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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024154305
(43)【公開日】2024-10-30
(54)【発明の名称】人工脈管網の製造装置、製造キットおよび製造方法
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20241023BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241023BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023068074
(22)【出願日】2023-04-18
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業」「ヒト胎盤の発生・分化に関する理解と臓器チップモデルの作製」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】堀 武志
(72)【発明者】
【氏名】梶 弘和
(72)【発明者】
【氏名】山本 茜
(72)【発明者】
【氏名】北野 勇
(72)【発明者】
【氏名】石原 甲平
(72)【発明者】
【氏名】水田 太郎
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA07
4B029BB11
4B029CC02
4B029DA10
4B029GA08
4B029GB09
4B029GB10
4B065AA90X
4B065BC11
4B065BC41
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する血管網等の脈管網を容易に作製することができる人工脈管網の製造装置等の実現。
【解決手段】人工脈管網の製造装置（１００）は、第１メッシュシート（１１）を底面に備え、ゲルを収容している第１支持体（２）と、第２メッシュシート（１２）を底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体（６）と、を備える。
【選択図】図１
【解決手段】人工脈管網の製造装置（１００）は、第１メッシュシート（１１）を底面に備え、ゲルを収容している第１支持体（２）と、第２メッシュシート（１２）を底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体（６）と、を備える。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容している第１支持体と、
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、
前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている、人工脈管網の製造装置。
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、
前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている、人工脈管網の製造装置。
【請求項2】
前記脈管内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項１に記載の製造装置。
【請求項3】
前記第２支持体には、前記第１メッシュシートと前記第２メッシュシートとの距離を一定に保つための固定部がさらに設けられている、請求項１に記載の製造装置。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の製造装置と、
前記製造装置が離接可能に収容され、前記脈管内皮細胞を培養するための培地を収容する容器と、を備え、
前記容器に収容される培地と前記第１メッシュシートとが接触するように、前記製造装置が前記容器に収容されている、人工脈管網の製造システム。
前記製造装置が離接可能に収容され、前記脈管内皮細胞を培養するための培地を収容する容器と、を備え、
前記容器に収容される培地と前記第１メッシュシートとが接触するように、前記製造装置が前記容器に収容されている、人工脈管網の製造システム。
【請求項5】
第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容するための第１支持体と、
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記第１支持体に挿入されるように前記第２支持体が構成されているものである、人工脈管網の製造キット。
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記第１支持体に挿入されるように前記第２支持体が構成されているものである、人工脈管網の製造キット。
【請求項6】
第１メッシュシートを底面に備える第１支持体にゲル化溶液を供給する、ゲル化溶液供給工程、
第２メッシュシートを前記ゲル化溶液と接触するように配置する、第２メッシュシート配置工程、
前記ゲル化溶液をゲル化することによってゲルを調製する、ゲル調製工程、
脈管内皮細胞を前記第１メッシュシートまたは前記第２メッシュシートに播種する、播種工程、
前記ゲル調製工程後、前記脈管内皮細胞を培養する培養工程、を含み、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下である、人工脈管網の製造方法。
第２メッシュシートを前記ゲル化溶液と接触するように配置する、第２メッシュシート配置工程、
前記ゲル化溶液をゲル化することによってゲルを調製する、ゲル調製工程、
脈管内皮細胞を前記第１メッシュシートまたは前記第２メッシュシートに播種する、播種工程、
前記ゲル調製工程後、前記脈管内皮細胞を培養する培養工程、を含み、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下である、人工脈管網の製造方法。
【請求項7】
前記脈管内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記第２メッシュシート配置工程では、前記第２メッシュシートを底面に備える第２支持体の底面を前記ゲル化溶液と接触させることにより、前記第２メッシュシートを配置する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項9】
前記ゲル調製工程後、前記第１支持体を容器に収容する、第１支持体収容工程と、
前記第１支持体および前記容器に培地を供給する、培地供給工程と、をさらに含み、
前記第１支持体に供給される培地が、前記容器に供給される培地とは異なる、請求項６に記載の製造方法。
前記第１支持体および前記容器に培地を供給する、培地供給工程と、をさらに含み、
前記第１支持体に供給される培地が、前記容器に供給される培地とは異なる、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、人工脈管網の製造装置、製造キットおよび製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
世界一の高齢社会である日本国において、健康寿命を縮める最大のリスクは生活習慣病（糖尿病、高血圧、高脂血症、心筋梗塞、脳卒中等）である。不規則な食事または睡眠、運動不足等から引き起こされる生活習慣病は「血液または血管の状態」と密接に関わっている。例えば、血糖値の高いドロドロした血液になると血管に酸化ストレスが生じる。このストレスにより引き起こされる血管へのダメージが生活習慣病発症のリスク要因となる。
【0003】
このような社会的な背景から血管構成細胞（特に血管内皮細胞）をin vitroで使用した血管研究が活発に行われてきた。
【0004】
例えば、非特許文献１には、血管内皮細胞を培養皿内で培養した血管モデルが開示されている。非特許文献２には、コラーゲンゲルまたはマトリゲル（細胞外基質）の中で血管内皮細胞を培養し、チューブ状の人工血管網をゲル内で形成させる方法が開示されている。非特許文献３には、マイクロ流体デバイス内で灌流可能な人工血管網を作製する方法が開示されている。
【0005】
また、非特許文献４および５には、インサートカラムを使用した人工血管モデルの作製方法が開示されている。インサートカラムとは、一般的なマルチウェルプレートの上から挿入または搭載するカラムである。当該カラム内で人工血管網を作製することによって、カラム内からカラム外への溶液の灌流ができるようになる。非特許文献４には、カラム内に細胞を積層する技術を使用して作製した灌流可能な血管が開示されている。非特許文献５には、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を懸濁させたフィブリンゲルを多数の孔の開いた２枚のＰＤＭＳ膜でサンドイッチし、上下から培地を供給することによりＨＵＶＥＣの管腔化を促していることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】You, L., et al., Astragaloside IV prevents high glucoseinduced cell apoptosis and inflammatory reactions through inhibition of the JNK pathway in human umbilical vein endothelial cells. Mol Med Rep, 2019. 19(3): p. 1603-1612.
【非特許文献2】Pulliero, A., et al., Inhibition of neuroblastoma cell growth by TREX1-mutated human lymphocytes. Oncol Rep, 2012. 27(5): p. 1689-94.
【非特許文献3】Kim, S., et al., Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip, 2013. 13(8): p. 1489-500.
【非特許文献4】Hikimoto, D., et al., High-Throughput Blood- and Lymph-Capillaries with Open-Ended Pores Which Allow the Transport of Drugs and Cells. Adv Healthc Mater, 2016. 5(15): p. 1969-78.
