特開 2024-155608 測定流路の処理方法及び液体クロマトグラフィ装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024155608

(43)【公開日】2024-10-31

(54)【発明の名称】測定流路の処理方法及び液体クロマトグラフィ装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20241024BHJP

   G01N 30/20 20060101ALI20241024BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 Q

G01N30/20 L

G01N30/26 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023070465

(22)【出願日】2023-04-21

(71)【出願人】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】石川 一輝

(57)【要約】

【課題】各種ヘモグロビンピークを良好に分離する。
【解決手段】検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置の測定流路に、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を流すコンディショニング処理を、ヘモグロビンを分析する前に実行することを含む、測定流路の処理方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置の測定流路に、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を流すコンディショニング処理を、ヘモグロビンを分析する前に実行することを含む、測定流路の処理方法。

【請求項2】

前記ヘモグロビンは、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２とを含む、請求項１に記載の測定流路の処理方法。

【請求項3】

前記アルブミンはウシ血清アルブミンである、請求項１に記載の測定流路の処理方法。

【請求項4】

前記アルブミンはウシ血清アルブミンである、請求項２に記載の測定流路の処理方法。

【請求項5】

前記測定流路を次亜塩素酸で洗浄した後に、前記コンディショニング処理を実行する、請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の測定流路の処理方法。

【請求項6】

測定流路を有するとともに、前記測定流路に検体を流すことで該検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置であって、
前記測定流路が、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液でヘモグロビンの測定前にあらかじめコンディショニング処理されている、液体クロマトグラフィ装置。

【請求項7】

測定流路を有するとともに、前記測定流路に検体を流すことで該検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置であって、
アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を測定流路に供給する供給装置を備える、液体クロマトグラフィ装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフィによるヘモグロビン分析における測定流路の処理方法及び液体クロマトグラフィ装置に関する。

【背景技術】

【0002】

血液中のヘモグロビンは様々な疾患の診断材料となる。たとえば、ＨｂＡが糖化したＨｂＡ１ｃは糖尿病の診断指標であり、ＨｂＡ２はサラセミア症の診断指標である。これらのヘモグロビンは様々な測定原理により測定される。たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィでは各種ヘモグロビンのピークを分離して面積を算出することでそのヘモグロビン種の割合を算出して、これを測定値としている。この測定値は、液体クロマトグラフィのカラムの下流に設けられた光学セルにヘモグロビンの吸収波長の光を照射して得られる吸光度を基に求められる。上記のような疾患を高い精度で診断するためにヘモグロビンの測定も高い精度が求められ、ヘモグロビンのピークを良好に分離することが求められている。

【0003】

液体クロマトグラフィ装置では、カラムや光学セルに高圧がかけられるため、機械的強度を担保するため流路を有する部材はステンレス等の金属で形成されていることが多い。一方で、流路の金属面には検体のタンパク質成分が非特異的に吸着するため、測定結果に影響を及ぼすこともある。この点に鑑み、下記特許文献１には、多孔質金属フィルターを使用した液体クロマトグラフィ用カラムをポリリジンでコンディショニングすることが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１７－２２７４６１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

高速液体クロマトグラフィでヘモグロビン分析を繰り返すうちに測定流路が汚れるため、定期的に洗浄を行う必要がある。しかし、洗浄直後に実施したヘモグロビン分析では、隣接するピークの分離度がかえって悪化する場合があった。これは、ヘモグロビンが、測定流路の清浄な金属表面に吸着することが一因と考えられる。

【0006】

本開示の測定流路の処理方法は、液体クロマトグラフィの測定流路へのヘモグロビンの吸着の抑制を図り、隣接ピークの分離能を向上させることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の測定流路の処理方法は、検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置の測定流路に、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を流すコンディショニング処理を、ヘモグロビンを分析する前に実行する。

【発明の効果】

【0008】

本開示の処理方法によれば、ヘモグロビンの隣接ピークの分離能を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】第１実施形態の液体クロマトグラフィ装置の概要を表す模式図である。

