特開 2024-153824 ヘキソサミニダーゼＡ、酸スフィンゴミエリナーゼおよびパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１のＣＮＳにおける活性を増加させるための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024153824

(43)【公開日】2024-10-29

(54)【発明の名称】ヘキソサミニダーゼＡ、酸スフィンゴミエリナーゼおよびパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１のＣＮＳにおける活性を増加させるための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241022BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20241022BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20241022BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20241022BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/40

C07K16/28

C07K16/46 ZNA

A61P43/00 ZNA

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P43/00

【審査請求】有

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024124266

(22)【出願日】2024-07-31

(62)【分割の表示】P 2021506506の分割

【原出願日】2019-08-07

(31)【優先権主張番号】62/715,693

(32)【優先日】2018-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/715,696

(32)【優先日】2018-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/715,697

(32)【優先日】2018-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508105751

【氏名又は名称】アーマジェン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＲＭＡＧＥＮ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム・エム・パードリッジ

(72)【発明者】

【氏名】ルーベン・ジェイ・ボアド

(57)【要約】      （修正有）

【課題】中枢神経系(ＣＮＳ)における酵素欠損を有する対象を処置するための、二機能性融合抗体を提供する。
【解決手段】（ａ）ヘキソサミニダーゼＡ(ＨＥＸＡ)および（ｂ）内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、融合抗体である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるヘキソサミニダーゼＡ(ＨＥＸＡ)欠損を処置する方法であって、ＨＥＸＡ活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＨＥＸＡおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項2】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

融合抗体がＧ_Ｍ２ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位／Kg体重を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項21】

融合抗体がＧ_Ｍ２ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位のＨＥＸＡ活性／Kg体重を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２０に記載の方法。

【請求項27】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項２０に記載の方法。

【請求項28】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２０に記載の方法。

【請求項29】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２０に記載の方法。

【請求項30】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２０に記載の方法。

【請求項31】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項32】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。

【請求項33】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。

【請求項34】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。

【請求項35】

中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、請求項２０に記載の方法。

【請求項36】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項37】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

融合抗体がＧ_Ｍ２ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位のＨＥＸＡ活性／Kg体重を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項41】

融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項３６に記載の方法。

【請求項44】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項３６に記載の方法。

【請求項45】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項３６に記載の方法。

【請求項46】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項47】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項３６に記載の方法。

【請求項48】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項49】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。

【請求項50】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。

【請求項51】

融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。

【請求項52】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項３６に記載の方法。

【請求項53】

中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、請求項３６に記載の方法。

【請求項54】

ＨＥＸＡが配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項55】

(ａ)ＨＥＸＡおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。

【請求項56】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項57】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項58】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項59】

該融合抗体がＧ_Ｍ２ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項60】

該融合タンパク質がＨＥＸＡのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項61】

リンカーが配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項62】

融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項63】

ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項64】

ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項65】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項66】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項67】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項68】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項69】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項70】

該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項71】

該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項72】

該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。

【請求項73】

治療有効量の請求項５５に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。

【請求項74】

請求項５５に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項75】

単離ポリヌクレオチドが配列番号１４の核酸配列を含む、請求項７４に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項76】

請求項７４に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項77】

配列番号１４の核酸配列を含む、請求項７６に記載のベクター。

【請求項78】

請求項７６に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項79】

宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。

【請求項80】

配列番号１０と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。

【請求項81】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも８５％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項82】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９０％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項83】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９５％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項84】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９６％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項85】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９７％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項86】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９８％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項87】

アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９９％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項88】

アミノ酸配列が８０を含む、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。

【請求項89】

配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５を含む、単離ポリペプチド。

【請求項90】

処置を必要とする対象の中枢神経系における酸スフィンゴミエリナーゼ(ＡＳＭ)欠損を処置する方法であって、ＡＳＭ活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＡＳＭおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項91】

ＡＳＭのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、請求項９０に記載の方法。

【請求項93】

ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項９０に記載の方法。

【請求項94】

融合抗体がスフィンゴミエリンのセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、請求項９０に記載の方法。

【請求項95】

ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項９０に記載の方法。

【請求項96】

ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項９０に記載の方法。

【請求項97】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、請求項９０に記載の方法。

【請求項98】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項99】

融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、請求項９０に記載の方法。

【請求項100】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項９０に記載の方法。

【請求項101】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項９０に記載の方法。

【請求項102】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項103】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項９０に記載の方法。

【請求項104】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項105】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項９０に記載の方法。

【請求項106】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項９０に記載の方法。

【請求項107】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項９０に記載の方法。

【請求項108】

中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、請求項９０に記載の方法。

【請求項109】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項110】

融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、請求項１０９に記載の方法。

【請求項112】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項113】

融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項１０９に記載の方法。

【請求項114】

ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項115】

ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項116】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項117】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項118】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項119】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項120】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項121】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項122】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項123】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項124】

中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項125】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項126】

ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項128】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、請求項１２５に記載の方法。

【請求項129】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項130】

融合抗体のＡＳＭ比活性が約１００ミリ単位／mgである、請求項１２５に記載の方法。

【請求項131】

ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項132】

ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項133】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項134】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項135】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項136】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項137】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項138】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項139】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項140】

融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項141】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項142】

中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項143】

ＡＳＭが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項144】

(ａ)ＡＳＭおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。

【請求項145】

ＡＳＭのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項146】

ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項147】

ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項148】

該融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項149】

該融合タンパク質がＡＳＭのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項150】

リンカーが配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項151】

融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項152】

ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項153】

ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項154】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項155】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項156】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項157】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項158】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項159】

該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項160】

該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項161】

該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１４４に記載の融合抗体。

【請求項162】

治療有効量の請求項１４４に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。

【請求項163】

請求項１４４に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項164】

単離ポリヌクレオチドが配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１６３に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項165】

請求項１６３に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項166】

配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１６５に記載のベクター。

【請求項167】

請求項１６４に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項168】

宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、請求項１６７に記載の宿主細胞。

【請求項169】

配列番号１８と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。

【請求項170】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも８５％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項171】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９０％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項172】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９５％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項173】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９６％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項174】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９７％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項175】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９８％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項176】

アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９９％同一である、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項177】

アミノ酸配列が１６９を含む、請求項１６９に記載の単離ポリペプチド。

【請求項178】

配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５を含む、単離ポリペプチド。

【請求項179】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１型(ＰＰＴ１)欠損を処置する方法であって、ＰＰＴ１活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＰＰＴ１および(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項180】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項１７９に記載の方法。

【請求項181】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、請求項１７９に記載の方法。

【請求項182】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１７９に記載の方法。

【請求項183】

融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項１７９に記載の方法。

【請求項184】

ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１７９に記載の方法。

【請求項185】

ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１７９に記載の方法。

【請求項186】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、請求項１７９に記載の方法。

【請求項187】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項１７９に記載の方法。

【請求項188】

融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、請求項１７９に記載の方法。

【請求項189】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項190】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項191】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１７９に記載の方法。

【請求項192】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項193】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１７９に記載の方法。

【請求項194】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１７９に記載の方法。

【請求項195】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１７９に記載の方法。

【請求項196】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項197】

中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がＮＣＬ１バッテン病である、請求項１７９に記載の方法。

【請求項198】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み；ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項199】

融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項200】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１.５μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、請求項１９８に記載の方法。

【請求項201】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項１９８に記載の方法。

【請求項202】

融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項１９８に記載の方法。

【請求項203】

ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項204】

ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項205】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項206】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項207】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項208】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項209】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項１９８に記載の方法。

【請求項210】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項211】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項212】

融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項１９８に記載の方法。

【請求項213】

中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がＮＣＬ１バッテン病である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項214】

処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み；ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。

【請求項215】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２１４に記載の方法。

【請求項216】

融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項217】

５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約５０μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、請求項２１４に記載の方法。

【請求項218】

治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項２１４に記載の方法。

【請求項219】

融合抗体のＰＰＴ１比活性が約１００ミリ単位／mgである、請求項２１４に記載の方法。

【請求項220】

ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項221】

ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離立した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項222】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項223】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項224】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２１４に記載の方法。

【請求項225】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項226】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２１４に記載の方法。

【請求項227】

融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項228】

融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項229】

融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。

【請求項230】

全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項231】

中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がニーマン・ピック病である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項232】

ＰＰＴ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２１４に記載の方法。

【請求項233】

(ａ)ＰＰＴ１および(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。

【請求項234】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項235】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項236】

ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項237】

該融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項238】

該融合タンパク質がＰＰＴ１のアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項239】

リンカーが配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項240】

融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項241】

ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項242】

ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項243】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項244】

免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項245】

免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項246】

免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項247】

免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項248】

該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項249】

該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項250】

該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。

【請求項251】

治療有効量の請求項２３３に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。

【請求項252】

請求項２３３に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項253】

単離ポリヌクレオチドが配列番号２５の核酸配列を含む、請求項２５２に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項254】

請求項２５２に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項255】

配列番号２５の核酸配列を含む、請求項２５４に記載のベクター。

【請求項256】

請求項２５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項257】

宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、請求項２５６に記載の宿主細胞。

【請求項258】

配列番号２３と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。

【請求項259】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも８５％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項260】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９０％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項261】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９５％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項262】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９６％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項263】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９７％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項264】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９８％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項265】

アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９９％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項266】

アミノ酸配列が配列番号２３を含む、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。

【請求項267】

配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２を含む、単離ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月７日出願の米国仮特許出願６２／７１５,６９３、２０１８年８月７日出願の米国仮特許出願６２／７１５,６９６および２０１８年８月７日出願の米国仮特許出願６２／７１５,６９７の利益を請求する。35 U.S.C. § 119に従い、優先権を主張する。上記特許出願は、本明細書に全文が示されているように、引用により本明細書に包含させる。

【0002】

配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出した配列表を含み、引用により全体として本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは２０１９年８月３日に作成し、「28570_717601_Sequence_Listing.txt」なる名称であり、サイズは２２,９８９バイトである。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
リソソーム蓄積症は、リソソーム酵素をコードする遺伝子の変異により引き起こされる。脳を含む臓器における酵素活性の喪失が、細胞における封入体の蓄積をもたらし、これにより細胞機能不全に至り、脳において、このような細胞機能不全は精神遅滞、痙攣発作、盲目および運動障害に至る壊滅的影響を有し得る。テイ・サックス病は、ＴＳＤとも称され、中枢神経系(ＣＮＳ)に主に影響する遺伝性代謝疾患である。ＴＳＤは、リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼＡまたはＨＥＸＡをコードする遺伝子の変異が原因である。ＨＥＸＡは、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニド部分における末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基を加水分解する。ＨＥＸＡ酵素は、唯一、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドからＮ－アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃ)残基を除去することにより、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドをＧ_Ｍ３ガングリオシドに加水分解できる。不十分なＨＥＸＡ酵素レベルは、例えば、末梢組織およびＣＮＳにおける、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドの病的増大を引き起こす。テイ・サックスは脳変性および盲目を引き起こす。患者はまた四肢の弛緩および痙攣発作も経験する。これらの神経障害のため、テイ・サックスを有して生まれた小児は、通常嚥下性肺炎により２～４歳で死亡する。現時点で、テイ・サックス病の治癒または有効な処置はない。ニーマン・ピック病は、ＮＰＤとも称され、中枢神経系(ＣＮＳ)に主に影響する遺伝性代謝疾患である。ＮＰＤ Ａ型(ＮＰＡ)およびＮＰＤ Ｂ型(ＮＰＢ)は、リソソーム酵素である酸スフィンゴミエリナーゼまたはＡＳＭをコードする遺伝子の変異が原因である。ＡＳＭは、スフィンゴミエリン(ＳＰＭ)を加水分解して、セラミドおよびホスホコリンを産生する。不十分なレベルのＡＳＭ酵素は、例えば、末梢組織およびＣＮＳにおける、ＳＰＭの病的増大を引き起こす。ＮＰＡは、本疾患のより重度なタイプであり、患者は重度ＣＮＳ合併症を有し、約３歳で死亡する。ＮＰＢのＣＮＳ疾患は少なく、死亡は青年期または成人早期に起こる。現時点で、ＮＰＡ／ＮＰＢの治癒または有効な処置はない。小児バッテン病は、神経セロイドリポフスチン沈着症１型(ＮＣＬ１)またはセロイドリポフスチン沈着症、神経１型(ＣＬＮ１)とも称され、中枢神経系(ＣＮＳ)および体性臓器に主に影響する遺伝性代謝疾患である。小児バッテン病は、リソソーム酵素であるパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１型またはＰＰＴ１をコードするＣＬＮ１遺伝子の変異が原因である。ＰＰＴ１は、細胞タンパク質の長鎖脂肪酸アシルコンジュゲートのチオエステル結合を加水分解して、細胞タンパク質のシステイン残基のチオール部分から脂肪酸を遊離させる。バッテン病群は最も一般的な小児遺伝性疾患であり、小児バッテン病は６～２４か月で現れる。乳児のこの神経変性疾患は、進行性運動喪失、盲目、痙攣発作および精神遅滞と関連する。不十分なレベルのＰＰＴ１酵素は、リポフスチンと称される自己蛍光顆粒の病的蓄積に至り、これは、大部分の神経細胞の細胞質における脂質溶媒に耐性である。ＮＣＬ１を有する小児は、一般に９～１３歳で死亡する。現時点で、ＮＣＬ１の治癒または有効な処置はない。一般に、ＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１などのリソソーム蓄積障害の処置は、一般に患者の欠損酵素を置き換えるまたは代理となる組み換え酵素の導入を含む、静脈内酵素置換療法またはＥＲＴを含むであろう。しかしながら、全身的に投与された組み換え酵素は血液脳関門(ＢＢＢ)を通過せず、それ故にＣＮＳにおけるＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１にほとんど影響を与えない。この理由のため、ＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１などの疾患にＥＲＴは承認されていない。

【発明の概要】

【0004】

発明の要約
ここに記載されるのは、ヘキソサミニダーゼＡ(「ＨＥＸＡ」)、酸スフィンゴミエリナーゼ(「ＡＳＭ」)またはパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１(「ＰＰＴ１」)の欠損を有する対象を処置するための方法および組成物である。ある実施態様において、ここに提供する方法は、治療有効量の二機能性融合抗体またはタンパク質の全身的投与による、ＣＮＳへのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１の送達を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、内在性血液脳関門(ＢＢＢ)受容体およびＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１に対する抗体のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、酵素に遺伝子的に融合したヒトインスリン抗体(ＨＩＲ Ａｂ)(「ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体」または「ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体」または「ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体」)である。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体またはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体は、図１に記載するとおり、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素活性を維持しながら、血液脳関門(「ＢＢＢ」)を通ってＣＮＳに輸送される。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂは、ＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、分子トロイの木馬として作用して、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１を脳に運ぶ。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。

【0005】

一つの態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１のアミノ酸配列および免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体(例えば、ヒトインスリン受容体)の細胞外ドメインに結合し、Ｇ_Ｍ２ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはタンパク質脂肪酸アシルコンジュゲートの分解を触媒する。ある実施態様において、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素は、各シグナルペプチドを伴わず、配列番号９、配列番号１７または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列をコードする対応するヌクレオチド配列は、それぞれＨＥＸＡ、ＡＳＭおよびＰＰＴ１について、配列番号１１、配列番号１９および配列番号２４に示す。

【0006】

ある実施態様において、ＨＥＸＡ、ＰＰＴ１またはＡＳＭは、分離した存在としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持する。ある実施態様において、ＨＥＸＡ、ＰＰＴ１またはＡＳＭおよび免疫グロブリンは、各々、分離した存在としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持する。

【0007】

ある実施態様において、少なくとも約６００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約９００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１２００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約２０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約４０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約５０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約８０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１０,０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３０μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１０μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。

【0008】

ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１５００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２２５０μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約３０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約５０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１０,０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１５,０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２０,０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２５,０００μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５０μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２５０μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２５μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７.５μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素が脳に送達される。

【0009】

ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.５mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.６mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.７mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.８mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.９mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約３mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約６mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１０mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約５０mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.４mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.３mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.２mg／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.１mg／Kg体重を含む。

【0010】

ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約６単位／Kg体重を含み、ここで、１単位のＨＥＸＡ酵素活性は、蛍光定量的酵素アッセイで１分あたり１μmolの４－メチルウンベリフェロン(ＭＵ)を形成する(図１３～１４)；または１単位のＡＳＭ酵素活性は、蛍光定量的酵素アッセイで１分あたり１μmolの６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェロン(ＨＭＵ)を形成する(図２３)または１単位のＰＰＴ１酵素活性は、蛍光定量的酵素アッセイで１分あたり１μmolの４－メチルウンベリフェリル６－チオ－パルミテート－β－Ｄ－グルコピラノシド(Ｍｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ)を形成する(図３３)。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約７単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約８単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約９単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１０単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約３０単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１００単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１５０単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約３００単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１０００単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約５単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約４単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約３単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約１単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.３単位／Kg体重を含む。ある実施態様において、融合抗体の治療有効用量は、少なくとも約０.１単位／Kg体重を含む。

【0011】

ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも０.１単位／mgタンパク質である。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも０.３単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも０.６単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも１単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも２.５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも７.５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも１０単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも３０単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１比活性は、少なくとも５０単位／mgである。

【0012】

ある実施態様において、全身投与は非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である。

【0013】

ある実施態様において、融合抗体はキメラ抗体である。ある実施態様において、融合抗体はヒト化抗体である。

【0014】

ある実施態様において、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である。ある実施態様において、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１の免疫グロブリン重鎖である。

【0015】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、４つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、６つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または３つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで、単一アミノ酸変異は置換、欠失または挿入である。

【0016】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖(図５、配列番号７)は、１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２および１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ配列は図７に示される。

【0017】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ配列は図７に示される。

【0018】

ある実施態様において、免疫グロブリン軽鎖は、カッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である。

【0019】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖(図６、配列番号８)は３つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、５つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または５つまでの単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、ここで、単一アミノ酸変異は置換、欠失または挿入である。

【0020】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２および１つの単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。

【0021】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。

【0022】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含み、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む。

【0023】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９０％同一であり、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９０％同一である。

【0024】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７と少なくとも９５％同一であり、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８と少なくとも９５％同一である。

【0025】

ある実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号７を含み、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号８を含む。

【0026】

ある実施態様において、ＨＥＸＡは配列番号９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＥＸＡは、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＥＸＡは、配列番号９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＡＳＭは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＡＳＭは、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＡＳＭは、配列番号１７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＰＴ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＰＴ１は、配列番号２１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＰＴ１は、配列番号２１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0027】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも９０％同一であり；軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％同一であり；ＨＥＸＡのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９５％同一であるかまたは配列番号９を含み、ＡＳＭのアミノ酸配列は、配列番号１７と少なくとも９５％同一であるかまたは配列番号１７を含み、ＰＰＴ１のアミノ酸配列は、配列番号２１と少なくとも９５％同一であるかまたは配列番号２１を含む。

【0028】

他の実施態様において、融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は配列番号７を含み、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８を含み、そしてＨＥＸＡのアミノ酸配列は配列番号９を含むかまたはＡＳＭのアミノ酸配列は配列番号１７を含むかまたはＰＰＴ１のアミノ酸配列は配列番号２１を含む。

【0029】

ある実施態様において、ここに提供する融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより、ＢＢＢを通過する。ある実施態様において、融合抗体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する。ある実施態様において、融合抗体は、インスリン受容体に結合することにより、ＢＢＢを通過する。

【0030】

ある実施態様において、中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損は、テイ・サックス病またはＴＳＤである。ある実施態様において、中枢神経系におけるＡＳＭ欠損は、ニーマン・ピック病またはＮＰＤである。ある実施態様において、中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損は、神経セロイドリポフスチン沈着症１型疾患またはＮＣＬ１である。

【0031】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過する、方法である。ある実施態様において、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。

【0032】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒して、セラミドおよびホスホコリンを形成する。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、脂肪酸アシルタンパク質チオエステルコンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0033】

ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＨＥＸＡ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＡＳＭ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒してセラミドおよびホスホコリンを形成する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＰＰＴ１活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、脂肪酸アシルタンパク質チオエステルコンジュゲートの加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

【0034】

ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＨＥＸＡ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＨＥＸＡのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、ＨＥＸＡ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＨＥＸＡのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＡＳＭ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＡＳＭのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、ＡＳＭ活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＡＳＭのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒してセラミドおよびホスホコリンを形成する。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、ＰＰＴ１活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、ＰＰＴ１活性を有する融合抗体である。ある実施態様において、ＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、脂肪酸アシルタンパク質チオエステルコンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0035】

ある実施態様において、ここに提供される融合タンパク質は、ＨＥＸＡのアミノ酸配列と免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む。ある実施態様において、リンカーは、配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。ある実施態様において、ここに提供される融合タンパク質は、ＡＳＭのアミノ酸配列と免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む。ある実施態様において、リンカーは、配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。ある実施態様において、ここに提供される融合タンパク質は、ＰＰＴ１のアミノ酸配列と免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む。ある実施態様において、リンカーは、配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２または配列番号２２のアミノ酸４６２～４６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

【0036】

ある実施態様において、ここに提供されるのは、治療有効量のここに記載する融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。

【0037】

ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するＨＥＸＡ融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチドである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１４の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号１４の核酸配列を含むベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するベクターを含む、宿主細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＨＥＸＡのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＨＥＸＡのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するＡＳＭ融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチドである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２０の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号２０の核酸配列を含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するベクターを含む、宿主細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＡＳＭのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＡＳＭのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒して、セラミドおよびホスホコリンを形成する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するＰＰＴ１融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチドである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２５の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号２５の核酸配列を含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するベクターを含む、宿主細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、方法である。ある実施態様において、ＰＰＴ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0038】

ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＣＮＳにおける酵素欠損を有する対象を処置するための方法および組成物である。ある実施態様において、ここに提供する方法は、治療有効量の二機能性融合抗体またはタンパク質を全身的に投与することにより、テイ・サックス病(ＴＳＤ)で欠損している酵素をＣＮＳに送達することを含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、内在性血液脳関門(ＢＢＢ)受容体に対する抗体およびＴＳＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、酵素に遺伝子的に融合したヒトインスリン抗体(ＨＩＲ Ａｂ)である。ある実施態様において、融合抗体は、酵素活性を維持しながら、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＢＢＢを通って輸送される。ある実施態様において、融合抗体はＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、酵素を脳に運ぶための分子トロイの木馬として作用する。ある実施態様において、全身投与のための融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、ここに提供する方法は、治療有効量の二機能性融合抗体またはタンパク質を全身的に投与することにより、ニーマン・ピック病(ＮＰＤ)で欠損している酵素をＣＮＳに送達することを含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、内在性血液脳関門(ＢＢＢ)受容体に対する抗体およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、酵素に遺伝子的に融合したヒトインスリン抗体(ＨＩＲ Ａｂ)である。ある実施態様において、融合抗体は、酵素活性を維持しながら、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＢＢＢを通って輸送される。ある実施態様において、融合抗体はＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、酵素を脳に運ぶための分子トロイの木馬として作用する。ある実施態様において、全身投与のための融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、ここに提供する方法は、治療有効量の二機能性融合抗体またはタンパク質を全身的に投与することにより、神経セロイドリポフスチン沈着症１(ＮＣＬ１)で欠損している酵素をＣＮＳに送達することを含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、内在性血液脳関門(ＢＢＢ)受容体に対する抗体およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、酵素に遺伝子的に融合したヒトインスリン抗体(ＨＩＲ Ａｂ)である。ある実施態様において、融合抗体は、酵素活性を維持しながら、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＢＢＢを通って輸送される。ある実施態様において、融合抗体はＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、酵素を脳に運ぶための分子トロイの木馬として作用する。ある実施態様において、全身投与のための融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。

【0039】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、対象に、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列、ＴＳＤまたはＮＰＤにおける酵素治療剤のアミノ酸配列および免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を含む融合抗体の治療有効用量を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体(例えば、ヒトインスリン受容体)の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、対象に、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列、ＮＣＬ１における酵素治療剤のアミノ酸配列および免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含む融合抗体の治療有効用量を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体(例えば、ヒトインスリン受容体)の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される

【0040】

ある実施態様において、ＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１における酵素治療剤はリソソーム酵素である。

【0041】

ある実施態様において、ＴＳＤにおける酵素治療剤はヘキソサミニダーゼＡ(ＨＥＸＡ)であり、ＮＰＤにおける酵素治療剤は酸スフィンゴミエリナーゼ(ＡＳＭ)であり、ＮＣＬ１における酵素治療剤はパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１型(ＰＰＴ１)である。

【0042】

ある実施態様において、融合抗体は、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドにおけるＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドの末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンのセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合抗体は、脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0043】

ある実施態様において、酵素は、分離した存在としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持する。ある実施態様において、酵素および免疫グロブリンは、各々、分離した存在としてのその活性と比較して、その活性の少なくとも２０％を保持する。

【0044】

ある実施態様において、少なくとも約６００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約９００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１２００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約２０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約４０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約５０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約８０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１００００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３０μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１０μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約３μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、少なくとも約１μgの酵素が脳に送達される。

【0045】

ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１５００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２２５０μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約３０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約５０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１００００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１５０００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２００００μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５０μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２５０μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７５μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２５μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約７.５μgの酵素が脳に送達される。ある実施態様において、５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgの酵素が脳に送達される。

【0046】

ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも０.１単位／mgタンパク質である。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも０.３単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも０.６単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも２.５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも７.５単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも１０単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも３０単位／mgである。ある実施態様において、融合抗体の酵素比活性は少なくとも５０単位／mgである。

【0047】

ある実施態様において、中枢神経系における酵素欠損症はＴＳＤである。ある実施態様において、中枢神経系における酵素欠損症はＮＰＤである。ある実施態様において、中枢神経系における酵素欠損症はＰＰＴ１である。

【0048】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列およびＴＳＤで欠損している酵素を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過する、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過する、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過する、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。

【0049】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質；および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質；および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒して、セラミドおよびホスホコリンを形成する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質；および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体の治療有効用量を対象に全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

【0050】

ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ここに記載されるのは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドである。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒してセラミドおよびホスホコリンを形成する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、融合抗体は内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。ある実施態様において、ここに記載されるのは、配列番号１０もしくは配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５または配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２を含む、単離ポリペプチドである。

【0051】

ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＴＳＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＴＳＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒してセラミドおよびホスホコリンを形成する。ある態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む、融合抗体である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0052】

ある実施態様において、ここに提供される融合タンパク質は、酵素のアミノ酸配列と免疫グロブリン軽鎖または重鎖何れかのアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む。

【0053】

ある実施態様において、ここに提供されるのは、治療有効量のここに記載する融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。

【0054】

ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載する融合抗体をコードする単離ポリヌクレオチドである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１４の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号１４の核酸配列を含むベクターである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２０の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号２０の核酸配列を含むベクターである。ある実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２５の核酸配列を含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される単離ポリヌクレオチドを含む、ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号２５の核酸配列を含むベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するベクターを含む、宿主細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。

【0055】

ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、該対象に(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＴＳＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、該対象に(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＴＳＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、該対象に(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、該対象に(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＮＰＤで欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含む融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒してセラミドおよびホスホコリンを形成する。ある態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、該対象に(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象の中枢神経系における酵素欠損症を処置する方法であって、(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＮＣＬ１で欠損している酵素のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含む、方法である。ある実施態様において、酵素のアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに結合する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体はヒトインスリン受容体である。ある実施態様において、融合抗体は、内在性ＢＢＢ受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は、ヒトインスリン受容体受容体に結合する抗体である。ある実施態様において、融合抗体は脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒する。

【0056】

引用による取り込み
本明細書に記載するすべての刊行物、特許および特許出願を、各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に引用により本明細書に包含させると示したのと同程度に引用により全体として本明細書に包含させる。

【0057】

図面の簡単な説明
本実施態様の新規特徴を添付する特許請求の範囲に具体的に示す。本実施態様の特徴および利点のよりよい理解は、本実施態様の原則が利用される説明的実施態様を示す次の詳細な記載および次のとおりの添付する図面を参酌して得られる。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】融合抗体が分子トロイの木馬(ＴＨ)として作用する内在性ＢＢＢ受容体(Ｒ)の細胞外ドメインに対する抗体およびＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１、リソソーム酵素(Ｅ)を含む、「分子トロイの木馬」戦略の略図を示す。脳細胞に入ると、ＢＢＢの後ろで、脳細胞で、融合抗体のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１部分が、酵素特異的リソソーム蓄積基質(Ｓ)を代謝可能産物(Ｐ)に分解する。

【0059】

【図2】例示的ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体が成熟ＨＥＸＡのアミノ末端とＨＩＲ Ａｂの軽鎖のカルボキシル末端の、軽鎖の定常ドメイン(ＣＬ)とＨＥＸＡ酵素の間のアミノ酸リンカーを用いる融合により形成される。軽鎖(ＶＬ)および重鎖(ＶＨ)の可変領域が示される。重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが示される。