【非特許文献5】Bang, S., et al., 3D Microphysiological System‐Inspired Scalable Vascularized Tissue Constructs for Regenerative Medicine. Advanced Functional Materials, 2021. 32(1): p. 2105475.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
非特許文献１の血管モデルは、血管内皮細胞に対する物質の影響を簡易的に調べることができるが、チューブ状の形態をしておらず、実際の血管機能を十分に保持していないと考えられる。
【0008】
非特許文献２の方法によるチューブ状の人工血管網の形成は簡便であるが、血管チューブがゲル内部に埋もれており、チューブ内部に物質を通すことができない。したがって、血管に対する物質の影響を適切に評価することができないものと考えられる。
【0009】
一般的に血管研究で使用されるマイクロ流体デバイスの流路の高さ（ｚ軸方向）は1００～２００μｍ程度であるため、非特許文献３の方法により作製されるチューブ状の血管はｚ軸方向への伸長が制限されている。したがって、生体を模倣した血管網を作製することはできない。さらに、マイクロ流体デバイスを使用した非特許文献３の方法では、例えば９６穴ウェルプレート等のマルチウェルプレートを使用したサンプル処理等の多検体処理に不向きである。
【0010】
非特許文献４の方法では、例えば、内皮細胞層１つ、線維芽細胞層４つ、内皮細胞層１つ、線維芽細胞層４つ、内皮細胞層１つ、を積層していき、増殖した内皮細胞が血管様チューブを形成する。このように細胞層を数ステップに分けて積層する必要があるため、やや手間がかかる。非特許文献４の方法は、灌流可能な血管を作れるという利点はあるが、最終産物の厚み（上面から下面までの距離）が約５０μｍと極めて薄い。そのため、ｘｙ軸方向への血管伸長は観察できるものの、ｚ軸方向（垂直方向）への顕著な伸長は起きないため、被験物質（薬剤または他の種類の細胞、等）の血管チューブに対するｚ軸方向への影響の解析が難しい。さらに、積層する細胞層に線維芽細胞層が含まれているため、血管内皮細胞のみの解析（例えば、明視野での顕微鏡観察または遺伝子発現解析）が難しい。
【0011】
非特許文献５の方法では、ゲルの上面と下面から供給される培地の種類は同じであり、さらに使用されるＰＤＭＳ膜の全面積に対する孔の面積は２０％以下と低い。この方法では、灌流可能な血管は作製できていない。
【0012】
このように、従来の人工血管網の作製方法では、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する血管網を容易に作製することができず、人工血管網の作製に関するさらなる研究開発が望まれている。
【0013】
本発明の一態様は、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する血管網等の脈管網を容易に作製することができる人工脈管網の製造装置等を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造装置は、第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容している第１支持体と、
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、
前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている、人工脈管網の製造装置である。
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、
前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている、人工脈管網の製造装置である。
【0015】
また、本発明の一態様に係る人工脈管網の製造キットは、第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容するための第１支持体と、
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記第１支持体に挿入されるように前記第２支持体が構成されているものである、人工脈管網の製造キットである。
第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、
前記第１支持体に挿入されるように前記第２支持体が構成されているものである、人工脈管網の製造キットである。
【0016】
また、本発明の一態様に係る人工脈管網の製造方法は、第１メッシュシートを底面に備える第１支持体にゲル化溶液を供給する、ゲル化溶液供給工程、
第２メッシュシートを前記ゲル化溶液と接触するように配置する、第２メッシュシート配置工程、
前記ゲル化溶液をゲル化することによってゲルを調製する、ゲル調製工程、
脈管内皮細胞を前記第１メッシュシートまたは前記第２メッシュシートに播種する、播種工程、
前記ゲル調製工程後、前記脈管内皮細胞を培養する培養工程、を含み、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下である、人工脈管網の製造方法である。
第２メッシュシートを前記ゲル化溶液と接触するように配置する、第２メッシュシート配置工程、
前記ゲル化溶液をゲル化することによってゲルを調製する、ゲル調製工程、
脈管内皮細胞を前記第１メッシュシートまたは前記第２メッシュシートに播種する、播種工程、
前記ゲル調製工程後、前記脈管内皮細胞を培養する培養工程、を含み、
前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下である、人工脈管網の製造方法である。
【発明の効果】
【0017】
本発明の一態様によれば、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する血管網等の脈管網を容易に作製することができる人工脈管網の製造装置等を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】製造装置１の第１支持体２および第２支持体６の概略構成を示す図である。
【図2】製造装置１の第１支持体２および第２支持体６の概略構成を示す図である。
【図3】第２支持体６を第１支持体２内に挿入後の概略構成を示す図である。
【図4】第２支持体６を第１支持体２内に挿入後の概略構成を示す図である。
【図5】製造装置１の断面図である。
【図6】製造装置１の断面図である。
【図8】製造装置１の写真である。
【図9】製造装置１の写真である。
【図10】製造装置１の写真である。
【図11】製造装置１の写真である。
【図12】製造装置１００の第２支持体１０６の平面図である。
【図13】製造装置１００の第１支持体１０２の平面図である。
【図14】第２支持体１０６を第１支持体１０２に挿入する前の製造装置１００の斜視図である。
【図15】第２支持体１０６を第１支持体１０２に挿入する前の製造装置１００の正面断面図である。
【図16】ゲルが収容された製造装置１００の概略構成を示す図である。
【図17】第１支持体１０２の写真である。
【図18】倒立させた製造装置１００の写真である。
【図20】製造システム１０００の概略構成を示す図である。
【図21】人工脈管網の製造方法の一例を示す図である。
【図22】実施例で使用したメッシュシートの部分拡大図である。
【図23】実施例１の結果を示す図である。
【図24】実施例２で作製した人工脈管網の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図25】実施例２の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書において「Ａ～Ｂ」とは、特に指定しない限りＡ以上Ｂ以下であることを示している。
【0020】
〔人工脈管網の製造装置〕
［実施形態１］
以下、本発明の実施形態１に係る人工脈管網の製造装置（以下、「製造装置１」と示す場合がある）について、図１～１１に基づき、詳細に説明する。製造装置１は、脈管内皮細胞から人工脈管網を製造するための装置である。製造装置１によって製造された人工脈管網は、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する脈管網である。
［実施形態１］
以下、本発明の実施形態１に係る人工脈管網の製造装置（以下、「製造装置１」と示す場合がある）について、図１～１１に基づき、詳細に説明する。製造装置１は、脈管内皮細胞から人工脈管網を製造するための装置である。製造装置１によって製造された人工脈管網は、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する脈管網である。
【0021】
本明細書において、「人工脈管網」とは、脈管内皮細胞を培養することによって得られる、人工的に作製した三次元脈管網（脈管のネットワーク）を示す。脈管の例として、血管およびリンパ管等が挙げられる。
【0022】
図１～２は、製造装置１の第１支持体２および第２支持体６の概略構成を示す図である。図３～４は、第２支持体６を第１支持体２内に挿入後の概略構成を示す図である。図５および６は、製造装置１の断面図であり、図７は図６の部分拡大図である。図８～１１は、製造装置１の写真を示す。
【0023】
図１に示すように、製造装置１は、第１支持体２と、第２支持体６と、を備える、二重カラム式デバイスである。第１支持体２は、ゲルを収容するための部材である。第２支持体６は、第１支持体２内に挿入され、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための部材である。
【0024】
（ゲル）
ゲルは、脈管内皮細胞の足場となる。ゲルの例として、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン、フィブリン、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲン等の細胞外マトリックスを含むゲル等が挙げられる。ゲルは、上記細胞外マトリックスを含む溶液であるゲル化溶液をゲル化させることによって調製することができる。
ゲルは、脈管内皮細胞の足場となる。ゲルの例として、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン、フィブリン、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲン等の細胞外マトリックスを含むゲル等が挙げられる。ゲルは、上記細胞外マトリックスを含む溶液であるゲル化溶液をゲル化させることによって調製することができる。
【0025】