【図2】第２実施形態の液体クロマトグラフィ装置の概要を表す模式図である。

【図3】ヘモグロビン分析クロマトグラムの一例である。

【図4】隣接する２つのピークの分離度を説明するための仮想的なヘモグロビン分析クロマトグラムである。

【図5】光学セルの洗浄前と洗浄後とを比較したヘモグロビン分析クロマトグラムである。

【図6】光学セル洗浄後のＨｂＡ２ピーク値の推移を示すグラフである。

【図7】光学セル洗浄直後の測定と、その後３００回目の測定とを比較したクロマトグラムである。

【図8】光学セル洗浄後のＨｂＡ０ピークとＨｂＡ２ピークとの分離度の推移を示すグラフである。

【図9】各種コンディショニング液によるコンディショニング処理の効果を、ＨｂＡ２ピーク値で比較したグラフである。

【図10】各種コンディショニング液によるコンディショニング処理の効果を、ＨｂＡ０ピークとＨｂＡ２ピークとの分離度で比較したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

ヘモグロビンは、複雑な立体構造を有するため、電荷的かつ疎水的な吸着作用が強く、測定流路の配管及び検出器などに使用される金属表面と結合しやすい。そしてヘモグロビン分析の際には、隣接するピーク同士が融合するなどして良好な分離能を得ることができないことがある。その原因は、検体が分析装置に導入されカラムを介して検出器を通過する過程で、検体中のヘモグロビンが測定流路における金属を含む部材と接触して吸着し、検出ピークの幅が拡大することによる。

【0011】

ここで、カラムは耐圧性を要するため、樹脂での置換は困難であり、必然的にステンレスのような、鉄を含む金属が使用される。また、配管についてはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のような樹脂での代替が進んでいるが、検出器の中は樹脂での置換ができておらず、鉄原子が内側面に露出している部分が存在している。

【0012】

そこで、本実施形態の測定流路の処理方法では、検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置の測定流路に、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を流すコンディショニング処理を、ヘモグロビンを分析する前に実行することで、流路における鉄とヘモグロビンとの非特異的な結合を抑制し、それにより隣接するピークの分離能を向上することができる。

【0013】

コンディショニング液でコンディショニング処理がなされる測定流路は、検体が流れる流路である。具体的には検体がカラムを介してヘモグロビンの検出部の一部を構成する光学セルを通過するまでに検体が通る流路である。たとえば、カラムに検体を導入するインジェクタと、インジェクタの下流に設けられたカラムとを接続する流路と、カラムと、カラムの下流に設けられた検出部とを接続する流路と検出部とを表面処理液で表面処理すればよい。

【0014】

ここで、本開示でいう「コンディショニング」とは、測定流路において検体が接触する部分に、検体の測定対象（具体的にはヘモグロビン）とは無関係のタンパク質を含む液（すなわち、本開示でいうコンディショニング液）をあらかじめ接触させることで、表面にその無関係のタンパク質を非特異的に吸着させることをいう。このコンディショニングにより、検体の測定対象であるヘモグロビンの、測定流路の表面への非特異的吸着が、あらかじめ非特異的に測定流路に吸着している無関係のタンパク質により妨げられる。

【0015】

コンディショニング液には、ヘモグロビンとは無関係のタンパク質又はこれを含む物質として、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクが溶解されている。これらアルブミン、カゼイン又はスキムミルクは、これらのうちの少なくとも一つが溶解されていれば、それ以外が溶解されていてもよい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いることができるが、ヒトヘモグロビンを測定する意味でより無関係のタンパク質として、ＢＳＡを用いることが望ましい。

【0016】

コンディショニング液におけるアルブミン、カゼイン又はスキムミルクの濃度は、０．５～５質量％、望ましくは１～３質量％、さらに望ましくは１．５～２．５質量％である。なお、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクのうち二つ以上がコンディショニング液液に溶解されている場合、上記の濃度はそれらの濃度の合計を意味する。コンディショニング液に用いられる溶媒は、アルブミン及びスキムミルクの場合は精製水が、水に難溶のカゼインの場合はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がそれぞれ望ましい。

