特開 2024-155659 骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024155659

(43)【公開日】2024-10-31

(54)【発明の名称】骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20241024BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742 ZNA

A61P19/08

A61P19/02

A61P37/02

C12N1/20 A

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023113930

(22)【出願日】2023-07-11

(31)【優先権主張番号】112114624

(32)【優先日】2023-04-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 「Ｃｅｌｌｓ ２０２２，Ｊｕｌ １１；１１（１４）：２１６９」に公開された「Ｏｒａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＧＫＢ７ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ」

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519298765

【氏名又は名称】葡萄王生技股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】陳 勁初

(72)【発明者】

【氏名】陳 炎▲錬▼

(72)【発明者】

【氏名】林 詩偉

(72)【発明者】

【氏名】林 子淳

(72)【発明者】

【氏名】蔡 侑珊

(72)【発明者】

【氏名】王 ▲啓▼憲

(72)【発明者】

【氏名】侯 毓欣

(72)【発明者】

【氏名】石 仰慈

(72)【発明者】

【氏名】林 ▲静▼▲ウェン▼

(72)【発明者】

【氏名】陳 雅君

(72)【発明者】

【氏名】江 佳琳

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼ 姿和

(72)【発明者】

【氏名】陳 ▲彦▼博

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA23X

4B065AC20

4B065BC03

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC68

4C087CA09

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB07

(57)【要約】

【課題】骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物に関する。
【解決手段】クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含むことで、骨関節炎による関節痛を緩和し、硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善し、且つ軟骨組織及び／又は滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現量及び／又はＴＮＦ－αの発現量を低下させる骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＧＫＢ７含有組成物であって、有効量の前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含み、前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日に台湾食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）に寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である、骨関節炎を改善するための組成物。

【請求項2】

前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程を経た後に得られた生菌であり、前記発酵工程は、発酵基質により２５℃～４０℃の嫌気性環境で前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７に対して１６時間～２４時間行われる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程及び不活化工程を経た後に得られた死菌であり、前記発酵工程は、発酵基質により２５℃～４０℃の嫌気性環境で前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７に対して１６時間～２４時間行われる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

被験体がラットである場合、前記有効量は５０ｍｇ／ｋｇ体重／日～２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

被験体がヒトである場合、前記有効量は１ｍｇ／ｋｇ体重／日～２００ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物であって、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含むことで、被験体の硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善する、変形性関節炎を改善するための組成物。

【請求項7】

前記組成物が投与されていない対照被験体に比べ、前記組成物が投与された前記被験体の前記軟骨組織及び／又は前記滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現量及び／又はＴＮＦ－αの発現量が低下する、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物が投与されていない対照被験体に比べ、前記組成物が投与された前記被験体の関節痛は緩和される、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物は、週に３回～７回の頻度で前記被験体に投与される、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物は、前記被験体に２週間～８週間投与される、請求項６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、筋骨格疾患を改善するためのプロバイオティクス含有組成物に関し、特に、骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は、変形性関節炎とも呼ばれ、関節に慢性変形性炎症が発生した疾患である。骨関節炎は、手部、臀部及び膝関節に発生する場合が多い。骨関節炎の患部に硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨下部再構築、軟骨組織及び滑膜組織の炎症等の症状が発生し、患部の痛み、凝り及び／又は腫れが引き起こされる。骨関節炎は、非常に一般的であり、２０２１年に発表された文献に基づく統計によると、世界中の６５歳以上の人の三分の一に影響を与えている。人口が高齢化している国において、骨関節炎は、深刻な問題となっている。

【0003】

現段階では、骨関節炎は、治癒できず、重篤の場合、手術するしかできない。手術前に、骨関節炎による関節痛を緩和し、及び／又は関節の可動性を改善するために、保存療法を採用してよい。非ステロイド性抗炎症薬は、保存療法に一般的に使用される薬物であり、シクロオキシゲナーゼ（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ＣＯＸ）の作用を阻害し、プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２；ＰＧＥ２）の発生を低減し、更に骨関節炎を緩和することができる。しかしながら、非ステロイド性抗炎症薬は、骨関節炎を緩和するしかできず、骨関節炎を治療できないだけでなく、プロテオグリカンの合成を阻害し、骨関節炎の悪化を加速する恐れもある。なお、非ステロイド性抗炎症薬を長期にわたって使用すれば、消化性潰瘍、下肢浮腫、腎臓と心臓機能の損傷等の副作用を招くこともある。

【0004】

腸内微生物叢の生態系は、口腔から肛門までの細菌、真菌、ウィルス、ファージ及び寄生虫を含む。微生物叢は、宿主免疫機能、腸透過性の調節、栄養素の吸収、病原体耐性、神経伝達物質の合成と分泌及び代謝恒常性等を含める多くの重要な作用に関与する。腸内菌共生バランス失調によって、腸粘膜の透過性を増やし、代謝バランスに干渉し、全身性炎症、軟骨内の分解及び腸脳軸の失調を招き、骨関節炎の肝心な要因の１つであると認められている。しかしながら、現段階では、クロストリジウム・ブチリカムが筋骨格疾患を改善できるかについての研究は少ない。

