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特開2024-155847細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024155847

(43)【公開日】2024-10-31

(54)【発明の名称】細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ

(51)【国際特許分類】

C07K 16/00 20060101AFI20241024BHJP

C40B 40/10 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/88 20060101ALI20241024BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

C40B40/10

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N15/88 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024067298

(22)【出願日】2024-04-18

(31)【優先権主張番号】P 2023068435

(32)【優先日】2023-04-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516255448

【氏名又は名称】株式会社ＥｐｓｉｌｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】望月佑樹

(72)【発明者】

【氏名】村上僚

(72)【発明者】

【氏名】中尾香菜子

(72)【発明者】

【氏名】土屋政幸

(72)【発明者】

【氏名】松永康佑

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA05

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045AA20

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

【課題】細胞内において凝集性の低下したＶＨＨ抗体を提供する。
【解決手段】Ｈ１３、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２のうち、少なくとも１か所にアミノ酸置換が導入されており、正味電荷が、ｐＨ６．６において－２．０以下である、ＶＨＨ抗体を提供する。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む、又は（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８を含む、ＶＨＨ抗体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体であって、Ｈ１３、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２（ここで、アミノ酸の位置はＫａｂａｔナンバリングに基づく）のうち、少なくとも１か所にアミノ酸置換が導入されており、前記ＶＨＨ抗体の正味電荷が、ｐＨ６．６において－２．０以下である、ＶＨＨ抗体。

【請求項2】

細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体であって、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、
（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
ＶＨＨ抗体。

【請求項3】

ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、請求項２に記載のＶＨＨ抗体。

【請求項4】

ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、請求項２に記載のＶＨＨ抗体。

【請求項5】

ＶＨＨ抗体ライブラリーであって、前記ライブラリーに含まれるＶＨＨ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、
（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体のライブラリー。

【請求項6】

ＶＨＨ抗体であって、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷が－２．０以下であり、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体。

【請求項7】

（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
をコードする核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸を含むベクター。

【請求項9】

請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項10】

請求項７に記載の核酸を含むリポソーム。

【請求項11】

細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体の作成方法であって、
ＶＨＨ抗体に負電荷化変異を導入して、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷が－２．０以下であるものを得る工程と、
得られたＶＨＨ抗体をコードする核酸にランダム変異導入を行い、ランダム変異導入された核酸にコードされるＶＨＨ抗体を、抗原との親和性に基いてセレクションを行う工程と
を含む、方法。

【請求項12】

細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体の作製方法であって、
請求項５に記載のライブラリーから、目的とする抗原に親和性が高いものを選択する工程
を含む、ＶＨＨ抗体の作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨを生じるＶＨＨライブラリーに関する。

【背景技術】

【0002】

医薬品の研究は極めて進展の速い領域である。かつては、微生物を培養してその生産物から有効な物質を探す発酵創薬や植物からの有効成分の抽出、精製を主としたものが重要な地位を占めていた。２０世紀末の有機化学の進歩を背景に単離、精製ではなく、有機合成により有効な医薬を合成する低分子医薬が発達し始めた。低分子医薬の開発では、創薬ターゲットを特定して、低分子化合物からなるリード化合物を探索し、最適化を行い、開発候補品を決定したうえで、大量に化学合成を行う。低分子医薬品の開発は現在も行なわれているが、２１世紀に入ってやや行き詰まり、低分子医薬品の新規承認は減少傾向である。

【0003】

２０世紀末から低分子医薬に代わり、バイオテクノロジーを用いて生産された抗体医薬をはじめとしたバイオ医薬品が脚光を浴びている。これらバイオ医薬品には、従来の低分子医薬では効果が低かった疾患に対しても優れた効果を発揮するものが多く、抗体医薬等、近年多くの医薬品が承認されている。

【0004】

しかし、バイオ医薬品は、低分子医薬品の製造に用いられる単純な化学合成工程に比べて，培養細胞等を用いた製造工程や遺伝子操作を伴う。また、バイオ医薬品は分子量１万を超える高分子量のタンパク質を主成分とすることが多く、製造工程でのわずかな変化によって最終産物が変わってしまうことも起こり得るため、高い精度をもって品質管理が必要となる。そのためバイオ医薬品の開発及び製造は、コストが非常に高いという問題がある。また、消化管での分解を受けやすく経口投与ができないこと、分子量が大きいため細胞内への導入が困難であり、標的分子が細胞表面の受容体などに限定される問題もある。

【0005】

すなわち、低分子薬は、高い細胞内浸透性を有し、低分子のものを標的とすることができる一方、大きい分子を標的とすることは困難であり、タンパク質同士の結合を阻害することはできない。低分子薬は、経口投与が可能で、安く製造することができる反面、標的への特異性が低いため副作用も生じ得る。それに対して、抗体医薬は、標的への特異性や結合力が強く、タンパク質同士の結合を効果的に阻害し得る一方、分子量も大きく、細胞内に透過できないうえ、製造コストも高く、経口投与ができないという欠点もある。

【0006】

次世代の医薬品モダリティとして、低分子医薬品と抗体医薬との間に位置づけられる中分子に対する期待感が高まってきている。中分子医薬について明確な定義はないが、一般に、分子量５００以下の低分子薬よりは大きく、分子量１５万程度の抗体医薬よりは小さい、分子量５００～２０００程度のものが中分子医薬に分類される。中分子医薬は、既存のペプチド医薬、オリゴヌクレオチドを医薬として用いる核酸医薬、及び天然物由来の天然物医薬を含み、特にオリゴヌクレオチドを医薬として用いる核酸医薬、ペプチド骨格を持ったペプチド医薬の開発が近年さかんである。

【0007】

なかでも、ペプチド医薬及び核酸医薬は、化学合成で製造可能であり、経口投与が可能なうえ、標的特異性が高く、その分子量の小ささから細胞内の物質を標的とすることが可能である。そのため、低分子と抗体等のバイオ医薬のメリットを併せ持つ次世代の医薬品として期待されている。

【0008】

ペプチド医薬は、遺伝子組換えや化学合成のいずれかで製造される。分子量の比較的小さいペプチド医薬は、化学合成が可能であり、樹脂上でアミノ酸を連結させるペプチド固相合成法（Solid-Phase Peptide Synthesis,ＳＰＰＳ）が現在主流の合成方法である。しかし、ペプチド医薬は依然として生体膜を通過しにくく、細胞内への移行が困難である。また、分子が大きくなると一般に合成ステップが増え、製造コストが増大する問題がある。

【0009】

ペプチド医薬の一つとして、ペプチドが大きな環状骨格を形成した環状ペプチドも開発されている。環状ペプチドは一般に標的タンパク質に対する親和性が高いため高活性のものが作りやすく、また、細胞膜への透過性が高い。さらに、環状ペプチドは、一般に、直鎖状ペプチドよりもプロテアーゼに対し安定になることが知られており、分解されることなく患部に辿り着くことも期待できる。例えば、１１のアミノ酸からなる環状ペプチドであるシクロスポリンは、分子量１２００を超えるにもかかわらず良好な体内動態を示す。

【0010】

環状ペプチドの開発として、進化分子工学を応用し、天然の２０種のアミノ酸に限らず、人工アミノ酸をも含めて連結させる手法が開発されている。この手法によれば、Ｎ－メチルアミノ酸やＤ－アミノ酸などを含むシクロスポリンを合成可能である。さらに、Ｎ－クロロアセチルアミノ酸とシステインは、互いに結合しやすいため、これらのアミノ酸をペプチド鎖に組み込むと、両者が反応して全体が大きな環を形成すたるため、任意のアミノ酸から成る環状アミノ酸が合成可能である（特許文献１）。

【0011】

アルパカやリャマなどのラクダ科動物の血液中には、２つの重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）で構成されるＩｇＧ抗体の他に、重鎖のみで構成される抗体（重鎖抗体；ＨＣＡｂ）が存在する。ＶＨＨと称されるＨＣＡｂの可変領域は、ＶＨＨは、ＣＤＲ（相補性決定領域）と呼ばれる３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）可変領域と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）とからなり、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体ｓｃＦｖと比較しても分子量が小さいため、抗体工学技術を応用した医薬品への応用が期待されている。ＶＨＨは、製造コストが安く、室温での安定な保存や輸送が可能であるうえ、ＶＨＨの結合する抗原結合部位（パラトープ）の構造は、従来の抗体の抗原結合部位よりも多様性に富む。そのため、経口、経肺、経鼻投与など各種の投与ルートが可能なＶＨＨが開発されつつあり、今後の創薬への応用が期待されている。

【0012】

抗体医薬は、細胞内への移行効率が極めて低いため、非常に高濃度の投与が必要となり、また、標的細胞以外の細胞にも導入されるなどの問題があった。そのため、細胞内で抗体タンパク質を生成させる試みも行われたが、細胞質内で生成させると抗体が正しくフォールディングせずに凝集して細胞に障害を与えるため、実用化に難点がある。

【0013】

ペプチドリンカーを介して抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結された一本鎖 (single chain Fv:ｓｃＦｖ）抗体は、特異的な抗原結合活性を維持した低分子化抗体である。しかし、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を細胞内に導入して細胞質で発現させても、強い凝集が生じ、安定にｓｃＦｖ抗体を細胞質で発現させることは非常に困難であった。しかし、樺山らは、ｓｃＦｖ抗体の細胞内凝集を抑えるために、ｐＨ６．６における総電荷と凝集には相関があることを見出し、ｐＨ６．６において強い負電荷をｓｃＦｖ抗体に持たせるようにペプチドタグを融合することが細胞内でも安定なｓｃＦｖ抗体を作製する際に重要であることを確認した。具体的には、ｓｃＦＶ抗体の等電点を酸性域に誘導するペプチドタグの付加により、ｓｃＦｖ全体の等電点を酸性域にして、細胞内における凝集を抑制することによって、ｐＨ６．６で強い負電荷を持つ安定細胞内抗体である「ＳＴＡＮＤ（Stable cytoplasmic antibody）」が開発された（特許文献２及び非特許文献１）。

【0014】

さらに、ほとんどの抗体フラグメントは、正しくフォールディングされないため、イントラボディとして使用できないが、Philibertらは、細胞内で安定発現することが確認されたｓｃＦｖのフレームワーク領域を使用した人工合成ライブラリーを作製し、さらにファージディスプレイ法とＣＡＴ酵素を使用した細胞内安定発現スクリーニング系により厳選したイントラボディライブラリーを作製した（特許文献３及び非特許文献２）。しかし、この方法では、ファージディスプレイとなるためライブラリサイズが大きいとは言えず、また、実用化は進んでいない。

【0015】

Dingusらは、ＰＤＢ（Protein Data Bank、タンパク質構造データバンク）から得られた７５個のＶＨＨ抗体のＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅLａ細胞内での発現を調べたところ、ＶＨＨ抗体の半数以上が細胞内で安定発現せずに、細胞内で凝集、又は分解されることを明らかにした。Dingusらは、安定発現するＶＨＨ抗体群と安定発現しないＶＨＨ抗体群の配列解析の結果から、安定発現させるための変異の導入法を導き出し報告しているが、安定発現しないＶＨＨ抗体もある（特許文献３）。

【0016】

Moutelらは、細胞内ＶＨＨ抗体も取得可能な人工合成ＶＨＨライブラリーの構築を報告している。Moutelらは、７つの抗原に対して細胞内ＶＨＨ抗体のヒット率（評価したクローンの内、細胞内で利用可能なクローンの割合）を報告しているが、０～４０％と必ずしも高くはない。（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【特許文献1】特開２０１４－２１７３５２号公報

【特許文献2】国際公開第２０２３／００８４１５号

【特許文献3】特表２０１０－５２１４４７号公報

【非特許文献】

【0018】

【非特許文献1】Nature Communications volume 11, Article number: 336 (2020)

【非特許文献2】BMC Biotechnology 2007, 7:81

【非特許文献3】eLife 2022;11:e68253

【非特許文献4】eLife 2016;5:e16228

【発明の概要】

【0019】

中分子医薬は、抗体医薬が狙う細胞外標的はもちろん、低分子化合物では分子サイズの関係で困難といわれている細胞内でのタンパク質/タンパク質間相互作用、細胞内でのタンパク質/核酸間相互作用へのアプローチが可能となる。

【0020】

上述した進化工学的手法により、低分子側からの中分子医薬へのアプローチは環状ペプチドの合成が主流である。しかし、高分子側からの中分子医薬へのアプローチは、多様なタンパク質の利用が検討されている状況にある。本発明者は、次世代抗体分子として着目されているＶＨＨ抗体を中分子に応用すべく検討した。ＶＨＨ抗体は熱・構造安定性に優れており、シングルドメイン構造であるので再構成にも優れているが、一般にこれら細胞外のタンパク質分子を細胞内で発現させると凝集する傾向がある。上述のとおり、細胞内でも凝集しないｓｃＦｖやＶＨＨ等のタンパク質分子を作製する技術がいくつか報告されているが、特異性を喪失せず、任意のＶＨＨ抗体に適応でき、実用化に耐える技術は開発されていない。