【0017】

測定流路のコンディショニング処理は、コンディショニング液を測定流路の内表面に接触させればよい。たとえば測定流路内部をコンディショニング液で浸漬してもよいし、測定流路にコンディショニング液を通液してもよい。なお、測定流路の内表面の全てをコンディショニング液で表面処理することが好ましいが、金属が露出している測定流路の部分が分かっている場合はその部分のみをコンディショニング処理してもよい。たとえば、測定流路のうちカラムの内表面にのみ金属が露出している場合、そのカラムの内表面のみをコンディショニング処理してもよい。また測定流路の内表面のうち金属が露出している部分の全てをコンディショニング処理することが好ましいが、金属が露出している部分の一部をコンディショニング処理するだけでもよい。

【0018】

なお、液体クロマトグラフィ装置の測定流路は適宜のタイミングで洗浄が行われるが、この洗浄には次亜塩素酸を含む洗浄液を用いるのが効果的である。しかし、次亜塩素酸を含む洗浄液で測定流路を洗浄した直後は、測定流路の金属部分が露出した状態となり、続くヘモグロビン測定の際にヘモグロビンが非特異的吸着を起こしやすくなっている。したがって、本開示のコンディショニング処理は、測定流路を次亜塩素酸で洗浄した後に実行することが望ましい。

【0019】

本開示の測定流路の処理方法は、たとえば図１に示す第１の実施形態のように模式化した液体クロマトグラフィ装置１０により実施される。この液体クロマトグラフィ装置１０では、分析対象であるヘモグロビンに適した担体である充填剤２１が充填されたカラム２０の上流及び下流にそれぞれ測定流路４０、５０が接続している。上流側の測定流路４０のさらに上流には、液体を測定流路４０に導入するインジェクタ６０が設けられている。インジェクタ６０の最上流には溶離液が供給される溶離液供給路６１が位置し、その上流には溶離液を貯留する溶離液貯留槽８０が位置している。なお、溶離液貯留槽８０は、タンク形状には限られず、溶離液が封入された使い捨てのパックであってもよい。

【0020】

一方、溶離液供給路６１の下流には溶離液を下流へ送出するポンプ６２が位置する。ポンプ６２の下流には、上流側の測定流路４０に、コンディショニング液を流入させるコンディショニング液流路６４と、検体を流入させる検体流路６５とを合流させる導入部６３が位置している。

【0021】

溶離液貯留槽８０は複数の領域（又は複数のパック）に区分され、複数種類の溶離液がそれぞれ互いに混じり合わないように貯留されている。ポンプ６２は溶離液貯留槽８０に貯留された複数種類の溶離液を任意の割合で混合して下流に送出することができる。カラム２０の下流の測定流路５０には、測定流路５０中にヘモグロビンの吸収波長を含む光（図中矢印で示す）を照射する光源７１と、測定流路５０と接続する流路が設けられた、光源７１から照射された光が透過する光学セル７３と、光学セル７３内を通過した光を受光する検出器７２とが設けられている。測定流路５０において、光源７１と光学セル７３と検出器７２とによってヘモグロビンが検出される部分が検出部７０である。

【0022】

第１の実施形態の液体クロマトグラフィ装置１０では、コンディショニング液を収容した適宜の容器（たとえば、シリンジ等）がコンディショニング処理の度に、コンディショニング液流路６４に接続されて流路へ注入される。これによって、測定流路４０、５０を有するとともに、測定流路４０、５０に検体を流すことで検体中のヘモグロビンを分析する液体クロマトグラフィ装置１０において、測定流路４０、５０が、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液で、ヘモグロビンの測定前にあらかじめコンディショニング処理される。