上記細胞外マトリックスとしてフィブリノーゲンを使用する場合、フィブリノーゲンを含む溶液とトロンビンとを混合することによって、当該溶液のゲル化が促進され、ゲルを調製することができる。
【0026】
ゲルの濃度を調整することによって、人工脈管網の各脈管の太さを約５～２００μｍ程度に調整することができる。
【0027】
（第１支持体２）
第１支持体２は、第１支持体本体３と、容器当接部４と、溝５と、第１メッシュシート１１と、を備える。
第１支持体２は、第１支持体本体３と、容器当接部４と、溝５と、第１メッシュシート１１と、を備える。
【0028】
第１支持体２を構成する材料の例として、例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。第１支持体２は例えば、射出成形等の成形によって作製することができる。
【0029】
第１支持体本体３はカラムの形状を有している。第１支持体本体３の大きさは、目的の人工脈管網の大きさに応じて適宜選択すればよい。例えば、第１支持体本体３の内径は２～２０ｍｍであってもよい。
【0030】
第１支持体本体３の上部に設けられ、円環状である容器当接部４を後述する容器の上端面と当接させることによって、製造装置１を容器内に保持することができる。そして、第１支持体の第１メッシュシート１１と容器内の培地とが接触することによって、培地の栄養成分を製造装置１に播種された脈管内皮細胞に供給することができる。
【0031】
容器当接部４の大きさおよび形状は、容器の大きさに応じて適宜選択することができる。
【0032】
第１支持体本体３に設けられている溝５に、後述する第２支持体６の固定部（突起）８を挿入することによって、第２支持体６を所望の位置で第１支持体２内に固定させることができる。
【0033】
（第１メッシュシート１１）
第１メッシュシート１１は、第１支持体本体３の底面に備えられている。第１メッシュシート１１としては、脈管内皮細胞を播種できることができ、さらに脈管内皮細胞が増殖することができる構造であれば、特に限定されない。第１メッシュシート１１は、所定の形状の開口部が規則的または非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体が好ましい。第１メッシュシート１１は、平面視において、多角形の開口部を多数有することがより好ましい。第１メッシュシート１１の開口部の形状は、典型的には三角形、四角形、六角形等の多角形であるが、円、楕円またはその他の多角形であってもよい。なお、第１メッシュシート１１の開口部の形状とは、メッシュシートを構成するフレームに囲まれた領域の形状であるともいえる。
第１メッシュシート１１は、第１支持体本体３の底面に備えられている。第１メッシュシート１１としては、脈管内皮細胞を播種できることができ、さらに脈管内皮細胞が増殖することができる構造であれば、特に限定されない。第１メッシュシート１１は、所定の形状の開口部が規則的または非規則的に繰り返し並んだ平面状の構造体が好ましい。第１メッシュシート１１は、平面視において、多角形の開口部を多数有することがより好ましい。第１メッシュシート１１の開口部の形状は、典型的には三角形、四角形、六角形等の多角形であるが、円、楕円またはその他の多角形であってもよい。なお、第１メッシュシート１１の開口部の形状とは、メッシュシートを構成するフレームに囲まれた領域の形状であるともいえる。
【0034】
本明細書において、メッシュシートの開口部以外の部分をフレームまたはフレーム部と示す。また、メッシュシートの開口部の面積がマイクロ平方メートルサイズであるとき、メッシュシートは、マイクロメッシュ等と称する場合もある。
【0035】
第１メッシュシート１１の材料は、脈管内皮細胞が付着し増殖できる材料であればよく、例えば、光硬化性樹脂、生体適合性材料、生体分解性材料等を使用することができる。
【0036】
光硬化性樹脂を第１メッシュシート１１の材料として使用する場合、フォトリソグラフィ法によってメッシュシートを作製することができる。当該光硬化性樹脂としては、例えば、アクリレート化合物、メタクリレート化合物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物、チオール化合物、シリコーン系化合物等が挙げられる。これらの樹脂を２種以上組み合わせて使用してもよい。当該光硬化性樹脂の具体例としては、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、エポキシアクリレート、ポリ（メタ）アクリル酸メチル、エトキシ化ビスフェノールＡアクリレート、脂肪族ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリル変性脂環式エポキシド、２官能アルコールエーテル型エポキシド、アクリルシリコーン、アクリルジメチルシロキサン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0037】
光硬化性樹脂を第１メッシュシート１１の材料としてフォトリソグラフィ法によってメッシュシートを作製する場合、露光した部分が除去されるポジ型のレジストを用いてマイクロメッシュシートを作製することができる。例えば、ポジ型のレジストとして、ＤＮＱ（ジアゾナフトキノン）ノボラック系樹脂ポジ型レジスト、ｔ－ブトキシカルボニル、テトラヒドロピラン、フエノキシエチル、トリメチルシリル、t－ブトキシカルボニルメチル等の脱保護反応型、ポリフタルアルデヒド、ポリカーボネート、ポリシリエルーテル等の解重合反応型のレジストが挙げられる。また、フォトリソグラフィ法に使用される現像液の例として、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＭＥＫ（メルエチルケトン）、ＧＢＬ（γ－ブチロラクトン）、ＥＬ（乳酸エチル）等が挙げられる。
【0038】
第１メッシュシート１１の材料として使用し得る生体適合性材料としては、シリコーン、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡＸ）、ポリウレタン、シリコーン－ポリウレタン共重合体、セラミックス、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ゴアテックス（商標）等の超高分子量ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、その他生体由来材料等が挙げられるがこれらに限定されない。また、前記メッシュシートは、生体適合性材料以外の材料で形成し、表面を生体適合性材料で処理したものであってもよい。
【0039】
上記生体分解性材料としては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、およびそれらの共重合体、ＰＨＢ－ＰＨＶ系ポリ（アルカン酸）類、ポリエステル類、デンプン、セルロース、キトサン等の天然高分子またはその誘導体等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0040】
第１メッシュシート１１の材料としては、生体への毒性が低い点で、上記の中でも、ポリエステル、とりわけポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。また、蛍光顕微鏡観察の際に自家蛍光を抑えるため、ＰＥＴは黒色に染色されていることが好ましい。ポリエステル製のメッシュシートの具体例として、天池合繊社（アマイケ社）製の生地ＡＧ００１Ｎ０、ＡＧ００Ｚ１Ｎ０、ＡＧ００Ｚ３Ｎ０、水田製作所社製メッシュシート等が挙げられる。また、黒色に染色されたポリエステル製のメッシュシートの具体例として、天池合繊社（アマイケ社）製の生地ＡＧ００１Ｎ１、ＡＧ００Ｚ１Ｎ９、ＡＧ００Ｚ３Ｎ９等が挙げられる。
【0041】
また、第１メッシュシート１１は、予め細胞接着促進材料でコーティングされていてもよい。細胞接着促進材料でコーティングすることによって、脈管内皮細胞を培養支持体に定着させて伸展または増殖をし易くできる。細胞接着促進材料の例として、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックスタンパク質、ポリＬリジン等の陽性電荷物質等が挙げられる。細胞接着促進材料として、具体的には、マトリゲル（登録商標）が挙げられる。
【0042】
第１メッシュシート１１の開口部の形状は、一方向に伸長した形状であってもよい。「一方向に伸長した形状」とは、当該形状を規定する複数の軸線のうち、他の軸（短軸）よりも長い軸（長軸）が１つ存在する形状をいう。このような形状として、例えば、長方形、菱形、楕円等が挙げられる。開口部の形状が長方形である場合、長辺が長軸に対応し、短辺が短軸に対応する。また、開口部の形状が菱形である場合、２つの対角線のうちの長い方の対角線が長軸に対応し、短い方の対角線が短軸に対応する。「一方向に伸長した形状」は、例えば、長軸（長辺）が短辺（短軸）よりも遥かに長い長方形、長軸が短軸よりも遥かに長い菱形または楕円が挙げられる。長方形である場合、一方向が伸長した形状は、短辺：長辺が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０の形状である。また、菱形である場合、一方向が伸長した形状は、短軸：長軸が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０の形状である。また、楕円である場合、一方向が伸長した形状は、短軸：長軸が１：２～１：５、好ましくは１：２～１：１０である形状である。勿論、本発明は、これらの構成に限定されない。なお、「一方向に伸長した形状」は、長方形、菱形、楕円に限定されず、当該形状を規定する複数の軸線のうち、他の軸よりも遥かに長い軸が１つ存在する形状であればよい。
【0043】
上記の構成のように第１メッシュシート１１の開口部が一方向に伸長した形状である場合、開口部は、一方向へ長く伸びた大きな壁面を有することになる。当該壁面に接着して増殖する細胞の数は多く、かつ、同様の配向性を有して増殖するので、上記の構成によれば、たとえば増殖する線維芽細胞または心筋細胞の配向性を開口部の伸長方向へ制御することができる。
【0044】
第１メッシュシート１１の開口部は、培養する脈管内皮細胞の少なくとも１個が通過できる大きさであってもよい。開口部が培養する脈管内皮細胞の少なくとも１個が通過できる大きさであるとは、開口部の大きさと、脈管内皮細胞の大きさとが、脈管内皮細胞が変形してまたは変形しないで、開口部を通過できる関係であることを意味する。開口部は、脈管内皮細胞が開口部に接触しないで通過できる大きさであってもよいし、脈管内皮細胞が接触しながら（換言すれば、脈管内皮細胞が変形しながら）通過できる大きさであってもよい。
【0045】
