義する。
表にしたデータは、ヌクレオフェクション後１１日目に取得した。構築物７２８９および
７２９０は、試験した７つの構築物の中で最大のＢ２Ｍ干渉を示した。Ｂ２Ｍノックアウ
ト細胞上に存在するバックグラウンドシグナルは、参照集団の２％未満である（列挙せず
）。

【0518】

【表1】

【0519】

この研究で試験した７つの構築物はすべて、ある程度の安定したＢ２Ｍノックダウンお
よびＣＡＲ発現を示した。興味深いことに、この研究は、内因性タンパク質ノックダウン
の程度が、異なるガイド鎖およびパッセンジャー鎖の選択によって調節され得ることを実
証した。ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチによって提供されるこの柔軟性は、さまざまな程度
の内因性タンパク質ノックダウンがほぼ完全なノックアウトよりも好ましい場合に有利で
あり得る。７２８２、７２８８、７２８９、および７２９０でコードされた候補配列をさ
らなる実験で調査した。

【0520】

実施例４
ｓｈＲＮＡｍｉＲ Ｂ２Ｍ ＣＡＲ Ｔ細胞の同種異系性およびナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞殺滅に対する感受性

【0521】

これらの研究では、同種抗原特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはＮＫ細胞によ
る細胞溶解に対する細胞の感受性についての、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用した不完全である
が安定したノックダウンと比較して、遺伝子アブレーションによるＢ２Ｍのノックアウト
の効果を評価した。非血縁健常ドナー由来の単球由来樹状細胞を使用してＣＴＬをプライ
ミングして、同種抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を活性化および増殖させた。

【0522】

アフェレーシスサンプルを２人の非血縁健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キット
ＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用
して、Ｔ細胞を濃縮した。樹状細胞を調製するために、アフェレーシスサンプルからの未
分画単核細胞をポリスチレン細胞培養フラスコにプレーティングし、１～２時間接着させ
た。非接着細胞を捨て、接着細胞を、単球を樹状細胞様細胞に分化させるサイトカイン混
合物（８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、いずれもＰｅｐ
ｒｏＴｅｃｈ製）中で６日間培養した。樹状細胞（ＤＣ）を収集し、非血縁ドナー由来の
Ｔ細胞と共にさまざまな比率でプレーティングした。最初の２４時間の共培養は、外因性
サイトカインの非存在下で行った。その後、ＩＬ－２を１０ｎｇ／ｍｌで培養物に添加し
た。

【0523】

共培養を５日間行い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４マイクロビーズ
およびＬＳカラムを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させることによってＣＤ８＋Ｔ細胞を
濃縮した。ＣＤ３－ＰＥ（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ８－Ｂ
Ｖ４２１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して純度を評価した。次
いで、プライミングされたＣＴＬを、ＤＣを生成したのと同じドナー由来の標的Ｔ細胞と
共培養した。標的Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／
ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％
ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（
商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、標的Ｔ細胞を、メガ
ヌクレアーゼＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９を使用してＢ２Ｍ遺伝子座で編集（Ｂ２Ｍ Ｋ
Ｏ）するか、またはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を使用してＴＲＡＣ遺伝子座で編集した。
ＴＲＡＣ編集標的Ｔ細胞に、ＡＡＶ ７２０６（対照ＣＡＲ Ｔ）またはＡＡＶ ７２８
９（Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ）のいずれかを２５，０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯ
Ｉで形質導入した。

【0524】

ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗Ｂ
２Ｍ－ＰＥ（クローンＴＵ－９９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３－ＰＥ（ク
ローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ＦＭＣ６３－ＢＶ４２１（自社生産の
クローンＶＭ１６）を使用して、Ｂ２Ｍ－画分またはＣＡＲ＋画分を９９％超の純度にＦ
ＡＣＳ選別した。選別した標的細胞を１μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔ
ｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、１：５～５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：
Ｔ）比で同種抗原感作ＣＴＬと共に培養物中に入れた。培養セットアップの１８時間後、
サンプルを色素陽性生標的細胞について分析し、生存標的細胞の数を「エフェクターなし
」対照と比較することによって殺滅パーセントを計算した。

【0525】

ナチュラルキラー（ＮＫ）応答も測定した。ＮＫ細胞を、ＣＤ５６陽性選択キット（Ｓ
ｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣサンプルから磁気的
に濃縮した。濃縮されたＮＫ細胞を、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識ＣＡＲ－
Ｔ細胞（ＡＡＶ６－７２０６で作製）、Ｂ２ＭノックダウンＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲを含有するＡＡＶ６－７２８９で作製）、またはＢ２ＭノックアウトＴ細
胞と１８時間共培養した。１８時間の共培養後、色素陽性生存標的細胞を計数し、殺滅パ
ーセントを計算した。

【0526】

正常レベルのＢ２Ｍ表面発現を有するＣＡＲ Ｔ細胞を、プライミングされた同種抗原
特異的ＣＴＬによって殺滅させた（図６Ａ）。Ｅ：Ｔ比が上昇するにつれて、それに応じ
て殺滅パーセントが増加し、２：１のＥ：Ｔ比で最大７４％の殺滅があった。Ｂ２Ｍ遺伝
子座で遺伝子編集され、Ｂ２Ｍタンパク質の表面発現を完全に欠いているＴ細胞は、各Ｅ
：Ｔ比でＢ２Ｍ＋対照ほど効率的に殺滅されなかった。Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲをコー
ドし、正常なＢ２Ｍ表面レベルの５～１０％を発現するＣＡＲ Ｔ細胞で観察された殺滅
レベルは、同様に、プライミングされたＣＴＬによって、Ｂ２Ｍ ＫＯによって観察され
たものよりも低いパーセンテージで非効率的に殺滅された。

【0527】

Ｂ２Ｍノックアウト細胞は、Ｅ：Ｔ比と相関してＮＫ細胞によって殺滅され、５：１の
Ｅ：Ｔ比で最大５０％の殺滅に達したことがさらに観察された（図６Ｂ）。操作されてい
ないレベルのＢ２Ｍ発現を有するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞によって効率的に殺滅され
なかったが、いくらかのバックグラウンド殺滅が最も高いＥ：Ｔ比で観察された。注目す
べきことに、Ｂ２Ｍノックダウン細胞は、ＮＫ細胞によって非効率的に殺滅されたが、最
も高いＥ：Ｔ比でいくらかの殺滅（２８％）が観察された。

【0528】

メガヌクレアーゼによるＢ２Ｍ発現の遺伝子アブレーションは、プライミングされた同
種抗原特異的ＣＴＬによる殺滅に対して高度に耐性の細胞をもたらしたが、それらはＮＫ
細胞によって容易に殺滅された。ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチを使用して内因性Ｂ２Ｍを
正常レベルの５～１０％に安定にノックダウンすると、ＣＴＬに対して同様に耐性である
が、ＮＫ細胞溶解に対して実質的に感度が低い細胞が得られた。これは、これらの細胞が
、Ｂ２Ｍの完全なノックアウトを有する同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞よりもインビボでＮＫ細
胞殺滅を回避する可能性が高いことを示唆している。

【0529】

Ｂ２ＭのｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノックダウンに加えて、第２の遺伝子編集アプローチを
ＮＫ細胞回避について評価した。第２のアプローチは、Ｂ２Ｍ遺伝子に切断部位を生成す
るように操作されたメガヌクレアーゼの使用、および切断部位へのドナー鋳型の導入を含
んだ。このドナー鋳型は、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポ
リペプチド（配列番号６６）をコードした。細胞表面に発現された場合、ＨＬＡ－Ｅは、
ＮＫ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害受容体に結合することが知られており、ＮＫ細胞
媒介溶解からＨＬＡ－Ｅ＋細胞を保護することが示されている。ここでは、ＨＬＡ－Ｅコ
ード配列のＢ２Ｍ遺伝子への標的挿入がＢ２Ｍ発現を同時にノックアウトし、したがって
ＣＡＲ Ｔ細胞の同種異系性を低下させ、ＮＫ細胞殺滅を阻害するためにＨＬＡ－Ｅを発
現することができるかどうかを調べた。

【0530】

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナー
から採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣ
ｕｌｔ Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇ
ｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の
３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、Ｂ２Ｍ遺伝子座中のＢ２Ｍ １３－１
４認識配列（配列番号６０）を認識して切断するＢ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９メガヌクレ
アーゼをコードするＲＮＡ １ｕｇをエレクトロポレーションした。

【0531】

エレクトロポレーションの直後に、グリシン－セリンリンカーによって連結された３つ
のポリペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質（配列番号６６）をコードするＡＡＶ７
３４６を用いて細胞に形質導入した。第１のポリペプチドは、ＨＬＡ－Ｇリーダーペプチ
ド（配列番号１２０）とそれに続く（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号１２１）とを含
む九量体である。第２のポリペプチドは、完全長コドン最適化ヒトＢ２Ｍ遺伝子（配列番
号１１９をコードする）とそれに続く（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号１２２）であ
る。第３のポリペプチドは、ヒトＨＬＡ－Ｅ－０１：０３配列（配列番号１１８）である
。導入遺伝子はＪｅＴプロモータの制御下にあり、双方向ポリＡ配列によって終結する。
導入遺伝子は、導入遺伝子をＢ２Ｍ１３－１４切断部位に挿入するように指向させる相同
アームに隣接している。

【0532】

３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する完全Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で少なくとも６日間培
養した後、細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＷ６／３２－
Ｂ２Ｍ編集細胞を検出するため）および抗ＨＬＡ－Ｅ－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
クローン３Ｄ１２）で染色した。Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ
－ＳまたはＬＸを使用して、細胞をノックアウト／ノックイン頻度について分析した。Ｈ
ＬＡ－ＡＢＣ^－ＨＬＡＥ^＋細胞を、Ｂｅｃｋｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＭｅ
ｌｏｄｙを使用してＦＡＣＳによって精製した。形質導入されていないＨＬＡ－ＡＢＣ－
（Ｂ２Ｍ編集され、ＡＡＶなし）を対照として選別した。この実施例において以前に記載
されたように、ＣＴＬおよびＮＫ細胞による殺滅に対する感受性について、選別された細
胞を測定した。

【0533】

Ｂ２Ｍ１３－１４ｘ．４７９ ＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞は、標準的なＭＨ
Ｃ Ｉタンパク質ＨＬＡ－Ａ、ＢおよびＣならびにＨＬＡ－Ｅの表示を欠く集団を発達さ
せた（図７Ａ）。Ｂ２Ｍ編集細胞にＡＡＶ７３４６を用いて形質導入すると、高レベルの
ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を発現するＨＬＡ－ＡＢＣ－細胞の集団が現れる（図７Ｂ）。これ
らの集団を９９％超の純度に選別した（図８）。