【0023】

一方、図２に示す第２の実施形態の液体クロマトグラフィ装置１０は充填剤２１が充填されたカラム２０、カラム２０のそれぞれ上流及び下流に位置する測定流路４０、５０、溶離液供給路６１、ポンプ６２、導入部６３、コンディショニング液流路６４、検体流路６５を有するインジェクタ６０、光源７１、光学セル７３及び検出器７２を有する検出部７０については第１の実施形態の液体クロマトグラフィ装置１０と同様である。しかし、第２の実施形態の液体クロマトグラフィ装置１０は、コンディショニング液流路６４の上流に、アルブミン、カゼイン又はスキムミルクを溶解したコンディショニング液を測定流路に供給する供給装置９０を備える点で、第１の実施形態の液体クロマトグラフィ装置１０と相違する。

【0024】

供給装置９０は、コンディショニング液を貯留するコンディショニング液貯留槽９１と、コンディショニング液をコンディショニング液流路６４に送出するポンプ９２とで構成される。供給装置９０のポンプ９２は、インジェクタ６０のポンプ６２と同様に、図示しない制御装置によって制御される。これによって、測定流路４０、５０のコンディショニング処理を、たとえば、所定の測定回数を消化した後であるとか、所定の時間ごとであるとかの、所定のタイミングで実行させるようにすることができる。

【0025】

本実施例では、インジェクタ６０の導入部６３に検体流路６５を経て導入された検体は、上流側の測定流路４０、カラム２０及び下流側の測定流路５０、光学セル７３の順に流れる。ここで、光学セル７３に備わる流路の内表面にも金属が露出している。そのため、検体が流れる光学セル７３の流路をあらかじめコンディショニング処理することで、検体に含まれるヘモグロビンが検出部７０に到達する過程において、測定流路５０との非特異的な吸着が妨げられることになる。

【0026】

コンディショニング処理の後、溶離液を測定流路４０に送出後、検体流路６５からインジェクタ６０内の導入部６３に検体が導入される。そして各ヘモグロビン分画に適した適宜の組成の溶離液が順次、測定流路４０へ送出される。溶離液とともに測定流路４０に導入された検体はカラム２０へ送出され、検体に含まれるヘモグロビンはここで各ヘモグロビン分画に分離される。分離されたヘモグロビン分画は、カラム２０の下流の測定流路５０に設けられた検出部７０によって吸光度が測定される。そして、検体が測定流路４０に導入された時間からの経過時間に対する吸光度を示したクロマトグラムが得られる。

【0027】

上記のヘモグロビンを分析したときのクロマトグラムの一例を図３に示す。このクロマトグラムでは、溶出時間９．８秒付近でＨｂＡ１ｃピークが現れ、溶出時間１８．８秒付近でＨｂＡ０ピークが現れ、溶出時間２２．２秒付近でＨｂＡ２ピークが現れている。

【0028】

ここで、図４に示す仮想的なヘモグロビン分析クロマトグラムのように、分析対象となる２つのピークを想定する。この図４のクロマトグラムにおける縦軸及び横軸は、図３と同様に吸光度及び溶出時間（秒）である。そして、図中左側のピーク（以下「第１ピーク」とする。）の頂点に対応する溶出時間をｔ_R1とし、図中右側のピーク（以下「第２ピーク」とする。）の頂点に対応する溶出時間をｔ_R2とする。また、第１ピークの高さをｈ₁とし、第２ピークの高さをｈ₂としたとき、第１ピークにおいて高さ０．５ｈ₁におけるピークの幅（以下、「半値幅」（単位は時間（秒））とする。）をＷ_0.5h1、及び第２ピークにおいて高さ０．５ｈ₂における半値幅をＷ_0.5h2とする。このとき、第１ピークと第２ピークとの分離度Ｒは、下記数式にて定義される。

【0029】

【数1】

【0030】

すなわち、上記数式にてｔ_Ｒ２－ｔ_Ｒ１で定義されるピーク間距離（換言すると、ピークが生ずる時間差）が大きいほど、また、各ピークの幅が小さいほど、２つのピークの分離度は高くなる。