第１メッシュシート１１の開口部が略四角形である場合、培地中の栄養成分が脈管内皮細胞に十分供給される点で、略四角形の一辺が２５μｍ以上であることが好ましく、５０μｍ以上であることがより好ましく、７５μｍ以上であることがさらに好ましい。また、ゲルを保持する点で、当該略四角形の一辺が２２５μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以下であることがより好ましく、１７５μｍ以下であることがさらに好ましい。
【0046】
第１メッシュシート１１の開口部の面積は、培地中の栄養成分が脈管内皮細胞に十分供給される点で、１０００μｍ２以上が好ましく、５０００μｍ２以上がより好ましく、１００００μｍ２以上がさらに好ましい。また、ゲルを保持する点で、当該開口部の面積は、７００００μｍ２以下が好ましく、６００００μｍ２以下がより好ましく、５００００μｍ２以下がさらに好ましい。
【0047】
本明細書において、第１メッシュシート１１の開口率（空隙率）とは、メッシュシートの面積に対する、開口（孔）の総面積の割合を示す。第１メッシュシート１１の開口率は、２５％以上８０％以下である。培地中の栄養成分が脈管内皮細胞に十分供給される点で、当該開口率は、３０％以上であることが好ましく、３５％以上であることがより好ましく、４０％以上であることがさらに好ましい。また、ゲルを保持する点で、当該開口率は、７５％以下であることが好ましく、７０％以下であることがより好ましく、６５％以下であることがさらに好ましい。
【0048】
（第２支持体６）
第２支持体６は、第２支持体６の底面に備えられる第２メッシュシートが、第１支持体２に収容されるゲルと接触するように、第１支持体２内に挿入される部材である。第２支持体６は、第２支持体本体７と、突起８、８’、８’’と、第２メッシュシート１２と、を備える。
第２支持体６は、第２支持体６の底面に備えられる第２メッシュシートが、第１支持体２に収容されるゲルと接触するように、第１支持体２内に挿入される部材である。第２支持体６は、第２支持体本体７と、突起８、８’、８’’と、第２メッシュシート１２と、を備える。
【0049】
第２支持体６が第１支持体２内に挿入されることによって、第２支持体６に収容される培地と第１支持体２内のゲルとが第２メッシュシート１２を介して接触し、培地の栄養成分を製造装置１に播種された脈管内皮細胞に供給することができる。
【0050】
製造装置１によって、第１支持体２に収容されるゲルは、第１メッシュシート１１および第２メッシュシート１２によって挟まれる。当該構成によって、第１メッシュシート１１に接触させる培地および第２メッシュシート１２に接触させる培地それぞれから栄養が脈管内皮細胞に供給される。
【0051】
第２支持体６を構成する材料の例は、第１支持体２と同様である。第２支持体６を構成する材料は、第１支持体２を構成する材料と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0052】
第２支持体本体７はカラムの形状を有している。第２支持体本体７は、第１支持体本体３内に挿入することができれば、大きさは特に限定されない。第２支持体本体７の外面は、第１支持体本体３の内面と接触していてもよいし、当該内面と離間させてもよい。第２支持体本体７の外面と第１支持体本体３の内面とを離間させることによって、第１支持体本体３内の過剰なゲルを、当該離間によって生じた空間に移動させることができる。
【0053】
第２支持体本体７の上面に、サイズが異なる３種類の突起８、８’、８’’が備えられている。図５～７のように、第１支持体本体３の溝５に、３種類の突起８、８’、８’’のいずれかを挿入させることによって、第２支持体６を所望の位置で第１支持体２内に固定させることができる。突起を第１支持体本体３の溝５に挿入することによって、第２支持体本体７全体が第１支持体本体３内に挿入される。
【0054】
第２メッシュシート１２を構成する材料ならびに開口部の形状および大きさ等の例は、第１メッシュシート１１と同様である。第２メッシュシート１２を構成する材料ならびに開口部の形状および大きさはそれぞれ、第１メッシュシート１１と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0055】
培地中の栄養成分を脈管内皮細胞により十分に供給できる点で、第１メッシュシート１１および第２メッシュシート１２の少なくとも一方のメッシュシートの開口率が２５％以上８０％以下であることが好ましく、第１メッシュシート１１および第２メッシュシート１２の両方のメッシュシートの開口率が２５％以上８０％以下であることが好ましい。
【0056】
図８は、倒立させた、第１支持体２および第２支持体６の写真である。図９は第１支持体２および第２支持体６の側面の写真である。図１０は、第２支持体６を第１支持体２内に挿入後の、倒立させた製造装置１の写真である。
【0057】
図１１は、リング１３を装着し、倒立させた製造装置１の写真である。製造装置１は、第１メッシュシート１１の周縁部を覆い、第１支持体２に着脱可能に取り付けられる、リング１３を備えていてもよい。リング１３によって、脈管内皮細胞を含む細胞懸濁液を数百μＬ以上、第１メッシュシート１１に搭載することによって、脈管内皮細胞を容易に播種することができる。リング１３を構成する材料の例は、第１支持体２と同様である。リング１３を構成する材料は、第１支持体２を構成する材料と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0058】
（脈管内皮細胞）
脈管内皮細胞を製造装置１に播種し、培養することによって、ゲル内で内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する脈管網を製造することができる。脈管内皮細胞の例として、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞等が挙げられる。血管内皮細胞の例として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Entothelial Cells、ＨＵＶＥＣ）等が挙げられる。リンパ管内皮細胞の例として、Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells (HMVEC-dLyAd, Lonza)等が挙げられる。
脈管内皮細胞を製造装置１に播種し、培養することによって、ゲル内で内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する脈管網を製造することができる。脈管内皮細胞の例として、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞等が挙げられる。血管内皮細胞の例として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Entothelial Cells、ＨＵＶＥＣ）等が挙げられる。リンパ管内皮細胞の例として、Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells (HMVEC-dLyAd, Lonza)等が挙げられる。
【0059】
脈管内皮細胞は、第１メッシュシート１１または第２メッシュシート１２に直接播種してもよい。また、脈管内皮細胞を含むゲル化溶液を第１支持体２に収容し、当該ゲル化溶液をゲル化させてゲルを調製することによって、脈管内皮細胞を第１メッシュシート１１または第２メッシュシート１２に播種してもよい。より効率的に脈管内皮細胞を増殖させることができる点で、脈管内皮細胞を第１メッシュシート１１に播種することが好ましく、ゲルと接触する表面とは反対側の第１メッシュシートの表面に脈管内皮細胞を播種することがより好ましい。ゲルと接触する表面とは反対側の第１メッシュシートの表面に脈管内皮細胞を播種するときは、より多くの脈管内皮細胞を播種することができる点で、第１支持体２にリング１３を装着することが好ましい。
【0060】
脈管内皮細胞以外のその他の細胞を、脈管内皮細胞と共に製造装置１に播種してもよい。その他の細胞の例として、ペリサイト（周皮細胞）等の血管構成細胞；Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells (HMVEC-dLyAd, Lonza)等のリンパ管構成細胞；等が挙げられる。
【0061】
本製造装置によって、灌流可能なチューブ状の脈管網を簡単に製造することができる。本製造装置を例えば、９６穴プレートのウェルに収容することによって、多検体処理が可能となる。
【0062】
本製造装置においては、脈管がゲルの下から上に（第１支持体のメッシュシート側から第２支持体のメッシュシート側に）、または、上から下に（第２支持体のメッシュシート側から第１支持体のメッシュシート側に）四方八方（ｘｙｚ軸方向）に成長する。したがって、本製造装置によって、生体内の脈管を模倣した三次元的な配置をした人工脈管網を作製することができる。例えば、本製造装置によって製造された、三次元的な配置をした人工血管網を使用して、血管腫（血管の奇形）および動脈瘤（網膜動脈瘤等）等の血管の形態異常の解析が実施できる可能性がある。また、本製造装置によって製造された血管内に溶液を灌流することができるため、血管内皮細胞に対する適切な物質応答を評価することができる。
【0063】
本発明の一態様に係る製造装置に第１メッシュシート１１および第２メッシュシート１２が備えられていることによって、脈管内皮細胞が塊状に凝集することを抑制し、効率的に人工脈管を製造することができる。また、第１メッシュシート１１および第２メッシュシート１２が備えられていることによって、培地中のより多くの栄養を脈管内皮細胞に供給することができ、脈管形成を促進することができる。
【0064】
〔実施形態２〕
以下、本発明の実施形態２に係る人工脈管網の製造装置（以下、「製造装置１００」と示す場合がある）について、図１２～１９に基づき、詳細に説明する。なお、説明の便宜上、実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。製造装置１００は、キャップの形状を有する第１支持体１０２と、第２支持体１０６と、を備える、キャップ式デバイスである。
以下、本発明の実施形態２に係る人工脈管網の製造装置（以下、「製造装置１００」と示す場合がある）について、図１２～１９に基づき、詳細に説明する。なお、説明の便宜上、実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。製造装置１００は、キャップの形状を有する第１支持体１０２と、第２支持体１０６と、を備える、キャップ式デバイスである。
【0065】
図１２は、第２支持体１０６の平面図である。図１３は、第１支持体１０２の平面図である。図１４は、第２支持体１０６を第１支持体１０２に挿入する前の製造装置１００の斜視図である。図１５は、第２支持体１０６を第１支持体１０２に挿入する前の製造装置１００の正面断面図である。図１６は、ゲルが収容された製造装置１００の概略構成を示す図である。
【0066】
【0067】