【0060】

【図3】ＥｃｏＲＩ、ＰｍｅＩおよびＰｖｕＩで消化したｐＵＣ５７－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡのアガロースゲル電気泳動。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ合成遺伝子(配列番号１０)は商業ベンダーにより合成され、ｐＵＣ５７クローニングベクターに入れられた。約２.３kb ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ改変ｃＤＮＡが放出され、ＥｃｏＲＩ－ＰｍｅＩによりｐＵＣ５７プラスミド骨格から分離され(レーン２、３複製)、アガロースゲル電気泳動により単離された。融合タンパク質ｃＤＮＡの単離を促すため、ｐＵＣ５７骨格ベクターをＰｖｕＩで消化させ、それはそれぞれ約１.７および１.３kbまでサイズを減少させた。レーン１はＤＮＡ標品である。

【0061】

【図4】ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ発現ベクターの遺伝子操作。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ軽鎖(ＬＣ)融合タンパク質発現ベクター、クローンｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡを、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ ｃＤＮＡの発現ベクターの同じエンドヌクレアーゼ部位に挿入することにより操作した。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ ｃＤＮＡは、３１アミノ酸リンカーを介して、シグナルペプチドのない５０７アミノ酸の成熟ＨＥＸＡ(配列番号９)のアミノ末端に融合した２３４アミノ酸のＨＩＲ Ａｂ ＬＣ(配列番号８)からなる融合タンパク質をコードする。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス；ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン；ＳＶ＝サルウイルス；ａｍｐ＝アンピシリン耐性；ｎｅｏ＝ネオマイシン；複製起点；ＤＨＦＲ＝ジヒドロ葉酸レダクターゼ；ＬＣ＝軽鎖；ＨＥＸＡ＝ヘキソサミニダーゼＡ

【0062】

【図5】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する例示的ヒトインスリン受容体抗体からの免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列可変領域。下線を引いた配列はそれぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。ヒトＩｇＧ１由来重鎖定常領域は斜体で示す。

【0063】

【図6】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する例示的ヒトインスリン受容体抗体からの免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列可変領域。下線を引いた配列はそれぞれシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３である。ヒトカッパ軽鎖由来定常領域は斜体で示す。

【0064】

【図7】ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに対する例示的ヒトインスリン受容体抗体の重鎖および軽鎖からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を示す表。

【0065】

【図8】２２アミノ酸酵素シグナルペプチドを含まないＨＥＸＡのアミノ酸配列(NP_000511)(成熟ＨＥＸＡ)。

【0066】

【図9】例示的ヒトインスリン受容体抗体軽鎖の成熟ヒトＨＥＸＡへの融合体のアミノ酸配列。下線を引いた配列は、順に、ＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および軽鎖のカルボキシ末端を成熟ＨＥＸＡのアミノ末端に結合する３１アミノ酸配列である。斜体の配列はヒトカッパ由来軽鎖定常領域に対応する。太字の配列はヒトＨＥＸＡに対応する。

【0067】

【図10】分子量標品(左側レーン)、ＨＩＲＭＡｂとして示す精製ＨＩＲ ＡｂおよびＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡとして示す精製ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ＨＩＲＭＡｂは５５kDa重鎖および２８kDa軽鎖により形成される。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質は５５kDa ＨＩＲ Ａｂ重鎖(ＨＣ)および軽鎖とＨＥＸＡの９５kDa融合体(ＬＣ－ＨＥＸＡ)から形成される。

【0068】

【図11】抗ヒトＩｇＧ一次抗体(左パネル)または抗ヒトＨＥＸＡ一次抗血清(右パネル)のウェスタンブロット。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の免疫反応性をキメラＨＩＲ Ａｂ(右パネル)と比較し、これらはそれぞれＨＩＲＭＡｂおよびＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡと示される。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂは、抗ＩｇＧウェスタンで同一重鎖を有する。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の融合軽鎖は抗ＩｇＧおよび抗ヒトＨＥＸＡ抗体両者と反応し、一方ＨＩＲＭＡｂ重鎖および軽鎖は抗ＩｇＧ抗体とのみ反応する。分子量(ＭＷ)標品ならびに免疫反応性重鎖および軽鎖の移動に基づき、ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の重鎖および軽鎖の推定ＭＷはそれぞれ５９kDaおよび９９kDaであり、これは、図２に示すヘテロ四量体融合タンパク質の３１６kDaのＭＷに対応する。

【0069】

【図12】キメラＨＩＲ Ａｂ(ＨＩＲＭＡｂと記載)またはＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ(ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡと記載)融合タンパク質のＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)への結合は飽和性である。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ結合のＥＤ_５０は１１２±１８ng／mLであり、これは、３１６kDaのＭＷに基づき、０.３５±０.０６nMである。これは、１５０kDaのＭＷに基づき０.２３±０.０２nMである３４±３ng／mLであるキメラＨＩＲＭＡｂの結合のＥＤ_５０と同等である。

【0070】

【図13】(Ａ)ＨＥＸＡ蛍光定量的酵素アッセイの中性基質４－メチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド(４ＭＵＧ)の構造をパネルＡに示す。ＨＥＸＡによる分子の開裂後、基質は蛍光生成物、４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に変換される。(Ｂ)２０分間の固定インキュベーション時間でのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の質量に関する４－ＭＵ生成物の直線的形成。

【0071】

【図14】(Ａ)ＨＥＸＡ蛍光定量的酵素アッセイのアニオン性基質、４－メチルウンベリフェリル－７－(６－スルホ－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド(４ＭＵＧＳ)の構造をパネルＡに示す。ＨＥＸＡによる分子の開裂後、基質は蛍光生成物、４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に変換される。(Ｂ)２０分間の固定インキュベーション時間でのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の質量に関する４－ＭＵ生成物の直線的形成。

【0072】

【図15】例示的ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体が成熟ＡＳＭのアミノ末端とＨＩＲ Ａｂの軽鎖のカルボキシル末端の、軽鎖の定常ドメイン(ＣＬ)とＡＳＭ酵素の間のアミノ酸リンカーを用いる融合により形成される。軽鎖(ＶＬ)および重鎖(ＶＨ)の可変領域が示される。重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが示される。

【0073】

【図16】ＥｃｏＲＩ、ＰｍｅＩおよびＰｖｕＩで消化したｐＵＣ５７－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭのアガロースゲル電気泳動。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ合成遺伝子(配列番号２０)は商業ベンダーにより合成され、ｐＵＣ５７クローニングベクターに入れられた。～２.５kb ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ改変ｃＤＮＡが放出され、ＥｃｏＲＩ－ＰｍｅＩによりｐＵＣ５７プラスミド骨格から分離され(レーン２～４複製)およびアガロースゲル電気泳動により単離された。融合タンパク質ｃＤＮＡの単離を促すため、ｐＵＣ５７骨格ベクターをＰｖｕＩで消化させ、それはそれぞれ約１.７および１.３kbまでサイズを減少させた。レーン１はＤＮＡ標品である。

【0074】

【図17】ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ発現ベクターの遺伝子操作。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ軽鎖(ＬＣ)融合タンパク質発現ベクター、クローンｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭを、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ ｃＤＮＡの発現ベクターの同じエンドヌクレアーゼ部位に挿入することにより操作した。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ ｃＤＮＡは、３１アミノ酸リンカーを介して、シグナルペプチドのない５６７アミノ酸の成熟ＡＳＭ(配列番号１７)のアミノ末端に融合した２３４アミノ酸のＨＩＲ Ａｂ ＬＣ(配列番号８)からなる融合タンパク質をコードする。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス；ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン；ＳＶ＝サルウイルス；ａｍｐ＝アンピシリン耐性；ｎｅｏ＝ネオマイシン；複製起点；ＤＨＦＲ＝ジヒドロ葉酸レダクターゼ；ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖；ＡＳＭ＝酸スフィンゴミエリナーゼ。

【0075】

【図18】４６アミノ酸酵素シグナルペプチドおよび１５アミノ酸プロペプチドを含まないＡＳＭのアミノ酸配列(NP_000534)(成熟ＡＳＭ)。

【0076】

【図19】例示的ヒトインスリン受容体抗体軽鎖の成熟ヒトＡＳＭへの融合体のアミノ酸配列。下線を引いた配列は、順に、ＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および軽鎖のカルボキシ末端を成熟ＡＳＭのアミノ末端に結合する３１アミノ酸配列である。斜体の配列はヒトカッパ由来軽鎖定常領域に対応する。太字の配列は、４６アミノ酸シグナルペプチドおよび１５アミノ酸プロペプチドがないヒトＡＳＭに対応する。

【0077】

【図20】分子量(ＭＷ)標品(レーン１、５および６)、精製ＨＩＲ Ａｂ(レーン２)および精製ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質(レーン３)およびウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)標品(レーン４)の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ＨＩＲ Ａｂは５５kDa重鎖(ＨＣ)および２８kDa軽鎖(ＬＣ)により形成される。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質は５５kDa ＨＩＲ Ａｂ重鎖(ＨＣ)およびＨＩＲ Ａｂ軽鎖とＡＳＭ１０５kDa融合体(ＬＣ－ＡＳＭ)により形成される。kDa＝キロダルトン；ＬＭＷ＝低ＭＷ；ＨＭＷ＝高ＭＷ。

【0078】

【図21】抗ヒトＩｇＧ一次抗体(Ａ)または抗ヒトＡＳＭ一次抗血清(Ｂ)のウェスタンブロット。ＨＩＲＭＡｂ－ＡＳＭ融合タンパク質(レーン３)の免疫反応性を、ＨＩＲ Ａｂ(レーン２)の免疫反応性と比較する。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質およびＨＩＲ Ａｂ両者は、抗ＩｇＧウェスタンで同一重鎖を有する。軽鎖とＡＳＭの融合タンパク質は抗ＩｇＧおよび抗ヒトＡＳＭ抗体両者と反応し、一方ＨＩＲ Ａｂ重鎖および軽鎖は抗ＩｇＧ抗体とのみ反応する。分子量(ＭＷ)標品ならびに免疫反応性重鎖および軽鎖の移動に基づき、ＨＩＲＭＡｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の重鎖および融合軽鎖の推定ＭＷはそれぞれ５５kDaおよび１０５kDaであり、これは図１５に示すヘテロ四量体融合タンパク質の３２０kDaのＭＷに対応する。

【0079】

【図22】キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質のＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)への結合は飽和性である。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ結合のＥＤ_５０は２９９±４０ng／mLであり、これは、３２０kDaのＭＷに基づき０.９３±０.１２nMである。これは、１５０kDaのＭＷに基づき０.３２±０.０１nMである４７±２ng／mLであるキメラＨＩＲ Ａｂの結合のＥＤ_５０と同等である。

【0080】

【図23】(Ａ)ＡＳＭ蛍光定量的酵素アッセイの基質、６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリルホスホリルコリン(ＨＭＵ－ＰＣ)の構造をパネルＡに示す。ＡＳＭによる分子の開裂後、基質は蛍光生成物、６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェロン(ＨＭＵ)に変換される。(Ｂ)６０分間の固定インキュベーション時間でのＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質(ng)の質量に関するＨＭＵ生成物の直線的形成(インキュベーション１分間あたりに形成されるＨＭＵのnmolとして表す)。

【0081】

【図24】例示的ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体が成熟ＰＰＴ１のアミノ末端とＨＩＲ Ａｂの重鎖のカルボキシル末端の重鎖の定常ドメイン(ＣＬ)とＰＰＴ１酵素の間のアミノ酸リンカーを用いる融合により形成される。軽鎖(ＶＬ)および重鎖(ＶＨ)の可変領域が示される。重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインおよび軽鎖の定常ドメイン(ＣＬ)が示される。

【0082】

【図25】ＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＵＣ５７－ヒトＰＰＴ１(シグナルペプチドがない)のアガロースゲル電気泳動。ヒトＰＰＴ１合成遺伝子(配列番号２４)は商業ベンダーにより合成され、ｐＵＣ５７クローニングベクターに入れられた。ヒトＰＰＴ１ ｃＤＮＡはそれぞれＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接する。約０.９kb ヒトＰＰＴ１改変ｃＤＮＡが放出され、約３.０kb ｐＵＣ５７プラスミド骨格からＳｔｕＩ－ＨｉｎｄIII消化(レーン２～４は複製)から分離され、アガロースゲル電気泳動により単離された。レーン１はＤＮＡ標品である。

【0083】

【図26】ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ－ＰＰＴ１発現ベクターの遺伝子操作。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１重鎖(ＨＣ)融合タンパク質発現ベクター、クローンｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣ－ＰＰＴ１を、ｐＵＣ５７－ヒトＰＰＴ１をＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動により単離して得たヒトＰＰＴ１(シグナルペプチドがない)ｃＤＮＡ(図２５)を、名称ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣの発現ベクターのＨｐａＩ－ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することにより操作した。後者は４アミノ酸リンカー、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒまたは３１アミノ酸リンカー(SSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSS)、続いてＨｐａＩ部位を含む。ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ－ＰＰＴ１ ｃＤＮＡは、４アミノ酸または３１アミノ酸リンカーを介して、シグナルペプチド(配列番号２１)がない２７９アミノ酸の成熟ＰＰＴ１のアミノ末端に融合したＨＩＲ Ａｂ ＨＣの１～４６１アミノ酸(配列番号７)からなる融合タンパク質をコードする。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス；ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン；ＳＶ＝サルウイルス；ａｍｐ＝アンピシリン耐性；ｎｅｏ＝ネオマイシン；複製起点；ＤＨＦＲ＝ジヒドロ葉酸レダクターゼ；ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖；ＰＰＴ１＝パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ。

【0084】

【図27】２７アミノ酸酵素シグナルペプチドを含まないＰＰＴ１のアミノ酸配列(NP_000301)。

【0085】

【図28】例示的ヒトインスリン受容体抗体重鎖の成熟ヒトＰＰＴ１への融合体のアミノ酸配列。下線を引いた配列は、順に、ＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および重鎖のカルボキシ末端を成熟ＰＰＴ１のアミノ末端に結合する４アミノ酸配列である。斜体の配列はヒトＩｇＧ１由来重鎖定常領域に対応する。太字の配列は、酵素の２７アミノ酸シグナルペプチドがないヒトＰＰＴ１に対応する。

【0086】

【図29】例示的ヒトインスリン受容体抗体重鎖の成熟ヒトＰＰＴ１への融合体のアミノ酸配列。下線を引いた配列は、順に、ＩｇＧシグナルペプチド、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および重鎖のカルボキシ末端を成熟ＰＰＴ１のアミノ末端に結合する３１アミノ酸配列である。斜体の配列はヒトＩｇＧ１由来重鎖定常領域に対応する。太字の配列は、酵素の２７アミノ酸シグナルペプチドがないヒトＰＰＴ１に対応する。

【0087】

【図30】分子量(ＭＷ)標品、精製ＨＩＲ Ａｂ(レーン１)および精製ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質(レーン２)の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【0088】

【図31】抗ヒトＩｇＧ一次抗体(Ａ)または抗ヒトＰＰＴ１一次抗体(Ｂ)のウェスタンブロット。パネルＡにおいて、抗ヒトＩｇＧ一次抗体に対する免疫反応性をＨＩＲ Ａｂ(レーン１)およびＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質(レーン２)で比較する。パネルＢにおいて、抗ヒトＰＰＴ１一次抗体に対する免疫反応性をＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質(レーン１)について示す。パネルＡは、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質およびＨＩＲ Ａｂが抗ＩｇＧウェスタンで同一軽鎖を有することを示す。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の融合重鎖は抗ＩｇＧ(レーン２、パネルＡ)および抗ヒトＰＰＴ１抗体(レーン１、パネルＢ)両者と反応する。分子量(ＭＷ)標品の相対的移動に基づき、ＨＩＲ Ａｂは５４kDa重鎖(ＨＣ)および２４kDa軽鎖(ＬＣ)により形成される。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質は２４kDa ＨＩＲ Ａｂ軽鎖(ＨＣ)および ＨＩＲ Ａｂ重鎖、成熟ＰＰＴ１およびＰＰＴ１をＨＩＲ Ａｂ重鎖のＣ末端に結合する３１アミノ酸リンカーの９９kDa融合タンパク質からなる。

【0089】

【図32】キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)への結合は飽和性である。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１結合のＥＤ_５０は９４±２８ng／mLであり、これは、２４６kDaのＭＷに基づき０.３８±０.１１nMである。これは、１５０kDaのＭＷに基づき０.２６±０.０４nMである３９±６ng／mLのキメラＨＩＲ Ａｂの結合のＥＤ_５０と同等である。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質は、ＨＩＲ Ａｂ重鎖のＣ末端と成熟ＰＰＴ１のＮ末端の間に３１アミノ酸リンカーを含む。

【0090】

【図33】(Ａ)ＰＰＴ１蛍光定量的酵素アッセイの基質、４－メチルウンベリフェリル６－チオ－パルミテート－β－Ｄ－グルコピラノシド(Ｍｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ)の構造をパネルＡに示す。ＰＰＴ１による分子の開裂後、基質は蛍光生成物、４－メチルウンベリフェロン(ＭＵ)に変換される。(Ｂ)６０分間の固定インキュベーション時間でのＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の質量に関するＭＵ生成物の直線的形成。４アミノ酸または３１アミノ酸リンカーを有するＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１のＰＰＴ１酵素活性は同等である。

【発明を実施するための形態】

【0091】

発明の詳細な記載
血液脳関門(ＢＢＢ)は、中枢神経系に全身的に投与されたリソソーム酵素(例えば、組み換えＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)を送達する際の厄介な障壁である。ここに記載する方法および組成物は、ＨＥＸＡなどのＴＳＤで欠損している酵素またはＡＳＭなどのＮＰＤで欠損している酵素またはＰＰＴ１などのＮＣＬ１で欠損している酵素を、治療に意義のあるレベルでＢＢＢを通過してＣＮＳに送達するために重要な因子を検討する：１)内在性ＢＢＢトランスポーター上での輸送を経てＢＢＢを通過させるためのＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１で欠損している酵素の修飾；２)ＢＢＢ輸送を生じさせるのに必要な修飾後の酵素活性の保持に基づく、全身的に投与された修飾酵素のＣＮＳへの取り込み量および速度。ここに記載する方法および組成物の種々の態様は、(１)介在配列を伴いまたは伴わずに内在性ＢＢＢ受容体の細胞外ドメインに対する免疫グロブリン(重鎖または軽鎖)に融合した酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１活性を有するタンパク質)を含む融合抗体を提供し；そして(２)ＣＮＳにおける取り込みおよび比活性に基づき融合抗体の治療有効全身用量を確立することにより、これらの因子を検討する。ある実施態様において、内在性ＢＢＢ受容体に対する抗体は、ヒトインスリン受容体に対する抗体(ＨＩＲ Ａｂ)である。

【0092】

したがって、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象に酵素活性を有し、ヒトインスリン受容体などの内在性ＢＢＢ受容体トランスポーターの細胞外ドメインに選択的に結合する二機能性ＢＢＢ受容体Ａｂ－酵素融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することによる、中枢神経系における酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)欠損を処置するための組成物および方法である。

【0093】

一部定義
ここで使用する「処置」または「処置する」は、治療的利益および／または予防的利益の達成を含む。治療的利益は、処置される根底の障害または状態の根絶または改善を意味する。例えば、ＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１を有する個体において、治療的は、障害の進行の部分的または完全な停止または障害の部分的または完全な回復を意味する。また、治療的利益は、患者で改善が観察されるように、根底の状態と関連する１以上の生理学的または心理学的症状の根絶または改善により、患者がなお該状態に罹患し得る事実とは関係なく、達成される。処置の予防的利益は、状態の阻止、状態の進行遅延(例えば、リソソーム蓄積障害の進行の減速)または状態が発症する可能性の減少を含む。ここで使用する「処置する」または「処置」は予防を含む。

【0094】

ここで使用する用語「有効量」は、全身的に投与したとき、有益なまたは所望の臨床的結果または認知、記憶および気分の改善または他の所望のＣＮＳ結果などの有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分である量であり得る。有効量はまた予防効果を生じる量、例えば、病的なまたは望まない状態の出現を遅延、低減または排除する量でもある。このような状態は、精神遅滞、聴力損失および神経変性を含むが、これらに限定されない。有効量は１以上の投与で達成され得る。処置に関して、ここに提供される組成物の「有効量」は、障害、例えば、神経学障害の進行を軽減、寛解、安定化、逆転または減速させるのに十分な量である。「有効量」は、単独でまたは疾患または障害の処置に使用される１以上の薬剤と組み合わせて使用されるここに提供する組成物の何れかによるものであり得る。本実施態様の範囲内の治療剤の「有効量」は、患者の処置医または獣医師により決定される。このような量は当業者により容易に確認され、本実施態様により投与したときの治療効果である。治療有効量であるかに影響する因子は、投与した融合抗体の酵素比活性、その吸収プロファイル(例えば、その脳への取り込み速度)、障害が始まってからの経過時間ならびに処置される個体の年齢、身体状態、他の疾患状態の存在および栄養状態を含む。さらに、患者が受けるかもしれない他の投薬は、投与する治療剤の治療有効量の決定に影響する。

【0095】

ここで使用する「約」ある値は、該ある値の±１０％と定義される。例えば、用語「約－２０℃」は－２２℃～－１８℃の範囲を意味する。他の例として、「約１時間」は５４分間～６６分間の範囲を意味する。

【0096】

ここで使用する不定冠詞「ある」は、特に断らない限り「少なくとも１つ」を意味する。同様に、定冠詞「該」は、特に断らない限り、文脈がオープンエンドであることを可能とするか必要とするとき、「少なくとも該」を意味する。ここで使用する用語「または」は、非排他的であることをいうために使用するかまたは、例えば「ＡまたはＢ」は、特に断らない限り「Ａを含むがＢは含まない」、「Ｂを含むがＡを含まない」および「ＡおよびＢを含む」。ここで使用する単数表現は、明示的にかつ明白に一つのものに限定されない限り、複数を含む。ここで使用する用語「または」は、特に断らない限り「および／または」を意味する。ここで使用する用語「実質的に」は、特に断らない限り、該用語により修飾される値の３０％を超えないまたは下回らない値をいう。例えば、用語「実質的に－２０℃」は－２６℃～－１４℃の範囲を意味する。

【0097】

ここで使用する「対象」または「個体」は動物、例えば、哺乳動物である。ある実施態様において、「対象」または「個体」はヒトである。ある実施態様において、対象はＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１を有する。

【0098】

ある実施態様において、融合抗体を含む薬理学的組成物は、「末梢性に投与される」または「末梢投与される」。ここで使用するこれらの用語は、ＣＮＳへの直接投与ではない、例えば、薬剤を血液－脳関門の非脳側と接触させる、薬剤、例えば、治療剤の個体への投与の何らかの形態をいう。ここで使用する「末梢投与」は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、経頬、鼻腔内、直腸、経口、非経腸、舌下または経鼻を含む。

【0099】

ここでの「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される添加物」は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発しない、あらゆる担体をいう。このような担体は当業者に周知である。薬学的に許容される担体／添加物の徹底的な記載は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USAに見ることができる。薬学的に許容される担体の例は、塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。例えば、ここに記載する組成物は液体形態で提供でき、０.０１～１％でのポリソルベート－８０などの界面活性剤またはマンニトール、ソルビトールもしくはトレハロースなどの炭水化物添加物を伴うまたは伴わない、種々のｐＨ(５～８)の食塩水ベースの水溶液に製剤される。一般に使用される緩衝液はヒスチジン、酢酸、リン酸またはクエン酸を含む。点滴溶液は０～１０％デキストロースを含み得る。

【0100】

「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に使用した方法、例えば、直接取り込み、形質導入、f-matingまたは組み換え宿主細胞を作るために当分野で知られる他の方法の如何にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞をいう。外因性ポリヌクレオチドは、統合されていないベクター、例えば、プラスミドとして維持されるかまたはそれらとは異なって、宿主ゲノムに統合され得る。

【0101】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうためにここで相互交換可能に使用される。すなわち、ポリペプチドの記載はペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、その逆もまた同じである。本用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび１以上のアミノ酸残基が天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、例えば、アミノ酸アナログに適用される。ここで使用する用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により結合している、完全長タンパク質(例えば、抗原)を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖に適用される。

【0102】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然にコードされるアミノ酸は、２０の通常のアミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン)およびピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸に類似する基本化学構造を有する化合物をいい、すなわち、このようなアミノ酸アナログの基本化学構造は、一般に水素、カルボキシル基、アミノ基および、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合したα炭素を含む。このようなアナログは、修飾Ｒ基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。

【0103】

アミノ酸は、本明細書では一般に知られる３文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号で記載し得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般に受け入れられている一文字コードで記載し得る。

【0104】

用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸に類似する結合性質を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。他に限定されない限り、本用語はまたＰＮＡ(ペプチド核酸)、アンチセンステクノロジーで使用されるＤＮＡのアナログ(ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど)を含む、オリゴヌクレオチドアナログもいう。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた暗示的にその保存的修飾されたバリアント(縮重コドン置換を含むが、これに限定されない)および相補的配列ならびに明示的に示される配列を含む。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびCassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。

【0105】

用語「単離」および「精製」は、その天然環境から実質的にまたは本質的に取り出されたまたは濃縮された物質をいう。例えば、単離核酸は、通常隣接する核酸またはサンプルにおける他の核酸もしくは成分(タンパク質、脂質など)から離されたものであり得る。他の例では、ポリペプチドは、その天然環境から実質的に取り出されてまたは濃縮されているならば、精製されている。核酸およびタンパク質を精製および単離する方法は当分野で周知である。

【0106】

血液脳関門
ある態様において、ここに提供されるのは、内在性ＢＢＢ受容体／トランスポーター上での受容体介在輸送を介して血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンに融合したＴＳＤ(例えば、ＨＥＸＡ)、ＮＰＤ(例えば、ＡＳＭ)またはＮＣＬ１(例えば、ＰＰＴ１)で欠損している酵素を利用する、組成物および方法である。ターゲティングのための例示的内在性トランスポーターは、ＢＢＢ上のインスリン受容体である。ＢＢＢインスリン受容体は、循環インスリンおよびある種のＨＩＲＭＡｂなどのペプチド模倣モノクローナル抗体(ＭＡｂ)の脳への輸送に介在する。内在性リガンドまたはペプチド模倣ＭＡｂで標的化される他の内在性トランスポーターは、ＢＢＢトランスフェリン受容体、ＢＢＢインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体、ＢＢＢレプチン受容体またはＢＢＢ低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)受容体を含む。組成物および方法は、末梢血から、血液脳関門を通過してＣＮＳにＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１を輸送するのに有用である。ここで使用する「血液－脳関門」は、脳毛細血管内皮原形質膜内の密着結合により形成され、脳内への分子の輸送を制限する極めて堅固な関門を形成する、末梢循環と脳および脊髄の間の関門であり、ＢＢＢは、分子量６０Da程度の尿素のよう小な分子でさえ、制限できるほど緻密な関門である。脳内の血液－脳関門、脊髄内の血液－脊髄関門および網膜内の血液－網膜関門は、中枢神経系(ＣＮＳ)内の連続的毛細血管関門であり、集合的に血液－脳関門またはＢＢＢと称される。

【0107】

ＢＢＢは、脳およびＣＮＳに対する新規神経治療剤、診断剤および研究ツールの開発を制限する。組み換えタンパク質、アンチセンス薬物、遺伝子医薬、精製抗体またはＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)ベースの薬物などの大部分の高分子治療剤は、薬理学的に意義のある量でＢＢＢを通過しない。一般に小分子薬物はＢＢＢを通過できると考えられているが、実際、ＢＢＢを通過する輸送がないため全小分子薬物の＜２％しか脳で活性ではない。薬理学的に意義のある量でＢＢＢを通過するために、分子は脂質可溶性であり、４００ダルトン(Da)未満の分子量を有しなければならず、小分子の圧倒的多数は、これら二重の分子特徴を有しない。それ故に、大部分の潜在的治療剤、診断剤または研究分子は、薬理学的に活性な量でＢＢＢを通過しない。ＢＢＢを迂回するために、脳室内(ＩＣＶ)注入、脳内(ＩＣ)投与および対流増強拡散(ＣＥＤ)などの侵襲的経頭蓋薬物送達戦略が使用される。脳への経頭蓋薬物送達は高価であり、侵襲的であり、かつ大部分無効である。ＩＣＶ経路は、髄腔内(ＩＴ)経路とも称され、ＩＣＶ経路により与えられる薬物では典型的な脳実質にではなく、脳の脳室上皮または髄膜表面にしかＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１を送達しない。ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１などの酵素のＩＣ投与は、脳内でのタンパク質拡散効率が極めて低いため、局所送達しか提供しない。同様に、ＣＥＤ経路は、拡散による薬物浸透が限定されているため、脳のカテーテル先端近辺の局所送達しか提供しない。

