特開 2024-153703 治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのＢ細胞およびその投薬量

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024153703

(43)【公開日】2024-10-29

(54)【発明の名称】治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのＢ細胞およびその投薬量

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20241022BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20241022BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/87 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/90 20060101ALN20241022BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241022BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 ZNA

A61K45/00

A61K38/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K39/395 N

A61K38/43

A61K38/46

A61P3/00

A61K38/36

A61K39/00 H

C12N5/10

C12N5/0781

A61K35/17

C12N15/09 110

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/87 Z

C12N15/90 Z

C12N15/12

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024115656

(22)【出願日】2024-07-19

(62)【分割の表示】P 2023072284の分割

【原出願日】2018-04-27

(31)【優先権主張番号】62/491,151

(32)【優先日】2017-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】512176646

【氏名又は名称】イミュソフト コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】マシュー レイン ショルツ

(72)【発明者】

【氏名】エリック ジェイ． ハービッグ

(72)【発明者】

【氏名】アール． スコット マカイバー

(72)【発明者】

【氏名】ライアン デ ラート

(72)【発明者】

【氏名】エリック オルソン

(57)【要約】

【課題】治療用タンパク質等、治療剤を産生するように遺伝子改変された自家および／または同種異系Ｂ細胞を投与するための方法を提供すること。
【解決手段】単回の最大有効用量の遺伝子改変Ｂ細胞を投与するための方法、および多回用量の遺伝子改変Ｂ細胞を投与するための方法が、特に開示されている。本明細書に開示されている組成物および方法は、治療剤の長期ｉｎ ｖｉｖｏ送達に有用である。本発明の一態様は、ＭＰＳ Ｉを処置するための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の、ＩＤＵＡを産生するように遺伝子改変Ｂ細胞を、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本願明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／４９１，１５１号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。

【0002】

配列表に関する陳述
この出願に関連する配列表は、紙でのコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、本明細書に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＩＭＣＯ－００６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１０ＫＢであり、２０１８年４月２６日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された。

【0003】

本開示は、抗原特異的抗体またはタンパク質（例えば、酵素）等、治療剤の長期ｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのＢ細胞の使用に関し、特に、Ｂ細胞の単回および多回投薬量の投与に関する。

【背景技術】

【0004】

慢性疾患および障害を処置するための現在の方法は、治療剤の直接的注入（例えば、酵素補充療法）、ウイルスベクターによる遺伝子療法、および幹細胞の養子移入（例えば、造血幹細胞移入）を含む。しかし、これらの方法のそれぞれに不利益がある。組換え治療用タンパク質の注射は、タンパク質の有限の半減期に悩まされ、３種の方法は全て、治療剤による最適に満たない組織浸透をもたらす。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスベクターの注射による等、治療剤を産生するように内在性組織を変更することは一般に、中央集中した位置から産生される治療剤をもたらす。１か所の位置からの治療剤の産生は、産生組織における局在化された毒性の確率を増加させる。その上、組換えウイルスは、外来のものとしてみなされるため、有害反応を引き起こすことなくウイルスベクターを複数回投与することができる可能性は低く、治療剤の正確な投薬量を達成するために単回の注射機会があることを意味する。ウイルスを使用した細胞への核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入等の手順に固有の生物学的変動を考慮すれば、単回注射の制約下で所望の投薬量を達成することは非常に心許ないであろう。

【0005】

近年、導入遺伝子の長期ｉｎ ｖｉｖｏ発現のための分化したＢ細胞組成物の使用は、様々な疾患および障害の処置のための有望な戦略として同定された。しかし、治療剤の送達のための改変Ｂ細胞を投与するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで薬剤の治療有効レベルを達成するために関しては、未だ記載がない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、本技術分野において依然として、多くの慢性疾患および障害のための長期処置の必要がある。本開示は、慢性疾患および障害を処置するために、遺伝子改変Ｂ細胞組成物を投与および投薬するための方法を提供する。本開示は、詳細な説明に記載されている通り、上述および他の利点を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様は、治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ産生のために遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

【0008】

本発明の一態様は、ｉｎ ｖｉｖｏで複数の組織に治療剤を送達するための方法であって、２またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

【0009】

本発明の一態様は、ＭＰＳ Ｉを処置するための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の、ＩＤＵＡを産生するように遺伝子改変Ｂ細胞を、ＭＰＳ Ｉを有する被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

【0010】

本発明の一態様は、ＭＰＳ Ｉを有する被験体におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を低下させるための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の、ＩＤＵＡを産生するように遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

【0011】

本発明の一態様は、ｉｎ ｖｉｖｏで１種または複数の組織に治療剤を送達するための方法であって、１または複数用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含み、遺伝子改変Ｂ細胞が遊走性である、方法を提供する。

【0012】

本発明の一態様は、治療剤の相乗的ｉｎ ｖｉｖｏ産生を可能にするように遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与する方法であって、治療剤の最大ｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導するための、改変Ｂ細胞の最適な単回用量濃度を決定するステップと、改変Ｂ細胞の最適な単回用量濃度を減少させて、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度を得るステップと、２またはそれよりも多い用量の最適に満たない単回用量濃度の改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。

【0013】

本発明の一態様は、治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞を提供する。一部の実施形態では、治療剤は、ＩＤＵＡである。一部の実施形態では、治療剤は、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである。

【0014】

本発明の一態様は、治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞の集団を含む組成物であって、遺伝子改変Ｂ細胞が、最適な遊走能にあるものである、組成物を提供する。一部の実施形態では、治療剤は、ＩＤＵＡである。一部の実施形態では、治療剤は、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである。

【0015】

本発明の一態様は、治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞の集団を含む組成物であって、組成物中の遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著な量の炎症性サイトカインを産生しない時点で培養物から収集される、組成物を提供する。一部の実施形態では、治療剤は、ＩＤＵＡである。一部の実施形態では、治療剤は、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである。

【0016】

本発明の一態様は、治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ産生のために遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与する方法であって、最適な単回用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、治療剤は、ＩＤＵＡである。一部の実施形態では、治療剤は、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ産生のために遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与する方法であって、
２またはそれよりも多い逐次用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目２）
投与ステップが、最適に満たない単回用量濃度で２またはそれよりも多い用量の前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
投与ステップが、３またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に対して自家である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に対して同種異系である、項目１に記載の方法。（項目６）
前記被験体が、ヒトである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記治療剤が、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡコード小分子である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記タンパク質が、酵素、抗体もしくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、細胞表面受容体、分泌タンパク質、シグナル伝達分子、抗原性断片、凝固因子、または接着分子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８－かつＣＤ１３８－である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８＋である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８－である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記投与ステップが、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内注射を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記投与ステップが、静脈内注射を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞において前記治療剤を発現するようにスリーピングビューティートランスポゾンを使用して調製された、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞において前記治療剤を発現するように組換えウイルスベクターを使用して調製された、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記組換えウイルスベクターが、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノ随伴ウイルスをコードする、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞のゲノムへの、前記治療剤をコードするポリヌクレオチド配列の標的化組込みによって調製された、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記標的化組込みが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込み、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性遺伝子組込み、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込みまたはメガヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込みを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリヌクレオチドの前記標的化組込みが、相同組換えにより起こった、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記標的化組込みが、標的ＤＮＡ部位においてＤＮＡ切断を誘導することができるヌクレアーゼのウイルスベクター媒介性送達を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＡＳ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、配列番号１と同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、配列番号１と少なくとも約８５％同一である、または配列番号１と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、培養後２日目または３日目に操作される、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、エレクトロポレーションを含む方法を使用して操作される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における４日目、５日目、６日目または７日目に、被験体への投与のために収集される、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における８日目またはそれよりも後に、被験体への投与のために収集される、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における１０日目またはそれよりも前に、被験体への投与のために収集される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
収集された前記遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著なレベルの炎症性サイトカインを産生しない、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著なレベルの炎症性サイトカインを産生しないことが決定された培養中の時点で収集される、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作前および後の培養期間全体にわたって、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－３１および多量体化ＣＤ４０リガンドのそれぞれを含む培養系において育成される、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記多量体化ＣＤ４０リガンドが、抗ｈｉｓ抗体を使用して多量体化された、ＨＩＳタグ付きＣＤ４０リガンドである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体への前記投与ステップの前に、前記遺伝子改変Ｂ細胞を拡大増殖するステップをさらに含む、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団が、高い程度のポリクロナリティーを示す、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の前記最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．２％未満を構成する、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の前記最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．０５％未満を構成する、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、メトトレキセートに対して増強された耐性を有するヒトＤＨＦＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
メトトレキセートに対して増強された耐性を有する前記ヒトＤＨＦＲ遺伝子が、アミノ酸２２におけるロイシンからチロシンへの置換変異、およびアミノ酸３１におけるフェニルアラニンからセリンへの置換変異を含有する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
投与のための収集の前に、前記遺伝子改変Ｂ細胞をメトトレキセートで処置するステップを含む、項目１～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
メトトレキセートによる前記処置が、１００ｎＭ～３００ｎＭの間である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
メトトレキセートによる前記処置が、２００ｎＭである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に投与されると、多様な組織へと遊走する、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の前記集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される１種または複数の組織へと遊走する、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。（項目４４）
前記被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の前記集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳へと遊走する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞によって産生される前記治療剤が、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）である、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞の前記投与が、前記被験体の多様な組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の低下をもたらす、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞の前記投与が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される前記被験体の１種または複数の組織におけるＧＡＧの低下をもたらす、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞の前記投与が、前記被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳におけるＧＡＧの低下をもたらす、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記被験体が、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を有する、項目１～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記遺伝子改変Ｂ細胞の前記投与が、前記被験体のＭＰＳ Ｉを処置する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ｉｎ ｖｉｖｏで複数の組織に治療剤を送達するための方法であって、２またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目５２）
被験体におけるＭＰＳ Ｉを処置するための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の、ＩＤＵＡを産生するように遺伝子改変されたＢ細胞を、ＭＰＳ Ｉを有する前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目５３）
ＭＰＳ Ｉを有する被験体におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を低下させるための方法であって、２またはそれよりも多い逐次用量の、ＩＤＵＡを産生するように遺伝子改変されたＢ細胞を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目５４）
ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ二機能性導入遺伝子を含む改変Ｂ細胞。
（項目５５）
ｉｎ ｖｉｖｏで１種または複数の組織に治療剤を送達するための方法であって、１または複数用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含み、前記遺伝子改変Ｂ細胞が遊走性である、方法。
（項目５６）
前記Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、ＣＸＣＬ１２を使用した走化性アッセイにおいて遊走する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記Ｂ細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％または少なくとも約５０％が、ＣＸＣＬ１２を使用した走化性アッセイにおいて遊走する、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、ＣＸＣＬ１３を使用した走化性アッセイにおいて遊走する、項目５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記Ｂ細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％または少なくとも約５０％が、ＣＸＣＬ１３を使用した走化性アッセイにおいて遊走する、項目５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記Ｂ細胞の少なくとも約４０％が、ＣＸＣＬ１２を使用した走化性アッセイにおいて遊走し、前記Ｂ細胞の少なくとも約４０％が、ＣＸＣＬ１３を使用した走化性アッセイにおいて遊走する、項目５５に記載の方法。
（項目６１）
前記改変Ｂ細胞が、前記治療剤を発現するように遺伝子操作される、項目５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記改変Ｂ細胞が、前記治療剤を分泌するように遺伝子操作される、項目５５～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞が操作後約７日間未満にわたり培養下に置かれたときに投与される、項目５５に記載の方法。
（項目６４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞が４～９日間培養下に置かれたときに投与される、項目５５に記載の方法。
（項目６５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞が操作後５、６または７日間培養下に置かれた後に投与される、項目５５に記載の方法。
（項目６６）
前記治療剤が、ＩＤＵＡである、項目５５～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである、項目５５～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
少なくとも２用量の前記改変Ｂ細胞を投与するステップを含む、項目５５～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記投与ステップが、静脈内注射を含む、項目５５～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
治療剤の相乗的ｉｎ ｖｉｖｏ産生を可能にするように遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与する方法であって、前記治療剤の最大ｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導するための、前記改変Ｂ細胞の最適な単回用量濃度を決定するステップと、前記改変Ｂ細胞の前記最適な単回用量濃度を減少させて、前記改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度を得るステップと、２またはそれよりも多い用量の前記最適に満たない単回用量濃度の前記改変Ｂ細胞を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
（項目７１）
前記改変Ｂ細胞の最適な単回用量濃度が決定されるように、前記改変Ｂ細胞の複数の単回投薬量が検査される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
改変Ｂ細胞の単回用量濃度で存在する改変Ｂ細胞の前記投薬量の増加が、前記治療剤の産生の線形増加をもたらす、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
最適投薬量が見つかるように、前記改変Ｂ細胞の複数の最適に満たない単回用量濃度が検査され、得られた投薬量が、より低い投薬量の場合よりも、線形を超える増加をもたらす、項目７０に記載の方法。
（項目７４）
前記最適に満たない単回用量濃度が、前記最適な単回用量濃度の用量の２分の１または３分の１である、項目７０に記載の方法。
（項目７５）
前記最適に満たない単回用量濃度が、前記最適な単回用量濃度の用量の３分の１未満である、項目７０に記載の方法。
（項目７６）
前記被験体への２またはそれよりも多い用量の前記最適に満たない単回用量濃度の前記改変Ｂ細胞の投与によって得られる、前記治療剤の前記相乗的ｉｎ ｖｉｖｏ産生が、Ｂ細胞産物の静脈内注射によって得られる、項目７０～７５のいずれか一項に記載の方法。（項目７７）
前記Ｂ細胞が、前記治療剤を発現するように操作される、項目７０～７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記改変Ｂ細胞が、前記治療剤を分泌するように遺伝子操作される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記治療剤が、ＩＤＵＡである、項目７０～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである、項目７０～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８２）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が投与される被験体に対して自家である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が投与される被験体に対して同種異系である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８４）
前記被験体が、ヒトである、項目８２または８３に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８５）
前記治療剤が、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡコード小分子である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８６）
前記タンパク質が、酵素、抗体もしくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、細胞表面受容体、分泌タンパク質、シグナル伝達分子、抗原性断片、凝固因子、または接着分子である、項目８５に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８７）
前記治療剤が、ＩＤＵＡである、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８８）
前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目８９）
ＣＤ２０－、ＣＤ３８－かつＣＤ１３８－である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目９０）
ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８＋である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目９１）
ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８－である、項目８１に記載の遺伝子改変Ｂ細胞。
（項目９２）
治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞の集団を含む組成物であって、前記遺伝子改変Ｂ細胞が最適な遊走能にあるものである、組成物。
（項目９３）
前記治療剤が、ＩＤＵＡである、項目９２に記載の組成物。
（項目９４）
前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである、項目９２に記載の組成物。
（項目９５）
治療剤を産生するように操作された遺伝子改変Ｂ細胞の集団を含む組成物であって、前記組成物における前記遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著な量の炎症性サイトカインを産生しない時点で培養物から収集される、組成物。
（項目９６）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記遺伝子改変Ｂ細胞が投与される被験体に対して自家である、項目９２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記遺伝子改変Ｂ細胞が投与される被験体に対して同種異系である、項目９２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９８）
前記被験体が、ヒトである、項目９６～９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９９）
前記治療剤が、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡコード小分子である、項目９２または９５に記載の組成物。
（項目１００）
前記タンパク質が、酵素、抗体もしくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、細胞表面受容体、分泌タンパク質、シグナル伝達分子、抗原性断片、凝固因子、または接着分子である、項目９９に記載の組成物。
（項目１０１）
前記治療剤が、ＩＤＵＡである、項目９２～１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０２）
前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬまたはＬＣＡＴである、項目９２～１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８－かつＣＤ１３８－である、項目９２～１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８＋である、項目９２～１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８－である、項目９２～１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０６）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞において前記治療剤を発現するようにスリーピングビューティートランスポゾンを使用して調製された、項目９２～１０５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞において前記治療剤を発現するように組換えウイルスベクターを使用して調製された、項目９２～１０５のいずれか一項に記載の組成物。（項目１０８）
前記組換えウイルスベクターが、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノ随伴ウイルスをコードする、項目１０７に記載の組成物。
（項目１０９）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記Ｂ細胞のゲノムへの、前記治療剤をコードするポリヌクレオチド配列の標的化組込みによって調製された、項目９２～１０５および１０６～１０８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１０）
前記標的化組込みが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込み、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性遺伝子組込み、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込みまたはメガヌクレアーゼ媒介性遺伝子組込みを含む、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１１）
前記ポリヌクレオチドの前記標的化組込みが、相同組換えにより起こった、項目１１０に記載の組成物。
（項目１１２）
前記標的化組込みが、標的ＤＮＡ部位においてＤＮＡ切断を誘導することができるヌクレアーゼのウイルスベクター媒介性送達を含む、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１３）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＡＳ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、項目１１２に記載の組成物。
（項目１１４）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、配列番号１と同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む、項目９２～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、配列番号１と少なくとも約８５％同一である、または配列番号１と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む、項目９２～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１６）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、培養後２日目または３日目に操作される、項目９２～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、エレクトロポレーションを含む方法を使用して操作される、項目１１６に記載の組成物。
（項目１１８）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における４日目、５日目、６日目または７日目に、被験体への投与のために収集される、項目９２～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１９）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における８日目またはそれよりも後に、被験体への投与のために収集される、項目９２～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２０）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における１０日目またはそれよりも前に、被験体への投与のために収集される、項目９２～１１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２１）
収集された前記遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著なレベルの炎症性サイトカインを産生しない、項目９２～１２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２２）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、顕著なレベルの炎症性サイトカインを産生しないことが決定された培養中の時点で収集される、項目９２～１２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作前および後の培養期間全体にわたって、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－３１および多量体化ＣＤ４０リガンドのそれぞれを含む培養系において育成される、項目９２～１２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２４）
前記多量体化ＣＤ４０リガンドが、抗ｈｉｓ抗体を使用して多量体化された、ＨＩＳタグ付きＣＤ４０リガンドである、項目１２３に記載の組成物。
（項目１２５）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体への投与の前に拡大増殖される、項目９２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２６）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団が、高い程度のポリクロナリティーを示す、項目１２５に記載の組成物。
（項目１２７）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の前記最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．２％未満を構成する、項目１２６に記載の組成物。
（項目１２８）
拡大増殖された遺伝子改変Ｂ細胞の前記最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．０５％未満を構成する、項目１２６に記載の組成物。
（項目１２９）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、メトトレキセートに対して増強された耐性を有するヒトＤＨＦＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、項目９２～１２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３０）
メトトレキセートに対して増強された耐性を有する前記ヒトＤＨＦＲ遺伝子が、アミノ酸２２におけるロイシンからチロシンへの置換変異、およびアミノ酸３１におけるフェニルアラニンからセリンへの置換変異を含有する、項目１２９に記載の組成物。
（項目１３１）
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、投与のための収集の前にメトトレキセートで処置された、項目９２～１３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３２）
メトトレキセートによる前記処置が、１００ｎＭ～３００ｎＭの間である、項目１３１に記載の組成物。
（項目１３３）
メトトレキセートによる前記処置が、２００ｎＭである、項目１３２に記載の組成物。（項目１３４）
前記組成物に含まれる前記遺伝子改変Ｂ細胞が、被験体に投与されると、多様な組織へと遊走する、項目９２～１３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３５）
遺伝子改変Ｂ細胞の前記組成物が、被験体に投与されると、前記組成物に含まれる遺伝子改変Ｂ細胞の前記集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される１種または複数の組織へと遊走する、項目９２～１３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３６）
遺伝子改変Ｂ細胞の前記組成物が、被験体に投与されると、前記組成物に含まれる遺伝子改変Ｂ細胞の前記集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳へと遊走する、項目１３５に記載の組成物。
（項目１３７）
前記遺伝子改変Ｂ細胞によって産生される前記治療剤が、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）である、項目９２～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３８）
被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む前記組成物の投与が、前記被験体の多様な組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の低下をもたらす、項目１３７に記載の組成物。
（項目１３９）
被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む前記組成物の投与が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される前記被験体の１種または複数の組織におけるＧＡＧの低下をもたらす、項目１３７に記載の組成物。
（項目１４０）
被験体への前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む前記組成物の投与が、前記被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳におけるＧＡＧの低下をもたらす、項目１３７に記載の方法。
（項目１４１）
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を有する被験体に投与される、項目９２～１４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４２）
前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む前記組成物の投与が、前記被験体のＭＰＳ Ｉを処置する、項目１４１に記載の組成物。
（項目１４３）
前記遺伝子改変Ｂ細胞によって産生される前記治療剤が、ＦＩＸ、ＬＰＬおよびＬＣＡＴから選択される、項目９２～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４４）
治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ産生のために遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与する方法であって、最適な単回用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１４５）
前記被験体が、ヒトである、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記最適単回用量が、ヒト等価量の３×１０^７個の改変Ｂ細胞／Ｋｇである、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記用量が、１．５×１０^９個の遺伝子改変Ｂ細胞／Ｋｇである、項目１４４～１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記最適な単回用量の遺伝子改変Ｂ細胞が、最適投薬量の３分の２またはそれに満たない投薬量と比較して、治療薬の注入細胞１個あたりのレベルで線形を超える増加をもたらす、項目１４４～１４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４９）
前記最適な単回用量の遺伝子改変Ｂ細胞が、単回Ｂ細胞注入の状況において、細胞１個あたりの、治療薬の最大ｉｎ ｖｉｖｏレベルをもたらす、項目１４４～１４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５０）
前記薬剤が、ＩＤＵＡである、項目１４４～１４９のいずれか一項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ヒトＩＤＵＡの転位および発現のための、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）（ＳＢ）トランスポゾンおよびトランスポサーゼ構築物／マップの図表である。ＩＤＵＡは、ＥＥＫプロモーターによって調節される（実施例１を参照）。ＥＥＫの上流にＥＦ１ａプロモーターを取り込む双方向性プロモーターは、反対方向における薬物耐性ヒトＬ２２Ｙ－Ｆ３１Ｓジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の転写を調節する。ＣＭＶ調節されるＳＢ１００ｘは、ＳＢトランスポサーゼ活性をもたらす。キャッピングされポリアデニル化されたＳＢ１００ｘコードｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから提供される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成された。矢印：転写方向。色の濃い三角形が入った緑色のボックスは、Ｔ２ ＳＢ逆方向反復／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列である。ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。図１Ａは、構築物設計を示す。図１Ｂは、Ｌ２２Ｙ；Ｆ３１Ｓ変異を有するヒトＤＨＦＲを含む、図１Ａに示すｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ構築物のプラスミドマップを示す。

【0018】

【図2】図２は、初代ヒトＢ細胞におけるヒトＩＤＵＡのＳＢ媒介性発現を示す。ヒトＣＤ１９＋初代Ｂ細胞は、２日間培養し、次いでＬｏｎｚａ ４Ｄシステムを使用して、トランスポサーゼ供給源としてｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡおよびｐＣＭＶ－ＳＢ１００ｘをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後８日目の細胞ライセートをＩＤＵＡ酵素活性に関してアッセイした。