第１支持体１０２は、第１支持体本体１０３と、メッシュシート１１と、を備える。第１支持体本体１０３は、ＰＤＭＳ等の樹脂によって構成されている。
【0068】
第２支持体１０６は、第２支持体本体１０７と、容器当接部１０８と、メッシュシート１２と、を備える。製造装置１の第１支持体２を、製造装置１００の第２支持体１０６として使用してもよい。
【0069】
第２支持体本体１０７の上部に設けられ、円環状である容器当接部１０８を後述する容器の上端面と当接させることによって、製造装置１００を容器内に保持することができる。そして、第１支持体１０２に収容されたゲルと容器内の培地とが第１メッシュシート１１を介して接触することによって、培地の栄養成分を製造装置１００に播種された脈管内皮細胞に供給することができる。
【0070】
図１６に示すように、まずは、第１支持体１０２の第１メッシュシート１１上に（図１６の１６０１）、ゲル化溶液４０を収容する（図１６の１６０２）。次に、第２支持体１０６の第２メッシュシート１２とゲル化溶液４０とが接触するように第２支持体１０６を第１支持体１０２内に挿入する（図１６の１６０３）。第２支持体１０６を第１支持体１０２内に挿入後、第２支持体１０６を所望の位置に固定するために、第２支持体本体１０７の外面と第１支持体本体１０３の内面とが接触していることが好ましい。第２支持体１０６を第１支持体１０２内に挿入後、ゲル化溶液４０をゲル化させることによって、ゲル３０を調製する（図１６の１６０４）。
【0071】
〔人工脈管網の製造システム〕
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造システム（以下、「本製造システム」と示す場合がある）は、上記人工脈管網の製造装置と、当該製造装置が離接可能に収容されている容器と、を備える。本製造システムの一例を、図２０を参照して説明する。
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造システム（以下、「本製造システム」と示す場合がある）は、上記人工脈管網の製造装置と、当該製造装置が離接可能に収容されている容器と、を備える。本製造システムの一例を、図２０を参照して説明する。
【0072】
図２０の製造システム１０００は、製造装置１０と、容器（ウェル）２０と、を備える。製造装置１０は、容器当接部４の形状が異なる以外は本発明の実施形態１の製造装置１と同様の構成である。なお、図２０において、製造装置１０の一部の部材は省略している。
【0073】
製造装置１０は、容器当接部４をウェル２０の上端面に当接させることによって、ウェル２０内に収容されている。ウェル２０は、マルチウェルプレート２００のウェルである。
【0074】
図２０において、ウェル２０に収容されている培地８１と第１メッシュシート１１とが接触するように、製造装置１がウェル２０に収容されている。第１メッシュシート１１が培地８１と十分に接触できるように、第１メッシュシート１１がウェル２０の底面（より好ましくは、ウェルの内壁および底面）と接触せずに、製造装置１０をウェル２０に収容することが好ましい。
【0075】
ウェル２０の底面に対して鉛直方向および水平方向の位置が一定となるように製造装置１がウェル２０内に収容されていることが好ましい。
【0076】
脈管内皮細胞を製造装置１０の第１メッシュシート１１または第２メッシュシート１２に播種し、ウェル２０および製造装置１０内にそれぞれ培地８１および培地９１を収容することによって、製造装置１０のゲル３０内で、人工脈管網６０を製造することができる。
【0077】
培地８１および９１は、脈管内皮細胞の培養で使用されている公知の培地を使用することができる。培地８１および９１は同じであってもよいし、異なっていてもよい。脈管内皮細胞のゲル３０内での移動を促進する点で、第１メッシュシート１１に脈管内皮細胞を播種する場合は、培地９１がより多くの脈管成長因子を含み、培地８１がより少ない脈管成長因子を含むことが好ましい。また、第２メッシュシート１２に播種する場合は、培地８１がより多くの脈管成長因子を含み、培地９１がより少ない脈管成長因子を含むことが好ましい。脈管成長因子の例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、TGF alpha（腫瘍細胞増殖因子－α）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、Ａｎｇ－１（アンジオポエチン－１）等が挙げられる。
【0078】
製造システム１０００によって製造された人工脈管網６０は、内部に溶液を灌流可能な管腔構造を有する脈管網である。したがって、人工脈管網６０を使用して、被験物質３００を製造装置１０内の培地９１またはウェル２０内の培地９１に添加することによって、被験物質３００の内皮細胞に対する適切な物質応答を正確に評価することができる。
【0079】
〔人工脈管網の製造キット〕
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造キット（以下、「本製造キット」と示す場合がある）は、第１支持体２および第２支持体６、または、第１支持体１０２および第２支持体１０６を含む。
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造キット（以下、「本製造キット」と示す場合がある）は、第１支持体２および第２支持体６、または、第１支持体１０２および第２支持体１０６を含む。
【0080】
本製造キットは、第１支持体および第２支持体の他に、第１支持体に第２支持体が挿入された製造装置が離接可能に収容され、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容する容器（例えば、マルチウェルプレート）を含んでいてもよい。本製造キットは、また、ゲルを調製するための成分および脈管内皮細胞を含んでいてもよい。
【0081】
また、本製造キットは、人工脈管網を製造するための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙もしくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、または磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスクまたはＣＤ－ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。指示書に代えて、人工脈管網を製造するための手順等を解説した音声ファイル、または動画ファイルを含んでもよい。磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスクまたはＣＤ－ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよいし、アクセス可能なクラウドサーバー等に保存され、インターネット回線を介して参照する形式のものでもよい。
【0082】
〔人工脈管網の製造方法〕
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造方法（以下、「本製造方法」と示す場合がある）の一例を、図２１を参照して説明する。図１の第１支持体２と同一であるため、図２１中の第１支持体２の説明は省略する。
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造方法（以下、「本製造方法」と示す場合がある）の一例を、図２１を参照して説明する。図１の第１支持体２と同一であるため、図２１中の第１支持体２の説明は省略する。
【0083】
（第１支持体収容工程）
図２１の２１０１では、第１支持体２の容器当接部４を容器（ウェル）２０の上端面と当接させることによって、第１支持体２をウェル２０内に収容する。
図２１の２１０１では、第１支持体２の容器当接部４を容器（ウェル）２０の上端面と当接させることによって、第１支持体２をウェル２０内に収容する。
【0084】
（ゲル化溶液供給工程）
図２１の２１０２では、第１支持体２の第１メッシュシート１１上にゲル化溶液４０を供給する。表面張力によって、ゲル化溶液４０は第１支持体２内に保持される。
図２１の２１０２では、第１支持体２の第１メッシュシート１１上にゲル化溶液４０を供給する。表面張力によって、ゲル化溶液４０は第１支持体２内に保持される。
【0085】
（第２メッシュシート配置工程およびゲル調製工程）
図２１の２１０３では、ゲル化溶液４０と接触するように第２メッシュシート１２を配置する（第２メッシュシート配置工程）。そして、ゲル化溶液４０のゲル化を促進させることによって、ゲル３０を調製する（ゲル調製工程）。例えば、一定温度でインキュベーションすることによって、ゲル化溶液４０のゲル化を促進させることができる。ゲル化溶液収容工程および第２メッシュシート配置工程は、２１０１の操作を行わずに実施してもよい。
図２１の２１０３では、ゲル化溶液４０と接触するように第２メッシュシート１２を配置する（第２メッシュシート配置工程）。そして、ゲル化溶液４０のゲル化を促進させることによって、ゲル３０を調製する（ゲル調製工程）。例えば、一定温度でインキュベーションすることによって、ゲル化溶液４０のゲル化を促進させることができる。ゲル化溶液収容工程および第２メッシュシート配置工程は、２１０１の操作を行わずに実施してもよい。
【0086】
第２メッシュシート配置工程では、第２メッシュシート１２を底面に備える第２支持体６の底面をゲル化溶液４０と接触させることにより、第２メッシュシート１２を配置する。第２支持体６を使用することによって、第２メッシュシート１２を容易に、ゲル化溶液４０と接触させることができる。
【0087】
（播種工程）
図２１の２１０４では、第１支持体２をウェル２０から離接し、ゲル３０を収容する第１支持体２を上下反転させる。回転させた第１支持体２の第１メッシュシート１１の周縁部を覆うようにＰＤＭＳ製リング６１を装着する。リング６１を装着後、脈管内皮細胞７１を含む細胞懸濁液７２を第１メッシュシート１１上に載せる。
図２１の２１０４では、第１支持体２をウェル２０から離接し、ゲル３０を収容する第１支持体２を上下反転させる。回転させた第１支持体２の第１メッシュシート１１の周縁部を覆うようにＰＤＭＳ製リング６１を装着する。リング６１を装着後、脈管内皮細胞７１を含む細胞懸濁液７２を第１メッシュシート１１上に載せる。
【0088】
（接着工程）
図２１の２１０５では、脈管内皮細胞７１を培養（例えば、１～２４時間の培養）することによって、脈管内皮細胞７１を第１メッシュシート１１に接着させる。
図２１の２１０５では、脈管内皮細胞７１を培養（例えば、１～２４時間の培養）することによって、脈管内皮細胞７１を第１メッシュシート１１に接着させる。
【0089】
（第１支持体収容工程および培地供給工程）