【0021】

本発明者は、鋭意検討の結果、負電荷に偏らせたフレームワーク領域（負電荷ＦＲ）を有するＶＨＨ抗体であれば、細胞内で発現させても凝集性が低い、負電荷化ＶＨＨ抗体となることを見出した。

【0022】

すなわち、本発明者は、ｓｃＦｖ抗体の等電点を酸性域に誘導するペプチドタグを付加するのではなく、ＦＲに中性アミノ酸から酸性アミノ酸への変異、又は塩基性アミノ酸から中性、酸性アミノ酸への変異を導入することによって、ＦＲを負電荷化することにより細胞内で安定なＶＨＨ抗体とすることができることを見出した。また、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷をー２．０以下とすれば、細胞内で安定なＶＨＨ抗体とすることができることを見出した。

【0023】

本発明は、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体であって、Ｈ１３、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２（ここで、アミノ酸の位置はＫａｂａｔナンバリングに基づく）のうち、少なくとも１か所にアミノ酸置換が導入されており、前記ＶＨＨ抗体の正味電荷が、ｐＨ６．６において－２．０以下である、ＶＨＨ抗体に関する。

【0024】

また、本発明は、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体であって、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、
（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
ＶＨＨ抗体に関する。

【0025】

上記において、ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列を使用することができる。

【0026】

又は、ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列を含む、配列を使用することができる。

【0027】

本発明は、ＶＨＨ抗体であって、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷が－２．０以下であり、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体にも関する。

【0028】

上記ＶＨＨ抗体は、細胞内での凝集性が低下しており、（細胞質内又は核内のような）細胞内で安定であり、ＶＨＨ抗体として十分な機能、すなわち、抗原への親和性、結合性、中和能等を細胞内で発揮する。そのため、本発明のＶＨＨ抗体は、細胞内タンパク質を、細胞質、核又はその分泌経路で標的とすることができ、細胞内タンパク質と結合することにより、当該タンパク質の機能を調節、例えば、阻害、中和、促進等することができる。そのため、細胞内での凝集性が低下した本発明のＶＨＨ抗体は、細胞内タンパク質を標的とする中分子医薬として極めて有望である。

【0029】

本発明の別の態様として、ＶＨＨ抗体ライブラリーであって、前記ライブラリーに含まれるＶＨＨ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、
（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体のライブラリーに関する。

【0030】

さらに、本発明の別の態様として、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列をコードする核酸に関する。

【0031】

また、さらに別の態様として、上記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞に関する。また、上記核酸を含むリポソームにも関する。

【0032】

本発明は、さらに別の態様として、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体の作製方法であって、
ＶＨＨ抗体に負電荷化変異を導入して、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷が－２．０以下であるＶＨＨ抗体を得る工程と、
前記ＶＨＨ抗体をコードする核酸にランダム変異導入を行い、ランダム変異導入された核酸にコードされるＶＨＨ抗体を、抗原との親和性に基づくセレクションを行う工程をと
含む、方法に関する。

【0033】

また、上記ＶＨＨ抗体の作製方法において、得られたＶＨＨ抗体は、細胞内での凝集性が低いＶＨＨ抗体である。

【0034】

本発明のさらに別の態様として、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体の作製方法であって、ＶＨＨ抗体ライブラリーから、目的とする抗原に親和性が高いものを選択する工程を含み、
ここで、前記ＶＨＨライブラリーに含まれるＶＨＨ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含み、
（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
細胞内における凝集性が低下したＶＨＨ抗体のライブラリーである、
ＶＨＨ抗体の作製方法に関する。

【0035】

この方法によれば、ＶＨＨ抗体ライブラリーから、目的とする抗原に親和性が高いものを選択するだけで、目的とする抗原に親和性が高いだけではなく、細胞内における凝集性の低いＶＨＨ抗体を得ることができる。すなわち、最初に、目的とする抗原に親和性の高いＶＨＨ抗体を準備することなく、上述の工程を経るだけで、目的とする抗原に親和性が高いだけではなく、細胞内における凝集性の低いＶＨＨ抗体を効率よく得ることができるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】実施例において用いられたｃＤＮＡディスプレイ分子の模式図である。

【図2】負電荷化した抗ＨＳＡＶＨＨが可溶性画分で確認されることを示す実施例２の結果を示す写真である。

【図3】負電荷化した抗ＫＲＡＳＶＨＨが可溶性画分で確認されることを示す実施例７の結果を示す写真である。

【図4】負電荷化した抗ＫＲＡＳＶＨＨが、細胞内でＫＲＡＳに結合していることを示す、実施例８の結果を示す写真である。

【図5】負電荷化した抗ＫＲＡＳＶＨＨが、細胞内でＫＲＡＳに結合していることを示す、実施例１０の結果を示す写真である。

【図6】ｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１、ｎＶＭ５６９－ｍｔ１について、変異個所を示す図である。

【図7-1】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｌａ変異）をまとめた表である。

【図7-2】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｌａ変異）をまとめた表である。

【図7-3】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｌａ変異）をまとめた表である。

【図8-1】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｓｐ変異、Ｇｌｎ変異）をまとめた表である。

【図8-2】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｓｐ変異、Ｇｌｎ変異）をまとめた表である。

【図8-3】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｓｐ変異、Ｇｌｎ変異）をまとめた表である。

【図8-4】複数のクローンについて、ＡＨｏナンバリング及びアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｓｐ変異、Ｇｌｎ変異）をまとめた表である。

【図9】負電荷化した抗ＫＲＡＳＶＨＨが、細胞内でＫＲＡＳに結合していることを示す、実施例１５の結果を示す写真である。

【図10】負電荷化した抗ＫＲＡＳＶＨＨが、細胞内でＫＲＡＳに結合していることを示す、実施例１６の結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明者は、ＶＨＨ抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）として、陰性の性質を有するＦＲにより構成されるＶＨＨ抗体ライブラリーを構築して、様々な標的分子に結合できる陰性ＶＨＨを取得する方法を確立した。具体的には、ＶＨＨ抗体のＦＲに変異を導入することによりＶＨＨを負電荷化した。さらに、Directed evolution（定向進化）により結合性を担保したクローンを得た。また、そのクローンの負電荷ＦＲを用いたライブラリーを構築し、ＶＨＨ抗体をスクリーニングした。得られた負電荷ＶＨＨ抗体をコードする遺伝子を細胞内に発現させたところ、凝集せず、安定であり、抗原への結合性を保っていることが確認された。得られた負電荷ＶＨＨ抗体ライブラリーを用いることによって、特定の抗原に限らず、他の任意の標的に対しても同様に、細胞内で発現させても凝集せず、結合性の高い、負電荷化ＶＨＨ抗体を得ることができる。

【0038】

また、本発明者は、ＶＨＨ抗体ライブラリーが、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷が－２．０以下であれば、細胞内における凝集性が低下したＶＨＨを生じることを見出した。具体的には、公知の手段を用いて変異導入時のΔΔＧを計算することにより、ｐＨ６．６における正味電荷が－２．０以下であるＶＨＨ抗体を設計すれば、細胞内の凝集性が低下した、安定なＶＨＨ抗体を得ることができる。例えば、Ｈ１３、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２（ここで、アミノ酸の位置はＫａｂａｔナンバリングに基づく）に負電荷化変異を導入することによって、細胞内でも凝集性が低下し、安定かつ抗原特異性を保持したＶＨＨを得ることができる。

【0039】

また、本発明者は、（ａ）ＦＲ２及びＦＲ３のアミノ酸配列として、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に記載のアミノ酸配列、若しくは
（ｉｉ）配列番号２８及び配列番号２９において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、
を含む、又は
（ｂ）ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列として、
（ｉｉｉ）配列番号９７及び配列番号９８、若しくは
（ｉｖ）配列番号９７及び配列番号９８において１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列
を含む、
ＶＨＨ抗体とすれば、細胞内における凝集性が低下し、抗原結合能を保持した安定なＶＨＨ抗体を生じることを見出した。

【0040】

理論にとらわれるわけではないが、一般に、タンパク質の総電荷は細胞質のｐＨが７．４であることを前提に計算されるが、ｐＨ７．４におけるｓｃＦｖ抗体の総電荷と凝集の相関は低いことが指摘されていた。一方、細胞質のｐＨは生体内では変動があり、細胞質内で局所的にｐＨの変動があることも示唆されている。タンパク質は固有の等電点（ｐＩ）を持ち、ｐＨがそのｐＩを下回れば総電荷は陽電荷になり、ｐＨがｐＩを上回れば総電荷は負電荷となる。そのため、細胞質における抗体はより低ｐＨにさらされ、その環境下では、ＶＨＨ抗体の負電荷が減少し凝集していると考えられる。細胞内でも安定なＶＨＨ抗体を作製するためには、ｐＨ６．６においてＶＨＨ抗体が強い負電荷をもつように、具体的には、ｐＨ６．６における正味電荷が－２．０以下になるように変異を導入すれば、細胞内でも凝集が低減され、安定なＶＨＨ抗体となることが見出された。

【0041】

本発明において、細胞内における凝集性が低下したとは、負電荷化していないＶＨＨと比べて、細胞内において凝集、特に不溶性の凝集塊を形成しないことをいい、細胞内における凝集性の低下は、細胞内における安定性をも意味する。細胞内における凝集性の低下は、本技術分野における公知の手段、例えば、可溶性画分におけるＶＨＨの量と不溶性画分におけるＶＨＨの量とを比較して、不溶性画分と比べて可溶性画分にＶＨＨが検出されるか否か等により判断することができる。

【0042】

本明細書では、アミノ酸は１文字表記又は３文字表記により表記する。塩基性アミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）であり、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、及びグルタミン酸（Ｅ）であり、中性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）である。
一般的なＶＨＨの正味電荷は中性付近に分布している。本発明では、負電荷化のために、ＦＲに負電荷性を高める変異、すなわち中性アミノ酸から酸性アミノ酸への変異、又は塩基性アミノ酸から中性、酸性アミノ酸への変異を導入する。また、本明細書では、これらの変異を負電荷化変異とも称する。

【0043】

また、配列番号２８及び２９、並びに９７及び９８から選択されるアミノ酸配列に加えて、配列番号２８及び２９、並びに９７及び９８に１～３個までのアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含む配列、又は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、若しくは９９．５％同一であるものも同様に使用することができる。
さらに、本発明のＶＨＨのアミノ酸配列をコードする核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列、又はこれらに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である配列を含む核酸を使用することができる。

【0044】

ここで、アミノ酸の置換は、中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換する、及び塩基性アミノ酸を中性アミノ酸に置換することをいう。アミノ酸の挿入は、酸性アミノ酸又は中性アミノ酸の挿入をいう。アミノ酸の欠失は、塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸の欠失をいう。

【0045】

ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であり、低ストリンジェント条件から高ストリンジェント条件が含まれる。特に高ストリンジェント条件が好ましい。低ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、塩濃度が高く、低温で洗浄を行う条件であり、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、塩濃度が低く、高温で洗浄を行う条件であり、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄する条件である。

【0046】

負電荷化変異とは、中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸の、酸性アミノ酸への置換、及び塩基性アミノ酸の中性アミノ酸への置換、酸性アミノ酸又は中性アミノ酸の挿入、塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸の欠失のいずれか１以上により、正味電荷を低下させるような変異をいい、望ましくは、ｐＨ６．６におけるＶＨＨ抗体の正味電荷を－２．０以下に低下させる変異をいう。

【0047】

ＶＨＨ抗体（又は単にＶＨＨとも称する）とは、アルパカやリャマなどのラクダ科動物の血液中に含まれる抗体であって、重鎖（Ｈ鎖）のみで構成される抗体（重鎖抗体；ＨＣＡｂ）の利用した低分子量の天然のシングルドメイン抗体である。ＶＨＨは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）とからなる。

【0048】

「正味電荷」は、分子内に存在する全ての電荷の和として定義される。ＶＨＨの正味電荷は、中性アミノ酸から酸性アミノ酸への変異、又は塩基性アミノ酸から中性、酸性アミノ酸への変異を導入することにより、正味電荷の値を小さくすることができる。

【0049】

正味電荷の測定は、プロテインカリキュレーター（https://www.calculator.net/protein-calculator.html）等の公知の方法により行うことができる。ＶＨＨの正味電荷を、ｐＨ６．６で、－２．０以下、望ましくは－２．２以下、さらに望ましくは－２．５以下、－２．８以下、－３．０以下とすれば、細胞内で安定なＶＨＨとすることができる。