【発明の概要】

【0005】

従って、本発明の一態様は、骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＧＫＢ７含有組成物であって、有効量のクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含む骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物を提供する。

【0006】

本発明の別の態様は、変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有経口組成物であって、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含むことで、被験体の硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善する変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有経口組成物を提供する。

【0007】

本発明の上記態様によれば、骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７であって、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含み、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日に台湾食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）に寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物を提案する。

【0008】

本発明の幾つかの実施例によれば、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程を経た後に得られた生菌であり、発酵工程は、発酵基質により２５℃～４０℃の嫌気性環境でクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７に対して１６時間～２４時間行われる。

【0009】

本発明の幾つかの実施例によれば、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程及び不活化工程を経た後に得られた死菌であり、発酵工程は、発酵基質により２５℃～４０℃の嫌気性環境でクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７に対して１６時間～２４時間行われる。

【0010】

本発明の幾つかの実施例によれば、被験体がラットである場合、有効量は５０ｍｇ／ｋｇ体重／日～２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

【0011】

本発明の幾つかの実施例によれば、被験体がヒトである場合、有効量は１ｍｇ／ｋｇ体重／日～２００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

【0012】

本発明の別の態様によれば、変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有経口組成物であって、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０であるクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含むことで、被験体の硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善する変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有経口組成物を提案する。

【0013】

本発明の幾つかの実施例によれば、組成物が投与されていない対照被験体に比べ、経口組成物が投与された被験体の軟骨組織及び／又は滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現量及び／又はＴＮＦ－αの発現量が低下する。

【0014】

本発明の幾つかの実施例によれば、組成物が投与されていない対照被験体に比べ、経口組成物が投与された被験体の関節痛は緩和される。

【0015】

本発明の幾つかの実施例によれば、組成物は、週に３回～７回の頻度で被験体に投与される。

【0016】

本発明の幾つかの実施例によれば、組成物は、被験体に２週間～８週間投与される。

【発明の効果】

【0017】

本発明の骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有経口組成物を適用すれば、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を含み、被験体の硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善し、軟骨組織及び／又は滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現量及び／又はＴＮＦ－αの発現量を低下させ、且つ関節痛を緩和することができる。
下記の添付図面についての詳しい説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、利点と実施例をより明らかで分かりやすくするためのものである。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の一実施例による異なる群別のラットの手術６週間後の体重負荷の差の変化を示すグラフである。

【図2】本発明の一実施例による異なる群別のラットの手術６週間後の体重負荷の差の変化を示すグラフである。

【図3】図３Ａ～図３Ｇは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の骨密度、骨量、骨体積分率、骨表面積密度、骨梁厚さ、骨梁数及び骨梁間隙を示す箱ひげ図である。

【図4】図４Ａ～図４Ｃは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアを示す。

【図5】図５Ａ～図５Ｂは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の軟骨組織のＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアを示す箱ひげ図である。

【図6】図６Ａ～図６Ｂは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の滑膜組織のＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアを示す箱ひげ図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

引用文献における用語の定義又は使用が本明細書における当該用語の定義と矛盾するか又は反対する場合、本明細書における当該用語の定義が適用されるが、この引用文献における当該用語の定義が適用されない。また、文脈において別途定義されていない限り、単数形の用語は、複数形を含んでもよく、複数形の用語は、単数形を含んでもよい。

【0020】

前述したように、本発明は、筋骨格疾患を改善するためのクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）含有組成物を提供する。本明細書に記載の筋骨格疾患は、運動系（筋肉、骨、関節及び隣接する結合組織を含む）が損傷され、一時的又は生涯の機能制限が引き起こされることを指す。筋骨格疾患は、通常、痛み、行動性及び器用さの制限等を特徴とする。筋骨格疾患は、骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、痛風、強直性脊椎炎等の関節問題、骨粗鬆症、骨減少症、脆弱性骨折、外傷性骨析等の骨格問題、サルコペニア等の筋肉問題、背中及び首の痛み等の脊椎問題、及び体の多くの部位又は系の問題を含む。

【0021】

幾つかの実施例において、筋骨格疾患は骨関節炎である。骨関節炎の臨床症状は、痛み及び凝りを含み、この痛みは、活動後に悪化するが、休息後に緩和され、凝りは、活動後に改善されるが、休息後に再発する。光学イメージングツールにより検出したところ、骨関節炎の患部に、関節腔の狭小化、骨棘の形成、軟骨下骨硬化又は軟骨下骨嚢胞、硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症が現れる場合が多い。

【0022】

幾つかの実施例において、骨関節炎の評価項目は、痛みの度合い、硬骨損傷の度合い、軟骨損傷の度合い、軟骨組織及び滑膜組織の炎症性サイトカインの発現量を含んでよいが、これらに限定されない。幾つかの具体例において、骨関節炎が一般的に非対称であるため、痛みの度合いは、体重負荷の差によって評価されてよい。

