知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024154930
(43)【公開日】2024-10-31
(54)【発明の名称】アーモンドアレルゲンの検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20241024BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 521
G01N33/53 Q
G01N33/543 525Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023069165
(22)【出願日】2023-04-20
(71)【出願人】
【識別番号】000113067
【氏名又は名称】プリマハム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】大黒 そのみ
(72)【発明者】
【氏名】加藤 重城
(57)【要約】
【課題】食品等の被検試料から、ペカンナッツ等の他の種実類等との交差反応性を示すことなく、アーモンドアレルゲンをイムノクロマト法により迅速に検出できる手段を提供すること。
【解決手段】アーモンド１１Ｓグロブリンに結合し、アーモンド以外の種実類等の１１Ｓグロブリンに結合しない２種類のモノクローナル抗体を使用することにより、アーモンドを精度よく検出することができることを確認した。
【選択図】なし
【解決手段】アーモンド１１Ｓグロブリンに結合し、アーモンド以外の種実類等の１１Ｓグロブリンに結合しない２種類のモノクローナル抗体を使用することにより、アーモンドを精度よく検出することができることを確認した。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルとを用い、測定サンプルを展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項2】
抽出液が、ＳＤＳ、ＴＷＥＥＮ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項１記載のイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項3】
アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする請求項１又は２記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項4】
アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて未加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする請求項１又は２記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項5】
被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルにおけるアーモンドに対する反応性が、アーモンドのタンパク質濃度が被検試料中の濃度として２ｐｐｍ～２０ｐｐｍで判定することができることを特徴とする請求項１又は２記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項6】
測定サンプルにおけるアーモンドのタンパク質濃度が０．１ｐｐｍ～１ｐｐｍで判定することができることを特徴とする請求項１又は２記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
【請求項7】
アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体とを備え、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするアーモンドアレルゲンの検出キット。
【請求項8】
ＳＤＳ、ＴＷＥＥＮ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含む、被検試料からアレルゲンを抽出するための抽出液をさらに含むことを特徴とする請求項７記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
【請求項9】
ＦＢＳをさらに含むことを特徴とする請求項７又は請求項８記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アーモンドに特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、かかる抗体を用いて、アーモンドアレルゲンを検出する方法やキットに関する。
【背景技術】
【0002】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な要因により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、「食物アレルゲン」という）の摂取が原因となる有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こすことが知られている。これらの症状は死に至ることもあることから、卵、乳、小麦、えび、かに、落花生、そばの７品目が特定原材料として、容器包装された加工食品で表示が義務づけられている。また、アーモンド、アワビ、イカ、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、クルミ、ごま、さけ、サバ、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、マツタケ、モモ、ヤマイモ、リンゴ、ゼラチンの２１品目が、特定原材料に準ずるものとして、できるだけ表示することが推奨されている。
【0003】
上記の食物アレルゲンを迅速かつ簡易に検出するため、抗原抗体反応を利用して特定の抗原又は抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法が広く用いられており、試料中の被検出物質に、蛍光物質等からなる標識物質により標識された抗体又は抗原を免疫反応により結合させ、結合した標識物質を測定する免疫測定法が採用されている。これらの免疫測定法では、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く用いられており、サンドイッチ型反応を利用したイムノクロマトグラフィー法（例えば、特許文献１参照）等によるアレルゲン検出方法が提案されている。
【0004】
一方、アーモンド（Prunus dulcis）は、種実類の一種であって、５０質量％以上の脂質を含み、その約７割は、一価不飽和脂肪酸のオレイン酸であり、さらにビタミンＥやビタミンＢ２を多く含むとされる。近年、菓子類等への使用や、乳糖やコレステロールを略含まないアーモンド飲料の生産が増えており、今後のアーモンドによるアレルギー発症者の増加を見越して、２０１９年に特定原材料に準ずるものとして、新たにアーモンドが追加された。そのため、原料、食品、食品製造装置、食品包装等に意図せず混入したアーモンドを検出し、また食品表示との整合性を確認するために、アーモンドについての適切な検出手段が求められている。
【0005】
現在、市販されているアーモンドアレルゲン検出用キット「AlerTox Sticks Kit（登録商標）アーモンド(KIT3030)」（ハイジエナダイアグノスティカエスパーナ社製）は、イムノクロマト法によるキットであるが、検出限界は２０ｐｐｍにすぎない。また、ＮＥＯＧＥＮ社のＲｅｖｅａｌ３－Ｄアーモンドキットの取扱説明書には、拭い液や洗浄液からアーモンド成分をスクリーニングできるようにデザインされている旨明示されており、食品中のアーモンド成分の検出には必ずしも適切ではない。
【0006】
他方、アーモンド検出用ＰＣＲプライマーセット等を用いるアーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時ＰＣＲ検出方法（例えば、特許文献２等参照）が提案されているが、ＰＣＲ等の操作が必要であるので判定までに時間がかかると考えられ、また、アーモンドのみを検出する方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平５－０１０９５０号公報
【特許文献2】特開２０２２－１６０４９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、食品等の被検試料から、他の種実類等と交差反応性を示すことなく、アーモンドアレルゲンをイムノクロマト法により迅速に検出できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、より低濃度においても、アーモンドアレルゲンを検出できるイムノクロマト法によるアレルゲン検出方法について検討を続けてきたが、アーモンド１１Ｓグロブリンに結合する、特定の２種類のモノクローナル抗体を使用することにより、アーモンドアレルゲンを従来のキットよりも低い濃度にて検出することができることを見いだした。さらに、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含む抽出液を用いて加熱処理を行った試料をイムノクロマトに供することにより、非常に低い濃度のアレルゲンを交差反応性なく検出できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルとを用い、測定サンプルを展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
［２］抽出液が、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする上記［１］記載のイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
［３］アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［４］アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて未加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［５］被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルにおけるアーモンドに対する反応性が、アーモンドのタンパク質濃度が被検試料中の濃度として２ｐｐｍ～２０ｐｐｍで判定することができることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［６］測定サンプルにおけるアーモンドのタンパク質濃度が０．１ｐｐｍ～１ｐｐｍで判定することができることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［１］アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルとを用い、測定サンプルを展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
［２］抽出液が、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする上記［１］記載のイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出方法。
［３］アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［４］アレルゲンの測定サンプルが、被検試料から抽出液を用いて未加熱抽出した測定サンプルであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［５］被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルにおけるアーモンドに対する反応性が、アーモンドのタンパク質濃度が被検試料中の濃度として２ｐｐｍ～２０ｐｐｍで判定することができることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