【0050】

または、ＦＬＡＧ（登録商標）配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をつけた状態で（Nature Communications volume 11, Article number: 336 (2020)参照）、ー４．０以下、望ましくは、－４．２以下、さらに望ましくは、－４．５以下、－４．８以下、さらに望ましくは、－５．０以下とすれば、細胞内で安定なVHHとすることができる。

【0051】

上記の方法で得られた負電荷化ＶＨＨに、さらにランダム変異を導入し抗原との親和性に基づいて選択することが望ましい。当業者は、抗原との親和性の高いＶＨＨをｃＤＮＡディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、酵母ディスプレイ法等の公知の方法により容易に選択することができる。

【0052】

本発明のある一態様は、ＶＨＨをコードする核酸である。本発明でいう核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。また、本発明の核酸は、天然に存在する核酸、及び人工的な核酸のいずれを含んでもよい。核酸は、ベクターに挿入されている状態でも、リポソームに内包されているものであってもよい。

【0053】

本発明において、ベクターとして、本技術分野で任意の公知のベクターを使用することができる。具体的には、発現ベクターであり、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターのいずれも使用可能である。ベクターの例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスベクター、水泡性口炎ウイルスベクター、プラスミドベクターなどを含むがこれらに限定されない。

【0054】

リポソームとして、中性リポソーム又は双極性リポソームのいずれでも使用可能であり、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）のようなリン脂質、並びにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む他のタイプの双極性脂質を含み、１４～２２の範囲の炭化水素鎖長を有し、飽和又は１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合を有する。以下のリン脂質、すなわち、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）を単独で、又は他の脂質成分と組み合わせて、安定なリポソームを作成することができる。リポソーム中に、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリエタノールアミン－ラウリルサルフェート、アルキルアリルサルフェート、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステレエート、両性アクリルポリマー、ポリエトキシル化脂肪酸アミド、ＤＤＡＢ、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ＤＯＰＧ、及びジセチルホスフェートのような追加のリン無含有脂質を組み込むことも可能である。

【0055】

リポソームとして、ＡＬＣ－０３１５、すなわち、［（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカン酸エステル）、ＡＬＣ－０１５９、すなわち、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールの混合物とすることも可能である。または、リポソームとして、ＳＭ－１０２、すなわち、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタン酸エステル、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ、すなわち、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン、ＤＳＰＣ、すなわち、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、及びコレステロールの混合物とすることも可能である。

【0056】

以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。

【実施例0057】

負電荷フレームワーク（ＦＲ）のデザイン１
細胞内で安定発現するＶＨＨを獲得可能なＶＨＨライブラリー構築のために、負電荷性を高めたＦＲのデザインを実施した。負電荷性を高める変異、すなわち中性アミノ酸から酸性アミノ酸への変異、又は塩基性アミノ酸から中性、酸性アミノ酸への変異を導入する箇所の選定に以下のデータを使用した。

【0058】

＜各ポジションのアミノ酸をアラニンに置換した際のΔΔＧ＞
ＰＤＢ（Protein Data Bank、タンパク質構造データバンク）ＩＤ：１ＦＶＣ、１ＭＥＬ、４ＩＤＬ、４ＴＵＹ、４Ｗ７０、５ＳＶ４の６つのクローンに関して、プロリンを除く各ポジションをアラニンに置換（Ａｌａ置換）した際の自由エネルギー差ΔΔＧを求める自由エネルギー摂動法を網羅的に実施した。具体的には、Visual Molecular Dynamics (https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）のプラグインAlaScan pluginを用いて天然配列から各ポジションをAla置換するハイブリッドトポロジーと、自由エネルギー摂動法計算用の入力ファイルを作成した。その後、NAMD version 3.0 alpha （http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）を用いて自由エネルギー摂動計算を行った。１ステップの時間には、２フェムト秒、温度制御（３００Ｋ）にはLangevin dynamics、圧力制御（１ａｔｍ）にはLangevin pistonを用いた。力場パラメータにはCHARMM 36、水分子はＴＩＰ３Ｐを用いた。系のサイズはタンパク質と溶媒（水とイオン）を含めておよそ３万～４万原子であり、周期境界条件のボックスサイズはおよそ７０Å３である。

【0059】

ΔΔＧの十分な統計を得るために、計算の際には置換前状態（λ＝０）から置換後状態（λ＝１）への方向とその逆（λ＝１から０）の両方向での計算を行った。それぞれの方向で、λ＝０．０５刻みで０から１（または１から０）の摂動計算を合計２４ナノ秒実施した。両方向のデータをまとめてベネット受容比法で統計処理しΔΔＧを得た。６つのクローンについてＡＮＡＲＣＩ（https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/）を用いてＡＨｏナンバリングを求めてアライメントを行い、各ポジションのΔΔＧの平均値、標準偏差を得た。図７参照。

【0060】

＜ＰＤＢに登録されているＶＨＨ抗体のうち、負電荷性が高い配列のＦＲ＞
以下の手順により、ＰＤＢに登録されているＶＨＨ抗体の配列群から負電荷性が高い配列のＦＲ配列を取得した。
ＳＡｂＤａｂ（http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabdab/）より、立体構造に紐づく抗体情報（sabdab_summary_all.tsv）を取得し、ファイル内からＶＨＨ抗体のアミノ酸配列を取得した。具体的には、構造解析手法をX線結晶構造解析で行い、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎが２．８Å以下、Ｈ鎖のみのＣｈａｉｎＩＤがアノテーションされているものを取得し、複合体の場合は結合相手がハプテンではない抗体のＰＤＢＩＤとＣｈａｉｎＩＤを取得した。ＳＥＱＲＥＳレコードから当該ＣｈａｉｎＩＤのアミノ酸配列を取得した。ＡＮＡＲＣＩ（https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/）を実行してＫａｂａｔナンバリングの採番およびＶＨＨ領域を抽出した。クラスタリングによる配列冗長性を除去し、最終的に３３０件のＶＨＨ配列データを取得した。以下のＦＲとＣＤＲの定義に従い、ＦＲを抽出し、アルギニン、リジン１か所につきを＋１、グルタミン酸、アスパラギン酸１か所につき－１として、ＦＲの暫定的な正味電荷を計算した。

【0061】

ＶＨＨの配列のＣＤＲ及びＦＲの位置を、以下のとおりＫａｂａｔナンバリングで特定した。
ＦＲ１Ｈ１～Ｈ２５
ＣＤＲ１Ｈ２６～Ｈ３５
ＦＲ２Ｈ３６～Ｈ４９
ＣＤＲ２Ｈ５０～Ｈ６５
ＦＲ３Ｈ６６～Ｈ９４
ＣＤＲ３Ｈ９５～Ｈ１０２
ＦＲ４Ｈ１０３～Ｈ１１３

【0062】

正味電荷が－２以下のＦＲを抽出し、PharamaLogical（登録商標）ライブラリー（https://www.mdpi.com/2073-4468/11/1/10）のＦＲと相同性が低いクローンを除いた５つのクローン（ＰＤＢＩＤ：５Ｕ６４、６ＦＹＳ、３Ｖ０Ａ、２Ｘ８９、６Ｚ３Ｘ）をアライメントした。

【0063】

また、細胞内の還元環境に対応するために、ＦＲに含まれているシステイン残基をアラニン残基に置換した。上記の点を踏まえ、ヒト化ＶＨＨ人工ライブラリーであるPharmaLogical（登録商標）のサブライブラリーであるRollタイプのＦＲに変異を導入し、以下の負電荷ＦＲのベース配列を設計した。

【0064】

負電荷ＦＲベース配列＿Ｒｏｌｌ
ＦＲ１（配列番号１）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAAAS
ＦＲ２（配列番号２）
WFRQAPGSEREGVA
ＦＲ３（配列番号３）
RFTISQDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYAAA
ＦＲ４（配列番号４）
WGQGTLVTVSS

【実施例0065】

負電荷ＦＲベース配列の最適化
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた定向進化により負電荷ＦＲベース配列を最適化した。
抗ＨＳＡ＿ＶＨＨであるＶＭ１１０４に負電荷ＦＲのベース配列＿Ｒｏｌｌを導入したＶＭ１４８９の遺伝子の５’側及び３’側に以下の配列を付加したｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクト（ＰＦ＿ＶＭ１４８９）の遺伝子合成をユーロフィンジェノミクス株式会社に外注した。

【0066】

５’側（配列番号５）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
３’側（配列番号６）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA

【0067】

以下、ｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクトとした場合は、上記の配列を付加したＤＮＡ配列を指す。ＶＭ１１０４、及びＶＭ１１０４を負電荷化したＶＭ１４８９のアミノ酸配列を表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

ｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクトであるＰＦ＿ＶＭ１４８９から、ＰＦ＿ＶＭ１４８９の２本鎖ＤＮＡを調製した。
ＰＦ＿ＶＭ１４８９プラスミド、Ｎｅｗｌｅｆｔ及びＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖＫ）のプライマーセット、並びにＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ株式会社製）からなる反応液を調製し、変性温度を９５℃、アニーリング温度を６５℃、伸長反応時間を１０秒からなる熱サイクルを２５サイクル回すＰＣＲを行った。プライマー配列は下記に示す通りである。ＰＣＲ反応液はＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、２０μＬのNuclease-free waterで溶出し、ＤＳ－１１＋ＮａｎｏＰａｄにより濃度定量した。

【0070】

Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
NewYtag (cnvK) （配列番号１０）
TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT

【0071】

＜ＶＭ１４８９変異体ライブラリーＤＮＡの作製＞
ＰＦ＿ＶＭ１４８９の２本鎖ＤＮＡに、エラープローンＰＣＲを行ってランダム変異導入ＤＮＡを生成した。
上記の通り調製したＰＦ＿ＶＭ１４８９の２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＦ－Ｅｒ－Ｐｒ＿ＦＷ及びＰＦ－Ｅｒ－Ｐｒ＿ＲＶのプライマーセットを使用して、エラープローンＰＣＲを実施した。エラープローンＰＣＲにはＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用した。プライマー配列は下記に示すとおりである。キットの説明書に従い、１ｎｇテンプレートＤＮＡ／５０μＬ反応液を調製し、説明書に記載のＰＣＲプログラムを実施した。ＰＣＲ反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、２０μＬのNuclease-free waterで溶出し、ＤＳ－１１＋ＮａｎｏＰａｄにより濃度定量した。

【0072】

PF-Er-Pr_FW（配列番号１１）
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
PF-Er-Pr_RV（配列番号１２）
GATGATGATGGGATCCTCC

【0073】

上記のランダム変異導入ＤＮＡに対して、ＰＬ＿Ｔ７＿ＡＴＧ及びＰＬ＿Ｈｉｓ－Ｃ（ＹｔａｇｃｎｖＫ）のプライマーセットを用いてＰＣＲを実施し、ｃＤＮＡディスプレイ用のコンストラクトに戻した。２ｐｍｏｌのランダム変異導入ＤＮＡ、上記のプライマーセット、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる１００μＬのＰＣＲ反応液を調製し５０ μＬｘ２本に分注後、変性温度を９５℃、アニーリング温度を６０℃、伸長反応時間を１０秒からなる熱サイクルを６サイクル回すＰＣＲを行った。プライマーの配列は下記に示すとおりである。ＰＣＲ反応液はＦａｓｔＧｅｎｅＧｅｌ／ＰＣＲＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（日本ジェネティクス社）にて精製３０μＬＧＰ３で溶出し、ＤＳ－１１＋ＮａｎｏＰａｄにより濃度定量した。得られたライブラリーをＶＭ１４８９変異体ライブラリーＤＮＡとした。

【0074】

PL_T7_ATG（配列番号１３）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
PL_His-C（Ytag cnvK）（配列番号１４）
TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGATGATGGGATCCTCCCCC

【実施例0075】

ＨＳＡに結合するＶＭ１４８９変異体のセレクション
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてＶＭ１４８９変異体ライブラリーＤＮＡからＨＳＡに結合する変異体を選択した。

【0076】

＜ｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーの調製＞
ｃＤＮＡディスプレイの調製は以下を１単位として実施した。
ライブラリーＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、図１に示したヌクレオチドリンカーと混合してこれらを光架橋させた。具体的には、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（Promega社）を使用し、添付されたマニュアルに従ってｍＲＮＡを転写した。得られた転写産物をRNAClean XP（Beckman Coulter社）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。得られた精製産物の濃度は、NanoPad DS－11 FX（DeNovix社）により定量した。

【0077】

上記のようにして得られたmRNA を終濃度1μM、その他、１μMリンカー、50ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌを含む溶液を１５μＬ調製し、約９０℃に加熱し、その後、２５℃まで徐々に降温させ、上記リンカーをｍＲＮＡの３’末端側にハイブリダイズさせた。その後、約３６５ｎＭのＵＶを４０６ｍＪ／ｃｍ^２の条件で照射しｍＲＮＡ－リンカー連結体を調製した。