【0023】

幾つかの具体例において、硬骨損傷の度合いは、骨密度（Ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ；ＢＭＤ）、骨量（Ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ；ＢＭＣ）、骨体積分率（Ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）、骨表面積密度（Ｂｏｎｅ ａｒｅａ ｆｒａｃｔｉｏｎ）、骨梁厚さ（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、骨梁数（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）及び骨梁間隙（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）で評価されてよい。幾つかの具体例において、軟骨損傷の度合いは、国際変形性関節症学会（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＯＡＲＳＩ）により推奨されたラット関節組織学的スコアリングシステムを利用してスコアリングされてよい。

【0024】

幾つかの具体例において、上記炎症性サイトカインは、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ）－１β及び腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）－αを含んでよいが、これらに限定されない。ＩＬ－１β及びＴＮＦ－αは、タンパク質分解酵素の合成を促進し、関節部の細胞外マトリックスを分解し、骨関節炎をより深刻にすることを補足して説明しておく。

【0025】

実験により、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、骨関節炎を改善できることが実証された。具体的には、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７が投与されていない対照被験体に比べ、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７が投与された被験体の痛みの度合い、硬骨損傷の度合い、軟骨損傷の度合い、軟骨組織及び滑膜組織における炎症性サイトカインの発現量が低下する。上記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日に台湾食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ、住所：新竹市食品路３３１号、郵便番号：３００１９３）に寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である。

【0026】

従って、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、骨関節炎及び変形性関節炎を改善するための組成物の調製に適用可能であり、この組成物は、有効量のクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含んでよいが、これに限定されない。幾つかの実施例において、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程を経た後に得られた生菌である。幾つかの実施例において、発酵工程は、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７が好ましい増殖活性及び／又は骨関節炎改善活性を有するように、２５℃～４０℃、又は３５℃～４０℃、又は３７℃で行われる。幾つかの実施例において、発酵工程は、多くのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の生菌を得るように、１６時間～２４時間、又は１８時間行われる。幾つかの実施例において、発酵工程は、嫌気性環境で行われる。嫌気性環境の空気組成は、特に制限されず、酸素含有量が０％であるか又は０％に近ければよい。一具体例において、嫌気性環境は、７５％～８５％の窒素、５％～１５％の水素及び５％～１５％の二酸化炭素を含んでよいが、これらに限定されない。

【0027】

発酵工程の発酵基質は、特に制限されず、例えば市販の発酵基質であってよい。幾つかの具体例において、発酵基質は、強化クロストリジア培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ；ＲＣＭ）であってよい。幾つかの実施例において、発酵基質は、１ｗｔ％～１０ｗｔ％の糖類、０．１ｗｔ％～５．０ｗｔ％の酵母エキス、０．１ｗｔ％～５．０ｗｔ％のペプトン、０．０１ｗｔ％～２．００ｗｔ％の微量元素、０．０１ｗｔ％～０．１０ｗｔ％のシステイン、０．０５ｗｔ％～１．００ｗｔ％のＴＷＥＥＮ－８０及びバランスが取れた量の水を含んでよいが、これらに限定されない。上記糖類は、単糖及び／又は二糖を含んでよいが、これらに限定されない。幾つかの具体例において、糖類は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてよい。上記微量元素は、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、塩素イオン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてよい。

【0028】

幾つかの実施例において、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、上記発酵工程及び不活化工程を経た後に得られた死菌である。不活化工程の方法は、特に制限されず、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７が増殖活性を失うようにすればよい。幾つかの実施例において、不活化工程は、熱不活化工程、放射線不活化工程及び／又は化学的不活化工程を含んでよいが、これらに限定されない。幾つかの具体例において、不活化工程は、１１０℃～１２０℃の飽和蒸気圧で１０分間～２０分間の熱不活化工程を行うことである。クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の死菌は、増殖活性を失ったが、実験により、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の死菌は、依然として骨関節炎を改善する活性を有することが実証されたことに留意されたい。次に、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の生菌に比べ、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の死菌の保存及び／又は剤形は、より制限されず、多くの製品の種類に適用可能である。

【0029】

幾つかの実施例において、発酵工程を経た後、又は発酵工程及び不活化工程を経た後、発酵基質を除去するために、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７に固液分離工程を選択的に行ってよい。固液分離工程は、特に制限されないが、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の生菌又は死菌を保留しながら、発酵基質を除去できる必要がある。幾つかの具体例において、固液分離工程は、濾過工程及び／又は遠心分離工程を含んでよいが、これらに限定されない。熱不活化工程と固液分離工程の順序は、特に制限されないことを補足して説明しておく。幾つかの実施例において、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、発酵工程後に、固液分離工程を経てから、不活化工程を経てよい。