［６］測定サンプルにおけるアーモンドのタンパク質濃度が０．１ｐｐｍ～１ｐｐｍで判定することができることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のアーモンドアレルゲンの検出方法。
【0011】
また、本発明は以下のとおりである。
［７］アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体とを備え、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするアーモンドアレルゲンの検出キット。
［８］ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含む、被検試料からアレルゲンを抽出するための抽出液をさらに含むことを特徴とする上記［７］記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
［９］ＦＢＳをさらに含むことを特徴とする上記［７］又は［８］記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
［７］アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体とを備え、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするアーモンドアレルゲンの検出キット。
［８］ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含む、被検試料からアレルゲンを抽出するための抽出液をさらに含むことを特徴とする上記［７］記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
［９］ＦＢＳをさらに含むことを特徴とする上記［７］又は［８］記載のアーモンドアレルゲンの検出キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明の検出方法によると、アーモンドのアレルゲンを迅速かつ精度よく定性的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】（ａ）は、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生に対する、ＰＤＡＭ１抗体の反応性を示すグラフである。（ｂ）は、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生に対する、ＰＤＡＭ２抗体の反応性を示すグラフである。
【図2】製品Ａにおいて、ａ）抽出液としてＰＢＳを使用して加熱処理を行って抽出した場合、ｂ）ＩＣ抽出液を使用して未加熱にて抽出した場合、及びｃ）ＩＣ抽出液を使用して加熱処理を行って抽出した場合の、イムノクロマトストリップにおける判定ラインの着色の濃度を示すグラフである。
【図3】製品Ｂにおいて、ａ）抽出液としてＰＢＳを使用して加熱処理を行って抽出した場合、ｂ）ＩＣ抽出液を使用して未加熱にて抽出した場合、及びｃ）ＩＣ抽出液を使用して加熱処理を行って抽出した場合の、イムノクロマトストリップにおける判定ラインの着色の濃度を示すグラフである。
【図4】製品Ｃにおいて、ａ）抽出液としてＰＢＳを使用して加熱処理を行って抽出した場合、ｂ）ＩＣ抽出液を使用して未加熱にて抽出した場合、及びｃ）ＩＣ抽出液を使用して加熱処理を行って抽出した場合の、イムノクロマトストリップにおける判定ラインの着色の濃度を示すグラフである。
【図5】ポリフェノールを含む食品４種類について、抽出液としてＰＢＳを使用して加熱処理を行って抽出した場合と、ＩＣ抽出液を使用して加熱処理を行って抽出した場合の、イムノクロマトストリップにおける判定ラインの着色の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明のアーモンドアレルゲンの検出方法としては、アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて未加熱で又は加熱して抽出したアレルゲンの測定サンプルとを用い、測定サンプルを展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２である検出方法であれば特に制限されず、上記アーモンドの１１Ｓグロブリンとは、一般に可溶性の球状タンパク質であるグロブリンのうち、沈降係数が１１Ｓに相当するものの総称であって、植物における貯蔵タンパク質として知られており、アーモンドにおける主要アレルゲンのひとつとして知られている。
【0015】
本発明におけるアーモンドとしては、バラ科サクラ属（Rosaceae Cerasus）の落葉高木に属するアーモンド（Prunus dulcis）の木から採取される果実から、果肉と種子の殻を取り除いた仁（生アーモンド）を加熱処理したナッツを挙げることができ、アーモンドは、ビター種と、スイート種（甘扁桃）とに大別できるが、ビター種は苦みを生じさせるアミグダリンを含むので、スイート種が好ましい。スイート種としては、ノンパレル（Ｎｏｎｐａｒｅｉｌ）種、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）種、カーメル（Ｃａｒｍｅｌ）種、ミッション（Ｍｉｓｓｉｏｎ）種、ビュート（Ｂｕｔｅ）種等の多数の品種が知られている。
【0016】
上記加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、モノクローナル抗体の一方は、抗体産生細胞（ハイブリドーマ）（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３４５）が産生する抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、ＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しないモノクローナル抗体の他方は、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３４６）が産生する抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２である。
【0017】
上記アーモンド１１Ｓグロブリンに結合するモノクローナル抗体の抗体産生細胞の調製方法としては、加熱処理したアーモンド１１Ｓグロブリン若しくはその粉砕処理物を、そのまま又は適当なアジュバントと共に免疫原として哺乳動物に投与し、免疫感作させる方法を例示することができる。
【0018】
上記哺乳動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギを挙げることができるが、調製の簡便性からラットやマウスを用いることが好ましく、ラットに由来するモノクローナル抗体やマウスに由来するモノクローナル抗体を好適に用いることができる。投与箇所としては、静脈注射、皮下、腹腔内を例示することができる。追加免疫は、数日から数週間後に行うことができ、１０日～３週間後がより好ましい。抗アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体産生細胞の分離は、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１０日後に免疫動物から採取することにより行うことができ、抗体産生細胞としては、脾臓細胞やリンパ節細胞や末梢血由来細胞が好ましく、マウスの脾臓細胞やラット腸骨リンパ節細胞がより好ましい。
【0019】
上記アーモンド１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体の調製方法としては、上記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合をおこない、上記アーモンド１１Ｓグロブリンを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、培養培地又は腹水からモノクローナル抗体を採取する、ケラーとミルシュタインによるハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）等の公知の方法を挙げることができる。
【0020】
上記ミエローマ細胞としては、一般に入手可能な株化細胞を用いることができるが、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ、陽性ハイブリドーマとして生存できる性質を有することが好ましく、具体的には、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＮＳＩ／１－Ａｇ４－１、ＮＳ０／１等のマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０等のラットミエローマ細胞株などを挙げることができる。
【0021】
上記細胞融合の方法としては、抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。例えば、細胞融合終了後、ＲＰＭＩ１６４０培地等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法等により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、アーモンド１１Ｓグロブリンを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【0022】
上記ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３４５）が産生する抗アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１（ＰＤＡＭ１抗体）や、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３４６）が産生する抗アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２（ＰＤＡＭ２抗体）は、２０２０年１２月２２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に受託されている。
【0023】
上記ＰＤＡＭ１抗体及びＰＤＡＭ２抗体は、それぞれ、カシューナッツ(Anacardium occidentale：ウルシ科カシューナットノキ属（Anacardiaceae Anacardium）)、ヘーゼルナッツ（Corylus avellana：カバノキ科ハシバミ属（Betulaceae Corylus）一部はセイヨウハシバミとムラサキセイヨウハシバミの雑種)、ピスタチオ（Pistacia vera：ウルシ科カイノキ属（Anacardiaceae Pistacia））、マカデミアナッツ（Macadamia integrifolia：ヤマモガシ科マカダミア属（Proteaceae Macadamia））、クルミ(クルミ科クルミ属（Juglandaceae Juglans）)、ペカンナッツ（クルミ科ペカン属（Juglandaceae Carya））、及び、落花生（Arachis hypogaea：マメ科ラッカセイ属（Fabaceae Arachis））（本願明細書において、まとめて「他の木の実類」ということもある）のタンパク質、とりわけ可食部を構成するタンパク質に反応せず、エピトープに結合しない。
【0024】