【0108】

ここに記載する方法は、ＢＢＢを迂回するためのこれらの高度に侵襲的かつ一般に不満足な方法の代替を提供し、機能的ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１が、ここに記載する、それぞれＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合抗体、ＨＩＲＭＡｂ－ＡＳＭ融合抗体またはＨＩＲＭＡｂ－ＰＰＴ１融合抗体組成物の全身投与後に末梢血からＢＢＢを通過してＣＮＳに入ることを可能とする。ここに記載する方法は、所望の二機能性ＨＩＲＭＡｂ－酵素融合抗体を末梢血からＣＮＳに到達させるために、ＢＢＢ上のインスリン受容体(例えば、ヒトインスリン受容体)の発現を利用する。

【0109】

内在性受容体
グルコースまたはアミノ酸などの血中のある内在性小分子は水可溶性であるが、あるＢＢＢ担体系上の担体介在輸送(ＣＭＴ)のため、それでもＢＢＢを貫通できる。例えば、グルコースは、ＧＬＵＴ１グルコーストランスポーター上でのＣＭＴを介してＢＢＢを貫通する。Ｌ－ＤＯＰＡなどの治療アミノ酸を含むアミノ酸は、ＬＡＴ１大型中性アミノ酸トランスポーター上でのＣＭＴを介してＢＢＢを通過する。同様に、インスリン、トランスフェリン、インシュリン様増殖因子、レプチンまたは低密度リポタンパク質などの血中のある種の内在性大型分子は、あるＢＢＢ受容体系上の受容体介在経細胞輸送(ＲＭＴ)により、ＢＢＢを通過できる。例えば、インスリンは、インスリン受容体上でのＲＭＴを介してＢＢＢを通過する。トランスフェリンは、トランスフェリン受容体上でのＲＭＴを介してＢＢＢを通過する。インシュリン様増殖因子は、インシュリン様増殖因子受容体上でのＲＭＴを介してＢＢＢを通過し得る。レプチンは、レプチン受容体上でのＲＭＴを介してＢＢＢを通過し得る。低密度リポタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体上での輸送を介してＢＢＢを通過し得る。

【0110】

ＢＢＢは、数種の巨大分子の血液から脳への輸送を可能とする、インスリン受容体を含む特異的受容体を有することが示されている。特に、インスリン受容体は、ここに記載するＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体のトランスポーターとして適する。ここに記載するＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合抗体、ＨＩＲＭＡｂ－ＡＳＭ融合抗体またはＨＩＲＭＡｂ－ＰＰＴ１融合抗体は、ヒトインスリン受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に結合する。

【0111】

インスリン受容体およびその細胞外、インスリン結合ドメイン(ＥＣＤ)は、構造的および機能的両者で、文献において広範に特徴づけされている。例えば、Yip et al (2003), J Biol. Chem, 278(30):27329-27332;およびWhittaker et al. (2005), J Biol Chem, 280(22):20932-20936参照。ヒトインスリン受容体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、GenBank accession No. NM_000208の下に見られ得る。

【0112】

インスリン受容体介在輸送系に結合する抗体
ＴＳＤ(例えば、ＨＥＸＡ)、ＮＰＤ(例えば、ＡＳＭ)またはＮＣＬ１(例えば、ＰＰＴ１)で欠損している酵素のＣＮＳへの送達のための一つの非侵襲的アプローチは、酵素(ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)の、インスリン受容体のＥＣＤに選択的に結合する抗体への融合である。ＢＢＢで発現されるインスリン受容体は、それにより、ＢＢＢを通過する酵素の輸送のためのベクターとして働き得る。あるＥＣＤ特異的抗体は内在性リガンドを模倣し、それにより、特異的受容体系上の輸送を介して原形質膜関門を横断し得る。このようなインスリン受容体抗体は、図１に模式的に記載するとおり、分子「トロイの木馬」または「ＴＨ」として働き得る。酵素は、それ自体では、通常血液－脳関門(ＢＢＢ)を通過しない。しかしながら、酵素のＴＨへの融合後、酵素は、脳においてＢＢＢおよび脳細胞膜両者で発現されるＩＲなどの内在性ＢＢＢ受容体上での輸送により、ＢＢＢおよび脳細胞膜を通過できる(図１)。

【0113】

故に、抗体および他の巨大分子は通常脳から排除されるとの事実にかかわらず、ＢＢＢ上に発現される受容体、例えば、インスリン受容体の細胞外ドメインに特異性を有するならば、脳実質に分子を送達するための有効な媒体であり得る。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体は、ヒトＢＢＢ ＨＩＲ上の細胞外表面エピトープであり、この結合は、ヒトＢＢＢインスリン受容体が介在する輸送反応を介して、融合抗体がＢＢＢを横断することを可能とする。

【0114】

用語「抗体」は、天然であれ、一部または完全に合成により産生されたものであれ、免疫グロブリンをいう。本用語はまた抗原結合ドメインであるまたはそれと相同である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチドまたはタンパク質を包含する。ＣＤＲ移植抗体も本用語により意図される。

【0115】

「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一軽(Ｌ)鎖および２つの同一重(Ｈ)鎖からなる約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一般に一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合し、一方ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖で変わる。各重鎖および軽鎖はまた一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(「ＶＨ」)、続いていくつかの定常ドメイン(「ＣＨ」)を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(「ＶＬ」)および他端に定常ドメイン(「ＣＬ」)を有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間に境界を形成すると考えられる。

【0116】

用語「可変ドメイン」は、種々のアイソフォームまたは異なる種間におけるようなファミリーメンバーの配列で広く異なるタンパク質ドメインをいう。抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、各特定の抗体のその特定の抗原への結合および特異性に使用される抗体の可変ドメインをいう。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインをとおして均一に分布はしていない。軽鎖および重鎖可変ドメイン両者の超可変領域と称されるセグメントに集約される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」と称される。非修飾重鎖および軽鎖の各々は、大部分β－シート配置を採用し、３つの超可変領域(これは、β－シート構造を連結し、ある場合それを形成するループを形成する)に結合される可変ドメイン４つのＦＲ(それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４)からなる。各鎖の超可変領域はＦＲにより近位で保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与するKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を発揮する。

【0117】

ここで使用するとき、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、相補的方法で抗原に直接結合し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として知られる３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。

【0118】

軽鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、一般に残基約２４～３４(ＣＤＲＬ１)、５０～５６(ＣＤＲＬ２)および８９～９７(ＣＤＲＬ３)に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、一般に残基約３１～３５(ＣＤＲＨ１)、５０～６５(ＣＤＲＨ２)および９５～１０２(ＣＤＲＨ３)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))に対応するおよび／または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２(Ｌ１)、５０～５２(Ｌ２)および９１～９６(Ｌ３)および重鎖可変ドメインにおける残基２６～３２(Ｈ１)、５３～５５(Ｈ２)および９６～１０１(Ｈ３)；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987))に対応する。

【0119】

ここで使用する「可変フレームワーク領域」または「ＶＦＲ」は、抗原結合ポケットまたは溝の一部を形成するおよび／または抗原と接触し得るフレームワーク残基をいう。ある実施態様において、フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたは溝の一部であるループを形成する。ループにおけるアミノ酸残基は抗原と接触してもしなくてもよい。ある実施態様において、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖または抗体軽鎖の三次元構造の検査により決定される。三次元構造は、溶媒接触アミノ酸位置がループを形成するおよび／または抗体可変ドメインで接触する抗原を提供する可能性が高いため、そのような位置を分析し得る。溶媒接触位置の一部は、アミノ酸配列多様性を許容でき、その他(例えば構造的位置)の多様化は低くてよい。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングに由来し得る。ある実施態様において、ＶＦＲは、重鎖可変ドメインのアミノ酸７１～７８位に対応するアミノ酸位置を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなり、位置はKabat et al., 1991に従い規定される。ある実施態様において、ＶＦＲは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の間に位置するフレームワーク領域３の部分を形成する。ＶＦＲは、標的抗原と接触するまたは抗原結合ポケットの一部を形成するように十分に配置されたループを形成し得る。

【0120】

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てられ得る。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはサブラス(アイソタイプ)、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２にさらに細分され得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメイン(Ｆｃ)は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。

【0121】

あらゆる脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパまたは(「κ」)およびラムダまたは(「λ」)と称される２つの明確に異なるタイプの一方に割り当てられ得る。

【0122】

ここに記載する抗体または融合抗体に関して、用語「選択的に結合する」、「選択的結合」、「特異的に結合する」または「特異的結合」は、解離定数(Ｋｄ)が約１０^－６Ｍ以下、例えば、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍまたは１０^－１２Ｍである、抗体または融合抗体のその標的抗原への結合をいう。

【0123】

ここで使用する用語抗体は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味することも理解される(一般に、Holliger et al., Nature Biotech. 23 (9) 1126-1129 (2005)参照)。このような抗体の非限定的例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544 546)；および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が一価分子を形成するよう対合する単一タンパク質鎖として製造させる合成または天然リンカーにより、組み換え方法を使用して連結され得る(一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖまたは一本鎖ＦａｂまたはｓｃＦａｂとして知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423 426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883;およびOsbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778参照)。このような一本鎖抗体も、用語抗体に含まれることが意図される。特異的一本鎖抗体のあらゆるＶＨおよびＶＬ配列を、意図するＩｇＧ分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作製するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列と結合させ得る。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組み換えＤＮＡテクノロジーを使用する、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖまたは他のフラグメントの作製にも使用され得る。二重特異性抗体または単一単量体可変ドメインのみからなる抗体などの他の形態の一本鎖抗体も包含される。

【0124】

「Ｆ(ａｂ’)２」および「Ｆａｂ’」部分は、免疫グロブリン(モノクローナル抗体)をペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼで処理することにより製造でき、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合近くで免疫グロブリンを消化することにより産生した抗体フラグメントを含む。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを開裂し、ＶＬ(Ｌ鎖可変領域)およびＣＬ(Ｌ鎖定常領域)からなるＬ鎖およびＶＨ(Ｈ鎖可変領域)およびＣＨγ１(Ｈ鎖の定常領域におけるγ１領域)からなるＨ鎖フラグメントがジスルフィド結合によりそのＣ末端領域で結合された、２つの相同抗体フラグメントを産生する。これら２つの相同抗体フラグメントの各々はＦａｂ’と称される。ペプシンはまた２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを開裂し、２つの上記Ｆａｂ’がヒンジ領域で結合したフラグメントよりわずかに大きな抗体フラグメントを産生する。この抗体フラグメントはＦ(ａｂ’)２と称される。

【0125】

Ｆａｂフラグメントは軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での数残基の付加により、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についてここでの命名である。Ｆ(ａｂ’)２抗体フラグメントは、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学カップリングも知られる。

【0126】

「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、緻密な、非共有結合的に会合された１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインの二量体である。この配置で、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、一可変ドメイン(または抗原に特異的な３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体より親和性は低い。

【0127】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ、ＶＬまたはＶＨとＶＬ両者のドメインを含み、ここで、両ドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。ある実施態様において、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成することが可能となる。ｓＦｖのレビューのために、例えば、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269 315 (1994)参照。

【0128】

「キメラ」抗体は、異なる哺乳動物の組み合わせに由来する抗体である。哺乳動物は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギまたはヒトであり得る。異なる哺乳動物の組み合わせは、ヒトおよびマウス源からのフラグメントの組み合わせを含む。

【0129】

ある実施態様において、ここに提供される抗体は、一般にマウスモノクローナル抗体のヒト化に由来するキメラヒト－マウス抗体であるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)である。このような抗体は、例えば、抗原攻撃に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されている、遺伝子導入マウスから得る。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素を、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウス系統に導入する。遺伝子導入マウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成でき、該マウスをヒト抗体分泌ハイブリドーマの産生に使用できる。

【0130】

ヒトでの使用について、ヒトに投与したとき顕著な免疫原性を有しないのに十分であるヒト配列、例えば、約８０％ヒトおよび約２０％マウスまたは約８５％ヒトおよび約１５％マウスまたは約９０％ヒトおよび約１０％マウスまたは約９５％ヒトおよび５％マウスまたは約９５％を超えるヒトおよび約５％未満のマウスまたは１００％ヒトを含む、ＨＩＲ Ａｂが好ましい。ＨＩＲ ＭＡｂのより高度なヒト化形態も操作され得て、ヒト化ＨＩＲ Ａｂは、マウスＨＩＲ Ａｂと同等な活性を有し、ここに提供される実施態様において使用され得る。例えば、２００２年１１月２７日出願の米国特許出願公開２００４０１０１９０４および２００５年２月１７日出願の米国特許出願公開２００５０１４２１４１参照。本実施態様において使用するのに十分なヒト配列を有するヒトＢＢＢインスリン受容体に対するヒト化抗体は、例えば、Boado et al. (2007), Biotechnol Bioeng, 96(2):381-391に記載される。

【0131】

例示的実施態様において、ＨＩＲ抗体またはそれ由来の融合抗体(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)は、図７(配列番号１～３)に挙げられたＨＣ ＣＤＲの少なくとも一つの配列またはそのバリアントに対応するＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、最大１個、２個、３個、４個、５個または６個の単一アミノ酸変異を有する配列番号１のアミノ酸配列に対応するＨＣ ＣＤＲ１、最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の単一アミノ酸変異を有する配列番号２のアミノ酸配列に対応するＨＣ ＣＤＲ２または最大１個または２個の単一アミノ酸変異を有する配列番号３のアミノ酸配列に対応するＨＣ ＣＤＲ３、ここで、単一アミノ酸変異は置換、欠失または挿入である。

【0132】

他の実施態様において、ＨＩＲ抗体または融合抗体(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)は、アミノ酸配列が配列番号７(図５に示す)に少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)である、免疫グロブリンＨＣを含む。

【0133】

ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂまたは融合Ａｂ(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)は、図７(配列番号４～６)に挙げられたＬＣ ＣＤＲの少なくとも一つの配列またはそのバリアントに対応するＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、最大１個、２個、３個、４個または５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号４のアミノ酸配列に対応するＬＣ ＣＤＲ１、最大１個、２個、３個または４個の単一アミノ酸変異を有する配列番号５のアミノ酸配列に対応するＬＣ ＣＤＲ２または最大１個、２個、３個、４個または５個の単一アミノ酸変異を有する配列番号６のアミノ酸配列に対応するＬＣ ＣＤＲ３。

【0134】

他の実施態様において、ＨＩＲ Ａｂまたは融合Ａｂ(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)は、アミノ酸配列が配列番号８(図６に示す)に少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)である、免疫グロブリンＬＣを含む。

【0135】

さらに他の実施態様において、ＨＩＲ Ａｂまたは融合Ａｂ(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)は、上記ＨＩＲ重鎖およびＨＩＲ軽鎖の何れかに対応する重鎖および軽鎖両方を含む。

【0136】

ここに提供されるＨＩＲ抗体は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体がグリコシル化されるならば、抗体の機能に顕著に影響しないあらゆるパターンのグリコシル化が使用され得る。グリコシル化は、抗体が産生される細胞に典型的なパターンで生じ得て、細胞型毎に異なり得る。例えば、マウス骨髄腫細胞により産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、トランスフェクトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンと異なり得る。ある実施態様において、抗体は、トランスフェクトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により産生されるパターンでグリコシル化される。

【0137】

当業者は、現在のテクノロジーで、候補ＨＩＲ Ａｂまたは既知ＨＩＲ Ａｂの膨大な数の配列バリアントが容易に産生でき(例えば、インビトロ)、ヒトインスリン受容体のＥＣＤまたはその単離エピトープなどの標的抗原への結合についてスクリーニングできることを認識する。例えば、抗体配列バリアントの超ハイスループットスクリーニングの例についてFukuda et al. (2006) “In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display,” Nuc. Acid Res., 34(19)(オンライン出版)参照。また、Chen et al. (1999), “In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site,” Prot Eng, 12(4): 349-356も参照。インスリン受容体ＥＣＤは、例えば、Coloma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載のとおり精製し、ＨＩＲ Ａｂおよび既知ＨＩＲ ＡｂのＨＩＲ Ａｂ配列バリアントについてスクリーニングに使用できる。

【0138】

したがって、ある実施態様において、所望のレベルのヒト配列で遺伝子操作したＨＩＲ Ａｂを、ＴＳＤで欠損している酵素(例えば、ＨＥＸＡ)と融合して、二機能的分子である組み換え融合抗体を産生する。例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体は、末梢投与後、(ｉ)ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；(ii)Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基を加水分解し；そして(iii)ＢＢＢ ＨＩＲ上での輸送を介してＢＢＢを通過し、ＨＥＸＡ活性を保持して脳内に入ることができる。ある実施態様において、所望のレベルのヒト配列で遺伝子操作したＨＩＲ Ａｂを、ＮＰＤで欠損している酵素(例えば、ＡＳＭ)と融合させて、二機能的分子である組み換え融合抗体を産生する。例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体は、末梢投与後、(ｉ)ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；(ii)スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホコリンを形成し；そして(iii)ＢＢＢ ＨＩＲ上での輸送を介してＢＢＢを通過し、ＡＳＭ活性を保持して脳内に入ることができる。ある実施態様において、所望のレベルのヒト配列で遺伝子操作したＨＩＲ Ａｂを、ＮＣＬ１で欠損している酵素(例えば、ＰＰＴ１)と融合させて、二機能的分子である組み換え融合抗体を産生する。例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体は、末梢投与後、(ｉ)ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；(ii) 脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートを加水分解し；そして(iii)ＢＢＢ ＨＩＲ上での輸送を介してＢＢＢを通過し、ＰＰＴ１活性を保持して脳内に入ることができる。

【0139】

リソソーム酵素
組み換えＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１の全身投与(例えば、静脈内注射による)は、それぞれＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１を有する患者のＣＮＳにおけるＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１の欠損を救済するとは期待されない。ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１はＢＢＢを通過せず、ＢＢＢを通過して酵素が輸送されないため、末梢投与後ＣＮＳにおける意義のある治療効果を有することが妨げられる。しかしながら、本発明者らは、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１を、ＨＩＲ ＡｂなどのＢＢＢを通過する抗体に融合させたとき(例えば、共有リンカーにより)、この酵素は、それから静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などのまたは経口投与などの非侵襲的末梢経路での投与後、血液からＣＮＳに入ることができるようになることを発見した。ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の投与は、末梢血から脳へのリソソーム酵素活性の送達を可能とする。ここに記載されるのは、それぞれＣＮＳにおけるＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１欠損の処置のために治療的に有効であるＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の全身用量の決定である。ここに記載するとおり、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の適切な全身用量は、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性および酵素活性の定量的決定に基づき、確立される。

【0140】

Ｇ_Ｍ２ガングリオシドは中枢神経系で合成される。ここで使用するＨＥＸＡ(例えば、GenBank Accession No. NP_000511下に挙げられるヒトＨＥＸＡ配列)は、Ｇ_Ｍ２ガングリオシドにおけるＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドの末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒できる、あらゆる天然に存在するまたは人工的な酵素をいう。スフィンゴミエリンは中枢神経系で合成される。ここで使用するＡＳＭ(例えば、GenBank Accession No. NP_000534下に挙げられるヒトＡＳＭ配列)は、セラミドおよびホスホコリンを形成するスフィンゴミエリンの加水分解を触媒できる、あらゆる天然に存在するまたは人工的な酵素をいう。脂肪酸アシルコンジュゲートは中枢神経系で合成される。ここで使用するＰＰＴ１(例えば、GenBank Accession No. NP_000301)下に挙げられるヒトＰＰＴ１配列)は、脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートの加水分解を触媒できるあらゆる天然に存在するまたは人工的な酵素をいう。

【0141】

ある実施態様において、ＨＥＸＡは、Genbank NP_000511下に挙げられる５２９アミノ酸タンパク質のヒトＨＥＸＡのアミノ酸配列とまたは２２アミノ酸シグナルペプチドを欠き、配列番号９に対応するその５０７アミノ酸部分配列と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を有する(図８)。ヒトＨＥＸＡのクローニングおよび発現は、Myerowitz et al (1985), “Human β-hexosaminidase α chain: coding sequence and homology with the β chain,” Proc Natl Acad Sci, 82: 7830-7834に記載されている。ある実施態様において、ＡＳＭは、Genbank NP_000534下に挙げられる６３１アミノ酸タンパク質のヒトＡＳＭのアミノ酸配列とまたは４６アミノ酸シグナルペプチド、１５アミノ酸プロペプチドおよび３アミノ酸カルボキシル末端ペプチドを欠き、配列番号１７に対応するその５６７アミノ酸部分配列と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を有する(図１８)。ヒトＡＳＭのクローニングおよび発現は、Schuchman et al (1991), “Human acid sphingomyleinase,” J Biol Chem 266: 8531-8539に記載されている。ある実施態様において、ＰＰＴ１は、Genbank NP_000301下に挙げられる３０６アミノ酸タンパク質のヒトＰＰＴ１のアミノ酸配列とまたは２７アミノ酸シグナルペプチドを欠き、配列番号２１に対応するその２７９アミノ酸部分配列と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を有する(図２７)。ヒトＰＰＴ１のクローニングおよび発現は、Camp et al (1994), “Molecular cloning and expression of palmityoy-protein thioesterase,” J Biol Chem 269: 23212-23219に記載されている。

【0142】

ある実施態様において、ＨＥＸＡは、配列番号９と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何れかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を有する(図８に示す)。ある実施態様において、ＡＳＭは、配列番号１７と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を示す(図１８に示す)。ある実施態様において、ＰＰＴ１は、配列番号２１と少なくとも５０％同一(例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までの何らかの他のパーセント同一)であるアミノ酸配列を有する(図２７に示す)。配列番号９、配列番号１７または配列番号２１などの規範的ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１配列の配列バリアントは、例えば、配列全体または特定のドメインに対応する特異的配列の無作為変異誘発により産生され得る。あるいは、上記のもののような酵素機能に重要であることが知られる残基の変異を回避しながら、部位特異的変異誘発を反復して実施し得る。さらに、酵素配列の複数バリアントの産生において、変異耐容性予測プログラムを使用して、厳密に無作為の変異誘発により産生されるであろう非機能的配列バリアントの数を大きく減らし得る。タンパク質機能に対するタンパク質配列のアミノ酸置換の影響を予測する種々のプログラム(例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴおよびＴｏｐｏＳＮＰ)が、例えば、Henikoff et al. (2006), “Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function,” Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80に記載される。ＨＥＸＡ配列バリアントを、ＨＥＸＡ活性／ＨＥＸＡ活性の保持について、図１３で使用される、基質として４－メチルウンベリフェリルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド(４－ＭＵＧ)としても知られる４－メチルウンベリフェリル－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシドを使用して、文献、Dewji (1986): Purification and characterization of β-N-acetylhexosaminidase I₂ from human liver, Biochem J., 234: 157-162において知られる蛍光定量的酵素アッセイによりスクリーニングできる。ＡＳＭ配列バリアントを、ＡＳＭ活性／ＡＳＭ活性の保持について、図２３で使用される、基質として６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリルホスホコリン(ＨＭＵ－ＰＣ)を使用する、文献、van Diggelen et al (2005): A new fluorometric enzyme assay for the diagnosis of Niemann Pick A/B, with specificity of natural sphingomyelinase substrate J Inherit. Metab. Dis., 28: 733-741において知られる蛍光定量的酵素アッセイによりスクリーニングできる。ＰＰＴ１配列バリアントを、ＰＰＴ１活性／ＰＰＴ１活性の保持について、図３３で使用される、基質として４－メチルウンベリフェリル６－チオ－パルミテート－β－Ｄ－グルコピラノシド(Ｍｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ)を使用する、文献、van Diggelen et al (1999): A rapid fluorogenic palmitoyl-protein thioesterase assay: Pre- and postnatal diagnosis of INCL Molec Genet Metab, 66: 240-244において知られる蛍光定量的酵素アッセイによりスクリーニングできる。したがって、当業者は、非常に多数の操作可能なＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１配列バリアントが、上記のとおり、当分野で日常的な方法により、酵素配列バリアンの極めて多様な「ライブラリー」の産生およびスクリーニングにより得ることができることを認識する。

【0143】

パーセント配列同一性は、慣用法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)参照。簡潔には、２つのアミノ酸配列を、Henikoff and Henikoff (ibid.)のギャップ・オープニング・ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１および「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアマトリクスを使用する整列スコアが最適化するように整列させる。次いで、パーセント同一性を、([同一マッチ総数]／[長い配列の長さ＋２つの配列の整列のために長い配列に導入したギャップの数])(１００)として計算する。

【0144】

当業者は、２つのアミノ酸配列の整列に利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識する。Pearson and Lipmanの「ＦＡＳＴＡ」類似性探索アルゴリズムは、ここに開示するアミノ酸配列と他のペプチドのアミノ酸配列が共有する同一性レベルの試験に適当なタンパク質整列方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムはPearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載される。簡潔には、ＦＡＳＴＡは、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、最高密度の同一性(ｋｔｕｐ変数が１であるならば)または同一性対(ｋｔｕｐ＝２であるならば)を有するクエリー配列(例えば、配列番号９)および試験配列により共有される領域を同定することにより、まず配列を特徴づけする。次いで、最高密度の同一性を有する１０領域を、アミノ酸置換マトリクスを使用して全対合アミノ酸の類似性を比較することにより再スコア化し、最高スコアに貢献する残基のみを含むよう、領域の終点を「トリム」する。「カットオフ」値(配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づき、予定された式により計算)より大きなスコアを有する領域が数個あるならば、トリムした初期領域を試験して、該領域をギャップを用いて近似整列を形成するように連結できるか決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸挿入および欠失を可能とするNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))の就職を使用して整列させる。ＦＡＳＴＡ分析の例示的パラメータはｋｔｕｐ＝１、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１および置換マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータをPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2に説明されるとおり、スコアマトリクスファイル(「ＳＭＡＴＲＩＸ」)の修飾によりＦＡＳＴＡプログラムに導入できる。

【0145】

本実施態様はまた、ここに開示するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するタンパク質にも関する。一般的アミノ酸の中で、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、下記群の各々の中でのアミノ酸の置換により説明される。(１)グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、(２)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、(３)セリンおよびスレオニン、(４)アスパラギン酸およびグルタミン酸、(５)グルタミンおよびアスパラギンおよび(６)リシン、アルギニンおよびヒスチジンのように分けられる。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連タンパク質の５００を超える群の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２,０００の局所多重整列由来のアミノ酸置換マトリクスである(Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を使用して、本実施態様のアミノ酸配列に導入し得る保存的アミノ酸置換を定義できる。化学性質(上記のとおり)にのみ基づきアミノ酸置換を操作することは可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは－１を超えるＢＬＯＳＵＭ６２値によりあらわされる置換をいう。例えば、置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられるならば、該アミノ酸置換は保存的である。このシステムによると、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも１(例えば、１、２または３)のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２(例えば、２または３)のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。

【0146】

アミノ酸配列は、付加的Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸などの付加的残基を含んでよく、配列が本実施態様の組成物および方法において機能的であるのに十分な生物学的タンパク質活性を保持する限り、なお、本質的にここに開示する配列の一つに示すとおりであることも理解される。

【0147】

組成物
ここに記載する二機能性融合抗体が、別個の構成要素タンパク質の活性、例えば、ＢＢＢを通過できる抗体(例えば、ＨＩＲ Ａｂ)のＢＢＢ上の内在性受容体の細胞外ドメイン(例えば、ＩＲ ＥＣＤ)への結合とＴＳＤ(例えば、ＨＥＸＡ)、ＮＰＤ(例えば、ＡＳＭ)またはＮＣＬ１(例えば、ＰＰＴ１)で欠損している酵素の酵素活性を高い割合で保持することが判明した。ここに記載するタンパク質の何れかをコードするｃＤＮＡおよび発現ベクターの構築ならびにその発現および精製は、十分に当分野の通常技術の範囲内であり、ここに、例えば、実施例１～３に、そしてBoado et al (2007), Biotechnol Bioeng 96:381-391、米国特許出願１１／０６１,９５６および米国特許出願１１／２４５,７１０に詳述される。

【0148】

ここに記載されるのは、ここに記載するとおり、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１に融合するＢＢＢを通過できる内在性ＢＢＢ受容体に対する抗体(例えば、ＨＩＲ Ａｂ)を含む二機能性融合抗体であり、ここで、内在性ＢＢＢ受容体に対する抗体は血液脳関門を通過でき、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１は、分離された存在(separate entities)としての活性と比較して、各々、平均で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性を保持する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体であり、ここで、ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、分離された存在としての活性と比較して、各々平均で少なくとも約５０％の活性を保持する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体であり、ここで、ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、分離された存在としての活性と比較して、各々平均で少なくとも約６０％の活性を保持する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体であり、ここで、ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、分離された存在としての活性と比較して、各々平均で少なくとも約７０％の活性を保持する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体であり、ここで、ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、分離された存在としての活性と比較して、各々平均で少なくとも約８０％の活性を保持する。ある実施態様において、ここに提供されるのは、融合ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体であり、ここで、ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、分離された存在としての活性と比較して、各々平均で少なくとも約９０％の活性を保持する。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂは、分離した存在としての活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性を保持し、酵素は、分離された存在としての活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性を保持する。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂは、分離された存在としての活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性を保持する。ある実施態様において、酵素は、分離された存在としての活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性を保持する。したがって、ここに記載されるのは、ＢＢＢを通過できる二機能性ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体を含む組成物であり、ここで、構成要素ＨＩＲ Ａｂおよび酵素は、各々、融合抗体の一部として、別のタンパク質としての活性と比較して、それぞれ、平均で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の活性、例えば、ＨＩＲ結合および酵素活性を保持する。ＨＩＲ Ａｂ酵素融合抗体は、ここに記載するＨＩＲ抗体および酵素の何れかを含む融合タンパク質をいう。