【0534】

図９Ａに示されるように、Ｂ２Ｍ編集されていないＣＡＲ Ｔ細胞は、同種抗原プライ
ムＣＴＬによって殺滅され、Ｅ：Ｔ比の上昇につれて、ＣＡＲ Ｔ殺滅の増加が観察され
た（最大で約７５％に達した）。対照的に、Ｂ２Ｍノックアウト細胞およびＨＬＡ－Ｅ導
入遺伝子を発現するＢ２Ｍノックアウト細胞は両方とも効率的に殺滅されず（１０％以下
）、Ｅ：Ｔ比の上昇による殺滅の増加は観察されなかった。

【0535】

図９Ｂに示すように、ＮＫ細胞による殺滅を測定した場合、Ｂ２Ｍが十分なＣＡＲ Ｔ
細胞はＮＫ細胞によって効率的に標的化されなかったが、Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞は効
率的に殺滅された（最大約５０％）。ＨＬＡ－ＡＢＣ発現を欠くにもかかわらず、ＨＬＡ
－Ｅ^＋細胞は、Ｂ２Ｍが十分な細胞で観察される程度に匹敵する程度までＮＫ細胞溶解か
ら保護された。これらのデータは、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子破壊が、同種抗原プライ
ムＣＴＬによる細胞溶解からＴ細胞を保護し、ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子が、ＮＫ細胞溶解の
自己機序の喪失を防止することを示している。

【0536】

実施例５
ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２Ｍのノックダウンを有するＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ有効
性およびＢ２Ｍノックダウンの安定性

【0537】

これらの研究は、対照ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞に曝露し、インビボで活性
化した後の細胞と比較した、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＢ２Ｍのノックダウンを有するＣＤ
１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するため、およびインビボでのＢ２Ｍノックダウン
の安定性を決定するために行った。

【0538】

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後
３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２）をコード
するｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直ちに、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ配列を担持す
る７２０６ ＡＡＶベクター、またはＣＡＲの終止コドンとポリアデニル化配列との間に
コードされるＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを有するＣＤ１９ ＣＡＲを担持する７２８
９ ＡＡＶベクターを用いて形質導入した。両群由来の残存ＣＤ３＋（未編集）ＣＡＲ
Ｔ細胞を、ＣＤ３磁気濃縮キットを使用して枯渇させ、処分し、両群由来の細胞を、前述
のように枯渇後の増殖後に凍結保存した。

【0539】

雌ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するＮＡＬＭ－６ヒト急性リンパ芽球
性白血病細胞株を接種し、１週間後、ビヒクルコントロール、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ
細胞、またはＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ細胞のいずれかを５ｅ６ Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞／マウスの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（ｎ＝動物５匹／群）。

【0540】

ルシフェラーゼ活性を、遮光性のサンプル室に取り付けられたＣＣＤカメラを備えたＩ
ＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）イメージングシステムを
使用して、生きた動物において測定した。

【0541】

イメージングの当日に、動物にルシフェリン基質を注射し、麻酔誘導室に入れた。鎮静
の後、ルシフェリン基質後に一定の間隔で画像を取得するために、生理学的温度に加熱し
たステージを備えたイメージングチャンバー内に動物を背臥位で置いた。取得時間は、Ｌ
ｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアによって自動的に決定された。目的の領域を各マウス
の周りに引き、フラックスを定量化し、光子／秒（ｐ／ｓ）として報告した。Ｌｉｖｉｎ
ｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア４．５．２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用して
データを分析し、エクスポートした。

【0542】

マウス血液中に存在するヒトＴ細胞上のＢ２Ｍ発現の分析のために、ＣＡＲ Ｔ細胞の
投与後１４日目に個々のマウスから血液サンプルを採取した。赤血球を溶解し、次いでサ
ンプルを洗浄し、ヒトＣＤ４５およびＢ２Ｍの存在について染色し、前述のようにフロー
サイトメトリによって分析した。

【0543】

図１０Ａに示すように、ＮＡＬＭ－６細胞を移植し、ビヒクル（三角形の黒い線）で処
置したマウスは、生物発光イメージングによって測定されるように、研究の経過にわたっ
て腫瘍成長の増加を示し、経時的に総フラックスが着実に増加した。対照的に、ビヒクル
処置動物と比較して総フラックスの減少によって観察されるように、ＣＤ１９指向性ＣＡ
Ｒ Ｔ細胞（丸のついた濃い灰色の線）または統合されたＢ２Ｍ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲ
（三角形のついた薄い灰色の線）を含むＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかで処置
したマウスは、研究の経過にわたって迅速かつ持続可能な抗腫瘍活性を媒介した。

【0544】

ＣＡＲ Ｔ投与の１４日後に、血液サンプルを採取して、ヒトＣＤ４５＋細胞上のＢ２
Ｍの発現を評価した。図１０Ｂに示すように、Ｂ２Ｍ発現のＭＦＩは、統合されたＢ２Ｍ
標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを有するＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ細胞では、対照ＣＤ１９指向
性ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して９０％を超えて減少しており、活性化され、標的細胞のクリ
アランスを媒介しているＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ保有細胞が、ゲノムに統合されたＢ２
Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲを有さない対照細胞と比較してＢ２Ｍ発現レベルが依然として低下
していることを示した。

【0545】

ＣＡＲを発現する細胞におけるＢ２Ｍ発現の標的ノックダウンを可能にする構築物の一
方にｓｈＲＮＡｍｉＲベクターが含まれることのみが異なる、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ Ｔ
細胞の２つの群を作製した。両方の群のＣＡＲ Ｔ細胞は、白血病の異種移植モデルにお
いて腫瘍負荷を軽減することができた。マウスから採取した血液サンプルにより、Ｂ２Ｍ
ｓｈＲＮＡｍｉＲを有するヒトＴ細胞が、対照ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞群のマウスの
血液中のＴ細胞よりも細胞表面上のＢ２Ｍ発現レベルが低いことが確認され、Ｂ２Ｍのノ
ックダウンが、ヒト白血病の関連するマウスモデルにおいて活性化され、標的細胞の殺滅
を媒介している細胞においてさえ安定であることを示している。

【0546】

実施例６
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＳ１の安定なノックダウン

【0547】

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してＣＳ１を安定にノックダウンするこ
とができるかどうかを決定するために開始した。ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒの３つの候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列をｍｉＲ－Ｅ足場内に構築し、
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ（ＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、
Ｎ６共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む）の終止コ
ドンの後に配置した。これらを構築物７２１０１、７２１０２、および７２１０３と命名
した。

【0548】

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナー
から採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣ
ｕｌｔ Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇ
ｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の
３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ １－２認
識配列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲ
ＮＡ １ｕｇをエレクトロポレーションした。ヌクレオフェクションを、ＣＡＲをコード
する線状化ＤＮＡの２ｕｇ／１ｅ６細胞および候補ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７ ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲのうちの１つの存在下で行った。この実験では、個々のサンプルに、上記のようなＴ
ＲＣ１－２Ｌ．１５９２、およびＲＮＡｉの特徴をコードしないＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物
をヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの７日後、培養物を抗ＣＤ３（クロ
ーンＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＳ１（クローン１６２．１、Ｂ
ｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびビオチン化ＢＣＭＡ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で染
色して、ＣＡＲ（ストレプトアビジン－ＡＰＣまたはＢＶ４２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄを
用いて対比染色）を検出した。

【0549】

ＣＡＲ＋細胞上のＣＳ１表面発現レベルを、同じ培養物中のＣＡＲ－細胞上に表示され
るレベルと比較することによって、相対的なノックダウンの大きさを測定することができ
た。構築物７２１０１および７２１０２は、ＣＳ１発現を目に見えるように変化させなか
ったが、平均蛍光強度は、それぞれ２６％および３０％のノックダウンを示唆した。７２
１０３を使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞は、目に見えるほど低いレベルのＣＳ－１を
示し、高発現細胞はほとんどなく、３６％のノックダウンと計算された（図１１）。

【0550】

これらの実験は、内因性ＣＳ１の発現がＣＡＲ Ｔ細胞において安定に低下され得るこ
とを実証した。産生中のフラトリサイド活性を防止するために、ＣＳ１特異的ＣＡＲ Ｔ
細胞上のＣＳ１をノックダウンするという目的で、候補７２１０３をさらに調べることに
なる。

【0551】

実施例７
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（ＴＧＦＢＲ２
）の安定なノックダウン

【0552】

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してさらなる内因性遺伝子のＴＧＦＢＲ
２を安定にノックダウンすることができるかどうかを決定するために開始した。ＴＧＦＢ
Ｒ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲのための候補ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し
、ｍｉＲ－Ｅ足場に組み込み、（実施例１に記載されるように）ＦＭＣ６３に基づく抗Ｃ
Ｄ１９ ＣＡＲの終止コドンの後に配置した。ＴＧＦＢＲ２ ７２１１０ ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号２７および２８として示さ
れる。ＴＧＦＢＲ２ ７２１１１ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖
は、それぞれ配列番号２９および３０として示される。ＴＧＦＢＲ２ ７２１１２ ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３１および３２と
して示される。ＴＧＦＢＲ２ ７２１１３ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖および
ガイド鎖は、それぞれ配列番号３３および３４として示される。ＴＧＦＢＲ２ ７２１１
４ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３５およ
び３６として示される。

【0553】

アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者
の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞
を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ
３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ
胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標
）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。

【0554】

刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲ
Ｃ １－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼを
コードするＲＮＡ １μｇをエレクトロポレーションした。ヌクレオフェクションを、Ｃ
ＡＲをコードする線状化ＤＮＡの２μｇ／１×１０^６細胞および候補ＴＧＦＢＲ２ ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲのうちの１つの存在下で行った。この実験では、個々のサンプルに上記のＴ
ＲＣ１－２Ｌ．１５９２をヌクレオフェクションし、ＦＭＣ６３抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコ
ードするがＲＮＡｉの特徴を含まないＡＡＶ ７２０６を用いて形質導入した。

【0555】

細胞を、抗ＴＧＦＢＲ２抗体ＭＭ００５６－４Ｆ１４（Ａｂｃａｍ）およびＰＥにコン
ジュゲートされた抗マウスκ軽鎖二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、ヌクレオ
フェクション後７、１０および１４日目にＴＧＦＢＲ２発現について分析した。ＣＡＲ＋
細胞を、自社で作製した抗ＦＭＣ６３－Ａｌｘ６４７を使用して同定した。ＣＡＲ＋上の
ＴＧＦＢＲ２シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＣＡＲ－細胞上のものと比較し、ノッ
クダウンパーセントを計算した。ＣＡＲ＋事象の頻度は、異なる構築物にわたって一貫し
ており、４．９％～６．７％の範囲であった（図１２）。