【0019】

【図3】図３は、ラージスケールＢ細胞拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）における、ＩＤＵＡ＋細胞のＭＴＸ選択的濃縮を示す一連のヒストグラムである。２名の別々のドナー（１９００９および２７６４）由来のＢ細胞は、ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲトランスポゾンをエレクトロポレーションし、２～４日目からＭＴＸあり（下の２枚のヒストグラム）またはなし（上の２枚のヒストグラム）の培地においてインキュベートし、次いで総計７日間さらに拡大増殖させた。各集団由来の細胞を７日目に採取し、ヒトＩＤＵＡの細胞内染色とそれに続くフローサイトメトリーにより、％ＩＤＵＡ陽性細胞に関してアッセイした（細胞計数／ＩＤＵＡ）。

【0020】

【図4】図４は、ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ転位Ｂ細胞を注入されたＮＳＧマウスにおけるイズロニダーゼ発現を示す。ＮＳＧ ＩＤＵＡ＋マウスに、－３０および－４日目にＣＤ４＋Ｔ細胞をｉ．ｐ．注入し、次いで０日目に、ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．注射のいずれかにより、ＭＴＸにおいて選択された１０^７個のｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ Ｂ細胞を注入した。対照として、一部のマウスに、ｉ．ｐ．注射により、ＧＦＰを発現するＢ細胞を注入した。示されている時点において、血漿試料をＩＤＵＡに関してアッセイした。マウス１～８は、ＩＤＵＡ発現Ｂ細胞のｉ．ｐ．注入を受けた。マウス９、１０、１２および４２は、ＩＤＵＡ発現Ｂ細胞のｉ．ｖ．注入を受けた。マウス４３および４８は、ＧＦＰ発現Ｂ細胞のｉ．ｐ．注入を受けた。

【0021】

【図5】図５は、ＭＰＳ Ｉのマウスモデルを使用した、血漿中に存在するイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の量を示す。マウスは、凡例の上から下に、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の存在下での３×１０^６個のＩＤＵＡを形質導入されたＢ細胞（ＩＤＵＡ＋Ｂ細胞）、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の存在下での１×１０^７個のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の存在下での３×１０^７個のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞のみ、または細胞なしを０日目に受け、投与後３８日目まで、血清におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを測定した。

【0022】

【図6】図６は、多回用量の、ＩＤＵＡを形質導入されたＢ細胞（ＩＤＵＡ＋Ｂ細胞）による、ＭＰＳ Ｉのマウスモデルにおける血漿中に存在するＩＤＵＡの量を示す。ヒトＢ細胞は、正常ドナーのアフェレーシス産物からＣＤ１９濃縮し、拡大増殖プロセスにおいてｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡトランスポゾンプラスＳＢ１００ｘコードｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同じドナーから単離し、ＩＤＵＡ転位Ｂ細胞の注入の１週間前に、ＮＳＧ ＭＰＳ Ｉ動物に腹腔内（ｉ．ｐ）注入した。対照群は、無処置ＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウス（「Ｂ細胞なし」）、およびＩＤＵＡ＋Ｂ細胞のみをｉ．ｖ．注入されたＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウス（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞なし）を含んだ。自家ＣＤ４＋Ｔ細胞で前処置されたＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウスはその後、０、２１および４２日目に（矢印）、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．のいずれかでＩＤＵＡ＋Ｂ細胞を注入した。ＩＤＵＡ酵素活性レベルは、５６日目まで血清において測定した。Ｎ＝４。

【0023】

【図7】図７は、図６に記載されている同じＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウス由来の血漿ＩｇＧを示す。Ｎ＝４。

【0024】

【図8】図８は、ＭＰＳ Ｉマウス由来の様々な組織におけるＩＤＵＡ活性を示す。ＭＰＳ Ｉマウスに、０、２１および４２日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（または対照として細胞なし）の存在下で、３投薬量の１×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞（または対照として細胞なし）を与え、第１のＢ細胞注入後６０日目に、示されている臓器におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを測定した。Ｎ＝４。

【0025】

【図9】図９は、ＭＰＳ Ｉマウス由来の様々な組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を示す。ＭＰＳ Ｉマウスに、０、２１および４２日目に、０日目におけるＣＤ４＋Ｔ細胞（または対照として細胞なし）の存在下で、３投薬量の１×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞（または対照として細胞なし）を与え、第１のＢ細胞注入後６０日目に、示されている臓器におけるＧＡＧレベルを測定した。その上、赤色の水平バーは、マウスの群のそれぞれの血漿における平均ＩＤＵＡ酵素活性を示す。Ｎ＝４。

【0026】

【図10】図１０は、ＩＤＵＡ活性が、２用量の２×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞で処置されたＭＰＳＩ ＮＳＧマウス由来の血漿において長期検出可能であることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞の投与の１週間後に第１の投薬量のＢ細胞を与え、第２の投薬量のＢ細胞は、第１のＢ細胞投薬量の３０日後に投与した（ＩＤＵＡ＋Ｂ細胞）。右側にある色分けされた凡例は、マウス群を示す。Ｘ軸は、週での時間を示す。Ｙ軸は、マウス血漿試料において検出されたＩＤＵＡ酵素活性の量を示す。

【0027】

【図11】図１１は、図１０のものと同じプロトコールに従って、２用量の２×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞で処置されたＭＰＳＩ ＮＳＧマウスにおける複数の組織に存在するＩＤＵＡ活性の量を示す。右側にある色分けされた凡例は、マウス群および時点を示す。Ｘ軸は、調査されている組織を列挙し、Ｙ軸は、検出されたＩＤＵＡ酵素活性のレベルを列挙する。

【0028】

【図12】図１２は、図１０および図１１のものと同じプロトコールに従って、２用量の２×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞で処置されたＭＰＳ Ｉ ＮＳＧマウス由来の様々な組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を示す。Ｂ細胞産物による処置は、複数の組織におけるＧＡＧのレベルの長期低下をもたらす。右側にある色分けされた凡例は、ＧＡＧを評価した臓器を示す。Ｘ軸は、マウス群および細胞投薬量を示す。Ｙ軸は、検出されたＧＡＧの量を示す。

【0029】

【図13A】図１３は、ＩＤＵＡを発現するように操作されたＢ細胞の、２チャンバーＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおける化学誘引物質に向けた遊走を示す。図１３Ａは、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の０日目遊走を示す。図１３Ｂは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｃは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１３に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｃの両方について、ケモカインなし対照は、４日目の時点でのみ実行されたことに留意されたい。図１３Ｄは、図１３Ａ～図１３Ｃにおけるデータの生成に利用したＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイの模式図を示す。

【図13B】図１３は、ＩＤＵＡを発現するように操作されたＢ細胞の、２チャンバーＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおける化学誘引物質に向けた遊走を示す。図１３Ａは、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の０日目遊走を示す。図１３Ｂは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｃは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１３に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｃの両方について、ケモカインなし対照は、４日目の時点でのみ実行されたことに留意されたい。図１３Ｄは、図１３Ａ～図１３Ｃにおけるデータの生成に利用したＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイの模式図を示す。

【図13C】図１３は、ＩＤＵＡを発現するように操作されたＢ細胞の、２チャンバーＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおける化学誘引物質に向けた遊走を示す。図１３Ａは、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の０日目遊走を示す。図１３Ｂは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｃは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１３に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｃの両方について、ケモカインなし対照は、４日目の時点でのみ実行されたことに留意されたい。図１３Ｄは、図１３Ａ～図１３Ｃにおけるデータの生成に利用したＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイの模式図を示す。

【図13D】図１３は、ＩＤＵＡを発現するように操作されたＢ細胞の、２チャンバーＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおける化学誘引物質に向けた遊走を示す。図１３Ａは、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の０日目遊走を示す。図１３Ｂは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１２に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｃは、操作後の培養における４、５、６、７、８または９日後の、化学誘引物質ＣＸＣＬ１３に向けた操作されたＢ細胞の遊走を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｃの両方について、ケモカインなし対照は、４日目の時点でのみ実行されたことに留意されたい。図１３Ｄは、図１３Ａ～図１３Ｃにおけるデータの生成に利用したＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイの模式図を示す。

【0030】

【図14】図１４は、ＩＤＵＡを発現するように操作されたＢ細胞のクロナリティーのディープシークエンシング解析の概要データを示す。

【0031】

【図15A】図１５は、ＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞による炎症性サイトカイン産生のルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）解析を示す。図１５Ａは、２日目（Ｄ２）、７日目（Ｄ７）、ならびにＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）ありおよびなしの０日目（Ｄ０）基本培地における、ＩＬ６、ＩＦＮアルファおよびＩＦＮガンマ産生を示す。図１５Ｂは、Ｄ２、Ｄ７およびＤ０基本培地における、ｓＦＡＳ、ＴＮＦＲｐ７５、ＢＡＦＦ、ＨＧＦおよびＩＬ５産生を示す。

【図15B】図１５は、ＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞による炎症性サイトカイン産生のルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）解析を示す。図１５Ａは、２日目（Ｄ２）、７日目（Ｄ７）、ならびにＩＬ６（５０ｎｇ／ｍｌ）ありおよびなしの０日目（Ｄ０）基本培地における、ＩＬ６、ＩＦＮアルファおよびＩＦＮガンマ産生を示す。図１５Ｂは、Ｄ２、Ｄ７およびＤ０基本培地における、ｓＦＡＳ、ＴＮＦＲｐ７５、ＢＡＦＦ、ＨＧＦおよびＩＬ５産生を示す。

【0032】

【図16A】図１６は、本発明に従って操作されたヒトＢ細胞における、ヒトＬＣＡＴ（レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ヒトＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）およびヒトＦＩＸ（凝固第ＩＸ因子）の発現を示す。図１６Ａは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＣＡＴ活性を示す。図１６Ｂは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＰＬ活性を示す。図１６Ｃは、操作された初代Ｂ細胞における、ＥＬＩＳＡによるＦＩＸタンパク質発現を示す。

【図16B】図１６は、本発明に従って操作されたヒトＢ細胞における、ヒトＬＣＡＴ（レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ヒトＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）およびヒトＦＩＸ（凝固第ＩＸ因子）の発現を示す。図１６Ａは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＣＡＴ活性を示す。図１６Ｂは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＰＬ活性を示す。図１６Ｃは、操作された初代Ｂ細胞における、ＥＬＩＳＡによるＦＩＸタンパク質発現を示す。

【図16C】図１６は、本発明に従って操作されたヒトＢ細胞における、ヒトＬＣＡＴ（レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ヒトＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）およびヒトＦＩＸ（凝固第ＩＸ因子）の発現を示す。図１６Ａは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＣＡＴ活性を示す。図１６Ｂは、操作された形質芽球／形質細胞におけるＬＰＬ活性を示す。図１６Ｃは、操作された初代Ｂ細胞における、ＥＬＩＳＡによるＦＩＸタンパク質発現を示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明の実施は、それとは反対のことが特に指示されていなければ、当業者の技能範囲内で、分子生物学、組換えＤＮＡ技法、タンパク質発現およびタンパク質／ペプチド／炭水化物化学の従来方法を用いることになるであろうが、これらの多くについては、説明目的で後述する。斯かる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ． Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、２００４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＢｕｚｄｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ編、２００９年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．（２００５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版、Ｈｏｂｏｋｅｎ ＮＪ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版、２０１０年）；Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｒ．、ＲＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（第３版、２００５年）を参照されたい。上に記述されている刊行物は、本願の出願日に先立つそれらの開示のために単に提供されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明のために斯かる開示に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。

【0034】

定義および略語
他に定義されていなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、それとは反対のことが指定されていない限り、次の用語は、示されている意義を有する。本明細書に関して、本明細書で定義されている用語の定義が、取り込まれた参考文献においてこの同じ用語に与えられている定義とは異なる場合は常に、本明細書で明確に定義されている定義が、その用語の正確な定義である。

【0035】

単語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、特に注意されていなければ、１つまたは複数を表示する。

【0036】

「約」とは、参照分量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほど変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。用語「約」と併せて使用されている数値の文脈で記述されるいずれかの実施形態では、約という用語が省略され得ることが特に企図される。

【0037】

「組成物」は、活性な薬剤および担体、不活性または活性な、例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。特定の実施形態では、組成物は、用いられている投薬量または濃度において、無菌である、エンドトキシンを実質的に含まない、またはレシピエントにとって無毒性である。

【0038】

文脈がそれ以外のことを要求しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変化形は、オープンかつ包括的な意味合いで、すなわち、「が挙げられるがこれらに限定されない」として解釈するべきである。

【0039】

「からなる」とは、語句「からなる」の前に来るものが何であれ、「を含みこれらに限定される」を意味する。よって、語句「からなる」は、列挙されている要素が、必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の前に列挙されているいずれかの要素を含むことを意味し、列挙されている要素について本開示に指定されている働きまたは作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定される。よって、語句「から本質的になる」は、列挙されている要素が、要求されるまたは強制的であるが、他の要素は、必要に応じたものであり、列挙されている要素の働きまたは作用に影響を与えるか否かに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。

【0040】

「生物学的活性」または「生物活性」の本明細書を通じた参照は、本明細書で企図されるいずれかの化合物、薬剤、ポリペプチド、コンジュゲート、医薬組成物の投与の結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてまたは細胞、組織、臓器もしくは生物（例えば、動物または哺乳動物またはヒト）において誘導されるいずれかの応答を指す。生物学的活性は、アゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を指すことができる。生物学的活性は、有益な効果となることができる；または生物学的活性は、有益でない、すなわち、毒性となり得る。一部の実施形態では、生物学的活性は、生きている被験体、例えば、ヒト等の哺乳動物における、薬物または医薬組成物が有するプラスまたはマイナスの効果を指すであろう。したがって、用語「生物学的に活性」は、本明細書に記載されている通り、生物学的活性を保有するいずれかの化合物を記載することを意味する。生物学的活性は、当業者にとって現在公知のいずれか適切な手段によって評価することができる。斯かるアッセイは、定性的または定量的となることができる。当業者であれば、異なるポリペプチドの活性を評価するために異なるアッセイを用いることの必要を容易に認めるであろう；平均的な研究者にとって慣例的な課題である。斯かるアッセイは多くの場合、最適化を殆ど要求することなく実験室設定において簡単に実行され、大抵の場合、多くの実験室に共通している様々な技術を使用して、広範囲のポリペプチドの生物学的活性の単純で、信頼でき、かつ再現性がある読み取りを提供する商業的キットを利用できる。斯かるキットが利用できない場合、通常技能を有する研究者であれば、過度の実験法を用いずに、標的ポリペプチドのための組織内の生物活性アッセイを簡単に設計および最適化することができる；その理由として、これが科学的プロセスの慣例的な側面であることが挙げられる。

【0041】

用語「例えば」の参照は、「例えば、次のものが挙げられるがこれらに限定されない」を意味するように意図されるため、その後に続くものが何であれ、特定の実施形態の単なる例であることを理解するべきであるが、決して、限定的な例として解釈するべきではない。他に断りがなければ、「例えば」の使用は、他の実施形態が企図されており、これが本発明によって包含されることを明確に示すように意図される。

【0042】

「実施形態」または「一実施形態」または「ある実施形態」または「一部の実施形態」または「ある特定の実施形態」の本明細書を通じた参照は、実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通じた様々な箇所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」または「ある特定の実施形態では」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指す訳ではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１または複数の実施形態においていずれか適した様式で組み合わせることができる。

【0043】

「増加された」または「増強された」量は典型的に、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載されている量またはレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０倍またはそれよりも多い（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間の１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４等を含む）増加を含むことができる。同様に、「減少された」または「低下された」または「より少ない」量は典型的に、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載されている量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０分の１またはそれよりも少ない（例えば、１００、５００、１０００分の１）（その間の１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）減少を含むことができる。

【0044】

用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、「ｅｘ ｖｉｖｏ」および「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、それらの通常の科学的意義を有するように本明細書で意図される。したがって、例えば、「ｉｎ
ｖｉｔｒｏ」は、例えば、適切な基質、酵素、ドナーおよび必要に応じてバッファー／補因子を使用して試験管内で行われる酵素反応等、単離された細胞構成成分により起こる実験または反応を指すことを意味する。「ｅｘ ｖｉｖｏ」は、生物から摘出されたまたは生物とは独立して繁殖された機能的な臓器または細胞を使用して実行される実験または反応を指すことを意味する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、その正常でインタクトな状態で、生きている生物内で起こる実験または反応を指すことを意味する。

【0045】

「哺乳動物」は、ヒトと、実験動物および家庭用ペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびウサギ）等の飼育動物、ならびに野生生物その他等の非飼育動物の両方とを含む。

【0046】

「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、起こっても起こらなくてもよいこと、また、その記載が、前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。

【0047】

「医薬組成物」は、化合物（例えば、治療上有用なポリペプチド）、および動物、例えば、ヒトへの化合物の送達のために本技術分野で一般に許容される媒体の製剤を指す。斯かる媒体は、したがって、いずれか薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。

【0048】

「薬学的に有効な賦形剤」および「薬学的に有効な担体」は、当業者にとって周知であり、それらの調製のための方法もまた、当業者には容易に明らかである。斯かる組成物およびその調製のための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年、本明細書に組み込む）に見出すことができる。

【0049】

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらのアナログのいずれかである、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有することができ、公知または未知のいずれかの機能を行うことができる。次に、ポリヌクレオチドの非限定例を挙げる：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ポリマーのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する改変を与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分を含むことができる。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションによる等、重合後にさらに改変することができる。

【0050】

「被験体」は、本明細書において、本発明の薬剤で処置することができる、疾患もしくは症状を示すまたは疾患もしくは症状を示すリスクがあるいずれかの動物を含む。適した被験体は、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモット等）、家畜および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌ等）を含む。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者が含まれる。

【0051】

「実質的に」または「本質的に」は、豊富なまたは相当な量、分量、サイズ；殆ど全体的にまたは完全に；例えば、ある所与の分量の９５％またはそれよりも多いことを意味する。

【0052】

「治療剤」は、被験体（例えば、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に治療有効量で投与されると、下に定義される疾患または状態の処置をもたらすことができる、いずれかの化合物を指す。

【0053】

「治療有効量」または「治療有効用量」は、被験体（例えば、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に投与されると、動物における疾患または状態の、下に定義される通りの処置をもたらすのに十分な、本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与様式、ならびに処置されるべき動物の年齢に応じて変動するであろうが、当業者が自身の知識および本開示を考慮に入れることによって慣例的に決定することができる。

【0054】

「処置すること」または「処置」は、本明細書において、目的の疾患または状態を有する被験体、好ましくは、ヒトにおける目的の疾患または状態の処置を網羅し、（ｉ）特に、被験体が、状態に対する素因を有するが、当該状態であると未だ診断されていない場合、被験体における疾患もしくは状態が起こることを予防もしくは阻害すること；（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること；（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を軽減すること、すなわち、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと；または（ｉｖ）疾患もしくは状態に起因する症状を軽減することを含む。本明細書において、用語「疾患」、「障害」および「状態」は、互換的に使用することができる、または特定の疾病、傷害または状態は、公知の原因となる病原体を持たない場合がある（病因が未だ解明されていないように）という点で異なる場合があり、したがって、これは、傷害または疾患として未だ認識されていないが、単に望ましくない状態または症候群として認識されており、その場合、症状の特異性がより高いまたは低いセットが臨床医によって同定されている。

【0055】

概要
本発明は、治療剤を産生するための核酸の導入により変更された、自家および／または同種異系Ｂ細胞を利用し、改変Ｂ細胞を投与する方法に関する。一部の実施形態では、用語「操作Ｂ細胞」、「遺伝子操作Ｂ細胞」、「改変Ｂ細胞」および「遺伝子改変Ｂ細胞」は、治療剤を産生するための１種または複数の核酸（例えば、導入遺伝子）（例えば、治療用ポリペプチド等、ポリペプチドの発現を可能にする導入遺伝子）を含むように変更されたＢ細胞を指すように本明細書で互換的に使用されている。具体的には、改変Ｂ細胞は、単回投薬量または多回投薬量として投与することができる。予想外なことに、ある特定のＢ細胞投薬量が、他の投薬量と比較して、治療剤の予想されるレベルよりも優れたものを産生することが判明した。その上、驚いたことに、多用量レジメンの経過にわたって送達されるＢ細胞の多回投薬量の使用が、同数の細胞を含有する単回投薬量によって達成されるものよりも優れた治療剤レベルをもたらすことが判明した。その上、驚いたことに、改変Ｂ細胞が、化学誘引物質に向けた最適な遊走能のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を有することが判明し、その遊走能は、培養におけるある一定期間後に減退し得る。その上、操作Ｂ細胞の出発集団はＩＬ６を産生したが、産生レベルは、培養の終わりまでにほぼバックグラウンドレベルまで減退し、検査した大部分の炎症性サイトカインは、操作Ｂ細胞によって産生されなかったことが予想外に判明した。さらに、操作Ｂ細胞の最終集団において特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．２％超を構成することが見出されなかったため、最終的な操作Ｂ細胞集団が、有意にポリクローナルであったことが示された。最後に、改変Ｂ細胞が、他のモダリティを使用した標的化が困難な肺、心臓および腸等、広範囲の組織に薬物を有効に送達することができることが発見された。

【0056】

したがって、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞組成物を投与するための方法は、治療剤の長期ｉｎ ｖｉｖｏ送達および発現に有用である。本開示は、全般的に、産物の安全性を確実にしつつ、治療剤を産生する細胞の十分な濃縮および数、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの治療剤の十分なレベルを達成するための方法に関する。

【0057】

本明細書において、語句「長期ｉｎ ｖｉｖｏ生存」および「長期生存」は、被験体における投与後１０日間またはそれよりも長い、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞の生存を指す。長期生存は、日、週またはさらには年単位で測定することができる。一実施形態では、改変Ｂ細胞の大部分は、投与後１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０日間またはそれよりも長く、ｉｎ ｖｉｖｏで生存する。一実施形態では、改変Ｂ細胞の大部分は、投与後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２週間またはそれよりも長く、ｉｎ ｖｉｖｏで生存する。別の実施形態では、改変Ｂ細胞は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０年間またはそれよりも長く、ｉｎ ｖｉｖｏで生存する。その上、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、１０日間またはそれよりも長くｉｎ ｖｉｖｏで生存することができるが、改変Ｂ細胞の大部分が、投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９日間またはそれよりも長くｉｎ ｖｉｖｏで生存することが理解される。したがって、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞が、短期処置（例えば、４日間）および長期処置（例えば、３０日間またはそれよりも長い）方法に有用であることが企図される。