【0030】

幾つかの実施例において、上記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の生菌及び／又は死菌は、更に乾燥工程を経ることで、凍結乾燥粉末を得てよく、その保存時間が延長される。幾つかの実施例において、凍結乾燥粉末は、５．５×１０７ＣＦＵ／ｇのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を含む。生菌、死菌、生菌の凍結乾燥粉末及び死菌の凍結乾燥粉末の活性物質は、細胞壁、細胞膜に分泌された細胞外マトリックス、細胞質及び／又は細胞が発酵工程を経た後に生じた代謝物（例えば、脂質、糖類、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質及び／又は他の生体分子）を含んでよいが、これらに限定されず、その中の単一の物質を利用し、及び／又は未知の分離不能な成分を排除することによっても、骨関節炎及び変形性関節炎を改善する効果を達成できると合理的に予期できないことに留意されたい。従って、本発明に記載のクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の死菌は、成分、特性又はパラメータによって定義することができず、即ち、本発明は、成分、特性又はパラメータによる定義が可能ではないか又は実際的ではない場合がある。

【0031】

被験体は、特に限定されないが、例えばラット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ又はヒト等の哺乳類動物であってよい。幾つかの実施例において、被験体がラットである場合、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の有効量は、比較的少ない投与量で好ましい効果を達成するように、例えば５０ｍｇ／ｋｇ体重／日～２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日であってよく、例えば５０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ又は８０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施例において、被験体がヒトである場合、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の有効量は、例えば、１ｍｇ／ｋｇ体重／日～２００ｍｇ／ｋｇ体重／日であってよく、例えば１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は１ｍｇ／ｋｇ体重／日～５０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。動物実験により、１００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を投与すれば、確かに骨関節炎を改善することができるが、この動物実験では、前十字靭帯切断術によって骨関節炎を誘発したため、骨関節炎の経過が非常に速いことに留意されたい。臨床に適用される際に、比較的少ない投与量で同じ効果を達成できるはずである。幾つかの実施例において、被験体がヒトである場合、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の有効量は、１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。上記実施例において、被験体は、骨関節炎を予防しようとしているか、又は早期の骨関節炎（少なくとも１つで４つ未満の関節が炎症を起こし、且つ発病から２年以内）に罹患している。

【0032】

クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、被験体に一定の時間にわたって連続して投与する必要がある。幾つかの実施例において、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、例えば、週に５回等、週に３回～７回の頻度で被験体に投与されてよい。幾つかの実施例において、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、被験体に２週間～８週間投与され、又はそれよりも長くても短くてもよい。

【0033】

適用時に、上記組成物は、例えば経口組成物であってよい。幾つかの実施例において、上記組成物は、例えば医薬組成物又は食品組成物であってよい。一実施例において、経口組成物は、食品的又は医学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、補助剤、防腐剤、充填剤及び／又は添加剤を選択的に含んでよい。

【0034】

以下、複数の実施例を利用して本発明の適用を説明するが、それらは、本発明を限定するものではなく、当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、各種の変更や修飾を行うことができる。

【実施例0035】

１． 調製例１
１．１ 菌株の由来
健康なヒトの糞便から菌株ＧＫＢ７を分離した。菌株ＧＫＢ７のＤＮＡを精製した後、遺伝子配列決定を行うことにより、配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１に示される菌株ＧＫＢ７の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の核酸断片配列を得た。配列アライメントを経て、菌株ＧＫＢ７がクロストリジウム・ブチリカムであると同定された。上記ＤＮＡの精製、遺伝子配列決定及び配列アライメントは、既知の手法により行われ、且つ後続の菌株ＧＫＢ７による骨関節炎の改善の評価に影響を与えないため、繰り返して説明しない。クロストリジウム・ブチリカム菌株ＧＫＢ７は、グラム染色陽性であり、絶対嫌気性であり、運動でき、芽胞と鞭毛がある。クロストリジウム・ブチリカム菌株ＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日にＢＣＲＣに寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である。

【0036】

１．２ 凍結乾燥粉末の調製
菌株ＧＫＢ７をＲＣＭ寒天に塗布し、３７℃の嫌気性環境（８０％のＮ２、１０％のＨ２及び１０％のＣＯ２）で２４時間培養することにより、単一コロニーが得られた。続いて、単一コロニーを培養液に接種してから、３７℃の嫌気性環境で発酵工程を２４時間行うことにより、液体培養物が得られた。培養液には、５％のグルコース、１．５％の酵母エキス、０．５％のペプトン、０．１％のＭｇＳＯ４、０．２％のＫ２ＨＰＯ４、０．１％の酢酸ナトリウム、０．２％のＮａＣｌ及びバランスが取れた量の水が含まれる。培地の種類は、菌株ＧＫＢ７の骨関節炎に対する改善効果に影響を与えず、上記に列挙された培養液は、本発明を制限することを意図するものではないことを補足して説明しておく。

【0037】

続いて、液体培養物に１０００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍの遠心分離工程を行うことにより、菌株ＧＫＢ７の生菌の菌体が得られた。遠心分離工程の前に、液体培養物と１５ｗｔ％の脱脂粉乳を混合することで、菌体が団子状に凝集することに役立ち、菌体回収率を増やすことができる。その後、菌体と６ｗｔ％～５０ｗｔ％の脱脂粉乳を混合してから、凍結乾燥工程を行うことにより、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末が得られた。凍結乾燥は、単に投与、定量及び保存を容易にするためであり、本発明を制限することを意図するものではないことを補足して説明しておく。