【0149】

ここに提供される実施態様の何れかにおいて、ＨＩＲ Ａｂは、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体またはインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体または他の類似内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に対する抗体などのここに記載する内在性ＢＢＢ受容体に対する抗体により置き換えられ得る。

【0150】

ある場合、ここに記載する融合抗体において、抗体と酵素間の共有結合は、抗体重鎖または軽鎖のカルボキシ末端またはアミノ末端にであり得る。ある場合、抗体と酵素間の共有結合は、酵素のアミノ末端またはカルボキシ末端にである。一般に、ここに提供する結合は、融合抗体がＩＲのＥＣＤに結合し、血液脳関門を通過することを可能とし、酵素がその活性の治療的に有用な部分を保持することを可能とする。ある実施態様において、共有結合は、抗体のＨＣと酵素間または抗体のＬＣと酵素間または酵素と一本鎖抗体間である。あらゆる適当な結合、例えば、軽鎖のカルボキシ末端と酵素のアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端と酵素のアミノ末端、軽鎖のアミノ末端と酵素のカルボキシ末端、重鎖のアミノ末端と酵素のカルボキシ末端、酵素のアミノ末端と一本鎖抗体のカルボキシ末端または酵素のカルボキシ末端と一本鎖抗体のアミノ末端が使用され得る。ある実施態様において、結合は、ＬＣのカルボキシ末端と酵素のアミノ末端である。

【0151】

酵素は、リンカーを介して、ターゲティング抗体(例えば、ＭＡｂ、ＨＩＲ－ＭＡｂ)に融合または共有結合し得る。末端アミノ酸間の結合は、融合アミノ酸配列の一部を形成する介在ペプチドリンカー配列により達成され得る。ペプチド配列リンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２０を超えるアミノ酸長であってよくまたはペプチド配列リンカーは０～２０アミノ酸の範囲の任意の数のアミノ酸であり得る。ある好ましい実施態様を含むある実施態様において、ペプチドリンカーは、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸長より短い。ある好ましい実施態様を含むある実施態様において、ペプチドリンカーは少なくとも２０～２５アミノ酸長である。ある実施態様において、ペプチドリンカーは３１アミノ酸長である。ある実施態様において、リンカーは、配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５または配列番号１８の２３５～２６５または配列番号２３の４６２～４９２を含む。ある実施態様において、酵素はターゲティング抗体に直接結合され、それ故に０アミノ酸長である。

【0152】

ある実施態様において、リンカーは、あらゆる組み合わせまたは順番でグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を含む。ある場合、リンカーにおけるグリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わされたパーセンテージは、リンカーにおける総残基数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である。ある好ましい実施態様において、リンカーにおけるグリシン、セリンおよびアラニン残基の組み合わされたパーセンテージは、リンカーの総残基数の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である。ある実施態様において、アミノ酸(天然または合成アミノ酸を含む)のあらゆる数の組み合わせをリンカーに使用できる。ある実施態様において、４アミノ酸リンカーが使用される。ある実施態様において、リンカーは、配列番号２２のアミノ酸４６２～２６５における配列Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒを有する。ある実施態様において、２アミノ酸リンカーは、あらゆる組み合わせまたは順番でグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基(例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ。Ａｌａ－Ａｌａ、Ｓｅｒ－ＡｌａまたはＡｌａ－Ｓｅｒリンカー)からなる。ある実施態様において、２アミノ酸リンカーは、他のアミノ酸と共に１個のグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を含む(例えば、Ｓｅｒ－Ｘ、ここで、Ｘは何らかの既知アミノ酸である)。さらに他の実施態様において、２アミノ酸リンカーは、ｇｌｙ、ｓｅｒまたはａｌａ以外の任意の２アミノ酸(例えば、Ｘ－Ｘ)からなる。

【0153】

ある実施態様において、リンカーは、６２アミノ酸からなるヒトＩｇＧ３からのヒンジ領域などの内在性ヒトタンパク質の配列に由来する。ある実施態様において、リンカーは、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の切断バージョンに由来する。ある実施態様において、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域のシステイン残基は、鎖間のジスルフィド結合を排除するために、セリン残基に変異される。ある実施態様において、セリン－セリン－セリンスペーサーは、ヒンジ配列のアミノ末端側およびカルボキシル末端側両者に配置される。３１ ＡＡリンカーは、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域からの２５ ＡＡを含み、これは、上部ヒンジ領域の１２アミノ酸、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来し、アミノ末端はＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端はＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。下部ヒンジの第一Ｌｅｕは、補体結合を排除するためにＰｈｅに変異される。これらの実施態様は、配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５(図９)に対応する図９に示すリンカー(下線を引いた)を含む。

【0154】

ここに記載するとおり、ある実施態様において、リンカーは２アミノ酸長を超える長さである。このようなリンカーは、さらにここに記載するとおり、グリシン、セリンおよび／またはアラニン残基をあらゆる組み合わせまたは順番で含み得る。ある実施態様において、リンカーは、他のアミノ酸と共に１個のグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基からなる(例えば、Ｓｅｒ－ｎＸ、ここで、Ｘは何らかの既知アミノ酸であり、ｎはアミノ酸数である)。さらに他の実施態様において、リンカーは任意の２アミノ酸(例えば、Ｘ－Ｘ)からなる。ある実施態様において、該任意の２アミノ酸は、あらゆる組み合わせまたは順番でＧｌｙ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、それらの間に種々の数のアミノ酸が介在する。ある実施態様の一例において、リンカーは少なくとも１個のＧｌｙからなる。ある実施態様の一例において、リンカーは少なくとも１個のＳｅｒからなる。ある実施態様の一例において、リンカーは少なくとも１個のＡｌａからなる。ある実施態様において、リンカーは少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のＧｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｌａ残基からなる。好ましい実施態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_３または他の異形などの任意の組み合わせまたは数でＧｌｙおよびＳｅｒを反復配列で含む。

【0155】

本実施態様において使用されるリンカーは、当分野で知られる任意の方法を使用して設計され得る。例えば、融合タンパク質の作製において最適アミノ酸リンカーの決定に利用可能な多くの公開されたプログラムがある。ユーザーのタンパク質の配列および所望のリンカー長の入力に基づき、最適リンカーのアミノ酸配列を自動的に作成する公開された利用可能なコンピュータープログラム(例えばLINKERプログラム)を本方法および組成物に使用し得る。しばしば、このようなプログラムは、タンパク質の操作に使用する最適タンパク質リンカーを予測するために、タンパク質サブドメインを連結する天然に存在するリンカーの観察される傾向を使用し得る。ある場合、このようなプログラムは、最適リンカー予測の他の方法を使用する。本実施態様のリンカーの予測に適する一部プログラムの例は文献に記載され、例えば、Xue et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32, W562-W565 (Web Server issue providing internet link to LINKER program to assist the design of linker sequences for constructing functional fusion proteins); George and Heringa, (2003), Protein Engineering, 15(11):871-879 (providing an internet link to a linker program and describing the rational design of protein linkers); Argos, (1990), J. Mol. Biol. 211:943-958; Arai et al. (2001) Protein Engineering, 14(8):529-532; Crasto and Feng, (2000) Protein Engineering 13(5):309-312を参照のこと。

【0156】

ペプチドリンカー配列はプロテアーゼ開裂部位を含んでよいが、これは酵素の活性に必要ではない；事実、これら実施態様の利点は、二機能性ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体が、開裂せずに、輸送およびＢＢＢを通過した後の活性両者について部分的にまたは完全に活性であることである。図９は、ＬＣが、カルボキシ末端で、３１アミノ酸リンカーを介してＨＥＸＡのアミノ末端に融合している、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体(配列番号１０)のアミノ酸配列の例示的実施態様を示す。ある実施態様において、融合ＨＥＸＡ配列は、図８に示すとおり、その２２アミノ酸シグナルペプチドがない。

【0157】

ある実施態様において、ここに提供するＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体はＨＣおよびＬＣ両者を含む。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体は一価抗体である。他の実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体は、本明細書の実施例部分に記載するとおり、二価抗体である。

【0158】

ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の一部として使用されるＨＩＲ Ａｂはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい；ある実施態様において、抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞における合成により産生されるグリコシル化パターンで、グリコシル化される。

【0159】

ここで使用する「活性」は、生理学的活性(例えば、ＢＢＢを通過する能力および／または治療活性)、ＩＲ ＥＣＤに対するＨＩＲ Ａｂの結合親和性または酵素の酵素活性を含む。

【0160】

ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体のＢＢＢを通過する輸送は、標準法によるＨＩＲ Ａｂ単独のＢＢＢを通過する輸送と同等であり得る。例えば、モデル動物、例えば、霊長類などの哺乳動物によるＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の薬物動態および脳取り込みが使用され得る。同様に、酵素活性決定のための標準モデルを使用して、酵素単独およびＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の一部としての機能も比較し得る。例えば、ＨＩＲ Ａｂへの遺伝子融合後のＨＥＸＡ、ＡＳＭ、ＰＰＴ１の酵素活性の保持を示す実施例６、１１および１６参照。ＩＲ ＥＣＤに対する結合親和性を、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体とＨＩＲ Ａｂ単独で比較し得る。例えば、ここでの実施例６、１１および１６参照。

【0161】

またここに包含されるのは、１以上のここに記載するＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。薬学的に許容される担体／添加物の包括的な記載は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USAに見ることができる。本実施態様の医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内注射；経口、直腸、経頬、肺、経皮、鼻腔内または何れかの他の適当な末梢投与経路を含む、何らかの末梢経路を介して投与するのに適する組成物を含む。

【0162】

ここに提供される組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与用医薬組成物として、注射に特に適する。ここに提供される水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散され得る、本実施態様の有効量の組成物を含む。用語「薬学的にまたは薬理学的に許容される」は、適切である限り、動物、例えば、ヒトに投与したとき、有害な、アレルギー性または他の望まない反応を起こさない分子自体および組成物をいう。ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。慣用の媒体または薬剤が活性成分と不適合でない限り、治療組成物におけるその使用は意図される。補助的活性成分も組成物に加えてよい。

【0163】

注射用組成物のための薬学的に許容される担体の例は、塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含み得る。例えば、ここに提供する組成物は、液体形態で提供でき、種々のｐＨ(５～８)の水溶液に基づき、０～１０％のデキストロースを添加してまたは添加せず、０.０１～１％でポリソルベート－８０などの界面活性剤を添加してまたは添加せずまたはマンニトール、ソルビトールまたはトレハロースなどの炭水化物添加物を添加してまたは添加せず、食塩水中に製剤される。一般に使用される緩衝液は、ヒスチジン、酢酸、リン酸またはクエン酸を含む。通常の保存および使用条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を阻止するための防腐剤を含み得る。微生物の活動の阻止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール；フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを入れることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりもたらされ得る。

【0164】

ヒト投与のために、製剤は、ＦＤＡおよび他の規制当局標準により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たす。活性化合物は一般に非経腸投与用に製剤され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内または腹腔内経路を経る注射用に製剤される。活性要素または成分を含む水性組成物の製剤は、本開示に照らして、当業者には明らかである。一般に、このような組成物は、注射用として、液体溶液または懸濁液として製剤でき、注射前に液体の添加により溶液または懸濁液の調製に使用するのに適する固形も製造でき；そして製剤は乳化され得る。

【0165】

無菌注射用溶液を、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上に挙げた多様な他の成分と共に、適切な溶媒に取り込み、続いて濾過滅菌することにより製造する。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基本的分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、製造方法は、予め滅菌濾過した溶液からの活性成分と何らかの付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。

【0166】

製剤されたら、溶液は、投与製剤に適合する方法で、ここに記載する基準に基づき治療的に有効である量で、全身的に投与される。製剤は多様な投与形態で容易に投与でき、上記注射用溶液のタイプだけでなく、薬物放出カプセルなども用いられ得る。

【0167】

投与する医薬組成物の適切な量、処置回数および単位用量は、ここに記載するＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体のＣＮＳ取り込み特性によりおよび処置する対象、対象の状態および望む効果により変わる。投与を担う者は、何れの事象においても、個々の対象に適切な用量を決定する。

【0168】

静脈内または筋肉内注射などの非経腸投与に製剤される化合物に加えて、本実施態様の投与の他の別の方法を使用でき、皮内投与(米国特許５,９９７,５０１；５,８４８,９９１；および５,５２７,２８８参照)、肺投与(米国特許６,３６１,７６０；６,０６０,０６９；および６,０４１,７７５参照)、バッカル投与(米国特許６,３７５,９７５；および６,２８４,２６２参照)、経皮投与(米国特許６,３４８,２１０；および６,３２２,８０８参照)および経粘膜投与(米国特許５,６５６,２８４参照)を含むが、これらに限定されない。このような投与方法は当分野で周知である。点鼻液剤またはスプレー剤、エアロゾル剤または吸入剤を用いる本実施態様の鼻腔内投与も使用し得る。点鼻液は、通常液滴またはスプレーを鼻孔に投与するように設計された水溶液である。点鼻液は、鼻汁に多くの点で類似するよう、調製される。故に、水性点鼻液は、通常等張であり、５.５～６.５のｐＨを維持するようわずかに緩衝化される。さらに、眼製剤に使用するのに類似する抗微生物防腐剤および適切な薬物安定化剤が、必要であれば、製剤に包含され得る。種々の市販点鼻剤が知られ、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤が知られ、喘息予防に使用される。

【0169】

他の投与方法に適するさらなる製剤は、坐薬およびペッサリーを含む。直腸ペッサリーまたは坐薬も使用され得る。坐薬は、種々の重量および形態の固形投与形態であり、通常直腸または尿道への挿入のために当役される。挿入後、坐薬は、しばしば、体腔液に融解または溶解する。坐薬について、伝統的結合剤および担体は、一般に、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、このような坐薬は、任意の適当な範囲、例えば、０.５％～１０％、好ましくは１％～２％範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。

【0170】

経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常用いられる添加物を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または粉末の形をとる。ある規定された実施態様において、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または同化可能可食担体を含むかまたは硬もしくは軟殻ゼラチンカプセルに封入されてよくまたは錠剤に圧縮されてよくまたは食餌の食べ物に直接取り込まれてよい。経口治療投与のために、活性化合物は添加物と共に取り込まれ、摂取可能錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェーハ剤などの形で使用される。このような組成物および製剤は、少なくとも０.１％の活性化合物を含む。組成物および製剤のパーセンテージは、当然、変わり、簡便には単位重量の約２～約７５％または約２５～６０％でありうる。このような治療に有用な組成物における活性化合物の量は、適当な投与量が得られるものである。

【0171】

錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、次のトラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの添加物；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミント、冬緑油またはサクランボフレーバーなどの矯味剤を添加してよい。投与量単位形態がカプセルであるとき、上記タイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。種々の他の物質はコーティングとしてまたは投与量単位の物理的形態を他に修飾するように存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤を、シェラック、糖または両者でコーティングし得る。エリキシル剤のシロップは、活性化合物、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチレンおよびプロピルパラベン、色素およびサクランボまたはオレンジフレーバーなどのフレーバーを含み得る。ある実施態様において、経口医薬組成物を、胃の環境から活性成分を保護するために、腸溶性にコーティングしてよく、腸溶性コーティング方法および製剤は当分野で周知である。

【0172】

方法
ここに記載されるのは、ここに記載するとおり、治療有効量の融合抗体を全身的に投与することにより、有効用量のＴＳＤ、ＮＰＤまたはＮＣＬ１で欠損している酵素(例えば、それぞれＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)をＢＢＢを超えてＣＮＳに送達する方法である。ある実施態様において、ここに提供する融合抗体はＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１である。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の送達のための適当な全身用量は、ここに記載するとおりそのＣＮＳ取り込み特性および酵素比活性に基づく。ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１欠損を有する対象へのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の全身投与は、それぞれＣＮＳへのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１の非侵襲的送達のための有効なアプローチである。

【0173】

融合抗体の治療的有効全身用量である融合抗体の量は、一部、ここに記載するとおり、投与する融合抗体のＣＮＳ取り込み特性、例えば、全身的に投与された用量のＣＮＳに取り込まれるパーセンテージによる。

【0174】

ある実施態様において、全身的に投与されたＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の約１％が、末梢血からＢＢＢを通過する取り込みの結果として脳に送達される。ある実施態様において、全身的に投与されたＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の約０.３％～約３％(例えば、約０.３％、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、３％または約０.３％～約３％の何れかの％)が、末梢血からＢＢＢを通過する取り込みの結果として脳に送達される。ある実施態様において、全身的に投与されたＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の少なくとも０.５％が、末梢血からＢＢＢを通過する取り込みの結果として脳に送達される。ある実施態様において、全身的に投与されたＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の用量の約０.３％～約３％(例えば、約０.３％、０.４％、０.４８％、０.６％、０.７４％、０.８％、０.９％、１.０５、１.１、１.２、１.３％、１.５％、２％、２.５％、３％または約０.３％～約３％の何れかの％)が、全身投与後２時間以内、例えば、１.８時間、１.７時間、１.５時間、１.４時間、１.３時間、１.２時間、１.１時間、０.９時間、０.８時間、０.６時間、０.５時間または約０.５～２時間までの任意の他の時間に脳に送達される。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体の全身的に投与された用量が２時間以内に脳に送達される。

【0175】

したがって、ある実施態様において、ここに提供されるのは、ＢＢＢを通過する融合抗体の量が、対象の脳に少なくとも０.０１ngのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１タンパク質／mgタンパク質を提供する、例えば、対象の脳に０.０３ng、０.１ng、０.３ng、１ng、３ng、１０ng、３０ng、１００ngまたは３００ngまたは０.０１～３００ngの何れかの他の値のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１タンパク質／mgタンパク質を提供するように、５～５０kgヒトに治療有効量のここに記載する融合抗体を全身的に投与する方法である。

【0176】

ある実施態様において、対象の脳に送達される酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)活性の総単位数は、少なくとも、脳１グラムあたり０.００１ミリ単位／グラム脳であり、例えば、少なくとも、０.００３、０.０１、０.０３、０.１、０.３、１、３、１０、３０、１００または３００または約０.００１～３００ミリ単位／グラム脳のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１活性の他の何れかの総単位数のＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１が送達される。

【0177】

ある実施態様において、治療的有効全身用量は、少なくとも０.１単位、０.３単位、１単位、３単位、１０単位、３０単位、１００単位、３００単位、１０００単位、３０００単位、１００００単位または３００００単位または約０.１～３０,０００単位の何れかの他の全身用量の酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)活性を含む。

【0178】

他の実施態様において、治療的有効全身用量は、少なくとも約０.１単位の酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)活性／kg体重、少なくとも約０.３単位、１単位、３単位、１０単位、３０単位、１００単位、３００単位または１０００単位または約０.１～１０００単位の何れかの他の酵素活性単位／kg体重である。

【0179】

当業者は、ここに提供する融合抗体の治療的有効全身用量の質量は、一部、その酵素(例えば、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１)比活性によることを認識する。ある実施態様において、融合抗体の比活性は、少なくとも０.１Ｕ／mgタンパク質、少なくとも約０.２５単位／mg、０.５単位／mg、１単位／mg、２.５単位／mg、５単位／mg、１０単位／mg、３０単位／mgまたは５０単位／mgまたは約０.１単位／mg～約５０単位／mgの何れかの他の比活性値である。

【0180】

故に、ここに提供する融合抗体の比活性および処置する対象の体重を十分考察して、融合抗体の全身用量は、少なくとも０.１mg、例えば、０.３mg、１mg、１０mg、１５mg、２０mg、２５mg、３０mg、３５mg、４０mg、４５mg、５０mg、５５mg、６０mg、６５mg、７０mg、７５mg、１００mg、５００mgまたは約０.１mg～約５００mgの任意の他の値の融合抗体(例えば、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１)である。

【0181】

ここで使用する用語「全身投与」または「末梢投与」は、ＣＮＳへの直接投与ではない、例えば、ＢＢＢの物理的浸透または破壊を伴わないあらゆる投与方法を含む。「全身投与」は、静脈内、動脈内筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬、経皮、直腸、経肺胞(吸入)または経口投与を含むが、これらに限定されない。ここに記載されるあらゆる適当な融合抗体が使用され得る。

【0182】

ここでいうＨＥＸＡ欠損は、テイ・サックス病またはＴＳＤとして知られる１以上の状態を含む。ＨＥＸＡ欠損は、脳および他の臓器で起こるＧ_Ｍ２ガングリオシドの増大により特徴づけられる。ここでいうＡＳＭ欠損は、ニーマン・ピック病またはＮＰＤとして知られる１以上の状態を含む。ＡＳＭ欠損は、脳および他の臓器で起こるスフィンゴミエリンの増大により特徴づけられる。ここでいうＰＰＴ１欠損は、小児バッテン病またはＮＣＬ１として知られる１以上の状態を含む。ＰＰＴ１欠損は、脳および他の臓器で起こるスフィンゴミエリンの増大により特徴づけられる。

【0183】

ここに提供する組成物、例えば、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体を、組み合わせ治療の一部として投与し得る。組み合わせ治療は、酵素欠損を有する患者で一般にみられる症状の処置または軽減のための他の治療と組み合わせた、本実施態様の組成物の投与を含む。他のＣＮＳ障害方法または組成物と組み合わせて使用される本実施態様の組成物において、本実施態様の組成物と付加的方法または組成物のあらゆる組み合わせが使用され得る。故に、例えば、本実施態様の組成物の使用が、他のＣＮＳ障害処置剤との組み合わせであるならば、２剤を同時に、連続的、重複する期間、類似する、同じまたは異なる頻度などで投与し得る。ある場合、１以上の他のＣＮＳ障害処置剤と組み合わせて本実施態様の組成物を含む組成物が使用される。

【0184】

ある実施態様において、組成物、例えば、ＨＩＲ Ａｂ－酵素融合抗体を、同じ製剤内または別の組成物の、他の投薬と共に患者に共投与する。例えば、ここに提供する融合抗体を、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１以外の、同様にヒト血液－脳関門を通過するよう操作された組み換えタンパク質である他の融合タンパク質と製剤し得る。さらに、融合抗体を、他の大型分子または小分子と組み合わせて製剤し得る。

【実施例0185】

次の具体的実施例は、単に説明として解釈されるものであり、本開示の残りを、どうであれ限定しない。実施例１、２および３は、両方のＩｇＧドメインの高親和性結合が保持され、同時に高酵素活性が保持されるように、融合タンパク質の二機能性が保持された、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質の操作の分野における予測不可能性を示す。さらに詳述せずとも、当業者は、本明細書の記載に基づき、本実施態様をその全範囲まで使用できると考える。ここに引用するすべての刊行物は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスが記載されているとき、そのような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は移り変わるが、等価な情報をインターネットのサーチにより見つけることができると理解される。それらの引用は、このような情報の利用可能性および大衆への流布の証拠である。

【0186】

実施例１. ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質の発現および機能的分析
スライ症候群とも称される、ＭＰＳ－VIIで変異したリソソーム酵素はβ－グルクロニダーゼ(ＧＵＳＢ)である。ＭＰＳ－VIIは、脳におけるグリコサミノグリカンの蓄積をもたらし、これはリソソーム封入体を形成する。ＭＰＳ－VIIの酵素置換療法(ＥＲＴ)は、ＧＵＳＢ酵素がＢＢＢを通過しないため、脳における処置として有効ではない可能性がある。ＢＢＢを通過させるためにヒトＧＵＳＢを再操作する試みにおいて、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質プロジェクトが開始された。

【0187】

２２アミノ酸シグナルペプチドおよび１８アミノ酸カルボキシル末端プロペプチドを含む、ヒトＧＵＳＢタンパク質(NP_000172)のアミノ酸Ｍｅｔ_１－Ｔｈｒ_６５１に対応するヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡを、逆転写(ＲＴ)ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)およびカスタムオリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)によりクローン化した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分解し、ヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡに対応する約２.０kbの予測された主要な単一バンドを単離した。クローン化ヒトＧＵＳＢを真核生物発現プラスミドに挿入し、このＧＵＳＢ発現プラスミドをｐＣＤ－ＧＵＳＢと名付けた。プラスミドの発現カセット全体を双方向性ＤＮＡシーケンシングにより確認した。ＣＯＳ細胞の６ウェル形式でｐＣＤ－ＧＳＵＢでのトランスフェクションは、７日目に条件培地で高ＧＵＳＢ酵素活性をもたらし(表１、実験Ａ)、これは、機能的ヒトＧＵＳＢ ｃＤＮＡの操作の成功を確認した。ＧＵＳＢ酵素活性を、市販の４－メチルウンベリフェリルベータ－Ｌ－グルクロニド(ＭＵＧｌｃＵ)を使用する蛍光定量的アッセイで決定した。この基質はＧＵＳＢにより４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に加水分解され、４－ＭＵは、発光波長４５０nmおよび励起波長３６５nmを使用して蛍光光度計で蛍光定量的に検出される。既知量の４－ＭＵで標準曲線を構築した。アッセイを、３７℃で、ｐＨ＝４.８で６０分間インキュベーションにより実施し、グリシン－炭酸緩衝液(ｐＨ＝１０.５)添加により停止させた。

【0188】

ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のカルボキシル末端がヒトＧＵＳＢのアミノ末端に融合され、２２アミノ酸ＧＵＳＢシグナルペプチドを欠き、１８アミノ酸カルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドを欠く該融合タンパク質を発現する新規ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＵＳＢプラスミド発現プラスミドが操作された。ＧＵＳＢ ｃＤＮＡを、鋳型としてｐＣＤ－ＧＵＳＢを使用するＰＣＲによりクローン化した。順方向ＰＣＲプライマーは、オープンリーディングフレームを維持し、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端と酵素の２２アミノ酸シグナルペプチドを欠くＧＵＳＢのアミノ末端の間にＳｅｒ－Ｓｅｒリンカーを導入するため、「ＣＡ」ヌクレオチドを導入する。ＧＵＳＢ逆ＰＣＲプライマーは、成熟ヒトＧＵＳＢタンパク質の末端Ｔｈｒ直後に停止コドン、「ＴＧＡ」を導入する。ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＵＳＢの発現カセットのＤＮＡシーケンシングは、７１４ヌクレオチド(nt) サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、９nt コザック部位(GCCGCCACC)、３,２２８nt ＨＣ－ＧＵＳＢ融合タンパク質オープンリーディングフレームおよび３７０nt ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)転写終止配列を含む、４,３２１ntを含んだ。プラスミドは、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、４４３アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、２アミノ酸リンカー(Ｓｅｒ－Ｓｅｒ)および酵素シグナルペプチドおよびカルボキシル末端プロペプチドを欠く６１１アミノ酸ヒトＧＵＳＢからなる１,０７５アミノ酸タンパク質をコードした。ＧＵＳＢ配列は、ヒトＧＵＳＢ(NP_000172)のＬｅｕ^２３－Ｔｈｒ^６３３と１００％同一であった。グリコシル化がない重鎖融合タンパク質の予測分子量は１１９,３０６Daであり、７.８３の予測等電点(ｐＩ)であった。

【0189】

ＣＯＳ細胞を６ウェル培養皿に播種し、キメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＣＤ－ＬＣおよびｐＣＤ－ＨＣ－ＧＵＳＢで二重トランスフェクトした。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。しかしながら、ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＵＳＢおよびｐＣＤ－ＬＣ発現プラスミドでＣＯＳ細胞の二重トランスフェクション後、ＧＵＳＢ酵素活性の特異的増加はなかった(表１、実験Ｂ)。しかしながら、培地中の低ＧＵＳＢ活性は、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡにより決定して、培地ＩｇＧがわずか２３±２ng／mLであったため、ＨＩＲＭＡｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質の低い分泌に起因した可能性がある。それ故に、ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０×Ｔ５００プレートにスケールアップし、ＨＩＲＭＡｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＩｇＧウェスタンブロッティングは、融合タンパク質重鎖のサイズの予測された増加を示した。しかしながら、ＨＩＲＭＡｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は、６.１±０.１nmol／時間／タンパク質μgで低かった。対照的に、ヒト組み換えＧＵＳＢの比活性は２,０００nmol／時間／タンパク質μgである[Sands et al (1994) Enzyme replacement therapy for murine mucopolysaccharidosis type VII. J Clin Invest 93, 2324-2331]。これらの結果は、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性が、ＧＵＳＢのＨＩＲ ＡｂのＨＣのカルボキシル末端への融合後、＞９５％喪失したことを示した。ＨＩＲの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)へのＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質結合の親和性をＥＬＩＳＡで試験した。ＨＩＲ ＥＣＤで永久にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を無血清培地(ＳＦＭ)で増殖させ、ＨＩＲ ＥＣＤを小麦胚芽凝集素親和性カラムで精製した。ＨＩＲ ＥＣＤを９６ウェル皿に播種し、ＨＩＲ ＡｂおよびＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質のＨＩＲ ＥＣＤへの結合をビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)二次抗体、続いてアビジンおよびビオチニル化ペルオキシダーゼで検出した。５０％最大結合をもたらすタンパク質濃度、ＥＤ_５０を、非線形回帰分析により決定した。ＨＩＲ受容体アッセイは、６１１アミノ酸ＧＵＳＢのＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端への融合後、ＨＩＲに対する親和性の減少がなかったことを示した。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ Ａｂ結合のＥＤ_５０は０.７７±０.１０nMであり、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ_５０は０.８１±０.０４nMであった。

