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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024156715
(43)【公開日】2024-11-06
(54)【発明の名称】アルファ－シヌクレインに対するバリアントＲＮＡｉ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241029BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241029BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241029BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241029BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20241029BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241029BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241029BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241029BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241029BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
A61K48/00
A61K31/713
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P43/00 111
A61K35/76
C12N15/864 100Z
C12N15/113 Z
【審査請求】有
【請求項の数】24
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024115452
(22)【出願日】2024-07-19
(62)【分割の表示】P 2021529252の分割
【原出願日】2019-08-02
(31)【優先権主張番号】62/714,616
(32)【優先日】2018-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】500034653
【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ブラッドフォード・エルマー
(72)【発明者】
【氏名】ブレンダ・リチャーズ
(72)【発明者】
【氏名】マルティーヌ・ラッタ－マユー
(72)【発明者】
【氏名】マリア・カルメン・オビヌ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェロニク・トウパン
(72)【発明者】
【氏名】ヴェロニク・ブランシャール
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）の発現を標的化する、神経変性シヌクレイン病を処置するためのＲＮＡｉ分子を提供する。
【解決手段】ａ）第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、ガイド領域を含み、ガイド領域は、配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびにｃ）第２の鎖は、非ガイド領域を含む、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉが提供される。
【選択図】なし
【解決手段】ａ）第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、ガイド領域を含み、ガイド領域は、配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびにｃ）第２の鎖は、非ガイド領域を含む、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉが提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、
ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は二本鎖を形成し；
ｂ）該第１の鎖は、ガイド領域を含み、該ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびに
ｃ）該第２の鎖は、非ガイド領域を含む、前記ＲＮＡｉ。
ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は二本鎖を形成し；
ｂ）該第１の鎖は、ガイド領域を含み、該ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびに
ｃ）該第２の鎖は、非ガイド領域を含む、前記ＲＮＡｉ。
【請求項2】
ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項3】
第１の鎖は、配列番号２４に対して約９０％の同一性または配列番号５３に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項4】
ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項5】
第２の鎖は、配列番号３７に対して約９０％の同一性または配列番号３７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項6】
第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項7】
ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む、請求項６に記載のＲＮＡｉ。
【請求項8】
ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む、請求項６または７に記載のＲＮＡｉ。
【請求項9】
ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む、請求項６～８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項10】
ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む、請求項６～８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項11】
ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む、請求項１０に記載のＲＮＡｉ。
【請求項12】
ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項13】
ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項14】
ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項15】
ポリペプチドは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）である、請求項１４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項16】
アルファシヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレインである、請求項１５に記載のＲＮＡｉ。
【請求項17】
神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物。
【請求項19】
ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項１８に記載の発現構築物。
【請求項20】
ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている、請求項１８または１９に記載の発現構築物。
【請求項21】
プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される、請求項２０に記載の発現構築物。
【請求項22】
イントロンをさらに含む、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の発現構築物。
【請求項23】
イントロンは、ＣＢＡイントロンまたはｈＥＦ１アルファイントロンである、請求項２２に記載の発現構築物。
【請求項24】
イントロンは、キメライントロンである、請求項２２に記載の発現構築物。
【請求項25】
発現ベクターは自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである、請求項２２に記載の発現構築物。
【請求項26】
ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の発現構築物。
【請求項27】
ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである、請求項２６に記載の発現構築物。
【請求項28】
請求項１８～２７のいずれか１項に記載の発現構築物を含むベクター。
【請求項29】
組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項30】
発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する、請求項２９に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項31】
発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する、請求項３０に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項32】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項３０または３１に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項33】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項３０～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項34】
スタッファー核酸をさらに含む、請求項３０～３３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項35】
スタッファー核酸は、ＲＮＡｉをコードする核酸の上流または下流に配置されている、請求項３４に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項36】