【0058】

Ｂ細胞
骨髄から離れた後に、Ｂ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用し、抗原を内部移行させる。抗原は、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してＢ細胞によって取り入れられ、プロセシングされる。抗原は、抗原ペプチドへとプロセシングされ、ＭＨＣ ＩＩ分子上に負荷され、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対してＢ細胞の細胞外表面に提示される。このようなＴ細胞は、ＭＨＣ ｌｌ／抗原分子に結合し、Ｂ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞による刺激後に、活性化されたＢ細胞は、より特殊化された細胞へと分化し始める。胚中心Ｂ細胞は、長寿命のメモリーＢ細胞または形質細胞へと分化することができる。さらに、二次免疫刺激は、追加的な形質細胞を生じるメモリーＢ細胞をもたらすことができる。メモリーまたは非メモリーＢ細胞のいずれかからの形質細胞の形成に先行して、大量の抗体を産生する形質細胞へと最終的に分化する前駆体形質芽球の形成が行われる（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年６月；３０巻（６号）：２７７～２８５頁；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５巻：２３１～２４２頁を参照）。形質芽球は、Ｂ細胞よりも多いが、形質細胞よりも少ない抗体を分泌する。これは、急速に分裂し、抗原を内部移行させ、Ｔ細胞に対して抗原を提示し続ける。形質芽球は、ケモカイン産生部位（例えば、骨髄内）へと遊走する能力を有し、それによって、長寿命の形質細胞へと分化することができる。最終的に、形質芽球は、形質芽球として数日間残った後に死ぬか、成熟し完全に分化した形質細胞へと変更不能に分化することができる。具体的には、形質細胞生存ニッチを含有する組織（例えば、骨髄内）へとホーミングすることができる形質芽球は、高レベルのタンパク質を数年間分泌し続けることができる、長寿命の形質細胞になるために、常在性形質細胞を置き換えることができる。

【0059】

本明細書に記載されている方法において使用されるＢ細胞は、汎Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質芽球および／または形質細胞を含む。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、メモリーＢ細胞である。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、形質芽球である。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、形質細胞である。

【0060】

終末分化した形質細胞は典型的に、ＣＤ１９およびＣＤ２０等、共通汎Ｂ細胞マーカーを発現せず、比較的少ない表面抗原を発現する。形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８およびインターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を発現し、ＣＤ４５の発現を欠くことから、例えばフローサイトメトリーによってこれらのマーカーを使用して、形質細胞を同定することができる。ナイーブＢ細胞はＣＤ２７－であり、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋であり、形質細胞はＣＤ２７＋＋であるため、ＣＤ２７もまた、形質細胞の優れたマーカーである。メモリーＢ細胞サブセットが、表面ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＤを発現することもできる一方、形質細胞は、細胞表面にこれらのマーカーを発現しない。ＣＤ３８およびＣＤ１３８は、形質細胞に高レベルで発現される（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｔｈｅ
Ｆｒｅｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．「Ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ」ページバージョンＩＤ：４０４９６９４４１；最新改訂の日付：２０１０年１２月３０日、０９：５４ ＵＴＣ、２０１１年１月４日検索を参照；Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ．２００９年１２月１０日；１１４巻（２５号）：５１７３～８１頁；Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年６月；３０巻（６号）：２７７～２８５頁；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５巻：２３１～２４２頁；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２０１０年、１６巻：１２３～１２９頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ． Ｓ．； Ｈｏｎｊｏ， Ｔ．； Ａｌｔ，
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ．（２００４年）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１８９～１９１頁；Ｂｅｒｔｉｌ Ｇｌａｄｅｒ； Ｇｒｅｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｇ．； Ｊｏｈｎ Ｆｏｅｒｓｔｅｒ； Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｇｅｏｒｇｅ Ｇ．； Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ， Ｆｒｉｘｏｓ（２００８年）．Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｓｅｔ． Ｈａｇｅｒｓｔｗｏｎ， ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．、３４７頁；Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍａｒｋ； Ｍｕｒｐｈｙ， Ｋｅｎｎｅｔｈ； Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃｈａｒｌｅｓ； Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｐａｕｌ Ｊ．（２００８年）．Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７～３８８頁；Ｒａｗｓｔｒｏｎ ＡＣ（２００６年５月）「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ」Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｙｔｏｍも参照）。

【0061】

「静止状態の」は、本明細書において、細胞が活性に増殖していない細胞状態を指す。

【0062】

「活性化された」は、本明細書において、細胞が活性に増殖している、および／または刺激に応答してサイトカインを産生している細胞状態を指す。

【0063】

用語「分化する」および「分化した」は、本明細書において、ある細胞型または状態から別の細胞型または状態への、細胞の表現型の変化を指す。例えば、形質細胞へと移行するメモリーＢ細胞は、分化している。

【0064】

用語「被験体」は、適応免疫応答を誘発することができる、生きている生物を含むように意図される（例えば、哺乳動物）。被験体の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびこれらのトランスジェニック種が挙げられる。一実施形態では、被験体は、ヒトである。Ｂ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、感染部位由来の組織、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、Ｂ細胞の供給源は、ＰＢＭＣである。本開示のある特定の実施形態では、本技術分野で利用できるいずれかの数のＢ細胞株を使用することができる。

【0065】

本明細書に記載されている方法のある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（高密度溶液の調製に使用することができる、スクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）分離等、当業者に公知のいずれかの数の技法を使用して、被験体から採取された血液の単位から得ることができる。好まれる一実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって、個体の循環血由来の細胞が得られる。アフェレーシス産物は典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞を含むリンパ球、赤血球細胞および血小板を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の加工ステップのために適切なバッファーまたは培地中に細胞を置くことができる。本明細書に記載されている方法の一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠くことができる、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠くことができる。当業者であれば容易に認めるであろうが、洗浄ステップは、製造業者の指示に従って半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ）を使用することによる等、当業者にとって公知の方法によって達成することができる。洗浄後に、細胞は、例えばＰＢＳ等、種々の生体適合性バッファーに再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接的に再懸濁することができる。

【0066】

Ｂ細胞は、本技術分野で公知の技法を使用して、末梢血または白血球アフェレーシスから単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して単離することができ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、Ｒｏｓｅｔｔｅ四量体複合体システム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）またはＭＡＣＳ（商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）等、本技術分野で公知の種々の抗体のいずれかを使用した負のまたは正の選択によって精製することができる。ある特定の実施形態では、メモリーＢ細胞は、Ｊｏｕｒｄａｎら（Ｂｌｏｏｄ．２００９年１２月１０日；１１４巻（２５号）：５１７３～８１頁）によって記載されている通りに単離される。例えば、抗ＣＤ２磁気ビーズを使用したＣＤ２＋細胞の除去後に、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞をＦＡＣＳによって選別することができる。骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）は、抗ＣＤ１３８磁気マイクロビーズ選別または他の同様の方法および試薬を使用して精製することができる。ヒトＢ細胞は、例えば、ＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。ヒトメモリーＢ細胞は、例えば、メモリーＢ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。

【0067】

Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＢ細胞単離キット（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）等、他の単離キットが市販されている。ある特定の実施形態では、休止Ｂ細胞は、（Ｄｅｆｒａｎｃｏら（１９８２年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１５５巻：１５２３頁）に記載されている通り、不連続パーコール勾配における沈降によって調製することができる。

【0068】

一実施形態では、ＰＢＭＣは、勾配に基づく精製（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標））を使用して、血液試料から得られる。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシスに基づく採取から得られる。一実施形態では、Ｂ細胞は、汎Ｂ細胞を単離することによりＰＢＭＣから単離される。単離ステップは、正のおよび／または負の選択を利用することができる。一実施形態では、負の選択は、抗ＣＤ３コンジュゲートマイクロビーズを使用したＴ細胞の枯渇を含み、これにより、Ｔ細胞枯渇画分を提供する。さらなる実施形態では、メモリーＢ細胞は、ＣＤ２７に対する正の選択によって、汎Ｂ細胞またはＴ細胞枯渇画分から単離される。

【0069】

特定の一実施形態では、メモリーＢ細胞は、望まれない細胞の枯渇、およびＣＤ２７ ＭｉｃｒｏＢｅａｄによるその後の正の選択によって単離される。望まれない細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、血小板および赤血球系細胞は、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対するビオチン化抗体のカクテルならびに抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄを使用して枯渇させることができる。

【0070】

一実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞が得られる。「スイッチしたメモリーＢ細胞」または「スイッチしたＢ細胞」は、本明細書において、アイソタイプクラススイッチングを起こしたＢ細胞を指す。一実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞は、ＩｇＧに対して正に選択される。別の実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞は、ＩｇＤおよびＩｇＭ発現細胞を枯渇させることにより得られる。スイッチしたメモリーＢ細胞は、例えば、スイッチしたメモリーＢ細胞キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。

【0071】

例えば、特定の一実施形態では、非標的細胞は、ビオチン化ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）、抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＤ抗体のカクテルで標識することができる。このような細胞はその後に、抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄで磁気標識することができる。高度に純粋なスイッチしたメモリーＢ細胞は、磁気標識された細胞の枯渇によって得ることができる。

【0072】

さらなる実施形態では、例えば、ＣＤ２７遺伝子（またはメモリーＢ細胞に特異的であり、ナイーブＢ細胞において発現されない他の遺伝子）等、メモリーＢ細胞に特有の遺伝子由来のプロモーター配列が、例えば、メトトレキセートの存在下でメモリーＢ細胞の正の選択を可能にする変異したジヒドロ葉酸レダクターゼ等、選択可能マーカーの発現の駆動に使用される。別の実施形態では、例えば、ＣＤ１９遺伝子等、汎Ｂ細胞遺伝子由来のプロモーター配列が、例えば、メトトレキセートの存在下でメモリーＢ細胞の正の選択を可能にする変異したジヒドロ葉酸レダクターゼ等、選択可能マーカーの発現の駆動に使用される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を使用して、またはシクロスポリンの添加により枯渇される。別の実施形態では、ＣＤ１３８＋細胞は、正の選択によって汎Ｂ細胞から単離される。さらに別の実施形態では、ＣＤ１３８＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。別の実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、正の選択によって汎Ｂ細胞から単離される。さらに別の実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。一実施形態では、ＣＤ２７＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。別の実施形態では、メモリーＢ細胞および／または形質細胞は、本技術分野で利用できるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法を使用して、ＰＢＭＣから選択的に拡大増殖される。

【0073】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢ細胞の培養
メモリーＢ細胞等、Ｂ細胞は、Ｂ細胞を活性化し、形質細胞もしくは形質芽球またはその両方へと分化させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を使用して培養することができる。当業者によって認識されるであろうが、形質細胞は、標準フローサイトメトリー方法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンによって同定することができる。例えば、終末分化した形質細胞は、比較的少ない表面抗原を発現し、ＣＤ１９およびＣＤ２０等、共通汎Ｂ細胞マーカーを発現しない。その代わりに、形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８およびＩＬ－６Ｒの発現、ならびにＣＤ４５の発現欠如によって同定することができる。ナイーブＢ細胞はＣＤ２７－であり、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋であり、形質細胞はＣＤ２７＋＋であるため、ＣＤ２７を、形質細胞の同定に使用することもできる。形質細胞は、高レベルのＣＤ３８およびＣＤ１３８を発現する。

【0074】

一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１３８－メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ１３８－、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。

【0075】

一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ１３８－メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ２０－、ＣＤ１３８－、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。

【0076】

一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ３８－、ＣＤ１３８－メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ２０－、ＣＤ３８－、ＣＤ１３８－、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。

【0077】

一実施形態では、Ｂ細胞は、１種または複数のＢ細胞活性化因子、例えば、Ｂ細胞を活性化および／または分化させることが公知の種々のサイトカイン、増殖因子または細胞株のいずれかと接触される（例えば、Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １９９８年、９２巻：４５０９～４５２０頁；Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ ２００９年、１ １３巻：１４２２～１４３１頁を参照）。斯かる因子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４およびＩＬ－３５、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－δ、Ｃ型ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２、Ｃ－Ｃ型ケモカイン（現在まで、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８を含む）およびＣＸＣ型ケモカイン（現在まで、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７を含む）、ならびにＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＮＦ－α、４－１ ＢＢリガンド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＬｙＳ）、ＦＡＳリガンド、ｓＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌの多量体バージョンを含む；例えば、複数のｓＣＤ４０Ｌ分子を一緒にグループ化するための、抗ポリ－ヒスチジンｍＡｂと組み合わせた、ヒスチジンタグ付き可溶性組換えＣＤ４０Ｌ）、リンホトキシン、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ）、ＣｐＧ、ならびに他のｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＣｐＧ）からなる群より選択することができるが、これらに限定されない。

【0078】

Ｂ細胞活性化因子は、様々な濃度でｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物に添加して、所望の成果（例えば、拡大増殖または分化）を達成することができる。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の拡大増殖において利用される。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の分化において利用される。別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の拡大増殖および分化の両方において利用される。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、拡大増殖および分化のために同じ濃度で提供される。別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、拡大増殖のために第１の濃度で、また、分化のために第２の濃度で提供される。Ｂ細胞活性化因子を、１）Ｂ細胞の拡大増殖において利用し、Ｂ細胞の分化においては利用しないことができる、２）Ｂ細胞の分化において利用し、Ｂ細胞の拡大増殖においては利用しないことができる、または３）Ｂ細胞の拡大増殖および分化において利用することができることが企図される。

【0079】

例えば、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－１０から選択される１種または複数のＢ細胞活性化因子と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、０．２５～５．０μｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、０．５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、架橋剤（ＨＩＳタグ付きＣＤ４０Ｌと組み合わせた抗ＨＩＳ抗体等）が、ＣＤ４０Ｌの多量体の作製に使用される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの分子は、タンパク質多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域またはロイシンジッパードメイン）を使用して、共有結合により連結される、または一体に保持される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ビーズにコンジュゲートされる。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、フィーダー細胞から発現される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－２の濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－４の濃度は、２ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－１０の濃度は、４０ｎｇ／ｍｌである。

【0080】

一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１から選択される１種または複数のＢ細胞活性化因子と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、０．２５～５．０μｇ／ｍｌ
ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、０．５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、架橋剤（ＨＩＳタグ付きＣＤ４０Ｌと組み合わせた抗ＨＩＳ抗体等）が、ＣＤ４０Ｌの多量体の作製に使用される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの分子は、タンパク質多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域またはロイシンジッパードメイン）を使用して、共有結合により連結される、または一体に保持される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ビーズにコンジュゲートされる。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、フィーダー細胞から発現される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－２の濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－４の濃度は、２ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－１０の濃度は、４０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５０～１５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－１５の濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５０～１５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２１と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－２１の濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１と共に培養される。

【0081】

例えば、一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、Ｂ細胞活性化因子ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１と共に培養され、ＣＤ４０Ｌは、架橋剤により架橋されて、ＣＤ４０Ｌの多量体を作製する。斯かる培養系は、培養期間全体（例えば、７日間の培養期間）にわたって維持することができ、Ｂ細胞は、目的の導入遺伝子（例えば、例えば、ＩＤＵＡ等、外因的ポリペプチド）を発現するようにトランスフェクトまたは他の仕方で操作されている。導入遺伝子は、Ｂ細胞に組み込むことができる（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクターにより）。導入遺伝子は、トランスポゾンの使用により、Ｂ細胞において発現させることができる。導入遺伝子は、Ｂ細胞のゲノムへの導入遺伝子の標的化組込みのために、Ｂ細胞において発現させることができる。標的化組込みは、相同組換えによるものとなることができる。相同組換えは、ヌクレアーゼによって誘導された二本鎖切断の際に起こることができる。ヌクレアーゼは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）となることができる、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９－ヌクレアーゼ系によるものとなることができる。

【0082】

別の例では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の分化のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１およびＰ－クラスＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ｐ－ＯＤＮ）から選択される１種または複数のＢ細胞活性化因子と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５～７５ｎｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５０～７５０Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ－αと共に培養される。一実施形態では、ＩＦＮ－αの濃度は、５００Ｕ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５～５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－２の濃度は、２０Ｕ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５～７５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－６の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－１０の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－１５の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２１と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ－２１の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１～５０μｇ／ｍｌ ｐ－ＯＤＮと共に培養される。一実施形態では、ｐ－ＯＤＮの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。

【0083】

一実施形態では、Ｂ細胞は、フィーダー細胞の上で接触または培養される。一実施形態では、フィーダー細胞は、ストロマ細胞株、例えば、マウスストロマ細胞株Ｓ１７またはＭＳ５である。別の実施形態では、単離されたＣＤ１９＋細胞は、ＣＤ４０－リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）を発現する線維芽細胞の存在下で、ＩＬ－１０およびＩＬ－４等、１種または複数のＢ細胞活性化因子サイトカインと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、組織培養プレートまたはビーズ等の表面に結合された状態で提供される。別の実施形態では、精製されたＢ細胞は、フィーダー細胞の存在または非存在下で、ＣＤ４０Ｌ、ならびにＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ｐ－ＯＤＮ、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ６およびＩＦＮ－αから選択される１種または複数のサイトカインまたは因子と共に培養される。

【0084】

別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、Ｂ細胞または他のフィーダー細胞へのトランスフェクションによって提供される。この文脈において、Ｂ細胞から抗体分泌細胞への分化を促進する１種もしくは複数の因子、および／または抗体産生細胞の長寿命を促進する１種もしくは複数の因子を使用することができる。斯かる因子は、例えば、Ｂｌｉｍｐ－１、ＴＲＦ４、Ｂｃｌ－ｘｌもしくはＢｃｌ５のような抗アポトーシス因子、またはＣＤ４０受容体の構成的に活性な変異体を含む。さらに、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）等、下流シグナル伝達分子の発現を促進する因子を、Ｂ細胞の活性化／分化において使用することもできる。この点に関して、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞活性化、細胞生存および抗アポトーシス機能は、大部分は、ＴＲＡＦ１～６によって媒介される（例えば、Ｒ．Ｈ． Ａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２巻（１９９８年）２８２１～２８３０頁を参照）。ＴＲＡＦシグナル伝達の下流エフェクターは、細胞および免疫機能の様々な側面に関与する遺伝子をオンにすることができる、ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１ファミリーにおける転写因子を含む。さらに、ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１の活性化は、抗アポトーシス遺伝子の転写により、アポトーシスからの細胞保護をもたらすことが示された。

【0085】

別の実施形態では、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が、Ｂ細胞の活性化および／または分化のために、または抗体産生細胞の長寿命を促進するために使用される。ＥＢＶ由来のタンパク質として、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２、ＥＢＥＲ、ｍｉＲＮＡ、ＥＢＶ－ＥＡ、ＥＢＶ－ＭＡ、ＥＢＶ－ＶＣＡおよびＥＢＶ－ＡＮが挙げられるがこれらに限定されない。

【0086】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供されている方法を使用したＢ細胞の活性化因子とＢ細胞との接触は、とりわけ、細胞増殖（すなわち、拡大増殖）、活性化された成熟Ｂ細胞と一貫した表現型へのｌｇＭ＋細胞表面表現型のモジュレーション、Ｉｇの分泌、およびアイソタイプスイッチングをもたらす。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ（商標）細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等、公知かつ市販の細胞分離キットを使用して単離することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ４０Ｌ線維芽細胞は、本明細書に記載されている方法における使用前に照射される。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＩＬ－３、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン、ＳＣＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、Ｇ－ＣＳＦおよびＣｐＧのうち１種または複数の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、本方法は、低レベルの繋留されたＣＤ４０Ｌおよび／またはプレートもしくはビーズに結合されたＣＤ４０Ｌを提供する形質転換ストロマ細胞（例えば、ＭＳ５）と併せて、上述の因子のうち１種または複数の存在下でＢ細胞を培養するステップを含む。

【0087】

上に記述されている通り、Ｂ細胞活性化因子は、Ｂ細胞の拡大増殖、増殖または分化を誘導する。したがって、Ｂ細胞は、上に列挙されている１種または複数のＢ細胞活性化因子と接触されて、拡大増殖された細胞集団を得る。細胞集団は、トランスフェクションの前に拡大増殖することができる。それに代えてまたはその上、細胞集団は、トランスフェクションの後に拡大増殖することができる。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む（例えば、Ｎｅｒｏｎら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１２年、７巻（１２号）：ｅ５１９４６頁を参照）。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＣｐＧおよびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１およびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１および多量体化されたＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。

【0088】

別の実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、Ｂ細胞へと導入された導入遺伝子によって誘導および／または増強される。例えば、そのリガンド（例えば、可溶性リガンドまたは細胞表面発現リガンド）と結合した際に細胞シグナル伝達経路（例えば、ＣＤ４０の下流のシグナル伝達）を誘導する組換え受容体または操作された受容体を含有するＢ細胞。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ４０導入遺伝子の発現のため、ＣＤ４０を過剰発現する。別の実施形態では、Ｂ細胞は、例えば、組換えにより操作された抗体を含む、操作された受容体を発現する。一実施形態では、操作された受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様であり、ｓｃＦｖおよびＢ細胞受容体（例えば、ＣＤ４０）の細胞内シグナル伝達部分の融合タンパク質を含む。

【0089】

一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、細胞培養物に添加された小分子化合物によって誘導および／または増強される。例えば、ＣＤ４０に結合しこれを二量体化する化合物を使用して、ＣＤ４０シグナル伝達経路を誘発することができる。

【0090】

当業者に公知の通り、本方法において種々の培養培地のいずれかを使用することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、２０００～２００９年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．よりを参照）。一実施形態では、本明細書に記載されている方法における使用のための培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ウシ胎仔または他の適切な血清を含有するまたは含有しない）が挙げられるがこれに限定されない。例示的な培地として、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０も挙げられるがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）または還元剤（例えば、Ｎ－アセチル－システイン、２－メルカプトエタノール）、１種または複数の抗生物質、および／またはインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムおよびシクロスポリン等の添加物を含むことができる。一部の実施形態では、ＩＬ－６、可溶性ＣＤ４０Ｌおよび架橋増強物質を使用することもできる。

【0091】

Ｂ細胞は、所望の分化および／または活性化を達成するための条件下および十分な期間培養される。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％が、所望の通りに分化および／または活性化されるような条件下および十分な期間培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、形質芽球および形質細胞の混合集団へと分化される。当業者によって認識されるであろうが、形質芽球および形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＩＬ－６Ｒ、ＣＤ２７^ｈｉｇｈおよびＣＤ１３８のうち１種もしくは複数の発現、および／またはＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４５のうち１種もしくは複数の発現の欠如もしくは低下等、本明細書の他の箇所に記載されている通りに標準フローサイトメトリー方法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンによって同定することができる。当業者によって理解されるであろうが、メモリーＢ細胞は一般に、ＣＤ２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８－であるが、初期形質芽球は、ＣＤ２０－、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋である。一実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して培養された細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８－である。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０－、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８＋の表現型を有する。ある特定の実施形態では、細胞は、１～７日間培養される。さらなる実施形態では、細胞は、７、１４、２１日間またはそれよりも長く培養される。よって、細胞は、適切な条件下で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９日間またはそれよりも長く培養することができる。細胞は再播種され、本技術分野で公知の技法を使用して、必要に応じて培地およびサプリメントを添加または交換することができる。