【0038】

２． 調製例２
液体培養物に対して１１０℃の飽和蒸気圧で熱不活化工程を行うことにより、熱不活化された液体培養物が得られた。その後、熱不活化された液体培養物に対して遠心分離工程を行うことにより、菌株ＧＫＢ７の死菌の菌体が得られた。続いて、菌株ＧＫＢ７の死菌の菌体に対して冷凍乾燥工程を行うことにより、菌株ＧＫＢ７の死菌凍結乾燥粉末が得られた。

【0039】

３． 評価方法及び結果
３．１ 動物モデル
８週齢の雄性スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ；ＳＤ）ラットをステンレス製のラットケージに飼育し、飼育環境の温度は２２±２℃であり、湿度は６０％～８０％であり、且つ明期と暗期はそれぞれ１２時間とされた。試験中に、ラットは、飼料（標準飼料、ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）と蒸留水を自由に摂取できるようにした。上記ラットの体重は、３００ｇ～３５０ｇであり、且つ骨格の発育が成熟していた。

【0040】

ラットを偽手術対照群（ｎ＝６）、手術対照群（ｎ＝６）及び実験群１（ｎ＝８）に分けた。偽手術対照群、手術対照群、実験群１のラットの右後肢に、対応する手術を実施し、手術対照群、実験群１のラットの右後肢は、関節切開術及び前十字靭帯線維切断を含む前十字靭帯切断（Ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ；ＡＣＬＴと略称される）を受け、ラットの右後肢にＡＣＬＴによって骨関節炎を誘発し、偽手術対照群のラットの右後肢は、関節切開術を受けたが、その前十字靭帯線維が切断されなかった。

【0041】

手術の２日後、各群の飼料に１ｍＬの蒸留水を加えた。実験群１のラットが１００ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日（５×１０１１ＣＦＵ／ｇに相当し、ヒトの投与量に換算すれば１６．１ｍｇ／ｋｇ体重／日となる）の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末を得るように、実験群１の蒸留水に菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末を週に５日加えた（調製例１）。

【0042】

その後、それぞれ異なる投与量の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末及び死菌凍結乾燥粉末で試験した。８週齢のラットを６群に分け、それぞれ偽手術対照群２、手術対照群２、実験群２、実験群３、実験群４及び陽性対照群とした。１群あたりの試験動物が８匹であった。手術対照群２、実験群２、実験群３、実験群４及び陽性対照群のラットの右後肢は、前十字靭帯切断手術を受けた。

【0043】

ラットが１日～２日の回復期を経た後、各群の飼料に１ｍＬの蒸留水を週に５日加えると共に、異なる群別の蒸留水に対応する投与量のＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末とＧＫＢ７の死菌凍結乾燥粉末を加えることにより、実験群２のラットが高投与量（１ｇ／ｋｇ ｂｗ／日、ヒトの投与量に換算すれば１６１．３ｍｇ／ｋｇ体重／日）の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末（調製例１）を得ることができ、実験群３のラットが低投与量（１００ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日、実験群１の投与量と同じ）の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末（調製例１）を得ることができ、実験群４のラットが１ｇ／ｋｇ ｂｗ／日の菌株ＧＫＢ７の死菌凍結乾燥粉末（調製例２）を得ることができるようにした。陽性対照群の蒸留水に５０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）を加え、セレコキシブは、市販の鎮痛薬であり、シクロオキシゲナーゼ（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ＣＯＸ）の活性を抑制する役割を果たすため、プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２；ＰＧＥ２）の合成を抑制することにより、炎症性疼痛を軽減することができる。

【0044】

３．２ 静的体重負荷試験（Ｓｔａｔｉｃ ｗｅｉｇｈｔ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｅｓｔ、又はＩｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｔｅｓｔと称される）
手術前に、偽手術対照群、手術対照群、実験群１のラットの左右後肢を別々のセンサプレートに１０秒置き、ラットが後肢で立つ時、左右後肢間の体重負荷の差（単位：坪量、ラットの体重で標準化された）を測定した。手術後、上記測定を毎週行った。一般的には、正常なラットは、体重を左右後肢に均等に割り当てるため、左右後肢間の体重負荷の差が大きいほど、ラットの右後肢の痛みの度合いが高くなることを示す。対応のあるｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）によって異なる群別の結果を比較した。

【0045】

図１は、本発明の一実施例による異なる群別のラットの手術６週間後の体重負荷の差の変化を示すグラフであり、横軸は、時間（単位：週間）を示し、縦軸は、体重負荷の差（単位：ｇ）を示し、曲線１１０、曲線１２０及び曲線１３０は、それぞれ偽手術対照群、手術対照群及び実験群１を示し、符号「＊」は、手術対照群と偽手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、符号「＃」は、実験群１と手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。