自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項３０～３５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項37】
ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、該第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、該第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項３６に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項38】
第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項39】
請求項２９～３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む細胞。
【請求項40】
請求項２９～３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子。
【請求項41】
ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項４０に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項42】
ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される
、請求項４０または４１に記載のｒＡＡＶ粒子。
、請求項４０または４１に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項43】
ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項４０または４１に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項44】
ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項４３に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項45】
請求項４０～４４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
【請求項46】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項47】
請求項１～１７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉを含むキット。
【請求項48】
請求項４０～４４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を含むキット。
【請求項49】
請求項４５または４６に記載の組成物を含むキット。
【請求項50】
使用するための説明書をさらに含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項51】
哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、該哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖、および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む前記方法。
【請求項52】
第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－Ｅ１パッセンジャー－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、該哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む前記方法。
【請求項54】
神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、該哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む第１の鎖、および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む前記方法。
【請求項55】
第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、該哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む前記方法。
【請求項57】
第１の鎖は、配列番号２４の配列を有する核酸配列または配列番号８の配列を有する核酸を含む、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
第２の鎖は、配列番号５３の配列を有する核酸または配列番号３７の配列を有する核酸を含む、請求項５２、５３、５５、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、請求項５１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項62】
ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
ＲＮＡｉは、発現構築物にコードされている、請求項５１～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項５１～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている、請求項５１～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
プロモーターは、哺乳動物の脳内でＲＮＡｉを発現することが可能である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、およびヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターから選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβーアクチンプロモーターを含むハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）である、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
発現構築物は、イントロンをさらに含む、請求項６６～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
イントロンは、ＣＢＡイントロンである、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
イントロンは、キメライントロンである、請求項７２に記載の方法。
【請求項75】
発現構築物は自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
核酸は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項６６～７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
発現構築物は、ベクターによってコードされる、請求項６６～７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
ベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項83】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項84】
ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に向かって、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
イントロンは、キメライントロン、デルタキメライントロンまたは短縮されたキメライントロンである、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
キメライントロンは、ＣＢＡ＋ウサギベータグロブリンイントロンである、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項89】
ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に向かって、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、キメライントロン、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項90】
ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
スタッファー核酸は、ヒトＡ１ＡＴ遺伝子のイントロン１を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
ベクターは、自己相補的なベクターである、請求項７９～９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項93】
ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、該第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、該第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
ベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている、請求項７９～９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項96】
ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型
キャプシドを含む、請求項９５に記載の方法。
キャプシドを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項98】
ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項99】
ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項９５～９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項100】
ｒＡＡＶウイルス粒子はＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターはＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