【0092】

ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、分化および活性化されて、Ｉｇを産生する、および／または導入遺伝子を発現するような、条件下および十分な期間培養される。

【0093】

Ｂ細胞活性化の誘導は、ＲＮＡへの^３Ｈ－ウリジン取り込み（Ｂ細胞が分化するにつれて、ＲＮＡ合成は増加する）等の技法によって、または細胞増殖に伴うＤＮＡ合成を測定する^３Ｈ－チミジン取り込みによって、測定することができる。一実施形態では、インターロイキン－４（ＩＬ－４）を、Ｂ細胞増殖の増強に適切な濃度（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）で培養培地に添加することができる。

【0094】

あるいは、Ｂ細胞活性化は、免疫グロブリン分泌の関数として測定される。例えば、ＣＤ４０Ｌが、ＩＬ－４（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－５（例えば、５ｎｇ／ｍｌ）、またはＢ細胞を活性化する他のサイトカインと共に、休止Ｂ細胞に添加される。活性化されたＢ細胞に典型的な細胞表面マーカーを測定するために、フローサイトメトリーを使用することもできる。例えば、Ｃｉｖｉｎ ＣＩ， Ｌｏｋｅｎ ＭＲ、Ｉｎｔ’ｌ
Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ９８７；５巻：１～１６頁；Ｌｏｋｅｎ， ＭＲら、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ， Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ａｎｄ Ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｉｎｅａｇｅｓ
ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ， ｉｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｌａｅｒｕｍ ＯＤ， Ｂｊｅｒｋｓｎｅｓ Ｒ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９２年；３１～４２頁；およびＬｅＢｅｉｎ ＴＷら（ｅｔ ａｉ）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９０年；４巻：３５４～３５８頁を参照されたい。

【0095】

２、３、４、５、６、７、８、９日間またはそれよりも長くから、一般に、３日間前後等、適切な期間にわたる培養後に、追加的な容量の培養培地を添加することができる。個々の培養物由来の上清を、培養における様々な時点で収集し、Ｎｏｅｌｌｅら（１９９１年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６巻：１１１８～１１２４頁に記載されている通りにＩｇＭおよびＩｇＧ１に関して定量化することができる。一実施形態では、培養物は、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴまたは本技術分野で公知の他のアッセイを使用して、目的の導入遺伝子の発現に関して収集および測定される。

【0096】

別の実施形態では、ＥＬＩＳＡが、抗体アイソタイプ産生、例えば、ＩｇＭ、または目的の導入遺伝子の産物の測定に使用される。ある特定の実施形態では、捕捉抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ等、市販の抗体を使用して、ＩｇＧ決定が為され、続いて、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇ、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび基質等、種々の適切な検出試薬のいずれかを使用して検出が為される。

【0097】

ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、細胞の数が、培養開始時のＢ細胞の数の、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００倍またはそれよりも多くなるような、条件下および十分な期間培養される。一実施形態では、細胞の数は、培養開始時のＢ細胞の数の１０～１０００倍（その中の連続した整数を含む）である。例えば、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも１０倍である。別の実施形態では、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも１００倍である。一実施形態では、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも５００倍である。

【0098】

Ｂ細胞の操作
一実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、導入遺伝子をトランスフェクトされる。Ｂ細胞をトランスフェクトするための例示的な方法は、ＷＯ２０１４／１５２８３２およびＷＯ２０１６／１００９３２に提供されており、これらは両者共に、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。Ｂ細胞のトランスフェクションは、Ｂ細胞へとＤＮＡまたはＲＮＡを導入するための本技術分野で利用できる種々の方法のいずれかを使用して達成することができる。適した技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、圧力媒介性トランスフェクションまたは「細胞圧搾（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）」（例えば、ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅマイクロ流体システム、ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ナノ粒子媒介性もしくはリポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニアを使用した形質導入を含むことができる。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ １３巻：１９７頁；ＵＳ５，１２４，２５９；ＵＳ５，２９７，９８３；ＵＳ５，２８３，１８５；ＵＳ５，６６１，０１８；ＵＳ６，８７８，５４８；ＵＳ７，７９９，５５５；ＵＳ８，５５１，７８０；およびＵＳ８，６３３，０２９を参照されたい。Ｂ細胞に適した市販のエレクトロポレーション技法の一例は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）トランスフェクション技術である。

【0099】

トランスフェクションは、上述の１種または複数の活性化および／または分化因子の存在下、単離されたＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の前にまたはその間に行うことができる。例えば、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９日目にトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２または３日目にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、細胞は、２日目にトランスフェクトされる。例えば、細胞は、例えば、プラスミド、トランスポゾン、ミニサークルまたは自己複製ＲＮＡの送達のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の２日目にエレクトロポレーションされる。別の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の４、５、６または７日目にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の６日目にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の５日目にトランスフェクトされる。

【0100】

一実施形態では、細胞は、活性化の前に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。別の実施形態では、細胞は、活性化の間に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、活性化の後に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、分化の前に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。別の実施形態では、細胞は、分化の間に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、分化の後に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、導入遺伝子の標的化組込みにより）。

【0101】

一実施形態では、非ウイルスベクターが、メモリーＢ細胞および／または形質細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの送達に使用される。例えば、ウイルス組込み系の必要なしに、メモリーＢ細胞および／または形質細胞のトランスフェクションを容易にすることができる系は、トランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾン系）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、メガヌクレアーゼ、ミニサークル、レプリコン、人工染色体（例えば、細菌人工染色体、哺乳動物人工染色体および酵母人工染色体）、プラスミド、コスミドおよびバクテリオファージを限定することなく含む。

【0102】

一部の実施形態では、斯かる非ウイルス依存性ベクター系は、本技術分野で公知のまたは後述するウイルスベクターにより送達することもできる。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）は、１種または複数の非ウイルスベクター（例えば、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）メガヌクレアーゼのうち１種または複数等）、または標的化組込みを容易にすることができる他のいずれかの酵素／補完的ベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの送達に利用される。したがって、一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞および／または形質細胞等、Ｂ細胞）は、標的化組込み方法により、外因的配列（例えば、ＩＤＵＡ等の治療用ポリペプチドをコードする配列）を発現するように操作することができる。斯かる方法は、本技術分野で公知であり、１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ）を使用して、細胞における内在性遺伝子座を切断するステップと、内在性遺伝子座に組み込まれ、細胞内で発現されるように、導入遺伝子を細胞に投与するステップとを含むことができる。導入遺伝子は、ヌクレアーゼによる切断ポイントにまたはその付近において宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるドナー配列に含まれていてよい。

【0103】

外因的配列（例えば、ＩＤＵＡ等の治療用ポリペプチドをコードする配列）の組込みは、組換えにより起こることができる。当業者には明らかであろうが、「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えが挙げられるがこれらに限定されない、２本のポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。組換えは、相同組換えとなることができる。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性修復機構により細胞における二本鎖切断の修復の際に行われる、斯かる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を利用し、それによって、「ドナー」分子（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列または斯かる配列を含むドナーベクター）は、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）を修復するための鋳型として、細胞のＤＮＡ修復の仕組みによって利用され、これらの手段は、ドナーから標的への遺伝情報の移入を引き起こす。ＨＲ指向性組込みの一部の実施形態では、ドナー分子は、ゲノムに対する相同性の少なくとも２個の領域を含有することができる（「相同性アーム」）。一部の実施形態では、相同性アームは、例えば、少なくとも５０～１００塩基対の長さとなることができる。相同性アームは、標的化組込みが起こるべき、切断部位に隣接するゲノムＤＮＡの領域に対する実質的ＤＮＡ相同性を有することができる。ドナー分子の相同性アームは、標的ゲノムまたは標的ＤＮＡ遺伝子座に組み込まれるべきＤＮＡに隣接することができる。染色体の切断と、それに続く鋳型としてプラスミドＤＮＡの相同領域を使用した修復は、相同性アームによって隣接される介在する導入遺伝子のゲノムへの移入をもたらすことができる。例えば、Ｋｏｌｌｅｒら（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻（２２号）：８９２７～８９３１頁；Ｔｈｏｍａｓら（１９８６年）Ｃｅｌｌ ４４巻（３号）：４１９～４２８頁を参照されたい。この種類の相同性指向性標的化組込みの頻度は、標的領域の近傍での二本鎖切断の計画的作製によって最大１０^５倍増加され得る（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７巻（９号）：８５１～８５７頁；Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１１号）：１２９８～１３０６頁；Ｍｏｅｈｌｅら（２００７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４巻（９号）：３０５５～３０６０頁；Ｒｏｕｅｔら（１９９４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻（１３号）：６０６４～６０６８頁。

【0104】

導入遺伝子が標的細胞のゲノムに組み込まれ得るような（例えば、ＨＲ等、組換えによる）、ゲノム遺伝子座の標的化切断を媒介することができるいずれかのヌクレアーゼは、本開示に従った細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）の操作において利用することができる。

【0105】

二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ等の部位特異的ヌクレアーゼによって、または特異的切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｔ ＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して作製することができる。例えば、あらゆる目的のためそれらの開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｂｕｒｇｅｓｓ（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４巻：８０～８１頁、Ｕｍｏｖら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ ４３５巻（７０４２号）：６４６～５１頁；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００９０２６３９００号；同第２００９０１１７６１７号；同第２０１０００４７８０５号；同第２０１１０２０７２２１号；同第２０１１０３０１０７３号および国際公開ＷＯ２００７／０１４２７５を参照されたい。

【0106】

一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性標的化組込みにより操作される。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、１個または複数のジンクフィンガー、およびヌクレアーゼ酵素を介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（ＺＦＰ）（または結合ドメイン）のカップリングによる特異性で、標的ヌクレオチド配列を認識および切断することができる酵素である。ＺＦＮは、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに操作可能に連結されたいずれか適した切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ酵素）を含んで、標的ＤＮＡ配列の部位特異的切断を容易にすることができる操作されたＺＦＮを形成することができる（例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３巻（３号）：１１５６～１１６０頁を参照）。例えば、ＺＦＮは、ＦＯＫ１酵素またはＦＯＫ１酵素の部分に連結された標的特異的ＺＦＰを含むことができる。一部の実施形態では、ＺＦＮ媒介性標的化組込みアプローチにおいて使用されるＺＦＮは、ＺＦＰにそれぞれ結合されたＦＯＫ１酵素のサブユニットをそれぞれ含む２種の別々の分子を利用し、各ＺＦＰは、標的切断部位に隣接するＤＮＡ配列に対する特異性を有し、この２種のＺＦＰが、それぞれの標的ＤＮＡ部位に結合するとき、ＦＯＫ１酵素サブユニットは、互いに近接させられ、一体に結合し、標的切断部位を切断するヌクレアーゼ活性を活性化する。ＺＦＮは、種々の生物におけるゲノム改変に使用されてきた（例えば、それらの全体を参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５）。カスタムＺＦＰおよびＺＦＮは、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、斯かるカスタムＺＦＮを使用して、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。

【0107】

一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ媒介性組込みにより操作される。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノム操作に使用され得る細菌系に基づく操作されたヌクレアーゼ系である。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが、細菌に侵入するとき、侵入者のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、このｃｒＲＮＡは、部分的相補性の領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同の領域にＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって指定された部位におけるＤＳＢに平滑断端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を要求する。この系は現在、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを１分子（「シングルガイドＲＮＡ」）へと組み合わせることができるように操作されており、シングルガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに相当する部分は、任意の所望の配列を標的化するようＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするように操作することができる（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻、８１６～８２１頁、Ｊｉｎｅｋら（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００４７１頁およびＤａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００５６３頁を参照）。よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するように操作することができ、ＤＳＢの修復は、誤りがちな修復の増加の原因となる修復阻害剤の使用によって影響され得る。

【0108】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ媒介性組込みは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲを利用する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けされた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断を４つの逐次的なステップで実行する。第１に、２種の非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介して、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにする。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のための追加的な要件である、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対形成により、標的ＤＮＡへとＣａｓ９を方向付ける。第４に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作製する。

【0109】

Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡ、および同一の直列反復（ＤＲ）を散りばめたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ゲノム操作を達成するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在していなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物によりまたは別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、それによると、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給）に融合されて、キメラｃｒ－ＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを作製する（シングルガイドＲＮＡとも命名される）。（Ｊｉｎｅｋ、前記箇所およびＣｏｎｇ、前記箇所を参照）。

【0110】

一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含有するシングルガイドＲＮＡは、任意の所望の配列を標的化するようにＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするように操作することができる（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻、８１６～８２１頁、Ｊｉｎｅｋら（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００４７１頁、Ｄａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００５６３頁）。よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するように操作することができる。

【0111】

カスタムＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から市販されており、斯かるカスタムシングルガイドＲＮＡ配列を使用して、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。組換えのための一本鎖ＤＮＡ鋳型は、合成することができる（例えば、本技術分野で公知のおよび市販のオリゴヌクレオチド合成方法により）、またはベクター、例えば、ＡＡＶ等のウイルスベクター中に提供することができる。

【0112】

一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物のＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介性標的化組込みにより操作される。「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１個または複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも称される）は典型的に、３３～３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。ＴＡＬ－エフェクターは、タンデム反復の核局在化配列、酸性転写活性化ドメインおよび中央集中ドメインを含有することができ、各反復は、このようなタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となるおよそ３４アミノ酸を含有する。（例えば、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ら（２００６年）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３巻（３号）：２５６～２７２頁）。ＴＡＬエフェクターは、およそ１０２ｂｐを含むタンデム反復に見出される配列に依存し、反復は典型的に、互いに９１～１００％相同である（例えば、Ｂｏｎａｓら（１９８９年）ＭｏＩ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８巻：１２７～１３６頁）。このようなＤＮＡ結合反復を操作して、新たな組み合わせおよび数の反復をタンパク質に入れて、新たな配列と相互作用し、非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製することができる（例えば、Ｂｏｎａｓら（１９８９年）ＭｏＩ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８巻：１２７～１３６頁）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結させて、標的特異的ＤＮＡ配列を切断するためのＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）を得ることができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）。

【0113】

カスタムＴＡＬＥＮは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から市販されており、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。

【0114】

一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物のメガヌクレアーゼ媒介性標的化組込みにより操作される。メガヌクレアーゼ（または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」）は、１２塩基対を超える認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合しこれを切断するエンドヌクレアーゼである。天然に存在するメガヌクレアーゼは、単量体（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ）または二量体（例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ）となることができる。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対切断部位を認識し、一般的に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへとグループ化される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５～３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。用語「メガヌクレアーゼ」は、単量体メガヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、および会合して二量体メガヌクレアーゼを形成する単量体を含む。

【0115】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物は、操作された（天然に存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを活用する。Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩ等、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５～３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５～９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：２９５２～２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６～６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９～６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体としての文脈において（すなわち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメインを含むように）変更することができる、または異種切断ドメインに融合することができる。カスタムメガヌクレアーゼは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から市販されており、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。

【0116】

Ｂ細胞の操作は、例えば、コードされたヌクレアーゼを含むベクターがＢ細胞によって取り入れられるような、ヌクレアーゼをコードする１種または複数のベクターによる、Ｂ細胞への１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ）の投与を含むことができる。ベクターは、ウイルスベクターとなることができる。

【0117】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質細胞）における特異的内在性遺伝子座（例えば、目的のセーフハーバー遺伝子または遺伝子座）を切断し、１種または複数の外因的（ドナー）配列（例えば、導入遺伝子）が投与される（例えば、これらの外因的配列を含む１種または複数のベクター）。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態では、ドナー導入遺伝子の標的化挿入は、細胞のゲノムへの導入遺伝子の組込み部位における、相同性指向性修復（ＨＤＲ）、非相同性修復機構（例えば、ＮＨＥＪ媒介性末端捕捉）、またはヌクレオチド（例えば、内在性配列）の挿入および／または欠失により行うことができる。

【0118】

一実施形態では、Ｂ細胞をトランスフェクトする方法は、ベクターとＢ細胞との接触に先立つＢ細胞のエレクトロポレーションを含む。一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８または９日目にエレクトロポレーションされる。一実施形態では、細胞は、プラスミドの送達のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の２日目にエレクトロポレーションされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８または９日目に、トランスポゾンを使用してトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８または９日目に、ミニサークルを使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、スリーピングビューティートランスポゾンのエレクトロポレーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の２日目に行われる。

【0119】

一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも部分をトランスフェクトするのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むベクターと接触される。一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％をトランスフェクトするのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むベクターと接触される。さらなる実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％をトランスフェクトするのに十分な条件下、ベクターと接触される。特定の一実施形態では、本明細書に記載されている通りにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＢ細胞がトランスフェクトされ、この場合、培養されたＢ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％をトランスフェクトするのに十分な条件下、本明細書に記載されているベクターと接触される。

【0120】

ウイルスベクターを用いて、メモリーＢ細胞および／または形質細胞を形質導入することができる。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルスアデノウイルスベクター、ならびにアンプリコンベクターを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶに由来するベクターを限定することなく含む（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｋｒｉｓｋｙ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５巻：１５１７～３０頁、１９９８年；Ｐｆｅｉｆｅｒ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．２巻：１７７～２１１頁、２００１年を参照）。

【0121】

一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８または９日目に、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）により形質導入される。特定の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の５日目に、ウイルスベクターにより形質導入される。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１日目に、麻疹ウイルスシュードタイプ化レンチウイルスにより形質導入される。

【0122】

一実施形態では、Ｂ細胞は、本技術分野における種々の公知技法のいずれかを使用して、レトロウイルスベクターにより形質導入される（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年４月１２日、２７２巻：２６３～２６７頁；Ｂｌｏｏｄ ２００７年、９９巻：２３４２～２３５０頁；Ｂｌｏｏｄ ２００９年、１ １３巻：１４２２～１４３１頁；Ｂｌｏｏｄ ２００９年１０月８日；１ １４巻（１５号）：３１７３～８０頁；Ｂｌｏｏｄ．２００３年；１０１巻（６号）：２１６７～２１７４頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）を参照）。Ｂ細胞のウイルス形質導入に関する追加的な記載は、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、ＷＯ２０１１／０８５２４７およびＷＯ２０１４／１５２８３２に見出すことができる。

【0123】

例えば、ドナー由来のＰＢＭＣ、ＢまたはＴリンパ球、およびＢ－ＣＬＬ等の他のＢ細胞がん細胞を単離し、ＩＭＤＭ培地もしくはＲＰＭＩ １６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）、または本明細書に記載されている他の適した培地において、無血清で、または血清（例えば、５～１０％ＦＣＳ、ヒトＡＢ血清および血清代替物）およびペニシリン／ストレプトマイシン、および／またはトランスフェリンおよび／またはインスリン等の他の適したサプリメントを補充して培養することができる。一実施形態では、細胞は、４８ウェルプレートにおける１×１０^５個の細胞で播種され、濃縮されたベクターは、慣例的な方法論を使用した当業者によって慣例的に最適化され得る様々な用量で添加される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０％ＡＢ血清、５％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈｌＬ－１５および５ｎｇ／ｍｌ ｒｈｌＬ－２を補充したＲＰＭＩにおいてＭＳ５細胞単層に移入され、培地は必要に応じて定期的に新しくする。当業者によって認識されるであろうが、他の適した培地およびサプリメントを所望の通りに使用することができる。

【0124】

ある特定の実施形態は、レトロウイルスベクター、またはレトロウイルスに由来するベクターの使用に関する。「レトロウイルス」は、動物細胞に感染することができ、感染初期段階で逆転写酵素を利用して、自身のＲＮＡゲノムからＤＮＡコピーを生成し、次いでこれが典型的に宿主ゲノムに組み込まれる、エンベロープ型ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスベクターの例として、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター、造血前駆体細胞およびその分化した後代等の標的細胞における長期安定的発現をもたらすマウス幹細胞ウイルスに基づくレトロウイルスベクター（例えば、Ｈａｗｌｅｙら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３巻：１０２９７～１０３０２頁、１９９６年；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ９２巻：８７７～８８７頁、１９９８年を参照）、ハイブリッドベクター（例えば、Ｃｈｏｉら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９巻：２３６～２４６頁、２００１年を参照）、ならびにレンチウイルスベクター等の複合レトロウイルス由来ベクターが挙げられる。

【0125】

一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも部分を形質導入するのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むレトロウイルスベクターと接触される。一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも２％を形質導入するのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むレトロウイルスベクターと接触される。さらなる実施形態では、Ｂ細胞は、休止Ｂ細胞の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％を形質導入するのに十分な条件下、ベクターと接触される。特定の一実施形態では、本明細書に記載されている通りにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された、分化および活性化されたＢ細胞が形質導入され、この場合、培養された分化／活性化されたＢ細胞は、分化および活性化されたＢ細胞の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％を形質導入するのに十分な条件下、本明細書に記載されているベクターと接触される。

【0126】

ある特定の実施形態では、形質導入の前に、細胞は、当業者に公知で慣例的に最適化される適切な濃度のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ（ＳＡＣ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および／またはＩＬ－２で予め刺激される。当業者に公知で本明細書に記載されている通り、他のＢ細胞活性化因子（例えば、ＰＭＡ）を使用することができる。

【0127】

上に記す通り、ある特定の実施形態は、レンチウイルスベクターを用いる。用語「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞の両方に感染することができる、複合レトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの例として、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む）、ビスナ・マエディ、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、これらのレンチウイルスのうちいずれか１種または複数に由来することができる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０巻：１４７９～１４８９頁、１９９９年；Ｃａｓｅら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９６巻：２９８８～２９９３頁、１９９９年；Ｕｃｈｉｄａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５巻：１ １９３９～１ １９４４頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻：６８２～６８６頁、１９９９年；Ｓｕｔｔｏｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２巻：５７８１～５７８８頁、１９９８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１ １２巻：４８４３～５２頁、２００８年を参照）。

【0128】

休止ＴおよびＢ細胞を、ＨＩＶアクセサリータンパク質（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）の大部分を保有するＶＳＶＧコートＬＶによって形質導入することができることが記録された（例えば、Ｆｒｅｃｈａら、２０１０年、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ １８巻：１７４８頁を参照）。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶゲノムまたはＳＩＶゲノム等、レンチウイルスゲノム由来のある特定の最小配列を含む。レンチウイルスのゲノムは典型的に、５’末端反復配列（ＬＴＲ）領域、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（例えば、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ）および３’ＬＴＲ領域へと組織化される。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ（反復）およびＵ５と称される３つの領域へと分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有し、Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有し、Ｒ領域は、Ｕ３およびＵ５領域を分離する。Ｒ領域の転写された配列は、ウイルスＲＮＡの５’および３’末端の両方に現れる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、「ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ Ｊ． Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｏ Ｎａｒａｙａｎ、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０巻：１６１７～１６３９頁、１９８９年；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．、１９９０年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８１５０～７頁、１９９８年；および米国特許第６，０１３，５１６号を参照）。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムのこれらのエレメントのうちいずれか１種もしくは複数を含んで、所望の通りにベクターの活性を調節することができる、またはこれらのエレメントのうち１種または複数に欠失、挿入、置換もしくは変異を含有して、例えば、レンチウイルス複製の病理学的効果を低下させる、もしくは単一ラウンドの感染にレンチウイルスベクターを限定することができる。