【0556】

ＴＧＦＢＲ２表面レベルは、ＣＡＲ＋集団ではサンプルごとに変動したが、ＴＲＡＣ遺
伝子座に組み込まれたＣＡＲ－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物を有さないＣＡＲ－集団では比較
的一貫していた。配列７２１１１、７２１１２および７２１１３は、実験全体を通して最
も堅固なノックダウンを支援するように思われた（ＴＧＦＢＲ２ ＭＦＩによる測定、以
下の表２に要約する）。これらの３つの配列をさらなる研究のために選択した。

【0557】

【表2】

【0558】

ＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列のこのスクリーニングにより、さまざまなレ
ベルのＴＧＦＢＲ２の安定なノックダウンを有するＣＡＲ Ｔ細胞を調製可能であること
が実証された。特に、構築物７２１１１、７２１１２および７２１１３は、ＣＡＲ－ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲ配列が首尾よく組み込まれた細胞における表面ＴＧＦＢＲ２の堅固な減少を
支援した。

【0559】

本明細書に記載のｓｈＲＮＡｍｉｒ媒介ノックダウンアプローチを、ＴＧＦＢＲ２遺伝
子のヌクレアーゼ媒介ノックアウトと比較するために、さらなる研究を行った。

【0560】

この研究では、アフェレーシスサンプルを健常で、情報を知らされ、補償されたドナー
から採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣ
ｕｌｔ Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇ
ｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の
３日後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルに、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をコードす
るＲＮＡ １ｕｇ、またはＴＧＦＢＲ２遺伝子を標的とする２つのヌクレアーゼ候補：Ｔ
ＧＦ１－２ｘ．５（配列番号６４）またはＴＧＦ１－２Ｌ．２９６（配列番号６５）のう
ちの１つをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、３０ｎｇ
／ｍｌのＩＬ－２を補充した完全Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地中で６日間培養し、その後編集効
率を分析した。これは、細胞を抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体（Ａｂｃａｍ クローンＭＭ００５
６－４Ｆ１４）で染色し、続いてＰＥにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧκ軽鎖（Ｂ
ｉｏＬｅｇｅｎｄ クローンＲＭＫ４５）で染色することによって達成した。データを、
Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＳまたはＬＸで取得した。

【0561】

ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２をエレクトロポレーションしたＴ細胞に、ＡＡＶ７２１１２
（実施例１に記載の抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＣＡＲをコードし、ＣＡＲ終止コドンの後
およびＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲがポリＡ配列の前に挿入されている）または
ＡＡＶ７２０６（ＲＮＡｉを含まない対照ＦＭＣ６３ ＣＡＲをコードする）を用いて直
ちに形質導入した。培養の６日間後、ＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞を、上記の方法を使用してＦ
ＡＣＳによって精製した。さらに、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９６編集培養物由来のＴＧＦβＲ
ＩＩ－細胞をこの様式で選別した。選別した細胞を無血清培地中で一晩静置した後、５０
０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦβ１（ＴＧＦＢＲ２のリガンド）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ
）で刺激した。ＴＧＦβ１添加の３０分後、細胞を回収し、Ｐｈｏｓ－Ｆｌｏｗ ｌｙｓ
ｅ－ｆｉｘ緩衝液およびＰｈｏｓ－Ｆｌｏｗ Ｆｉｘ－Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の説明書に従って使用して、染色のために直ちに調製し
た。固定された細胞を抗ｐＳＭＡＤ２／３－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染
色し、データをＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸで取得した。

【0562】

モックヌクレオフェクトＴ細胞を抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体および二次抗体で、または二次
抗体単独で染色して、それぞれ、ＴＧＦβＲＩＩの表面検出の陽性対照および陰性対照と
して役立てた。

【0563】

モックヌクレオフェクト細胞と比較して、ＴＧＦ１－２ｘ．５の導入は培養物中の細胞
の３８．６％においてＴＧＦＢＲ２ノックアウトをもたらしたが、ＴＧＦ１－２Ｌ．２９
６の導入は６９％のより高いノックアウト頻度をもたらした（図１３）。

【0564】

ＴＧＦβＲＩＩ発現が破壊されたＴ細胞（メガヌクレアーゼ対ＲＮＡｉ）を選別し、Ｔ
ＧＦβ１で刺激して、ＴＧＦβＲの下流シグナル伝達物質であるＳＭＡＤ２／３のリン酸
化を評価した。ＴＧＦβ１の非存在下で低いｐＳＭＡＤ２／３シグナルおよびＴＧＦβ１
曝露後により高いｐＳＭＡＤシグナルを示すＴＲＡＣ編集Ｔ細胞と比較して、ＴＧＦＢＲ
２ ＫＯ細胞はリガンド曝露にほとんど応答しない（図１４）。ＴＧＦＢＲ２編集サンプ
ルにおいて事象のある小さな集団が、サイトカイン曝露後にＳＭＡＤ２／３リン酸化を示
すが、これはおそらく選別不純物を表す。ＴＧＦβ１に応答してＳＭＡＤ２／３をリン酸
化する選別されたＴＧＦβＲＩＩ十分Ｔ細胞（７２０６ ＣＡＲ Ｔ）、およびＴＧＦβ
１に応答してＳＭＡＤ２／３をリン酸化しない選別されたＴＧＦＢＲ２ ＫＯ細胞と比較
して、ＴＧＦＢＲ２指向性ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＳＭＡＤ２／
３を陽性対照および陰性対照によって線引きされる範囲にわたるレベルにリン酸化する（
図１５）。

【0565】

ＴＧＦＢＲ２のメガヌクレアーゼ媒介ノックアウトおよびｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノック
ダウンが、（実施例６に記載されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現する）ＢＣＭＡ特異的Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞におけるｐＳＭＡＤ２／３シグナル伝達を低下させることができるかどうか
を決定するために、さらなる実験を行った。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の４つの実験群を
調製し、ｐＳＭＡＤ２／３レベルについて試験した。第１および第２の群には、それぞれ
未処理対照およびＴＧＦβ１処理ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が含まれた。第３および第４
の群には、それぞれ、ＴＧＦ １－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼでノックアウトされた
ＴＧＦＢＲ２、または７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲでノックダウンされ
たＴＧＦＢＲ２のいずれかを有するＴＧＦβ１で処理されたＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が
含まれた。

【0566】

ＣＡＲ Ｔ細胞の各群を、ＴＲＣ １－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１－２Ｌ
．１５９２メガヌクレアーゼを使用して調製し、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするＤＮ
Ａ構築物を上記のようにこの認識配列内に挿入した。ＴＧＦＢＲ２のノックアウトを有す
るＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＧＦ １－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼを用いて調
製し、ＴＧＦＢＲ２のノックダウンを有する細胞を、上記のように７２１１２ ＴＧＦＢ
Ｒ２ ｓｈＲＮＡｍｉＲを用いて調製した。それぞれのＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞群をＴ
ＧＦβ１（５００ ｎｇ／ｍｌ）で処理し、すべての細胞群を回収し、上記のように分析
した。ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞については、ＴＧＦＢＲ２陰性細胞集団についてフ
ローサイトメトリをゲーティングした。

【0567】

図１６に示されるように、未処理ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は低レベルのｐＳＭＡＤ２
／３を有し、これに対して、ＴＧＦβ１による処理はこれらのレベルを増大させた。ＴＧ
Ｆ １－２Ｌ．２９６メガヌクレアーゼによるＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ
ＢＲ２のノックアウトは、ｐＳＭＡＤ２／３を未処理ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞対照と同
等またはそれより低いレベルまで低下させた。７２１１２ ＴＧＦＢＲ２ ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲによるＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックアウトはまた、ｐＳ
ＭＡＤ２／３を未処理ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞対照と同等のレベルまで低下させた。

【0568】

したがって、これらの研究は、遺伝子編集またはｓｈＲＮＡｍｉＲのいずれかによるＴ
ＧＦＢＲ２破壊が、ＣＡＲ Ｔ細胞のＳＭＡＤ２／３をリン酸化する能力の低下をもたら
すことを実証した。ＳＭＡＤリン酸化は、障害されたＴＧＦＢＲ２遺伝子を有するＣＡＲ
Ｔ細胞では検出されなかったが、ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現する細胞は不均一であり、細
胞はさまざまな程度でＳＭＡＤ２／３をリン酸化する。

【0569】

実施例８
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックダウン対ノックアウトの比較

【0570】

ＴＧＦβ経路に対するさまざまな変更の後でＣＡＲ Ｔ細胞の活性を評価するさらなる
研究を行った。ＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ １－２部位に挿入されたＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ
（実施例６に記載）を使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を、健常な補償されたドナーのＴ細胞か
ら生成した（他の箇所に記載）。いくつかの変異体では、ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする
配列も、ＣＡＲと同じカセット中のＴＲＣ １－２部位（ＣＡＲ終止コドンとポリＡ配列
との間に配置される）に導入された。一変異体では、ｓｈＲＮＡｍｉＲはＴＧＦＢＲ２特
異的ｓｈＲＮＡｍｉＲ（構築物７２１５４）であったが、別の変異体では、ＴＧＦβ機能
に関連しないｓｈＲＮＡｍｉＲ（Ｂ２Ｍを標的とする－構築物７２１５５）を導入した。
ＣＡＲ Ｔ細胞の第３の変異体を、構築物７２１５５を使用して作製したが、ＴＧＦＢＲ
２遺伝子をノックアウトするために、それらを、上記のＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアー
ゼを使用してＴＧＦＢＲ２遺伝子座において編集した。ＴＧＦＢＲ２ ＫＯ群のＣＡＲ
Ｔ細胞は６０％のＫＯを含んでいた。

【0571】

ＣＡＲ Ｔ細胞の各群に、さまざまな腫瘍標的：Ｋ５６２陰性対照細胞、ＢＣＭＡを安
定に発現するようにトランスフェクトしたＫ５６２細胞、およびＢＣＭＡを安定に発現し
、活性ＴＧＦβ１を構成的に分泌するＫ５６２細胞（Ｃ２２３Ｓ Ｃ２２５Ｓ点変異）を
負荷した。１つの実験では、ＣＡＲ Ｔ細胞および標的を１：１の比でプレーティングし
た。図１７に示す時点において、Ｔ細胞および任意の生存標的を計数し、各時点で１：１
の比が再確立されるように新鮮な標的を培養物に添加した。時間に対する培養中のＴ細胞
の数を図１７に示す。陰性対照Ｋ５６２細胞に応答して増殖するＣＡＲ Ｔ細胞は観察さ
れなかった。