【0078】

上記ｍＲＮＡ－リンカー連結体１２ｐｍｏｌ分を含むPUREfrex（登録商標）1.0（ジーンフロンティア株式会社）の反応液５０μＬを調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭｇＣｌ_２及びＫＣｌを、それぞれ終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加えて、３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡ－リンカー連結体上のピューロマイシンにｍＲＮＡに対応するＶＨＨをディスプレイした。次いで、終濃度が１００ｍＭとなるようにＥＤＴＡ溶液（ｐＨ約８．０）を加えて、室温で１０分間インキュベートし、ｍＲＮＡディスプレイ分子からリボソームを解離させた。

【0079】

Dynabeads MyOne Streptavidin C1（Thermo Fisher Scientific社）６０μLスラリー分を１ｘ結合バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ここに上記の翻訳反応液と２ｘ結合バッファーを１：１で混合した溶液を加え、常温で３０分間撹拌した。磁性体ビーズを１ｘ結合バッファーで３回洗浄後、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭｄＮＴＰｓ、４ｕｎｉｔｓ／μＬ GeneAce Reverse Transcriptase（株式会社ニッポンジーン）で構成された逆転写反応液５０μＬに再懸濁し、攪拌しながら４２℃で３０分間インキュベートした。１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファー（２０ｍＭ Sodium phosphate、ｐＨ７．４、０．５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、２０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅＴ１（Thermo Fisher Scientific社）を含む１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファー４０μＬに再懸濁し、攪拌しつつ３７℃で１５分間インキュベートした。磁気分離後の上清を回収し、１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファーで洗浄済みのHis Mag Sepharose Ni（Cytiva社）２０μＬスラリー分と混合し、攪拌しつつ常温で３０分間インキュベートした。１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファーで２回洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ Sodium phosphate、ｐＨ７．４、０．５ＭＮａＣｌ、２５０ｍＭ Imidazole、０．０５％ Tween20）２５μＬに再懸濁し、攪拌しつつ常温で１０分間インキュベートした。磁気分離後に上清を回収し、ｃＤＮＡディスプレイ分子を含むサンプル溶液とした。

【0080】

＜ＨＳＡに結合するｃＤＮＡディスプレイ分子の分離＞
セレクションの１ｓｔラウンド（Ｒ１）は、上記のｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリー調製の工程を２単位実施し、ＶＭ１４８９変異体ｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーを５０μＬ調製した。Slide-A-Lyzer（商標）MINI Dialysis Devices, 3.5K MWCO（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてバッファー交換を行った。DeviceにｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーを投入し、５０ｍＬＰＢＳに浮かべ、スターラーで攪拌しつつ４℃で３０分間インキュベートした。サンプルをDeviceから回収後、１／９倍量の４％ BlockAce（株式会社ケー・エー・シー）を添加した。

【0081】

Dynabeads MyOne Streptavidin C1 1０μＬを４０μＬのＰＢＳＴで１回洗浄し、終濃度０．２μＭのＨＳＡ（Ａｖｉ－ｔａｇ）（アクロバイオ株式会社）を含む４０μＬのＰＢＳＴに再懸濁した。ローテーターで攪拌しつつ常温で２０分間インキュベートした後に４０μＬのＰＢＳＴで２回洗浄し、４０μＬの上記ｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーに再懸濁した。１０分間に１回程度の割合でタッピングにより攪拌しつつ３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬのＰＢＳＴで４回洗浄後、２０μＬのＰＢＳＴ（＋０．１％ＳＤＳ）に再懸濁し、８５℃で３分間インキュベートした。２０μＬのＰＢＳＴを添加してから磁気分離して上清を回収した。ＡＭｐｕｒｅＸＰを用いて上清中に含まれるｃＤＮＡディスプレイ分子を精製し３０μＬのNuclease-free waterに溶出した。

【0082】

溶出サンプル全量、PL_T7pro及びNewYtag（cnvK）のプライマーセット、並びにPrimeSTAR Maxからなる反応液を調製し、変性温度を９５℃、アニーリング温度を６５℃、伸長反応時間を１０秒からなる熱サイクルを２６サイクル回すＰＣＲを行った。ＰＬ＿Ｔ７ｐｒｏとＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖＫ）の配列は下記に示すとおりである。ＡＭｐｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、得られた精製物をＲ１ライブラリーＤＮＡとしてセレクションＲ２に使用した。

【0083】

PL_T7pro（配列番号１５）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC
NewYtag (cnvK)（配列番号１０）
TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT

【0084】

セレクションＲ２、Ｒ３では、一つ前のセレクションラウンドで得られたライブラリーＤＮＡからｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリー調製の工程を１単位実施し、２５μＬのｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーを調製した。ＨＳＡ固定化ビーズの調製をＲ１の５／８倍スケールで実施し、全量のｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーに再懸濁した。その後は、Ｒ１と同様の手順で、結合反応、洗浄、溶出、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲのサイクル数はＲ２では２３サイクル、Ｒ３で１７サイクルとした。

【0085】

＜各セレクションラウンドから得られたライブラリーＤＮＡの解析＞
次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて各セレクションラウンドから得られたライブラリーＤＮＡの解析を行った。ＮＧＳ解析にはＭｉＳｅｑＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｖ３（６００－ｃｙｃｌｅ）（イルミナ株式会社）を用いた。ＮＧＳ解析用のサンプルを、ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔ（イルミナ株式会社）のマニュアルに従い調製した。まず、Ｒ１～Ｒ３の各ライブラリーＤＮＡをテンプレートに２段階のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ株式会社）を用いた。１段階目のＰＣＲはＰＬｍｔ＿ｐｒＲｄ－Ｎ４＿ＶＨＨ＿ＦＷ及びＰＬｍｔ＿ｐｒＲｄ－Ｎ４＿ＶＨＨ＿ＲＶのプライマーセットで実施した。ＰＬｍｔ＿ｐｒＲｄ－Ｎ４＿ＶＨＨ＿ＦＷ及びＰＬｍｔ＿ｐｒＲｄ－Ｎ４＿ＶＨＨ＿ＲＶの配列は下記に示すとおりである。得られたＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、精製産物をテンプレートとして２段階目のＰＣＲを行った。２段階目のＰＣＲには、キットで指定されたインデックス付加用プライマーを使用した。上記と同様にＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ濃度をＮａｎｏＰａｄＤＳ－１１（ＤｅＮｏｖｉｘ社）を用いて測定した。さらにマニュアルに従いＤＮＡを１本鎖化して、希釈等の処理を行った上でカートリッジに投入後、ＭｉＳｅｑＳｙｓｔｅｍ（イルミナ社）に試薬カートリッジをセットしランした。

【0086】

PLmt_prRd-N4_VHH_FW（配列番号１６）
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
PLmt_prRd-N4_VHH_RV（配列番号１７）
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNATGATGATGATGGGATCCTCC
（Nは任意の塩基、以下本明細書において同じ）

【0087】

出力データに対して、Stitch Read機能によりForward sequenceとReverse sequenceのmergeを実施しＶＨＨの全長配列が含まれるリード群とした。同一の配列であるリード数をカウントし、各ユニーク配列のリード数を総リード数で割った割合を占有率とし、ユニーク配列と占有率を求めた。Ｒ１～Ｒ３ライブラリーＤＮＡに対して、本作業を実施し、Ｒ３ライブラリーＤＮＡ中に含まれていたユニーク配列に関して、Ｒ１～Ｒ３ライブラリーＤＮＡでの占有率を表２にまとめた。Ｒ２からＲ３にかけて占有率の増加度が高いユニーク配列に注目したところ、変異の蓄積と占有率の増加に相関がみられた一群がみられた。ＨＳＡへの結合に有利に働いていると考えられる変異を合わせた配列をＶＭ１４９８として、その他の変異体と合わせてその機能を調べた。

【0088】

【表2】

【0089】

ＶＭ１１０４と比較して電荷にかかわる変異がＦＲ２およびＦＲ３に確認されるため、ＶＨＨの負電荷化にはＦＲ２及びＦＲ３が寄与していると考えられる。ＶＭ１４９８のＦＲ１におけるＣからＡへの変異は、ジスルフィド結合を生じないようシステインを除くために導入し、ＡからＶへの変異は、凝集性の低下というよりむしろＶＨＨの構造安定性に寄与していると考えられる。
ＶＭ１４８９のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の配列は下記のとおりである。ＦＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングによる。

【0090】

VM1498
FR1（配列番号２７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAVAS

FR2（配列番号２８）
WFRQAPGREREGVA

FR3（配列番号２９）
RFTISLDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYAVA

FR4（配列番号３０）
WGQGTLVTVSS

【0091】

＜ＶＨＨの調製＞
ＶＭ１１０４、ＶＭ１４９１～ＶＭ１４９８をコードしたＤＮＡをユーロフィンジェノミクス株式会社にて遺伝子合成し、各々C. glutamicum発現用ベクターにＳｌｉＣＥ法を用いてインサートした。作製したプラスミドをC. glutamicumへ導入し、形質転換体とした。得られた形質転換体をＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃にて終夜培養を行った。その後、前記培養液をＶＨＨ発現用培地ＰＭ１Ｓ培地に継代し、２５℃にて７２時間培養を行って、培養上清中にＶＨＨ（単量体）の分泌発現を行った。培養上清の回収は３０００ｘｇで遠心操作し、さらに０．２２μｍのフィルター処理により上清から菌体を除去した。

【0092】

＜ＶＨＨの解離定数（ＫＤ）測定＞
上記生産したＶＨＨの内発現量が十分であったＶＭ１１０４、ＶＭ１４９３、ＶＭ１４９４、ＶＭ１４９５、ＶＭ１４９６、ＶＭ１４９７、ＶＭ１４９８について、Octet RED384 (Fortebio社)を用いてＫＤを測定した。リガンドとしてＶＨＨクローン群をＨｉｓ１Ｋセンサーチップに固相化し、アナライトとしてＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）の希釈系列：１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６ｎＭをあてて結合を測定した。結果を表３に示す。

【0093】

【表3】

ＶＭ１４８９の細胞内発現評価
ＶＭ１１０４を負電荷化したＶＭ１４９８についてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ凝集の有無を評価した。凝集の有無はＲＩＰＡバッファーによる細胞溶解後に遠心分離を行い、上清と沈殿中に含まれるＶＨＨ量をウェスタンブロッティングにより確認することで評価した。

可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）と凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）、ＶＭ１１０４、ＶＭ１４９８に関して、各ＶＨＨ遺伝子の５’末側にｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Thermo Fisher Scientific社)へのインサートに必要な配列、及び３’末側に、ＦＬＡＧ（登録商標）配列を含むGSDYKDDDDK（配列番号３１）をコードした配列とｐｃＤＮＡ３．１（＋）へのインサートに必要な配列を付加したＤＮＡフラグメント合成をユーロフィンジェノミスク株式会社に外注した。可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）と凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）については、Protein Eng Des Sel. 2010 Jun; 23(6): 489-498を参照。
５’末端側及び３’末端側に付加した塩基配列、並びに可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）及び凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）のアミノ酸配列は以下の通りである。

5'末側に付加した配列（配列番号３２）
GCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACCATG
3'末側に付加した配列（配列番号３３）
GGGAGTGACTACAAGGACGATGACGACAAGTGACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAAC

H7のアミノ酸配列（配列番号３４）
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAAIGSVFTMYTTAWYRQTPGNLRELVASITDEHRTNYAASAEGRFTISRDNAKHTVDLQMTNLKPEDTAVYYCKLEHDLGYYDYWGQGTQVTVSS
D4のアミノ酸配列（配列番号３５）
QAQVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCISSSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADDLRCGSNWSSYFRGSWGQGTQVTVSS

ＤＮＡフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Thermo Fisher Scientific社）と制限酵素ＸｈｏＩ（Thermo Fisher Scientific社）で処理済みのｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Thermo Fisher Scientific社）にＳＬｉＣＥ法を用いて挿入し発現プラスミドを構築した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの前日に４０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ウェルプレートに播種し、構築したプラスミドによりＰＥＩを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、２４時間で２％ＦＢＳ含有培地に交換し、さらに２４時間後、細胞の回収を行った。培養上清を除去しウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパーを用いて細胞をはがし１．５ｍＬチューブに回収した。３００ｘｇ、４℃、５分間の条件で遠心し、上清を除去後、９０μＬのＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク株式会社）に懸濁した。氷上で３０分間静置した後に、１６０００ｘｇ、４℃、１０分間の条件で遠心し、上清を回収した。上清には６ｘＳＤＳサンプルバッファー（１０％ＢＭＥ含有）を添加し、沈殿は１ｘＳＤＳサンプルバッファー（１．７％ＢＭＥ含有）に再懸濁し、９５℃で６分間インキュベートしたものを各可溶性画分と不溶性画分としウェスタンブロッティング用のサンプルとした。