本発明において、上記ＰＤＡＭ１抗体及びＰＤＡＭ２抗体を使用する場合、上記金コロイドを結合した金コロイド標識抗体としてＰＤＡＭ２抗体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体とするＰＤＡＭ１抗体の組合せ；又は、上記金コロイドを結合した金コロイド標識抗体としてＰＤＡＭ１抗体、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体としてＰＤＡＭ２抗体の組合せ；を使用することができるが、金コロイド標識抗体としてＰＤＡＭ２抗体、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル（メンブレン固相）抗体としてＰＤＡＭ１抗体の組合せ；を使用することがより好ましい。
【0025】
上記モノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体の作製方法としては従来公知の方法を含め特に限定されないが、例えば、０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液に、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にモノクローナル抗体を溶解した溶液を加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を加え、さらに１５分間反応させ、遠心分離する方法を挙げることができる。また、作製した金コロイド標識抗体を、例えばガラスウール製コンジュゲートパッドに塗布し、乾燥させることにより金コロイド標識抗体担持体を作製することもできる。
【0026】
上記展開支持体（抗体固定化メンブレン）は、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体を含む緩衝液を、例えば、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた後、ブロッキング処理することにより作製することができる。
【0027】
上記測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体部としては、ガラスウール製のサンプルパッドを例示することができる。上記ガラスウール製サンプルパッド、必要に応じて上記金コロイド標識抗体担持体、展開支持体、展開支持体の他端に吸収パッドを順次連結することによりイムノクロマトストリップを作製することができる。
【0028】
上記測定サンプルを調製する際に用いられる抽出液としては、被検試料に加えて抽出をすることにより、アレルゲンであるアーモンドの１１Ｓグロブリンを検出できる抽出液であれば特に制限されないが、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、及びチオ硫酸ナトリウムを含む溶液を挙げることができ、より好ましくはＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、チオ硫酸ナトリウムをダルベッコＰＢＳ溶液中に含む抽出液を挙げることができ、かかる抽出液を使用した場合に、よりアレルゲンの抽出効率が高く、かつ非特異反応を抑制できる。
【0029】
上記ＳＤＳの濃度としては、０．１～２．０％、好ましくは０．２～１．０％、より好ましくは０．３～０．７％を挙げることができ、上記Ｔｗｅｅｎ２０の濃度としては、０．０１～１．０％、好ましくは０．０８～０．５％、より好ましくは０．１～０．３％を挙げることができ、上記チオ硫酸ナトリウムの濃度としては、０．０１～５．０％、好ましくは０．０２～０．５％、より好ましくは０．０５～０．２％を挙げることができる
【0030】
（被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプル）
上記被検試料としては、アレルゲンが存在する可能性のある食品や、拭き取り液若しくは洗浄液を挙げることができ、上記食品としては、食品そのもののほか、該食品を製造するために用いられる原料又はその飛散物、該食品を包装した包装紙や包装容器に残るカス、食品製造工程における沈殿物等の残留物などを含めることができる。
上記被検試料としては、アレルゲンが存在する可能性のある食品や、拭き取り液若しくは洗浄液を挙げることができ、上記食品としては、食品そのもののほか、該食品を製造するために用いられる原料又はその飛散物、該食品を包装した包装紙や包装容器に残るカス、食品製造工程における沈殿物等の残留物などを含めることができる。
【0031】
上記拭き取り液若しくは洗浄液としては、アーモンドを含む可能性のある液体であれば広く含めることができ、例えば、食品製造現場等におけるアーモンドアレルゲンを含む可能性のある溶液を挙げることができる。具体的には、食品等を製造するために用いられる装置を洗浄した洗浄水；該洗浄水を取り除くために使用されたすすぎ液；のほか、上記洗浄水の乾燥物、上記すすぎ液の乾燥物を便宜上含めることができる。
【0032】
上記拭き取り液若しくは洗浄液からなる測定サンプルにおける溶媒としては、水道水や純水等の水、（生理）食塩水、ＰＢＳ等の水性溶媒を好適に挙げることができるが、これらの２種以上の混合液でもよく、例えば、水で拭き取り水に溶解してもよいし、（生理）食塩水で拭き取り水に溶解してもよいし、ＰＢＳで拭き取り水に溶解してもよいし、水で拭き取り（生理）食塩水に溶解してもよいし、（生理）食塩水で拭き取り（生理）食塩水に溶解してもよいし、ＰＢＳで拭き取り（生理）食塩水に溶解してもよいし、水で拭き取りＰＢＳに溶解してもよいし、（生理）食塩水で拭き取りＰＢＳに溶解してもよいし、ＰＢＳで拭き取りＰＢＳに溶解してもよい。なお、上記抽出液により拭取や洗浄を行って、拭き取り液や洗浄液とすることも可能である。
【0033】
上記被検試料は、上記抽出液を添加して２０倍抽出（例えば１ｍＬの拭き取り液若しくは洗浄液に１９ｍＬの抽出液を加える）を行った後、加熱処理を行うことにより、又は、加熱処理を行わずに（未加熱処理）、測定サンプルとしてイムノクロマト処理を施され、アレルゲンの検出を行うことができる。上記抽出液により拭取や洗浄を行って、拭き取り液や洗浄液とする場合、上記２０倍抽出を行うことなく、加熱処理を経て又は未加熱処理のまま、拭き取り液や洗浄液を測定サンプルとして、上記イムノクロマト処理を施すこともできる。
【0034】
上記加熱処理を行う場合の加熱処理の時間としては、例えば沸騰水浴中で５～３０分を挙げることができ、好ましくは８～１５分を挙げることができる。
【0035】
上記抽出液を用いて加熱抽出したアレルゲンの測定サンプルに、上記金コロイド標識抗体、及び好ましくは展開液を添加してイムノクロマトストリップにスポットすることにより、アーモンド１１Ｓグロブリンを認識する金コロイド標識抗体と、測定サンプル中のアーモンドアレルゲンとが結合して抗原抗体複合体が形成され；形成された抗原抗体複合体がイムノクロマトストリップ上の展開支持体を毛管現象等により移動し；金コロイド標識抗体と異なる１１Ｓグロブリンのエピトープを認識するアーモンドアレルゲンを認識するモノクローナル抗体が固定された所定の位置において、上記抗原抗体複合体が捕捉され；金コロイドの集積により現れる判定ラインの着色の有無により、アレルゲンを検出することができる。なお、前述したように、イムノクロマトストリップにあらかじめ金コロイド標識抗体を担持させておいてもよく、その場合は、上記測定サンプルに金コロイド標識抗体を添加する必要は必ずしもない。
【0036】
上記展開液としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれている溶液が好ましく、その場合のウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度としては、１０～５０重量％を挙げることができ、２０～４０重量％が好ましく、２５～３５重量％がより好ましく、１０重量％未満の場合、非特異反応を生じやすく好ましくない場合もあるが、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加しなくてもよい場合がある。また、展開液には、必要に応じて他の界面活性剤、防腐剤、無機塩などの各種添加剤を懸濁もしくは乳濁又は溶解せしめて調製することもできる。上記展開液に緩衝液を添加する場合には、そのｐＨが４～１０、特にｐＨ６～８が好ましく、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やトリス緩衝液（ＴＢＳ）などを好適に例示することができる。また、上記緩衝液は、綿棒等のイムノクロマトのスティックの先端部分に含ませておくこともできる。
【0037】
上記測定サンプルのイムノクロマト法によるアーモンドアレルゲンの検出においては、上記測定サンプルにイムノクロマトストリップのサンプル用担体部を浸漬させることにより、上記測定サンプル中のアーモンド１１Ｓグロブリンとアーモンドアレルゲンを認識する金コロイド標識抗体とが結合して抗原抗体複合体を形成し；形成された抗原抗体複合体がイムノクロマトストリップ上の展開支持体を毛管現象等により移動し；金コロイド標識抗体と異なる１１Ｓグロブリンのエピトープを認識するアーモンドアレルゲンを認識するモノクローナル抗体が固定された所定の位置において、上記抗原抗体複合体が捕捉され；金コロイドの集積により現れる着色ラインの有無により、アレルゲンを検出することができる。
【0038】
本発明において、抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルにおけるアーモンドに対する反応性としては、被検試料におけるアーモンド（標準品）のタンパク質濃度の濃度として２ｐｐｍ～２０ｐｐｍで検出できることを挙げることができる。
【0039】
本発明のアレルゲンの検出方法は、非診断目的のアレルゲンの検出方法とすることもできる。
【0040】
本発明のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットとしては、アレルゲンを認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、アレルゲンを認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体とを備え、前記アレルゲンが加熱変性アーモンド１１Ｓグロブリンであり、前記モノクローナル抗体の一方がアーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ１であり、他方がＰＤＡＭ１と異なるエピトープを認識して、アーモンドには結合するが、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生とは結合しない、抗アーモンドモノクローナル抗体ＰＤＡＭ２であることを特徴とするアーモンドアレルゲンの検出キットであれば特に制限されず、測定サンプルの調製方法や、測定サンプルからアーモンドアレルゲンを検出する方法を記載した取扱説明書や、イムノクロマトストリップに含まれている試薬液の各成分についての説明書等の添付文書が含まれるキットの構成としてもよい。また、製造年月日から１年以上常温保存した場合においても、実用性に耐えうる精度・安定性を有するキットが望ましい。
【0041】
上記キットが、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルを使用するキットである場合には、上記キットに抽出液として、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、及びチオ硫酸ナトリウムを含んでもよい。また、展開液に添加するＦＢＳを加えることができる。さらに、上記取扱説明書には、上記抽出液は拭き取り液や洗浄液として使用することもできる旨記載してもよい。
【0042】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0043】
［実施例１］
［アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体の確立］
（加熱変性アーモンド標準溶液の調製）