【0572】

正常レベルのＴＧＦＢＲ２発現を有するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ＋標的を負荷した
場合、共培養の６日目までに１５倍超増殖したが、ＴＧＦＢ分泌標的細胞の存在下では５
倍しか増殖しなかった。比較すると、ＴＧＦＢＲ２ノックダウン細胞は、ＢＣＭＡ＋標的
に応答して同様に増殖するが、ＴＧＦＢ分泌標的による阻害は少ない（１５倍対１０倍）
。別の実験では、ＣＡＲ Ｔ細胞を１：９のＥ：Ｔ比で標的と共にプレーティングし、生
存標的細胞を５日目および７日目に計数した。７日目までに、ＴＧＦＢＲ２ノックダウン
細胞は、それらのＴＧＦｂ分泌能にかかわらず、ＢＣＭＡ＋標的細胞を実質的に根絶した
。対照ＣＡＲ Ｔ細胞は、対照ＢＣＭＡ＋標的を根絶しただけであり、ＴＧＦｂ分泌ＢＣ
ＭＡ＋標的を排除しなかった（図１８）。

【0573】

ＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集してＴＧＦＢＲ２をノックアウトしたＣＡＲ
Ｔ細胞は、対照、または標的細胞によるＴＧＦｂ分泌に関連しなかったＴＧＢＦＲＩＩ
ノックダウンＣＡＲ Ｔ細胞を上回る機能的利点を示した。図１９に示されるように、Ｔ
ＧＦＢＲ２ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞を含有する培養物は、実験の１７日間にわたって
連続的な増殖を示した。これは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞を含有する培
養物における、ＣＤ４：ＣＤ８比の持続的な上昇に関連していた（図２０）。

【0574】

まとめると、これらのデータは、ＴＧＦ１－２Ｌ２９６による編集、またはＴＧＦＢＲ
２－特異的（ｓｅｐｃｉｆｉｃ）ｓｈＲＮＡｍｉＲの包含が、ＣＡＲ Ｔ細胞が抑制量の
ＴＧＦｂ１の存在下でエフェクター機能を維持および実行可能にすることを示している。

【0575】

実施例９
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦＢＲ２のノックダウン対ノックアウトの比較

【0576】

実施例８に記載のＣＡＲ Ｔ変異体に多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６、または活性ＴＧＦ
ｂ１を分泌するように操作されたＵ２６６細胞をさらに繰り返し（上記のように）負荷し
た。Ｋ５６２実験からの知見と一致して、対照ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖ピークは、対照Ｕ２
６６標的と比較して、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的に応答して約５０％低下した（図２１）
。ＴＧＦＢＲ２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦｂ１分泌Ｕ
２６６標的によって阻害されなかった。ＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集してＴ
ＧＦＢＲ２をノックアウトしたＣＡＲ Ｔ細胞は、他のＣＡＲ Ｔ変異体よりも多数に増
殖し、この実験の１９日間、多数を維持した（図２２）。これに伴い、ＣＤ４＋Ｔ細胞の
頻度も上昇した（図２３）。図２３のヒストグラムは共培養の１６日目に得られ、対照Ｃ
ＡＲ Ｔ培養物（７２１５４、ＣＤ４＋約１６％）と比較して、ＴＧＦＢＲ２ノックダウ
ンＣＡＲ Ｔ培養物はわずかにＣＤ４頻度（２３％）が上昇したが、培養された二重編集
ＣＡＲ Ｔは６３％のＣＤ４＋細胞を含んでいたことを示している。

【0577】

増殖のピーク後の、培養物中の標的細胞を根絶するＣＡＲ Ｔ細胞の能力に関してさら
なる観察を行った。１６日目の時点の、ＢＣＭＡ（ｙ軸）またはＴＧＦｂ－ＧＦＰ導入遺
伝子（ｘ軸）を発現する生存標的細胞を示すドットプロットを図２４に示す。１３日目の
再チャレンジ後の１６日目にＴ細胞数の減少が観察されたにもかかわらず、対照およびＴ
ＧＦＢＲ２ノックダウンＣＡＲ Ｔ細胞の両方がＵ２６６標的を根絶することができた。
Ｔ細胞数の減少を示さなかった二重編集ＣＡＲ Ｔ細胞もまた、１３日目と１６日目との
間にＵ２６６標的を根絶した。重要なことに、ＴＧＦｂ耐性を有する（ＴＧＦＢＲ２ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲを発現するか、またはＴＧＦ１－２Ｌ２９６ヌクレアーゼで編集された）
ＣＡＲ Ｔ細胞のみが、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的を排除することができた。対照ＣＡＲ
Ｔ細胞は、ＴＧＦｂ分泌Ｕ２６６標的を殺滅させることができなくなり、１３日目から
１６日目までに共培養物の９０％超を占めるように増殖した。

【0578】

これらのデータは、ｓｈＲＮＡｍｉＲノックダウンまたは遺伝子ノックアウトのいずれ
かによって、ＴＧＦＢＲ２の発現が乱されたＣＡＲ Ｔ細胞が、抑制レベルのＴＧＦｂサ
イトカインの存在下で増殖し、標的細胞を排除することができるという実施例８における
結論を裏付けている。

【0579】

実施例１０
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ５２の安定なノックダウン

【0580】

これらの研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を使用してさらなる内因性遺伝子のＣＤ５２を
安定にノックダウンすることができるかどうかを決定するために開始した。ＣＤ５２ ７
２１２３ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３
７および３８として示される。ＣＤ５２ ７２１２４ ｓｈＲＮＡｍｉＲのパッセンジャ
ー鎖およびガイド鎖は、それぞれ配列番号３９および４０として示される。

【0581】

アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性選択キットＩＩを製造者
の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用して、Ｔ細胞
を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ
３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ
胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標
）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０
^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ １－２認識配列を認識して切断するＴ
ＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ １μｇをエレクトロポ
レーションした。線状化ＤＮＡのサンプルも、ヌクレオフェクション時に最終濃度２μｇ
／１×１０^６細胞まで細胞に添加した。この実験では、それぞれが７２０６の変異体であ
り、それぞれがＦＭＣ６３ ＣＡＲ遺伝子の終止コドンの下流であるがポリＡ転写ターミ
ネータの上流に異なるＣＤ５２特異的ｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする、２つの異なる線状
化構築物を使用した。

【0582】

ヌクレオフェクション後１０日目に、細胞の培養物を抗ＣＤ３－ＢＶ７１１（クローン
ＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＭＣ６３－Ａｌｘ６４７（クローン
ＶＭ１６、自社生産）および抗ＣＤ５２－ＰＥクローン４Ｃ８ ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎ
ｃｅｓ）で染色した。ＣＤ５２の強度を、ＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞と未編集のＣＤ３＋／Ｃ
ＡＲ－細胞との間で比較した。

【0583】

ヌクレオフェクション後１０日目に、ＴＲＡＣ編集ＣＡＲ＋細胞上のＣＤ５２強度を、
同じ培養物中の未編集（ＣＤ３＋ＣＡＲ－）細胞上のＣＤ５２強度に対してプロットした
。構築物７２１２３および７２１２４をヌクレオフェクトされた培養物からのＣＡＲ＋集
団（影のないヒストグラム）は、対応する参照集団（影のあるヒストグラム）よりも約１
ｌｏｇ低いＣＤ５２シグナルを発現し、ＣＡＲ＋集団で約９０％の安定した低下を表した
（図２５）。

【0584】

この研究は、ｓｈＲＮＡｍｉＲアプローチが、ＣＡＲ Ｔ細胞集団における内因性ＣＤ
５２タンパク質を効率的かつ安定に約９０％ノックダウンするために活用できることを実
証する。

【0585】

実施例１１
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡｍｉＲによるタンパク質の多重ノックダウン

【0586】

さらなる研究を、多重アプローチにおいてＣＡＲ Ｔ細胞でのｓｈＲＮＡｍｉＲ媒介ノ
ックダウンを使用することの実現可能性を決定するために行った。これらの研究では、Ｂ
２ＭおよびＣＤ５２の両方を、ゲノムから安定に発現された異なるｓｈＲＮＡｍｉＲによ
る、同じＴ細胞中でのノックダウンのために標的化した。

【0587】

これらの実験のために、アフェレーシスサンプルを健常ドナーから採取し、ＣＤ３陽性
選択キットＩＩを製造者の説明書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に
従って使用して、Ｔ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺
激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を補充
したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。刺激の３日後、
細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中のＴＲＣ １－２認識配
列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ
１μｇをエレクトロポレーションした。

【0588】

線状化ＤＮＡのサンプルも、ヌクレオフェクション時に最終濃度１μｇ／１×１０^６細
胞まで細胞に添加した。この実験では、３つの異なる線状化構築物を使用し、それぞれが
ＪｅＴ駆動抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する７２０６の変異体であった。クローン７２９０
と呼ばれる１つの配列は、ＣＡＲの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡ
ｍｉＲを含む。７２１２４と呼ばれる第２の構築物は、同じ位置にＣＤ５２特異的ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲを含有し、７２１５６と呼ばれる第３の構築物は、ＣＡＲの３’ＵＴＲにＣＤ
５２ ｓｈＲＮＡｍｉＲ、そのすぐ後にＢ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲを含有する。

【0589】

エレクトロポレーション後、細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２を補充した完全Ｘ－Ｖ
ＩＶＯ１５中で７日間インキュベートした。この時点で、Ｔ細胞を、上に詳述したように
、ＴＲＡＣ編集およびＣＡＲ挿入、ならびにＣＤ５２およびＢ２Ｍ発現について分析した
。

【0590】

ＣＡＲ^＋ＣＤ３^－細胞の集団を、ＣＤ５２およびＢ２Ｍ発現について各サンプル中の未
編集ＣＤ３^＋ＣＡＲ^－細胞と比較した。７２９０ＤＮＡを投与したサンプルでは、ＣＡＲ
Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＡＲ－細胞と比較して、Ｂ２Ｍの表面レベル（平均蛍光強度によ
って測定）の９１％の低下を示した。両集団は、同等レベルの表面ＣＤ５２を示した。７
２１２４ＤＮＡを投与したサンプルでは、ＣＡＲ＋集団は未編集集団と比較してＣＤ５２
レベルの９０％の低下を示したが、Ｂ２Ｍレベルの低下は示さなかった。７２１５６ＤＮ
Ａを含有するＣＡＲ^＋細胞は、参照集団と比較して、両方のレベル低下、ＣＤ５２（８９
％）およびＢ２Ｍ（８８％）を示した（図２６）。さらに、ビオチン化抗ＣＤ５２試薬を
、依然として高レベルのＣＤ５２を発現するＣＡＲ－細胞を枯渇させるための陰性選択ア
プローチに使用して、ＣＤ５２発現が低下したＣＡＲ＋細胞の集団を濃縮できることが実
証された（図２７）。