【実施例0031】

（１）測定流路洗浄の影響
液体クロマトグラフィ装置によるヘモグロビン分析において、測定流路を洗浄することによるピークの分離度への影響を調べた。具体的には、まず、検出部において、ステンレス製の光学セルの導入口から、カラムからの配管接続部を取り外した。次に、シリンジを用いて、０．５質量％次亜塩素酸ナトリウム溶液２ｍＬを光学セルの導入口から注入して、光学セル内の測定流路を次亜塩素酸ナトリウム溶液で満たし、この状態で５分間静置した。これにより、光学セル内の測定流路に吸着したタンパク質は酸化分解されると推測される。その後、光学セル７３の導入口にカラムからの配管接続部を装着し、溶離液を十分量送出して、光学セル内の次亜塩素酸ナトリウム溶液を排出し、溶離液で置換した。

【0032】

上記の測定流路の洗浄の前後で、検体としてのヒト血液のヘモグロビン分析を実施した。ヘモグロビン分析は以下のとおりに行った。

【0033】

（１－１）溶離液
溶離液として、以下の溶離液Ａ～Ｃを調整した。溶離液Ａとして、リン酸二水素ナトリウム二水和物を１．４４質量％及びリン酸水素二ナトリウムを０．１６質量％の水溶液を調整し、ｐＨ５．０８に調整した。溶離液Ｂとして、リン酸二水素ナトリウム二水和物を０．０２質量％及びリン酸水素二ナトリウムを０．５０質量％の水溶液を調整し、ｐＨ８．０に調整した。溶離液Ｃとして、リン酸二水素ナトリウム二水和物を０．１２質量％及びリン酸水素二ナトリウムを０．３３質量％の水溶液を調整し、ｐＨ６．８２に調整した。

【0034】

（１－２）分析方法
まず、カラムに溶離液Ａを流して平衡化したのち、希釈した所定量の検体をカラムに導入した。そして、溶離液Ａを１３秒間流して、ＨｂＦ及びＨｂＡ１ｃを溶出した。次いで、溶離液Ａと溶離液Ｃとを１：９の割合で混合した液を５秒間流してＨｂＡ０を溶出した。次いで、溶離液Ｃを１７秒間流してＨｂＡ２を溶出した。次いで、溶離液Ｂを２秒間流して分析カラムに残ったヘモグロビンを全て溶出した。最後に、溶離液Ａを５秒間流した。検出部における測定波長は４２０ｎｍとし、得られた吸光度からクロマトグラムを作成した。

【0035】

（１－３）測定結果
測定結果は、図５に示すとおりであった。すなわち、セル洗浄後のクロマトグラムでは、図中の矢印で示すとおり、ＨｂＡ０ピーク及びＨｂＡ２ピークのいずれにおいても、ピークの裾野が広がる、いわゆるテーリングが生じていた。

【0036】

また、クロマトグラムにおけるピーク全体に対する、ＨｂＡ２ピークの割合（以下、「Ａ２割合」と表記する。）は、洗浄前が２．６６％であったのに対し、洗浄後は２．９６％となった。これは、テーリングの影響で洗浄後のＡ２割合が増大したと考えられる。これに伴い、ＨｂＡ０ピークとＨｂＡ２ピークとの分離度（以下、単に「分離度」と表記する。）は、洗浄前が０．７６７であったのに対し、洗浄後は０．７１３と、洗浄による悪化が確認された。

【0037】

（２）洗浄後の測定による影響
次に、測定流路の洗浄後、ヘモグロビン分析を繰り返すことによるピークの分離度への影響を調べた。具体的には、上記（１）と同様に光学セル内の測定流路を洗浄してから溶離液で置換したのち、（１）で用いた検体とは異なる検体を用いて、（１）と同様の測定を繰り返して、Ａ２割合（図６）及び分離度（図８）を観察した。

【0038】

その結果、図６に示すように、Ａ２割合は測定を繰り返していくうちに数値が低下していった。これは、測定を繰り返すうちに、測定流路がヘモグロビン蛋白でコーティングされていくことで、測定時におけるヘモグロビンの非特異的な吸着が抑制された結果と推測される。また、洗浄後１回目の測定と、３０１回目の測定とのヘモグロビン分析クロマトグラムを重複して表示させた図７によって、測定を繰り返すことでテーリングが抑制されたことが示される。これにより、図８に示すように、測定を繰り返すことで、分離度が向上していくことも示された。