請求項９５～１００のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項５１～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項102】
組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年８月３日付けで出願された米国仮出願第６２／７１４，６１６号の優先権の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年８月３日付けで出願された米国仮出願第６２／７１４，６１６号の優先権の利益を主張する。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる：配列リストのコンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１６５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録された日付：２０１９年７月３１日、サイズ：１９ＫＢ）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる：配列リストのコンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１６５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録された日付：２０１９年７月３１日、サイズ：１９ＫＢ）。
【0003】
本発明の開示は、バリアントＲＮＡｉ分子に関する。一部の態様において、本発明の開示は、アルファ－シヌクレインに対するバリアントＲＮＡｉに関する。
【背景技術】
【0004】
長期神経保護療法は、パーキンソン病または多系統萎縮症（ＭＳＡ）のような神経変性シヌクレイン病の処置として、相当な関心が高まっている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的に対して相補的であるＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を導入することによって、標的ｍＲＮＡが低減される機序である。ｓｉＲＮＡ配列は、構成的な、ポリメラーゼＩＩベースの発現を可能にする一方で、また脳内のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの導入に関連する神経毒性を排除する人工的ｍｉＲＮＡ足場（「ｓｈｍｉＲＮＡ」）中にも挿入される（１）。
【0005】
ＲＮＡｉの臨床開発に対する障害は、オフターゲットサイレンシングの可能性であり、その場合、ＲＮＡｉのシード領域（典型的には、ヌクレオチド１～７または１～８）が、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の非標的ｍＲＮＡの配列と対合して、転写の不安定化を引き起こす。オフターゲットサイレンシングを低減する試みとしては、起こる可能性のあるオフターゲットが最小である標的ｍＲＮＡに対して高い特異性を有する候補シード配列を同定するためのアルゴリズムの使用（非特許文献１）、およびＲＮＡｉのガイド領域中に内部バルジを設置すること（非特許文献２）が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｏｕｄｒｅａｕ ＲＬら、（２０１２年） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４１（１）：ｅ９頁
【非特許文献2】Ｔｅｒａｓａｗａら、（２０１１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２０１１：１３１５７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
複数のエビデンスによって、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）レベルの上昇は神経毒性をもたらす一方、低下は神経保護的であることが実証されている（２～９）。それゆえに、ＳＮＣＡレベルを低下させる治療戦略は、潜在的に、神経変性疾患の進行を停止し、その症状を緩和することができることになる。ＲＮＡｉ機序を利用するこのような治療戦略に対するニーズが依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願は、ＳＮＣＡに対するバリアントＲＮＡｉ分子および神経変性疾患の処置および
予防においてそれを使用するための方法を提供することによって、このようなニーズを満たす。本出願は、ＳＮＣＡに対するＲＮＡｉ分子およびこれらのＲＮＡｉ分子を調製するための構築物をスクリーニングまたは同定するための方法も提供する。
予防においてそれを使用するための方法を提供することによって、このようなニーズを満たす。本出願は、ＳＮＣＡに対するＲＮＡｉ分子およびこれらのＲＮＡｉ分子を調製するための構築物をスクリーニングまたは同定するための方法も提供する。
【0009】
一部の態様において、本発明は、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖はガイド領域を含み、ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；かつｃ）第２の鎖は非ガイド領域を含む、ＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号２４に対して約９０％の同一性または配列番号５３に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号３７に対して約９０％の同一性または配列番号３７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている。一部の実施形態において、ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【0010】
上記態様および実施形態の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）である。一部の実施形態において、アルファシヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレインである。一部の実施形態において、神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である。
【0011】
上記態様および実施形態の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物を提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（Ｅ
Ｆ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、発現構築物は、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＣＢＡイントロンまたはｈＥＦ１アルファイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、キメライントロンである。一部の実施形態において、発現ベクターは自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである。一部の実施形態において、発現構築物は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである。
Ｆ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、発現構築物は、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＣＢＡイントロンまたはｈＥＦ１アルファイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、キメライントロンである。一部の実施形態において、発現ベクターは自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである。一部の実施形態において、発現構築物は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである。
【0012】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の発現構築物のいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する。一部の実施形態において、発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ＲＮＡｉをコードする核酸の上流または下流に配置されている。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異を含む。
【0013】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細胞を提供する。
【0014】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
【0015】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む
組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
【0016】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉのいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、使用のための説明書をさらに含む。
【0017】
一部の態様において、本発明は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖、および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－Ｅ１パッセンジャー－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む。
【0018】
一部の態様において、本発明は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法を提供する。
【0019】
一部の態様において、本発明は、神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む第１の鎖、および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む。
【0020】
一部の態様において、本発明は、神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７
）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法を提供する。