【0591】

これらの知見は、２つの異なる転写物に対して指向する２つの操作されたｓｈＲＮＡｍ
ｉＲが、単一コピー標的挿入を介してＴ細胞に送達可能なこと、および両方のｓｈＲＮＡ
ｍｉＲ遺伝子が、一方のｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子のみを発現する対照と比較して、性能に
ほとんどまたは全く差がなく同時に機能し得ることを示す。

【0592】

実施例１２
ＣＡＲ、ＨＬＡ－ＥおよびｓｈＲＮＡｍｉＲをコードする構築物の単一ゲノム遺伝子座
への標的挿入

【0593】

同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞持続性を改善し、潜在的なＮＫ細胞殺滅に対するそれらの感受
性を低下させるためのアプローチにおける、ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の使用をさらに評価
する研究を行った。これらの研究では、前述のＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレア
ーゼを使用して、４つの候補構築物をＴＲＣ １－２認識部位においてＴ細胞に挿入した
。各構築物は、腫瘍抗原標的化のためのＣＤ１９特異的ＣＡＲ遺伝子（実施例１に記載さ
れているが、配列番号７３のシグナルペプチドを含むように改変されている）、ＭＨＣ
Ｉ発現を低下させ、アロ反応性Ｔ細胞を回避するように最適化されたＢ２Ｍ特異的ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲ（前述の７２８９構築物で使用されるものと同じもの）、およびＮＫ細胞溶解
を阻害するためのＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質遺伝子を含んでいた。図２８に示す構築物７
３１６１～７３１６４は、プロモータ使用および転写終結の点で違いのある異なる構成で
これらの３つのエレメントを組み込んでいる。

【0594】

構築物７３１６１（図２８ Ａ）は、ＪｅＴプロモータ（配列番号６７）を使用して、
ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質（配列番号６６）、およびｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子の
発現を、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナル（標識ＢｉｐＡ；配列番号６８）で終結する単一
転写物として駆動する。ｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＨＬＡ－Ｅ ０３－０１対立遺伝子のエク
ソン接合部に挿入された合成イントロン（配列番号６９）にコードされている。イントロ
ンはスプライシングで切り出され、核マイクロＲＮＡ生合成機序によってプロセシングさ
れるが、ＣＡＲ－ＨＬＡ－Ｅ転写物の残りはサイトゾルに輸送され、タンパク質に翻訳さ
れる。Ｐ２Ａ／フューリン部位（配列番号７０）は、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅ融合ポリペ
プチドの分離を可能にする。

【0595】

構築物７３１６２～１６４（図２８Ｂ～図２８Ｄ）は、Ｐ２Ａ／フューリン切断部位を
使用しないが、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅの発現を駆動するために別々のプロモータに依存
する。７３１６２では、ｓｈＲＮＡｍｉＲイントロンはＣＡＲ遺伝子に移動し、その両方
がＪｅＴプロモータによって制御され、ＢｉｐＡによって終結し、ＨＬＡ－Ｅは別個のＪ
ｅＴプロモータによって制御され、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルによって
終結する（配列番号７１）。７３１６３および７３１６４の構築物では、ｓｈＲＮＡｍｉ
Ｒイントロンはこの場合もまたＨＬＡ－Ｅにコードされ、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅの発現
は別々のプロモータおよびターミネータによって制御される。７３１６３では、ＣＡＲ遺
伝子はＪｅＴプロモータによって制御され、ＢｉｐＡによって終結し、ＨＬＡ－Ｅ発現は
ＥＦ１αコアプロモータ（配列番号７２）およびＢＧＨターミネータによって制御される
。７３１６４では、両方の遺伝子は、別個のＪｅＴプロモータ、およびＢｉｐＡ（ＣＡＲ
）またはＢＧＨ（ＨＬＡ－Ｅ）ターミネータのいずれかによって制御される。４つすべて
の構築物において、ＣＡＲ遺伝子は、編集されたＴ細胞の表面上のＣＡＲ密度を増加させ
るように最適化されたシグナルペプチド（配列番号７３）を含む。

【0596】

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後
３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼ（ＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２）をコー
ドするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直後に２５０００ウイルスゲノム／細胞の
ＭＯＩでＡＡＶベクターを用いて形質導入した。細胞に、ＡＡＶ７２０６または７３１６
１～７３１６４のうちの１つを投与した。さらに、刺激されたＴ細胞の他のサンプルに、
ＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２、および内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするヌクレアーゼＢ
２Ｍ １３－１４ｘ．４７９の両方をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションした
。これらの細胞に、ＪｅＴ駆動ＨＬＡ－Ｅ遺伝子をコードし、Ｂ２Ｍ１３－１４部位に隣
接する領域に相同な挿入を指向させるＡＡＶ７２０６およびＡＡＶ７３４６（前述）を用
いて形質導入した。これらの細胞は、ダブルノックアウト、ダブルノックイン（ｄＫＯ
ｄＫＩ）と呼ばれる。

【0597】

編集およびＡＡＶ形質導入の６日後、細胞を、先に記載された試薬、ハードウェア、ソ
フトウェアおよび手順を使用して、ＣＡＲ、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＥおよびＣＤ３の
表面発現についてフローサイトメトリによって分析した。

【0598】

ＴＲＡＣ編集ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度、ならびにＣＡＲ染色の強度を評価し、図２９の表
にまとめた。ＣＤ１９特異的ＣＡＲのみを発現する７２０６対照と比較して、構築物７３
１６１および７３１６３は遜色がなかったが、構築物７３１６２および７３１６４はＣＤ
３－／ＣＡＲ＋集団を産生したが、効率的ではなかった。すべての実験構築物は、７２０
６よりも高いＣＡＲ表面発現レベルが確認された（任意の蛍光単位で列挙したＭＦＩなら
びに７２０６シグナルのパーセンテージ）。これは、リーダーペプチド配列に対して行わ
れた改善に起因する可能性がある。

【0599】

すべての実験構築物は、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲの発現および可変レベルのＨＬＡ－
Ｅ発現から生じる、ＨＬＡ－ＡＢＣの等しく効率的なノックダウン（８９～９０％、図３
０）が確認された。注目すべきことに、７３１６２および７３１６４の構築物は、ＨＬＡ
－Ｅを発現するＣＤ３－／ＣＡＲ－集団の集団を生じさせた。この観察結果は、これらの
サンプルにおけるＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞のより低い相対頻度と相まって、ベクターの左
半分（ＣＡＲをコードする）または右半分（ＨＬＡ－Ｅ）のいずれかを欠く不完全なイン
サートが産生され、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされたことを示す。配列分析（図
示せず）により、組換え事象が、ベクター中に存在し得る同一の配列によって駆動された
ことが確認される。断片化は、２つのＪｅＴプロモータを含むベクター７３１６２および
７３１６４で観察されたが、同様のサイズのベクター、例えば反復同一配列を含まない７
３１６３からはインタクトなインサートのみが検出される。ＨＬＡ－ＡＢＣの効率的なノ
ックダウンはまた、ｓｈＲＮＡｍｉＲをイントロンに配置することが許容され、ＲＮＡｉ
機能を損なわないことを示唆する。

【0600】

要約すると、これらの研究は、ＣＡＲ Ｔ細胞において３つの異なる機能を支援するい
くつかの構築物の有効性を実証している（すなわち、ＣＡＲの高発現、ＨＬＡ－Ｅの高発
現、およびＨＬＡ－ＡＢＣの効率的なノックダウン）。ＨＬＡ－Ｅの発現およびＢ２Ｍ（
したがって、ＨＬＡ－ＡＢＣ）のノックダウンの両方が、ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＫ細胞殺滅
から保護するように潜在的に作用し得る。重要なことに、これらの多成分構築物のそれぞ
れは、単一のヌクレアーゼを使用してゲノム内の単一の遺伝子座に挿入することができ、
第１のヌクレアーゼを使用してＣＡＲ遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子座に挿入し、第２のヌクレ
アーゼを使用してＨＬＡ－Ｅ遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座に別々に挿入するための多重遺伝子
編集の必要性を回避する。さらに、ＨＬＡ－Ｅ染色のシグナル強度は、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子
がＢ２Ｍ１３－１４部位に挿入されている本発明者らの以前に記載されたｄＫＯ ｄＫＩ
細胞よりも多遺伝子実験サンプル（構築物７３１６１～７３１６４）において大きいこと
が分かった（図３０の表の第５列に報告されているＭＦＩを参照されたい）。本発明者ら
は、ｄＫＯ／ｄＫＩ細胞で観察されるＨＬＡ－Ｅ発現レベルによりＮＫ細胞溶解からの保
護を達成できることを知っているので、本発明者らは、構築物７３１６１および７３１６
３によって支持されるＨＬＡ－Ｅ発現レベルが保護も付与すると予想する。

【0601】

最後に、これらの実験は、均質なベクター、ＡＡＶ調製、および細胞表現型を達成する
ために、導入遺伝子における同一の反復配列の使用を回避することによって、部分的なベ
クター喪失をもたらす分子内相同性によって駆動される組換え事象を最小化しなければな
らないことをさらに示す。

【0602】

実施例１３
ＣＡＲ／ＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の評価

【0603】

この研究では、ＣＡＲ Ｔ細胞を調製し、実施例１２に記載されるようにＣＡＲ、ＨＬ
Ａ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅの表面発現について評価した。ここで、構築物７２０６、７
３１６１、または７３１６３をＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ １－２部位に挿入した。ＨＬＡ
－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅの発現レベルの比較として、さらなる対照細胞（ｄＫＯ／ｄＫ
Ｉ）を含めた。これらの対照ｄＫＯ／ｄＫＩ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２部位
に挿入されたＣＤ１９－ＣＡＲ ７２０６構築物と、Ｂ２Ｍ遺伝子のＢ２Ｍ １３－１４
部位に挿入されたＨＬＡ－Ｅ構築物とを有していた。