【0046】

図１に示すように、手術対照群（曲線１２０）の体重負荷の差は、偽手術対照群（曲線１１０）の体重負荷の差よりも有意に高く、且つ体重負荷の差が時間の経過につれて大きくなり、これは、ＡＣＬＴが確かに骨関節炎を誘発し、関節痛を引き起こすことを意味する。逆に、実験群１の体重負荷の差は、ＡＣＬＴ手術２週間後に有意に低下し、且つ時間の経過につれて持続的に低下し、ＡＣＬＴ手術３週間後、手術対照群の体重負荷の差の三分の一に過ぎなかった。この結果により、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末は、１４日間（２週間）連続して投与された後に骨関節炎による関節痛を顕著に緩和することができ、且つ２１日間（３週間）連続して投与された後により理想的な効果を達成できることが示された。

【0047】

偽手術対照群２、手術対照群２、実験群２、実験群３、実験群４及び陽性対照群に対しても静的体重負荷試験を行い、その方法は以上のように説明され、ここで繰り返して説明しない。

【0048】

図２は、本発明の一実施例による異なる群別のラットの手術６週間後の体重負荷の差の変化を示すグラフであり、横軸は、時間（単位：週間）を示し、縦軸は、体重負荷の差（単位：ｇ）を示し、曲線２１０、曲線２２０、曲線２３０、曲線２４０、曲線２５０及び曲線２６０は、それぞれ偽手術対照群２、手術対照群２、実験群２、実験群３、実験群４及び陽性対照群を示し、符号「＊」は、手術対照群２と偽手術対照群２の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、符号「＃」は、実験群２、実験群３、実験群４及び陽性対照群と手術対照群２の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。

【0049】

図２に示すように、手術対照群２（曲線２２０）に比べ、実験群２（曲線２３０）、実験群３（曲線２４０）、実験群４（曲線２５０）及び陽性対照群（曲線２６０）は、体重負荷の差が小さく、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末及びＧＫＢ７の死菌凍結乾燥粉末は、確かに骨関節炎による関節痛を緩和することができることが示され、実験群２を表す曲線２３０と、実験群４を表す曲線２５０とは、ほぼ重なり、同じ投与量の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末及び菌株ＧＫＢ７の死菌凍結乾燥粉末の骨関節炎に対する改善効果が同等であることが示され、骨関節炎及び変形性関節炎に対する改善効果が同じであることが説明された。実験群２のラット及び実験群４の投与量は実験群３と異なるが、いずれも関節痛を緩和する効果を有するため、下記実験は、低投与量の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末の投与による実験群１のラットへの影響であるが、当業者であれば、高い投与量の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末及び死菌凍結乾燥粉末の投与は、いずれも同じ効果を達成できることを理解することができる。

【0050】

３．３ 硬骨画像分析
ＡＣＬＴ手術６週間後、偽手術対照群、手術対照群及び実験群１のラットを犠牲にし、マイクロコンピュータ（又はミクロンオーダーコンピュータ、超小型コンピュータと呼ばれる）断層撮影（Ｍｉｃｒｏ－ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ、μ－ＣＴ）によってラットの右後肢の膝関節の骨パラメータを分析し、前記骨パラメータは、骨密度、骨量、骨体積分率、骨表面積密度、骨梁厚さ、骨梁数及び骨梁間隙を含む。マイクロコンピュータ断層撮影により、手術対照群のラットには確かに骨損失及び骨破壊（図示せず）を含む硬骨損傷があるが、実験群１のラットの硬骨損傷の度合いが手術対照群のラットよりも低い（図示せず）ことが示された。

【0051】

図３Ａ～図３Ｇは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の骨密度（図３Ａ）、骨量（図３Ｂ）、骨体積分率（図３Ｃ）、骨表面積密度（図３Ｄ）、骨梁厚さ（図３Ｅ）、骨梁数（図３Ｆ）及び骨梁間隙（図３Ｇ）を示す箱ひげ図であり、横軸は、群を示し、左から右へそれぞれ偽手術対照群、手術対照群及び実験群１であり、図３Ａ～図３Ｇの縦軸は、それぞれ骨密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、骨量（単位：ｍｇ）、骨体積分率（即ち、骨体積と総体積の比、ＢＶ／ＴＶと略称され、単位：％）、骨表面積密度（即ち、骨表面積と総体積の比、ＢＳ／ＴＶと略称され、単位：１／ｍｍ）、骨梁厚さ（Ｔｂ．Ｔｈと略称され、単位：ｍｍ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎと略称され、単位：１／ｍｍ）及び骨梁間隙（Ｔｂ．Ｓｐと略称され、単位：ｍｍ）を示し、符号「＊」は、手術対照群と偽手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、符号「＃」は、実験群１と手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。

【0052】

図３Ａ～図３Ｇに示すように、偽手術対照群に比べ、手術対照群は、ラットの右後肢の膝関節の骨密度、骨量、骨体積分率、骨表面積密度、骨梁厚さ及び骨梁数が有意に低下するが、骨梁間隙が有意に上昇し、ＡＣＬＴにより骨関節炎を誘発することで、確かに骨損失や骨破壊等の硬骨損傷を引き起こし得ることが示された。逆に、実験群１のラットの右後肢の膝関節の上記骨パラメータが顕著に改善され、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末が確かに骨関節炎による硬骨損傷を改善することができることが示された。