）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法を提供する。
【0021】
上記方法の一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号２４の配列を有する核酸配列または配列番号８の配列を有する核酸を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号５３の配列を有する核酸または配列番号３７の配列を有する核酸を含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている。一部の実施形態において、ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリン
カー、および第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
カー、および第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【0022】
上記方法の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）である。一部の実施形態において、アルファシヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレインである。一部の実施形態において、神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である。
【0023】
上記方法の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物を提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、発現構築物は、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＣＢＡイントロンまたはｈＥＦ１アルファイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、キメライントロンである。一部の実施形態において、発現ベクターは自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである。一部の実施形態において、発現構築物は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである。
【0024】
上記方法の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の発現構築物のいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する。一部の実施形態において、発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ＲＮＡｉをコードする核酸の上流または下流に配置されている。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
【0025】
上記方法の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
【0026】
本明細書において引用された、特許出願および公報を包含する全ての参考文献は、参照によってそれら全体が開示に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図2】インビトロでのヒトＳＮＣＡのＲＮＡｉ介在の低下を示すグラフである。ｓｈｍｉＲＮＡ形式で示したＲＮＡｉ配列およびヒトＳＮＣＡ ｃＤＮＡをコードするプラスミドによるトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物におけるＳＮＣＡの定量化。ＳＮＣＡレベルをＧＡＰＤＨ負荷対照に対して正規化し、かつ対照（非標的化対照ＲＮＡｉ）に対して正規化し、パーセントノックダウンを計算した。
【図3】インビトロでのマウスＳＮＣＡのＲＮＡｉ介在の低下を示すグラフである。ｍｉＲＮＡ形式で示したＲＮＡｉ配列およびマウスＳＮＣＡ ｃＤＮＡをコードするプラスミドによるトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物におけるＳＮＣＡの定量化。ＳＮＣＡレベルをＧＡＰＤＨ負荷対照に対して正規化し、かつ対照（非標的化対照ＲＮＡｉ）に対して正規化し、パーセントノックダウンを計算した。
【図4】図４Ａ～Ｄは、インビトロでのマウスまたはヒトアルファ－シヌクレインタンパク質のＲＮＡｉ介在の低下を示す図である。ｓｉＲＮＡ形式で示したＲＮＡｉ配列およびヒトＳＮＣＡ ｃＤＮＡ（図４Ａ）またはマウスＳＮＣＡ ｃＤＮＡ（図４Ｂ）をコードするプラスミドによるトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物におけるＳＮＣＡの定量的分析の図。ＳＮＣＡのタンパク質レベルをベータチューブリンに対して正規化し、かつ対照（非標的化対照ＲＮＡｉ）に対して正規化し、ヒトＳＮＣＡ（図４Ｃ）およびマウスＳＮＣＡ（図４Ｄ）に関するウエスタンブロッティング画像において示されるように、パーセントノックダウンを計算した。
【図5】図５Ａ～Ｂは、トランスフェクトしたＬＵＨＭＥＳ細胞において示したＲＮＡｉ配列の毒性を示すグラフである。ＬＵＨＭＥＳ細胞にｍｉＲＮＡ形式で示したＲＮＡｉ配列をトランスフェクトし、次いでロテノンで処理し、細胞毒性を誘導した。（図５Ａ）ロテノン処理の４８時間後にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイによって細胞生存率を測定し、Ｄ１とＥ１ ＲＮＡｉ配列の両方による有意な神経保護（それぞれ、３８％と４０％）を実証したが、対照ＲＮＡｉ配列に関しては実証されなかった。平均神経保護の％は、対照からの変化の％で計算される。（図５Ｂ）活性酸素種をロテノンに誘導された毒性の追加の読み出しとして測定した。
【図6】ＳＮＣＡノックダウンの神経保護との正の相関関係を示す図である。図５からのパーセント神経保護（細胞生存率として）を、それぞれの実験におけるＤ１またはＥ１からのノックダウンのレベルに対してプロットした。両ＲＮＡｉ配列は、パーセントノックダウンの、ロテノン処理したＬＵＨＭＥＳ細胞における神経保護のレベルとの有意な正の相関（ピアソンの）を示した。
【図7】インビボでｍｉＲＮＡ形式で示したＲＮＡｉによる標的ｍＲＮＡノックダウンを示すグラフである。バーは、平均＋／－ＳＥＭを示す。丸は、個々の動物を表す。多重比較による一元ＡＮＯＶＡによって有意性を評価した。
【図8】ＡＡＶ－Ｄ１ベクターの注射後のマウスの中脳にわたるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの低減を示す図である。１ｅ１０ ＧＣの対照またはＤ１ウイルスをマウスの片側に注射した。組織を収集し、１カ月後にインサイチュハイブリダイゼーションのために処理した。ＳＮＣＡアンチセンスプローブは、対側半球に対して吻側から尾側の３つの異なる解剖学レベルで標的低下を明らかに示す。対照のＲＮＡｉウイルスは、未注射半球に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少を全く示さなかった。
【図9】ＳＮｃ免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーションによるマウスにおけるＳＮＣＡタンパク質およびｍＲＮＡの低減を示す図である。
【図10】ＳＮｃ免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーションとその後のＡＡＶ．ｒｈ１０－Ｅ１ベクターの送達によるマウスにおけるＳＮＣＡタンパク質およびｍＲＮＡの低減を示す図である。
【図11】各サンプル群に関する個々の生物学的反復におけるα－シヌクレインに対して正規化された発現を示すグラフである；ＥＶは、「空のベクター」を表す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を処置するためのＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病または多系統萎縮症（ＭＳＡ）である。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、アルファ－シヌクレインを標的化する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、アルファ－シヌクレインの発現を低減する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＧＧ
ＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含む。一部の態様において、本発明の開示は、本発明の開示のＲＮＡｉを含む発現構築物、ベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、細胞、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）、および医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を処置する、ＳＮＣＡの発現を阻害する、および哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。よりさらなる態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を処置するか（例えば、神経変性シヌクレイン病の症状を緩和するか）、ＳＮＣＡの発現を阻害するか、または神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、シヌクレイン病は、パーキンソン病、多系統萎縮症またはレビー小体型認知症である。
ＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含む。一部の態様において、本発明の開示は、本発明の開示のＲＮＡｉを含む発現構築物、ベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、細胞、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）、および医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を処置する、ＳＮＣＡの発現を阻害する、および哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。よりさらなる態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を処置するか（例えば、神経変性シヌクレイン病の症状を緩和するか）、ＳＮＣＡの発現を阻害するか、または神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、シヌクレイン病は、パーキンソン病、多系統萎縮症またはレビー小体型認知症である。