【0604】

表にしたフローサイトメトリデータを図３１に示す。７３１６１および７３１６３で調
製した培養物中のＣＤ３－ＣＡＲ＋細胞の頻度は、導入遺伝子を発現するＴＲＡＣ編集細
胞（ＫＯ中のＫＩ）の頻度と同様に、対照（７２０６）に比肩した。ＣＡＲシグナルのＭ
ＦＩは、７３１６１および７３１６３で生成されたサンプルでは、７２０６またはｄＫＯ
／ｄＫＩサンプルよりも約２．５倍高く現れた。７３１６１および７３１６３で生成され
たＣＡＲ＋細胞は、ＨＬＡ－ＡＢＣ ＭＦＩの９０％超の減少を示し、それらの大部分は
ＨＬＡ－Ｅも発現する。ＨＬＡ－Ｅ＋ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度およびＭＦＩの両方が、７３
１６１の調製物でより高かった。まとめると、これらの結果は、ベクター７３１６１およ
び７３１６３が、７２０６よりも高いＣＡＲ発現、高度のＨＬＡ－ＡＢＣノックダウン、
およびｄＫＯ／ｄＫＩアプローチよりも高いＨＬＡ－Ｅレベルを支援することを示し、こ
れはインビボでのＮＫ細胞殺滅からのより大きな回避をもたらし得る。

【0605】

実施例１４
セクション３．２の実験－アロ反応性Ｔ細胞に対する保護のインビトロ評価

【0606】

この研究では、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子を備えている場
合、ＣＡＲ Ｔ細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）殺
滅から逃れる能力を評価した。最初に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、他の箇所に記載のベクター７
２０６、７２８９、７３１６１または７３１６３を使用して作製した。Ｂ２Ｍ ＫＯ Ｔ
細胞およびＢ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ細胞は、Ｂ２Ｍ特異的メガヌクレアーゼと、
ＪｅＴプロモータによって駆動されるＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質をコードするＢ２Ｍ特異
的修復ベクターとを使用して作製した。すべてのＣＡＲ Ｔ変異体を、同じドナーから収
集された細胞（ＨＣ６３６６）から作製した。

【0607】

次に、２人の非血縁ドナー由来のナイーブＴ細胞（Ｋ２９１６およびＫ３２１２）をＨ
６３６６アロ抗原に対して感作した。簡潔には、ＨＣ６３６６由来の単球を、組換えヒト
ＧＭ－ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびＩＬ－４（４００Ｕ／ｍｌ
－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下で６日間培養して、樹状細胞様ＡＰＣに分化させた。Ａ
ＰＣを収集し、Ｋ３２１２およびＫ２９１６由来のナイーブＴ細胞と５：１のＴ：ＡＰＣ
比で共培養した。ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）を２４時間後に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで
培養物に添加した。プレーティングの１週間後、同種抗原感作Ｔ細胞を収集し、ＣＤ４枯
渇によってＣＴＬを濃縮した（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅ
ｎｙｉ）。ＣＡＲ Ｔ変異体を１ｕＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍ
ｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、次いで、図３２に示す比で各ドナー由来の同種抗原プライ
ムＣＴＬと共にプレーティングした。この共培養を２０～２４時間行い、その時点でサン
プルを１ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で標識し、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓを用いて各サンプル中の色素陽性生細胞の数を計数
した。ゼロエフェクター対照を使用して殺滅パーセントを決定した。

【0608】

図３２では、Ｋ３２１２（パネルＡ）またはＫ２９１６（パネルＢ）のＣＴＬによるＣ
ＡＲ Ｔ細胞の殺滅が示されている。広範な殺滅が、対照（７２０６）ＣＡＲ Ｔ細胞に
対して観察された。低いＥ：Ｔ比（１：１未満）は２５～５０％の殺滅をもたらしたが、
１を超えるＥ：Ｔはこのアッセイでの最大殺滅：５０～６０％を支援した。Ｂ２Ｍ特異的
ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞はＣＴＬ殺滅を受けにくく、７３１６３ Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞において最大２０％、７３１６１ ＣＡＲ Ｔ細胞において最大１０％であ
った。

【0609】

ＣＡＲ Ｔ変異体に対するＮＫ活性を評価するために、ＣＤ５６陽性選択キット（Ｓｔ
ｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、同じドナー（ＨＣ６３６６）お
よび非血縁ドナー（Ｋ７９９）由来のＰＢＭＣからＮＫ細胞を磁気的に濃縮し、１０ｎｇ
／ｍｌ ＩＬ－１５（Ｇｉｂｃｏ）中で４８時間培養した。ＣＡＲ Ｔ標的細胞をＣｅｌ
ｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（上記）で標識し、図３３に指定された比でＮＫ細胞と一
緒にプレーティングした。共培養を、ＸＶＩＶＯ１５＋５％ ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍ
ｌ ＩＬ－２中で４～５日間行った。プレーティングの４～５日後、培養物を１ｕｇ／ｍ
ｌのヨウ化プロピジウムで標識し、生存ＣＡＲ Ｔ標的を上記のように計数した。Ｂ２Ｍ
ＫＯ細胞および７２８９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｓｈＲＮＡｍｉＲ単独）は、ドナー一致Ｎ
Ｋ細胞および不一致ＮＫ細胞の両方によってほぼ根絶され（９０％超の殺滅）、殺滅を、
正常なＨＬＡ－ＡＢＣレベルまたはＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子のいずれかの欠如に関連づけら
れる。正常なＨＬＡ－ＡＢＣ発現を有するＣＡＲ Ｔ細胞（７２０６）のＮＫ殺滅は非常
に低かった（１０％未満）か、または検出されなかった。ＨＬＡ－ＡＢＣを欠くが、ＨＬ
Ａ－Ｅ導入遺伝子を発現するＣＡＲ Ｔ変異体は、ＮＫ細胞溶解に対する感受性が変化し
た。自己ＮＫ細胞と共に培養した場合、７３１６３ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＢ２ＭＫＯ／
ＨＬＡ－Ｅ＋細胞は中程度に保護され（３０～４０％の殺滅）、７３１６１ ＣＡＲ Ｔ
細胞は堅固に保護された（１０％未満の殺滅）。同種異系ＮＫ細胞を用いて行った実験で
は、Ｂ２ＭＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ＋細胞および７３１６１細胞の殺滅は検出されなかった。

【0610】

これらの観察は、構築物７３１６１および７３１６３が、細胞をＮＫ殺滅に対して感作
することなく、同種抗原特異的ＣＴＬに対する保護を付与することを示している。さらに
、この保護は、単一の遺伝子編集を使用してＴＲＡＣ遺伝子座に挿入される単一の組換え
ＡＡＶベクターによって提供され得る。

【0611】

実施例１５
Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡｍｉＲ／ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性

【0612】

ｓｈＲＮＡｍｉＲおよびＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子の包含がＣＡＲ Ｔ細胞の殺腫瘍活性を
損なわないことを実証するために、本発明者らは、ＮＡＬＭ／６白血病細胞を移植した免
疫不全マウスにおいて腫瘍殺滅を経時的にモニターするインビボ実験を行った。ＮＯＤ．
Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス（ＮＯＤ．ｓｃｉｄ
．γ鎖 ＫＯまたはＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し
、ホタルルシフェラーゼを発現する５×１０^５個のＮＡＬＭ／６細胞（Ｉｍａｎｉｓ）を
尾静脈を介して注射した。腫瘍移植の６日後、動物にｄ－ルシフェリンを注射し、ＩＶＩ
Ｓ ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光を測定した。腫瘍生着を確
認した後、マウスを、７２０６対照導入遺伝子（ＣＤ１９ ＣＡＲのみ）、７２８９導入
遺伝子、７３１６１導入遺伝子または７３１６３導入遺伝子のいずれかを担持する１×１
０^６個または５×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞（他の箇所に記載されるように作製される）
で処置した。動物の１つの群にビヒクル対照（２％ヒト血清アルブミンを補充した生理食
塩水）を投与した。マウスを、発光については縦方向で、および体重についてモニターし
た。ＩＡＣＵＣ承認のヒューマンエンドポイントを使用して生存期間を決定した。発光測
定値を図３４に示し、生存率を図３５にプロットする。

【0613】

ビヒクル対照を投与された動物は、ＮＡＬＭ／６の生着後およそ２７日目にエンドポイ
ントに達するまで、処置後に発光の増加を示した。ＣＡＲ Ｔ介入を施されたマウスは、
ＣＡＲ Ｔ用量に比例する持続時間および大きさで、一時的に発光の低下を示した。これ
は延命効果を伴い、１×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたマウスは３５～４２日生
存し、５×１０^６個の細胞を投与されたマウスは５２日から６０日を超えて生存する。用
量サイズ以外に、処置群間の発光または生存に対する有意な寄与は観察されなかった。こ
の研究は、構築物７３１６１および７３１６３を使用して作製されたＣＡＲ Ｔ細胞が、
７２０６ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等の有効性を有することを示す。

【0614】

実施例１６
ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の非ウイルスＤＮＡトランスフェクションによるＤＣ
Ｋ ｓｈＲＮＡｍｉＲのスクリーニング

【0615】

これらの研究は、ＤＣＫを安定にノックダウンするためのｓｈＲＮＡｍｉＲとしての異
なるガイド配列およびパッセンジャー配列を評価するために開始した。この目的は、ＣＡ
Ｒ Ｔ細胞におけるＤＣＫのノックダウンが、ＣＡＲ Ｔリンパ球枯渇レジメンにおいて
一般的に使用されるフルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体の存在下でのＣＤ３－
／ＣＡＲ＋集団の濃縮を可能にするかどうかを決定することであった。

【0616】

この研究で利用された導入遺伝子は、ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモ
ータ（実施例１で前述）と、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルで終結する単一転写物として
のｓｈＲＮＡｍｉＲ遺伝子とを含んでいた。導入遺伝子は、導入遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子
のＴＲＣ１－２切断部位に挿入するように指向させる相同アームによって両側で挟まれて
いた。ｓｈＲＮＡｍｉＲについては、５つのＤＣＫガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖
配列を同定し、ｍｉＲ－Ｅ骨格にクローニングし、ＣＡＲの終止コドンと双方向ＳＶ４０
ポリＡ転写ターミネータとの間でＣＤ１９－ＣＡＲ構築物に挿入した。別個の実験では、
この研究で評価されたＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＤＣＫ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲを含
まないＣＤ１９ ＣＡＲ発現対照細胞の内因性ＤＣＫレベルと比較した場合、７０％（７
２１３６）、４０％（７２１３７）、３５％（７２１３８）、６０％（７２１４０）の低
下を示した（７２０６）。これらのＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、フルダラビンで処
理した場合のＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団を濃縮する能力について試験した。