【0129】

典型的に、最小レトロウイルスベクターは、ある特定の５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列、１種または複数の目的の遺伝子（標的細胞において発現されるべき）、１種または複数のプロモーター、ならびにＲＮＡのパッケージングのためのシス作用性配列を含む。本明細書に記載され、本技術分野で公知の通り、他の調節配列が含まれていてもよい。ウイルスベクターは典型的に、真核細胞（例えば、２９３－ＨＥＫ）等のパッケージング細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミドにクローニングされ、また、典型的に、細菌におけるプラスミドの複製に有用な配列を含む。

【0130】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス等、レトロウイルスの５’および／または３’ＬＴＲ由来の配列を含む。ＬＴＲ配列は、いずれかの種由来のいずれかのレンチウイルス由来のＬＴＲ配列となることができる。例えば、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列となることができる。好ましくは、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ配列である。

【0131】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列、ならびにレンチウイルス由来の不活性化されたまたは「自己不活性化型」３’ＬＴＲを含む。「自己不活性化型３’ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列が下流遺伝子の発現を駆動するのを防止する変異、置換または欠失を含有する３’末端反復配列（ＬＴＲ）である。３’ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルスにおける両方のＬＴＲの生成のための鋳型として作用する。よって、不活性化型欠失または変異を有する３’ＬＴＲが、プロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込む場合、５’ＬＴＲからの転写は不可能である。このことは、ウイルスエンハンサー／プロモーターおよびいずれかの内部エンハンサー／プロモーターの間の競合を排除する。自己不活性化型３’ＬＴＲは、例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２巻：９８７３～９８８０頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８１５０～８１５７頁、１９９８年；およびＩｗａｋｕｍａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１巻：１２０～１３２頁、１９９９年に記載されている。自己不活性化型３’ＬＴＲは、本技術分野で公知のいずれかの方法によって生成することができる。ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、好ましくは、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐｌおよび／またはＮＦ－カッパーＢ部位に欠失を有する。自己不活性化型３’ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルスは、不活性化された５’ＬＴＲを含むであろう。

【0132】

本明細書に提供されているベクターは典型的に、１個または複数の標的細胞において望ましく発現されるタンパク質（またはｓｉＲＮＡ等、他の分子）をコードする遺伝子を含む。ウイルスベクターにおいて、目的の遺伝子は、好ましくは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置する。さらに、目的の遺伝子は、好ましくは、他の遺伝的エレメント、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー等、転写調節配列と機能的関係性にあって、一度標的細胞に遺伝子が取り込まれると、特定の様式で目的の遺伝子の発現を調節する。ある特定の実施形態では、有用な転写調節配列は、時間的および空間的の両方で、活性に関して高度に調節される配列である。

【0133】

ある特定の実施形態では、１種または複数の追加的な遺伝子は、安全対策として取り込んで、主に、ヒト患者内等、不均一集団内のトランスフェクトされた標的細胞の選択的死滅を可能にすることができる。例示的な一実施形態では、選択された遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を、薬物ガンシクロビルの作用に対して感受性にする。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、二量体化薬によって活性化されるカスパーゼ９自殺遺伝子である（例えば、Ｔｅｙら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １３巻：９１３～９２４頁、２００７年を参照）。

【0134】

ある特定の実施形態では、マーカータンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルスベクターにおける一次遺伝子の前または後に配置して、所望のタンパク質を発現している細胞の同定および／または選択を可能にすることができる。ある特定の実施形態は、目的の一次遺伝子と共に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等、蛍光マーカータンパク質を取り込む。１種または複数の追加的なレポーター遺伝子が含まれる場合、レポーター遺伝子および／または他のいずれかの目的の遺伝子から目的の一次遺伝子を分離する、ＩＲＥＳ配列または２Ａエレメントも含まれていてよい。

【0135】

ある特定の実施形態は、１種または複数の選択可能マーカーをコードする遺伝子を用いることができる。例として、選択的培養培地において育成されている形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要な因子をコードする薬物耐性のための遺伝子等、真核細胞または原核細胞において有効な選択可能マーカーを挙げることができる。例示的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、ウアバイン、ブラストサイジン、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠損を補完するか、または補給するタンパク質をコードし、これらは別々のプラスミドに存在し、ウイルスベクターとのコトランスフェクションによって導入することができる。一実施形態では、遺伝子は、メトトレキセート耐性を付与する変異体ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする。ある特定の他の実施形態は、トランスフェクトされた細胞のタグ付けおよび検出または精製に使用することができる１種または複数の細胞表面受容体（例えば、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ））、または形質導入タグ系として有用な他の斯かる受容体をコードする遺伝子を用いることができる。例えば、Ｌａｕｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００年３月；７巻（３号）：４３０～７頁を参照されたい。

【0136】

レトロウイルスベクター等、ある特定のウイルスベクターは、１種または複数の異種プロモーター、エンハンサー、またはその両方を用いる。ある特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物におけるプロモーターまたはエンハンサー配列と置き換えることができる。ある特定の実施形態は、ウイルスベクターの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置し、目的の遺伝子に作動可能に連結した、「内部」プロモーター／エンハンサーを用いる。

【0137】

「機能的関係性」および「作動可能に連結された」は、プロモーターおよび／またはエンハンサーが、適切な調節分子と接触されると、遺伝子の発現が影響されることになるように、遺伝子が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して正確な位置および配向性にあることを限定することなく意味する。パッケージング細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を調節する（例えば、増加させる、減少させる）、感染した標的細胞における選択された目的の遺伝子の発現を調節する、またはその両方を行う、いかなるエンハンサー／プロモーターの組み合わせも使用することもできる。

【0138】

プロモーターは、ポリメラーゼ結合および転写が起こることを可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。プロモーターは、選択された目的の遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置し（典型的に、約１００～１０００ｂｐ以内）、それが作動可能に連結されたコードポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御する、非翻訳配列である。プロモーターは、誘導性または構成的となることができる。誘導性プロモーターは、その制御下で、温度変化等、培養条件の何らかの変化に応答して、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。プロモーターは、一方向性または双方向性となることができる。双方向性プロモーターを使用して、２種の遺伝子、例えば、目的の遺伝子および選択マーカーを同時発現させることができる。あるいは、同じベクターにおいて反対の配向性で、異なる遺伝子の発現をそれぞれ制御する２個のプロモーターを含む双方向性プロモーター構成を利用することができる。

【0139】

ポリヌクレオチドコード配列にプロモーターを作動可能に連結するための方法と同様に、種々のプロモーターが本技術分野で公知である。ネイティブプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、選択された目的の遺伝子の発現を方向付けることができる。ある特定の実施形態は、一般に、ネイティブプロモーターと比較して、所望のタンパク質のより優れた転写およびより高い収量を可能にすることから、異種プロモーターを用いる。

【0140】

ある特定の実施形態は、異種ウイルスプロモーターを用いることができる。斯かるプロモーターの例として、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等、ウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。ある特定の実施形態は、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または目的の遺伝子のネイティブ配列に関連したプロモーター等、異種哺乳動物プロモーターを用いることができる。典型的に、プロモーターは、活性化されたＢリンパ球、形質Ｂ細胞、メモリーＢ細胞または他のリンパ球標的細胞等、標的細胞と適合性である。

【0141】

ある特定の実施形態は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターのうち１種または複数を用いることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適した選択は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、ＰａｕｌｅおよびＷｈｉｔｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、２８巻、１２８３～１２９８頁、２０００年に見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、その下流ＲＮＡコード配列を転写するようにそれぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩを方向付けることができる、いずれかの合成または操作されたＤＮＡ断片も含む。さらに、ウイルスベクターの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター（単数または複数）は、誘導性となることができる。いずれか適した誘導性Ｐｏｌ ＩＩまたはＩＩＩプロモーターを、本明細書に記載されている方法と共に使用することができる。例示的なＰｏｌ ＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、ＯｈｋａｗａおよびＴａｉｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１巻、５７７～５８５頁、２０００年；ならびにＭｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９巻、１６７２～１６８２頁、２００１年に提供されている、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。

【0142】

使用することができる構成的プロモーターの非限定例として、ユビキチンのプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１６９巻：１３頁、１９８９年を参照）、β－アクチン（例えば、Ｇｕｎｎｉｎｇら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４巻：４８３１～４８３５頁、１９８７年を参照）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびｐｇｋプロモーター（例えば、これらのそれぞれを参照により本明細書に組み込む、Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ
６０巻：６５～７４頁、１９８７年）；Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍら、Ｇｅｎｅ ３２巻：４０９～４１７頁、１９８４年；およびＤｏｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０巻：２６３５～２６３７頁、１９８２年を参照）が挙げられる。組織特異的プロモーターの非限定例として、ｌｃｋプロモーター（例えば、Ｇａｒｖｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻：３０５８～３０６４頁、１９８８年；およびＴａｋａｄｅｒａら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻：２１７３～２１８０頁、１９８９年を参照）、ミオゲニンプロモーター（Ｙｅｅら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７巻：１２７７～１２８９頁、１９９３年）およびｔｈｙｌプロモーター（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅ １ １３巻：２０７～２１４頁、１９９２年を参照）が挙げられる。

【0143】

プロモーターの追加的な例として、Ｂリンパ球において機能的である、ユビキチン－Ｃプロモーター、ヒトμ重鎖プロモーターまたはＩｇ重鎖プロモーター（例えば、ＭＨ）、およびヒトκ軽鎖プロモーターまたはＩｇ軽鎖プロモーター（例えば、ＥＥＫ）が挙げられる。ＭＨプロモーターは、マトリクス会合領域が隣接するｉＥμエンハンサーが先行する、ヒトμ重鎖プロモーターを含有し、ＥＥＫプロモーターは、イントロンエンハンサー（ｉＥκ）、マトリクス会合性領域および３’エンハンサー（３Ｅκ）が先行する、κ軽鎖プロモーターを含有する（例えば、Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ．１ １３巻：１４２２～１４３１頁、２００９年および米国特許出願公開第２０１０／０２０３６３０号を参照）。したがって、ある特定の実施形態は、これらのプロモーターまたはエンハンサーエレメントのうち１種または複数を用いることができる。

【0144】

一実施形態では、ある１つのプロモーターは、選択可能マーカーの発現を駆動し、第２のプロモーターは、目的の遺伝子の発現を駆動する。例えば、一実施形態では、ＥＦ－１アルファプロモーターは、選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の産生を駆動し、ミニチュアＣＡＧプロモーター（例えば、Ｆａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０巻：２２７３～２２８５頁、１９９９年を参照）は、目的の遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）の発現を駆動する。

【0145】

上に記す通り、ある特定の実施形態は、内部エンハンサー等、エンハンサーエレメントを用いて、目的の遺伝子の発現を増加させる。エンハンサーは、その転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常約１０～３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサー配列は、□□□エンハンサー、□□□イントロンエンハンサーおよび３’□□エンハンサー等、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、インスリン）に由来することができる。複製起点の後側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む、真核生物ウイルス由来のエンハンサーも含まれる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対する位置５’または３’においてベクターへとスプライスすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。当業者であれば、所望の発現パターンに基づき適切なエンハンサーを選択するであろう。

【0146】

ある特定の実施形態では、プロモーターは、遺伝子の誘導性発現を可能にするように選択される。テトラサイクリン応答性系およびｌａｃオペレーター・リプレッサー系を含む、誘導性発現のための多数の系が、本技術分野で公知である。プロモーターの組み合わせを使用して、目的の遺伝子の所望の発現を得ることができることも企図される。当業者であれば、目的の生物および／または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づきプロモーターを選択することができるであろう。

【0147】

ある特定のウイルスベクターは、ウイルス粒子へのゲノムウイルスＲＮＡの取り込みを促進するためのシス作用性パッケージング配列を含有する。例として、ｐｓｉ－配列が挙げられる。斯かるシス作用性配列は、本技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているウイルスベクターは、２種またはそれよりも多い遺伝子を発現することができ、これは、例えば、配列内リボソーム進入配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）エレメント（参照により本明細書に組み込む米国特許第４，９３７，１９０号）もしくは２Ａエレメントまたはその両方等、同時発現を容易にするエレメントを取り込むことにより、第１の遺伝子を越えて別々の遺伝子のそれぞれに作動可能に連結した内部プロモーターを取り込むことにより達成することができる。単に説明として、単一のベクターが、所望の特異性を有する免疫グロブリン分子の各鎖をコードする配列を含む場合、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントを使用することができる。例えば、第１のコード領域（重鎖または軽鎖のいずれかをコード）は、プロモーターからすぐ下流に位置することができ、第２のコード領域（他方の鎖をコード）は、第１のコード領域から下流に位置することができ、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントは、第１および第２のコード領域の間に、好ましくは、第２のコード領域に直接先行して位置する。他の実施形態では、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントは、レポーター遺伝子、選択可能マーカー、または免疫機能を増強する遺伝子等、無関係の遺伝子の同時発現に使用される。使用することができるＩＲＥＳ配列の例は、脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＳＶ）、ポリオウイルス（ＰＯＬＩＯ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびペスチウイルス（例えば、豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ））のＩＲＥＳエレメントを限定することなく含む（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｌｅら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １２巻：１３５～１４７頁、１９９６年；およびＬｅら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３６２～３６９頁、１９９７年を参照）。２Ａエレメントの一例として、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ配列が挙げられる。

【0148】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供されているベクターは、所望の結果を達成するための追加的な遺伝的エレメントも含有する。例えば、ある特定のウイルスベクターは、ＨＩＶ－１ ｆｌａｐシグナル等、標的細胞におけるウイルスゲノムの核侵入を容易にするシグナルを含むことができる。さらに別の例として、ある特定のウイルスベクターは、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列等、標的細胞におけるプロウイルス組込み部位の特徴付けを容易にするエレメントを含むことができる。ある特定のウイルスベクターは、目的の遺伝子の発現を増強するように設計された１種または複数の遺伝的エレメントを含有することができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答性エレメント（ＷＲＥ）を構築物中に配置することができる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７４巻：３６６８～３６８１頁、１９９９年；およびＤｅｇｌｏｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１巻：１７９～１９０頁、２０００年を参照）。別の例として、ニワトリβ－グロビンインスレーターが、構築物中に含まれていてもよい。このエレメントは、メチル化およびヘテロクロマチン化効果による標的細胞における組み込まれたＤＮＡのサイレンシングの確率を低下させることが示されてきた。加えて、インスレーターは、染色体上の組込み部位における周囲のＤＮＡ由来のプラスのまたはマイナスの位置的効果から内部エンハンサー、プロモーターおよび外因的遺伝子を遮蔽することができる。ある特定の実施形態は、これらの遺伝的エレメントのそれぞれを用いる。別の実施形態では、本明細書に提供されているウイルスベクターは、発現を増加させるための遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）を含有することもできる（例えば、Ｚｈａｎｇ Ｆら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０年９月；１８巻（９号）：１６４０～９頁を参照）。

【0149】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供されているウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス）は、主に、選択された細胞型を標的化するために、１種または複数の選択されたウイルス糖タンパク質またはエンベロープタンパク質により「シュードタイプ化」されている。シュードタイプ化は、一般に、細胞表面ウイルス粒子上への１種または複数の異種ウイルス糖タンパク質の取り込みを指し、これは多くの場合、ウイルス粒子を、その通常の標的細胞とは異なる選択された細胞に感染させることができる。「異種」エレメントは、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する。典型的に、ウイルスベクターの糖タンパク質コード領域は、それ自身の糖タンパク質の発現を防止するための欠失による等、遺伝的に変更されている。単に説明として、ＨＩＶ由来レンチウイルスベクター由来のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１および／またはｇｐ１２０は典型的に、異種ウイルス糖タンパク質によるシュードタイプ化の前に欠失されている。

【0150】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、Ｂリンパ球を標的化する異種ウイルス糖タンパク質によりシュードタイプ化される。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、休止または静止状態Ｂリンパ球の選択的感染または形質導入を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂリンパ球形質細胞、形質芽球および活性化されたＢ細胞の選択的感染を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、静止状態Ｂリンパ球、形質芽球、形質細胞および活性化されたＢ細胞の感染または形質導入を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病細胞の感染を可能にする。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇによりシュードタイプ化される。別の実施形態では、異種ウイルス糖タンパク質は、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ麻疹ウイルス等の麻疹ウイルスの糖タンパク質に由来する。ある特定の実施形態は、麻疹ウイルス糖タンパク質ヘマグルチニン（Ｈ）、融合タンパク質（Ｆ）またはその両方をシュードタイプ化する（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｆｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１ １２巻：４８４３～５２頁、２００８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１ １４巻：３１７３～８０頁、２００９年を参照）。一実施形態では、ウイルスベクターは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）によりシュードタイプ化される。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型へとベクターを標的化するように機能する１個または複数の可変領域（例えば、重鎖および軽鎖可変領域）等、埋伏された抗体結合ドメインを含む。

【0151】

ウイルスベクターの生成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））、Ｃｏｆｆｉｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９７年））および「ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ Ｊ． Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００年））に記載されている通り、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定の標準技法を限定することなく含む、本技術分野で公知のいずれか適した遺伝子操作技法を使用して達成することができる。

【0152】

本技術分野で公知のいずれか種々の方法を使用して、そのゲノムがウイルスベクターのＲＮＡコピーを含む、適したレトロウイルス粒子を産生することができる。一方法として、ウイルスベクターは、所望の標的細胞特異性で、ウイルス粒子へのウイルスベクターに基づき、ウイルスゲノムＲＮＡをパッケージするパッケージング細胞株に導入することができる。パッケージング細胞株は典型的に、トランスで、構造ｇａｇタンパク質、酵素ｐｏｌタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を含む、ウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングおよび標的細胞の感染に要求されるウイルスタンパク質をもたらす。

【0153】

ある特定の実施形態では、パッケージング細胞株は、ある特定の必要なまたは所望のウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ）を安定に発現する（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，２１８，１８１号を参照）。ある特定の実施形態では、パッケージング細胞株は、本明細書に記載されている麻疹ウイルス糖タンパク質配列を含む、必要なまたは所望のウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、糖タンパク質）のある特定のものをコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトされる。例示的な一実施形態では、パッケージング細胞株は、ｇａｇおよびｐｏｌ配列を安定に発現し、次いでこの細胞株は、ウイルスベクターをコードするプラスミドおよび糖タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされる。所望のプラスミドの導入後に、ウイルス粒子は、採取され、超遠心分離による等、それに見合うように加工されて、ウイルス粒子の濃縮ストックを達成する。例示的なパッケージング細胞株は、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）細胞株を含む。

【0154】

治療剤
本明細書において、「目的の遺伝子」または「遺伝子」または「目的の核酸」は、標的トランスフェクト細胞において発現されるべき導入遺伝子を指す。用語「遺伝子」を使用することができるが、この用語は、ゲノムＤＮＡに見出される遺伝子であることを含意するものではなく、用語「核酸」と互換的に使用される。一般に、目的の核酸は、治療剤のコードに適した核酸を提供し、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを含むことができ、イントロンを含んでも含まなくてもよいが、一般に、イントロンを含まない。他の箇所に記されている通り、目的の核酸は、標的細胞において目的のタンパク質を有効に発現させるための発現制御配列に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、１種または複数の目的の遺伝子を含むことができ、例えば、本明細書に記載されている内部プロモーターを使用して組織化され得る免疫グロブリンの重鎖および軽鎖等、２、３、４もしくは５種またはそれよりも多い目的の遺伝子を含むことができる。

【0155】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」の言及は、本明細書において、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指定する。この用語は典型的に、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはどちらかの型のヌクレオチドの改変された形態である、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本および二本鎖形態を含む。目的の核酸または遺伝子は、目的のタンパク質をコードするいずれかの核酸となることができる。

【0156】

本明細書に記載されている遺伝子改変Ｂ細胞によって送達されるべき治療剤は、タンパク質となることができる。本明細書に記載されている使用のための目的のタンパク質は、所望の活性をもたらすいずれかのタンパク質を含む。この点に関して、目的のタンパク質として、抗体またはその抗原結合性断片、細胞表面受容体、サイトカイン（リンホカイン、インターロイキン、インターフェロンまたはケモカイン）等の分泌タンパク質、ＴＧＦ－ベータおよび線維芽細胞増殖因子等の他の分泌シグナル伝達分子、タンパク質の抗原性断片、ＤＮＡコード小分子（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
５巻、６４７～６５４頁（２００９年）を参照）、酵素、凝固因子、ならびに接着分子が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、核酸は、抗体またはその抗原結合性断片をコードする。例示的な抗原結合性断片は、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを含む。一実施形態では、核酸は、切断可能リンカーを含む融合タンパク質として目的のタンパク質をコードする。例えば、抗体重鎖および軽鎖は、自己切断可能リンカーペプチド、例えば、Ｆ２Ａと共に発現させることができる。

【0157】

一実施形態では、核酸によってコードされる抗体は、ＨＩＶ中和抗体、ｂ１２の少なくとも抗原結合ドメインを含む（例えば、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３年、７７巻：５８６３～５８７６頁；Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９４年８月；６８巻（８号）：４８２１～８頁；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２年、８９巻：９３３９～９３４３頁を参照；例示的な配列は、ｂ１２軽鎖（ＡＡＢ２６３０６．１ Ｇｌ ２９９７３７）および重鎖（ＡＡＢ２６３１５．１ Ｇｌ ２９９７４６）に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号に提示されている）。さらなる実施形態では、目的の核酸によってコードされる抗体は、Ｆｕｚｅｏｎ（商標）（Ｔ－２０／エンフビルチド／ペンタフシド（ｐｅｎｔａｆｕｓｉｄｅ）／ＤＰ－１７８）を含む。ＤＰ－１７８は、ＨＩＶにおけるｇｐ４１由来のアミノ酸配列であり、その標的細胞と融合するＨＩＶの能力に干渉する。Ｆｕｚｅｏｎは、当業者に公知の方法を使用して、合成によって産生することができる（例えば、２００１年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７５巻：３０３８～３０４２頁を参照；当該論文に記載されている方法が、治療用量のＤＰ－１７８ペプチドの分泌をもたらした可能性は非常に低いことに留意されたい）。