生アーモンド（ノンパレル種）の可食部（果肉と種子の殻を取り除いた仁の部分）をミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温にて風乾し、アセトンを除去したものを脱脂アーモンド粉末として調製した。かかる脱脂アーモンド粉末を１.０ｇ量り取り、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％チオ硫酸ナトリウムを含むダルベッコＰＢＳ（以下「ＩＣ抽出液」ともいう）を２０ｍＬ加えて攪拌し、沸騰水中で１０分間加熱して変性処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、加熱変性アーモンド標準溶液（Ｄ－ＡＭ）として調製した。
［アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体の確立］
（加熱変性アーモンド標準溶液の調製）
生アーモンド（ノンパレル種）の可食部（果肉と種子の殻を取り除いた仁の部分）をミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温にて風乾し、アセトンを除去したものを脱脂アーモンド粉末として調製した。かかる脱脂アーモンド粉末を１.０ｇ量り取り、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％チオ硫酸ナトリウムを含むダルベッコＰＢＳ（以下「ＩＣ抽出液」ともいう）を２０ｍＬ加えて攪拌し、沸騰水中で１０分間加熱して変性処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、加熱変性アーモンド標準溶液（Ｄ－ＡＭ）として調製した。
【0044】
（加熱変性木の実類抽出溶液の調製）
カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の可食部をそれぞれミルサーにより粉砕した後各１ｇを量り取り、上記ＩＣ抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌した後、沸騰水中で１０分間加熱して変性処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、カシューナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＣＳ」ＩＣ抽出溶液、ヘーゼルナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＨＺ」）ＩＣ抽出溶液、ピスタチオ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＳ」）ＩＣ抽出溶液、マカダミアナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＭＣ」）ＩＣ抽出溶液、ペカンナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＥ」）ＩＣ抽出溶液、クルミ加熱変性タンパク質ＩＣ抽出溶液（「Ｄ－ＷＮ」）、及び落花生加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＮ」）ＩＣ抽出溶液の各溶液として調製した。各溶液におけるタンパク質の濃度は、２－Ｄ ＱｕａｎｔＫｉｔ（GE Healthcare Life Science社製）を用いて必要に応じて測定した。
カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の可食部をそれぞれミルサーにより粉砕した後各１ｇを量り取り、上記ＩＣ抽出液を１９ｍＬ加えて撹拌した後、沸騰水中で１０分間加熱して変性処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、カシューナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＣＳ」ＩＣ抽出溶液、ヘーゼルナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＨＺ」）ＩＣ抽出溶液、ピスタチオ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＳ」）ＩＣ抽出溶液、マカダミアナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＭＣ」）ＩＣ抽出溶液、ペカンナッツ加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＥ」）ＩＣ抽出溶液、クルミ加熱変性タンパク質ＩＣ抽出溶液（「Ｄ－ＷＮ」）、及び落花生加熱変性タンパク質（「Ｄ－ＰＮ」）ＩＣ抽出溶液の各溶液として調製した。各溶液におけるタンパク質の濃度は、２－Ｄ ＱｕａｎｔＫｉｔ（GE Healthcare Life Science社製）を用いて必要に応じて測定した。
【0045】
（アーモンドアレルゲンの指標となるアーモンド１１Ｓグロブリンの精製）
上記脱脂アーモンド粉末を、プレップセル９６０（Bio Rad社製）を用いて精製した。１１Ｓグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。かかる凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で０．１％のアーモンド１１Ｓグロブリンの溶液を作製し、１ｍＬ容チューブに５００μＬずつ分注して、アーモンド１１Ｓグロブリンの抗原溶液とし、免疫に供するまで－４０℃にて凍結保管した。
上記脱脂アーモンド粉末を、プレップセル９６０（Bio Rad社製）を用いて精製した。１１Ｓグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。かかる凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で０．１％のアーモンド１１Ｓグロブリンの溶液を作製し、１ｍＬ容チューブに５００μＬずつ分注して、アーモンド１１Ｓグロブリンの抗原溶液とし、免疫に供するまで－４０℃にて凍結保管した。
【0046】
（ラット由来抗アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体の作製）
（１）ラットへの免疫
供試動物として、８週齢のＦ３４４／ＤｕＣｒｌＣｒｌｊラット（日本チャールズリバー社から入手）１匹を用いた。ラットの初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社製）を０．１％のアーモンド１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを用い、このエマルジョン２００μＬを尾根部より注射した。初回免疫から２週間後に、１００μＬの０．１％１１Ｓグロブリン溶液を尾部静脈より注射して追加免疫とした。
（１）ラットへの免疫
供試動物として、８週齢のＦ３４４／ＤｕＣｒｌＣｒｌｊラット（日本チャールズリバー社から入手）１匹を用いた。ラットの初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社製）を０．１％のアーモンド１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを用い、このエマルジョン２００μＬを尾根部より注射した。初回免疫から２週間後に、１００μＬの０．１％１１Ｓグロブリン溶液を尾部静脈より注射して追加免疫とした。
【0047】
（２）ラット由来抗体産生ハイブリドーマの作製
ラット由来抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、上記尾部静脈注射から４日後、供試ラットから腸骨リンパ節を無菌的に摘出した。腸骨リンパ節を細切後、ＲＰＭＩ１６４０（富士フィルム和光純薬社製）で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（ＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ、７０ｍｍ、Becton Dickinson社製）に通し、腸骨リンパ節細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により腸骨リンパ節細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この腸骨リンパ節細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加えて希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
ラット由来抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、上記尾部静脈注射から４日後、供試ラットから腸骨リンパ節を無菌的に摘出した。腸骨リンパ節を細切後、ＲＰＭＩ１６４０（富士フィルム和光純薬社製）で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（ＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ、７０ｍｍ、Becton Dickinson社製）に通し、腸骨リンパ節細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により腸骨リンパ節細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この腸骨リンパ節細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加えて希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
【0048】
（３）抗体産生ハイブリドーマの限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清を、ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として供試し、抗１１Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡ法により１１Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレートに移し、限界希釈法によるクローニングを行った。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清を、ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として供試し、抗１１Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡ法により１１Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレートに移し、限界希釈法によるクローニングを行った。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【0049】
（４）モノクローナル抗体のスクリーニング
上記培養上清の、アーモンド１１Ｓグロブリンを含むＤ－ＡＭに対する反応性が認められるモノクローナル抗体について、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生それぞれにおける１１Ｓグロブリン含む加熱変性処理粗タンパク質、すなわち、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ及びＤ－ＰＮに対する反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法にて判定し、Ｄ－ＡＭに対して陽性を示し、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ及びＤ－ＰＮに対して陰性を示すラット由来モノクローナル抗体を３種類選抜した。