【0029】
Ｉ．一般的な技術
本明細書で記載または言及される技術および手順は、一般的によく認識され、当業者により従来の手法を使用して一般的に採用されており、このような手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９
８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載の広く利用されている手法である。
本明細書で記載または言及される技術および手順は、一般的によく認識され、当業者により従来の手法を使用して一般的に採用されており、このような手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９
８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載の広く利用されている手法である。
【0030】
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
【0031】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのあらゆる長さのヌクレオチドの多量体型を指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を包含する。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基を含んでいてもよいし（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡで見出されるように）、または修飾または置換された糖またはリン酸基を含んでいてもよい。代替として、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混成のホスホロアミデート－リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすること、または適切なプライマーでのＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成することのいずれかによる、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
【0032】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、そのようなものとしては、これらに限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそれらのフラグメントはどちらも、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本開示の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持しさえすれば、ネイティブの配列に対する修飾、例えば欠失、付加、および置換（一般的に保存的な性質を有するもの）を包含するタンパク質も指す。これらの修飾は、例えば部位特異的変異誘発を介して計画的であってもよいし、または例えばＰＣＲ増幅によりタンパク質またはエラーを生じる宿主の突然変異を介して偶発的であってもよい。
【0033】
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターのケースにおいて、組換え核酸は、少なくとも１つの、および一部の実施形態において２つの、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を端に有する。
【0034】
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、および実施形態
において２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージ化機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカプセル封入された、およびウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子中にキャプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ関連ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
において２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージ化機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカプセル封入された、およびウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子中にキャプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ関連ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
【0035】
「異種」は、比較されるかまたは導入されるかまたは取り込まれる物体の残部の遺伝子型と別個の遺伝子型を有する物体から誘導されたことを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに取り入れられる細胞性の配列（例えば、遺伝子またはそれらの一部）は、そのベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。
【0036】
用語「導入遺伝子」は、細胞に導入されて、ＲＮＡに転写させることができ、場合により適切な条件下で翻訳および／または発現させることができるポリヌクレオチドを指す。態様において、導入遺伝子は、それが導入される細胞に所望の特性を付与するか、またはそれ以外の方法で所望の治療または診断結果をもたらす。別の態様において、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子に転写することができる。
【0037】
「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号３９６５２６で示されるニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン）から誘導されたポリヌクレオチド配列を指す。「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、本明細書で使用される場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントを含有するプロモーター、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター、例えばＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７に記載の配列を指す場合がある。用語「ＣＡＧプロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。
【0038】
用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価体」、または「ゲノムコピー」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶのＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２～２７８に記載されるような手順によって測定することができる。
【0039】
用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で使用される場合、ベクター、例えばウ
イルスベクターの一連のポリヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合がある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にキャプシド化されていてもよい。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を包含していてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターの端にある少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列を包含していてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを包含していてもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸の力価は、ｖｇ／ｍＬを単位として測定することができる。この力価を測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。
イルスベクターの一連のポリヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合がある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にキャプシド化されていてもよい。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を包含していてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターの端にある少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列を包含していてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを包含していてもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸の力価は、ｖｇ／ｍＬを単位として測定することができる。この力価を測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」は、特定の標的の存在、または活性をブロックする、低減する、消去する、または別の方法でそれに拮抗する作用を指す。阻害は、部分的阻害または完全阻害を指す。例えば、遺伝子の発現を阻害することは、ｍＲＮＡの存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などを含む遺伝子発現のブロック、低減、消去、またはいずれかの他の拮抗をもたらすいずれかの作用を指す。一部の実施形態において、ＳＮＣＡの発現を阻害することは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの存在量の低減（例えば、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの分解、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ翻訳の阻害などを含むＳＮＣＡの発現のブロック、低減、消去、またはいずれかの他の拮抗を指す。別の例として、細胞におけるタンパク質の蓄積を阻害することは、ｍＲＮＡの存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、タンパク質の分解などを含むタンパク質の発現のブロック、低減、消去、または他の拮抗をもたらすいずれかの作用を指す。一部の実施形態において、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の蓄積を阻害することは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの存在量の低減（例えば、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの分解、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ翻訳の阻害、ＳＮＣＡタンパク質の分解などを含む、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の発現のブロック、低減、消去、または他の拮抗を指す。