【0158】

特定の一実施形態では、目的の核酸は、免疫学的に活性なタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、目的の核酸は、Ｂ細胞、Ｔ細胞または他の免疫細胞の表面におけるタンパク質の提示を介して免疫ワクチン様反応を誘導する、タンパク質またはその生物学的活性断片（例えば、抗原性断片）をコードする。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、例えば、細胞分裂の促進、異なるＢ系列への分化の促進、細胞の不活性化もしくは死滅が挙げられるがこれらに限定されない、Ｂ細胞の調節に影響を与える、または他の導入されたＤＮＡエレメントの産生もしくは活性を調節する。インターロイキンは、当業者に公知であり、現在のところ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ２７のｐ２８サブユニットの分泌形態、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４およびＩＬ－３５を含む。インターフェロンは、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βおよびＩＦＮ－οを含む。本明細書における使用に企図されるケモカインは、Ｃ型ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２、Ｃ－Ｃ型ケモカイン（現在まで、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８を含む）およびＣＸＣ型ケモカイン（現在まで、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７を含む）を含む。目的の遺伝子として、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーも企図される（例えば、ＴＮＦ－ａ、４－１ ＢＢリガンド、Ｂ細胞活性化因子、ＦＡＳリガンド、リンホトキシン、ＯＸ４０Ｌ ＲＡＮＫＬおよびＴＲＡＩＬ）。

【0159】

ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、免疫学的寛容を誘導する。この点に関して、目的のタンパク質は、ＩｇＧ－抗原融合タンパク質を含むことができる（例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３５巻（１号）２００５年、１２～２０頁を参照）。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質の発現は、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０およびＬＰＳ等の因子による細胞の刺激を伴うことができる。ある特定の実施形態では、寛容を誘導するＩＬ－１０または転写因子等の因子は、培養Ｂ細胞により発現される。

【0160】

さらなる実施形態では、目的の遺伝子（複数可）は、Ｂ細胞から抗体分泌細胞への分化を促進する１種もしくは複数の因子および／または抗体産生細胞の長寿命を促進する１種もしくは複数の因子をコードする。斯かる因子は、例えば、Ｂｌｉｍｐ－１、Ｘｂｐ１、ＩＲＦ４、Ｚｂｔｂ２０、ＴＲＦ４、Ｂｃｌ－ｘｌ、Ｂｃｌ－２、Ｍｃｌ－１またはＢｃｌ５のような抗アポトーシス因子、およびＣＤ４０受容体の構成的に活性な変異体を含む。さらに別の目的の遺伝子は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）等、下流シグナル伝達分子の発現を促進する因子をコードする。この点に関して、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞活性化、細胞生存および抗アポトーシス機能は、大部分は、ＴＲＡＦ１～６によって媒介される（例えば、Ｒ．Ｈ． Ａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２巻（１９９８年）２８２１～２８３０頁を参照）。ＴＲＡＦシグナル伝達の下流エフェクターは、細胞および免疫機能の様々な側面に関与する遺伝子をオンにすることができる、ＮＦ－ＫＢおよびＡＰ－１ファミリーにおける転写因子を含む。さらに、ＮＦ－κβおよびＡＰ－１の活性化は、抗アポトーシス遺伝子の転写を介して、アポトーシスからの細胞保護をもたらすことが示されてきた。追加的な実施形態では、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－ベータまたはＦｃ－融合タンパク質等、コードされる因子は、免疫寛容の誘導に関連する。

【0161】

追加的な実施形態では、目的の核酸（複数可）は、１種または複数のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質をコードする。ＥＢＶ由来のタンパク質として、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２、ＥＢＥＲ、ＥＢＶ－ＥＡ、ＥＢＶ－ＭＡ、ＥＢＶ－ＶＣＡおよびＥＢＶ－ＡＮが挙げられるがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、目的の核酸は、抗体またはその抗原結合性断片をコードする。この点に関して、抗体は、天然抗体またはカスタムの組換えにより操作された抗体となることができる。抗体またはその部分を含む融合タンパク質は、本明細書に記載されているベクターによってコードされることが特に企図される。

【0162】

一実施形態では、本開示に係る抗体またはその断片は、ｍ３６抗ＨＩＶ抗体（例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８年１１月４日；１０５巻（４４号）：１７１２１～６頁を参照）等の抗ＨＩＶ抗体のアミノ酸配列、またはｍ３６等の抗ＨＩＶ抗体のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸分子を有する。特に、ｍ３６Ｌ２ＣＤ４Ｆｃ等、ｍ３６またはその誘導体を含む融合タンパク質が特に企図される（例えば、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８８巻、１号、２０１０年１０月、１０７～１１５頁を参照）。一実施形態では、抗ＨＩＶ抗体は、広く中和するモノクローナル抗体ＶＲＣ０１である（例えば、Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、３２９巻（５９９３号）：８５６８６１頁およびＬｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２０１１年、８５巻（１７号）：８９５４～８９６７頁を参照）。

【0163】

さらなる実施形態では、本開示の導入遺伝子によってコードされる抗体は、自己抗原に結合する。ある特定の実施形態では、自己抗原は、この点に関して、多発性硬化症または１型糖尿病の発症に関連し、ＭＢＰ、アルファＢ－クリスタリン、Ｓ１００ベータ、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＨＳＰ１０５、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）抗原１の上皮アイソフォーム（ＢＰＡＧ１－ｅ）、脂質、ならびにミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）－アルファおよびＭＯＧ－ベータアイソフォーム、または種々の島細胞自己抗原のいずれか（例えば、シアロ糖脂質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリン、インスリン受容体、３８ｋＤ、ウシ血清アルブミン、グルコーストランスポーター、ｈｓｐ ６５、カルボキシペプチダーゼＨ、５２ｋＤ、ＩＣＡ１２／ＩＣＡ５１２、１５０ｋＤおよびＲＩＮ極性）を含むがこれらに限定されない。これらの自己抗原に対する抗体は、本技術分野で公知であり、慣例的な技法を使用して、配列決定し、組換えにより作製することができる（例えば、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１０７巻（５号）：５５５～５６４頁（２００１年）を参照）。

【0164】

さらなる実施形態では、抗体は、がん関連抗原に結合する。がん関連抗原は、種々の腫瘍タンパク質に由来することができる。本開示において有用な説明のための腫瘍タンパク質として、ｐ５３、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、－１０、ＧＡＧＥ－１、－２、－８、ＧＡＧＥ－３、－４、－５、－６、－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＣ１ Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（例えば、抗体は、Ｈｅｒ２特異的ｍＡｂ、ハーセプチン（Ｒ）に由来することができる）、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＷＴ１、ＡＦＰ、□－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａおよびＴＥＬ／ＡＭＬ１のうちいずれか１種または複数が挙げられるがこれらに限定されない。上述および他の腫瘍タンパク質は、当業者にとって公知である。

【0165】

さらなる実施形態では、目的の核酸は、阻害活性、がん細胞において細胞死を誘導する能力、またはがん細胞増殖を減速もしくは阻害する能力等が挙げられるがこれらに限定されない、特定の機能属性を有するペプチドまたは他の結合ドメインをコードする。この点に関して、一実施形態では、目的の核酸によってコードされるペプチドまたは結合ドメインは、上述のがん関連抗原、ＣＤ４、ＨＩＶ ｇｐ１２０または他のウイルスタンパク質、ＩＣＡＭ－３、ＤＣ－ＳＩＧＮ等、本明細書に記載されている標的タンパク質のいずれかに結合することができる（例えば、米国特許第７，３０１，０１０号を参照）。ある特定の実施形態では、ペプチドは、病原性および非病原性細菌ならびに緑色植物に由来することができる。説明のためのペプチドは、米国特許第７０８４１０５号、同第７３０１０１０号、同第７３３８７６６号、同第７３８１７０１号、同第７４９１３９４号、同第７５１１１１７号、同第７５５６８１０号に開示されている。一実施形態では、目的の核酸は、ｐ５３ユビキチン化のペプチド阻害剤である、アズリン－ｐ２８（ＮＳＣ７４５１０４）をコードする（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１０年、ＤＯＩ、１０．１００７／Ｓ００２８０－０１０－１５１８－３；米国特許第７，０８４，１０５号を参照）。さらなる実施形態では、目的の核酸は、食欲を誘導し、がん患者の処置に使用することができる、グレリンとして公知の因子をコードする（例えば、Ｏｂｅｓ Ｆａｃｔｓ．２０１０年、３巻：２８５～９２頁；ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８巻（３号）：４３９～５６頁を参照）。別の実施形態では、目的の核酸は、アンジオポエチン１および２に結合し、これを阻害する、結合ペプチドをコードする（例えば、ＡＭＧ３８６を参照；がんの処置に使用される抗体（ペプチボディ）のＦｃ断片）。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、がんを有する個体から直接的に同定することができる。この点に関して、スクリーニングは、種々の公知技術を使用して実行することができる。例えば、一実施形態では、腫瘍生検が、患者から採取され、ＲＮＡが、腫瘍細胞から単離され、遺伝子チップ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ製）を使用してスクリーニングされ、腫瘍抗原が同定される。腫瘍標的抗原が同定されたら、本技術分野で公知の技法を使用して、これをクローニング、発現および精製することができる。

【0166】

特定の一実施形態では、目的の核酸は、酵素をコードする。一実施形態では、目的の核酸は、リソソーム蓄積障害を処置するための酵素をコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の処置または予防のために、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）の処置または予防のために、イデュルスルファーゼをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳ ＶＩ）の処置または予防のために、ガルスルファーゼをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の処置または予防のために、エロスルファーゼアルファをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ファブリー病の処置または予防のために、アガルシダーゼベータをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ファブリー病の処置または予防のために、アガルシダーゼアルファをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、アルファ－１－アンチトリプシン欠損の処置または予防のために、アルファ－１－アンチトリプシンをコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）の処置または予防のために、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼをコードする。別の実施形態では、目的の核酸は、血友病の処置または予防のために、第ＶＩＩ因子をコードする。一実施形態では、目的の核酸は、例えば、ＬＣＡＴ欠損および粥状動脈硬化の処置または予防に有用な、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）をコードする。別の実施形態では、目的の核酸は、例えば、粥状動脈硬化等、心血管疾患および障害の処置または予防のために、アポリポタンパク質Ａ－１ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ）をコードする。一実施形態では、目的の核酸は、ＬＰＬ欠損の処置または予防のために、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）をコードする。別の実施形態では、目的の核酸は、複数のＨＩＶ－１株（例えば、ｂ１２）に結合し、これを中和する、広く中和する抗体（ｂＮＡｂ）またはその融合タンパク質をコードする。さらに別の実施形態では、目的の核酸は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の処置または予防のために、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。

【0167】

「抗体」は、本明細書において、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方；霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（例えば、ヒト化）；マウス；マウス－ヒト；マウス－霊長類；ならびにキメラを含み；インタクトな分子、その断片（ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片等）、またはインタクトな分子および／または断片の多量体もしくは凝集体となることができ；天然で生じ得る、または例えば、免疫化、合成もしくは遺伝子操作によって産生することができ；「抗体断片」は、本明細書において、抗原に結合し、一部の実施形態では、例えば、ガラクトース残基の取り込みによって、クリアランスおよび摂取を容易にする構造的特色を示すように誘導体化することができる、抗体に由来するまたはこれに関係する断片を指す。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびこれらの組み合わせを含む。供給源は、ヒト、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマ由来；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１ １８０４頁）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、齧歯類、鳥類、ヒツジを含む、様々な種由来の抗体遺伝子配列（ファージライブラリー等において、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０巻：１３８８頁を参照）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ Ｊ．２７２巻：６１７９頁）、等々（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／０９８９３４；ＷＯ２００６／０７２６２０を参照）等、代替的な非抗体足場のループ領域におけるアミノ酸の操作された多様性をコードする配列、その他を含む。

【0168】

抗体技術を指すものとして当業者によって理解される用語はそれぞれ、本明細書に明確な定義がなければ、本技術分野において得られた意義を与えられている。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、それぞれ抗体軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の、別々の十分に定義された小領域で構成されている。用語「ＣＬ」および「ＣＨ」は、「免疫グロブリン定常領域」、すなわち、それぞれ抗体軽鎖または重鎖に由来する定常領域を指し、後者領域は、領域が由来した抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に応じて、Ｃｍ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４定常領域ドメインへとさらに分けることができると理解されている。定常領域ドメインの部分は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合等の免疫グロブリンのエフェクター機能、Ｆｃ受容体への結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べてより優れたｉｎ ｖｉｖｏ半減期、プロテインＡ結合、ならびにおそらくさらには胎盤移行（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｃａｐｏｎら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁を参照）を担うドメインを含有するＦｃ領域（「結晶化可能断片」領域）を構成する。さらに、Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、ポリペプチドの二量体化または多量体化を可能にする。

【0169】

免疫グロブリンのドメイン構造は、抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインを免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの間で交換することができるという点で操作に適している。例えば、アミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、置換）は、グリコシル化および／またはフコシル化部位の数または位置の変化等、免疫グロブリンの翻訳後プロセスを変更することができる。グリコシル化によりＡＤＣＣを増強するための方法は、本技術分野で公知であり、本明細書における使用に企図されている。例えば、グリコシル化を増強する酵素を抗体と同時発現させることができる。一実施形態では、ＭＧＡＴ３は、抗体を産生する細胞において過剰発現されて、抗体のグリコシル化およびそのＡＤＣＣ機能を増強する。一実施形態では、例えば、ｓｉＲＮＡによるＦｕｔ８の阻害は、抗体のグリコシル化およびＡＤＣＣを増強する。

【0170】

免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。組換え抗体技術のあらゆる側面に関する広範な紹介と共に詳細な情報は、教科書、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９年）に見出すことができる。詳細な抗体操作実験室プロトコールの包括的コレクションは、Ｒ． ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ． Ｄｕｂｅｌ編、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年）に見出すことができる。さらに別の関連プロトコールは、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡから出版されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９年８月）においても利用できる。酵素の産生およびタンパク質操作（例えば、ＩＤＵＡ）のための方法もまた、本技術分野で公知であり、本明細書における使用に企図されている。

【0171】

よって、本開示は、Ｂ細胞を遺伝子改変するための本開示の治療剤（例えば、目的のタンパク質）をコードするポリヌクレオチド（単離されたまたは精製されたまたは純粋なポリヌクレオチド）、斯かるポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示に係るポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が企図される。目的のタンパク質をコードする発現カセットも、本明細書において企図されている。

【0172】

本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、特に、組換え発現構築物に関する。一実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、斯かるタンパク質コード配列の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こすまたは容易にする他のポリヌクレオチド配列と共に含むベクターを企図する。原核生物および真核生物宿主による使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターは、その中に含有されているポリヌクレオチドの増幅、移入および／または発現に適した、本技術分野で公知のプラスミド、ファージミド、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、コスミド、ウイルス、人工染色体またはいずれかの核酸ビヒクルに基づくことができる、クローニングベクター、シャトルベクターおよび発現構築物を含む。

【0173】

本明細書において、ウイルスベクターに関して他のことが記載されていない限り、「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。例示的なベクターは、プラスミド、ミニサークル、トランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾン）、酵母人工染色体、自己複製ＲＮＡおよびウイルスゲノムを含む。ある特定のベクターは、宿主細胞において自律的に複製することができる一方、他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込み、これにより、宿主ゲノムと共に複製されることができる。加えて、ある特定のベクターは、本明細書において、発現制御配列に操作可能に連結された核酸配列を含有する（したがって、発現制御配列は、このような配列の発現を方向付けることができる）、「組換え発現ベクター」（または単純に、「発現ベクター」）と称される。ある特定の実施形態では、発現構築物は、プラスミドベクターに由来する。説明のための構築物は、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する、改変ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ ＩＣＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）を含む。他の適した哺乳動物発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記参照を参照；例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪのカタログも参照されたい）。

【0174】

融合タンパク質の増強された産生レベルの促進に適した調節制御下でジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）コード配列を含む、有用な構築物を調製することができ、そのようなレベルは、適切な選択薬剤（例えば、メトトレキセート）の適用後の遺伝子増幅に起因する。一実施形態では、転位に成功したＢ細胞を濃縮するための、メトトレキセート（ＭＴＸ）におけるインキュベーションと組み合わせた、薬物耐性ＤＨＦＲと共に治療用遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする二機能性トランスポゾンの使用は、より強力な産物を生成する。

【0175】

一般に、組換え発現ベクターは、上述の通り、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能マーカー、ならびに下流構造配列の転写を方向付けるための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。本開示に係るポリヌクレオチドと作動可能に連結されたベクターは、クローニングまたは発現構築物を生じる。例示的なクローニング／発現構築物は、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結した、少なくとも１個の発現制御エレメント、例えば、プロモーターを含有する。エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位等、追加的な発現制御エレメントも、本開示に係るベクターおよびクローニング／発現構築物において企図されている。本開示に係るポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始および終止配列と適切な位相でアセンブルされる。よって、例えば、本明細書に提供されているコード核酸は、宿主細胞において斯かるタンパク質を発現するための組換え発現構築物として、種々の発現ベクター構築物（例えば、ミニサークル）のいずれか１種に含まれていてよい。

【0176】

適切なＤＮＡ配列（複数可）は、例えば、種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、本技術分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（複数可）に挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼその他が関与する酵素反応のための、クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準技法、ならびに様々な分離技法が企図されている。多数の標準技法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ． ＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ、１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８２年）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ第ＩおよびＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；他に記載されている。

【0177】

発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を方向付けるための少なくとも１個の適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは調節型プロモーター）に操作可能に連結される。斯かる発現制御配列の代表例として、上述の通り、真核細胞またはそのウイルスのプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、カナマイシンベクター、または選択可能マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン－ｌを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の技能水準内にあり、本開示に係るタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した少なくとも１個のプロモーターまたは調節型プロモーターを含むある特定の特に好まれる組換え発現構築物の調製は、本明細書に記載されている。

【0178】

例えば、一実施形態では、ベクターは、図１ｂに示す構造を有するプラスミドとなることができる。一実施形態では、プラスミドは、配列番号１の配列を含むことができる。一実施形態では、プラスミドは、配列番号１の配列からなることができる。一実施形態では、プラスミドは、配列番号１と少なくとも約６０％同一である配列を含むまたはこれからなることができる。一実施形態では、プラスミドは、配列番号１と少なくとも約８５％同一である、または配列番号１と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一である配列を含むまたはこれからなることができる。

【0179】

本開示のポリヌクレオチドのバリアントも企図されている。バリアントポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている定義された配列のポリヌクレオチドの１種と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％同一である、または約６５～６８℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムもしくは約４２℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、定義された配列の当該ポリヌクレオチドの１種とハイブリダイズする。ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載されている機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。

【0180】

用語「ストリンジェント」は、本技術分野で一般的にストリンジェントとして理解されている条件を指すように使用されている。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、およびホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、約６５～６８℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｔ ａｉ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照）。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤等）を使用することもできる；しかし、ハイブリダイゼーションの速度が影響されるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加的な例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドのため）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドのため）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドのため）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドのため）での、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を含む。

【0181】

本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかで形質転換もしくはトランスフェクトされたまたは他の仕方でこれを含有する、宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入を含む、本技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、適した細胞に導入される。宿主細胞は、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法を含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞療法を受ける被験体の細胞を含む。本開示に係るポリヌクレオチド、ベクターまたはタンパク質を有する場合の本開示の態様として企図されている真核生物宿主細胞は、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを改変することができる改変ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号を参照）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ－７等）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、ならびに本開示に係るタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離において有用であることが本技術分野で公知の他のいずれかの真核細胞を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、または本開示に係るタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離に適することが本技術分野で公知のいずれかの原核細胞を含む原核細胞も企図されている。原核細胞からのタンパク質またはペプチドの単離において、特に、封入体からタンパク質を抽出するための本技術分野で公知の技法を使用することができることが企図されている。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から、当業者の技能範囲内にある。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が企図されている。

【0182】

用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。斯かる用語が、特定の対象細胞のみならず、斯かる細胞の後代も指すように意図されることを理解されたい。ある特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかにより後継世代において起こり得るため、斯かる後代は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、依然として、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または特定の遺伝子の増幅に適切であるように改変された従来の栄養培地において培養することができる。温度、ｐＨその他等、発現に選択された特定の宿主細胞のための培養条件は、当業者には容易に明らかとなるであろう。様々な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例として、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）Ｃｅｌｌ ２３巻：１７５頁によって記載されているサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７株、ならびに適合性ベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適したプロモーターおよび必要に応じてエンハンサーを、また、いずれか必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、ならびに５’隣接非転写配列、例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製を考慮して本明細書に記載されているものも含むであろう。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、要求される非転写遺伝的エレメントを提供することができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、当業者には馴染みがあるであろう種々の方法によってもたらすことができる（Ｄａｖｉｓら（１９８６年）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。

【0183】

細胞および組成物
一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化／分化され、本明細書に記載されている治療剤を発現するようにトランスフェクトされた。一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化／分化され、本明細書に記載されている治療剤を発現するように操作された（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性導入遺伝子組込み等、標的化導入遺伝子組込みアプローチを使用して）。一実施形態では、組成物は、形質Ｂ細胞へと分化しており、トランスフェクトまたは他の仕方で操作されており、１種または複数の目的のタンパク質を発現する、Ｂ細胞を含む。本開示のトランスフェクトまたは他の仕方で操作され活性化されたＢ細胞集団等、標的細胞集団は、単独で、または希釈剤および／またはサイトカインもしくは細胞集団等の他の構成成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。

【0184】

一実施形態では、１種または複数の目的のタンパク質を発現するように操作された改変Ｂ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化／分化後に、改変Ｂ細胞が特定の化学誘引物質に対して最適な遊走能を有する時点で、培養物から収集される。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の７日目、８日目または９日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の５日目、６日目または７日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションもしくは操作後のＢ細胞培養の８日目、またはトランスフェクションもしくは操作後の培養における８日目よりも後となることができる（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日目にまたは２０日目よりも後に）。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の１０日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の８日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の６日目または７日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の４日目または５日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の９日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の７日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１２への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、最適な遊走能は、改変Ｂ細胞の１回または複数の投与を受けている被験体の骨髄への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約７日目～約９日目に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約５日目～約７日目に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約１０日目より前に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約８日目より前に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１３への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、最適な遊走能は、改変Ｂ細胞の１回または複数の投与を受けている被験体における炎症部位への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約６日目または約７日目に、ＣＸＣＬ１３および／または被験体における炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約４日目または約５日目に、ＣＸＣＬ１３および／または被験体における炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約１０日目より前に、ＣＸＣＬ１３および／または炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約８日目より前に、ＣＸＣＬ１３および／または炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。

【0185】

一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞培養の７日目に、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方へのホーミングに最適な遊走能で、収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の５日目に、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方へのホーミングに最適な遊走能で、収集される。

【0186】

一部の実施形態では、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質へと遊走するときに、操作されたＢ細胞が収集される。例えばであって、例に限定されるべきではないが、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、ＣＸＣＬ１２へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＩＤＵＡを産生する）を収集することができる。または、別の非限定例では、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、ＣＸＣＬ１３へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＩＤＵＡを産生する）を収集することができる。さらに、Ｂ細胞の少なくとも約３０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質（例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）へと遊走するときに、またはＢ細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％もしくは少なくとも約７０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質（例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＩＤＵＡを産生する）を収集することができる。さらに、Ｂ細胞の７０％超が、走化性アッセイにおいて遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＩＤＵＡを産生する）を収集することができる。斯かる走化性アッセイは、本技術分野で公知であり、本明細書に記載されている（例えば、本明細書の実施例６を参照）。