各クローンの可溶性画分と不溶性画分を４％スタッキングー１５％セパレーティングＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、トランスブロット（登録商標） Turbo（商標）ミニＰＶＤＦ転写パック（Bio-Rad社）に転写した。メンブレンを３％ＢＳＡ溶液（TBST（50mM Tris-HCl、pH7.6、150mM NaCl、0.1% Tween20）に溶解）に浸し、室温で1時間振とうした。続いて、メンブレンを３％ＢＳＡ溶液で２０００倍希釈した抗ＦＬＡＧ（登録商標）ＩｇＧ－ＨＲＰ(Sigma社)に浸し、室温で1時間振とうした。ＴＢＳＴで１０分間ｘ３回メンブレンを洗浄した後に、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質 (Millipore社)をメンブレン上に垂らし、ＦＵＳＩＯＮ（Vilber Bio Imaging 社）により撮影した。凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）及び負電荷化していないＶＭ１１０４は不溶性画分で確認されたが、可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）及びＶＭ１１０４を負電荷化したＶＭ１４９８は可溶性画分で確認された（図２）。このことから、ＶＨＨを負電荷化することにより細胞内で発現しても凝集せず安定であることが確認された。

負電荷ＦＲからなるＶＨＨライブラリーの構築
ＦＲが負電荷化されたＶＭ１４９８が期待通り細胞内で凝集せずに発現可能であることが確認できたため、ＶＭ１４９８のＦＲをベースとしたＶＨＨ抗体ライブラリー４種を構築した。ＰharamaＬogicalライブラリーはＣＤＲ３の構造特性が異なる、Ｒｏｌｌ１２、Ｒｏ１ｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の４つのサブライブラリーから構成されている。ＶＭ１４９８はＲｏｌｌ１２タイプであるＶＭ１１０６をベースにデザインしたが、その負電荷化の変異をＲｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２にも導入し、負電荷ＶＨＨ抗体ライブラリーを作製した。

Ｕｐｒｉｇｈｔタイプ又はＲｏｌｌタイプのＣＤＲ１ーＦＲーＣＤＲ２をテンプレートとして（Antibodies 2022, 11(1), 10参照）、５’側からＦＲ３がコードされた領域までを含むフラグメントを作製した。

＜ＣＤＲ１領域の増幅＞
Ｒｏｌｌ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント、ｎＰＬ＿ＦＲ１＿ＦＷ及びｎＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿ＦＲ２＿ＲＶのプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６５℃で１０秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回すＰＣＲを行った。Ｕｐｒｉｇｈｔ型についても、Ｕｐｒｉｇｈｔ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメントに対してｎＰＬ＿ＦＲ１＿ＦＷとｎＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ＿ＦＲ２＿ＲＶのプライマーセットを用いて同様のＰＣＲを行った。プライマー配列は下記に示すとおりである。

Roll型用プライマー
nPL_FR1_FW（配列番号３６）
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT
nPL_Roll_FR2_RV（配列番号３７）
CTCACGTTCTCTTCCCGGTGCCTGGCG

Upright型用プライマー
nPL_FR1_FW（配列番号３６）
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT
nPL_Upright_FR2_RV（配列番号３８）
CTCCAGTTCTCTTCCCGGTGCCTGGCG

＜ＣＤＲ１領域への５’ＵＴＲ配列の付加＞
上記のＲｏｌｌ型のＰＣＲ反応液を１０分の１倍量、ＰＬ＿Ｔ７＿ＡＴＧ及びｎＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿ＦＲ２＿ＲＶのプライマーセット、１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で１０秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回すＰＣＲを行った。Ｕｐｒｉｇｈｔ型のＰＣＲ反応液についても、ＰＬ＿Ｔ７＿ＡＴＧ及びｎＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ＿ＦＲ２＿ＲＶのプライマーセットを用いて同様のＰＣＲを行った。ＡＭｐｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。用いたプライマーの配列は下記に示すとおりである。生じたフラグメントをＴ７－ＣＤＲ１フラグメントと称する。

Roll型用プライマー
PL_T7_ATG（配列番号１３）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
nPL_Roll_FR2_RV（配列番号３７）
CTCACGTTCTCTTCCCGGTGCCTGGCG

Upright型用プライマー
PL_T7_ATG（配列番号１３）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
nPL_Upright_FR2_RV（配列番号３８）
CTCCAGTTCTCTTCCCGGTGCCTGGCG

＜ＣＤＲ２領域の増幅＞
Ｒｏｌｌ型、Ｕｐｒｉｇｈｔ型それぞれのＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント、ｎＰＬ＿Ｒｏｌｌ＿ＦＲ２＿ＦＷ及びｎＰＬ＿ＦＲ３（Ｌ／Ｖ）＿ＲＶ（ｎＰＬ＿ＦＲ３（Ｌ）＿ＲＶ及びｎＰＬ＿ＦＲ３（Ｖ）＿ＲＶの１：１混合物）のプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを２０サイクル回すＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列は下記のとおりである。ＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。得られたフラグメントをＣＤＲ２フラグメントと称する。

nPL_Roll_FR2_FW（配列番号３９）
CGCCAGGCACCGGGAAGAGAACGTGAG
nPL_FR3(L)_RV（配列番号４０）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTCCAGGGAATCCATCTGGAGATACAGGGTGTTCTCCGCTTCGTCAAGGC
nPL_FR3(V)_RV（配列番号４１）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTCCAGGGAATCCATCTGGAGATACACGGTGTTCTCCGCTTCGTCAAGGC

＜Ｔ７－ＣＤＲ１フラグメントとＣＤＲ２フラグメントの連結＞
Ｒｏｌｌ型又はＵｐｒｉｇｈｔ型のＴ７－ＣＤＲ１フラグメント、Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー、及び１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。一方で、Ｒｏｌｌ型、もしくはＵｐｒｉｇｈｔ型のＣＤＲ２フラグメント、ｎＰＬ＿ＦＲ３＿ＲＶプライマー、１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲで使用したプライマー配列は下記のとおりである。

Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
nPL_FR3_RV（配列番号４２）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTCC

Ｒｏｌｌ型、Ｕｐｒｉｇｈｔ型について、Ｎｅｗｌｅｆｔをプライマーとして用いたＰＣＲ産物及びｎＰＬ＿ＦＲ３＿ＲＶをプライマーとして用いたＰＣＲ産物を、それぞれ等量ずつ混合し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回すＰＣＲを行った。AMpure XPを用いてＰＣＲ産物を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。得られたフラグメントをＴ７―ＣＤＲ２フラグメントと称する。

＜Ｔ７－ＣＤＲ２フラグメントへのＣＤＲ３配列の付加＞
Ｒｏｌｌ型のＴ７－ＣＤＲ２フラグメント、Ｎｅｗｌｅｆｔ及びｎＰＬ＿Ｒｏｌｌ１２＿ＣＤＲ３＿ＲＶ又はｎＰＬ＿Ｒｏｌｌ１５＿ＣＤＲ３＿ＲＶのプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＲＡＭａｘからなる反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で１０秒からなる熱サイクルを１２サイクル回した。Ｕｐｒｉｇｈｔ型のＴ７－ＣＤＲ２フラグメントに対しても、Ｎｅｗｌｅｆｔ及びｎＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６＿ＣＤＲ３＿ＲＶ又はｎＰＬ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ１２＿ＣＤＲ３＿ＲＶのプライマーセットを用いて同様にＰＣＲを行った。用いたプライマーセットの配列は下記に示すとおりである。

Ｒｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の各ＰＣＲ反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）に溶出した。得られたフラグメントを各Ｔ７－ＦＲ４フラグメントと称する。

Roll型用プライマー
Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
nPL_Roll12_CDR3_RV（配列番号４３）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGCAACGGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTC
nPL_Roll15_CDR3_RV（配列番号４４）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGCAACGGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTC

Upright型用プライマー
Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
nPL_Upright6_CDR3_RV（配列番号４５）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCANNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCATTGGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTC
nPL_Upright12_CDR3_RV（配列番号４６）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCATTGGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTC

＜Ｔ７－ＦＲ４フラグメントへのＶＨＨ遺伝子以降の配列の付加＞
各Ｔ７－ＦＲ４フラグメント、ＰＬ＿ＦＲ４＿ＲＶプライマー、及び１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる反応液を調製し、９５℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを２０サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。ＰＬ＿ＦＲ４＿ＲＶの配列は下記に示すとおりである。

PL_FR4_RV（配列番号４７）
TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGATGATGGGATCCTCCCCCTGAAGAGACTGTCACCAACGTGCCTTGACCCCA

＜フルコンストラクト・ライブラリーのＰＡＧＥ精製＞
ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５（３０ｋ、メルクミリポア社）を用いて、１３０００ｘｇで１５分遠心することでＰＣＲ産物を濃縮し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。精製したフルコンストラクトＤＮＡ、Ｎｅｗｌｅｆｔ及びＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖｋ）のプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる反応液をＲｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２のそれぞれ調製し、９５℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で１０秒からなる熱サイクルを４サイクル回すＰＣＲを行った。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５（３０ｋ、メルクミリポア社）にＰＣＲ反応液を投入し、１３０００ｘｇ、室温、１５分間の条件で遠心することでＰＣＲ産物を濃縮した後に、ＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）に溶出した。合成したｎＰＬＲｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の各ライブラリーＤＮＡにコードされた翻訳領域の配列は、ユーロフィンジェノミクス株式会社によるダイレクトシーケンシングにより確認した。得られた配列は、以下のとおりである。

nPL_Roll12
DNA配列
FR1（配列番号４８）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT

FR2（配列番号４９、５０）
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACGTGAGTTTGTGGCG、又は
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACGTGAGGGCGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号５１、５２）
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCCTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCGTTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA、又は
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCGTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCGTTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号５３）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAVAS

FR2（配列番号５４、５５）
WFRQAPGREREFVA、又は
WFRQAPGREREGVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号５６、５７）
RFTISLDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYAVAXXXXXXXXXYDYWGQGTLVTVSS、又は
RFTISLDEAENTVYLQMDSLEAEDTAVYYAVAXXXXXXXXXYDYWGQGTLVTVSS
（Xは、任意のアミノ酸。以下、本明細書において同じ）

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

nPL_Roll15
DNA配列
FR1（配列番号４８）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT

FR2（配列番号４９、５０）
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACGTGAGTTTGTGGCG、又は
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACGTGAGGGCGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号５８、５９）
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCCTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCGTTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA、又は
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCGTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCGTTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号５３）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAVAS

FR2（配列番号５４、５５）
WFRQAPGREREFVA、又は
WFRQAPGREREGVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号６０、６１）
RFTISLDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYAVAXXXXXXXXXXXXYDYWGQGTLVTVSS、又は
RFTISLDEAENTVYLQMDSLEAEDTAVYYAVAXXXXXXXXXXXXYDYWGQGTLVTVSS

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

nPL_Upright6
DNA配列
FR1（配列番号４８）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT

FR2（配列番号６２、６３）
TGGTATCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACTGGAGTGGGTGGCG、又は
TGGGTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACTGGAGTGGGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号６４、６５）
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCCTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA、又は
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCGTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号５３）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAVAS

FR2（配列番号６６、６７）
WYRQAPGRELEWVA、又は
WVRQAPGRELEWVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号６８、６９）
RFTISLDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYANAXXXXXXWGQGTLVTVSS、又は
RFTISLDEAENTVYLQMDSLEAEDTAVYYANAXXXXXXWGQGTLVTVSS

nPL_Upright12
DNA配列
FR1（配列番号４８）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGTAGCGAGT

FR2（配列番号６２、６３）
TGGTATCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACTGGAGTGGGTGGCG、又は
TGGGTTCGCCAGGCACCGGGAAGAGAACTGGAGTGGGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号７０、７１）
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCCTCTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA、又は
CGGTTTACCATCAGCCTTGACGAAGCGGAGAACACCCTGTATCTCCAGATGGATTCCCTGGAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCCAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCTCTTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR１（配列番号５３）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAVAS

FR2（配列番号６６、６７）
WYRQAPGRELEWVA
WVRQAPGRELEWVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号７２）
RFTISLDEAENTLYLQMDSLEAEDTAVYYANAXXXXXXXXXXDYWGQGTLVTVSS