【0039】

（３）考察
上記（１）の結果より、テーリングの発生、Ａ２割合の変動及び分離度の悪化の原理は次のとおり考えられる。本開示の液体クロマトグラフィ装置では、カラムにより分離されたヘモグロビンが光学セルを通過する際に吸光度が取得されてこれによりクロマトグラムが描かれる。光学セルはステンレス材質で構成されており、一般にステンレスにはタンパク質が吸着することが知られている。よって光学セルを通過するヘモグロビン分子はその一部がステンレス表面への吸着と脱離を繰り返しながら流路内を進んでいくと考えられる。

【0040】

そして、吸着したヘモグロビン分子は遅く溶出されるため、これがテーリングとしてクロマトグラムに現れると考えられる。ＨｂＡ０ピークのテーリングが顕著なのは、ピークが大きくその分子数が多いため、吸着も発生しやすいためと考えられる。すなわち、ＨｂＡ０ピークにテーリングが生ずる結果、分離度は悪化し、分離度の悪化に伴い、Ａ２割合が実際よりも大きく算出されたと考えられる。

【0041】

一方、上記（２）の結果から、ヘモグロビン測定を繰り返すことで、血液試料中のタンパク質が光学セルのステンレス表面へと吸着していき、ヘモグロビン分子が吸着できる箇所が徐々に少なくなっていくことで、ヘモグロビンの吸着が抑制され、結果テーリングも抑制されると考えられる。すなわち、新品の光学セル又は洗浄直後の光学セルではテーリングが発生し、測定を繰り返して既にタンパク質が吸着した光学セルではテーリングは発生しないと考えられる。

【0042】

新品の光学セル又は洗浄直後の光学セルでは、上記したように、テーリングが発生しやすく分離度が悪化するためＡ２割合を正確に測定することが困難である。よって、上記（２）の結果から示唆されるように、検体の測定前に、光学セルの測定流路を安定化させる必要がある。この安定化のためには、測定対象の検体を用いて測定を繰り返せばよいが、３００回以上の測定を繰り返すことは時間面及びコスト面から現実的ではない。

【0043】

そこで、測定を繰り返すことによる測定流路の安定化に代わり、測定系とは無関係のタンパク質溶液を光学セルの測定流路に流すコンディショニング処理により同様の効果が得られるかどうか、以下で検証した。

【0044】

（４）コンディショニング処理の効果
（４－１）コンディショニング液
下記の表１に示す材料を、最終タンパク質濃度２質量％に精製水で溶解して、コンディショニング液を調整した。ただし、カゼインは水に難溶のため、ＰＢＳ（組成：塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇ／Ｌ、ｐＨ：７．４）にて他と同じ濃度に調整した。「溶液１」の「ＢＳＡ」には「ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ ＡＬＢＵＭＩＮ」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ、Ａ７９０６－５０Ｇ）を使用した。「溶液２」の「ＨＳＡ」には「Ａｌｂｕｍｉｎ， ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ、Ａ１６５３－１０Ｇ）を使用した。「溶液３」の「カゼイン」には「カゼイン，乳由来」（富士フイルム和光純薬、０３０－０１５０５）を使用した。「溶液４」の「スキムミルク」には「スキムミルク粉末」（富士フイルム和光純薬、１９０－１２８６５）を使用した。また、「溶液５」の材料として使用した「精度管理物質」とは、液体クロマトグラフィ装置の測定精度管理に用いられる、既知の濃度のヘモグロビン溶液であり、具体的には「ＡＤＡＭＳ Ａ１ｃ コントロール」（アークレイ、７１２８５）を使用した。さらに、「溶液７」及び「溶液８」の材料として使用した血球及び全血は、一度－８０℃で凍結したのち溶血したものを使用とした。