上記培養上清の、アーモンド１１Ｓグロブリンを含むＤ－ＡＭに対する反応性が認められるモノクローナル抗体について、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生それぞれにおける１１Ｓグロブリン含む加熱変性処理粗タンパク質、すなわち、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ及びＤ－ＰＮに対する反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法にて判定し、Ｄ－ＡＭに対して陽性を示し、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ及びＤ－ＰＮに対して陰性を示すラット由来モノクローナル抗体を３種類選抜した。
【0050】
（５）マウスの腹水の採取及びラット由来モノクローナル抗体の精製
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＣＢ－１７／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社から入手）に不完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社製）を２００μＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞にクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する３種類のハイブリドーマをそれぞれ接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、アーモンド１１Ｓグロブリンに対して特異性を有する３種類のラット由来精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を取得し、それぞれＡ、Ｂ及びＰＤＡＭ２抗体と呼ぶこととした。
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＣＢ－１７／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社から入手）に不完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich社製）を２００μＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞にクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する３種類のハイブリドーマをそれぞれ接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、アーモンド１１Ｓグロブリンに対して特異性を有する３種類のラット由来精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を取得し、それぞれＡ、Ｂ及びＰＤＡＭ２抗体と呼ぶこととした。
【0051】
（マウス由来抗アーモンド１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体の作製）
（１）マウスへの免疫
供試動物として、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社から入手）２匹を用いた。マウスの初回免疫には、完全フロイントアジュバントを０．１％の上記アーモンド１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試し、このエマルジョンを一尾当たり１００μＬ腹腔内に注射した。追加免疫には、不完全フロイントアジュバントを０．１％の１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１匹当たり１００μＬ腹腔内に注射した。
（１）マウスへの免疫
供試動物として、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社から入手）２匹を用いた。マウスの初回免疫には、完全フロイントアジュバントを０．１％の上記アーモンド１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試し、このエマルジョンを一尾当たり１００μＬ腹腔内に注射した。追加免疫には、不完全フロイントアジュバントを０．１％の１１Ｓグロブリン溶液が５００μＬ入ったチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１匹当たり１００μＬ腹腔内に注射した。
【0052】
（２）血中抗体価の測定
初回又は追加免疫で１１Ｓグロブリンを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡ法によりマウス血中の抗１１Ｓグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社製）を用いた。さらに追加免疫を２週間の間隔で５回行い、十分に抗体価が上がったマウスに、１００μＬの０．１％１１Ｓグロブリン溶液を尾部静脈より注射した。
初回又は追加免疫で１１Ｓグロブリンを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡ法によりマウス血中の抗１１Ｓグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社製）を用いた。さらに追加免疫を２週間の間隔で５回行い、十分に抗体価が上がったマウスに、１００μＬの０．１％１１Ｓグロブリン溶液を尾部静脈より注射した。
【0053】
（３）マウス由来抗体産生ハイブリドーマの作製
マウス由来抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、上記１１Ｓグロブリン溶液の尾部静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュを通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
マウス由来抗体産生ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、上記１１Ｓグロブリン溶液の尾部静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュを通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
【0054】
（４）マウス由来抗体産生ハイブリドーマの限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清を、ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として供試し、抗１１Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡ法により１１Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレートに移し、限界希釈法によるクローニングを行った。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清を、ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として供試し、抗１１Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡ法により１１Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレートに移し、限界希釈法によるクローニングを行った。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【0055】
（５）モノクローナル抗体のスクリーニング
上記培養上清の、アーモンド１１Ｓグロブリンを含むＤ－ＡＭに対する反応性が認められるクローンについて、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の７種類のそれぞれにおける１１Ｓグロブリン含む加熱変性タンパク質、すなわち、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮに対する反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法にて判定し、Ｄ－ＡＭに対して陽性を示すが、上記７種類の他の木の実類のタンパク質に対して陰性を示すマウス由来モノクローナル抗体を１種類選抜した。
上記培養上清の、アーモンド１１Ｓグロブリンを含むＤ－ＡＭに対する反応性が認められるクローンについて、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の７種類のそれぞれにおける１１Ｓグロブリン含む加熱変性タンパク質、すなわち、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮに対する反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法にて判定し、Ｄ－ＡＭに対して陽性を示すが、上記７種類の他の木の実類のタンパク質に対して陰性を示すマウス由来モノクローナル抗体を１種類選抜した。
【0056】
（６）マウスの腹水の採取及びマウス由来モノクローナル抗体の精製
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを２００μＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、アーモンド１１Ｓグロブリンに対して特異性を有する１種類のマウス由来精製モノクローナル抗体を取得し、ＰＤＡＭ１抗体と呼ぶこととした。
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを２００μＬ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採取した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、アーモンド１１Ｓグロブリンに対して特異性を有する１種類のマウス由来精製モノクローナル抗体を取得し、ＰＤＡＭ１抗体と呼ぶこととした。
【0057】
［実施例２］
［抗体の組合せ評価］
上記Ａ、Ｂ、ＰＤＡＭ１抗体及びＰＤＡＭ２抗体から、二種類の抗体を選択することによる、アーモンドタンパク質の検出に適した抗体の組合せを検討することとした。
［抗体の組合せ評価］
上記Ａ、Ｂ、ＰＤＡＭ１抗体及びＰＤＡＭ２抗体から、二種類の抗体を選択することによる、アーモンドタンパク質の検出に適した抗体の組合せを検討することとした。
【0058】
［１．サンドイッチＥＬＩＳＡ法による抗体の組合せ評価］
（抗体の固相化）
９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ ｐｌａｔｅ Ｆ８ＮＡＬ、４６８６６７）を用い、固相化抗体を調製した。上記４種類の精製抗体をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ）で５μｇ／ｍＬの固相用抗体溶液に調製し、各抗体について１００μＬ／ウェルを８ウェルずつ分注した。３７℃にて１．５時間静置して固相化反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄し、１％牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社製）／ＰＢＳを１５０μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１時間静置して反応させてブロッキングを行い、その後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄して、４種類の固相化抗体を８ウェルずつ調製した。
（抗体の固相化）