【0053】

３．４ 組織学的分析
硬骨画像を分析した後、ラットの右後肢の膝関節組織を３７℃で４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍ ａｌｄｅｈｙｄｅ）のリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で２４時間固定してから、１０％のエチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）で２週間脱灰させた。濃度が漸進的に増加するエタノールで脱水した後、膝関節組織は、パラフィンブロックに包埋され、更に厚さ５μｍの組織切片に切られた。次に、組織切片をヘマトキシリン－エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ）及びサフラニンＯ／ファストグリーン（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ／Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ）で染色すると共に、光学顕微鏡で膝関節組織の組織病理学的変化を観察した。組織切片から分かるように、手術対照群のラットの膝関節組織には、確かに軟骨組織の病理学的変化及び滑膜組織の過形成等の軟骨損傷（図示せず）が生じたが、実験群１のラットの軟骨損傷の度合いが手術対照群のラットよりも低い（図示せず）。

【0054】

国際変形性関節症学会により推奨されたラット関節組織学的スコアリングシステム（国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアを含む）を利用して膝関節組織の軟骨損傷の度合いを定量化した。国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアは、当業者に熟知のものであり、ここで繰り返して説明しない。

【0055】

図４Ａ～図４Ｃは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアを示し、横軸は、群を示し、左から右へそれぞれ偽手術対照群、手術対照群及び実験群１であり、縦軸は、それぞれ国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコア（単位：点）を示し、符号「＊」は、手術対照群と偽手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、符号「＃」は、実験群１と手術対照群の間に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。

【0056】

図４Ａ～図４Ｃに示すように、偽手術対照群に比べ、手術対照群は、国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアが有意に向上し、ＡＣＬＴにより誘発された骨関節炎の症状は、確かに軟骨損傷を含む。しかしながら、手術対照群に比べ、実験群１の国際変形性関節症学会によるスコア、軟骨変性スコア及び滑膜炎症スコアが有意に低下し、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末が確かに骨関節炎による軟骨損傷を改善することができることが示された。

【0057】

３．５ 免疫組織化学染色分析（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）
内因性カタラーゼ活性を抑制するように、上記組織切片を３％過酸化水素溶液に浸漬してから、非特異的なバックグラウンドの発生を低下させるように、３％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳ溶液に浸漬した。４℃で抗ＩＬ－１β又は抗ＴＮＦ－αの抗体で一次抗体反応（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を行った後、室温で組織切片に二次抗体反応を１時間行い、更にジアミノベンジジン（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）で染色した。光学顕微鏡下で組織切片を観察した。ＩＨＣスコアでＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの免疫反応シグナルを示し、ＩＨＣスコアが高いほど、免疫反応シグナルが強くなり、即ち、ＩＬ－１β又はＴＮＦ－αの発現量が高くなることを示す。

【0058】

図５Ａ～図５Ｂは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の軟骨組織のＩＬ－１βのＩＨＣスコア（図５Ａ）及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコア（図５Ｂ）を示す箱ひげ図であり、横軸は、群を示し、左から右へそれぞれ偽手術対照群、手術対照群及び実験群１であり、縦軸は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコア（単位：点）を示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すように、偽手術対照群に比べ、手術対照群は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアが有意に上昇し、ＡＣＬＴにより誘発された骨関節炎の軟骨組織におけるＩＬ－１β及びＴＮＦ－α等の炎症性サイトカインの発現量が高いことを示した。逆に、手術対照群に比べ、実験群１は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアが有意に低下し、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末が確かに骨関節炎の軟骨組織における炎症性サイトカインの発現量を低下させることができることを示した。

【0059】

図６Ａ～図６Ｂは、それぞれ本発明の一実施例による異なる群別の滑膜組織のＩＬ－１βのＩＨＣスコア（図６Ａ）及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコア（図６Ｂ）を示す箱ひげ図であり、横軸は、群を示し、左から右へそれぞれ偽手術対照群、手術対照群及び実験群１であり、縦軸は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコア（単位：点）を示す。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、偽手術対照群に比べ、手術対照群は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアが有意に上昇し、ＡＣＬＴにより誘発された骨関節炎の滑膜組織における炎症性サイトカインの発現量が確かに高いことを示した。逆に、手術対照群に比べ、実験群１は、ＩＬ－１βのＩＨＣスコア及びＴＮＦ－αのＩＨＣスコアが有意に低下し、菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末が確かに骨関節炎の滑膜組織における炎症性サイトカインの発現量を低下させることができることを示した。