図２１の２１０６では、脈管内皮細胞７１が第１メッシュシート１１に接着後、リング６１を外す。次に、第１支持体２を上下反転させ、第１支持体２の容器当接部４をウェル２０の上端面に当接させることによって、ウェル２０内に第１支持体２を収容する（第１支持体収容工程）。第１支持体２をウェル２０内に収容後、第１支持体２およびウェル２０内に培地８１を供給する（培地供給工程）。第１支持体２およびウェル２０内への培地８１の供給は、第１支持体２をウェル２０内に収容する前に行ってもよい。
図２１の２１０６では、脈管内皮細胞７１が第１メッシュシート１１に接着後、リング６１を外す。次に、第１支持体２を上下反転させ、第１支持体２の容器当接部４をウェル２０の上端面に当接させることによって、ウェル２０内に第１支持体２を収容する（第１支持体収容工程）。第１支持体２をウェル２０内に収容後、第１支持体２およびウェル２０内に培地８１を供給する（培地供給工程）。第１支持体２およびウェル２０内への培地８１の供給は、第１支持体２をウェル２０内に収容する前に行ってもよい。
【0090】
（培養工程）
図２１の２１０７では、第１支持体２の培地８１を誘導培地９１に置換する。誘導培地９１の例として、脈管成長因子を含む培地等が挙げられる。そして、脈管内皮細胞の培養を行い、メッシュシート１１に接着した脈管内皮細胞７１はゲル３０に入り込み、管腔を有する脈管１１０を形成する。誘導培地９１を使用することによって、上方向（第２メッシュシート１２側）への脈管内皮細胞７１の移動を促進させることができる。
図２１の２１０７では、第１支持体２の培地８１を誘導培地９１に置換する。誘導培地９１の例として、脈管成長因子を含む培地等が挙げられる。そして、脈管内皮細胞の培養を行い、メッシュシート１１に接着した脈管内皮細胞７１はゲル３０に入り込み、管腔を有する脈管１１０を形成する。誘導培地９１を使用することによって、上方向（第２メッシュシート１２側）への脈管内皮細胞７１の移動を促進させることができる。
【0091】
そして、チューブ状の脈管内皮細胞７１がゲル３０の上面に到達し、灌流可能な脈管１１０である人工脈管網６０が形成される（図２１の２１０８）。図２１の２１０８に示すように、メッシュシート１１および１２の開口部は約１００μｍ×約２００μｍの略長方形の開口部を有する。
【0092】
図２１では、ゲル３０の調製後に第１メッシュシート１１に脈管内皮細胞７１を播種しているが、脈管内皮細胞７１の播種のタイミングおよび播種箇所はこれに限らない。例えば、ゲル化溶液４０に脈管内皮細胞７１を懸濁後、図２１の２１０２の操作を行うことで脈管内皮細胞７１の播種を行ってもよい。または、図２１の２１０２の操作を行う前に、第１メッシュシート１１に脈管内皮細胞７１を播種してもよい。また、ゲル３０内に脈管内皮細胞７１の播種を行ってもよい。これらの場合は、図２１の２１０４および２１０５の操作を省略することができる。
【0093】
また、脈管内皮細胞７１を第２メッシュシート１２上に播種し、脈管網を第２メッシュシート１２から第１メッシュシート１１に向かって形成するように調製してもよい。脈管内皮細胞を第２メッシュシート１２に播種する場合は、ウェル２０内の培地を誘導培地とすることが好ましい。
【0094】
培地量がより多いウェル２０内の培地と接触することによって、脈管内皮細胞の増殖がより効率化できる点で、また、効率的に死細胞を生細胞集団から離せるという点で、ゲル３０と接触する表面とは反対側の第１メッシュシート１１の表面に脈管内皮細胞７１を播種することがより好ましい。
【0095】
図２１の２１０７の操作で、第１支持体２内の培地を培地８１から培地９１に置換しているが、２１０６の操作時に第１支持体２内に培地９１を供給してもよい。
【0096】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る人工脈管網の製造装置は、第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容している第１支持体と、第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている。
本発明の態様１に係る人工脈管網の製造装置は、第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容している第１支持体と、第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、前記ゲルと前記第２メッシュシートとが接触するように、前記第２支持体が前記第１支持体内に挿入されており、前記ゲルが第１メッシュシートおよび第２メッシュシートによって挟まれている。
【0097】
本発明の態様２に係る人工脈管網の製造装置は、本発明の態様１において、前記脈管内皮細胞が血管内皮細胞であってもよい。
【0098】
本発明の態様３に係る人工脈管網の製造装置は、本発明の態様１または２において、前記第２支持体には、前記第１メッシュシートと前記第２メッシュシートとの距離を一定に保つための固定部がさらに設けられていてもよい。
【0099】
本発明の態様４に係る人工脈管網の製造システムは、本発明の態様１～３のいずれかの製造装置と、前記製造装置が離接可能に収容され、前記脈管内皮細胞を培養するための培地を収容する容器と、を備え、前記容器に収容される培地と前記第１メッシュシートとが接触するように、前記製造装置が前記容器に収容されている。
【0100】
本発明の態様５に係る人工脈管網の製造キットは、第１メッシュシートを底面に備え、ゲルを収容するための第１支持体と、第２メッシュシートを底面に備え、脈管内皮細胞を培養するための培地を収容するための第２支持体と、を備え、前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下であり、前記第１支持体に挿入されるように前記第２支持体が構成されているものである。
【0101】
本発明の態様６に係る人工脈管網の製造方法は、第１メッシュシートを底面に備える第１支持体にゲル化溶液を供給する、ゲル化溶液供給工程、第２メッシュシートを前記ゲル化溶液と接触するように配置する、第２メッシュシート配置工程、前記ゲル化溶液をゲル化することによってゲルを調製する、ゲル調製工程、脈管内皮細胞を前記第１メッシュシートまたは前記第２メッシュシートに播種する、播種工程、前記ゲル調製工程後、前記脈管内皮細胞を培養する培養工程、を含み、前記第１メッシュシートおよび前記第２メッシュシートの少なくとも一方のメッシュシートの開口率が、２５％以上８０％以下である。
【0102】
本発明の態様７に係る人工脈管網の製造方法は、本発明の態様６において、前記脈管内皮細胞が血管内皮細胞であってもよい。
【0103】
本発明の態様８に係る人工脈管網の製造方法は、本発明の態様６または７において、前記第２メッシュシート配置工程では、前記第２メッシュシートを底面に備える第２支持体の底面を前記ゲル化溶液と接触させることにより、前記第２メッシュシートを配置してもよい。
【0104】
本発明の態様９に係る人工脈管網の製造方法は、本発明の態様６～８のいずれかにおいて、前記ゲル調製工程後、前記第１支持体を容器に収容する、第１支持体収容工程と、前記第１支持体および前記容器に培地を供給する、培地供給工程と、をさらに含み、前記第１支持体に供給される培地が、前記容器に供給される培地とは異なっていてもよい。
【0105】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献のすべてが参考として援用される。
【実施例0106】
〔実施例１〕人工血管網の作製
（実施例１の概要）
本実施例では、ＨＵＶＥＣを使用して、灌流可能の人工血管網を作製した。市販のインサートカラムから多孔膜部分を除去し、多孔膜の代わりにマイクロメッシュシートを貼付した。このカラム内にゲルを入れメッシュ上に載せた。続いて、ゲルの上からメッシュシートを載せることにより、ゲルを２枚のメッシュシートでサンドイッチする形を構築した。このカラムの底面にＨＵＶＥＣを播種し培養した。インサートカラム内にはＶＥＧＦを含んだ血管誘導培地を加えた。一方で、インサートカラム外（ウェル内）にはＨＵＶＥＣ用の増殖培地（ＥＧＭ－２）を入れた。６日間以上培養することにより、灌流可能な人工血管網が形成された。
（実施例１の概要）
本実施例では、ＨＵＶＥＣを使用して、灌流可能の人工血管網を作製した。市販のインサートカラムから多孔膜部分を除去し、多孔膜の代わりにマイクロメッシュシートを貼付した。このカラム内にゲルを入れメッシュ上に載せた。続いて、ゲルの上からメッシュシートを載せることにより、ゲルを２枚のメッシュシートでサンドイッチする形を構築した。このカラムの底面にＨＵＶＥＣを播種し培養した。インサートカラム内にはＶＥＧＦを含んだ血管誘導培地を加えた。一方で、インサートカラム外（ウェル内）にはＨＵＶＥＣ用の増殖培地（ＥＧＭ－２）を入れた。６日間以上培養することにより、灌流可能な人工血管網が形成された。
【0107】
（材料および方法）
＜メッシュシート付インサートカラムの作製＞
市販のインサートカラム（関東化学）から膜を取り除いた。カラム底面にΦ８ｍｍのマイクロメッシュシート（以下、メッシュシート）を貼付した（図２１の２１０１の操作に相当）。メッシュシートは水田製作所社製であり、その部分拡大写真を図２１に示す。Φ８ｍｍのマイクロメッシュシートは生検トレパン（カイインダストリーズ）を用いて作製した。メッシュシートの貼付は、ＰＤＭＳ溶液（主剤と硬化剤を１０：１の割合で混合したもの）を糊として使用することで行った。ＰＤＭＳ溶液は６０℃のホットヒーターの上にカラムを置くことで硬化させた。
＜メッシュシート付インサートカラムの作製＞
市販のインサートカラム（関東化学）から膜を取り除いた。カラム底面にΦ８ｍｍのマイクロメッシュシート（以下、メッシュシート）を貼付した（図２１の２１０１の操作に相当）。メッシュシートは水田製作所社製であり、その部分拡大写真を図２１に示す。Φ８ｍｍのマイクロメッシュシートは生検トレパン（カイインダストリーズ）を用いて作製した。メッシュシートの貼付は、ＰＤＭＳ溶液（主剤と硬化剤を１０：１の割合で混合したもの）を糊として使用することで行った。ＰＤＭＳ溶液は６０℃のホットヒーターの上にカラムを置くことで硬化させた。
【0108】
＜フィブリンゲルの調製とカラム内への導入＞
フィブリノーゲン溶液にトロンビンを混合させるとゲル化反応が始まり、フィブリンゲルが得られる。この反応は３７℃で加温することにより促進する。フィブリンゲルの調製方法を以下に記述する。
フィブリノーゲン溶液にトロンビンを混合させるとゲル化反応が始まり、フィブリンゲルが得られる。この反応は３７℃で加温することにより促進する。フィブリンゲルの調製方法を以下に記述する。
【0109】