９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ ｐｌａｔｅ Ｆ８ＮＡＬ、４６８６６７）を用い、固相化抗体を調製した。上記４種類の精製抗体をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ）で５μｇ／ｍＬの固相用抗体溶液に調製し、各抗体について１００μＬ／ウェルを８ウェルずつ分注した。３７℃にて１．５時間静置して固相化反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄し、１％牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社製）／ＰＢＳを１５０μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１時間静置して反応させてブロッキングを行い、その後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄して、４種類の固相化抗体を８ウェルずつ調製した。
【0059】
（測定用アーモンドタンパク質溶液の調製と添加）
上記Ｄ－ＡＭを、ＰＢＳＴを用いて０．１ｐｐｍ又は１ｐｐｍの濃度のＤ－ＡＭ溶液となるように調製し、測定用アーモンドタンパク質溶液とした。上記固相化した抗体が調製された１６ウェルに０．１ｐｐｍのＤ－ＡＭ溶液を１００μＬ／ウェル分注し、別の１６ウェルに１ｐｐｍのＤ－ＡＭ溶液を１００μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１．５時間静置して、Ｄ－ＡＭと各固相化抗体とを反応させた。その他ＰＢＳＴをブランクとした。その後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
上記Ｄ－ＡＭを、ＰＢＳＴを用いて０．１ｐｐｍ又は１ｐｐｍの濃度のＤ－ＡＭ溶液となるように調製し、測定用アーモンドタンパク質溶液とした。上記固相化した抗体が調製された１６ウェルに０．１ｐｐｍのＤ－ＡＭ溶液を１００μＬ／ウェル分注し、別の１６ウェルに１ｐｐｍのＤ－ＡＭ溶液を１００μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１．５時間静置して、Ｄ－ＡＭと各固相化抗体とを反応させた。その他ＰＢＳＴをブランクとした。その後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
【0060】
（ＨＲＰ標識抗体による反応）
上記４種類の精製モノクローナル抗体それぞれについて、西洋わさびペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase；ＨＲＰ）による酵素標識をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ（ＬＫ０９、株式会社同仁化学研究所製）を用いて行った。ＰＢＳＴを用いて０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗体を調製し、１００μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１．５ｈ静置して反応させた。その後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
上記４種類の精製モノクローナル抗体それぞれについて、西洋わさびペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase；ＨＲＰ）による酵素標識をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ（ＬＫ０９、株式会社同仁化学研究所製）を用いて行った。ＰＢＳＴを用いて０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗体を調製し、１００μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１．５ｈ静置して反応させた。その後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
【0061】
（発色）
発色剤３、３’、５、５’テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ溶液、１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， ＳｕｒｅＢｌｕｅ、５１２０－００７５、KPL社製）を１００μＬ／ウェル分注し、遮光下常温にて１０分静置して反応させた。１規定塩酸を１００μＬ／ウェル分注することにより反応を停止させ、主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍにて吸光度を測定した。マイクロプレート上の抗体の組合せのレイアウト、及び、各ウェルにおける主波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値を実質吸光度として、以下の表１に示す。なお、６２０ｎｍの副波長は、検体によるウェル内の汚れや洗浄操作等によるウェルのくもり、キズ等によるウェル間吸光度差をキャンセルするために測定された吸光度である。
発色剤３、３’、５、５’テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ溶液、１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， ＳｕｒｅＢｌｕｅ、５１２０－００７５、KPL社製）を１００μＬ／ウェル分注し、遮光下常温にて１０分静置して反応させた。１規定塩酸を１００μＬ／ウェル分注することにより反応を停止させ、主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍにて吸光度を測定した。マイクロプレート上の抗体の組合せのレイアウト、及び、各ウェルにおける主波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値を実質吸光度として、以下の表１に示す。なお、６２０ｎｍの副波長は、検体によるウェル内の汚れや洗浄操作等によるウェルのくもり、キズ等によるウェル間吸光度差をキャンセルするために測定された吸光度である。
【0062】
【表1】
【0063】
（結果）
上記主波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値（実質吸光度：４５０ｎｍ－６２０ｎｍ）においては、ＰＤＡＭ１抗体を固相化抗体とし、ＰＤＡＭ２抗体を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いた酵素標識抗体とした場合に、実質吸光度が高いことが確認され、アーモンドタンパク質に対する反応性が強いことが確認された。
上記主波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値（実質吸光度：４５０ｎｍ－６２０ｎｍ）においては、ＰＤＡＭ１抗体を固相化抗体とし、ＰＤＡＭ２抗体を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いた酵素標識抗体とした場合に、実質吸光度が高いことが確認され、アーモンドタンパク質に対する反応性が強いことが確認された。
【0064】
［実施例３］
［２．イムノクロマトグラフィーによる抗体の組合せ評価］
上記［１．サンドイッチＥＬＩＳＡ法による抗体の組合せ評価］において、アーモンドタンパク質に対する反応性が強いことが示された、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体とを用いて、以下の手順でイムノクロマトストリップを作製し、アーモンドタンパク質の検出について、イムノクロマトストリップにおける金コロイド標識抗体とメンブレン上に固定化された抗体の組合せについて、より好適な抗体の組合せを検討することにした。
［２．イムノクロマトグラフィーによる抗体の組合せ評価］
上記［１．サンドイッチＥＬＩＳＡ法による抗体の組合せ評価］において、アーモンドタンパク質に対する反応性が強いことが示された、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体とを用いて、以下の手順でイムノクロマトストリップを作製し、アーモンドタンパク質の検出について、イムノクロマトストリップにおける金コロイド標識抗体とメンブレン上に固定化された抗体の組合せについて、より好適な抗体の組合せを検討することにした。
【0065】
（アーモンドタンパク質を含む測定サンプルの作製）
上記Ｄ－ＡＭをそれぞれの被検液中の濃度が、１．０ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）、０．５ｐｐｍ（１０ｐｐｍ）、０．２ｐｐｍ（４ｐｐｍ）、０．１ｐｐｍ（２ｐｐｍ）、及び０ｐｐｍ（ネガティブコントロール）となるように調整し、各濃度のアーモンド加熱変性タンパク質を含む測定サンプルを作製した。なお、カッコ内は、２０倍抽出を想定した製品換算濃度である。
上記Ｄ－ＡＭをそれぞれの被検液中の濃度が、１．０ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）、０．５ｐｐｍ（１０ｐｐｍ）、０．２ｐｐｍ（４ｐｐｍ）、０．１ｐｐｍ（２ｐｐｍ）、及び０ｐｐｍ（ネガティブコントロール）となるように調整し、各濃度のアーモンド加熱変性タンパク質を含む測定サンプルを作製した。なお、カッコ内は、２０倍抽出を想定した製品換算濃度である。
【0066】
（イムノクロマトストリップの作製）
（１）金コロイド標識抗体の作製
ＰＤＡＭ１及びＰＤＡＭ２の各抗体について、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるように各抗体溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（BBI solutions社製）５ｍＬに上記抗体溶液をそれぞれ５００μＬ加え、室温で３０分間反応させた後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μＬ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製して、２種類の金コロイド標識抗体溶液を調製した。
（１）金コロイド標識抗体の作製
ＰＤＡＭ１及びＰＤＡＭ２の各抗体について、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍＬとなるように各抗体溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（BBI solutions社製）５ｍＬに上記抗体溶液をそれぞれ５００μＬ加え、室温で３０分間反応させた後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μＬ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製して、２種類の金コロイド標識抗体溶液を調製した。
【0067】
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＤＡＭ１及びＰＤＡＭ２の各抗体について、ＰＢＳで４ｍｇ／ｍＬとなるように各抗体溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に各抗体溶液を塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むリン酸緩衝液（Phosphate Buffer：ＰＢ）で３７℃にて１時間ブロッキング後、ＰＢで洗浄し乾燥させることにより、上記各抗体をメンブレンに固定化し、ＰＤＡＭ１抗体固定化メンブレン及びＰＤＡＭ２抗体固定化メンブレンを調製した。