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

負電荷ＶＨＨライブラリーからの抗ＫＲＡＳ＿ＶＨＨの獲得
構築したライブラリーが機能すること、すなわち任意の抗原に対して結合するＶＨＨが取得可能であり、なおかつ取得されたＶＨＨが細胞内で凝集せずに抗原に結合可能であることを実証するために、ＫＲＡＳ変異体をモデル抗原としｃＤＮＡディスプレイ法によるＶＨＨのセレクションを実施した。

基本的には実施例３に記載された手順に倣い、ＫＲＡＳに結合するＶＨＨ抗体の取得を進めた。ただし、抗原にはＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｑ６１Ｈ）（Sino Biological社）をEZ-Link（商標）Sulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo-Fisher Scientific社）を用いてビオチン化したものを使用した。また、ｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーのバッファーを、ＰＢＳ、１００ μＭＧＭＰＰＮＰ（Ｓｉｇｍａ社）、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＧＳＨ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４％ＢｌｏｃｋＡｃｅに調製した。抗原を固定化したDynabeads MyOne streptavidin C1とｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーを下記表４に示した抗原濃度となるように混合し、攪拌しつつインキュベーションした。Ｒ１－Ｒ５では１００μＬのＰＢＳＴ、Ｒ６では洗浄バッファー（ＰＢＳ、１０μＭＧＭＰＰＮＰ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＧＳＨ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．４％ＢｌｏｃｋＡｃｅ）で４回洗浄後、磁性体ビーズ上の抗原に結合しているｃＤＮＡディスプレイ分子を回収し、ＰＬ＿Ｔ７ｐｒｏとＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖＫ）とのプライマーセットでリカバリーＰＣＲを実施した。

抗ＫＲＡＳ＿ＶＨＨの一次結合評価
＜ＶＨＨ発現プラスミドライブラリーの作製＞
上記のin vitroセレクションによって選抜したＶＨＨをコードするＤＮＡプールを、ＶＨＨ発現用のプラスミドベクターにインサートした。まず、in vitroセレクションによって取得したＤＮＡライブラリーに対して、制限酵素処理するための配列をＰＣＲにより付加し、インサートＤＮＡを得た。このインサートＤＮＡとC. glutamicum発現用プラスミドベクターを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、３７℃にて１時間処理し、その後、制限酵素ＳｆｉＩ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、５０℃にて１時間処理した。制限酵素処理したインサートＤＮＡとベクターＤＮＡをＡＭＰｕｒｅＸＰで精製した。

以上のように精製したベクターＤＮＡを脱リン酸化酵素であるFastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、３７℃にて１時間脱リン酸化反応させた。その後、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとのモル比が１：３になるように混合し、Ligation high（東洋紡社）を用いて、１６℃にて終夜ライゲーション反応を行い、セレクションされたＶＨＨ遺伝子プールが導入されたプラスミドライブラリーを取得した。

＜分泌発現系によるＶＨＨ抗体の調製＞
電気穿孔法によりプラスミドライブラリーをC. glutamicumへ導入し、形質転換体ライブラリーとした。得られた形質転換体ライブラリーをＣＭ２Ｇプレート培地に植菌し、３０℃にて終夜培養を行った。その後、前記培養プレートの９６個のコロニーからＶＨＨ発現用培地ＰＭ１Ｓ培地に継代し、２５℃にて７２時間培養を行って、培養上清中にＶＨＨの分泌発現を行った。培養上清の回収は３０００ｘｇで遠心操作し、さらに０．２２μｍのフィルター処理により上清から菌体を除去した。

＜ビアコアによる一次結合評価＞
センサーチップ上にリガンドとしてビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を固定化し、アナライトとして上記の調製したＶＨＨ抗体群を一点濃度で結合・解離させることを順次連続して結合の有無を確認した。

ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ａｖｉ－ｔａｇ）（Sino Biological社）のビオチン化にはBirA biotin-protein ligase standard reaction kit（Avidity社）を用いた。キットのマニュアル記載の組成に従い、反応条件は４℃、終夜とした。ビオチン化反応後、Slide-A-Lyzer(商標)MINI Dialysis Devices, 3.5K MWCOを用いて、精製しつつＰＢＳＴにバッファー交換した。

Biacore（商標）T200（Cyitva社）にSeries S Sensor Chip CAP（Cytiva社）をセットし、ランニングバッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１０μＭＧＭＰＰＣＰ（Ｓｉｇｍａ社）、０．０５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）でｐｒｉｍｅを１回実施した。Manual Runを開始し、ＦＣ１～ＦＣ４に２μＬ／ｍｉｎの流速でBiotin CAPture Reagentを5分間流し固定化した。続いて、ＦＣ２、ＦＣ４に２μＬ／ｍｉｎの流速で８０ｎＭビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を５分間流し固定化した。ＦＣ２－１に流路を切り替え、３０μＬ／ｍｉｎに流速を変更し、ランニングバッファーで１００倍に希釈した上記のＶＨＨ各クローンを２分間流し、２分間洗浄することを、４８クローン分連続して実施し、各クローンのレスポンスから結合の有無を評価した。ＦＣ４－３に切り替えて、残りの４８クローン分についても同様にレスポンスから結合の有無を評価した。

＜ヒットＶＨＨの調製＞
上記、１次結合評価にて結合が見られたクローンについて、配列解析をした。ヒットクローンである形質転換体を３７℃にて一晩培養を行い、この培養液についてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＤＮＡ精製し、その後、各ＤＮＡのシーケンシングをＥｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ社に外注した。取得したＨｉｔｃｌｏｎｅの中で配列が重複するものを除き、残ったクローンをユニーククローンとした。

上記の配列解析によって特定したユニーククローンについて、３０℃にて一晩前培養を行った。その後、この前培養液をＶＨＨ発現用培地ＰＭ１Ｓ培地に継代し、２５℃にて７２時間培養を行って、培養上清中にＶＨＨ抗体（単量体）の分泌発現を行った。培養上清の回収は遠心操作によって行い、上清からの菌体の除去を行った。

取得した培養上清より、His MultiTrap HP (Cytiva社)を用いて当該製品説明書に従って上記サンプルを精製した。１００μＬの溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を添加し、５００ｘｇ、４℃、２分間の条件で遠心した。溶出液を回収し、この溶出液を精製ＶＨＨクローンサンプルとした。

＜ビアコアによる精製ＶＨＨクローンのＫＤ測定＞
Biacore T200を用いてSeries S Sensor Chip CAPに固相化したビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）に対する各クローンＶＨＨの結合活性を測定した。測定にはMethods CAP Single-Cycle Kineticsを用いた。温度は25℃に設定した。ランニングバッファーには１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１０μＭＧＭＰＰＣＰ、０．０５％ surfactant P20を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである。

１）ビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の固相化：流速を２μＬ／ｍＬに設定し、Biotin CAPture Reagentを３００秒間添加し、その後、１００ｎＭのビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を１２０秒間添加することで固定化した。
２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニングバッファーで１２．３ｎＭ、３７．０ｎＭ、１１１．１ｎＭ、３３３．３ｎＭ、１０００ｎＭに希釈した各クローンＶＨＨをAssociation Time 120秒間で結合させて、Dissociation Time 600秒間に設定して相互作用させた。
３）センサーチップ表面の再生：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、Regeneration stock 1（Cytiva社）とRegeneration stock 2（Cytiva社）を３：１で混合した溶液を１２０秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Biacore T200 Evaluation（ソフトウェアバージョン2.0）（Cytiva社）を用いて1:1 binding modelによる解析を行い、結合活性を算出した。

取得した負電荷ＶＨＨ抗体ライブラリー由来の抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）＿ＶＨＨ群の配列とＫＤを表５にまとめた。

抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）＿ＶＨＨの細胞内発現評価
実施例４に記載した手順に倣い、負電荷ＶＨＨ抗体ライブラリー由来の抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）＿ＶＨＨ抗体群：ＶＭ１８６６、ＶＭ１８６７、ＶＭ２３５９、ＶＭ２３６０、ＶＭ２３６３、ＶＭ２３６６、ＶＭ２３６９について細胞内発現時の凝集の有無を評価した。ただし、発現細胞には、すい臓がん由来細胞株であるＰＡＮＣ－１細胞（ＡＴＣＣ）を使用した。ＰＡＮＣ－１細胞をトランスフェクションの前日に４０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ウェルプレートに播種し、構築したプラスミドをLipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen)を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、２４時間で２％ＦＢＳ含有培地に交換し、さらに２４時間後、細胞の回収を行った。回収した細胞をＲＩＰＡバッファーに溶解し、可溶性画分、不溶性画分を調製し、ウェスタンブロッティングによりＶＨＨ抗体の所在を確認した。（図３）。

凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）及び負電荷化していないＶＭ１１０４は不溶性画分で確認されたが、可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）及びＶＭ１１０４を負電荷化したＶＭ１８６６、ＶＭ１８７６、ＶＭ２３５９、ＶＭ２３６０、ＶＭ２３６３、ＶＭ２３６６、ＶＭ２３６９は可溶性画分で確認された（図３）。このことから、特定の抗原を認識するＶＨＨ抗体のみならず、任意のＶＨＨ抗体を負電荷化することにより細胞内で発現しても凝集せず安定であることが確認された。

免疫沈降による抗ＫＲＡＳ＿ＶＨＨ抗体の細胞内結合評価
すい臓がん由来細胞株であるＰＡＮＣ－１について、細胞内で発現させた抗ＫＲＡＳＶＨＨ抗体が内在性ＫＲＡＳに結合することを共免疫沈降法により検証した。

まず、実施例８と同様に、Ｈ７、抗ＨＳＡ抗体であるＶＭ１４９８、並びに実施例７で得られた抗ＫＲＡＳ抗体であるＶＭ１８６６及びＶＭ１８６７をＰＡＮＣ－１細胞内で発現させ、細胞を回収した。また、Dynabeads protein G (ベリタス社) ５２μＬスラリー分をＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ含有１ｘＰＢＳ）で洗浄後、５２０μＬＰＢＳ－Ｔ、１３μｇ抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（メルク社）を添加し、室温で３０分間回転させることで抗体を磁性ビーズに結合させた。その後、５００μＬＩＰバッファー（３０ｍＭＨｅｐｅｓ－ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＫＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％ＮＰ－４０、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡフリー、プロテアーゼ阻害剤カクテル（メルク社）でビーズを２回洗浄し、５００ｕＬＩＰバッファーでビーズを懸濁した。

抗体結合ビーズの調製後、ＶＨＨ抗体を発現した細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、１ｘＰＢＳを新たに加えてセルスクレーパーを用いてチューブに回収した。回収後、３００ｘｇで５分間遠心分離を行い、ＰＢＳを除いた。次に、２００μＬＩＰバッファーで細胞を懸濁し、氷上で１０分間静置することで細胞を溶解させた。細胞の溶解後、１５０００ｘｇ，４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を細胞抽出液として回収した。なお、この細胞抽出液の一部をｉｎｐｕｔ画分として分注しＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルを調製した。

各細胞抽出液と１００μＬスラリー分の抗体結合ビーズを混合し、４℃で１時間回転した。その後、５００μＬＩＰバッファーで３回洗浄し、ビーズを１ｘＳＤＳサンプルバッファーで懸濁し、７０℃で１０分間加熱することでビーズに結合したタンパク質をＩＰ画分として溶出した。

各ｉｎｐｕｔ画分、ＩＰ画分について、実施例８と同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングおよび撮影を行った。なお、１次抗体として４０００倍に希釈した抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体または１０００倍に希釈した抗ＫＲＡＳ抗体（メルク社）を用い、４℃で一晩反応させた。また、２次抗体として１００００倍に希釈した抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを用い、室温で１時間反応させた。抗ＫＲＡＳ抗体であるＶＭ１８６６及びＶＭ１８６７が、細胞内でＫＲＡＳに結合していることが確認された（図４）。

負電荷フレームワーク（ＦＲ）のデザイン２
実施例１では、各ポジションのアミノ酸をアラニンに置換した際のΔΔＧとＰＤＢに登録されているＶＨＨの内、負電荷性が高い配列のＦＲの情報を元に負電荷ＦＲベース配列を設計した。一方で、別の出発点として、以下の情報を元に負電荷ＦＲの設計を試みた。

（１）PharmaLogicalライブラリー由来のＶＭ５６５及びＶＭ５７７（ともに抗ＫＲＡＳ＿ＶＨＨ）の立体構造をＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（https://swissmodel.expasy.org/）を用いてホモロジーモデリングし、任意の１か所の位置のアミノ酸をアスパラギン酸（Ａｓｐ置換）に置換した際のΔΔＧ
（２）ＰＤＢＩＤ：４ＩＤＬ、１ＭＥＬについて、任意の１か所の位置のアミノ酸をアスパラギン酸もしくはグルタミンに置換（Ｇｌｎ置換）した際のΔΔＧ