【0060】

以上を纏めると、本発明は、特定の投与量、特定の剤形、特定の検出方法又は特定の評価方法によって単に骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物を例示して説明した。しかし、当業者にとって、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、他の投与量、他の剤形、他の検出方法又は他の評価方法も、骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物に適用されてもよく、上記に限定されない。例えば、組成物は、例えば医薬組成物又は食品組成物であってよく、医学的及び食品的に許容される担体、賦形剤及び／又は添加剤を選択的に含んでよく、粉剤、錠剤、粒剤、座剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は塞栓剤等の剤形とされてよい。他の例において、菌株ＧＫＢ７は、他の適切な培地又は他の培養環境を利用して培養されてもよく、得られた菌体も、上記の骨関節炎に対する改善効果を有するはずである。他の実施例において、低投与量の生菌（実験群１）が達成可能な効果は、骨関節炎による硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症等を改善する効果を含み、高投与量の生菌（実験群２）及び高投与量の死菌（実験群４）によっても達成可能である。

【0061】

上記実施例によれば、本発明の骨関節炎及び変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物は、クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を使用することにより、骨関節炎による関節痛を緩和することができるだけでなく、骨関節炎による硬骨損傷、軟骨損傷、軟骨組織及び／又は滑膜組織の炎症を改善することもでき、将来、有効成分として各種の組成物の調製に使用され、骨関節炎、ひいては他の筋骨格疾患の改善に適用することができるという利点を有する。

【0062】

本発明は、複数の特定の実施例によって以上のように開示されたが、他の実施例も可能である。従って、本発明の添付される特許請求の範囲の精神や範囲は、ここに含まれる実施例に記載のものに限定されない。

【符号の説明】

【0063】

１１０、１２０、１３０、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０ 曲線
［生物材料の寄託］
クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日に台湾食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）に寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である。
[参考配列]

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

2024155659000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-09-03

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

骨関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＧＫＢ７含有組成物であって、５．５×１０ ^７ ＣＦＵ／ｇの生細胞又は死細胞の前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含み、前記死細胞が、生細胞を１１０℃～１２０℃の飽和蒸気圧下で１０分～２０分間加熱不活化工程に供することによって得られ、前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７は、２０２２年０４月０１日に台湾食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）に寄託され、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０であり、前記組成物は、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日～２，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の有効用量で被験体に投与され、前記被験体はラットであり、それによって被験体の軟骨組織および／または滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現レベルを減少させる、骨関節炎を改善するための組成物。

【請求項2】

前記組成物は、週に３回～７回の頻度で前記被験体に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物は、前記被験体に２週間～８週間投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

食品のまたは医学的に、許容される、担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、保存剤、充填剤、および/または添加剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物は医薬組成物または食品組成物である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

変形性関節炎を改善するためのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７含有組成物であって、受託番号がＢＣＲＣ ９１１１２０である、５．５×１０ ^７ ＣＦＵ／ｇの生細胞又は死細胞の前記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を有効成分として含み、前記死細胞が、生細胞を１１０℃～１２０℃の飽和蒸気圧下で１０分～２０分間加熱不活化工程に供することによって得られ、前記組成物は、１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の有効用量で被験体に投与され、前記被験体はヒトであり、それによって被験体の軟骨組織および／または滑膜組織におけるＩＬ－１βの発現レベルを減少させる、変形性関節炎を改善するための組成物。

【請求項7】

前記組成物が投与されていない対照被験体に比べ、前記組成物が投与された前記被験体の前記軟骨組織及び／又は前記滑膜組織におけるＴＮＦ－αの発現量が低下する、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物が投与されていない対照被験体に比べ、前記組成物が投与された前記被験体の関節痛は緩和される、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物は、週に３回～７回の頻度で前記被験体に投与される、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物は、前記被験体に２週間～８週間投与される、請求項６に記載の組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0030】

幾つかの実施例において、上記クロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の生菌及び／又は死菌は、更に乾燥工程を経ることで、凍結乾燥粉末を得てよく、その保存時間が延長される。幾つかの実施例において、凍結乾燥粉末は、５．５×１０ ^７ ＣＦＵ／ｇのクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７を含む。生菌、死菌、生菌の凍結乾燥粉末及び死菌の凍結乾燥粉末の活性物質は、細胞壁、細胞膜に分泌された細胞外マトリックス、細胞質及び／又は細胞が発酵工程を経た後に生じた代謝物（例えば、脂質、糖類、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質及び／又は他の生体分子）を含んでよいが、これらに限定されず、その中の単一の物質を利用し、及び／又は未知の分離不能な成分を排除することによっても、骨関節炎及び変形性関節炎を改善する効果を達成できると合理的に予期できないことに留意されたい。従って、本発明に記載のクロストリジウム・ブチリカムＧＫＢ７の死菌は、成分、特性又はパラメータによって定義することができず、即ち、本発明は、成分、特性又はパラメータによる定義が可能ではないか又は実際的ではない場合がある。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0041】

手術の２日後、各群の飼料に１ｍＬの蒸留水を加えた。実験群１のラットが１００ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日（５．５×１０ ^７ ＣＦＵ／ｇに相当し、ヒトの投与量に換算すれば１６．１ｍｇ／ｋｇ体重／日となる）の菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末を得るように、実験群１の蒸留水に菌株ＧＫＢ７の生菌凍結乾燥粉末を週に５日加えた（調製例１）。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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