ＰＤＡＭ１及びＰＤＡＭ２の各抗体について、ＰＢＳで４ｍｇ／ｍＬとなるように各抗体溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に各抗体溶液を塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むリン酸緩衝液（Phosphate Buffer：ＰＢ）で３７℃にて１時間ブロッキング後、ＰＢで洗浄し乾燥させることにより、上記各抗体をメンブレンに固定化し、ＰＤＡＭ１抗体固定化メンブレン及びＰＤＡＭ２抗体固定化メンブレンを調製した。
【0068】
（３）イムノクロマトストリップの組立
上記２種類の抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、２種類のイムノクロマトストリップを作製した。
上記２種類の抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、２種類のイムノクロマトストリップを作製した。
【0069】
（４）イムノクロマトグラフィーによる、アーモンドタンパク質の検出の確認
上記各金コロイド標識抗体を２０μＬ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬに、上記各濃度の測定サンプルを５０μＬそれぞれ加えたものを、被検液として各抗体がメンブレンに固定化されているイムノクロマトストリップにスポットし、各抗体の組合せにおいてアーモンドタンパク質（アレルゲン）検出の有無の確認を行った。メンブレンに固定化された抗体と金コロイド標識抗体との各組合せにおける、アーモンドタンパク質溶液の各濃度における検出の有無を以下の表２に示す。判定はラインの着色が強い方から順に「＋」、「＋ｗ」と表記し、陰性を「－」とした。なお、「N.T.」は検出試験を行っていないことを示す。
上記各金コロイド標識抗体を２０μＬ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬに、上記各濃度の測定サンプルを５０μＬそれぞれ加えたものを、被検液として各抗体がメンブレンに固定化されているイムノクロマトストリップにスポットし、各抗体の組合せにおいてアーモンドタンパク質（アレルゲン）検出の有無の確認を行った。メンブレンに固定化された抗体と金コロイド標識抗体との各組合せにおける、アーモンドタンパク質溶液の各濃度における検出の有無を以下の表２に示す。判定はラインの着色が強い方から順に「＋」、「＋ｗ」と表記し、陰性を「－」とした。なお、「N.T.」は検出試験を行っていないことを示す。
【0070】
【表2】
【0071】
（結果）
上記表２から明らかなとおり、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２から調製されている場合に、被検液中のアーモンドタンパク質（Ｄ－ＡＭ）の濃度が１．０ｐｐｍと０．５ｐｐｍのときは「＋」、０．２ｐｐｍ及び０．１ｐｐｍのときにも「＋ｗ」を示し、高い反応性があることが確認された。なお、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ２抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ１抗体から調製されている場合にも、測定サンプル中のアーモンドタンパク質の濃度が１．０ｐｐｍのときは「＋」を示し、また、０．５ｐｐｍのときは「＋ｗ」を示したので、０．５ｐｐｍ以上であれば反応性があることが確認されたが、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２抗体である場合が、アーモンドタンパク質を検出する能力がより高いことが確認された。
上記表２から明らかなとおり、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２から調製されている場合に、被検液中のアーモンドタンパク質（Ｄ－ＡＭ）の濃度が１．０ｐｐｍと０．５ｐｐｍのときは「＋」、０．２ｐｐｍ及び０．１ｐｐｍのときにも「＋ｗ」を示し、高い反応性があることが確認された。なお、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ２抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ１抗体から調製されている場合にも、測定サンプル中のアーモンドタンパク質の濃度が１．０ｐｐｍのときは「＋」を示し、また、０．５ｐｐｍのときは「＋ｗ」を示したので、０．５ｐｐｍ以上であれば反応性があることが確認されたが、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２抗体である場合が、アーモンドタンパク質を検出する能力がより高いことが確認された。
【0072】
［実施例４］
［ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体の特異性評価］
［アーモンド以外の他の木の実類のタンパク質とのイムノクロマトグラフィーによる交差反応性の確認］
上記イムノクロマトストリップのうち、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２抗体であるイムノクロマトストリップを使用して、前記Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮをイムノクロマトグラフィーによる検出対象として交差反応性の有無を評価することとした。
［ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体の特異性評価］
［アーモンド以外の他の木の実類のタンパク質とのイムノクロマトグラフィーによる交差反応性の確認］
上記イムノクロマトストリップのうち、メンブレンに固定化された抗体がＰＤＡＭ１抗体であり、金コロイド標識抗体がＰＤＡＭ２抗体であるイムノクロマトストリップを使用して、前記Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮをイムノクロマトグラフィーによる検出対象として交差反応性の有無を評価することとした。
【0073】
（各他の木の実類のタンパク質を含む測定試料の作製）
カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生について各１ｇを、上記ＩＣ抽出液を用いて２０倍でタンパク質を抽出し、各測定試料を作製した。
カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生について各１ｇを、上記ＩＣ抽出液を用いて２０倍でタンパク質を抽出し、各測定試料を作製した。
【0074】
（イムノクロマトグラフィーによる各他の木の実類の検出の確認）
上記金コロイド標識ＰＤＡＭ２抗体溶液を２０μＬ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬ、他の木の実類のそれそれのタンパク質を含む上記各測定試料をそれぞれ５０μＬ加えて、被検液とした。かかる被検液をＰＤＡＭ１抗体がメンブレンに固定化されているイムノクロマトストリップにスポットし、各木の実のタンパク質の検出の有無の確認を行った。結果を表３に示す。
上記金コロイド標識ＰＤＡＭ２抗体溶液を２０μＬ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μＬ、他の木の実類のそれそれのタンパク質を含む上記各測定試料をそれぞれ５０μＬ加えて、被検液とした。かかる被検液をＰＤＡＭ１抗体がメンブレンに固定化されているイムノクロマトストリップにスポットし、各木の実のタンパク質の検出の有無の確認を行った。結果を表３に示す。
【0075】
【表3】
【0076】
(結果)
表３から明らかなとおり、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体とを用いる上記イムノクロマトストリップは、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の各タンパク質に対して反応性を示さず、これらの木の実タンパク質との交差反応性がないことが確認された。
表３から明らかなとおり、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体とを用いる上記イムノクロマトストリップは、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生の各タンパク質に対して反応性を示さず、これらの木の実タンパク質との交差反応性がないことが確認された。
【0077】
［実施例５］
［アーモンド以外の木の実タンパク質との交差反応性についてインダイレクトＥＬＩＳＡ法による確認］
アーモンドタンパク質（Ｄ－ＡＭ）と、アーモンド以外の７種類のタンパク質（Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮ）の合計８種類のタンパク質を抗原とした場合の、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体の各タンパク質への反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法で確認することとした。
［アーモンド以外の木の実タンパク質との交差反応性についてインダイレクトＥＬＩＳＡ法による確認］
アーモンドタンパク質（Ｄ－ＡＭ）と、アーモンド以外の７種類のタンパク質（Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮ）の合計８種類のタンパク質を抗原とした場合の、ＰＤＡＭ１抗体とＰＤＡＭ２抗体の各タンパク質への反応性をインダイレクトＥＬＩＳＡ法で確認することとした。
【0078】
（抗原の固相化）
９６ウェルマイクロプレートを用い、Ｄ－ＡＭ、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮを抗原として固相化した。ダルベッコＰＢＳで１００μｇ／ｍＬの各抗原溶液を調製し、それぞれ２ウェルずつ１００μＬ／ウェル分注した。３７℃にて１．５時間静置して、抗原の固相化反応をさせた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１５０μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１時間静置して反応させてブロッキング反応を行った後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄して、８種類の固相化抗原を２ウェルずつ調製した。
９６ウェルマイクロプレートを用い、Ｄ－ＡＭ、Ｄ－ＣＳ、Ｄ－ＨＺ、Ｄ－ＰＳ、Ｄ－ＭＣ、Ｄ－ＷＮ、Ｄ－ＰＥ、及びＤ－ＰＮを抗原として固相化した。ダルベッコＰＢＳで１００μｇ／ｍＬの各抗原溶液を調製し、それぞれ２ウェルずつ１００μＬ／ウェル分注した。３７℃にて１．５時間静置して、抗原の固相化反応をさせた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１５０μＬ／ウェル分注し、３７℃にて１時間静置して反応させてブロッキング反応を行った後ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄して、８種類の固相化抗原を２ウェルずつ調製した。
【0079】
（一次抗体反応）
ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬのＰＤＡＭ１抗体溶液を調製し、８種類の固相化抗原が調製されたウェルに１００μＬ／ウェル分注した（８ウェル）。ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬのＰＤＡＭ２抗体溶液を調製し、８種類の固相化抗原が調製されたウェルに１００μＬ／ウェル分注した（８ウェル）。３７℃にて１．５時間静置して反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬのＰＤＡＭ１抗体溶液を調製し、８種類の固相化抗原が調製されたウェルに１００μＬ／ウェル分注した（８ウェル）。ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬのＰＤＡＭ２抗体溶液を調製し、８種類の固相化抗原が調製されたウェルに１００μＬ／ウェル分注した（８ウェル）。３７℃にて１．５時間静置して反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