【0187】

簡潔に説明すると、本開示の細胞組成物は、トランスフェクトされており、本明細書に記載されている治療剤を発現している、分化および活性化されたＢ細胞集団を、１種または複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。斯かる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、乳酸リンゲル溶液その他等のバッファー；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含むことができる。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内または皮下投与のために製剤化される。

【0188】

一実施形態では、細胞組成物は、投与の前に純度に関して評価される。別の実施形態では、細胞組成物は、治療剤産生の頑強性に関して検査される。一実施形態では、細胞組成物は、無菌性に関して検査される。別の実施形態では、細胞組成物は、レシピエント被験体に適合することを確認するためにスクリーニングされる。

【0189】

一実施形態では、操作されたＢ細胞集団は、被験体への投与の前に、ポリクロナリティーに関して評価される。最終細胞産物のポリクロナリティーを確実にすることは、重要な安全性パラメータである。具体的には、優勢なクローンの出現は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍発生または自己免疫性疾患に潜在的に寄与するものとして考慮される。ポリクロナリティーは、本技術分野で公知のまたは本明細書に記載されているいずれかの手段によって評価することができる。例えば、一部の実施形態では、ポリクロナリティーは、操作されたＢ細胞集団において発現されるＢ細胞受容体の配列決定（例えば、ディープシークエンシング）によって評価される。Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞発生において変化を起こして、Ｂ細胞の間で特有のものとなるため、本方法は、どの程度の数の細胞が同じＢ細胞受容体配列を共有するか（これらがクローナルであることを意味する）を定量化することを可能にする。よって、一部の実施形態では、同じＢ細胞受容体配列を発現する操作されたＢ細胞集団におけるＢ細胞が多くなるにつれて、集団のクロナリティーが高くなり、したがって、被験体への投与に対する集団の安全性が低くなる。逆に、一部の実施形態では、同じＢ細胞受容体配列を発現する操作されたＢ細胞集団におけるＢ細胞が少なくなるにつれて、集団のクロナリティーは低くなり（すなわち、ポリクロナリティーが高くなり）、よって、被験体への投与に対する集団の安全性が高くなる。

【0190】

一部の実施形態では、操作されたＢ細胞は、十分にポリクローナルであることが決定された後に、被験体に投与される。例えば、最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．２％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞を被験体に投与することができる。最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．１％超、または総Ｂ細胞集団の約０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％もしくは約０．０４％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞を被験体に投与することができる。特定の実施形態では、最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．０３％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞（例えば、ＩＤＵＡを産生する）が被験体に投与される。

【0191】

一実施形態では、細胞組成物は、４℃で貯蔵および／または発送される。別の実施形態では、細胞組成物は、貯蔵および／または発送のために凍結される。細胞組成物は、例えば、－２０℃または－８０℃で凍結することができる。一実施形態では、細胞組成物を凍結するステップは、液体窒素を含む。一実施形態では、細胞組成物は、速度制御フリーザーを使用して凍結される。したがって、本明細書に記載されている方法は、解凍ステップをさらに含むことができる。

【0192】

使用方法
本発明の一態様は、治療剤の長期ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関する。特定の実施形態では、改変Ｂ細胞が、慢性疾患および障害を処置および／または予防する方法において使用される。

【0193】

本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、処置または予防されるべき疾患または障害に適切な様式で投与することができる。投与の分量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度等の因子によって決定されるであろうが、適切な投薬量は、臨床治験によって決定することができる。

【0194】

一実施形態では、単回用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。一実施形態では、２またはそれよりも多い用量の改変Ｂ細胞が、被験体に逐次投与される。一実施形態では、３用量の改変Ｂ細胞が、被験体に逐次投与される。一実施形態では、ある用量の改変Ｂ細胞が、被験体に毎週、隔週、毎月、隔月、年四回、半年毎に、毎年または隔年投与される。一実施形態では、改変Ｂ細胞によって産生される治療剤の量が減少する場合、第２のまたはその後の用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。

【0195】

一実施形態では、所望の量（例えば、有効量）の治療剤が被験体において検出されるまで、ある用量の改変Ｂ細胞が、ある特定の頻度（例えば、毎週、隔週、毎月、隔月または年四回）で被験体に投与される。一実施形態では、治療剤の量は、被験体においてモニターされる。一実施形態では、改変Ｂ細胞によって産生される治療剤の量が、所望の量を下回って減少する場合、その後の用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。一実施形態では、所望の量は、所望の効果を産生する範囲である。例えば、ＭＰＳ Ｉを有する個体におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を低下させるための方法において、ＩＤＵＡの所望の量が、ＩＤＵＡの非存在下でのＧＡＧのレベルと比較して、ある特定の組織におけるＧＡＧのレベルを減少させる量である。

【0196】

「有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示されている場合、投与されるべき本開示の組成物の正確な量は、医師によって、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被験体）の状態の個体差を考慮しつつ決定することができる。Ｂ細胞組成物は、適切な投薬量（複数可）で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知の注入技法を使用することにより投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３１９巻：１６７６頁、１９８８年を参照）。

【0197】

特定の患者に最適な投薬量および処置レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニターし、それに従って処置を調整することにより、医学技術分野の当業者によって決定することができる。処置は、生物学的試料（例えば、体液または組織試料）における治療剤（例えば、目的の遺伝子またはタンパク質）のレベルの測定後に調整することもでき、処置有効性の評価に使用することもでき、処置は、それに従って、増加または減少するように調整することができる。典型的には、関係する養子免疫療法研究において、抗原特異的Ｔ細胞は、およそ２×１０^９～２×１０^１１個の細胞が患者に投与される（例えば、米国特許第５，０５７，４２３号を参照）。

【0198】

本開示の一部の態様では、多用量レジメンのための改変Ｂ細胞の最適な投薬量は、被験体のためのＢ細胞の最適な単回用量濃度を先ず決定し、最適な単回用量濃度に存在するＢ細胞の数を減少させて、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度をもたらし、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２またはそれよりも多い投薬量をこの被験体に投与することにより決定することができる。一部の態様では、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２、３またはそれよりも多い投薬量が、被験体に投与される。一部の態様では、被験体への改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２、３またはそれよりも多い投薬量の投与は、改変Ｂ細胞が発現するように操作される治療用ポリペプチドの相乗的ｉｎ
ｖｉｖｏ産生をもたらす。一部の態様では、最適に満たない単回用量濃度は、最適な単回用量濃度の１／２、または３、４、５、６、７、８、９、１０分の１または１０分の１未満を含む。一部の態様では、治療用ポリペプチドは、ＩＤＵＡである。一部の態様では、治療用ポリペプチドは、ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＩＸ）である。一部の態様では、治療用ポリペプチドは、ヒトレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）である。一部の態様では、治療用ポリペプチドは、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）である。

【0199】

本開示の一部の態様では、１０^６個／キログラム（患者あたり１０^６～１０^１１個）の範囲内の、より少ない数の本開示のトランスフェクトされたＢ細胞を投与することができる。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１または１×１０^１２個の細胞が被験体に投与される。Ｂ細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与することができる。細胞は、治療法を受ける患者に対して自家または異種（例えば、同種異系）であってよい。所望に応じて、処置は、免疫応答の誘導および注入されたＢ細胞の生着を増強するために、本明細書に記載されているマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＢＡＦＦ等）の投与を含むこともできる。

【0200】

対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、植え込みまたは移植によるものを含む、いずれか簡便な様式で実行することができる。本明細書に記載されている組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、髄内に、髄腔内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に、患者に投与することができる。本明細書に記載されている組成物は、神経系へと直接的に、患者に投与することができる。一実施形態では、本開示のＢ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されているＢ細胞組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｂ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、骨髄または感染部位へと直接的に注射することができる。

【0201】

さらに別の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系において送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：１５２７～１５３３頁；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．１４巻：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年；Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８巻：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３２１巻：５７４頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９７４年、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、１９８４年、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年；Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．２３巻：６１頁を参照；Ｌｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８巻：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．２５巻：３５１頁；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１巻：１０５頁も参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的に近接して配置することができ、これにより、全身性用量の一部のみを要求する（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９８４年、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、第２巻、１１５～１３８頁を参照）。

【0202】

本開示のＢ細胞組成物は、いずれかの数のマトリクスを使用して投与することもできる。マトリクスは、組織工学の文脈内で長年利用されてきた（例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｌａｎｚａ、ＬａｎｇｅｒおよびＣｈｉｃｋ（編））、１９９７年を参照）。本開示は、Ｂ細胞を支持および維持するための人工リンパ系臓器として作用するという新規文脈内で斯かるマトリクスを利用する。したがって、本開示は、組織工学における有用性を実証したマトリクス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本開示の組成物、デバイスおよび方法において使用することができるマトリクスの種類は、実質的に無制限であり、生物学的および合成マトリクスの両方を含むことができる。特定の一例では、米国特許第５，９８０，８８９号；同第５，９１３，９９８号；同第５，９０２，７４５号；同第５，８４３，０６９号；同第５，７８７，９００号；または同第５，６２６，５６１号によって表記されている組成物およびデバイスが利用される。マトリクスは、哺乳動物宿主に投与される場合、生体適合性であることに一般的に関連する特色を含む。マトリクスは、天然および／または合成材料から形成され得る。マトリクスは、インプラント等、動物の身体内に永続的な構造もしくは取り外し可能な構造を残すことが望ましい場合、非生分解性となることができる；または生分解性となることができる。マトリクスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファ（ｔｅｌｆａ）パッド、繊維、中空繊維、凍結乾燥された構成成分、ゲル、粉末、多孔性組成物またはナノ粒子の形態を取ることができる。加えて、マトリクスは、徐放の播種細胞または産生サイトカインまたは他の活性薬剤を可能にするように設計することができる。ある特定の実施形態では、本開示のマトリクスは、可撓性かつ弾性であり、無機塩、水性の流体、および酸素を含む溶解したガス状作用物質等の物質に対して透過性である半固体足場として記載することができる。

【0203】

マトリクスは、本明細書において、生体適合性物質の一例として使用されている。しかし、本開示は、マトリクスに限定されず、よって、マトリクス（単数または複数）という用語が現れる場合は常に、このような用語は、細胞の保持または細胞の横断を可能にし、生体適合性であり、物質それ自体が半透膜であるようにこの物質を通って直接的にまたは特定の半透性物質と併せて使用されて、巨大分子の横断を許すことができるデバイスおよび他の物質を含むものと解読されるべきである。

【0204】

本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法または本技術分野で公知の他の方法を使用してトランスフェクトおよび活性化されたＢ細胞は、抗ウイルス剤等の薬剤、化学療法、照射、シクロスポリン、ビスルフィン（ｂｉｓｕｌｆｉｎ）、ボルテゾミブ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩およびＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体、またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法等の他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射による処置が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの数の関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）患者に投与される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、プロテアソーム（ボルテゾミブ）のいずれかを阻害する、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ６６巻：８０７～８１５頁、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ．７３巻：３１６～３２１頁、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．
Ｉｍｍｕｎ．５巻：７６３～７７３頁、１９９３年；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記参照））。さらなる実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド等の化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはキャンパス等の抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）患者に投与される。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）等、Ｂ細胞除去療法の後に投与される。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、ボルテゾミブ等の薬剤を使用したＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準処置に続いて、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後に、被験体は、本開示の拡大増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加的な実施形態では、拡大増殖された細胞は、外科手術の前または後に投与される。

【0205】

患者に投与されるべき上述の処置の投薬量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質と共に変動するであろう。ヒト投与のための投薬量のスケーリングは、本技術分野で許容される実施に従って行うことができる。

【0206】

改変Ｂ細胞は、様々な感染性疾患、がん、変性疾患および免疫学的障害の処置または予防において使用することができる。

【0207】

本明細書に記載されている改変Ｂ細胞を含む組成物は、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌等、感染性生物に起因する種々の感染性疾患のいずれかの処置において使用することができる。感染性生物は、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、寄生生物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属の種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属の種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属の種等、原生動物および後生動物病原体）、細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ属、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ属）、真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属の種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉおよびプリオン（公知プリオンは、動物に感染して、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピー、ならびにウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）または「狂牛病」およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトが罹ることが公知の４種のプリオン病は、（１）クールー病、（２）クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）である）を含むことができる。本明細書において、「プリオン」は、使用されているいずれかの動物、特に、ヒトおよび飼い慣らされた家畜において上述の疾患または他の疾患の全てまたはいずれかを引き起こすあらゆる形態のプリオンを含む。説明のための感染性疾患として、トキソプラズマ症、ヒストプラズマ症、ＣＭＶ、ＥＢＶ、コクシジオイデス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、結核症、ＨＩＶその他が挙げられるがこれらに限定されない。

【0208】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞組成物は、種々のがんの予防または処置に使用することもできる。この点に関して、ある特定の実施形態では、トランスフェクトされたＢ細胞を含む組成物は、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞癌、子宮がん、膵がん、食道がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸部がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、ヘパトーム、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または他のがんの予防または処置に有用である。

【0209】

一実施形態では、改変Ｂ細胞は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、他の免疫不全、免疫抑制および重症複合免疫不全疾患（ＳＣＩＤ）等、免疫学的障害の処置において使用することもできる。

【0210】

一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺機能亢進症／グレーブス病、甲状腺機能低下症／橋本病、インスリン依存性糖尿病（１型）、重症筋無力症、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エヴァンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害剤症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリウマチ熱等が挙げられるがこれらに限定されない、自己免疫性疾患の処置において使用することもできる。よって、一実施形態では、本明細書における方法は、疾患を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載されている改変Ｂ細胞を含む組成物を、それを必要とする被験体または患者に投与し、これにより、疾患を処置するステップを含む方法を含む。

【0211】

一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩ、ＭＰ ＩＶ、ＭＰＳ Ｖ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、リソソーム蓄積障害、ニーマン・ピック病（Ａ、ＢおよびＣ型）、ゴーシェ病（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）、テイ・サックス病およびポンペ障害等が挙げられるがこれらに限定されない、酵素欠損疾患および障害の処置において使用することもできる。

【0212】

一実施形態は、個体におけるＭＰＳ Ｉを処置するための方法であって、ＩＤＵＡを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（ＩＤＵＡ＋Ｂ細胞）を、ＭＰＳ Ｉを有するまたはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、単回の最大有効用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞が、被験体に投与される。別の実施形態では、２またはそれよりも多い用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞が、被験体に投与され、これにより、生着されるＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の量を最大化する。一部の実施形態では、被験体に投与される２またはそれよりも多い用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞は、単回の最大有効用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞よりも少ないＩＤＵＡ＋Ｂ細胞を含む。一部の実施形態では、２またはそれよりも多い用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞が、最大有効単回用量のＩＤＵＡ＋Ｂ細胞を下回るＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の投薬量で被験体に投与される場合、その結果としてのＩＤＵＡ産生の相乗的増加が起こる。一実施形態では、被験体へのＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の投与は、健康な対照被験体に見られる正常レベルのＩＤＵＡをもたらす。一実施形態では、被験体へのＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の投与は、被験体における正常レベルを超えるＩＤＵＡをもたらす。一実施形態では、被験体へのＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の投与は、正常レベルまで、被験体におけるＧＡＧのレベルを低下させる。一実施形態では、被験体へのＩＤＵＡ＋Ｂ細胞の投与は、被験体におけるＧＡＧの正常レベル未満まで、被験体におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

【実施例0213】

（実施例１）
ＩＤＵＡ発現Ｂ細胞の産生
ヒトＩＤＵＡの転位および発現のためのスリーピングビューティートランスポゾンおよびトランスポサーゼ構築物を生成した。Ｂ細胞におけるＩＤＵＡ遺伝子組込みおよび発現を達成するためにアセンブルされたトランスポゾンを図１に示す。本発明者らは、Ｂ細胞における高レベル発現を達成するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーエレメントからなるＥＥＫプロモーター、ならびに以前に記載された他の調節エレメントを使用した。ＩＤＵＡ転位および発現に関して検査するために、２名の別々のドナーからヒトＢ細胞を単離し、培養において拡大増殖し、２日目に、ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡプラスｐＣＭＶ－ＳＢ１００ｘをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション８日後に調製された細胞ライセートは、約６０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ
ＩＤＵＡ活性を含有しており、これは、野生型細胞に見出されるＩＤＵＡのレベルの約５０倍であり、拡大増殖されたヒトＢ細胞における高レベルＩＤＵＡ発現を達成するためのＳＢトランスポゾン系の有効性を実証する（図２）。

【0214】

ＩＤＵＡ発現細胞を濃縮するために、本発明者らは、また、葉酸塩アンタゴニストメトトレキセート（ＭＴＸ：（ＭｃＩｖｏｒ ＲＳ．、１９９６年、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １８巻：Ｓ５０～５４頁））に対して耐性である新規バリアント酵素（Ｌ２２Ｙ、Ｆ３１Ｓ）をコードするように合成されたヒトジヒドロ葉酸レダクターゼと共にヒトＩＤＵＡをコードする、二機能性トランスポゾン（ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ、図１）を生成した。この構築物のプラスミドマップを図１Ｂに示し、その配列を配列番号１として提示する。

【0215】

本発明者らは、また、透過処理および細胞内染色に続くフローサイトメトリーによって高レベルのＩＤＵＡを発現する細胞を同定するための、市販の抗ヒトＩＤＵＡ抗体を使用した技法を確立した。ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲと同様のＧＦＰ－ＤＨＦＲトランスポゾンを使用して、本発明者らは先ず、細胞の拡大増殖の２～４日目の間にいくつかの異なる濃度のＭＴＸでインキュベートすることにより、転位したＢ細胞の選択的増生のための条件を確立した。本発明者らは、２００ｎＭが、ＧＦＰレポーター導入遺伝子を発現するＢ細胞の選択的増生（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）に最も有効な条件をもたらしたことを見出した（表１）。次いで、本発明者らは、ｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ＋ｐＣＭＶ－ＳＢ１００ｘエレクトロポレーション細胞の拡大増殖にこれらの条件を適用し、７日目に細胞内染色によって％ＩＤＵＡ＋細胞に関して評価した。１０～１２％の頻度のＩＤＵＡ＋細胞が、転位細胞集団において観察されたが、この頻度は、ＭＴＸ選択を適用することにより、２５％またはそれを超えるまで増加した（図３）。

【表1】

【0216】

ＮＯＤ－ＳＣＩＤにおいて戻し交配したＭＰＳ Ｉマウス系統を使用して、初期ｉｎ ｖｉｖｏ研究を開始したが、この系統への注入１週間後のＢ細胞維持に関する証拠はなかった。この問題は、実施例２に後述するＮＳＧ－ＭＰＳ Ｉマウスを生成するＩＬ－２受容体ガンマ－Ｃノックアウトアレルにおいて交配することにより最終的に解決されたが、その一方で、本発明者らは、ＩＤＵＡ＋ＮＳＧマウスにおけるＭＴＸ選択ＩＤＵＡ＋Ｂ細胞（図３に示す）の養子移入に関して検査した。自家末梢血細胞をＣＤ４＋に関して濃縮し、－３０および－４日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注入して、０日目にｉ．ｐ．または静脈内のいずれかで注射されたｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ－ＤＨＦＲ転位Ｂ細胞に関する支持を提供した。本発明者らは、ｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．の両方でＩＤＵＡ発現Ｂ細胞を投与した動物において、野生型レベルから野生型の２００倍にわたる血漿ＩＤＵＡの範囲を観察した（図４）。本発明者らは、また、血漿における極めて高レベルのヒト免疫グロブリン（平均１～４ｍｇ／ｍＬ）を観察した － ヒトＢ細胞養子移入成功の強力な証拠である。ＩＤＵＡ欠損動物において実行されなかったが、にもかかわらず、本実験の結果は、ＮＳＧマウスへの高度に強力なＩＤＵＡ＋Ｂ細胞集団の導入後に達成することができるヒトＩＤＵＡのレベルの例を提供する。

【0217】

（実施例２）
ＭＰＳ ＩマウスにおけるＩＤＵＡのｉｎ ｖｉｖｏ産生
投与される改変Ｂ細胞の数および産生される治療剤の量の間の関係性が、線形であるか決定するために、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）のマウスモデルを、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を発現するように遺伝子改変された同種異系Ｂ細胞と共に使用した。

【0218】

ＮＳＧ（ＮＯＤ－ＳＣＩＤガンマ－Ｃ欠損）マウスを、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＤＵＡ欠損マウスと交配して、同じ系統におけるガンマ－ＣおよびＩＤＵＡ欠損アレルを採取し、本明細書において「ＭＰＳ Ｉマウス」とも称される、ＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウスを生成した。十分なＮＳＧ ＭＰＳ Ｉマウスが生成されたら、これらの動物に、－７日目に３×１０^６個のＣＤ４＋Ｔ細胞をｉ．ｐ．注入し、次いで０日目に３×１０^６、１×１０^７または３×１０^７個のｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ転位Ｂ細胞（細胞内染色によりおよそ１０％ＩＤＵＡ＋）をｉ．ｖ．注入した。ＭＰＳ Ｉマウスに、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞（または対照として細胞なし）の存在下で、単回用量の、ＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞（または対照として細胞なし）を与え、その内容全体を参照により本明細書に組み込む、Ｈｏｐｗｏｏｄ ＪＪら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１９７９年３月１日；９２巻（２号）：２５７～６５頁によって以前に報告されたＩＤＵＡ酵素アッセイプロトコールを使用して、３８日目まで血清におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを測定した（図５）。マウスは、Ｂ細胞の長期生存に要求される因子を欠くため、同様に、Ｂ細胞生存を促進するために、マウスにＣＤ４＋Ｔメモリー細胞を腹腔内投与した。

【0219】

予想外なことに、これらの結果は、細胞数および血清ＩＤＵＡレベルの間の関係性が、ある特定の細胞用量において線形でないことを実証した。理論に制約されることを望まないが、この知見は、異なる細胞濃度で異なる生存成果を産生する、ｉｎ ｖｉｖｏで互いに相互作用するＢ細胞によるものである可能性がある。よって、これらの結果は、必要な最小数の細胞を投与しつつ、治療剤の十分な産生を達成する理想的な用量が存在することを示す。この概念は、図５に説明されており、それによると、３×１０^７個の細胞用量は、１×１０^７個の細胞用量と比較して、血漿におけるＩＤＵＡ活性レベルの３倍を超える増加をもたらした。

【0220】

（実施例３）
ＭＰＳ Ｉマウスにおける多回用量のＩＤＵＡ産生Ｂ細胞
Ｂ細胞の投薬量が、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される治療剤の量を達成するか決定するために、ＭＰＳ Ｉマウスに、一連の３用量のＩＤＵＡ産生Ｂ細胞を与えた。