【0190】

要約すると、ＧＵＳＢのＨＩＲ Ａｂ ＨＣのカルボキシル末端への融合は、該融合タンパク質のＨＩＲへの結合の親和性を失わせなかった。しかしながら、融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は＞９５％減少した。

【0191】

ＨＩＲ ＡｂとＧＵＳＢの融合タンパク質の製造を成功させる努力において、ＧＵＳＢシグナルペプチドを含む成熟ヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端を、ＨＩＲ ＡｂのＨＣのアミノ末端に融合させる、新規アプローチが行われた。この融合タンパク質をＧＵＳＢ－ＨＩＲ Ａｂと名付けた。第一段階は、この新規融合タンパク質をコードする新規発現プラスミドの操作であり、このプラスミドをｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＨＣと名付けた。ｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＨＣプラスミドは、１９アミノ酸シグナルペプチドを欠くＨＩＲＭＡｂの重鎖(ＨＣ)のアミノ末端が２２アミノ酸ＧＵＳＢシグナルペプチドを含むが、１８アミノ酸カルボキシル末端ＧＵＳＢプロペプチドを欠くヒトＧＵＳＢのカルボキシル末端に融合された、融合タンパク質を発現する。ｐＣＤ－ＧＵＳＢベクターを、２２アミノ酸ＧＵＳＢシグナルペプチドを含むが、ＧＵＳＢカルボキシル末端で１８アミノ酸プロペプチドを欠くＧＵＳＢタンパク質を発現する、ＧＵＳＢ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ｐＣＤ－ＧＵＳＢのＧＵＳＢ １８アミノ酸カルボキシル末端プロペプチドを部位特異的変異誘発(ＳＤＭ)により欠失させた。後者は、ＧＵＳＢのＴｈｒ^６３３残基の３’フランキング領域にＡｆｅＩ部位を作り、ｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＡｆｅＩと名付けた。次いで、カルボキシル末端プロペプチドをＡｆｅＩおよびＨｉｎｄIII(ＧＵＳＢの３’非コード領域に位置)で欠失させた。１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチドを欠き、ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ停止コドンを含むＨＩＲＭＡｂ ＨＣオープンリーディングフレームを、ＰＣＲによりＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡを鋳型として作製した。ＰＣＲで作製したＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡを、ｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＡｆｅＩのＡｆｅＩ－ＨｉｎｄIII部位に挿入して、ｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＨＣを形成させた。ＧＵＳＢのカルボキシル末端とＨＩＲＭＡｂ ＨＣのアミノ末端の間のＳｅｒ－Ｓｅｒリンカーを、ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ ｃＤＮＡのクローニングに使用したＰＣＲプライマーにより、ＡｆｅＩ部位内に導入した。ｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＨＣ発現カセットのＤＮＡシーケンシングは、プラスミドが２２アミノ酸ＧＵＳＢシグナルペプチド、６１１アミノ酸ＧＵＳＢ、２アミノ酸リンカー(Ｓｅｒ－Ｓｅｒ)および４４３アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ ＨＣからなる１,０７８アミノ酸タンパク質を発現することを示した。ＧＵＳＢ配列はヒトＧＵＳＢ(NP_000172)のＭｅｔ^１－Ｔｈｒ^６３３と１００％同一であった。

【0192】

６ウェル形式でのＣＯＳ細胞のｐＣＤ－ＬＣおよびｐＣＤ－ＧＵＳＢ－ＨＣ発現プラスミドでの二重トランスフェクションは、ｐＣＤ－ＬＣおよびｐＣＤ－ＨＣ－ＧＵＳＢプラスミドでの二重トランスフェクションと比較して、７日目に条件培地で高いＧＵＳＢ酵素活性をもたらした(表１、実験Ｃ)。しかしながら、ＥＬＩＳＡにより決定して、７日条件培地における培地ヒトＩｇＧ濃度がわずか１３±２ng／mLであったため、ＧＵＳＢ－ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質もほとんどＣＯＳ細胞から分泌されなかった。ＣＯＳ細胞トランスフェクションを１０×Ｔ５００プレートにスケールアップし、ＧＵＳＢ－ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、融合タンパク質重鎖のサイズの予測された増加を示した。精製ＧＵＳＢ－ＨＩＲＭＡｂ融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は２２６±８nmol／時間／タンパク質μgと高く、これは、ＨＩＲＭＡｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質の特異的ＧＵＳＢ酵素活性より３７倍高かった。しかしながら、ＨＩＲ受容体アッセイは、ＧＵＳＢのＨＩＲＭＡｂ重鎖のアミノ末端への融合後にＨＩＲに対する親和性が顕著に減少することを示し、これは、受容体結合親和性の９５％減少をもたらした。ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ Ａｂ結合のＥＤ_５０は０.２５±０.０３nMであり、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質の結合のＥＤ_５０は４.８±０.４nMであった。

【0193】

要約すると、ＧＵＳＢのＨＩＲ Ａｂ ＨＣのアミノ末端への融合は、融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性を保持させたが、ＧＵＳＢ－ＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質のＨＩＲへの結合を９５％減少させた。対照的に、ＧＵＳＢのＨＩＲ Ａｂ ＨＣのカルボキシル末端への融合は、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＵＳＢ融合タンパク質へのＨＩＲの結合の親和性を減少させなかった。しかしながら、この融合タンパク質のＧＵＳＢ酵素活性は、＞９５％減少した。これらの発見は、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質の二機能性、例えば、ＩｇＧ部分の同族抗原への高親和性結合および高酵素活性が保持されるような方法で、リソソーム酵素のＩｇＧ分子へ融合する分野における予測不可能な性質を説明し得る。

【表1】

【0194】

実施例２. ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質の発現および機能的分析
ゴーシェ病(ＧＤ)で変異しているリソソーム酵素はβ－グルコセレブロシダーゼ(ＧＣＲ)である。
神経障害性形態のＧＤはＣＮＳに影響し、これは脳におけるＧＣＲ酵素活性の欠如により、脳細胞におけるリソソーム封入体の蓄積をもたらす。ＧＤの酵素置換療法(ＥＲＴ)は、ＧＣＲ酵素がＢＢＢを通過しないため、脳の処置に有効ではない。ＢＢＢを通過させるためにヒトＧＣＲを再操作する試みにおいて、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質プロジェクトが操作され、発現され、酵素活性について試験された。３９アミノ酸シグナルペプチドを欠くヒトＧＣＲタンパク質(NP_000148)のアミノ酸Ａｌａ_４０－Ｇｌｎ_５３６に対応するヒトＧＣＲ ｃＤＮＡは、商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＧＣＲ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠くＧＣＲオープンリーディングフレームを含む、１５２２ヌクレオチド(nt)からなった。５’末端で、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ(ＲＥ)配列を加え、３’末端で、ＧＣＲ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域からの１４ntフラグメントにＨｉｎｄIII ＲＥ部位を続けた。ＧＣＲ遺伝子内の内部ＨｉｎｄIIIおよびＳｔｕＩ部位を、アミノ酸配列を変えることなく変異させた。ＧＣＲ遺伝子は、ＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIIIを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され、ＨＩＲ Ａｂ重鎖をコードする真核生物発現プラスミドのＨｐａＩおよびＨｉｎｄIII部位に挿入され、この発現プラスミドは、ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲと名付けられた。この発現プラスミドは、ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のカルボキシル末端が、３９アミノ酸ＧＣＲシグナルペプチドを欠くヒトＧＣＲのアミノ末端に融合され、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣとＧＣＲの間に３アミノ酸リンカー(Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ)を有する融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ発現カセットの配列構造(identity)を確認した。発現カセットは、２１３４nt ＣＭＶプロモーター配列、２,８８９nt発現カセットおよび３６７ ＢＧＨポリＡ配列を含む５,３９０ntからなった。プラスミドは９６３アミノ酸タンパク質をコードし、これは、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、４４３アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、３アミノ酸リンカー(Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ)および酵素シグナルペプチドを欠く４９７アミノ酸ヒトＧＣＲからなった。ＧＣＲ配列は、ヒトＧＣＲ(NP_000148)のＡｌｓ^４０－Ｇｌｎ^５３６と１００％同一であった。グリコシル化がない重鎖融合タンパク質の予測分子量は１０４,４４０Daであり、８.４２の予測等電点(ｐＩ)である。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を６ウェル培養皿に播種し、キメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＣＤ－ＬＣおよびｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲで二重トランスフェクトした。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地をデプス濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、融合タンパク質を、ヒトＩｇＧまたはヒトＧＣＲに対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＩｇＧおよびＧＣＲ抗体何れもＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質の１３０kDa重鎖と反応した。融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性を、組み換えＧＣＲの酵素アッセイについて先に記載されたとおり(J.B. Novo, et al, Generation of a Chinese hamster ovary cell line producing recombinant human glucocerebrosidase, J. Biomed. Biotechnol., Article ID 875383, 1-10, 2012)、酵素基質として４－メチルウンベリフェリルベータ－Ｄ－グルコピラノシド(４－ＭＵＧ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイで測定した。ＧＣＲ酵素アッセイを、０.２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０.２５％タウロコール酸ナトリウム含有クエン酸／リン酸緩衝液／ｐＨ＝５.５中、５mMの最終４－ＭＵＧ濃度で実施し、３７℃で６０分間インキュベーションを実施した。０.１Ｍグリシン／０.１Ｍ ＮａＯＨを加えて、酵素活性を停止させた。ＧＣＲ酵素は、４－ＭＵＧ基質を産物、４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に変換する。アッセイ標準曲線を４－ＭＵ(０.０３～３nmol／チューブ)で作成した。酵素活性を単位／mgタンパク質として報告しており、ここで、１単位＝１μmol／分である。組み換えヒトＧＣＲの酵素活性は４０単位／mgである(Novo et al, 2012)。しかしながら、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性はわずか０.０７単位／mgであり、これは、組み換えＧＣＲの比活性と比較して９９％減少している。この研究は、短い３アミノ酸リンカーを用いるＧＣＲのＨＩＲ Ａｂの重鎖のＣ末端への融合が、ＧＣＲ酵素活性のほぼ完全な喪失をもたらすことを示した。

【0195】

ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質におけるＧＣＲ酵素活性をレスキューする可能性を、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣのＣＨ３ドメインとＧＣＲの間に３つの異なって伸びるリンカーを挿入してさらに探索した。３つの伸長リンカーは２３アミノ酸長、３１アミノ酸長または５８アミノ酸長からなり、これら発現プラスミドをそれぞれｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌ、ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－ＬＬおよびｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌ４と名付けた。ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌにおいて、リンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸に由来し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２３アミノ酸に対応する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。２３アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPSSSである。ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－ＬＬにおいて、３１アミノ酸リンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌ４において、５８アミノ酸リンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸の２反復に対応し、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ残基で離され、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。反復の何れかのコアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。５８アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。ＧＣＲ ｃＤＮＡの５’末端は、２３アミノ酸、３１アミノ酸または５８アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ ＡｂのＨＣをコードするｃＤＮＡに連結された。これらの発現プラスミドは、ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のカルボキシル末端が、３９アミノ酸ＧＣＲシグナルペプチドを欠くヒトＧＣＲのアミノ末端に、ＨＩＲ Ａｂ ＨＣのＣ末端と成熟ＧＣＲのＮ末端の間のそれぞれ２３アミノ酸、３１アミノ酸または５８アミノ酸リンカーにより融合されている、融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、３つのｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ発現カセットの配列構造を確認した。プラスミドは、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、４４３アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、２３アミノ酸、３１アミノ酸または５８アミノ酸リンカーおよび酵素シグナルペプチドを欠く４９７アミノ酸ヒトＧＣＲからなる、９８３アミノ酸、９９１アミノ酸および１,０１８アミノ酸のタンパク質をそれぞれコードした。ＧＣＲ配列は、ヒトＧＣＲ(NP_000148)のＡｌｓ^４０－Ｇｌｎ^５３６と１００％同一であった。伸長リンカーを有するＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を、キメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＣＤ－ＬＣおよびｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌ、ｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－ＬＬまたはｐＣＤ－ＨＣ－ＧＣＲ－Ｌ４で二重トランスフェクトした。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地をデプス濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、融合タンパク質を、ヒトＩｇＧまたはヒトＧＣＲに対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。伸長リンカーを有する融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性を、上記のおよび組み換えＧＣＲの酵素アッセイについて先に記載されたとおり(J.B. Novo, et al, Generation of a Chinese hamster ovary cell line producing recombinant human glucocerebrosidase, J. Biomed. Biotechnol., Article ID 875383, 1-10, 2012)、酵素基質として４－メチルウンベリフェリルベータ－Ｄ－グルコピラノシド(４－ＭＵＧ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイで測定した。ＧＣＲ酵素アッセイを、０.２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０.２５％タウロコール酸ナトリウム含有クエン酸／リン酸緩衝液／ｐＨ＝５.５中、５mMの最終４－ＭＵＧ濃度で実施し、３７℃で６０分間インキュベーションを実施した。０.１Ｍグリシン／０.１Ｍ ＮａＯＨを加えて、酵素活性を停止させた。ＧＣＲ酵素は、４－ＭＵＧ基質を産物、４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に変換する。アッセイ標準曲線を４－ＭＵ(０.０３～３nmol／チューブ)で作成した。酵素活性を単位／mgタンパク質として報告しており、ここで、１単位＝１μmol／分である。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ－Ｌ、－ＬＬまたは－Ｌ４融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性は、組み換えＧＣＲの比活性のわずか＜５％であった。これらの結果は、ＧＣＲの重鎖(ＨＣ)ＩｇＧのＣ末端への融合は、２３～５８アミノ酸長の長いリンカーでも、ＧＣＲ酵素活性のほぼ完全な喪失をもたらすことを示す。

【0196】

ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質におけるＧＣＲ酵素活性をレスキューするさらなる試みにおいて、ヒトＧＣＲ ｃＤＮＡが、３１アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)のＣ末端に融合している他の構築物を操作した。３９アミノ酸シグナルペプチドを欠くヒトＧＣＲタンパク質(NP_000148)は、商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＧＣＲ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠く、ＧＣＲオープンリーディングフレームを含む１５２２ヌクレオチド(nt)からなった。ＧＣＲ ｃＤＮＡの５’末端を、３１アミノ酸リンカーを介して、ＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする７０２nt ｃＤＮＡに結合した。このリンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。発現ベクターの３’非翻訳領域からの１８ntフラグメントを３’末端に付加し、ＰｍｅＩ ＲＥ部位が続いた。融合タンパク質ｃＤＮＡの５’末端はＥｃｏＲＩ部位、続いて発現ベクターの５’非翻訳領域の５nt、続いて完全コザック部位(GCCGCCACC)を含む。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＣＲをコードする人工遺伝子は２,３３５塩基対からなり、それは、商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＣＲ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され、それぞれＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡ領域が隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入し、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＣＲと名付けた発現プラスミドを形成させた。この発現プラスミドは、ＨＩＲ ＡｂのＬＣのカルボキシル末端が３９アミノ酸ＧＣＲシグナルペプチドを欠くヒトＧＣＲのアミノ末端に、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣとＧＣＲの間の３１アミノ酸リンカー(SSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSS)で融合している融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、ｐＨＩＲ－ＬＣ－ＧＣＲ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、９コザック部位、２,２８９nt融合タンパク質ｃＤＮＡおよび２９１ ＢＧＨポリＡ配列を含む４,４４４ntからなった。プラスミドは、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、２１４アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ、３１アミノ酸リンカーおよび酵素シグナルペプチドを欠く４９７アミノ酸ヒトＧＣＲを含む７６２アミノ酸からなるＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質をコードした。ＧＣＲ配列は、ヒトＧＣＲ(NP_000148)のＡｌｓ^４０－Ｇｌｎ^５３６と１００％同一であった。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＣＲおよびキメラＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)であるＨＩＲ Ａｂ ＨＣをコードする発現プラスミドで二重トランスフェクトした(図２)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣはＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の４４３アミノ酸配列をコードする。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣをコードする２,３２８nt配列は、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする２,３１６nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧおよびヒトＧＣＲに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性を、上記のとおり４－メチルウンベリフェリルベータ－Ｄ－グルコピラノシド(４－ＭＵＧ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイにより測定した。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性は、組み換えＧＣＲの比活性のわずか＜５％であった。これらの組み合わせた結果は、リソソーム酵素、ＧＣＲの種々の長さのリンカーを用いるＩｇＧのＨＣまたはＬＣのＣ末端への融合が、酵素活性をほぼ欠くＩｇＧ－酵素融合タンパク質をもたらすことを示す。

【0197】

ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質におけるＧＣＲ酵素活性を保持する努力を続ける中で、シグナルペプチドを含むヒトＧＣＲを、ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のＮ末端に、ＧＣＲのＣ末端と抗体ＨＣのＮ末端の間の５６アミノ酸リンカーを介して、融合させた他の構築物を再操作した。NP_000148に提供されるＧＣＲの３９アミノ酸シグナルペプチドを含むヒトＧＣＲタンパク質の配列、続いて下記５６アミノ酸リンカー、続いて重鎖シグナルペプチドを伴う４４３アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ重鎖をコードする、カスタム遺伝子を合成した。この遺伝子は、プロモーター領域のＥｃｏＲＩ部位部分および完全長コザック部位を含む２０ntの５’フランキング領域を含む。３’フランキング領域で、遺伝子は、ＢＧＨポリＡ部位に対応する２９１nt、続いてＮｈｅＩ部位を含む３０ntの非翻訳領域を含む。３,４４９nt遺伝子は、商業的ベンダーによりカスタム合成された。５６アミノ酸リンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来するヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸の２反復に対応し、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ残基により離され、アミノ末端はＳｅｒ残基およびカルボキシル末端はＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。何れかの反復のコアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。５６アミノ酸リンカーの配列はSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。ＧＣＲ－ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ遺伝子は、ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され、ＣＭＶプロモーターが隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入され、ｐＧＣＲ－ＨＩＲ－Ａｂ－ＨＣと名付けられた発現プラスミドが形成された。ＤＮＡシーケンシングで、ｐＧＣＲ－ＨＩＲ－Ａｂ－ＨＣ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、９nt コザック部位、３,１０８nt融合タンパク質ｃＤＮＡおよび２９１ ＢＧＨポリＡ配列を含む５,２６３ntからなった。プラスミドは、３９アミノ酸ＧＣＲシグナルペプチド、４９７アミノ酸ＧＣＲ、５６アミノ酸リンカーおよびＩｇＧシグナルペプチドを欠く４４３アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＨＣからなる１,０３５アミノ酸ＧＣＲ－ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ融合タンパク質をコードした。ＧＣＲ配列は、ヒトＧＣＲ(NP_000148)のＭｅｔ^１－Ｇｌｎ^５３６と１００％同一であった。ＧＣＲ－ＨＩＲ Ａｂ ＨＣ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ＧＣＲ－ＨＩＲ Ａｂ ＨＣおよびキメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)であるＨＩＲ Ａｂ ＬＣをコードする発現プラスミドで二重トランスフェクトした(図２)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＬＣは、ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣタンパク質の２３４アミノ酸配列をコードする。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣをコードする７１４nt配列は、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする７０５nt配列、続いてＴＡＧ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＣＲ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧおよびヒトＧＣＲに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性を、上記のとおり４－メチルウンベリフェリルベータ－Ｄ－グルコピラノシド(４－ＭＵＧ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイにより測定した。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＣＲ融合タンパク質のＧＣＲ酵素活性は、組み換えＧＣＲの比活性のわずか＜７％であった。酵素活性ＩｇＧ－ＧＣＲ融合タンパク質の操作におけるこれらの組み合わせた結果は、ＧＣＲが３アミノ酸、２３アミノ酸、３１アミノ酸、５６アミノ酸または５８アミノ酸の範囲の種々のリンカーでＩｇＧのＨＣまたはＬＣのＣ末端またはＮ末端に融合された、５つの異なる構築物の操作を記載する。全例で、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質は酵素活性をほぼ欠如した。

【0198】

実施例３. ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質の発現および機能的分析
クラッベ病(ＫＤ)で変異するリソソーム酵素はガラクトセレブロシダーゼ(ＧＡＬＣ)である。ＫＤは、スフィンゴ脂質の代謝異常を含む神経系の髄鞘に影響する、稀な神経変性障害である。ＫＤの酵素置換療法(ＥＲＴ)は、ＧＡＬＣ酵素がＢＢＢを通過しないため、脳の有効な処置ではない。ＢＢＢを通過させるためにヒトＧＡＬＣを再操作する試みにおいて、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質プロジェクトが操作され、発現され、酵素活性について試験された。ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡは、４２アミノ酸シグナルペプチドを欠くヒトＧＡＬＣタンパク質(NM_000153)のアミノ酸Ｔｙｒ_４３－Ａｒｇ_６８５に対応する。ＧＡＬＣ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠くＧＡＬＣオープンリーディングフレームを含む１,９３２ヌクレオチド(nt)からなった。ＧＡＬＣ ｃＤＮＡの５’末端は、３１アミノ酸リンカーを介して、ＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする７０２nt ｃＤＮＡに結合された。このリンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。発現ベクターの３’非翻訳領域からの１８ntフラグメントを３’末端に付加し、ＰｍｅＩ ＲＥ部位が続いた。融合タンパク質ｃＤＮＡの５’末端はＥｃｏＲＩ部位、続いて発現ベクターの５’非翻訳領域の５nt続いて完全コザック部位(GCCGCCACC)を含む。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＧＡＬＣをコードする人工遺伝子は２,７７６塩基対からなり、それは、商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＡＬＣ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され、それぞれＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡ領域が隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入し、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＡＬＣと名付ける発現プラスミドを形成させた。この発現プラスミドは、ＨＩＲ ＡｂのＬＣのカルボキシル末端が、４２アミノ酸ＧＡＬＣシグナルペプチドを欠くヒトＧＡＬＣのアミノ末端に、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣとＧＡＬＣの間の３１アミノ酸リンカー(SSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSS)で融合された、融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、ｐＨＩＲ－ＬＣ－ＧＡＬＣ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、２,７３６nt融合タンパク質ｃＤＮＡおよび２９４ ＢＧＨポリＡ配列を含む４,８８５ntからなった。プラスミドは、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、２１４アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ、３１アミノ酸リンカーおよび酵素シグナルペプチドを欠く６４３アミノ酸ヒトＧＡＬＣからなる９０８アミノ酸ＬＣ－ＧＡＬＣ融合タンパク質をコードした。ＧＡＬＣ配列は、ヒトＧＡＬＣタンパク質(NM_000153)のＴｙｒ_４３－Ａｒｇ_６８５と１００％同一であった。グリコシル化されていない軽鎖融合タンパク質の予測分子量は９９,３６３Daであり、５.８の予測等電点(ｐＩ)である。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＧＡＬＣおよびキメラＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)であるｐＨＩＲ Ａｂ ＨＣをコードする発現プラスミドで二重トランスフェクトした(図２)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣは、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の４４３アミノ酸配列をコードする。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣをコードする２,３２８nt配列は、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする２,３１６nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、これは、それぞれ１１５kDaおよび５５kDaの分子量で移動する、予測した軽鎖－ＧＡＬＣ融合および融合タンパク質の重鎖を示した。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧおよびヒトＧＡＬＣに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。融合タンパク質のＧＡＬＣ酵素活性を、組み換えＧＡＬＣの酵素アッセイについて先に記載されたとおり(Meng et al., Proc Natl Acad Sci, 107:7886-91, 2010)、４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド(ＭＵＧＰ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイで測定した。ＧＡＬＣ酵素アッセイを、０.２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液／ｐＨ＝４.５で最終０.５mM濃度のＭＵＧＰで実施し、３７℃で２０分間インキュベーションを実施した。０.２５ Ｍグリシン／０.１５ Ｍ ＮａＯＨを加えて、酵素活性を停止させた。ＧＡＬＣ酵素は、ＭＵＧＰ基質を産物、４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)に変換する。アッセイ標準曲線を、４－ＭＵ(０.０１～３nmol／チューブ)で作成した。酵素活性を単位／mgタンパク質として報告し、ここで、１単位＝１nmol／分である。ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質の酵素活性を、市販の組み換えヒトＧＡＬＣと同じ酵素アッセイで比較した。ヒト組み換えＧＡＬＣは、１８４５単位／mgの高酵素活性を有した。しかしながら、ＧＡＬＣＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質の酵素活性はわずか１３.３単位／mgであり、これは、組み換えＧＡＬＣの比活性と比較して、９９％減少である。

【0199】

ＨＩＲ Ａｂ－ＧＡＬＣ融合タンパク質におけるＧＡＬＣ酵素活性をレスキューする試みにおいて、シグナルペプチドを含むヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡを、３１アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)のＮ末端に融合させた他の構築物を再操作した。ｃＤＮＡは、酵素(NM_000153)の４２アミノ酸シグナルペプチドを含むヒトＧＡＬＣタンパク質、続いて３１アミノ酸リンカー、続いてＬＣシグナルペプチドがないＨＩＲ－Ａｂ ＬＣの２１４アミノ酸配列をコードした。この遺伝子は、プロモーター領域のＥｃｏＲＩ部位部分および完全長コザック部位を含む２０ntの５’フランキング領域を含む。３’フランキング領域で、遺伝子は、ＢＧＨポリＡ部位の部分に対応する２９nt、続いてＰｍｅＩ部位を含む３０ntの非翻訳領域を含む。２,８４２nt遺伝子は、商業的ベンダーによりカスタム合成された。３１アミノ酸リンカーは、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含む２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され、ＣＭＶプロモーターが隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入され、ｐＧＡＬＣ－ＨＩＲ－Ａｂ－ＬＣと名付けられた発現プラスミドを形成する。この発現プラスミドは、ＧＡＬＣのカルボキシル末端が、２０アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣシグナルペプチドを欠くＨＩＲ Ａｂ ＬＣのアミノ末端に、ＧＡＬＣとＨＩＲ Ａｂ ＬＣの間の３１アミノ酸リンカーで融合された、融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングは、ｐＧＡＬＣ－ＨＩＲ－Ａｂ－ＬＣ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、９nt コザック部位、２７,９３nt融合タンパク質ｃＤＮＡおよび２９４ ＢＧＨポリＡ配列を含む４,９５１ntからなった。プラスミドは、４２アミノ酸ＧＡＬＣシグナルペプチド、６４３アミノ酸ＧＡＬＣ、３１アミノ酸リンカーおよびＩｇＧシグナルペプチドを欠く２１４アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣからなる、９３０アミノ酸ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ融合タンパク質をコードした。ＧＡＬＣ配列は、ヒトＧＡＬＣ(NM_000153)のＭｅｔ_１－Ａｒｇ_６８５と１００％同一であった。ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ ＬＣおよびキメラＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)であるＨＩＲ Ａｂ ＨＣをコードする発現プラスミドで二重トランスフェクトした(図２)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣは、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の４４３アミノ酸配列をコードする。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣをコードする２,３２８nt配列は、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする２,３１６nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質の純度を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ融合タンパク質を、ヒトＩｇＧおよびヒトＧＡＬＣに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ融合タンパク質のＧＡＬＣ酵素活性を、上記のとおり４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド(ＭＵＧＰ)を使用する蛍光定量的酵素アッセイで測定した。ＧＡＬＣ－ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ融合タンパク質のＧＡＬＣ酵素活性は、組み換えＧＡＬＣの比活性のわずか＜５％であった。これらの組み合わせた結果は、ＩｇＧのＬＣのＣ末端またはＮ末端へのリソソーム酵素、ＧＡＬＣの融合は、酵素活性をほとんど欠くＩｇＧ－酵素融合タンパク質をもたらすことを示した。