【0080】
（二次抗体反応）
上記ＰＤＡＭ１抗体溶液を分注した８ウェルには、抗ラットＩｇＧ抗体（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research、712-056-153））を１００μＬ／ウェル分注し、上記ＰＤＡＭ２抗体溶液を分注した８ウェルには、抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research、315-055-003））を１００μＬ／ウェル分注した。３７℃にて１．５時間静置して反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
上記ＰＤＡＭ１抗体溶液を分注した８ウェルには、抗ラットＩｇＧ抗体（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research、712-056-153））を１００μＬ／ウェル分注し、上記ＰＤＡＭ２抗体溶液を分注した８ウェルには、抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research、315-055-003））を１００μＬ／ウェル分注した。３７℃にて１．５時間静置して反応させた後、ＰＢＳＴ２５０μＬで各ウェルを５回洗浄した。
【0081】
（発色）
ｐ－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物０．０１ｇ、及び、１％２，２’－イミノジエタノール＋１％塩化マグネシウム六水和物＋０．０２％アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ９．８）（ジエタノールアミンバッファー）１０ｍＬを混合して調製された発色剤を、上記１６ウェルに１００μＬ／ウェル分注し、遮光下常温にて３０分静置して反応させた。５規定水酸化ナトリウムを５０μＬ／ウェル分注することにより反応を停止させ、主波長４０５ｎｍ、副波長６２０ｎｍにて吸光度を測定した。各抗原における主波長４０５ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値について、図１に示す。
ｐ－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物０．０１ｇ、及び、１％２，２’－イミノジエタノール＋１％塩化マグネシウム六水和物＋０．０２％アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ９．８）（ジエタノールアミンバッファー）１０ｍＬを混合して調製された発色剤を、上記１６ウェルに１００μＬ／ウェル分注し、遮光下常温にて３０分静置して反応させた。５規定水酸化ナトリウムを５０μＬ／ウェル分注することにより反応を停止させ、主波長４０５ｎｍ、副波長６２０ｎｍにて吸光度を測定した。各抗原における主波長４０５ｎｍにおける吸光度の測定値から副波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定値を差し引いた値について、図１に示す。
【0082】
（結果）
図１（ａ）から明らかなとおり、ＰＤＡＭ１抗体は、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生のいずれに対しても反応性を示さず、アーモンドに対して反応性を示した。図１（ｂ）から明らかなとおり、ＰＤＡＭ２抗体も、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生のいずれに対して反応性を示さず、アーモンドに対してのみ反応性を示した。
図１（ａ）から明らかなとおり、ＰＤＡＭ１抗体は、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生のいずれに対しても反応性を示さず、アーモンドに対して反応性を示した。図１（ｂ）から明らかなとおり、ＰＤＡＭ２抗体も、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、マカダミアナッツ、クルミ、ペカンナッツ、及び落花生のいずれに対して反応性を示さず、アーモンドに対してのみ反応性を示した。
【0083】
［食品中のアーモンドタンパク質の検出］
アーモンドを含むことが明らかな市販のチョコレート菓子３種類（製品Ａ、製品Ｂ、及び製品Ｃ）を用いて、本発明のイムノクロマト法によるアレルゲン検出を行った。各サンプル１．０ｇを量り取り、抽出液を１９ｍＬ加え、未加熱のまま、又は沸騰水中に１０分間加熱処理を行って抽出処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、上記３種類の各食品抽出溶液を調製したが、各食品抽出溶液を調製する際の上記抽出処理として、上記製品Ａ、製品Ｂ、及び製品Ｃそれぞれについて、以下の４種類の手順で行い、イムノクロマト法における効率的な抽出について検討を行った。
アーモンドを含むことが明らかな市販のチョコレート菓子３種類（製品Ａ、製品Ｂ、及び製品Ｃ）を用いて、本発明のイムノクロマト法によるアレルゲン検出を行った。各サンプル１．０ｇを量り取り、抽出液を１９ｍＬ加え、未加熱のまま、又は沸騰水中に１０分間加熱処理を行って抽出処理を行い、冷却後に遠心し、各遠心上清を回収して、上記３種類の各食品抽出溶液を調製したが、各食品抽出溶液を調製する際の上記抽出処理として、上記製品Ａ、製品Ｂ、及び製品Ｃそれぞれについて、以下の４種類の手順で行い、イムノクロマト法における効率的な抽出について検討を行った。
【0084】
１）ダルベッコＰＢＳを抽出液として未加熱抽出を行う
２）ダルベッコＰＢＳを抽出液として沸騰水中で１０分間加熱する加熱抽出を行う（ＰＢＳ加熱抽出）
３）上記ＩＣ抽出液を抽出液として未加熱抽出を行う（（ＩＣ）未加熱抽出）
４）上記ＩＣ抽出液を抽出液として沸騰水中で１０分間加熱する加熱抽出を行う（（ＩＣ）加熱抽出）
上記４種類の各抽出処理が行われた製品Ａ及び製品Ｂの各食品抽出溶液（１２種類）について、上記抽出時に用いた抽出液にて、×１００、×１０００、×１００００、×２００００に希釈して、各濃度のサンプルとして、上記イムノクロマトストリップに供した。判定ラインの着色の濃さ（ｍＡＢＳ）をイムノクロマトリーダＣ１００６６－１０（浜松ホトニクス株式会社製）によって測定し、結果を図２～図４に示す。
２）ダルベッコＰＢＳを抽出液として沸騰水中で１０分間加熱する加熱抽出を行う（ＰＢＳ加熱抽出）
３）上記ＩＣ抽出液を抽出液として未加熱抽出を行う（（ＩＣ）未加熱抽出）
４）上記ＩＣ抽出液を抽出液として沸騰水中で１０分間加熱する加熱抽出を行う（（ＩＣ）加熱抽出）
上記４種類の各抽出処理が行われた製品Ａ及び製品Ｂの各食品抽出溶液（１２種類）について、上記抽出時に用いた抽出液にて、×１００、×１０００、×１００００、×２００００に希釈して、各濃度のサンプルとして、上記イムノクロマトストリップに供した。判定ラインの着色の濃さ（ｍＡＢＳ）をイムノクロマトリーダＣ１００６６－１０（浜松ホトニクス株式会社製）によって測定し、結果を図２～図４に示す。
【0085】
（結果）
図２～図４から明らかなとおり、製品Ａ、製品Ｂ及び製品Ｃいずれにおいても、上記ＩＣ抽出液を抽出液として用いて加熱抽出を行った場合は、ＰＢＳを用いた加熱抽出よりも高い感度で測定が可能であることが確認された。また、ＩＣ抽出液を抽出液として用いて未加熱で抽出を行った場合でも、製品Ａを除いては、ＰＢＳを用いた加熱抽出よりも高い感度で測定が可能であることが確認された。なお、上記１）のダルベッコＰＢＳを抽出液として未加熱抽出を行った場合は、いずれの場合も判定ラインの着色が認められず陰性であったため、図２～図４の各グラフの記載から除外した。
図２～図４から明らかなとおり、製品Ａ、製品Ｂ及び製品Ｃいずれにおいても、上記ＩＣ抽出液を抽出液として用いて加熱抽出を行った場合は、ＰＢＳを用いた加熱抽出よりも高い感度で測定が可能であることが確認された。また、ＩＣ抽出液を抽出液として用いて未加熱で抽出を行った場合でも、製品Ａを除いては、ＰＢＳを用いた加熱抽出よりも高い感度で測定が可能であることが確認された。なお、上記１）のダルベッコＰＢＳを抽出液として未加熱抽出を行った場合は、いずれの場合も判定ラインの着色が認められず陰性であったため、図２～図４の各グラフの記載から除外した。
【0086】
以上の結果から、正確な濃度がわからず、また、加工の程度が異なる市販製品についても、前記ＩＣ抽出液を使用した場合には、加熱抽出、未加熱抽出いずれにおいても少なくとも製品の８００００倍希釈（２０×４０００）程度の溶液をサンプルとすればアーモンドアレルゲンを定性的に十分に検出できることが確認された。
【0087】
（ポリフェノール含有飲料における検出）
コーヒーやお茶に含まれるポリフェノールは、タンパク質を吸着する性質があり、免疫学的測定を阻害することが知られている。そこで、ポリフェノール含量が多いと思われる、ブラックコーヒー、ほうじ茶、ルイボスティー、及び、抹茶入り緑茶の４種類のアーモンドを含まない市販の飲料に、アーモンドミルクを添加した各試料について、アーモンドアレルゲンの検出を試みた。
コーヒーやお茶に含まれるポリフェノールは、タンパク質を吸着する性質があり、免疫学的測定を阻害することが知られている。そこで、ポリフェノール含量が多いと思われる、ブラックコーヒー、ほうじ茶、ルイボスティー、及び、抹茶入り緑茶の４種類のアーモンドを含まない市販の飲料に、アーモンドミルクを添加した各試料について、アーモンドアレルゲンの検出を試みた。
【0088】
上記４種類の市販の飲料を１．０ｇ量り取り、上記ＩＣ抽出液を１９ｍＬ加えた後、アーモンドミルクをタンパク質量として１０ｐｐｍとなるように添加して測定サンプルを調製した後、各飲料について、抽出液として、ＰＢＳとＩＣ抽出液の２種類のいずれかを使用して、沸騰水中で１０分間加熱処理を行い、加熱抽出を行った。加熱抽出後、サンプルの上清を回収して、８種類の加熱抽出サンプルとした。
【0089】
上記８種類の加熱抽出サンプルをイムノクロマトで測定した。判定ラインの着色の濃さ（ｍＡＢＳ）をイムノクロマトリーダＣ１００６６－１０（浜松ホトニクス株式会社製）によって測定した。結果を図５に示す。
【0090】
（結果）
図５から明らかなとおり、いずれの飲料においても、ＰＢＳを抽出液として加熱処理したサンプルからは、アレルゲンを検出することはほとんどできなかった。一方、ＩＣ抽出液を用いて加熱処理したサンプルからは、アーモンドタンパク質が検出することができることが確認された。したがって、ＩＣ抽出液を用いて加熱抽出した場合には、免疫学的測定を阻害するポリフェノールを含む食品においても、アーモンドアレルゲンの有無について、濃度が１０ｐｐｍ以上あれば、定性的な検査が可能であることを確認した。
図５から明らかなとおり、いずれの飲料においても、ＰＢＳを抽出液として加熱処理したサンプルからは、アレルゲンを検出することはほとんどできなかった。一方、ＩＣ抽出液を用いて加熱処理したサンプルからは、アーモンドタンパク質が検出することができることが確認された。したがって、ＩＣ抽出液を用いて加熱抽出した場合には、免疫学的測定を阻害するポリフェノールを含む食品においても、アーモンドアレルゲンの有無について、濃度が１０ｐｐｍ以上あれば、定性的な検査が可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0091】
試料中のアーモンドアレルゲンを迅速かつ精度よく検出することのできる、本発明のアーモンドアレルゲンの検出方法や、それに用いることができる本発明のアレルゲンの検出キットは、食品産業において特に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