【0221】

ＭＰＳ Ｉマウスに、０日目に、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞（または対照として細胞なし）の存在下で、一連の３用量の、１×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞（または対照として細胞なし）を与え、５６日目まで血清におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを測定した（図６）。具体的には、ＭＰＳ Ｉマウスに、－７日目に３×１０^６個のＣＤ４＋Ｔ細胞をｉ．ｐ．注入し、次いで０日目に１０^７個のｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ転位Ｂ細胞（細胞内染色によりおよそ１０％ＩＤＵＡ＋）をｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．のいずれかで注入した。動物に、第１の注射後２１および４２日目に、同じ投与経路によって１０^７個のｐＫＴ２／ＥＥＫ－ＩＤＵＡ転位Ｂ細胞の追加的な注入を与えた。

【0222】

この手順を使用して、本発明者らは、野生型レベルの血漿ＩＤＵＡ（約１ｎｍｏｌ／時間／ｍｌ）が、Ｂ細胞処置動物の大部分において達成されること、また、これが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の事前の投与を要求することを見出した（図６）。本発明者らは、Ｂ細胞養子移入の証拠として、血漿におけるヒトＩｇＧが、２００μｇ／ｍＬ～最大１ｍｇ／ｍＬに及んだことを見出した（図７）。

【0223】

これらの結果は、いくつかの用量の経過にわたる同数の改変Ｂ細胞の投与が、単回用量での改変Ｂ細胞の全ての投与によって達成されるものよりも大きい究極レベルの治療剤をもたらすことを実証する。図６から分かる通り、１×１０^７個のＢ細胞の第１の用量の後のＩＤＵＡの初期レベルは、第３の用量の後に達成されるものと比較して低かったが、これは予想外に、第１の用量の後に観察されるＩＤＵＡの血清レベルの３倍を大幅に上回るＩＤＵＡの血清レベルをもたらした。この現象は、図５における１×１０^７個の細胞／マウスデータを、各用量が１×１０^７個であるため図６におけるデータと比較することによって観察することもできる。図５において、静脈内投与される１×１０^７個の細胞の単回投薬量が、Ｄ３８によって減退レベルのＩＤＵＡをもたらしたことが示される一方、図６において、静脈内投与される３用量の１×１０^７個の細胞に起因するＩＤＵＡのレベルが、大幅に増加することならびに同様に、同じ時点で１×１０^７個の単回投薬量レベルおよび３×１０^７個の単回投薬量レベルの３倍を大幅に超えることの両方を続ける発現レベルをもたらしたことが明らかである。予想外なことに、複数の投薬量にわたるこの相乗作用は、操作されたＢ細胞を静脈内送達されたこれらのマウス群のみに観察されており、操作されたＢ細胞を腹腔内注射により受けたマウスには観察されなかった。

【0224】

多回用量が、同数の細胞の単回投薬量から予想されるものを超える治療剤のレベルをもたらしたことを示すことに加えて、多回投薬量が、より大きいレベルの治療剤をもたらしたことの単なる概念は、有利かつ予想外である。機構的には、分化したＢ細胞が、有限のレベルの生存ニッチを占有し、新たな分化細胞が作製されると、これが、古い細胞の一部を置き換えることが考えられる。したがって、その後の用量のＢ細胞が、治療剤の血清レベルの付随する増加をもたらさないことが予想され得る。しかし、本発明者らは、これが事実ではなく、追加的なＢ細胞注入が、それが作製する治療剤のより大きい定常状態血漿レベルをもたらすことを示した。この現象は、要求される細胞投薬量を最小化しつつ、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療薬の適正な投薬量を達成するのに有用である。

【0225】

具体的には、患者は、ある投薬量を投与され、次いで、薬物の血漿レベルを測定することができる。レベルが、所望のものよりも低い場合、細胞の追加的な投薬量を投与することができる。大部分の注射された生物製剤の平均半減期を考慮すると、これらの知見は確かに、生物製剤の直接的注入に適用不能である。さらに、これらの結果は、ウイルスに基づく薬物送達等の他の方法を使用して達成可能となる可能性が低く、これはまた、ベクターに対する免疫応答を誘発し、これにより、さらなる用量の投与の将来的な試みの有効性を低下／邪魔し得る。

【0226】

したがって、本明細書に開示されている治療剤を送達するための方法は、１回よりも多い用量の改変Ｂ細胞を投与する能力、およびこれに起因する投薬量の積み重ねを含む、先行技術の方法を上回る利点を提供する。

【0227】

（実施例４）
複数の組織へのＢ細胞に基づく送達
治療剤の直接的注入、ウイルスベクターによる送達、および造血幹細胞移入は全て、複数の組織への治療剤の送達に成功できていない。改変Ｂ細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで治療剤を種々の組織に送達することができるか決定するために、ＭＰＳ Ｉマウスに、先の実施例に記載されている通り、一連の３用量のＩＤＵＡ産生Ｂ細胞を与えた。

【0228】

先の実施例に記載されているプロトコールに従って、ＭＰＳ Ｉマウスに、ＣＤ４＋Ｔ細胞（または対照として細胞なし）の存在下で、３用量の１×１０^７個のＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞（または対照として細胞なし）を含む投薬量レジメンを与えた。第１のＢ細胞注入後６０日目に、動物を安楽死させ、組織を収集し、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腸、筋肉、脳、心臓、腹膜灌流および骨髄におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを測定した（図８）。

【0229】

フローサイトメトリーは、ヒトＴおよびＩＤＵＡ発現Ｂ細胞を注入された動物の脾臓およびリンパ節における２０％～３５％のヒトＣＤ４５＋および２％～１０％のＣＤ１９＋細胞を示した。末梢組織およびさらには脳において回復されるＩＤＵＡ活性によって観察される、実質的な代謝性相互補正（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）が存在した（図８）。

【0230】

ＩＤＵＡは、ＧＡＧを分解し、存在するＧＡＧの量は、ＭＰＳ Ｉマウスの組織における等、ＩＤＵＡの非存在下で増加する。したがって、当該組織においてＩＤＵＡがＧＡＧを分解しているか決定するために、６０日目に脳、肺、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、脾臓および腸におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）も測定した（図９）。ＩＤＵＡによる代謝性相互補正の結果として、組織グリコサミノグリカンは、ＣＤ４＋Ｔ細胞も注入されたＢ細胞処置動物において有意に低下した（図９）。

【0231】

これらの結果は、改変Ｂ細胞によるＩＤＵＡの送達が、組織への治療剤の増強された送達と、当該組織における治療剤の活性の両方を可能にすることを実証した。図８は、ＩＤＵＡを産生するＢ細胞の注入に起因する、組織におけるＩＤＵＡ酵素活性レベルを示す。図９は、これら同じマウスにおけるＧＡＧレベルを示す。ＧＡＧは、ＭＰＳ Ｉマウス組織に集積し、ＩＤＵＡの酵素活性によって崩壊される、毒性細胞産物である。両方の図において観察することができるように、ＩＤＵＡ産生およびＧＡＧ低下が、肺、脾臓、肝臓、心臓および腸を含む複数の組織において有効に起こった。留意するべきことに、ＩＤＵＡの注入は、心臓、脾臓および肝臓等の組織における疾患症状発現に適切に取り組むとは考えられない。これらの結果は、初めて、ＭＰＳ Ｉの代謝性補正に対するＩＤＵＡ発現ヒトＢ細胞の有効性を実証した。したがって、このデータは、遺伝子改変Ｂ細胞による酵素のｉｎ ｖｉｖｏ送達が、身体の様々な臓器の処置を増強する傾向を仮定することを支持する。

【0232】

（実施例５）
Ｂ細胞に基づく治療薬送達の長期有効性
治療薬のＢ細胞に基づく送達が、長期タンパク質産生をもたらすか決定するために、本発明者らは、ＩＤＵＡ産生Ｂ細胞を受けたＭＰＳ Ｉ ＮＳＧマウスの血漿および組織における長期ＩＤＵＡ活性を解析した。

【0233】

以前に記載された通りに、ＩＤＵＡを過剰発現するＢ細胞を調製した。ＮＳＧ ＭＰＳ
Ｉ動物に、Ｂ細胞注入の１週間前に、３ｅ６個のＣＤ４＋メモリーＴ細胞を腹腔内注入した。次に、この動物に、０および３０日目に、２ｅ７個のＩＤＵＡ発現Ｂ細胞を注入した。

【0234】

本発明者らは先ず、先の実施例に記載されている通りに、ＩＤＵＡ産生Ｂ細胞を受けたＭＰＳＩ ＮＳＧマウス由来の血漿におけるＩＤＵＡ酵素活性を解析した。この期間にわたり、対照として、無処置ＭＰＳＩ ＮＳＧマウスも解析した。２週間前後毎に、６．５ヶ月間、これらの動物から血液を収集し、以前に記載された通りに、ＩＤＵＡ酵素活性に関してアッセイした。

【0235】

図１０に示す通り、血漿ＩＤＵＡ活性は、操作されたＢ細胞を受けるマウスにおいて強く誘導されており、ピーク血漿応答は、注入後５週間前後で起こり、ＩＤＵＡ活性は、注入６．５ヶ月後の屠殺時まで、これらの動物においてより高いままであった。

【0236】

さらに、Ｂ細胞産物による長期処置はまた、操作されたＢ細胞の注入後３、６および６．５ヶ月目に、解析した複数の組織におけるＩＤＵＡのレベル増加の延長をもたらし（図１１）、上の実施例４において観察されたＩＤＵＡの増強された組織送達が、単なる一過性ではなく、長期持続することを示す。

【0237】

さらに、Ｂ細胞の第１の注入の３ヶ月、６ヶ月および６．５ヶ月後に、動物を安楽死させ、実施例４に記載されている通り、組織からの抽出物をＧＡＧレベルに関してアッセイしたところ、複数の組織においてＧＡＧのレベルの長期低下が観察された（図１２）。ＧＡＧ低下の陽性対照として、ＮＳＧ－ＩＤＵＡ^＋／－マウス（ＩＤＵＡに関してヘテロ接合性であり、表現型的に正常である）をアッセイした。ＧＡＧ低下の陰性対照として、ＭＰＳＩ ＮＳＧマウスの一群は、細胞を受けなかった。

【0238】

よって、これらのデータは、改変Ｂ細胞による治療剤の送達が、血漿のみならず、ＩＤＵＡの注入では典型的に処置不能な、心臓、脾臓および肝臓等の組織においても、ｉｎ ｖｉｖｏでの酵素活性レベルの延長された増強を可能にすることを示す。

【0239】

（実施例６）
操作されたＢ細胞の遊走能の最適化 形質細胞が長期生存するためには、前駆体細胞（すなわち、形質芽球）が、骨髄等の位置に見出される長期形質細胞生存ニッチへと遊走する能力を有する必要があることが一般に受け入れられる。対照的に、形質細胞は、分化を完了すると、その遊走能力を下方調節することが一般に受け入れられる。したがって、形質芽球の注入集団から形質細胞の集団の生成を意図する場合、細胞が頑強な遊走能を有することが重要と思われる。具体的には、ＣＸＣＬ１２に向けた遊走が、骨髄への形質細胞前駆体の遊走に重要である。その上、ＣＸＣＬ１３等のケモカインは、炎症部位および脾臓等の組織への遊走に重要となり得る。

【0240】

培養条件が、遊走性Ｂ細胞を生成するか決定するために、また、治療用タンパク質を発現するように操作されたＢ細胞の遊走能が、操作されたＢ細胞が、操作後だが被験体への投与のために収集される前に培養下で残存する時間量に依存するか決定するために、本発明者らは、以前に記載された通りにＩＤＵＡを過剰発現するＢ細胞を調製し、その遊走能の解析の前に４～９日間、操作されたＢ細胞を培養下に維持した。

【0241】

チャンバーが接続された２チャンバー型培養容器（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレート）を使用してアッセイを行った。一方のチャンバーに、操作されたＢ細胞を播種し、他方のチャンバーは、Ｂ細胞を骨髄に引き寄せる化学誘引物質であるＣＸＣＬ１２を、またはＢ細胞を炎症部位および脾臓等の組織に引き寄せる化学誘引物質であるＣＸＣＬ１３を１００ｎｇ／ｍＬで負荷した。Ｂ細胞を３時間遊走させた後に、第２のウェルからＢ細胞を採取し、計数した。各アッセイにおいて、化学誘引物質（ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）が第２のチャンバーに添加されなかった陰性対照を使用した。ＣＸＣＬ１２に関して、アッセイの模式図を図１３Ｄに提示する。同じアッセイをＣＸＣＬ１３に使用した。

【0242】

被験群は、操作されたＢ細胞の遊走能を大幅に増強することを本発明者らが以前に示した（その全体を参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６６９０８を参照）培養系に曝露されたＢ細胞であった。本明細書に記載されている実験の全てに利用されている（他に記述がなければ）この培養系は、ＣＤ４０Ｌ（多量体化のためにＨＩＳタグ付けされている）、ＣＤ４０Ｌ架橋剤（ＣＤ４０Ｌの多量体化を誘導する抗ＨＩＳ抗体）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１を含む。操作後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ解析の前に、Ｂ細胞を適切な日数培養した。

【0243】

驚いたことに、本発明者らは、本発明者らの培養条件下で操作されたＢ細胞が、７～９日間前後（培養において、または操作後５～７日間）でピークになる、ＣＸＣＬ１２への最適な遊走潜在力、および６～７日間前後（培養において、または操作後４～５日間前後）でピークになるＣＸＣＬ１３への最適な遊走潜在力を有することを観察した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。これらのデータは、一部の実例では、このウィンドウ内で、操作されたＢ細胞を収集し被験体に投与して、最適な遊走潜在力を確実にし、標的組織への最適な遊走を誘導することが有益となり得ることを示唆する。

【0244】

（実施例７）
ＩＤＵＡを発現するように操作された最終Ｂ細胞のクロナリティー評価
最終細胞産物のポリクロナリティーを確実にすることは、重要な安全性パラメータである。具体的には、優勢なクローンの出現は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍発生または自己免疫性疾患に潜在的に寄与するものとして考慮される。Ｂ細胞最終産物において評価するために、細胞を、以前に記載された通りに培養において育成し（実施例６に提示されている培養条件を参照）、実施例１に記載されている方法を使用して、ＩＤＵＡを発現するように操作し、培養７日目に収集し、冷凍保存した。ＤＮＡを抽出し、Ｂ細胞受容体のハイスループットディープシークエンシングに付した。Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞発生において変化を起こして、Ｂ細胞の間で特有のものとなるため、本方法は、どの程度の数の細胞が同じＢ細胞受容体配列を共有するか（これらがクローナルであることを意味する）を定量化することを可能にする。

【0245】

ディープシークエンシングの結果を図１４および下の表２に示す。２４８，０００個を超える鋳型分子を解析したところ、２４１，０００個前後の特有の再配列が観察され、０．０３％のクロナリティーの最大頻度（すなわち、任意の特異的Ｂ細胞クローンの蔓延）を表す。

【表2】

【0246】

本実験は、最終Ｂ細胞産物が、高度にポリクローナルであり、単一クローンは、細胞集団の相当な部分を占めないことを実証する。具体的には、配列決定の結果は、単一クローンが、最終集団の０．０３％超を占めないことを実証する。よって、最終的な操作されたＢ細胞は、治療目的のために十分にポリクローナルであることが予想され、いずれか特定のクローンを豊富に含有するとは思われない。培養条件、ゲノム改変、および外来性因子の存在（例えば、培養培地に存在するウシ胎仔血清）が、クロナリティーの出現を生じ得ることは真実味があるため、本発明者らは、単一クローンが有意な頻度を達成しなかったという点において、この結果を予想外と考慮する。

【0247】

（実施例８）
操作されたＢ細胞の炎症性潜在力

【0248】

多くの治療薬と同様に、本発明は、免疫系を刺激する潜在力を有し、有効性を低下または排除し得る有害な副作用および／または中和抗体をもたらす可能性がある。斯かる有害な免疫反応を誘発し得るかに関する有用な予測因子の１つは、最終的な操作されたＢ細胞産物が、炎症性サイトカインを産生するか否かである。よって、本発明者らは、培養の終わりに、Ｂ細胞産物（上述の実施例に従ってＩＤＵＡを産生するように操作されたＢ細胞）が、様々な炎症性サイトカインのいずれかを産生するかについて測定した。

【0249】

Ｂ細胞を、以前に記載された通りに培養において７日間培養し（実施例６に提示されている培養条件を参照）、実施例１に記載されている方法を使用して、ＩＤＵＡを発現するように操作し、培養７日目に収集し、冷凍保存した。培養中の複数時点において、培地試料を採取し、ルミネックスデバイスを使用して、サイトカインのパネルに関してアッセイした。具体的には、次の因子の存在についてアッセイした：ＩＬ６、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮガンマ、ｓＦＡＳ、ＴＮＦＲｐ７５、ＢＡＦＦ、ＨＧＦ、ＩＬ５、ＩＬ２Ｒアルファ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ１ｒａ、ＴＮＦＲｐ５５、ＶＥＧＦ、ＩＬ１アルファ、ｓＩＬ６Ｒ。培地製剤は、これらの因子を含有し得るＦＢＳを含有するため、陰性対照としてＢ細胞なしの培地を使用した。ＩＬ６の場合、陽性対照として役立てるために、Ｂ細胞なしの培地に組換えタンパク質（一部の事例では）を添加した。

【0250】

驚いたことに、大抵の場合、Ｂ細胞培養の終わりまでに、調べた因子は、検出不能であった、または培地のみ対照よりも上昇しなかった（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。操作された細胞が、培養および操作プロセスにおいて有意な刺激を起こす免疫細胞であることを考慮すると、この結果は予想外であった。これの例外は、ＩＬ６およびｓＦＡＳ（図１５Ａ、左から１番目の群および図１５Ｂ、左から１番目の群）であった。培養の際に増加することが見出された唯一の因子は、ｓＦＡＳであった。ＩＬ６の場合、培養２日目に上昇したレベルが検出されたが、７日目までに、ＩＬ６のレベルは、培地単独で見られるレベルに非常に近かった。

【0251】

全体的に見て、これらの結果は、培養の終わりに、Ｂ細胞産物が、顕著なレベルの検査した炎症性サイトカインを産生していないことを説明する。本発明者らが、Ｂ細胞に多数の刺激性サイトカインを提供していることを考慮すると、最終産物が、顕著なレベルのこれらのサイトカインを産生しないことは予期されなかった。最も予想外なことに、本発明者らは、時間と共に、Ｂ細胞が、そのＩＬ６産生をバックグラウンドレベル付近まで低下させたことを見出した。ＩＬ６が、強力な免疫刺激性シグナルであることが公知であるという点において、この結果は、臨床実行にとって非常に適切である。全体的に見て、本発明者らは、これらの結果が、最終Ｂ細胞産物が、全体として免疫系の有意な刺激を回避する潜在力の観点から、ｉｎ ｖｉｖｏで安全であると予想されることを反映すると考える。

【0252】

（実施例９）
ヒトＬＣＡＴまたはＦＩＸを発現するＢ細胞の産生
ヒトＬＣＡＴ、ヒトＬＰＬおよびヒトＦＩＸの転位および発現のためのスリーピングビューティートランスポゾンおよびトランスポサーゼ構築物を、実施例１に記載されている通りに生成し、培養２日目に初代メモリーＢ細胞をエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。ＬＣＡＴおよびＬＰＬのために、エレクトロポレーション２日後に（培養４日目、「Ｄ４」）、また、エレクトロポレーション６日後にも（培養８日目、「Ｄ８」）培地を採取し、発現を解析した。

【0253】

トランスフェクトＢ細胞におけるＬＣＡＴの発現は、蛍光に基づくＬＣＡＴ酵素活性アッセイ（後述する方法を参照）を使用して確認した。トランスフェクト細胞から採取された培地は、Ｄ４およびＤ８の両方で強いＬＣＡＴ活性を有した一方、培地のみ対照において有意な活性は観察されなかった（図１６Ａ）。

【0254】

トランスフェクトＢ細胞におけるＬＰＬの発現は、蛍光に基づくＬＰＬ酵素活性アッセイ（後述する方法を参照）を使用して確認した。トランスフェクト細胞から採取された培地は、Ｄ４およびＤ８の両方で強いＬＰＬ活性を有した一方、培地のみ対照において有意な活性は観察されなかった（図１６Ｂ）。

【0255】

レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）およびリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の検出のため、Ｂ細胞を培養し（実施例６に提示されている培養条件を参照）、培養２日目に、ＬＣＡＴまたはＬＰＬのいずれかをコードするトランスポゾンと共にトランスポサーゼの供給源をコードする構築物（ＳＢ１００ｘ、実施例１および図１を参照）をエレクトロポレーションした（実施例１と同様に）。培養４日目および８日目に培地試料を採取し、蛍光定量的酵素アッセイを使用して、ＬＣＡＴおよびＬＰＬの存在に関してアッセイした。具体的には、４－メチルウンベリフェリルパルミテート基質（４－ＭＵＰ）を使用し、３４０、３９０および４６０ｎｍの波長における蛍光の増加を測定することにより、ＬＣＡＴおよびＬＰＬによる基質の切断を検出した。１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を含有する反応バッファーを調製し、３７℃に置いた。２ｍｇの４－ＭＵＰを１６ｍｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と混合することにより、４－ＭＵＰを希釈した。４－ＭＵＰおよび反応バッファーを組み合わせ、２ｕｌ活性化因子化合物（例えば、ｐ－ニトロフェニルブチレート）と共に、９６ウェルプレートのウェルに総容量１５０ｕｌを添加した。Ｂ細胞培養培地の系列希釈を調製し、次に、５０ｕｌの希釈物を混合物に添加し、３７℃でインキュベートした。蛍光測定は、培養培地添加の直後に始め、３０分間の全持続時間にわたり毎分採取した。

【0256】

トランスフェクトＢ細胞におけるＦＩＸの発現は、ＥＬＩＳＡによって確認した。より具体的には、Ｂ細胞の細胞ライセートを調製し、製造業者の推奨プロトコールに従って市販のＥＬＩＳＡキット（ＦＩＸ－ＥＩＡ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、ＩＮ）を使用したＥＬＩＳＡにより検出した。エレクトロポレーション２日後に培地を採取したところ、培地は、およそ１５ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＩＸタンパク質を含有した一方、陰性対照細胞（ＧＰＦをトランスフェクトされたＢ細胞）においてＦＩＸタンパク質は検出されなかった（図１６Ｃ）。

【0257】

よって、これらのデータは、本明細書に開示されている方法においてＢ細胞を使用して、広範囲のポリペプチドを発現させ、被験体に送達することができることを実証する。

【0258】

上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照されているおよび／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要であれば、実施形態の態様を改変することができる。

【0259】

上述の詳細な説明を踏まえて、実施形態に上述および他の変化を為すことができる。一般に、次の特許請求の範囲において、使用されている用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示されている特異的な実施形態に限定するものと解釈するべきではないが、斯かる特許請求の範囲が権利を有する均等の全範囲と共にあらゆる可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【配列表】

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