【0200】

実施例１、２および３は、ＩｇＧ－リソソーム酵素融合タンパク質操作の分野での予測可能性の欠如を示す。ＧＵＳＢの場合、酵素活性は、ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のＣ末端(ＣＴ)への融合後失われた。逆に、酵素活性は、ＧＵＳＢのＨＩＲ ＡｂのＨＣのアミノ末端(ＮＴ)への融合後保持されたが、この場合、ヒトインスリン受容体(ＨＩＲ)に対する抗体の結合活性の＞９５％が失われた。ＨＩＲへの結合喪失は、標的抗原に結合するＣＤＲ領域が、ＨＣまたは軽鎖(ＬＣ)のＮＴ付近に位置するためであろう可能性がある。３アミノ酸から５８アミノ酸範囲の種々の長さのリンカーを用いるＨＩＲ ＡｂのＨＣまたはＬＣのＮＴまたはＣＴへのＧＣＲの融合の場合、ＧＣＲ酵素活性の＞９５％の喪失があった。ＧＡＬＣの場合、酵素を、３１アミノ酸長リンカーで抗体のＬＣのＣＴまたはＮＴに融合させたが、これは何れの構築物でも酵素活性のほぼ完全な喪失をもたらした。本発明において、各酵素のＨＩＲ Ａｂ重鎖または軽鎖のカルボキシル末端への融合後、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１活性が保持されるとの予測されない観察がなされた(図２、１５、２４)。

【0201】

実施例４. ＨＩＲ Ａｂ軽鎖－ＨＥＸＡ融合タンパク質発現プラスミドＤＮＡの遺伝子操作
ＴＳＤで変異しているリソソーム酵素はＨＥＸＡである。ＨＥＸＡの喪失は、脳におけるＧ_Ｍ２ガングリオシドの蓄積をもたらす。ＴＳＤの酵素置換療法は、Desnick RJ and Kaback MM (Advances in genetics: Tay-Sachs disease. Advances in Genetics Series. Vol 44. San Diego, CA: Academic Press; 2001)に記載のとおり、ＨＥＸＡ酵素がＢＢＢを通過できないため、脳の処置に有効ではない。ＨＥＸＡを、ＢＢＢの通過と酵素活性発揮両方が可能な二機能性分子を開発するために、ＨＩＲ Ａｂと融合させた。ある実施態様において、成熟ＨＥＸＡのアミノ末端を、ＨＩＲ Ａｂの各軽鎖のカルボキシル末端と融合させる(図２)。

【0202】

ＨＥＸＡの酵素活性が、ＨＩＲ Ａｂに融合されたとき保持されるか、不明であった。実施例１、２および３に記載したＩｇＧ－ＧＵＳＢ、ＩｇＧ－ＧＣＲおよびＩｇＧ－ＧＡＬＣ融合タンパク質での経験は、本技術の予測不可能な性質およびＩｇＧ部分またはリソソーム酵素部分が、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質の構築後、生物学的活性を喪失する可能性を説明し得る。ヒトＨＥＸＡ ｃＤＮＡは、２２アミノ酸シグナルペプチドを欠くヒトＨＥＸＡタンパク質(accession # NP_000511)のアミノ酸Ｌｅｕ－２３～Ｔｈｒ－５２９に対応する。ＨＥＸＡ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠くＨＥＸＡオープンリーディングフレームを含む、１,５２４ヌクレオチド(nt)からなった(配列番号１１)。ＨＥＸＡ ｃＤＮＡの５’末端を、３１アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする７０２nt ｃＤＮＡに結合した。このリンカーは、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含み、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSであり、配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５に対応する。発現ベクターの３’非翻訳領域からの１８ntフラグメントを３’末端に付加し、ＰｍｅＩ ＲＥ部位が続いた。融合タンパク質ｃＤＮＡの５’末端は、ＥｃｏＲＩ部位、続いて発現ベクターの５’非翻訳領域の５nt続いて完全コザック部位(GCCGCCACC)を含む。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＨＥＸＡをコードする人工遺伝子は２,３６５塩基対からなり、それは商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により示されるとおり、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され(図３)、それぞれ、ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡ領域が隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入された(図４)。この発現プラスミドはｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡと名付けられた。この発現プラスミドは、ＨＩＲ ＡｂのＬＣのカルボキシル末端が、２２アミノ酸ＨＥＸＡシグナルペプチドを欠くヒトＨＥＸＡのアミノ末端に、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣとＨＥＸＡの間の３１アミノ酸リンカーで融合された融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、２,３２８nt発現カセットおよび２９１ ＢＧＨポリＡ配列を含む６,２４１ntからなった。プラスミドは、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、２１４アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ、３１アミノ酸リンカーおよび酵素シグナルペプチドを欠く５０７アミノ酸ヒトＨＥＸＡからなる７７２アミノ酸タンパク質をコードした。ＨＥＸＡ配列は、ヒトＨＥＸＡタンパク質(accession # NP_000511)のＬｅｕ２３－Ｔｈｒ５２９と１００％同一であった。グリコシル化がないＬＣ融合タンパク質の予測分子量は８４,８７０Daであり、予測等電点(ｐＩ)は５.０６である。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡの発現ベクターは、タンデムでジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)欠損ＣＨＯ細胞での安定なトランスフェクタントの産生に使用されるＤＨＦＲの発現カセットも含む(図４)。ＤＨＦＲ選択タンパク質の１８７アミノ酸配列を配列番号１６に示す。ＤＨＦＲをコードする５７３nt配列を配列番号１５に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする５６１nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。

【0203】

ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡおよびキメラＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＨＩＲ Ａｂ ＨＣで二重トランスフェクトした(図４)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣは、シグナルペプチドを含むＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の４６２アミノ酸配列をコードし、配列番号７のアミノ酸配列に対応する。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣをコードする１,３９８nt配列を配列番号１２に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする１,３８６nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0204】

実施例５. ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の重鎖および軽鎖両方をコードする発現ベクターでのチャイニーズハムスター卵巣細胞の安定なトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞１×ＨＴサプリメント(ヒポキサンチンおよびチミジン)含有無血清ＣＨＯユーティリティ培地で増殖させた。ＣＨＯ細胞(５×１０^６ 生存可能細胞)を、２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡおよび２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣプラスミドＤＮＡで共電気穿孔した(図４)。細胞－ＤＮＡ懸濁液を、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を、２５msecおよび１６０ボルトのパルスで矩形波エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション(ＥＰ)後、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を５０ml培養培地に移し、４×９６ウェルプレートのウェルあたり１２５μl(１０,０００細胞／ウェル)で播種した。ＥＰ後、ＣＨＯ細胞を３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに入れた。発現ベクターにおけるネオマイシン耐性(ｎｅｏ)遺伝子の存在により(図４)、トランスフェクト細胞株をまずＧ４１８で選択した。ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＨＥＸＡはＤＨＦＲの遺伝子も発現し(図４)、よって、トランスフェクト細胞を２０nM メトトレキサート(ＭＴＸ)およびＨＴ欠損培地でも選択した。ＥＰ約２１日後可視コロニーが検出されたら、条件培地をＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧのためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡで高ヒトＩｇＧシグナルのウェルを、９６ウェルプレートから１mLのＣＨＯユーティリティ無血清培地を含む２４ウェルプレートに移した。２４ウェルプレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。翌週ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを２４ウェルプレートのクローンで実施した。これを、６ウェルプレートからＴ７５フラスコを経て、最後に６０mLおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で繰り返した。この段階で、最終ＭＴＸ濃度は８０nMであり、培地中のＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の指標であった培地ＩｇＧ濃度は、１０^６／mLの細胞密度で＞１０mg／Ｌである。希釈クローニング(ＤＣ)のために選択したクローンをインキュベーターのオービタルシェーカーから除き、無菌フードに移した。細胞を、５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地で５００mLに希釈し、最終希釈は８細胞／mLであり、よって、４０×９６ウェルプレートの４,０００ウェルに、１細胞／ウェル(ＣＰＷ)の細胞密度で播種できた。細胞懸濁液が調製されたら、無菌フード内で、１２５μLアリコートを、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。プレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。１細胞／ウェルまで希釈した細胞は、血清なしでは生存できない。６日または７日目、ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、各ウェルに５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)を含む１２５μlのＦ－１２Ｋ培地を加えた。この選択培地は、その段階で５％ｄ－ＦＢＳ、３０nM ＭＴＸおよび０.２５mg／mL ジェネテシンを含んだ。初期１ＣＰＷプレーティング後２１日目、４,０００ウェルの各々からのアリコートを、ロボット装置を使用してヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡのために採った。ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μlの培地を採り、新しい無菌サンプル９６ウェルプレートに移した。初期１ＣＰＷプレーティング後２０日目、４０×９６ウェル免疫アッセイプレートに、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中一次抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧの１μg／mL溶液１００μLを播種した。プレートを、４℃冷蔵庫で一夜インキュベートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μLの二次抗体の１μg／mL溶液および遮断緩衝液を加えた。プレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄する。０.１Ｍグリシン緩衝液中の１００μLの１mg／mLの４－ニトロフェニルリン酸ジ(２－アミノ－２－エチル－１,３－プロパンジオール)塩を９６ウェル免疫アッセイプレートに加える。プレートをマイクロプレートリーダーで読んだ。アッセイは、４,０００ウェル／実験についてＩｇＧアウトプットデータを作成した。産生が最高であった２４～４８ウェルをさらなる伝播に使用した。１ＣＰＷ ＤＣからの産生が最高であった２４ウェルプレートを無菌フードに移し、６ウェル皿を経て、Ｔ７５フラスコおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で二重サブクローン化した。この工程中、細胞の血清を遠心分離の最終段階で０まで減らし、無血清培地(ＳＦＭ)に再懸濁した。上記工程を、０.５～１細胞／ウェル(ＣＰＷ)で第二ラウンドの希釈クローニングで繰り返した。この段階で、ウェルの約４０％が何らかの細胞増殖を示し、増殖を示す全ウェルがヒトＩｇＧも分泌した。これらの結果は、これらの方法で平均してウェルあたり１細胞のみが播種され、ＣＨＯ細胞株が単一細胞に由来することを確認した。希釈クローニング(ＤＣ)方法を、第二ラウンドのＤＣについて上記のとおり繰り返した。この第二ラウンドＤＣから産生された細胞株を、マスター細胞銀行の産生のために後に使用する、目録細胞銀行の製造に使用した。

【0205】

実施例６. 二機能的ＩｇＧ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＨＩＲ結合およびＨＥＸＡ活性の分析
ＣＯＳ由来ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質(ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡとも称する)を、図１０に示すとおり、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーでの精製後、還元ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)により純度を評価した。ＨＣおよびＬＣタンパク質のみがＨＩＲＭＡｂ単独またはＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質で検出される。ＨＩＲＭＡｂ単独について、高分子量(ＭＷ)バンドがＨＣであり、低ＭＷバンドがＬＣである。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質について、高ＭＷバンドはＬＣ－ＨＥＸＡ融合タンパク質であり、低ＭＷバンドはＨＣである。融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ(図１１、左パネル)またはヒトＨＥＸＡ(図１１、右パネル)に対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ重鎖および軽鎖の分子量(ＭＷ)を、ＭＷ標準の移動に基づく線形回帰により推定する。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合軽鎖のサイズ１０２kDaは、ＨＥＸＡのＨＩＲＭＡｂ軽鎖への融合により、ＨＩＲＭＡｂ単独の軽鎖のサイズ２６kDaより大きい。重鎖のサイズ５７kDaは、ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂ単独両者で、両タンパク質が同じ重鎖を使用するため、同一である。図２に示すヘテロ四量体ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の推定ＭＷは、ウェスタンブロットのＳＤＳ－ＰＡＧＥの移動に基づき、３１８kDaである。ＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に対する融合タンパク質の親和性をＥＬＩＳＡで決定した。Coloma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に先に記載のとおり、ＨＩＲ ＥＣＤで永久にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を無血清培地(ＳＦＭ)で増殖させ、ＨＩＲ ＥＣＤを小麦胚芽凝集素親和性カラムで精製した。ＨＩＲ ＥＣＤをNunc-Maxisorb ９６ウェル皿に播種し、ＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＨＩＲ ＥＣＤへの結合を、二次抗体、続いてアルカリホスファターゼ検出剤との結合により検出した。５０％最大結合をもたらすＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の濃度、ＥＤ_５０を非線形回帰分析により決定した。ＨＩＲへのＨＩＲＭＡｂ結合のＥＤ_５０は３４±３ng／mLであり、ＨＩＲへのＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質結合のＥＤ_５０は１１２±１８ng／mLであり(図１２)。ＨＩＲ ＡｂのＭＷは１５０kDaであり、ＨＩＲ Ａｂ－融合タンパク質のＭＷは３１８kDaである。それ故に、ＭＷ差異で正規化後、キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－融合タンパク質のＨＩＲ ＥＣＤに対する結合は同等であり、それぞれ０.２３±０.０２nMおよび０.３５±０.０６nMのＥＤ_５０であった(図１２)。これらの発見は、ＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質結合に対する親和性は、ＩｇＧの両軽鎖のカルボキシル末端へのＨＥＸＡ分子の融合にかかわらず、ＨＩＲへのＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質結合の親和性が保持されることを示す(図２)。

【0206】

ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質を産生するＣＨＯ系統を、上記のとおり２ラウンドのＤＣ後ＣＨＯ細胞から産生した。目録細胞株を、オービタルシェーカー上、２Ｌ振盪フラスコ中ＳＦＭで増殖させ、ＣＨＯ由来融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＣＨＯ由来融合タンパク質の純度および構成をそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびヒトＩｇＧ／ヒトＨＥＸＡウェスタンブロッティングにより評価し、結果はそれぞれ図１０および図１１に示すものと同等である。ＣＨＯ由来融合タンパク質の効力を、上記のとおりＨＩＲ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡで評価した。ＨＩＲ ＥＣＤへのＣＨＯ由来融合タンパク質の飽和性結合のＥＤ_５０は１２２±１５ng／mLであり、これは、上記のとおり、３１８kDaの融合タンパク質のＭＷを仮定して、０.３８±０.０５のＥＣ_５０に等しい。

【0207】

ＨＥＸＡ酵素活性を、Dewji (1986): Purification and characterization of β-N-acetylhexosaminidase I₂ from human liver, Biochem J., 234: 157-162により開発された蛍光定量的アッセイで決定した。このアッセイは、４－メチルウンベリフェリルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド(４－ＭＵＧ)としても知られる４－メチルウンベリフェリル－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシドを基質として使用する。この基質は商業的に入手可能であり、基質の構造を図１３Ａに概説する。この基質はＨＥＸＡにより４－メチルウンベリフェロン(４－ＭＵ)を加水分解し、アッセイにおける産物の産生が蛍光定量的に決定される。アッセイを、ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質(１０～１００ng／チューブ)および４ＭＵＧ基質を、１００mM クエン酸ナトリウム／０.２５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液／ｐＨ＝４.５で３７℃で２０分間インキュベートすることにより実施した。０.５Ｍグリシン／ＮａＯＨ／ｐＨ＝１０.７を加えて、反応停止させた。蛍光を、３６５nm励起フィルターおよび４５０nm吸収フィルターを備えた蛍光光度計で測定した。標準曲線を、０.００１～１.０nmol／チューブの４－ＭＵ産物で作成し、これは、蛍光単位のnmol／チューブへの変換を可能とした(図１３Ｂ)。酵素活性を、ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の単位／mgタンパク質として測定し、ここで、１ミリ単位＝インキュベーション１分あたり形成される４－ＭＵ産物の１nmolである。アッセイは、融合タンパク質の質量に関して直線的であった(図１３Ｂ)。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＨＥＸＡ酵素活性は、市販組み換えヒトＨＥＸＡの活性と同等であった(表２)。

【表2】

実験１および２両方で、融合タンパク質のＨＥＸＡ酵素活性は組み換えＨＥＸＡの酵素活性と等しかった。プロテインＡ精製ＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＨＥＸＡ酵素活性は、ＭＵＧＳ基質を使用して、ＣＯＳ由来融合タンパク質の活性より高く(表２)、１,９３１±３２３nmol／分／mgタンパク質であった。

【0208】

ＨＥＸＡは、ヘキソサミニダーゼのアルファサブユニットであり、ベータサブユニット、ＨＥＸＢとヘテロ－二量体を形成する。ＨＥＸＡサブユニットのみがアニオン性Ｇ_Ｍ２ガングリオシド基質が結合するカチオン性溝を有し、ＨＥＸＡサブユニットのみが４－メチルウンベリフェリル－７－(６－スルホ－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド(４－ＭＵＧＳである)アニオン性４－ＭＵＧアナログ基質と結合し、このアニオン性基質の構造を図１４Ａに示す。酵素アッセイは、４－ＭＵＧＳ基質を使用したとき、融合タンパク質の質量に関して直線的であった(図１４Ｂ)。２つの実験で、４－ＭＵＧＳ基質に対するＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の酵素活性は、組み換えＨＥＸＡと比較して高かった(表２)。それ故に、ＨＥＸＡのＨＩＲ ＡｂのＬＣのカルボキシル末端への融合は、ＩｇＧ－ＧＵＳＢ、ＩｇＧ－ＧＣＲおよびＩｇＧ－ＧＡＬＣ融合タンパク質(実施例１、２および３)で見られた結果と対照的に、ＨＥＸＡ酵素の酵素活性に最小の影響を有した。

【0209】

実施例７. ＨＥＸＡとターゲティング抗体を結合するアミノ酸リンカー
成熟ヒトＨＥＸＡを、ターゲティング抗体のＬＣのカルボキシル末端に３１アミノ酸リンカーで融合させる(図９で下線)。このリンカー配列は、配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５に対応する(図９)。あらゆる数のバリエーションのリンカーを、アミノ酸配列およびアミノ酸長両方の観点で、本リンカーの代替として使用し得る。このようなリンカーは、融合タンパク質の操作における最適アミノ酸リンカーの決定のための複数の公開された利用可能なプログラムが存在することから、当分野で周知である。頻繁に利用されるリンカーは、(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_ｎまたは他の異形など反復配列中に種々の組み合わせでＧｌｙおよびＳｅｒを含む。このようなリンカーを、ＨＥＸＡをターゲティング抗体のＬＣのアミノ末端に融合するときまたはＨＥＸＡをターゲティング抗体のＨＣのカルボキシ末端に融合するときまたはＨＥＸＡをターゲティング抗体のＨＣのアミノ末端に融合するときまたはＨＥＸＡを一本鎖ターゲティング抗体のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合するときにも使用し得る。

【0210】

実施例８. ヒト脳へのＨＥＸＡの受容体介在送達
テイ・サックス病(ＴＳＤ)は、早逝の原因となる極めて重篤な神経変性遺伝性疾患である。多くのこのようなリソソーム蓄積症は、組み換え酵素発現後、酵素置換療法(ＥＲＴ)で処置される。ヒトＨＥＸＡ酵素の配列が知られてから、３０年を超える[Myerowitz et al (1975): Human beta-hexosaminidase alpha chain: coding sequence and homology with the beta chain, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 7830-7834]。しかしながら、他のリソソーム酵素と同様ＨＥＸＡ酵素はＢＢＢを通過しないため、ＥＲＴは利用可能となっていない。ＢＢＢを通過させる試みにおいて、組み換え酵素は、脳の脳脊髄液(ＣＳＦ)区画への直接注射を経る髄腔内(ＩＴ)送達により与えられる。一般に、酵素は、腰部ＣＳＦ腔に注射される。ＩＴ送達経路は、酵素が血液プールに急速にさらされるため、有効であるとは予測されない。ヒトにおいてＣＳＦ体積全体が１日４～５回ターンオーバーすることが周知である。ＣＳＦ内に注射された薬物は遅い静脈内注射と等しく、薬物は、脳の脳室上皮表面にのみ分配される。初期の研究は、ＨＥＸＡのＩＴ注射でＴＳＤを処置する試みが無駄であることを示した(von Sprecht et al, Enzyme replacement in Tay-Sachs disease, Neurology, 29: 848-854, 1979)。ＴＳＤを有する患者を、腰部ＣＳＦへのＨＥＸＡのＩＴ注射で処置した。しかしながら、酵素はＣＳＦから急速に消えて血液に入り、Ｔ１／２はわずか３０分であった。ＩＴ注射後脳のＧ_Ｍ２ガングリオシド封入体は減少しなかった。ＨＥＸＡを静脈内(ＩＶ)注射したとき、血中Ｇ_Ｍ２ガングリオシドは減少し、酵素の生物学的活性は示された。ＩＴ ＨＥＸＡでの脳の処置の失敗は、活性酵素ではなく、送達問題によるものであった。ＴＳＤ患者の脳へのＨＥＸＡの送達の好ましいアプローチは、受容体介在輸送(ＲＭＴ)を介してＢＢＢを送達するよう再操作された形態のＨＥＸＡの静脈内(ＩＶ)点滴である。ＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質は、ヒトインスリン受容体に対する高親和性結合を保持し、これによりＨＥＸＡがＢＢＢを浸透し、内在性ＢＢＢインスリン受容体上のＲＭＴを介して血液から脳に入ることを可能とする。ＨＩＲ Ａｂ－リソソーム酵素融合タンパク質の脳取り込みは、脳あたり注射用量(ＩＤ)の１％である[Boado et al (2013) Blood-brain barrier molecular Trojan horse enables brain imaging of radioiodinated recombinant protein in the Rhesus monkey. Bioconj. Chem., 24:1741-1749]。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の治療用量が３mg／kgであり、体重が５０kgであり、酵素比活性が２,５００ミリ単位／mg(表２)であるならば、融合タンパク質の点滴用量(ＩＤ)は３７５,０００ミリ単位である。ＩＤの１％の融合タンパク質の脳取り込みを仮定して、脳ＨＥＸＡ酵素活性は、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＩＶ点滴後、１０００グラムヒト脳あたり３,７５０ミリ単位または３.７ミリ単位／グラムである。４－ＭＵＧＳアッセイで決定して(図１４)、正常脳における内在性ＨＥＸＡ酵素活性は１０.８nmol／時間／mgタンパク質である[Bradbury et al, Neurodegenerative lysosomal storage disease in European Burmese cats with hexosaminidase β-subunit deficiency, Molec Genet Metab, 97: 53-59]。このレベルの脳ＨＥＸＡ酵素活性は、１８ミリ単位／１００mg 脳タンパク質に等しく、ここで、１ミリ単位＝１nmol／分である。脳１グラムあたり１００mgタンパク質と仮定して、脳ＨＥＸＡ酵素活性は１８ミリ単位／グラムである。それ故に、３mg／kgのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質のＩＶ点滴後に産生されるＨＥＸＡ酵素活性、３.７ミリ単位／グラムは、脳における正常ＨＥＸＡ酵素活性、１８ミリ単位／グラムの２１％である。ＨＥＸＡのこのレベルの脳酵素置換は、治療的応答に必要な酵素活性の１０倍高い。ＴＳＤを有する患者における正常のわずか１～２％の細胞酵素活性を生じる酵素置換療法が、ＴＳＤの疾患の影響の排除に十分である(J. Muenzer and A. Fisher, Advances in the treatment of mucopolysaccharidosis type I, N. Engl J Med, 350: 1932-1934, 2004；またはJeyakumar et al, Neural stem cell transplantation benefits a monogenic neurometabolic disorder during the symptomatic phase of disease. Stem Cells, 27: 2362-2370 2009)。これらの考察は、ヒト脳における臨床的に意義のあるＨＥＸＡ酵素置換が、約３mg／kgの全身用量でのＨＩＲＭＡｂ－ＨＥＸＡ融合タンパク質の静脈内点滴後可能であることを示す。

【0211】

実施例９. ＨＩＲ Ａｂ軽鎖－ＡＳＭ融合タンパク質発現プラスミドのＤＮＡ遺伝子操作
ＮＰＤで変異しているリソソーム酵素はＡＳＭである。ＡＳＭの喪失は、脳および末梢臓器におけるスフィンゴミエリンの蓄積をもたらす。ＮＰＤの酵素置換療法は、Miranda et al (2000): Infusion of recombinant human acid sphingomyelinase into Niemann-Pick disease mice leads to visceral, but not neurological, correction of the pathophysiology, FASEB J., 14: 1988-1995に記載のとおり、ＡＳＭ酵素がＢＢＢを通過しないため、脳の処置に有効ではない。ＡＳＭを、ＢＢＢの通過および酵素活性発揮の両者が可能な二機能性分子の開発のために、ＨＩＲ Ａｂと融合させた。ある実施態様において、成熟ＡＳＭのアミノ末端を、ＨＩＲ Ａｂの各軽鎖のカルボキシル末端に融合させる(図１５)。

【0212】

ＨＩＲ Ａｂと融合させたとき、ＡＳＭの酵素活性が保持されるか否かは不明確であった。実施例１、２および３に記載したＩｇＧ－ＧＵＳＢ、ＩｇＧ－ＧＣＲおよびＩｇＧ－ＧＡＬＣ融合タンパク質での経験は、本技術の予測不可能な性質およびＩｇＧ部分またはリソソーム酵素部分が、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質の構築後、生物学的活性を喪失する可能性を説明し得る。ヒトＡＳＭ ｃＤＮＡは、４６アミノ酸シグナルペプチドおよび１５アミノ酸プロペプチドおよび３アミノ酸カルボキシル末端ペプチドを欠く、ヒトＡＳＭタンパク質(accession # NP_000534)のアミノ酸Ｈｉｓ－６２からＰｒｏ－６２８に対応する。ＡＳＭ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠く(配列番号１９)、ＡＳＭオープンリーディングフレームを含む１,７０４ヌクレオチド(nt)からなった。ＡＳＭ ｃＤＮＡの５’末端を、３１アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする７０２nt ｃＤＮＡに結合させた。このリンカーは、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域の配列を含み、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSであり、配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５に対応する。発現ベクターの３’非翻訳領域からの２６ntフラグメントを３’末端に付加し、ＰｍｅＩ ＲＥ部位が続いた。融合タンパク質ｃＤＮＡの５’末端はＥｃｏＲＩ部位、続いて発現ベクターの５’非翻訳領域の５nt続いて完全コザック部位(GCCGCCACC)を含む。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＡＳＭをコードする人工遺伝子は２,５４５塩基対からなり、それは商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により示されるとおり、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され(図１６)、それぞれ、ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡ領域が隣接する真核生物発現ベクターの同じＲＥ部位に挿入された(図１７)。この発現プラスミドはｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭと名付けた。この発現プラスミドは、ＨＩＲ ＡｂのＬＣのカルボキシル末端が、ＡＳＭシグナルペプチドおよびプロペプチドを欠くヒトＡＳＭのアミノ末端に、ＨＩＲ Ａｂ ＬＣとＡＳＭの間の３１アミノ酸リンカーで融合された融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングは、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、１,８５５nt ＣＭＶプロモーター配列、９nt コザック部位、２,４９９nt発現カセットおよび２９１ ＢＧＨポリＡ配列を含む６,２４１ntからなった。プラスミドは、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、２１４アミノ酸ＨＩＲ Ａｂ ＬＣ、３１アミノ酸リンカーならびに酵素シグナルペプチド、プロペプチドおよびカルボキシル末端トリペプチドを欠く５６７アミノ酸ヒトＡＳＭからなる８３２アミノ酸タンパク質をコードした。ＡＳＭ配列は、ヒトＡＳＭタンパク質(accession # NP_000534)のＨｉｓ６２－Ｐｒｏ６２８と１００％同一であった。グリコシル化がないＬＣ融合タンパク質の予測分子量は９２,０４２Daであり、予測等電点(ｐＩ)は６.３０である。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＬＣ－ＡＳＭの発現ベクターは、タンデムで、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)欠損ＣＨＯ細胞での安定なトランスフェクタントの産生に使用されるＤＨＦＲ発現カセットも含む(図１７)。ＤＨＦＲ選択タンパク質の１８７アミノ酸配列を配列番号１６に示す。ＤＨＦＲをコードする５７３nt配列を配列番号１５に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする５６１nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。

【0213】

ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を播種し、ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭおよびキメラＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＨＩＲ Ａｂ ＨＣで二重トランスフェクトした(図１７)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣは、１９アミノ酸シグナルペプチドを含み、配列番号７のアミノ酸配列に対応するＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の４６２アミノ酸配列をコードする。ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣをコードする１,３９８nt配列を配列番号１２に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする１,３８６nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0214】