【0045】

【表1】

【0046】

（４－２）評価方法
上記表１の各コンディショニング液につき、以下のとおり評価を行った。まず、上記（１）と同様に、光学セル内の測定流路を洗浄してから溶離液で置換した。その後、再び、光学セルの導入口から、カラムからの配管接続部を取り外した。次に、シリンジを用いて、上記各コンディショニング液２ｍＬを光学セルの導入口から注入して、光学セル内の測定流路をコンディショニング液で満たし、この状態で５分間静置した。

【0047】

その後、光学セル７３の導入口にカラムからの配管接続部を装着し、溶離液を十分量送出して、光学セル内のコンディショニング液を排出し、溶離液で置換した。この状態で、（１）と同様に血液試料を測定し、Ａ２割合及び分離度を測定した結果をそれぞれ図９及び図１０に示す。なお、洗浄前の光学セルで測定した結果を陽性対照（図中「（＋）」と表示）として、及び、洗浄後コンディショニング処理を行わずに測定した結果を陰性対照（図中「（－）」と表示）として、各図に示す。

【0048】

図９に示すＡ２割合の結果からは、いずれのコンディショニング液でも、セル洗浄前と同様に、テーリングが十分防がれていることが示された。また、図１０に示す分離度の結果についても、いずれのコンディショニング液でも、コンディショニング処理を行わない場合に比べ、分離度が向上していることが示された。特に、ＢＳＡは、セル洗浄前を上回る分離度を示し、特にコンディショニング処理の結果がよいことが示された。

【0049】

なお、精度管理物質、血球及び全血については、テーリングの防止及び分離度の向上の効果は認められたが、タンパク質としてヘモグロビンを含有するため、測定対象をヘモグロビンとする測定系では測定結果に影響を及ぼす懸念があるため、使用は避けた方がよいと思われる。さらに、ＨＳＡ及び血漿は、いずれもヒト血液由来の物質であり、ヘモグロビンを微量に含有している可能性が否定できないため、同じ理由で使用は避けた方がよいと思われる。以上より、コンディショニング液の材料としては、ＢＳＡが最も優れていて、スキムミルク及びカゼインも使用可能であることが分かった。

【0050】

（５）ＢＳＡの使用条件
最後に、上記（４）にてコンディショニング液の材料として最も優れていると思われたＢＳＡについて、使用条件を調べた。

【0051】

（５－１）濃度
ＢＳＡを、下記表２に示す様々な濃度で精製水に溶解してコンディショニング液を調整した。調整したコンディショニング液を、前記（４－２）と同様にコンディショニング処理に供したのち、（１）と同様に血液試料を測定し、Ａ２割合及び分離度を測定した。その結果を下記表２に併せて示す。なお、表中の「（＋）」及び「（－）」については前記（４－２）と同様である。

【0052】

【表2】

【0053】

上記結果からは、ＢＳＡ濃度が高いほど、テーリングが生じにくくなり、分離度が向上することが分かった。

【0054】

（５－２）処理時間
ＢＳＡを、濃度０．０００２％で精製水に溶解してコンディショニング液を調整した。調整したコンディショニング液を、処理時間を下記表３に示すとおりにした他は前記（４－２）と同様にコンディショニング処理に供したのち、（１）と同様に血液試料を測定し、Ａ２割合及び分離度を測定した。その結果を下記表３に併せて示す。なお、表中の「（＋）」及び「（－）」については前記（４－２）と同様である。

【0055】

【表3】

【0056】

上記結果からは、処理時間が長いほど、テーリングが生じにくくなり、分離度が向上することが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0057】

本発明は、液体クロマトグラフィ装置によるヘモグロビン分析に利用可能である。

【符号の説明】

【0058】

１０ 液体クロマトグラフィ装置
２０ カラム
２１ 充填剤
４０ 測定流路
４１ コンディショニング液流路
５０ 測定流路
６０ インジェクタ
６１ 溶離液供給路
６２ ポンプ
６３ 導入部
６４ コンディショニング液流路
６５ 検体流路
７０ 検出部
７１ 光源
７２ 検出器
７３ 光学セル
８０ 溶離液貯留槽
９０ 供給装置
９１ コンディショニング液貯留槽
９２ ポンプ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】