【0617】

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、静置した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣ
ｕｌｔ（商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－
２（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性
化した。刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、ＴＲＡＣ遺伝子中
のＴＲＣ １－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガヌクレア
ーゼをコードするＲＮＡ １μｇをエレクトロポレーションした。５つのＣＡＲ－ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲ構築物（構築物７２１３６～７２１４０）を、ヌクレオフェクション中にＴＲ
Ｃ １－２ヌクレアーゼ ＲＮＡと同時に線状化ＤＮＡ（１μｇ／１×１０^６細胞）とし
てＴ細胞に送達した。エレクトロポレーションした細胞を、５％ウシ胎児血清および３０
ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養した。

【0618】

ヌクレオフェクション後４日目に、２．５ｅ５の生存細胞を、９６丸底プレート中で広
範囲の用量のフルダラビンで処理した；１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉ
ｂｃｏ）を補充した完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地中５０ｕＭ、５ｕＭ、０．５ｕＭ、
０．０５ｕＭ、０．００５ｕＭ、および未処理対照。未処理対照には、最高用量のフルダ
ラビンに等しい体積のＤＭＳＯを投与した。処理の２日後、９６ウェルプレートを遠心沈
殿させ、薬物を含有する培地を捨て、細胞を９６ウェルプレートから４８ウェルプレート
に移し、新鮮な完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地、サイトカインおよびフルダラビン（い
かなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）で処理した。フルダラビンによる処理後
６日目に、２００ｕＬのサンプルを染色のために各ウェルから取り出し、残りの細胞を遠
心沈殿させ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）およびフルダラビ
ン（いかなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）を補充した新鮮な完全ＸＶＩＶＯ
（商標）１５培地で処理した。フルダラビンによる処理後６日目および１０日目に、２０
０ｕＬの培養物のサンプルを抗ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃｌｏｎｅ ＵＣＨ
Ｔ１）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）で
染色した。

【0619】

図３６は、フローサイトメトリによって試験した異なる用量のフルダラビンでプロット
したＫＯ中のＫＩ％を示し、表３の対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの下にも列挙する。ＫＯ中
のＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義
される。表にしたデータは、フルダラビンによる処理後１０日目に取得した。ＤＣＫ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲでは、漸増用量のフルダラビンによる処理は、ＣＤ３－
／ＣＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表３で観察す
ることができる。７２１３９を除いて、すべてのＤＣＫノックダウン構築物は、５ｕＭの
フルダラビン用量で７０％を超えるＫＯ中のＫＩを示した。用量５０ｕＭのフルダラビン
は、細胞に対して毒性が高すぎた。図３７は、ＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の事象／ｕＬ対フ
ルダラビンの濃度（ｕＭ）を示し、ＫＯ中のＫＩ％と相関する。最も高いＫＯ中のＫＩパ
ーセントおよび事象／ｕＬは、フルダラビン用量５ｕＭにおいて見られた。

【0620】

【表3】

【0621】

７２１３６、７２１３８にコードされた候補配列を、ＡＡＶを使用してさらなる実験で
調査した。

【0622】

この実験は、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＤＣＫをノックダウンすることにより、フル
ダラビンの存在下でＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の濃縮が可能になることを実証した。この非
ウイルスアプローチによって試験された５つのＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物のうち４
つは、用量５ｕＭのフルダラビンによる１０日間の処理が７０％を超えるＫＯ中のＫＩを
もたらしたことを示した。フルダラビンは、ＣＡＲ Ｔの投与前に患者をリンパ球枯渇さ
せるためにシクロホスファミドと共に一般的に使用される。この研究は、ｓｈＲＮＡｍｉ
ＲでＤＣＫをノックダウンすることにより、ＣＡＲ Ｔ細胞がフルダラビンに対して耐性
になり、それらの濃縮が可能になるという概念実証を提供する。臨床的には、ＤＣＫ ｓ
ｈＲＮＡｍｉＲの包含は、同種異系フルダラビン耐性ＣＡＲ Ｔの投与後の患者へのフル
ダラビンの継続的投与を可能にし、したがって宿主免疫応答を抑制し、これらの薬物耐性
ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボでより大きな増殖および持続性を有することを可能にし得る。
したがって、ＤＣＫをノックダウンする潜在的な臨床的利点は、同種異系薬物耐性ＣＡＲ
Ｔ細胞の活性の治療域の拡大を可能にし得るが、同時に、フルダラビンとＣＡＲ Ｔ療
法との相乗的抗腫瘍活性も可能にし得る。

【0623】

実施例１７
ＣＡＲ Ｔ細胞の表現型および抗腫瘍活性に対する、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＤＣＫノ
ックダウンの効果

【0624】

これらの研究は、ＡＡＶ形質導入後にＤＣＫを安定にノックダウンするためのｓｈＲＮ
ＡｍｉＲ（構築物７２１３６および７２１３８）としての異なるガイド配列およびパッセ
ンジャー配列を評価するために開始した。この目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞の表現型および抗
腫瘍活性に対するＤＣＫノックダウンの効果を決定することであった。

【0625】

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を、前述のように解凍し、静置し、活性化した。活性化後
３日目に、細胞に、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼであるＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２をコ
ードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、直後に２００００ウイルスゲノム／細胞
のＭＯＩでＡＡＶベクターを用いて形質導入した。細胞に、ＡＡＶ７２０６、または７２
１３６もしくは７２１３８を投与したか、またはＡＡＶを与えなかった（ＴＲＣ １－２
Ｌ．１５９２のみを投与した）。形質導入の３日後、ＣＡＲ Ｔ表現型を、抗ＣＤ３－
ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１）、抗ＦＭＣ６３－ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ
６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）、抗ＣＤ４－ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、
クローンＯＫＴ４）、抗ＣＤ８ａ－ＢＶ７８５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＳＫ１）
、抗ＣＤ６２Ｌ－ＢＳ５１５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＤＲＥＧ－５６）
、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ／シアニン７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＬ１）、抗
ＣＤ２７－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯ３２３）で染色することによっ
て研究した。サンプルをフローサイトメトリによって試験し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－Ｓでデ
ータを取得した。

【0626】

２．５ｅ５の生存細胞を４８ウェルプレートにおいて以下の用量のフルダラビンで処理
した：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全Ｘｕｒｉ
培地中、１２ｕＭ、６ｕＭ、３ｕＭおよび未処理対照。注：未処理対照には、最高用量の
フルダラビンに等しい体積のＤＭＳＯを投与した。処理後４日目に、細胞数を得て（図３
８に示す）、１ｅ６生存細胞を遠心沈殿させ、上清を捨て（６ｕＭおよび１２ｕＭのフル
ダラビンで処理したサンプルＴＲＣおよび７２０６を除く）、細胞を新しい４８ウェルプ
レートに移し、新鮮な完全Ｘｕｒｉ培地、サイトカイン、＋／－フルダラビンで処理した
。フルダラビンによる処理後８日目に、上記のようにＣＡＲ Ｔ表現型染色のためにサン
プルを採取した。残りの細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＣＤ３
陽性選択キットを使用してＣＤ３を枯渇させた。ＣＤ３－画分を保持し、１０ｎｇ／ｍＬ
のＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇｉｂｃｏ）を補充した完全Ｘｕｒｉ培地で培養し、フルダ
ラビンによるさらなる処理を行わなかった。形質導入後１４日目、ＣＡＲ Ｔ表現型染色
のためにサンプルを採取し、その後ＡＣＥＡアッセイをセットアップした（上記のパネル
参照）。これは、ＣＤ３－ＣＡＲ＋の％が、エフェクターとして加えるべきＣＡＲ Ｔの
正確な数を決定するために必要とされるからである。形質導入後１５日目に、エフェクタ
ー細胞として３または６ｕＭのフルダラビンで未処理の、または処理した７２１３６また
は７２１３８（ＤＣＫノックダウンＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ）または７２０６（ＣＤ１９
ＣＡＲ Ｔ）、および標的細胞としてＣＤ１９を発現するＨＥＫ ２９３使用して、ＡＣ
ＥＡ殺滅アッセイを設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使
用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。実験を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比２：
１、１：２および１：４で設定した。

【0627】

形質導入（フルダラビンによる前処理）後３日目のＣＡＲ Ｔ表現型をフローサイトメ
トリによって試験し、以下の表４に要約する。ＫＯ中のＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／
ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義される。Ｔナイーブ（Ｔｎ）、Ｔセ
ントラルメモリー（Ｔｃｍ）／Ｔトランジションメモリー（Ｔｔｍ）、Ｔエフェクターメ
モリー（Ｔｅｍ）についてのＣＤ４：ＣＤ８比および頻度を表４に報告する。ＴｎはＣＤ
６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ－（低）であり、一方、ＴｃｍはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋（
中）であり、ＴｔｍはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋（高）であり、ＴｅｍはＣＤ６２Ｌ
－、ＣＤ４５ＲＯ＋である。フルダラビンによる処理前のＣＡＲ Ｔ表現型は、以下に示
すように、７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲ）と７２１３６、７２１３８（ＤＣＫ ｓｈＲＮ
ＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ）との間で変化しないままである。

【0628】

【表4】

【0629】

図３８は、フルダラビンによる処理後４日目に得た生細胞数／ｍＬを示す。ＴＲＣのみ
（ＡＡＶなし）または７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲ ＡＡＶ）では、７２１３６および７
２１３８（ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ ＡＡＶ）と比較して
、漸増用量のフルダラビンによる処理後に細胞数の５０％以上の減少が見られた。

【0630】

フルダラビンによる処理後８日目のＣＡＲ Ｔ表現型をフローサイトメトリによって試
験し、下記の表５に報告する。図３９は、フルダラビンによる処理後８日目に得た生細胞
数／ｍＬを示す。ＤＣＫノックダウンにより、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡ
Ｒ Ｔ細胞は、ＴＲＣヌクレアーゼのみ（ＡＡＶなし）および７２０６（ＣＤ１９－ＣＡ
Ｒ ＡＡＶ）と比較して、フルダラビンの存在下でより生存可能であった。ＤＣＫ ｓｈ
ＲＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲ Ｔでは、漸増用量のフルダラビンによる処理はＣＤ３－
／ＣＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表５において
観察することができる。Ｔナイーブ（Ｔｎ）、Ｔセントラルメモリー（Ｔｃｍ）／Ｔトラ
ンジションメモリー（Ｔｔｍ）、Ｔエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）についてのＣＤ４：
ＣＤ８比および頻度もまた報告する。未処理またはフルダラビンで処理したサンプルの間
で、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲのＣＡＲ Ｔ表現型に有意差
は観察されなかった。しかしながら、ＣＤ１９ ＣＡＲ（７２０６）では、フルダラビン
による処理時のＣＤ４およびＣＤ８表現型は、セントラルメモリーからトランジションメ
モリーへ移行し、およびエフェクターメモリー表現型に移行する。これは、ＤＣＫノック
ダウンおよびフルダラビンによる処理がＣＡＲ Ｔ細胞表現型に対して有意な効果を全く
有さなかったことを示す。