実施例１０. ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の重鎖および軽鎖両方をコードする発現ベクターでのチャイニーズハムスター卵巣細胞の安定なトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞１×ＨＴサプリメント(ヒポキサンチンおよびチミジン)含有無血清ＣＨＯユーティリティ培地で増殖させた。ＣＨＯ細胞(５×１０^６ 生存可能細胞)を２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭおよび２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣプラスミドＤＮＡで共電気穿孔した(図４)。細胞－ＤＮＡ懸濁液を、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を、２５msecおよび１６０ボルトのパルスで矩形波エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション(ＥＰ)後、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を５０ml培養培地に移し、４×９６ウェルプレートのウェルあたり１２５μl(１０,０００細胞／ウェル)で播種した。ＥＰ後、ＣＨＯ細胞を３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに入れた。発現ベクターにおけるネオマイシン耐性(ｎｅｏ)遺伝子の存在により(図１７)、トランスフェクト細胞株をまずＧ４１８で選択した。ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ－ＡＳＭ はＤＨＦＲの遺伝子も発現し(図１７)、よって、トランスフェクト細胞を２０nM メトトレキサート(ＭＴＸ)およびＨＴ欠損培地でも選択した。ＥＰ約２１日後可視コロニーが検出されたら、条件培地をＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧのためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡで高ヒトＩｇＧシグナルのウェルを、９６ウェルプレートから１mLのＣＨＯユーティリティ無血清培地を含む２４ウェルプレートに移した。２４ウェルプレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。翌週ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを２４ウェルプレートのクローンで実施した。これを、６ウェルプレートからＴ７５フラスコを経て、最後に６０mLおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で繰り返した。この段階で、最終ＭＴＸ濃度は８０nMであり、培地におけるＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の指標であった培地ＩｇＧ濃度は、１０^６／mLの細胞密度で＞１０mg／Ｌである。希釈クローニング(ＤＣ)のために選択したクローンをインキュベーターのオービタルシェーカーから除き、無菌フードに移した。細胞を、５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地で５００mLに希釈し、最終希釈は８細胞／mLであり、よって、４０×９６ウェルプレートの４,０００ウェルに、１細胞／ウェル(ＣＰＷ)の細胞密度で播種できた。細胞懸濁液が調製されたら、無菌フード内で、１２５μLアリコートを、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。プレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。１細胞／ウェルまで希釈した細胞は、血清なしでは生存できない。６日または７日目、ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、各ウェルに５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)を含む１２５μlのＦ－１２Ｋ培地を加えた。この選択培地は、その段階で５％ｄ－ＦＢＳ、３０nM ＭＴＸおよび０.２５mg／mL ジェネテシンを含んだ。初期１ＣＰＷプレーティング後２１日目、４,０００ウェルの各々からのアリコートを、ロボット装置を使用してヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡのために採った。ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μlの培地を採り、新しい無菌サンプル９６ウェルプレートに移した。初期１ＣＰＷプレーティング後２０日目、４０×９６ウェル免疫アッセイプレートに、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中一次抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧの１μg／mL溶液１００μLを播種した。プレートを、４℃冷蔵庫で一夜インキュベートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μLの二次抗体の１μg／mL溶液および遮断緩衝液を加えた。プレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄する。０.１Ｍグリシン緩衝液中の１００μLの１mg／mLの４－ニトロフェニルリン酸ジ(２－アミノ－２－エチル－１,３－プロパンジオール)塩を９６ウェル免疫アッセイプレートに加える。プレートをマイクロプレートリーダーで読んだ。アッセイは、４,０００ウェル／実験についてＩｇＧアウトプットデータを作成した。産生が最高であった２４～４８ウェルをさらなる伝播に使用した。１ＣＰＷ ＤＣからの産生が最高であった２４ウェルプレートを無菌フードに移し、６ウェル皿を経て、Ｔ７５フラスコおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で二重サブクローン化した。この工程中、細胞の血清を遠心分離の最終段階で０まで減らし、無血清培地(ＳＦＭ)に再懸濁した。上記工程を、０.５～１細胞／ウェル(ＣＰＷ)で第二ラウンドの希釈クローニングで繰り返した。この段階で、ウェルの約４０％が何らかの細胞増殖を示し、増殖を示す全ウェルがヒトＩｇＧも分泌した。これらの結果は、これらの方法で平均してウェルあたり１細胞のみが播種され、ＣＨＯ細胞株が単一細胞に由来することを確認した。希釈クローニング(ＤＣ)方法を、第二ラウンドのＤＣについて上記のとおり繰り返した。この第二ラウンドＤＣから産生された細胞株を、マスター細胞銀行の産生のために後に使用する、目録細胞銀行の製造に使用した。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質を産生するＣＨＯ系統を、上記のとおり２ラウンドのＤＣ後ＣＨＯ細胞から産生した。目録細胞株を、オービタルシェーカー上、２Ｌ振盪フラスコ中ＳＦＭで増殖させ、ＣＨＯ由来融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0215】

実施例１１. 二機能的ＩｇＧ－ＡＳＭ融合タンパク質のＨＩＲ結合およびＡＳＭ活性の分析
ＣＯＳ由来またはＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質を、図２０に示すとおり、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーでの精製後、還元ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)により純度を評価した。ＨＣおよびＬＣタンパク質のみがＨＩＲＭＡｂ単独またはＨＩＲＭＡｂ－ＡＳＭ融合タンパク質で検出される。ＨＩＲ Ａｂ単独について、高分子量(ＭＷ)バンドはＨＣであり、低ＭＷバンドはＬＣである。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質について、高ＭＷバンドはＬＣ－ＡＳＭ融合タンパク質であり、低ＭＷバンドはＨＣである。融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ(図２１Ａ)またはヒトＡＳＭ(図２１Ｂ)に対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ重鎖および軽鎖の分子量(ＭＷ)を、ＭＷ標準の移動に基づく線形回帰により推定する。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合軽鎖のサイズ１０５kDaは、ＡＳＭのＨＩＲ Ａｂ軽鎖への融合により、ＨＩＲ Ａｂ軽鎖単独のサイズ２６kDaより大きい。重鎖のサイズ５４kDaは、両タンパク質が同じ重鎖を使用するため、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質およびＨＩＲ Ａｂ単独両者で同一である。図２に示すヘテロ四量体ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の推定ＭＷは、ウェスタンブロットのＳＤＳ－ＰＡＧＥの移動に基づき、３２０kDaである。

【0216】

ＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に対する融合タンパク質の親和性をＥＬＩＳＡで決定した。組み換えＨＩＲ ＥＣＤをNunc-Maxisorb ９６ウェル皿に播種し、ＨＩＲ ＥＣＤに対するＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の結合を、二次抗体、続いてアルカリホスファターゼ検出剤との結合により検出した。５０％最大結合をもたらすＣＨＯ由来ＨＩＲ ＡｂまたはＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の濃度、ＥＤ_５０を非線形回帰分析により決定した。ＨＩＲへのＨＩＲ Ａｂ結合のＥＤ_５０は４７±２ng／mLであり、ＨＩＲへのＡｂ－ＡＳＭ融合タンパク質結合のＥＤ_５０は２９９±４０ng／mLである(図２２)。ＨＩＲ ＡｂのＭＷは１５０kDaであり、ＨＩＲ Ａｂ－融合タンパク質のＭＷは３２０kDaである。それ故に、ＭＷ差異で正規化後、キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－融合タンパク質のＨＩＲ ＥＣＤに対する結合は同等であり、それぞれ０.３２±０.０１nMおよび０.９３±０.１２nMのＥＤ_５０である(図２２)。これらの発見は、ＨＩＲへのＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質結合の親和性が、ＩｇＧの両軽鎖のカルボキシル末端へのＡＳＭ分子の融合にかかわらず維持されることを示す(図１５)。

【0217】

ＡＳＭ酵素活性を、van Diggelen et al (2005): A new fluorometric enzyme assay for the diagnosis of Niemann Pick A/B, with specificity of natural sphingomyelinase substrate J Inherit. Metab. Dis., 28: 733-741により開発された蛍光定量的アッセイで、基質として６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリルホスホコリン(ＨＭＵ－ＰＣ)を使用して決定した。この基質は商業的に入手可能であり、基質の構造は図２３Ａに示す。この基質はＡＳＭにより６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェロン(ＨＭＵ)に加水分解され、アッセイにおける産物の産生が蛍光定量的に決定される。アッセイを、１００mM 酢酸ナトリウム／０.２％タウロコール酸ナトリウム／ｐＨ＝５.２中、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質(３.７５～３７.５ng／チューブ)およびＨＭＵ－ＰＣ基質を３７℃で６０分間インキュベーションすることにより実施した。０.５Ｍグリシン／ＮａＯＨ／ｐＨ＝１０.７を加えて、反応停止させた。蛍光を、３６５nm励起フィルターおよび４５０nm吸収フィルターを備えた蛍光光度計で測定した。標準曲線を、１０～３０００pmol／チューブの４－メチルウンベリフェロン(４ＭＵ)産物で作成し、これは、蛍光単位のpmol／分への変換を可能とした(図２３Ｂ)。酵素活性を、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の単位／mgタンパク質として測定し、ここで、１ミリ単位＝インキュベーション１分あたりに形成される１nmolのＨＭＵ産物である。アッセイは、融合タンパク質の質量に関して直線的であった(図２３Ｂ)。ＣＨＯ由来ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質のＡＳＭ酵素活性は９０２±４１nmol／分／mgタンパク質または９０２±４１ミリ単位／mgタンパク質または０.９０±０.０４単位／mgタンパク質であった。

【0218】

実施例１２. ＡＳＭとターゲティング抗体を結合するアミノ酸リンカー
成熟ヒトＡＳＭを、３１アミノ酸リンカー(図１９で下線)でターゲティング抗体のＬＣのカルボキシル末端に融合させる。このリンカー配列は、配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５に対応する(図１９)。あらゆる数のバリエーションのリンカーを、アミノ酸配列およびアミノ酸長両方の観点で、本リンカーの代替として使用し得る。このようなリンカーは、融合タンパク質の操作における最適アミノ酸リンカーの決定のための複数の公開された利用可能なプログラムが存在することから、当分野で周知である。頻繁に利用されるリンカーは、(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_ｎまたは他の異形など反復配列中に種々の組み合わせでＧｌｙおよびＳｅｒを含む。このようなリンカーを、ＡＳＭをターゲティング抗体のＬＣのアミノ末端に融合するときまたはＡＳＭをターゲティング抗体のＨＣのカルボキシ末端に融合するときまたはＡＳＭをターゲティング抗体のＨＣのアミノ末端に融合するときまたはＡＳＭｗｐ一本鎖ターゲティング抗体のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合するときにも使用し得る。

【0219】

実施例１３. ヒト脳へのＡＳＭの受容体介在送達
ニーマン・ピック病(ＮＰＤ)Ａ型またはＢ型は、ＡＳＭ酵素活性の減少をもたらすスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１(ＳＭＰＤ１)遺伝子の変異により引き起こされ、早逝の原因である極めて重篤な神経変性遺伝性疾患である。多くのこのようなリソソーム蓄積症は、組み換え酵素発現後、酵素置換療法(ＥＲＴ)で処置される。ヒトＡＳＭ酵素の配列が知られて２５年を超える[Schuchman et al (1991), “Human acid sphingomyleinase,” J Biol Chem 266: 8531-8539]。しかしながら、ＡＳＭ酵素は、他のリソソーム酵素と同様、ＢＢＢを通過しないため、ＮＰＤにおける脳の処置について現在ＦＤＡで承認されたＥＲＴはない。ＢＢＢを通過させる試みにおいて、組み換え酵素は、脳の脳脊髄液(ＣＳＦ)区画への直接注射を経る髄腔内(ＩＴ)送達により与えられる。一般に、酵素は腰部または脳室ＣＳＦ腔に注射される。ＩＴ送達経路は、酵素が血液プールに急速にさらされるため、ＣＳＦへの注射後有効であるとは予測されない。ヒトにおいてＣＳＦ体積全体が１日４～５回ターンオーバーすることが周知であり、脈絡叢由来の体液の搬出と血液側への逆戻りがある。ＣＳＦ内に注射された薬物は遅い静脈内注射と等しく、ＣＳＦに注射された薬物は、脳の脳室上皮表面にのみ分配され、酵素が脂質保存障害の矯正のために必要である脳の実質組織深層にいかない。ＮＰＤ患者の脳へのＡＳＭ送達の好ましいアプローチは、受容体介在輸送(ＲＭＴ)を介してＢＢＢを送達するよう再操作された形態のＡＳＭの静脈内(ＩＶ)点滴後の脳への経血管経路である。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質はヒトインスリン受容体への高親和性結合を保持し、これによりＡＳＭが、内在性ＢＢＢインスリン受容体上のＲＭＴを介して血液からＢＢＢを浸透し、脳に入ることが可能となる。ＨＩＲ Ａｂ－リソソーム酵素融合タンパク質は、成熟霊長類で脳に取り込まれ、脳あたり注射用量(ＩＤ)の１％の濃度がもたらされ、肝臓、脾臓および腎臓などの内臓における取り込みはさらに高いレベルである[Boado et al (2013) Blood-brain barrier molecular Trojan horse enables brain imaging of radioiodinated recombinant protein in the Rhesus monkey. Bioconj. Chem., 24:1741-1749]。ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の治療用量が３mg／kgであり、体重が５０kgであるならば、融合タンパク質の点滴用量(ＩＤ)は１５０mgである。ＩＤの１％の融合タンパク質の脳取り込みを仮定して、融合タンパク質の脳濃度は１５００μg／脳である。これは、ヒト脳重量が約１,０００グラムであるため、ヒトにおける１.５μg／脳グラムに等しい。１.９μg／グラムのヒトＡＳＭの脳における濃度が、ＡＳＭノックアウトマウスにおける１０^１０ベクターゲノムのＡＳＭコード化アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)の脳内注射で達成され、このレベルの脳ＡＳＭが脳における脳スフィンゴミエリンレベルの顕著な減少に十分であった；低用量のＡＡＶは、０.１～０.４μg／グラムのＡＳＭの脳レベルをもたらし、脳におけるこれらのＡＳＭレベルは、ＡＳＭノックアウトマウスの寿命を有意に延長させた[Bu et al (2012): Merits of combination of cortical, subcortical, and cerebellar injections for the treatment of Niemann-Pick disease type A, Mol. Ther., 20: 1892-1901]。ＡＳＭノックアウトマウスにおけるＡＳＭコード化ＡＡＶの静脈内注射は、内臓(肝臓、脾臓、腎臓)における０.１～１μg／グラムのＡＳＭ濃度をもたらし、内臓におけるＡＳＭのこれらの濃度は、臓器スフィンゴミエリン濃度の減少に十分であった[Barbon et al (2005): AAV8-mediated hepatic expression of acid sphingomyelinase corrects the metabolic defect in the visceral organs of a mouse model of Niemann-Pick disease, Mol. Ther., 12:431-440]。これらの考察は、ヒト脳および内臓の臨床的に意義のあるＡＳＭ酵素置換が、約３mg／kgの全身用量でのＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合タンパク質の静脈内点滴後に可能であることを示す。

【0220】

実施例１４. ＨＩＲ Ａｂ重鎖－ＰＰＴ１融合タンパク質発現プラスミドＤＮＡの遺伝子操作
ＮＣＬ１で変異しているリソソーム酵素はＰＰＴ１である。ＰＰＴ１喪失は、脳および末梢臓器におけるスフィンゴミエリン蓄積をもたらす。ＮＣＬ１の静脈内酵素置換療法は、Hu et al (2012): Intravenous high-dose enzyme replacement therapy with recombinant palmitoyl-protein thioesterase reduces visceral lysosomal storage and modestly prolongs survival in a preclinical mouse model of infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, Mol Genet. Metab., 107: 213-221に記載のとおり、ＰＰＴ１酵素がＢＢＢを通過しないため、脳の処置に有効ではない。酵素をＢＢＢ輸送させるため、ＰＰＴ１がＨＩＲ Ａｂと融合したＩｇＧ－ＰＰＴ１融合タンパク質として、ＰＰＴ１を操作した。目的は、ＢＢＢ通過および高ＰＰＴ１酵素活性発揮の両者が可能である二機能性分子の開発である。ある実施態様において、成熟ＰＰＴ１のアミノ末端を、ＨＩＲ Ａｂの各重鎖のカルボキシル末端に融合させる(図２４)。

【0221】

ＨＩＲ Ａｂと融合させたとき、ＰＰＴ１の酵素活性が保持されるか否かは不確実であった。実施例１、２および３に記載したＩｇＧ－ＧＵＳＢ、ＩｇＧ－ＧＣＲおよびＩｇＧ－ＧＡＬＣ融合タンパク質での経験は、本技術の予測不可能な性質およびＩｇＧ部分またはリソソーム酵素部分が、ＩｇＧ－酵素融合タンパク質の構築後、生物学的活性を喪失する可能性を説明し得る。ヒトＰＰＴ１ ｃＤＮＡは、２７アミノ酸シグナルペプチドを欠く、ヒトＰＰＴ１タンパク質(accession # NP_000301)のアミノ酸Ａｓｐ－２８からＧｌｙ－３０６に対応する(図２７)。まず、酵素シグナルペプチドを欠くＰＰＴ１を、４アミノ酸の短リンカー(ＳＬ)でＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のＣ末端に融合させた、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質を操作した。しかしながら、下記のとおり、この融合タンパク質は、極めて低いＰＰＴ１酵素活性を有した。それ故に、ＨＣのＣ末端とＰＰＴ１のＮ末端の間の４アミノ酸リンカーを３１アミノ酸の長リンカー(ＬＬ)に置き換えた、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質を再操作した。短４アミノ酸リンカーを有するＰＰＴ１融合タンパク質をＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１と名付ける。長３１アミノ酸リンカーを有するＰＰＴ１融合タンパク質をＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１と名付ける。ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質において、リンカーは、配列番号２２のアミノ酸４６２～４６５のＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列に対応する(図２８)。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質において、３１アミノ酸リンカーは配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２に対応する(図２９)。この３１アミノ酸リンカーはヒトＩｇＧ３ヒンジ領域からなり、１２アミノ酸の上部ヒンジ領域、続いてコアヒンジ領域の第一部分の５アミノ酸、続いて８アミノ酸の下部ヒンジ領域に由来する２５アミノ酸に対応し、アミノ末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列およびカルボキシル末端がＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ配列が隣接する。コアヒンジ領域の第一部分の２システイン残基は、ジスルフィド結合を排除するためにセリン残基に変異される。３１アミノ酸リンカーの配列はSSSELKTPLGDTTHTSPRSPAPEFLGGPSSSである。２７アミノ酸シグナルペプチドを欠く、ヒトＰＰＴ１タンパク質(accession # NP_000301)のアミノ酸Ａｓｐ_２８～Ｇｌｙ_３０６に対応するヒトＰＰＴ１ ｃＤＮＡは、商業的ＤＮＡ製造業者によりカスタム合成された。ＰＰＴ１ ｃＤＮＡは、ＴＧ停止コドンまでシグナルペプチドを欠く、ＰＰＴ１オープンリーディングフレームを含む８４０ヌクレオチド(nt)からなった。ＣＨ３を有するオープンリーディングフレームおよび融合タンパク質のリンカー領域を維持するため、５’末端で、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ(ＲＥ)配列、続いてＣＡntを付加した。３’末端で、ＨｉｎｄIII ＲＥ部位を含む発現ベクターの３’非翻訳領域に対応して、２３ntフラグメントを付加した。ＰＰＴ１遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により示されるとおり、ＳｔｕＩおよびＨｉｎｄIIIを用いてベンダーから提供されたｐＵＣプラスミドから遊離され(図２５)、ＨＩＲ Ａｂ重鎖をコードする真核生物発現プラスミドのＨｐａＩおよびＨｉｎｄIII部位に挿入され、この発現プラスミドはｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣ－ＰＰＴ１と名付けられた(図２６)。ＰＰＴ１ ｃＤＮＡの５’末端を、４アミノ酸または３１アミノ酸リンカーを介してＨＩＲ ＡｂのＨＣをコードするｃＤＮＡに結合させた。ＨＩＲ Ａｂ ＨＣの４６２位の末端リシン残基(配列番号７)を、プロテアーゼ部位の可能性があるため、融合タンパク質から欠失させた。これらの発現プラスミドは、ＨＩＲ Ａｂの重鎖(ＨＣ)のカルボキシル末端が、２７アミノ酸ＰＰＴ１シグナルペプチドを欠く、ヒトＰＰＴ１のアミノ末端に、それぞれＨＩＲ Ａｂ ＨＣのＣ末端と成熟ＰＰＴ１のＮ末端の間の４アミノ酸または３１アミノ酸リンカーにより融合した融合タンパク質を発現する。ＤＮＡシーケンシングで、それぞれＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１およびＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質に対応するｐＨＩＲ Ａｂ－ＨＣ－ＰＰＴ１発現カセットの配列構造を確認した。発現カセットは、ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１(図２８、配列番号２２)およびＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１(図２９、配列番号２３)融合タンパク質それぞれで４７３９ntまたは４８２０ntからなり、これは、２,１２５nt ＣＭＶプロモーター、９nt コザック部位、２,２３５または２,３１６ntオープンリーディングフレームおよび３７０nt ＢＧＨポリＡ配列を含んだ。プラスミドは、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド、４４２アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ ＨＣ、４アミノ酸または３１アミノ酸リンカーおよび酵素シグナルペプチドを欠く２７９アミノ酸ヒトＰＰＴ１からなる、それぞれ７４４アミノ酸および７７１アミノ酸のタンパク質をコードした。ＰＰＴ１配列は、ヒトＰＰＴ１タンパク質(accession # NP_000301)のアミノ酸Ａｓｐ_２８～Ｇｌｙ_３０６と１００％同一であった。ＨＩＲ ＡｂのＨＣ－ＳＬ－ＰＰＴ１およびＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質、それぞれの予測分子量は、グリコシル化がなく、それぞれ８０,０９６Daおよび８２,８５８Daであり、予測等電点(ｐＩ)は、それぞれ７.８２および７.５９である。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＬＣの発現ベクターは、タンデムで、ＣＨＯ細胞における安定なトランスフェクタントの産生に使用されるジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)の発現カセット(図２６)を含む。ＤＨＦＲ選択タンパク質の１８７アミノ酸配列を配列番号１６に示す。ＤＨＦＲをコードする５７３nt配列を配列番号１５に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする５６１nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。

【0222】

ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１およびＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で発現させた。ＣＯＳ細胞を、キメラＨＩＲ Ａｂの軽鎖(ＬＣ)をコードする発現プラスミドであるｐＣＤ－ＬＣおよびＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１またはＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１のための発現プラスミドで二重トランスフェクトした(図２６)。ｐＨＩＲ Ａｂ－ＬＣは、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＣタンパク質の２３４アミノ酸配列をコードし、配列番号８のアミノ酸配列に対応する。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＣをコードする７１４nt配列を配列番号１３に示し、これは、９nt コザック配列(GCCGCCACC)、続いてオープンリーディングフレームをコードする７０２nt配列、続いてＴＡ停止コドンからなる。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を使用して１：２.５のＤＮＡμg：リポフェクタミン２０００μLの比で行い、条件無血清培地を３日目および７日目に集めた。無血清培地(ＳＦＭ)への融合タンパク質分泌をヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりモニターした。条件培地を限外濾過により浄化し、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0223】

実施例１５. ＨＩＲＭＡｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の重鎖および軽鎖両方をコードする発現ベクターでのチャイニーズハムスター卵巣細胞の安定なトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞１×ＨＴサプリメント(ヒポキサンチンおよびチミジン)含有無血清ＣＨＯユーティリティ培地で増殖させた。ＣＨＯ細胞(５×１０^６ 生存可能細胞)を、ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１発現のために２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ ＨＣ－ＰＰＴ１および２.５μg ＰｖｕＩ直線化ｐＨＩＲ Ａｂ－ＬＣプラスミドＤＮＡで共電気穿孔した(図２６)。細胞－ＤＮＡ懸濁液を、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を、２５msecおよび１６０ボルトのパルスで矩形波エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション(ＥＰ)後、細胞を氷上で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を５０ml培養培地に移し、４×９６ウェルプレートのウェルあたり１２５μl(１０,０００細胞／ウェル)で播種した。ＥＰ後、ＣＨＯ細胞を３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに入れた。発現ベクターにおけるネオマイシン耐性(ｎｅｏ)遺伝子の存在により(図２６)、トランスフェクト細胞株をまずＧ４１８で選択した。ｐＨＩＲ Ａｂ ＬＣ はＤＨＦＲの遺伝子も発現し(図２６)、よって、トランスフェクト細胞を２０nM メトトレキサート(ＭＴＸ)およびＨＴ欠損培地でも選択した。ＥＰ約２１日後可視コロニーが検出されたら、条件培地をＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧのためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡで高ヒトＩｇＧシグナルのウェルを、９６ウェルプレートから１mLのＣＨＯユーティリティ無血清培地を含む２４ウェルプレートに移した。２４ウェルプレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。翌週ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを２４ウェルプレートのクローンで実施した。これを、６ウェルプレートからＴ７５フラスコを経て、最後に６０mLおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で繰り返した。この段階で、最終ＭＴＸ濃度は８０nMであり、培地におけるＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質の指標である培地ＩｇＧ濃度は、１０^６／mLの細胞密度で＞１０mg／Ｌである。希釈クローニング(ＤＣ)のために選択したクローンをインキュベーターのオービタルシェーカーから除き、無菌フードに移した。細胞を、５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地で５００mLに希釈し、最終希釈は８細胞／mLであり、よって、４０×９６ウェルプレートの４,０００ウェルに、１細胞／ウェル(ＣＰＷ)の細胞密度で播種できた。細胞懸濁液が調製されたら、無菌フード内で、１２５μLアリコートを、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。プレートを、３７℃および８％ＣＯ_２のインキュベーターに戻した。１細胞／ウェルまで希釈した細胞は、血清なしでは生存できない。６日または７日目、ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、各ウェルに５％透析ウシ胎児血清(ｄ－ＦＢＳ)を含む１２５μlのＦ－１２Ｋ培地を加えた。この選択培地は、その段階で５％ｄ－ＦＢＳ、３０nM ＭＴＸおよび０.２５mg／mL ジェネテシンを含んだ。初期１ＣＰＷプレーティング後２１日目、４,０００ウェルの各々からのアリコートを、ロボット装置を使用してヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡのために採った。ＤＣプレートをインキュベーターから出し、無菌フードに移し、そこで、８チャネルピペッターまたは精密ピペッター系を使用して、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μlの培地を採り、新しい無菌サンプル９６ウェルプレートに移した。初期１ＣＰＷプレーティング後２０日目、４０×９６ウェル免疫アッセイプレートに、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中一次抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧの１μg／mL溶液１００μLを播種した。プレートを、４℃冷蔵庫で一夜インキュベートした。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μLの二次抗体の１μg／mL溶液および遮断緩衝液を加えた。プレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄する。０.１Ｍグリシン緩衝液中の１００μLの１mg／mLの４－ニトロフェニルリン酸ジ(２－アミノ－２－エチル－１,３－プロパンジオール)塩を９６ウェル免疫アッセイプレートに加える。プレートをマイクロプレートリーダーで読んだ。アッセイは、４,０００ウェル／実験についてＩｇＧアウトプットデータを作成した。産生が最高であった２４～４８ウェルをさらなる伝播に使用した。１ＣＰＷ ＤＣからの産生が最高であった２４ウェルプレートを無菌フードに移し、６ウェル皿を経て、Ｔ７５フラスコおよび１２５mLスクエアプラスチックボトルでオービタルシェーカー上で二重サブクローン化した。この工程中、細胞の血清を遠心分離の最終段階で０まで減らし、無血清培地(ＳＦＭ)に再懸濁した。上記工程を、０.５～１細胞／ウェル(ＣＰＷ)で第二ラウンドの希釈クローニングで繰り返した。この段階で、ウェルの約４０％が何らかの細胞増殖を示し、増殖を示す全ウェルがヒトＩｇＧも分泌した。これらの結果は、これらの方法で平均してウェルあたり１細胞のみが播種され、ＣＨＯ細胞株が単一細胞に由来することを確認した。希釈クローニング(ＤＣ)方法を、第二ラウンドのＤＣについて上記のとおり繰り返した。この第二ラウンドＤＣから産生された細胞株を、マスター細胞銀行の産生のために後に使用する、目録細胞銀行の製造に使用した。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質を産生するＣＨＯ系統を、上記のとおり２ラウンドのＤＣ後ＣＨＯ細胞から産生した。目録細胞株を、オービタルシェーカー上、２Ｌ振盪フラスコ中ＳＦＭで増殖させ、ＣＨＯ由来融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0224】

実施例６. 二機能的ＩｇＧ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＨＩＲ結合およびＰＰＴ１活性の分析
ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質を、図３０に示すとおり、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーでの精製後、還元ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)により純度を評価した。ＨＣおよびＬＣタンパク質のみがＨＩＲ Ａｂ単独またはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質で検出される。ＨＩＲ Ａｂ単独について、高分子量(ＭＷ)バンドはＨＣであり、低ＭＷバンドはＬＣである。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質について、高ＭＷバンドはＨＣ－ＰＰＴ１融合タンパク質であり、低ＭＷバンドはＬＣである。融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ(図３２Ａ)またはヒトＰＰＴ１(図３２Ｂ)に対する一次抗体を使用するウェスタンブロッティングにより確認した。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１重鎖および軽鎖の分子量(ＭＷ)を、ＭＷ標準の移動に基づく線形回帰により推定する。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合重鎖のサイズ９９kDaは、ＰＰＴ１のＨＩＲ Ａｂ重鎖への融合により、ＨＩＲ Ａｂ単独の重鎖のサイズ５４kDaより大きい。軽鎖のサイズ２４kDaは、両タンパク質が同じ軽鎖を使用するため、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質およびＨＩＲ Ａｂ単独両者で同一である。図２に示すヘテロ四量体ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の推定ＭＷは、ウェスタンブロットのＳＤＳ－ＰＡＧＥの移動に基づき、２４６kDaである。