まず、粉末フィブリノーゲン（fibrinogen from bovine plasma (SIGMA)）をＰＢＳ（－）に溶解し、フィルターろ過し、１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。調製した１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンとＥＧＭ－２（Lonza）を１：２で混合しピペッティングした（例えば、フィブリノーゲン３０μＬ＋ＥＧＭ－２ ６０μＬ）。ＥＧＭ－２はＨＵＶＥＣを培養するための培地である。トロンビン（Sigma）（５０Ｕ／ｍＬ）を最終濃度が１Ｕ／ｍＬになるように加えゲル化反応を開始させた。調製したフィブリンゲル３０～４０μＬをカラムのメッシュ上に載せた（図２１の２１０２の操作に相当）。その上からΦ６ｍｍのメッシュシートを載せ、３７℃のインキュベーター内に入れ、１５分間以上インキュベーションしゲル化させた（図２１の２１０３の操作に相当）。
【0110】
＜カラムへの細胞の播種＞
ＲＦＰ（Red fluorescent protein）を発現するＨＵＶＥＣ（ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（Angio-Proteomie）はEGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit（Lonza）で維持および培養した。まず、５．０×１０６細胞／ｍＬのＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を調製した。次にゲルを導入したカラムを逆さまにし、マトリゲル（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含んだＥＧＭ－２を１００μＬ添加した。次にメッシュ／ゲル表面に、調製したＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を１００μＬ載せた（図２１の２１０４の操作に相当）。表面張力があるため、細胞懸濁液はカラム外（下）へ落ちなかった。３７℃のＣＯ２インキュベーター内でおよそ１～２時間後（図２１の２１０５の操作に相当）、カラムをウェルに挿入し。ウェル内（カラム外）にはＥＧＭ－２培地を１．３ｍＬ入れた（図２１の２１０６の操作に相当）。カラム内にはＶＥＧＦを含んだ血管誘導培地（後述）を２００μＬ入れた（図２１の２１０７の操作に相当）。カラム上の細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーター内で６～１４日間培養した（図２１の２１０８の操作に相当）。
ＲＦＰ（Red fluorescent protein）を発現するＨＵＶＥＣ（ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（Angio-Proteomie）はEGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit（Lonza）で維持および培養した。まず、５．０×１０６細胞／ｍＬのＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を調製した。次にゲルを導入したカラムを逆さまにし、マトリゲル（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含んだＥＧＭ－２を１００μＬ添加した。次にメッシュ／ゲル表面に、調製したＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を１００μＬ載せた（図２１の２１０４の操作に相当）。表面張力があるため、細胞懸濁液はカラム外（下）へ落ちなかった。３７℃のＣＯ２インキュベーター内でおよそ１～２時間後（図２１の２１０５の操作に相当）、カラムをウェルに挿入し。ウェル内（カラム外）にはＥＧＭ－２培地を１．３ｍＬ入れた（図２１の２１０６の操作に相当）。カラム内にはＶＥＧＦを含んだ血管誘導培地（後述）を２００μＬ入れた（図２１の２１０７の操作に相当）。カラム上の細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーター内で６～１４日間培養した（図２１の２１０８の操作に相当）。
【0111】
＜灌流試験＞
作製した血管が灌流可能かどうかを確認するために、ＰＢＳ（－）でおよそ１／１１希釈した蛍光ビーズ（Fluoresbrite（登録商標）YG Microspheres ６．００μｍ、ポリサイエンス社、cat.#17156）を２００μＬ、カラム内に添加した。
作製した血管が灌流可能かどうかを確認するために、ＰＢＳ（－）でおよそ１／１１希釈した蛍光ビーズ（Fluoresbrite（登録商標）YG Microspheres ６．００μｍ、ポリサイエンス社、cat.#17156）を２００μＬ、カラム内に添加した。
【0112】
＜血管誘導培地について＞
本実施例では、血管誘導培地としてＶＥＧＦを多く含んだＥＧＭ－２培地を使用した。ＶＥＧＦの供給源としてヒト肺線維芽細胞（human lung fibroblasts、ＮＨＬＦ）（Lonza）を使用した。以下に血管誘導培地の作製方法を記述する。
本実施例では、血管誘導培地としてＶＥＧＦを多く含んだＥＧＭ－２培地を使用した。ＶＥＧＦの供給源としてヒト肺線維芽細胞（human lung fibroblasts、ＮＨＬＦ）（Lonza）を使用した。以下に血管誘導培地の作製方法を記述する。
【0113】
ＮＨＬＦを１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ（High Glucose）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）で維持および管理した。ＮＨＬＦがディッシュ面積の７０～１００％に達している状態で、ＥＧＭ－２培地に置換し、３日間培養した時の上清を回収した。上清に混入したＮＨＬＦを除去する目的で、上清を１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、さらに、その上清を０．２２μｍ孔のフィルターでろ過した。得られた培地を血管誘導培地とした。この血管誘導培地は、ＮＨＬＦから分泌されたＶＥＧＦを含んでいる。ＶＥＧＦは血管新生を促進する因子である。
【0114】
＜メッシュシートの有効性について＞
人工血管網を培養する上で、顕微鏡観察がし易いということは重要である。さらに、血管網に対してカラム内またはカラム外から栄養が十分供給される必要がある。そのため、ゲルを挟み込むための部材として、適切なサイズの孔（空隙）があるメッシュシートを選んだ。空隙は血管網の出入口の役割を果たす。空隙が狭い場合は、十分な栄養が細胞に供給されず、一方で広過ぎる場合は、ゲルが基板上に載らずに下に落下してしまう問題がある。
人工血管網を培養する上で、顕微鏡観察がし易いということは重要である。さらに、血管網に対してカラム内またはカラム外から栄養が十分供給される必要がある。そのため、ゲルを挟み込むための部材として、適切なサイズの孔（空隙）があるメッシュシートを選んだ。空隙は血管網の出入口の役割を果たす。空隙が狭い場合は、十分な栄養が細胞に供給されず、一方で広過ぎる場合は、ゲルが基板上に載らずに下に落下してしまう問題がある。
【0115】
多孔膜の利用に関しては問題点がある。例えば、ポリカーボネートの多孔膜は光の透過性が優れておらず、上層にある細胞の形態をデバイスの下部から顕微鏡観察することが難しい。光の透過性が比較的良いＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）製の多孔膜を使用した場合も、細胞の輪郭を綺麗に観察することが難しい。さらに、市販されている多孔膜の穴の大きさは一般的に０．４μｍ～８μｍほどであり、膜面積に対する総孔面積の割合（空隙率）は最大で１５％ほどである。したがって、細胞への栄養供給が制限される。
【0116】
本実施例では多孔膜の代わりに、開口部の広いメッシュシート（開口部：縦およそ１６０～１７０μｍ、横およそ６０～６５μｍ）を使用した。このメッシュシートの空隙率（開口率）は約５０％である（図２１）。したがって、細胞への栄養供給に優れ、また、細胞の顕微鏡観察を容易に行うことができる。このメッシュシートはＰＥＴ製であり、細胞毒性がないため、細胞培養に使用できる。
【0117】
＜蛍光顕微鏡観察＞
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）溶液をカラム内とウェル内に加え、室温で４０分間放置することにより細胞（血管網）を固定した。その後、ＰＢＳ（－）溶液で細胞を洗浄した。細胞を共焦点顕微鏡TCS SP8（Leica）を使用して観察した。
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）溶液をカラム内とウェル内に加え、室温で４０分間放置することにより細胞（血管網）を固定した。その後、ＰＢＳ（－）溶液で細胞を洗浄した。細胞を共焦点顕微鏡TCS SP8（Leica）を使用して観察した。
【0118】
（結果と考察）
ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣをメッシュ上に播種し、およそ２週間培養した。共焦点顕微鏡でカラム内の細胞を解析した結果、ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣが血管網構造を形成したことが明らかになった。灌流可能な血管網かどうかを確認するために直径６μｍの蛍光ビーズをカラム上部から添加した結果、カラムの底面に張ったメッシュまで蛍光ビーズが到達することを確認することができた。また、蛍光ビーズは毛細血管内を通り、カラム下部まで落下することも確認した（図２２）。図２２中、右側の数字は、下部メッシュシート面からの上方向への距離（μｍ）を示す。
ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣをメッシュ上に播種し、およそ２週間培養した。共焦点顕微鏡でカラム内の細胞を解析した結果、ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣが血管網構造を形成したことが明らかになった。灌流可能な血管網かどうかを確認するために直径６μｍの蛍光ビーズをカラム上部から添加した結果、カラムの底面に張ったメッシュまで蛍光ビーズが到達することを確認することができた。また、蛍光ビーズは毛細血管内を通り、カラム下部まで落下することも確認した（図２２）。図２２中、右側の数字は、下部メッシュシート面からの上方向への距離（μｍ）を示す。
【0119】
以上の結果から、本発明の一態様に係る人工血管網の製造方法によって、灌流可能な血管網を作製できることが明らかになった。
【0120】
〔実施例２〕二重カラム式デバイスを用いた人工血管網の作製
（実施例２の概要）
本実施例では、二重カラム式デバイスを使用して、人工血管網の作製を行った。この二重カラム式デバイスは、外カラムと内カラムとから成る。まず、外カラム内のメッシュ上にゲルを載せ、その上から、内カラムを挿入した。これによりメッシュ、ゲル、メッシュのサンドイッチ構造を作った。この状態のデバイスに、細胞を播種し易いようにリングをはめ、外カラムの裏側のメッシュ上に細胞を播種した。１１日間培養後、作製された血管網を観察した。さらに、血管網に蛍光ビーズを流し、灌流可能な血管網ができていることを確認した。