ΔΔＧの計算はＡｌａ置換と同じく以下の通り実施した。各クローンに対してホモロジーモデリングした構造又はＰＢＤに登録された構造を用いて、任意の１か所の位置をＡｓｐ置換又はＧｌｎ置換した際の自由エネルギー差ΔΔＧを求める自由エネルギー摂動法を複数個所に対し実施した。具体的にはVisual Molecular Dynamics (https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)のプラグインAlaScan pluginをＡｌａ置換以外も行えるように改良し、天然配列から各ポジションをAsp置換またはＧｌｎ置換するハイブリッドトポロジーと、自由エネルギー摂動法計算用の入力ファイルを作成した。その後、NAMD version 3.0 alpha (http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/)を用いて自由エネルギー摂動計算を行った。1ステップの時間には２フェムト秒、温度制御（３００Ｋ）にはLangevin dynamics、圧力制御（１ａｔｍ）にはLangevin pistonを用いた。力場パラメータにはCHARMM 36、水分子はＴＩＰ３Ｐを用いた。系のサイズはタンパク質と溶媒（水とイオン）を含めておよそ３万～４万原子であり、周期境界条件のボックスサイズはおよそ７０Å３である。

４クローンについてＡＮＡＲＣＩにてＡＨｏナンバリングを行い、アライメントを行い、各ポジションのΔΔＧ（Ａｓｐ変異、Ｇｌｎ変異）をまとめた表を作成し比較した。図８を参照。ΔΔＧの値が１．５ｋＪ／ｍｏｌ以下のＨ１３、Ｈ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２（Ｋａｂａｔナンバリング）を変異導入箇所候補とした。さらに、立体構造的に変異導入箇所がＣＤＲ３から離れておりまた、変異導入箇所同士で近接しないようにし、最終的にＨ４３、Ｈ４４、Ｈ７０、Ｈ７４、Ｈ８１、Ｈ８２ｂ、Ｈ８３、Ｈ１１２に負電荷化の変異を導入した。

ＶＭ５６５、ＶＭ５６８、ＶＭ５６９に上記の負電荷化の変異を導入し、さらにシステインをアラニンに置換したｎＶＭ５６５、ｎＶＭ５６８、ｎＶＭ５６９をデザインし、ｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクトのＤＮＡ合成をユーロフィンジェノミクス社に外注した。各ＶＨＨのアミノ酸配列を表６に示す。

ｎＶＭ５６５、ｎＶＭ５６８、ｎＶＭ５６９のｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクトのＤＮＡをテンプレートに実施例２及び３に記載の手順に倣い、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入ライブラリーの作製、そのライブラリーからのｃＤＮＡディスプレイ法を用いたＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｑ６１Ｈ）結合変異体のセレクション、およびＮＧＳ解析を実施した。ＮＧＳ解析の結果から、初期のランダム変異導入ライブラリー中の占有率と、Ｒ３終了後のライブラリーＤＮＡ中の占有率を比較し、各クローンについて最も占有率が上昇していた配列をｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１、ｎＶＭ５６９－ｍｔ１とし、ｃＤＮＡディスプレイ用コンストラクトのＤＮＡ合成をユーロフィンジェノミクス社に外注した。各ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列を表７に示す。

ｎＶＭ５６５、ｎＶＭ５６８及びｎＶＭ５６９と比較して電荷にかかわる変異がＦＲ３およびＦＲ４に確認されるため、ＶＨＨ抗体の負電荷化にはＦＲ３及びＦＲ４が寄与していると考えられる。ｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１及びｎＶＭ５６９－ｍｔ１のＦＲ１－４の配列は、同じ配列であり、下記のとおりである。ＦＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングによる。

FR1（H1～H25）（配列番号９５）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAAAS

FR2（H36～H49）（配列番号９６）
WFRQAPGKGREFVA

FR3（H66～H94）（配列番号９７）
RFTIDRDNDKNTVYLDMNDLQAEDTAVYYAAA

FR4（H103～H113）（配列番号９８）
WGQGTLVTVDS

＜ＶＨＨクローンの結合評価＞
ＷＴのクローン：ＶＭ５６５、ＶＭ５６８、ＶＭ５６９とそれらを負電荷化し定向進化のプロセスを経て得られたｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１、ｎＶＭ５６９－ｍｔ１の計６クローンに関して、ビオチン化ＶＨＨを調製し、ビアコア測定のリガンドとして利用する方法でＫＤを測定した。

具体的な手順を以下に示す。ＶＨＨ－ｍＲＮＡ連結体の調製までを実施例３と同様の手順で実施した。クローンあたり２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、５０μＬのＰＵＲＥｆｒｅｘ反応液を使用した。ＶＨＨ－ｍＲＮＡ連結体を含む５０μＬのＰＵＲＥｆｒｅｘ反応液に２００μＬの１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファーを添加し、１ｘＨｉｓ－ｔａｇ結合バッファーで洗浄済みの４０μＬスラリー分のHis Mag Sepharose Niと混合し、攪拌しつつ室温で1時間インキュベートした。Ｈｉｓ－ｔａｇ結合バッファーで２回洗浄後、２０μＬの溶出バッファーに再懸濁し、攪拌しつつ室温で１０分間インキュベートした。NEBuffer2（NEB社）、Nuclease-free water、RNase H (タカラバイオ社)を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＨ処理サンプルをランニングバッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、１０μＭＧＭＰＰＣＰ、０．０５％ surfactant P20）で希釈しビアコア測定用のビオチン化ＶＨＨサンプルとした。

Biacore T200を用いてSeries S Sensor Chip CAPに上述のビオチン化ＶＨＨを固相化し、ＫＲＡＳとの結合活性を測定した。測定にはMethods CAP Single-Cycle Kineticsを用いた。温度は２５℃に設定した。ランニングバッファーは本項内の上述の通り。ラン毎の測定順は以下の通りである。

１）ビオチン化ＶＨＨの固相化：流速を２μＬ／ｍＬに設定し、Biotin CAPture Reagentを300秒間添加し、その後、濃度未知のビオチン化VHHサンプルを流速2μL/minに設定し300秒間添加することで固定化した。
２）結合活性の測定：流速を30μL/mLに設定し、ランニングバッファーで6.2nM、18.5nM、55.6nM、166.7nM、500nMに希釈したKRAS（G12D、Q61H）をAssociation Time 120秒間で結合させて、Dissociation Time ６００秒間に設定して相互作用させた。
３）センサーチップ表面の再生：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、Regeneration stock 1とRegeneration stock 2を３：１で混合した溶液を120秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Biacore T200 Evaluation（ソフトウェアバージョン2.0を用いて１：１ binding modelによる解析を行い、結合活性を算出した。各VHHの結合活性を表８に示す。

＜細胞内発現での凝集性評価＞
実施例８に記載した手順に倣い、ＶＭ５６５、ＶＭ５６８、ＶＭ５６９、ｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１、ｎＶＭ５６９－ｍｔ１についてすい臓がん由来細胞株であるＰＡＮＣ－１細胞（ＡＴＣＣ）に発現させ凝集性を評価した。結果を図５に示す。凝集性ＶＨＨ（Ｄ４）とＶＭ５６９は不溶性画分で確認され、ＶＭ５６８は発現が確認できなかったが、可溶性ＶＨＨ（Ｈ７）、負電荷化されたｎＶＭ５６８－ｍｔ１、及びｎＶＭ５６９－ｍｔ１は、可溶性画分で確認された。また、ＶＭ５６５と、負電荷化されたｎＶＭ５６５－ｍｔ１を比較するとｎＶＭ５６５－ｍｔ１の方がより可溶性画分での発現がみられた。

＜負電荷ＦＲ＿ｖｅｒ２のデザイン＞
ｎＶＭ５６５－ｍｔ１、ｎＶＭ５６８－ｍｔ１、ｎＶＭ５６９－ｍｔ１について、変異個所を確認した。図６の太字下線部が変異箇所であり、主にＣＤＲ領域への変異である。ｎＶＭ５６８－ｍｔ１では、ＦＲ３中にＡｌａからＶａｌへの変異が見られ、これは構造安定性に係る変異と考えられるが、ＦＲの安定化に必須な変異ではないと考えられる。すなわち、再デザインしたＦＲ領域自体は機能すると考えられるため、これらのＦＲで細胞内抗体ライブラリーｖｅｒ２を作製する。

ｐＨ６．６における正味電荷の測定と細胞内における発現の比較
実施例１０で確認した細胞内での安定発現の有無とＶＨＨ配列の正味電荷を下記の表９にまとめた。正味電荷はProtein Calculator（https://protcalc.sourceforge.net/）にて計算した。

【表9】

＋＋は、細胞内で凝集せず、強く発現したこと、＋は、不溶性画分と比べて比較的可溶性画分でより発現したこと、－は細胞内で凝集した、又は発現が可溶画分および不溶性画分ともに検出されなかったことを意味する。

細胞内ＶＨＨライブラリーｖｅｒ．２の構築
＜ＣＤＲ１領域の増幅＞
Ｒｏｌｌ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント(Antibodies 2022, 11(1), 10参照)、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ１＿ＦＷ＿ｓｈｏｒｔ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｒｏｌｌのプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回すＰＣＲを行った。
Ｕｐｒｉｇｈｔ型についても、Ｕｐｒｉｇｈｔ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント(Antibodies 2022, 11(1), 10参照)に対してｎＰＬｖ２＿ＦＲ１＿ＦＷ＿ｓｈｏｒｔとｎＰＬｖ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔ＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｕｐｒｉｇｈｔのプライマーセットを用いて同様のＰＣＲを行った。
プライマー配列は下記に示すとおりである。

Roll型用プライマー
nPLv2_FR1_FW_short（配列番号１０１）
TCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCG
nPLv2_FR2_RV_Roll（配列番号１０２）
CTCACGATCTTTTCCCGGTGCCTGGCG

Upright型用プライマー
nPLv2_FR1_FW_short（配列番号１０１）
TCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCG
nPLv2_FR2_RV_Upright（配列番号１０３）
CTCCAGATCTTTTCCCGGTGCCTGGCG

ＰＣＲ反応液をQuick Precip Plus (EdgeBioSystems社) を共沈剤としたエタノール沈殿により精製した。得られたフラグメントをｎＰＬｖ２＿ＣＤＲ１＿Ｒｏｌｌフラグメント及びｎＰＬｖ２＿ＣＤＲ１＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントと称した。

＜ＣＤＲ１領域への５’ＵＴＲ配列の付加＞
ｎＰＬｖ２＿ＣＤＲ１＿Ｒｏｌｌフラグメントをテンプレートに、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ１＿ＦＷ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｒｏｌｌのプライマーセット、１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回すＰＣＲを行った。さらに本ＰＣＲ反応液を１／１０倍量、ＰＬ＿Ｔ７＿ＡＴＧ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｒｏｌｌのプライマーセット、１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９５℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１０サイクル回すＰＣＲを行った。

また、ｎＰＬｖ２＿ＣＤＲ１＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントに対しても、ｎＰＬ＿ＦＲ１＿ＦＷ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｕｐｒｉｇｈｔのプライマーセットを用いて１段回目のＰＣＲを、さらにＰＬ＿Ｔ７＿ＡＴＧ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＲＶ＿Ｕｐｒｉｇｈｔのプライマーセットを用いて２段階目のＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。生成物をＴ７－ＣＤＲ１＿Ｒｏｌｌフラグメント及びＴ７－ＣＤＲ１＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントと称した。
用いたプライマーの配列は下記に示すとおりである。

Roll型用プライマー
nPLv2_FR1_FW（配列番号１０４）
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT
nPLv2_FR2_RV_Roll（配列番号１０２）
CTCACGATCTTTTCCCGGTGCCTGGCG
PL_T7_ATG（配列番号１３）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG

Upright型用プライマー
nPLv2_FR1_FW（配列番号１０４）
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT
nPLv2_FR2_RV_Upright（配列番号１０３）
CTCCAGATCTTTTCCCGGTGCCTGGCG
PL_T7_ATG（配列番号１３）GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG

＜ＣＤＲ２領域の増幅＞
Ｒｏｌｌ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＦＷ＿Ｒｏｌｌ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｌ／Ｖ）＿ＲＶ（ｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｌ）＿ＲＶ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｖ）＿ＲＶの１：１混合物）のプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回すＰＣＲを行った。
また、Ｕｐｒｉｇｈｔ型のＣＤＲ１－ＣＤＲ２フラグメント、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ２＿ＦＷ＿Ｕｐｒｉｇｈｔ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｌ／Ｖ）＿ＲＶ（ｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｌ）＿ＲＶ及びｎＰＬｖ２＿ＦＲ３（Ｖ）＿ＲＶの１：１混合物）のプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回すＰＣＲを行った。