【0631】

【表5】

【0632】

図４０は、ＡＣＥＡアッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理または３および
６ｕＭのフルダラビンで処理した７２０６（ＣＤ１９－ＣＡＲ）を使用した（ＴＲＣに対
して正規化した）細胞溶解％を示す。ＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３を標的細胞とした
。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２および１：４で設定した。細胞溶解の陽性対照として
Ｔｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。フルダラビンによる処理の＋
／－にかかわらず、最も効率的な殺滅は、Ｅ：Ｔ比２：１で見られた。Ｅ：Ｔ比１：２、
１：４では、未処理と比較して、漸増用量のフルダラビンの存在下では効率の悪い殺滅が
見られた。

【0633】

図４１は、ＡＣＥＡアッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理、または３ｕＭ
もしくは６ｕＭのフルダラビンで処理した７２１３８（ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現
するＣＤ１９－ＣＡＲ）を使用した（ＴＲＣに対して正規化した）細胞溶解％を示す。Ｃ
Ｄ１９を発現するＨＥＫ２９３を標的細胞とした。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２およ
び１：４で設定した。細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照として
ＴＲＣを使用した。フルダラビン処理の有無にかかわらず、Ｅ：Ｔ比２：１、次いで１：
２、次いで１：４で最も効率的な殺滅が見られたことが観察された。図４２は、ＡＣＥＡ
アッセイにおけるエフェクター細胞として、未処理、または３ｕＭもしくは６ｕＭのフル
ダラビンで処理した７２１３６（ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ
）を使用した（ＴＲＣに対して正規化した）細胞溶解％を示す。ＣＤ１９を発現するＨＥ
Ｋ２９３を標的細胞とした。実験を、Ｅ：Ｔ比２：１、１：２および１：４で設定した。
細胞溶解の陽性対照としてＴｒｉｔｏｎを使用し、陰性対照としてＴＲＣを使用した。フ
ルダラビン処理の有無にかかわらず、Ｅ：Ｔ比２：１、次いで１：２、次いで１：４で最
も効率的な殺滅が見られたことが観察された。

【0634】

最後に、ＤＣＫ ｓｈＲＮＡｍｉＲを発現するＣＤ１９－ＣＡＲ（７２１３６、７２１
３８）は、フルダラビンで処理した場合、Ｅ：Ｔ比１：２でＣＤ１９ ＣＡＲよりもより
効率的な殺滅を示した。これは、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用するＤＣＫノックダウンおよび
フルダラビンによる処理が、ＣＤ１９－ＣＡＲの抗腫瘍活性に対して相乗効果を有するこ
とを実証した。

【0635】

実施例１８
ＣＡＲ／ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物の非ウイルスＤＮＡトランスフェクションによるグル
ココルチコイド受容体ｓｈＲＮＡｍｉＲのスクリーニング

【0636】

これらの研究は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）を安定にノックダウンするための
ｓｈＲＮＡｍｉＲとしての異なるガイド配列およびパッセンジャー配列を評価するために
開始した。目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＧＲのノックダウンが、ＣＡＲ Ｔ細胞療法
に関連し得るサイトカイン放出症候群の治療において一般に使用されるデキサメタゾンな
どのコルチコステロイドの存在下でのＣＤ３－／ＣＡＲ＋集団の濃縮を可能にするかどう
かを決定することであった。

【0637】

この研究で利用された導入遺伝子は、ＣＤ１９－ＣＡＲの発現を駆動するＪｅＴプロモ
ータと、双方向ＳＶ４０ポリＡシグナルで終結する単一転写物としてのｓｈＲＮＡｍｉＲ
遺伝子とを含んでいた。導入遺伝子は、導入遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子のＴＲＣ１－２切断
部位に挿入するように指向させる相同アームによって両側で挟まれていた。ｓｈＲＮＡｍ
ｉＲについては、９つのＧＲガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列を同定し、ｍｉＲ
－Ｅ骨格にクローニングし、ＣＡＲの終止コドンと双方向ＳＶ４０ポリＡ転写ターミネー
タとの間でＣＤ１９－ＣＡＲ構築物に挿入した。別個の実験では、この研究で評価された
ＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現したがＧＲ標的化ｓｈＲＮＡｍｉＲ
を含まない対照細胞（７２０６）の内因性ＧＲレベルと比較した場合、３７％（７２１４
２）、４５％（７２１４３）、５０％（７２１４５）および５６％（７２１４９）の低下
を示した。これらのＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲ配列を、デキサメタゾンで処理した場合のＣ
Ｄ３－／ＣＡＲ＋集団を濃縮する能力について試験した。

【0638】

凍結保存したＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、静置した。Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（
商標）Ｔ細胞刺激因子（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５％ウシ胎児血清および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｇｉ
ｂｃｏ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。
刺激の３日後、細胞を収集し、１×１０^６細胞のサンプルに、Ｔ細胞受容体アルファ定常
遺伝子中のＴＲＣ １－２認識配列を認識して切断するＴＲＣ １－２Ｌ．１５９２メガ
ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ １μｇをエレクトロポレーションした。９つのＣＡＲ
－ｓｈＲＮＡｍｉＲ構築物（構築物７２１４２、７２１４３、７２１４５、７２１４６、
７２１４８～７２１５２）を、ヌクレオフェクション中にＴＲＣ１－２ヌクレアーゼＲＮ
Ａと同時に、線状化ＤＮＡ（１μｇ／１×１０^６細胞）としてＴ細胞に送達した。エレク
トロポレーションした細胞を、５％ウシ胎児血清および３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２を添加
したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養した。

【0639】

ヌクレオフェクション後８日目に、２．５ｅ５の生存細胞を、９６丸底プレート中で広
範囲の用量のデキサメタゾンで処理した；１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、ＩＬ－２１（Ｇ
ｉｂｃｏ）を補充した完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地中１００ｕＭ、１０ｕＭ、１ｕＭ
、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、および未処理対照。注：未処理対照には、最高用量のデキ
サメタゾンに等しい体積の９５％エタノールを投与した。処理の３日後、９６ウェルプレ
ートを遠心沈殿させ、薬物を含有する培地を捨て、細胞を９６ウェルプレートから４８ウ
ェルプレートに移し、新鮮な完全ＸＶＩＶＯ（商標）１５培地、サイトカインおよびデキ
サメタゾン（いかなる薬物も与えなかった未処理対照は除いて）で処理した。デキサメタ
ゾンによる処理後７日目に、染色のために各ウェルから２００ｕＬのサンプルを取り出し
た。サンプルを、抗ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１）、抗ＦＭ
Ｃ６３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローンＶＭ１６、自社生産）で染色し、Ｃｙｔ
ｏＦＬＥＸ－ＬＸでフローサイトメトリによって試験した。

【0640】

図４３は、フローサイトメトリによって試験した異なる用量のデキサメタゾンでのＫＯ
中のＫＩパーセントを示し、表６の対応するｓｈＲＮＡｍｉＲの下に列挙する。ＫＯ中の
ＫＩパーセントは、（ＣＤ３－／ＣＡＲ＋％）／（総ＣＤ３－％）×１００として定義さ
れる。表にしたデータは、デキサメタゾンによる処理後７日目に取得した。ＧＲ ｓｈＲ
ＮＡｍｉＲを発現するＣＡＲでは、漸増用量のデキサメタゾンによる処理はＣＤ３－／Ｃ
ＡＲ＋集団の濃縮をもたらし、ＫＯ中のＫＩパーセントの増加によって表６において観察
することができる。７２１４８を除いて、すべてのＧＲノックダウン構築物は、用量１、
１０ｕＭのデキサメタゾンで３５～５０％のＫＯ中のＫＩを示した。図４４は、デキサメ
タゾンの濃度（ｕＭ）に対してプロットされたＣＤ３－／ＣＡＲ＋の事象／ｕＬ を示す
。ＫＯ中のＫＩパーセントは、事象／ｕＬと相関する。

【0641】

【表6】

【0642】

この実験は、ｓｈＲＮＡｍｉＲを使用してＧＲをノックダウンすることにより、コルチ
コステロイド様デキサメタゾンの存在下でＣＤ３－／ＣＡＲ＋細胞の濃縮が可能になるこ
とを実証した。非ウイルスアプローチによって試験した９つのＧＲ ｓｈＲＮＡｍｉＲの
うち８つは、用量１ｕＭまたは１０ｕＭのデキサメタゾンによる７日間の処理が３５～５
０％のＫＯ中のＫＩをもたらしたことを示した。

【0643】

したがって、これらの実験により、ｓｈＲＮＡｍｉＲによるＧＲのノックダウンがＣＡ
Ｒ Ｔ細胞をデキサメタゾンに対して耐性にし、それらの濃縮を可能にすることが確認さ
れた。臨床的には、コルチコステロイドは、がんのための養子Ｔ細胞療法の投与後に時折
見られる、潜在的に生命を脅かす毒性であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の治療に
おいてトシリズマブと併せて一般に使用される。サイトカイン放出症候群は、いくつかの
サイトカインの循環レベルの上昇に関連する。しかしながら、高用量のコルチコステロイ
ドの投与は、ＣＡＲ Ｔ療法の臨床的有効性を低下させ得る。ＣＡＲ Ｔ細胞をコルチコ
ステロイドに対して耐性にすることによって、ＣＡＲ Ｔ細胞に対するＨｖＧ応答を、Ｃ
ＡＲ Ｔ機能に影響を及ぼすことなく抑制することができ、それによって、活性に対する
可能性の枠を増大させ、安全性を改善する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-08-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

そのゲノム中に、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｍｉＲ）をコードする核酸配列を含む遺伝子改変免疫細胞であって、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞において発現され、該ｓｈＲＮＡｍｉＲが該遺伝子改変免疫細胞における標的タンパク質の発現を低下させる、遺伝子改変免疫細胞。

【外国語明細書】