（実施例２の概要）
本実施例では、二重カラム式デバイスを使用して、人工血管網の作製を行った。この二重カラム式デバイスは、外カラムと内カラムとから成る。まず、外カラム内のメッシュ上にゲルを載せ、その上から、内カラムを挿入した。これによりメッシュ、ゲル、メッシュのサンドイッチ構造を作った。この状態のデバイスに、細胞を播種し易いようにリングをはめ、外カラムの裏側のメッシュ上に細胞を播種した。１１日間培養後、作製された血管網を観察した。さらに、血管網に蛍光ビーズを流し、灌流可能な血管網ができていることを確認した。
【0121】
（材料および方法）
＜二重カラム式デバイスの作製＞
外カラム（製造装置１の第１支持体２に相当）および内カラム（製造装置１の第２支持体６に相当）それぞれ、射出成形により作製した（水田製作所社製）。カラムの材料として、ポリカーボネート樹脂を使用した。外カラムの底面にΦ１０ｍｍのメッシュシート（水田製作所）を貼付した。同様に、内カラムの底面にΦ６ｍｍのメッシュシートを貼付した。外カラムおよび内カラムに貼付したメッシュシートの開口率は、実施例１のメッシュシートと同様に約５０％であり、ＰＥＴ製であった。
＜二重カラム式デバイスの作製＞
外カラム（製造装置１の第１支持体２に相当）および内カラム（製造装置１の第２支持体６に相当）それぞれ、射出成形により作製した（水田製作所社製）。カラムの材料として、ポリカーボネート樹脂を使用した。外カラムの底面にΦ１０ｍｍのメッシュシート（水田製作所）を貼付した。同様に、内カラムの底面にΦ６ｍｍのメッシュシートを貼付した。外カラムおよび内カラムに貼付したメッシュシートの開口率は、実施例１のメッシュシートと同様に約５０％であり、ＰＥＴ製であった。
【0122】
また、３Ｄプリンターで作製した二重カラム式デバイスを図８～１１に示す。の第２支持体６の内径は５．５ｍｍ、外径は７．３ｍｍである。第１支持体本体３の内径は８ｍｍ、外径は１０．８ｍｍであった。第１支持体の内面と第２支持体の外面とは、０．３５ｍｍ（＝（８－７．３）／２）の隙間が生じる。また、第２支持体６が第１支持体２内に挿入されたときに、第１支持体２のメッシュシート１１と第２支持体６のメッシュシートとの距離が、０．５ｍｍ、１ｍｍまたは１．５ｍｍになるように、第２支持体本体７の上面に３種類の突起が設けられている。
【0123】
本実施例２では、射出成形により作製した二重カラム式デバイスを使用して、人工血管網の作製を行った。
【0124】
底面メッシュシートの貼付は、ＰＤＭＳ溶液（主剤と硬化剤を１０：１の割合で混合したもの）を糊として使用することで行った。ＰＤＭＳ溶液は６０℃のホットヒーターの上にカラムを置くことで硬化させた。メッシュ付きカラムは７０％エタノールに浸し、乾かした後、ＵＶ処理を２０分間行うことでデバイスの殺菌を行った。
【0125】
＜フィブリンゲルの調整とカラム内への導入＞
粉末フィブリノーゲン（fibrinogen from bovine plasma (SIGMA)）をＰＢＳ（－）に溶解後、フィルターろ過し、１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。調製した１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液とＥＢＭ－２（Lonza）を１：２で混合しピペッティングした。トロンビン（Sigma、５０Ｕ／ｍＬ）を最終濃度が１Ｕ／ｍＬになるように加えゲル化反応を開始させた。
粉末フィブリノーゲン（fibrinogen from bovine plasma (SIGMA)）をＰＢＳ（－）に溶解後、フィルターろ過し、１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。調製した１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液とＥＢＭ－２（Lonza）を１：２で混合しピペッティングした。トロンビン（Sigma、５０Ｕ／ｍＬ）を最終濃度が１Ｕ／ｍＬになるように加えゲル化反応を開始させた。
【0126】
調製したフィブリンゲル８０μＬを外カラム内のメッシュ上に載せた。その上から内カラムを挿入した（メッシュ間距離約０．５ｍｍ）。フィブリンゲルが投入された二重カラム式デバイスを３７℃のインキュベーター内に入れ、２０分間以上インキュベーションしてフィブリンをゲル化させた。
【0127】
＜カラムへの細胞の播種＞
カラム内のフィブリンがゲル化した後、カラムを逆さまにし、ＰＤＭＳで作製したリングを装着した。そこに、０．２ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌを含んだＥＧＭ－２培地を１５０μＬ入れた。ＥＧＭ－２培地が投入された二重カラム式デバイスを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に入れた。
カラム内のフィブリンがゲル化した後、カラムを逆さまにし、ＰＤＭＳで作製したリングを装着した。そこに、０．２ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌを含んだＥＧＭ－２培地を１５０μＬ入れた。ＥＧＭ－２培地が投入された二重カラム式デバイスを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に入れた。
【0128】
インキュベーターから二重カラム式デバイスを取り出し、１５０μＬのＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液（３×１０６細胞／ｍＬ）を加えた。３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１．５時間静置した後、二重カラム式デバイスをウェルに挿入した。ウェル内（カラム外）には１ｍＬのＥＧＭ－２培地を入れた。カラム内にはＶＥＧＦを含んだ血管誘導培地を３００μＬ入れた。カラム上の細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１１日間培養した。
【0129】
＜蛍光顕微鏡観察＞
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）溶液をカラム内とウェル内に加え、室温で４０分間放置することにより細胞（血管網）を固定した。その後、ＰＢＳ（－）溶液で細胞を洗浄した。細胞を位相差顕微鏡CKX 53（オリンパス）と共焦点顕微鏡TCS SP8（Leica）を用いて観察した。
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）溶液をカラム内とウェル内に加え、室温で４０分間放置することにより細胞（血管網）を固定した。その後、ＰＢＳ（－）溶液で細胞を洗浄した。細胞を位相差顕微鏡CKX 53（オリンパス）と共焦点顕微鏡TCS SP8（Leica）を用いて観察した。
【0130】
＜灌流試験＞
作製した血管が灌流可能か否かを確認するために、ＰＢＳ（－）でおよそ１／１１希釈した蛍光ビーズ（Fluoresbrite（登録商標）YG Microspheres、６．００μｍ、ポリサイエンス社、cat.#17156）をカラム内に添加した。
作製した血管が灌流可能か否かを確認するために、ＰＢＳ（－）でおよそ１／１１希釈した蛍光ビーズ（Fluoresbrite（登録商標）YG Microspheres、６．００μｍ、ポリサイエンス社、cat.#17156）をカラム内に添加した。
【0131】
図２３に、ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣの培養１１日目の状態を示す。本二重カラム式デバイスを使用して、３次元的な血管網を作製することができた。
【0132】
実施例１と同様に、灌流可能な血管網か否かを確認するために直径６μｍの蛍光ビーズをカラム上部から添加した。その結果、カラムの底面に張ったメッシュまで蛍光ビーズが到達することを確認することができた（図２４）。以上の結果から、二重カラム式デバイスである本細胞培養デバイスを使用した細胞培養法により、灌流可能な血管網を作製できることが明らかになった。
【0133】
〔実施例のまとめ〕
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造装置によって、従来の血管内皮細胞と線維芽細胞とを使用した人工血管網の製造方法よりも単純に、すなわち血管内皮細胞のみで人工血管網が作製することができた。また、作製した人工血管網の長さは、従来報告されている人工血管網の長さよりも数倍以上長かった。このような長く、灌流可能である人工血管網を容易に作製することができるデバイスは、血管治療薬の開発または血管健康の維持に役立つサプリメントの開発において有用である。また、当該デバイスによって、網羅的な化学物質の解析を実施することができる。
本発明の一態様に係る人工脈管網の製造装置によって、従来の血管内皮細胞と線維芽細胞とを使用した人工血管網の製造方法よりも単純に、すなわち血管内皮細胞のみで人工血管網が作製することができた。また、作製した人工血管網の長さは、従来報告されている人工血管網の長さよりも数倍以上長かった。このような長く、灌流可能である人工血管網を容易に作製することができるデバイスは、血管治療薬の開発または血管健康の維持に役立つサプリメントの開発において有用である。また、当該デバイスによって、網羅的な化学物質の解析を実施することができる。
【符号の説明】
【0134】
１、１０、１００ 製造装置
２、１０２ 第１支持体
３、１０３ 第１支持体本体
４、１０８ 容器当接部
５ 溝
６、１０６ 第２支持体
７、１０７ 第２支持体本体
８、８’、８’’ 固定部（突起）
１１ 第１メッシュシート
１２ 第２メッシュシート
１３、６１ リング
２０ 容器（ウェル）
３０ ゲル
４０ ゲル化溶液
６０ 人工脈管網
７１ 脈管内皮細胞
７２ 細胞懸濁液
８１ 培地
９１ 培地（誘導培地）
１１０ 人工脈管
２００ マルチウェルプレート
３００ 被験物質
１０００ 製造システム
２、１０２ 第１支持体
３、１０３ 第１支持体本体
４、１０８ 容器当接部
５ 溝
６、１０６ 第２支持体
７、１０７ 第２支持体本体
８、８’、８’’ 固定部（突起）
１１ 第１メッシュシート
１２ 第２メッシュシート
１３、６１ リング
２０ 容器（ウェル）
３０ ゲル
４０ ゲル化溶液
６０ 人工脈管網
７１ 脈管内皮細胞
７２ 細胞懸濁液
８１ 培地
９１ 培地（誘導培地）
１１０ 人工脈管
２００ マルチウェルプレート
３００ 被験物質
１０００ 製造システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