用いたプライマーの配列は下記のとおりである。ＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ産物を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。得られたフラグメントをＣＤＲ２＿Ｒｏｌｌフラグメント及びＣＤＲ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントと称した。

nPLv2_FR2_FW_Roll（配列番号１０５）
CGCCAGGCACCGGGAAAAGATCGTGAG
nPLv2_FR3(L)_RV（配列番号１０６）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTGCAGGTCATTCATGTCGAGATACAGGGTGTTCTTGTCGTTGTCACGATCGATGGT
nPLv2_FR3(V)_RV（配列番号１０７）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTGCAGGTCATTCATGTCGAGATACACGGTGTTCTTGTCGTTGTCACGATCGATGGT
nPLv2_FR2_FW_Uprught（配列番号１０８）
CGCCAGGCACCGGGAAAAGATCTGGAG

＜Ｔ７－ＣＤＲ１フラグメントとＣＤＲ２フラグメントの連結＞
Ｒｏｌｌ型又はＵｐｒｉｇｈｔ型のＴ７－ＣＤＲ１フラグメント、Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー、及び１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。
一方で、ＣＤＲ２＿Ｒｏｌｌフラグメント又はＣＤＲ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメント、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ３＿ＲＶ＿ｏｕｔｅｒプライマー、１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを５サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。
それぞれのＰＣＲで使用したプライマー配列は下記のとおりである。

Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
nPLv2_FR3_RV_outer（配列番号１０９）
GTAGTACACGGCAGTATCTTCAGCTTGC

上記の２種類のＰＣＲ反応液をＲｏｌｌ型同士、Ｕｐｒｉｇｈｔ型同士で混合し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６０℃で５秒、伸長反応を７２℃で１５秒からなる熱サイクルを１０サイクル回すＰＣＲを行った。ＡＭｐｕｒｅＸＰを用いてＰＣＲ反応液を精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。得られたフラグメントをＴ７－ＣＤＲ２＿Ｒｏｌｌフラグメント及びＴ７－ＣＤＲ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントと称した。

＜Ｔ７－ＣＤＲ２フラグメントへのＣＤＲ３配列の付加＞
Ｔ７－ＣＤＲ２＿Ｒｏｌｌフラグメント、ＮｅｗｌｅｆｔとｎＰＬｖ２＿Ｒｏｌｌ１２＿ＣＤＲ３＿ＲＶ又はｎＰＬｖ２＿Ｒｏｌｌ１５＿ＣＤＲ３＿ＲＶのプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１０サイクル回すＰＣＲを行った。
Ｔ７－ＣＤＲ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔフラグメントに対しても、ＮｅｗｌｅｆｔとｎＰＬｖ２＿Ｕｐｒｉｇｈｔ６＿ＣＤＲ３＿ＲＶ又はｎＰＬｖ２＿ｕｐｒｉｇｈｔ１２＿ＣＤＲ３＿ＲＶのプライマーセットを用いて、同様のＰＣＲを行った。
用いたプライマーの配列は下記に示すとおりである。

Newleft（配列番号９）
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
nPLv2_Roll12_CDR3_RV（配列番号１１０）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNGGCAGCTGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGC
nPLv2_Roll15_CDR3_RV（配列番号１１１）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNGGCAGCTGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGC
nPLv2_Upright6_CDR3_RV（配列番号１１２）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNAGCATTTGCGTAGTACACGGCAGTATCTTCAGC
nPLv2_Upright12_CDR3_RV（配列番号１１３）
TCACCAACGTGCCTTGACCCCAATAATCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNAGCATTTGCGTAGTACACGGCA
GTATCTTCAGC

Ｒｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の各ＰＣＲ反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶出した。得られたフラグメントを各Ｔ７－ＦＲ４フラグメントと称した。

＜Ｔ７－ＦＲ４フラグメントへのＶＨＨ遺伝子以降の配列の付加＞
各Ｔ７－ＦＲ４フラグメント、ｎＰＬｖ２＿ＦＲ４＿ＲＶプライマー、及び１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなるＰＣＲ反応液を調製し、９８℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で５秒からなる熱サイクルを１５サイクル回す片側プライマーのみによるＰＣＲを行った。使用したプライマーの配列は下記に示すとおりである。

nPLv2_FR4_RV（配列番号１１４）
TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGATGATGGGATCCTCCCCCTGAATCGACTGTCACCAACGTGCCTTGACCCCA

＜フルコンストラクト・ライブラリーのＰＡＧＥ精製＞
Ｒｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の各ＰＣＲ反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し、８Ｍの尿素を含む変性ＰＡＧＥにて目的産物を精製した。精製したフルコンストラクトＤＮＡ、Ｎｅｗｌｅｆｔ及びＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖＫ）のプライマーセット、並びに１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘからなる反応液をＲｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２のそれぞれ調製し、９５℃で１０秒、アニーリングを６５℃で５秒、伸長反応を７２℃で１０秒からなる熱サイクルを３サイクル回すＰＣＲを行った。ＡＭＰｕｒｅＸＰを用いて精製し１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶出した。得られたＤＮＡを細胞内ＶＨＨライブラリ－ｖｅｒ．２（ｎＰＬｖ２）とした。
Ｒｏｌｌ１２、Ｒｏｌｌ１５、Ｕｐｒｉｇｈｔ６、Ｕｐｒｉｇｈｔ１２の各ｎＰＬｖ２にコードされた翻訳領域の配列は、ユーロフィンジェノミクス株式会社によるダイレクトシーケンシングにより確認した。得られた配列は、以下のとおりである。

nPLv2_Roll12
DNA配列
FR1（配列番号１１５）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT

FR2（配列番号１１６、１１７）
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCGTGAGTTTGTGGCG、又は
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCGTGAGGGCGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１１８、１１９）
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCCTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAGCTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA、又は
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCGTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAGCTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号１２０）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAAAS

FR2（配列番号１２１、１２２）
WFRQAPGKDREFVA、又は
WFRQAPGKDREGVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１２３、１２４）
RFTIDRDNDKNTLYLDMNDLQAEDTAVYYAAAXXXXXXXXXXDYWGQGTLVTVDS、又は
RFTIDRDNDKNTVYLDMNDLQAEDTAVYYAAAXXXXXXXXXXDYWGQGTLVTVDS
（Xは、任意のアミノ酸。）

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

nPLv2_Roll15
DNA配列
FR1（配列番号１２５）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT

FR2（配列番号１２６、１２７）
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCGTGAGTTTGTGGCG、又は
TGGTTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCGTGAGGGCGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１２８、１２９）
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCCTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAGCTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA、又は
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCGTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAGCTGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATTATTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号１３０）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSAAAS

FR2（配列番号１３１、１３２）
WFRQAPGKDREFVA、又は
WFRQAPGKDREGVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１３３、１３４）
RFTIDRDNDKNTLYLDMNDLQAEDTAVYYAAAXXXXXXXXXXXXXDYWGQGTLVTVDS、又は
RFTIDRDNDKNTVYLDMNDLQAEDTAVYYAAAXXXXXXXXXXXXXDYWGQGTLVTVDS
（Xは、任意のアミノ酸。）

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

nPLv2_Upright6
DNA配列
FR1（配列番号１３５）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT

FR2（配列番号１３６、１３７）
TGGTATCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCTGGAGTGGGTGGCG、又は
TGGGTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCTGGAGTGGGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１３８、１３９）
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCCTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA、又は
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCGTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号１４０）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

FR2（配列番号６６、６７）
WYRQAPGKDLEWVA、又は
WVRQAPGKDLEWVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１４１、１４２）
RFTIDRDNDKNTLYLDMNDLQAEDTAVYYANAXXXXXXWGQGTLVTVDS、又は
RFTIDRDNDKNTVYLDMNDLQAEDTAVYYANAXXXXXXWGQGTLVTVDS

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

nPLv2_Upright12
DNA配列
FR1（配列番号１４３）
ATGGAAGTACAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGGCTTGTACAGCCAGGTGGGAGTCTGCGCCTGAGCGCTGCAGCGAGT

FR2（配列番号１４４、１４５）
TGGTATCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCTGGAGTGGGTGGCG、又は
TGGGTTCGCCAGGCACCGGGAAAAGATCTGGAGTGGGTGGCG

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１４６、１４７）
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCCTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA、又は
CGGTTTACCATCGATCGTGACAACGACAAGAACACCGTGTATCTCGACATGAATGACCTGCAAGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACGCAAATGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGTCAAGGCACGTTGGTGACAGTCGATTCA

His-tagとGSリンカー（配列番号９９）
GGGGGAGGATCCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGC

タンパク質配列
FR1（配列番号１４８）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

FR2（配列番号１４９、１５０）
WYRQAPGKDLEWVA、又は
WVRQAPGKDLEWVA

FR3、CDR3及びFR4（配列番号１５１、１５２）
RFTIDRDNDKNTLYLDMNDLQAEDTAVYYANAXXXXXXXXXXXXWGQGTLVTVDS、又は
RFTIDRDNDKNTVYLDMNDLQAEDTAVYYANAXXXXXXXXXXXXWGQGTLVTVDS

His-tagとGSリンカー（配列番号１００）
GGGSHHHHHHGGS

負電荷ＶＨＨライブラリーｖｅｒ．２からのＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）選択的ＶＨＨの獲得
構築したライブラリーが機能すること、すなわち任意の抗原に対して結合するＶＨＨが取得可能であり、なおかつ取得されたＶＨＨが細胞内で凝集せずに抗原に結合可能であることを実証するために、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）をモデル抗原としｃＤＮＡディスプレイ法によるＶＨＨのセレクションを実施した。

基本的には実施例３、実施例６に記載された方法をベースに、一部条件を変更してＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）選択的ＶＨＨの取得を進めた。標的には実施例７に記載のビオチン化ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を使用した。また、結合及び洗浄バッファーには、ＰＢＳ，１ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＧＳＨ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．４％ＢｌｏｃｋＡｃｅ，１０μＭＧＭＰ－ＰＮＰを使用した。抗原を固定化したＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙＯｎｅｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＣ１とｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーを下記表１０に示した抗原濃度となるように混合し、攪拌しつつインキュベーションした。洗浄バッファーで４回洗浄後、磁性体ビーズ上の抗原に結合しているｃＤＮＡディスプレイ分子を回収し、ＰＬ＿Ｔ７ｐｒｏとＮｅｗＹｔａｇ（ｃｎｖＫ）のプライマーセットでリカバリーＰＣＲを実施した。また、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）選択的ＶＨＨを濃縮するために、セレクションラウンド２以降は、ｃＤＮＡディスプレイ・ライブラリーと抗原固定化磁性体ビーズを混合する際に、１０倍量のＫＲＡＳＷＴ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を添加した。

ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）選択的ＶＨＨ候補のＫＤ測定
＜ＮＧＳ解析＞
上記のｉｎｖｉｔｒｏセレクションによって選抜したＶＨＨをコードするＤＮＡプールのポピュレーションをＮＧＳにより解析した。ＮＧＳ解析は実施例３をベースに実施した。ただし、MiSeq Reagent Nano Kit v2（500-cycle）(イルミナ株式会社)を使用した。また、１段階目のＰＣＲには以下のプライマーセットを用いた。

PL_prRd-N4_VHH_FW（配列番号１６）
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATG
nPL_prRd-N4_VHH_RV（配列番号１５３）
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNTGAATCGACTGTCACCAACGTGCCTTG

＜ＶＨＨの調製＞
ＮＧＳ解析により判明したＤＮＡプール中で占有率が高い上位１５クローンについて遺伝子を合成し、実施例３及び実施例７記載の手順で精製ＶＨＨを調製した。調製した１５クローンの配列を表１１に示す。

＜ビアコアによるＶＨＨのＫＤ測定＞
実施例７と同様の手順で、前記の精製ＶＨＨのＫＤ測定を実施した。ただし、ランニングバッファーには１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、５μＭＧＭＰＰＮＰ、０．０５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を用いた。また、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）とＫＲＡＳ（ＷＴ）をそれぞれ別のフローセルに固定化しＫＤを同時に測定した（表１２）。

抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ＶＨＨの細胞内発現評価
実施例８に記載した手順に倣い、ＶＭ２９９７～ＶＭ３０１１について細胞内発現時の凝集の有無を評価した（図９）。発現量や、可溶性画分と不溶性画分における存在量の比率がクローンごとに異なるものの、すべてのクローンが比較的可溶発現することが確認できた。

免疫沈降による抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ＶＨＨの細胞内結合評価
実施例９に記載した手順に倣い、ＶＭ２９９７、ＶＭ２９９８、ＶＭ３００１、ＶＭ３００６について、細胞内発現したＶＨＨと内在性ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の結合を評価した（図１０）。いずれのクローンも内在性ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）と結合していることが確認できた。