【0225】

ＣＨＯ由来融合タンパク質の効力を、ＨＩＲ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡで評価した。ＨＩＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に対する融合タンパク質の親和性をＥＬＩＳＡで決定した。組み換えＨＩＲ ＥＣＤをNunc-Maxisorb ９６ウェル皿に播種し、ＨＩＲ ＥＣＤへのＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の結合を、二次抗体、続いてアルカリホスファターゼ検出剤との結合により検出した。５０％最大結合をもたらすＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の濃度、ＥＤ_５０を非線形回帰分析により決定した。ＨＩＲへのＨＩＲ Ａｂ結合のＥＤ_５０は３９±６ng／mLであり、ＨＩＲへのＡｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質結合のＥＤ_５０は９４±２８ng／mLである(図３２)。ＨＩＲ ＡｂのＭＷは１５０kDaであり、ＨＩＲ Ａｂ－融合タンパク質のＭＷは２４６kDaである。それ故に、ＭＷ差異で正規化後、ＨＩＲ ＥＣＤに対して、キメラＨＩＲ ＡｂまたはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質は、それぞれ０.２６±０.０４nMおよび０.３８±０.１１nMのＥＤ_５０で同等に結合した(図３２)。これらの発見は、ＰＰＴ１分子のＩｇＧの両軽鎖のカルボキシル末端への融合にかかわらず、ＨＩＲ Ａｂ融合タンパク質結合の親和性を示す(図２４)。

【0226】

ＰＰＴ１酵素活性を、van Diggelen et al (1999): A rapid fluorogenic palmitoyl-protein thioesterase assay: Pre- and postnatal diagnosis of INCL Molec Genet Metab, 66: 240-244により開発された蛍光定量的アッセイで、基質として４－メチルウンベリフェリル６－チオ－パルミテート－β－Ｄ－グルコピラノシド(Ｍｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ)を使用して決定した。この基質は商業的に入手可能であり、基質の構造を図３３Ａに示す。この基質はＰＰＴ１およびベータ－グルコシダーゼを４－メチルウンベリフェロン(ＭＵ)に加水分解し、アッセイにおけるＭＵ形成が蛍光定量的に決定される。アッセイを、マッキルベインリン酸／クエン酸緩衝液／ｐＨ＝４.０／１５mM ジチオスレイトール／０.３７５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１またはＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質(３～３０ng／チューブ)およびＭｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ基質(０.６４mM)を３７℃で６０分間インキュベーションすることにより実施した。０.５Ｍ炭酸ナトリウム／ｐＨ＝１０.７を加えて、反応停止させた。ＰＰＴ１活性は、Ｍｕ－６Ｓ－Ｐａｌｍ－ベータ－Ｇｌｃ基質のチオエステル結合を加水分解し、アッセイ緩衝液に加えたベータ－グルコシダーゼが、基質の残存グリコシド結合を加水分解して、ＭＵ産物を産生する。蛍光を、３６５nm励起フィルターおよび４５０nm吸収フィルターを備えた蛍光光度計で測定した。標準曲線を、１０～３０００pmol／チューブの４－メチルウンベリフェロン(４ＭＵ)産物で作成し、これは、蛍光単位のpmol／分への変換を可能とした(図３３Ｂ)。酵素活性を、ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１またはＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質の単位／mgタンパク質として測定し、ここで、１単位＝インキュベーション１分あたりに形成される１μmolのＭＵ産物である。アッセイは、ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質またはＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質について融合タンパク質の質量に関して直線的であった(図３３Ｂ)。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＰＰＴ１酵素活性は１.７±０.０１単位／mgタンパク質または１７４２±７５pmol／分／μgタンパク質であった。逆に、短リンカー融合タンパク質、ＨＩＲ Ａｂ－ＳＬ－ＰＰＴ１のＰＰＴ１比活性はわずか５３±１５pmol／分／μgタンパク質または超３１アミノ酸リンカーを有する融合タンパク質、ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１のＰＰＴ１活性と比較して、３０倍を超える減少であった。ＣＨＯ細胞に由来し、同じ蛍光定量的アッセイおよび基質で決定した組み換えヒトＰＰＴ１の比活性は、１５単位／mgである[Hu et al (2012): Intravenous high-dose enzyme replacement therapy with recombinant palmitoyl-protein thioesterase reduces visceral lysosomal storage and modestly prolongs survival in a preclinical mouse model of infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. M]。ＨＩＲ Ａｂ－ＬＬ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＭＷは上記音とおり２４６kDaであり、一方組み換えＰＰＴ１のＭＷは３４kDaである[Lu et al (2010): Human recombinant palmitoyl protein thioesterase-1 (PPT1) for preclinical evaluation of enzyme replacement therapy for infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Mol. Genet. Metab., 99:374-378]。融合タンパク質四量体あたりＰＰＴ１が２分子存在するため(図２)、ＩｇＧ－ＰＰＴ１の有効ＭＷは半分の２４６kDaまたは１２３kDaであり、これは、組み換えＰＰＴ１のＭＷより３.６倍大きい。それ故に、モルベースで、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＰＰＴ１比活性は、組み換えＰＰＴ１の活性の４２％である。

【0227】

実施例７. ＰＰＴ１とターゲティング抗体を結合するアミノ酸リンカー
成熟ヒトＰＰＴ１を、３１アミノ酸リンカー(図２９で下線)でターゲティング抗体のＨＣのカルボキシル末端に融合させる。このリンカー配列は、配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２に対応する(図２９)。酵素活性の減少を伴った短４アミノ酸リンカーは、配列番号２２のアミノ酸４６２～４６５に対応する(図２８)。あらゆる数のバリエーションのリンカーを、アミノ酸配列およびアミノ酸長両方の観点で、本リンカーの代替として使用し得る。このようなリンカーは、融合タンパク質の操作における最適アミノ酸リンカーの決定のための複数の公開された利用可能なプログラムが存在することから、当分野で周知である。頻繁に利用されるリンカーは、(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_ｎまたは他の異形など反復配列中に種々の組み合わせでＧｌｙおよびＳｅｒを含む。このようなリンカーを、ＰＰＴ１をターゲティング抗体のＬＣのアミノ末端に融合するときまたはＰＰＴ１をターゲティング抗体のＨＣのカルボキシ末端に融合するときまたはＰＰＴ１をターゲティング抗体のＨＣのアミノ末端に融合するときまたはＰＰＴ１を一本鎖ターゲティング抗体のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合するときにも使用し得る。

【0228】

実施例８. ヒト脳へのＰＰＴ１の受容体介在送達
神経セロイドリポフスチン症１型(ＮＣＬ１)はバッテン病の小児形態であり、リソソーム酵素パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１型(ＰＰＴ１)をコードするＣＬＮ１遺伝子の変異が原因である。脳および内臓におけるＰＰＴ１欠損は、自己蛍光脂質沈着物の蓄積に至る。脳におけるこのような沈着物は、進行性運動喪失、盲目、痙攣発作および精神遅滞により特徴づけられる重度神経変性遺伝性疾患を引き起こす。小児ＮＣＬ１は、約９～１３歳での死亡に至る。多くのこのようなリソソーム蓄積症は、組み換え酵素発現後、酵素置換療法(ＥＲＴ)で処置される。ヒトＰＰＴ１酵素の配列が知られて、２５年を超える[Camp et al (1994), “Molecular cloning and expression of palmityoy-protein thioesterase,” J Biol Chem 269: 23212-23219]。ＰＰＴ１酵素は、他のリソソーム酵素と同様、ＢＢＢを通過しないため、ＮＣＬ１における脳の処置について現在ＦＤＡで承認されたＥＲＴはない。ＢＢＢを通過させる試みにおいて、組み換え酵素は、脳の脳脊髄液(ＣＳＦ)区画への直接注射を経る髄腔内(ＩＴ)送達により与えられる。一般に、酵素は腰部または脳室ＣＳＦ腔に注射される。ＩＴ送達経路は、酵素が血液プールに急速にさらされるため、ＣＳＦへの注射後有効であるとは予測されない。ヒトにおいてＣＳＦ体積全体が１日４～５回ターンオーバーすることが周知であり、脈絡叢由来の体液の搬出と血液側への逆戻りがある。ＣＳＦ内に注射された薬物は遅い静脈内注射と等しく、ＣＳＦに注射された薬物は、脳の脳室上皮表面にのみ分配され、酵素が脂質保存障害の矯正のために必要である脳の実質組織深層にいかない。ＮＣＬ１患者の脳へのＰＰＴ１送達の好ましいアプローチは、受容体介在輸送(ＲＭＴ)を介してＢＢＢを送達するよう再操作された形態のＰＰＴ１の静脈内(ＩＶ)点滴後の脳への経血管経路である。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質はヒトインスリン受容体への高親和性結合を保持し、これによりＰＰＴ１が、内在性ＢＢＢインスリン受容体上のＲＭＴを介して血液からＢＢＢを浸透し、脳に入ることが可能となる。ＨＩＲ Ａｂ－リソソーム酵素融合タンパク質は、成熟霊長類で脳に取り込まれ、脳あたり注射用量(ＩＤ)の１％の濃度がもたらされ、肝臓、脾臓および腎臓などの内臓における取り込みはさらに高いレベルである[Boado et al (2013) Blood-brain barrier molecular Trojan horse enables brain imaging of radioiodinated recombinant protein in the Rhesus monkey. Bioconj. Chem., 24:1741-1749]。ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の治療用量が３mg／kgであり、体重が５０kgであるならば、融合タンパク質の点滴用量(ＩＤ)は１５０mgである。ＩＤの１％の融合タンパク質の脳取り込みを仮定して、融合タンパク質の脳濃度は１５００μg／脳である。これは、ヒト脳重量が約１,０００グラムであるため、ヒトにおける１.５μg／脳グラムに等しい。上記のとおり、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＰＰＴ１酵素比活性は１.７Ｕ／mgまたは１.７ミリ単位／μgであるため、ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の１.５μg／グラムの脳濃度は２.６ミリ単位／グラムに等しい。脳における内在性ＰＰＴ１酵素活性は７０nmol／mgタンパク質／時間であり[Dearborn et al (2016): Histochemical localization of palmitoyl protein thioesterase-1 activity, Mol Genet Metab., 117:210-216]、これは１.１６nmol／mgタンパク質／分または１.１６ミリ単位／mgタンパク質に等しい。脳１グラムあたり約１００mgタンパク質があるため、正常脳における内在性ＰＰＴ１酵素活性は１１６ミリ単位／グラムまたは１１６mU／グラムである。それ故に、３mg／kgのＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質のＩＶ用量は、１１６mU／グラムまたは２.２％の内在性活性で除して、２.６mU／ｇを置き換えると予測される。Hobert and Dawson [Neuronal ceroid lipofucsinosis therapeutic strategies: past, present, and future, Biochim. Biophys. Acta, 1762:945-953, 2006]は、ＮＣＬ１における「残存酵素活性のわずかな増加が、疾患進行を顕著に変えることができることは広く認められる(it is widely accepted that small increases in residual enzyme activity can significantly alter disease progression)」と記載し、内在性ＰＰＴ１酵素活性のわずか０.５％の回復が、治療効果をもたらすのに十分であるとの証拠を提供するSleat et al [Aminoglycoside-mediated suppression of nonsense mutations in late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, Eur. J. Ped. Neurol., 5(Suppl): 57-62の研究を引用する。これらの発見は、内在性リソソーム酵素活性のわずか１～２％の回復が、治療的であると認識される他のリソソーム蓄積症からの結果に一致する(J. Muenzer and A. Fisher, Advances in the treatment of mucopolysaccharidosis type I, N. Engl J Med, 350: 1932-1934, 2004)。これらの考察は、ヒト脳および内臓の臨床的に意義のあるＰＰＴ１酵素置換が、約３mg／kgの全身用量でのＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合タンパク質の静脈内点滴後可能であることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

2024153824000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-07-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

（ａ）ＨＥＸＡおよび（ｂ）内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。

【請求項2】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項１に記載の融合抗体。

【請求項3】

ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項１に記載の融合抗体。

【請求項4】

該融合タンパク質がＨＥＸＡのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合抗体。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0004】

発明の要約
ここに記載されるのは、ヘキソサミニダーゼＡ(「ＨＥＸＡ」)、酸スフィンゴミエリナーゼ(「ＡＳＭ」)またはパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１(「ＰＰＴ１」)の欠損を有する対象を処置するための方法および組成物である。ある実施態様において、ここに提供する方法は、治療有効量の二機能性融合抗体またはタンパク質の全身的投与による、ＣＮＳへのＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１の送達を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、内在性血液脳関門(ＢＢＢ)受容体およびＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１に対する抗体のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、二機能性融合抗体は、酵素に遺伝子的に融合したヒトインスリン抗体(ＨＩＲ Ａｂ)(「ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体」または「ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体」または「ＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体」)である。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体、ＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体またはＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体は、図１に記載するとおり、インスリン受容体の細胞外ドメインに結合し、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１酵素活性を維持しながら、血液脳関門(「ＢＢＢ」)を通ってＣＮＳに輸送される。ある実施態様において、ＨＩＲ Ａｂは、ＢＢＢ上の内在性インスリン受容体に結合し、分子トロイの木馬として作用して、ＨＥＸＡ、ＡＳＭまたはＰＰＴ１を脳に運ぶ。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＨＥＸＡ融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＡＳＭ融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。ある実施態様において、全身投与のためのＨＩＲ Ａｂ－ＰＰＴ１融合抗体の治療有効全身用量は、一部、ここに記載するとおり末梢血からの融合抗体の特定のＣＮＳ取り込み特性に基づく。
本開示は、例えば以下を提供する：
［項１］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるヘキソサミニダーゼＡ(ＨＥＸＡ)欠損を処置する方法であって、ＨＥＸＡ活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＨＥＸＡおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項２］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項１に記載の方法。
［項３］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、項１に記載の方法。
［項４］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、項１に記載の方法。
［項５］
融合抗体がＧ _Ｍ２ ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、項１に記載の方法。
［項６］
ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１に記載の方法。
［項７］
ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１に記載の方法。
［項８］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、項１に記載の方法。
［項９］
治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位／Kg体重を含む、項１に記載の方法。
［項１０］
融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、項１に記載の方法。
［項１１］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１に記載の方法。
［項１２］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１に記載の方法。
［項１３］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１に記載の方法。
［項１４］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１に記載の方法。
［項１５］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１に記載の方法。
［項１６］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１に記載の方法。
［項１７］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、項１に記載の方法。
［項１８］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、項１に記載の方法。
［項１９］
中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、項１に記載の方法。
［項２０］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項２１］
融合抗体がＧ _Ｍ２ ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項２０に記載の方法。
［項２２］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、請求項２０に記載の方法。
［項２３］
治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位のＨＥＸＡ活性／Kg体重を含む、請求項２０に記載の方法。
［項２４］
融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項２０に記載の方法。
［項２５］
ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２０に記載の方法。
［項２６］
ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２０に記載の方法。
［項２７］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項２０に記載の方法。
［項２８］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２０に記載の方法。
［項２９］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２０に記載の方法。
［項３０］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２０に記載の方法。
［項３１］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２０に記載の方法。
［項３２］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。
［項３３］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。
［項３４］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２０に記載の方法。
［項３５］
中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、請求項２０に記載の方法。
［項３６］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損症を処置する方法であって、該対象にＨＥＸＡ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＨＥＸＡのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項３７］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項３６に記載の方法。
［項３８］
融合抗体がＧ _Ｍ２ ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項３６に記載の方法。
［項３９］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＨＥＸＡ酵素が脳に送達される、請求項３６に記載の方法。
［項４０］
治療有効用量が少なくとも約１００ミリ単位のＨＥＸＡ活性／Kg体重を含む、請求項３６に記載の方法。
［項４１］
融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項３６に記載の方法。
［項４２］
ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項３６に記載の方法。
［項４３］
ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項３６に記載の方法。
［項４４］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項３６に記載の方法。
［項４５］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項３６に記載の方法。
［項４６］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項３６に記載の方法。
［項４７］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項３６に記載の方法。
［項４８］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項３６に記載の方法。
［項４９］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。
［項５０］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。
［項５１］
融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項３６に記載の方法。
［項５２］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項３６に記載の方法。
［項５３］
中枢神経系におけるＨＥＸＡ欠損がテイ・サックス病である、請求項３６に記載の方法。
［項５４］
ＨＥＸＡが配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
［項５５］
(ａ)ＨＥＸＡおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。
［項５６］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項５５に記載の融合抗体。
［項５７］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項５５に記載の融合抗体。
［項５８］
ＨＥＸＡのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項５５に記載の融合抗体。
［項５９］
該融合抗体がＧ _Ｍ２ ガングリオシドのＮ－アセチル－β－Ｄ－ヘキソサミニドにおける末端Ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン残基の加水分解を触媒する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６０］
該融合タンパク質がＨＥＸＡのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６１］
リンカーが配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６２］
融合抗体のＨＥＸＡ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６３］
ＨＥＸＡが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６４］
ＨＥＸＡおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６５］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６６］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６７］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６８］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項５５に記載の融合抗体。
［項６９］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項５５に記載の融合抗体。
［項７０］
該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項７１］
該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項７２］
該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項５５に記載の融合抗体。
［項７３］
治療有効量の請求項５５に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
［項７４］
請求項５５に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
［項７５］
単離ポリヌクレオチドが配列番号１４の核酸配列を含む、請求項７４に記載の単離ポリヌクレオチド。
［項７６］
請求項７４に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［項７７］
配列番号１４の核酸配列を含む、請求項７６に記載のベクター。
［項７８］
請求項７６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［項７９］
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、請求項７８に記載の宿主細胞。
［項８０］
配列番号１０と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
［項８１］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも８５％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８２］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９０％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８３］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９５％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８４］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９６％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８５］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９７％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８６］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９８％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８７］
アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９９％同一である、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８８］
アミノ酸配列が８０を含む、請求項８０に記載の単離ポリペプチド。
［項８９］
配列番号１０のアミノ酸２３５～２６５を含む、単離ポリペプチド。
［項９０］
処置を必要とする対象の中枢神経系における酸スフィンゴミエリナーゼ(ＡＳＭ)欠損を処置する方法であって、ＡＳＭ活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＡＳＭおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項９１］
ＡＳＭのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項９０に記載の方法。
［項９２］
ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、請求項９０に記載の方法。
［項９３］
ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項９０に記載の方法。
［項９４］
融合抗体がスフィンゴミエリンのセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、請求項９０に記載の方法。
［項９５］
ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項９０に記載の方法。
［項９６］
ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項９０に記載の方法。
［項９７］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、請求項９０に記載の方法。
［項９８］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項９０に記載の方法。
［項９９］
融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、請求項９０に記載の方法。
［項１００］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項９０に記載の方法。
［項１０１］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項９０に記載の方法。
［項１０２］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項９０に記載の方法。
［項１０３］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項９０に記載の方法。
［項１０４］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項９０に記載の方法。
［項１０５］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項９０に記載の方法。
［項１０６］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項９０に記載の方法。
［項１０７］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項９０に記載の方法。
［項１０８］
中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、請求項９０に記載の方法。
［項１０９］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項１１０］
融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、項１０９に記載の方法。
［項１１１］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、項１０９に記載の方法。
［項１１２］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、項１０９に記載の方法。
［項１１３］
融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、項１０９に記載の方法。
［項１１４］
ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１０９に記載の方法。
［項１１５］
ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１０９に記載の方法。
［項１１６］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、項１０９に記載の方法。
［項１１７］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１０９に記載の方法。
［項１１８］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１０９に記載の方法。
［項１１９］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１０９に記載の方法。
［項１２０］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１０９に記載の方法。
［項１２１］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、項１０９に記載の方法。
［項１２２］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１０９に記載の方法。
［項１２３］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、項１０９に記載の方法。
［項１２４］
中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、項１０９に記載の方法。
［項１２５］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＡＳＭ欠損症を処置する方法であって、該対象にＡＳＭ活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン重鎖およびＡＳＭのアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み、ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項１２６］
ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、項１２５に記載の方法。
［項１２７］
融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、項１２５に記載の方法。
［項１２８］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＡＳＭ酵素が脳に送達される、項１２５に記載の方法。
［項１２９］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、項１２５に記載の方法。
［項１３０］
融合抗体のＡＳＭ比活性が約１００ミリ単位／mgである、項１２５に記載の方法。
［項１３１］
ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１２５に記載の方法。
［項１３２］
ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１２５に記載の方法。
［項１３３］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１２５に記載の方法。
［項１３４］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１２５に記載の方法。
［項１３５］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１２５に記載の方法。
［項１３６］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１２５に記載の方法。
［項１３７］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１２５に記載の方法。
［項１３８］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、項１２５に記載の方法。
［項１３９］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１２５に記載の方法。
［項１４０］
融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、項１２５に記載の方法。
［項１４１］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、項１２５に記載の方法。
［項１４２］
中枢神経系におけるＡＳＭ欠損がニーマン・ピック病である、項１２５に記載の方法。
［項１４３］
ＡＳＭが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、項１２５に記載の方法。
［項１４４］
(ａ)ＡＳＭおよび(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。
［項１４５］
ＡＳＭのアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、項１４４に記載の融合抗体。
［項１４６］
ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、項１４４に記載の融合抗体。
［項１４７］
ＡＳＭのアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、項１４４に記載の融合抗体。
［項１４８］
該融合抗体がスフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホコリンへの加水分解を触媒する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１４９］
該融合タンパク質がＡＳＭのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５０］
リンカーが配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５１］
融合抗体のＡＳＭ比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５２］
ＡＳＭが分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５３］
ＡＳＭおよび免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５４］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５５］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５６］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５７］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５８］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１４４に記載の融合抗体。
［項１５９］
該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１６０］
該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１６１］
該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、項１４４に記載の融合抗体。
［項１６２］
治療有効量の項１４４に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
［項１６３］
項１４４に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
［項１６４］
単離ポリヌクレオチドが配列番号２０の核酸配列を含む、項１６３に記載の単離ポリヌクレオチド。
［項１６５］
項１６３に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［項１６６］
配列番号２０の核酸配列を含む、項１６５に記載のベクター。
［項１６７］
項１６４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［項１６８］
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、項１６７に記載の宿主細胞。
［項１６９］
配列番号１８と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
［項１７０］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも８５％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７１］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９０％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７２］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９５％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７３］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９６％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７４］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９７％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７５］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９８％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７６］
アミノ酸配列が配列番号１８と少なくとも９９％同一である、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７７］
アミノ酸配列が１６９を含む、項１６９に記載の単離ポリペプチド。
［項１７８］
配列番号１８のアミノ酸２３５～２６５を含む、単離ポリペプチド。
［項１７９］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるパルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１型(ＰＰＴ１)欠損を処置する方法であって、ＰＰＴ１活性を有する融合抗体を該対象に全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)ＰＰＴ１および(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含み、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項１８０］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、項１７９に記載の方法。
［項１８１］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合している、項１７９に記載の方法。
［項１８２］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、項１７９に記載の方法。
［項１８３］
融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、項１７９に記載の方法。
［項１８４］
ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１７９に記載の方法。
［項１８５］
ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１７９に記載の方法。
［項１８６］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約２.５μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、項１７９に記載の方法。
［項１８７］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、項１７９に記載の方法。
［項１８８］
融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも１００ミリ単位／mgである、項１７９に記載の方法。
［項１８９］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１７９に記載の方法。
［項１９０］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１７９に記載の方法。
［項１９１］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１７９に記載の方法。
［項１９２］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１７９に記載の方法。
［項１９３］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１７９に記載の方法。
［項１９４］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびインシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１７９に記載の方法。
［項１９５］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、項１７９に記載の方法。
［項１９６］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、項１７９に記載の方法。
［項１９７］
中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がＮＣＬ１バッテン病である、項１７９に記載の方法。
［項１９８］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン軽鎖を含み；ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項１９９］
融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、項１９８に記載の方法。
［項２００］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約１.５μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、項１９８に記載の方法。
［項２０１］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、項１９８に記載の方法。
［項２０２］
融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、項１９８に記載の方法。
［項２０３］
ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１９８に記載の方法。
［項２０４］
ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、項１９８に記載の方法。
［項２０５］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、項１９８に記載の方法。
［項２０６］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、項１９８に記載の方法。
［項２０７］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、項１９８に記載の方法。
［項２０８］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、項１９８に記載の方法。
［項２０９］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、項１９８に記載の方法。
［項２１０］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、項１９８に記載の方法。
［項２１１］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、項１９８に記載の方法。
［項２１２］
融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、項１９８に記載の方法。
［項２１３］
中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がＮＣＬ１バッテン病である、項１９８に記載の方法。
［項２１４］
処置を必要とする対象の中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損症を処置する方法であって、該対象にＰＰＴ１活性を有する融合抗体の治療有効用量を全身的に投与することを含み、ここで、該融合抗体が(ａ)免疫グロブリン軽鎖およびＰＰＴ１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および(ｂ)免疫グロブリン重鎖を含み；ここで、該融合抗体が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過し、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものである、方法。
［項２１５］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２１４に記載の方法。
［項２１６］
融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項２１４に記載の方法。
［項２１７］
５０kg体重当たりで正規化して、少なくとも約５０μgのＰＰＴ１酵素が脳に送達される、請求項２１４に記載の方法。
［項２１８］
治療有効用量が少なくとも約０.１mg／kg体重を含む、請求項２１４に記載の方法。
［項２１９］
融合抗体のＰＰＴ１比活性が約１００ミリ単位／mgである、請求項２１４に記載の方法。
［項２２０］
ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２１４に記載の方法。
［項２２１］
ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離立した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２１４に記載の方法。
［項２２２］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２１４に記載の方法。
［項２２３］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２１４に記載の方法。
［項２２４］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２１４に記載の方法。
［項２２５］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２１４に記載の方法。
［項２２６］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２１４に記載の方法。
［項２２７］
融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。
［項２２８］
融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。
［項２２９］
融合抗体がインスリン受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２１４に記載の方法。
［項２３０］
全身投与が非経腸、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮または呼吸器である、請求項２１４に記載の方法。
［項２３１］
中枢神経系におけるＰＰＴ１欠損がニーマン・ピック病である、請求項２１４に記載の方法。
［項２３２］
ＰＰＴ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２１４に記載の方法。
［項２３３］
(ａ)ＰＰＴ１および(ｂ)内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系に結合することにより血液脳関門(ＢＢＢ)を通過できる免疫グロブリンを含む融合抗体であって、ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも１０％を保持するものであるである、融合抗体。
［項２３４］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンに共有結合している、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２３５］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２３６］
ＰＰＴ１のアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端に共有結合される、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２３７］
該融合抗体が脂肪酸アシルタンパク質コンジュゲートのチオエステル結合の加水分解を触媒する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２３８］
該融合タンパク質がＰＰＴ１のアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーをさらに含む、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２３９］
リンカーが配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４０］
融合抗体のＰＰＴ１比活性が少なくとも約１００ミリ単位／mgである、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４１］
ＰＰＴ１が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４２］
ＰＰＴ１および免疫グロブリンの各々が分離した存在としてのその活性と比較してその活性の少なくとも２０％を保持する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４３］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧの免疫グロブリン重鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４４］
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン重鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４５］
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号３のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４６］
免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダクラスの免疫グロブリン軽鎖である、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４７］
免疫グロブリン軽鎖が配列番号４のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ２または配列番号６のアミノ酸配列に対応するＣＤＲ３を含む、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４８］
該融合抗体が内在性ＢＢＢ受容体介在輸送系の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２４９］
該融合抗体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体およびＩＧＦ受容体からなる群から選択される内在性ＢＢＢ受容体を介してＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２５０］
該融合抗体がインスリン受容体の結合によりＢＢＢを通過する、請求項２３３に記載の融合抗体。
［項２５１］
治療有効量の請求項２３３に記載の融合抗体および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
［項２５２］
請求項２３３に記載の融合抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
［項２５３］
単離ポリヌクレオチドが配列番号２５の核酸配列を含む、請求項２５２に記載の単離ポリヌクレオチド。
［項２５４］
請求項２５２に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［項２５５］
配列番号２５の核酸配列を含む、請求項２５４に記載のベクター。
［項２５６］
請求項２５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［項２５７］
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である、請求項２５６に記載の宿主細胞。
［項２５８］
配列番号２３と８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
［項２５９］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも８５％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６０］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９０％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６１］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９５％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６２］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９６％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６３］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９７％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６４］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９８％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６５］
アミノ酸配列が配列番号２３と少なくとも９９％同一である、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６６］
アミノ酸配列が配列番号２３を含む、請求項２５８に記載の単離ポリペプチド。
［項２６７］
配列番号２３のアミノ酸４６２～４９２を含む、単離ポリペプチド。

【外国語明細書】