【0041】
用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、例えばＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３～１９７３に記載されるような、複製中心のアッセイとしても公知の感染中心のアッセイによって測定した場合、感染性および複製能を有する組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
【0042】
用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、本明細書の実施例、または例えばＸｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３～１２４；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０～５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されるような機能アッセイで測定した場合、機能的な導入遺伝子産物の生産を引き起こす感染性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
【0043】
「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、逆方向でウイルスゲノムの末端で見出される相対的に短い配列を指す。
【0044】
「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、ネイティブの一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間に不均質性をもたらす２つの択一的な方向のいずれか
に存在していてもよい。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有する数種のより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と指定される）も含有し、それによりＩＴＲのこの部分内で鎖内の塩基対形成を起こすことが可能になる。
に存在していてもよい。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有する数種のより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と指定される）も含有し、それによりＩＴＲのこの部分内で鎖内の塩基対形成を起こすことが可能になる。
【0045】
「末端分解配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡの複製中にＡＡＶのｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶのＩＴＲのＤ領域における配列である。突然変異末端分解配列は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質による切断に対して耐性を有する。
【0046】
「ＡＡＶのヘルパー機能」は、ＡＡＶを宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にする機能を指す。ＡＡＶのヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶ複製およびパッケージ化に役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶのヘルパー機能は、遺伝毒性物質などの分野において公知である。
【0047】
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（これは、欠陥パルボウイルスである）を宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。このようなヘルパーウイルスが多数同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアおよびバキュロウイルスなどが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類由来の数多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関より入手可能である。ＡＴＣＣなどの受託機関より同様に入手可能なヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶ複製に関するアデノウイルスのヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関より入手可能なバキュロウイルスとしては、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルスが挙げられる。
【0048】
ｒＡＡＶの調製は、感染性のＡＡＶ粒子と感染性のヘルパーウイルス粒子との比率が、少なくとも約１０２：１；少なくとも約１０４：１、少なくとも約１０６：１；または少なくとも約１０８：１であるかまたはそれより高い場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と述べられる。一部の実施形態において、調製物も、それに相当する量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子の不純物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在すると予想されるようなタンパク質）を含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の汚染は、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）として一般的に観察することができる。
【0049】
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「パーセント（％）配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が達成されるように配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸または核酸配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業界における能力の範囲内の様々な方法で、例えば、公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、増刊３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載さ
れるもの、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムなど、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代替として、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（代替として、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の％核酸配列同一性を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｗ／Ｚ（式中Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列の長さＣが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。
れるもの、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムなど、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代替として、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（代替として、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の％核酸配列同一性を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｗ／Ｚ（式中Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列の長さＣが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。
【0050】
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、それが、その天然の環境の要素から同定され分離および／または回収されていることを意味する。
【0051】
「有効量」は、臨床結果などの（例えば、症状の緩和、臨床評価項目の達成などの）有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の観点から、有効量は、疾患を緩和する、安定化する、またはその発症を遅延させるのに十分な量である。
【0052】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
【0053】
「処置」は、本明細書で使用される場合、有益な、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の目的に関して、有益な、または所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化された（例えば、悪化しない）状況、疾患の拡大（例えば、転移）の予防、疾患進行の遅延または減速、病状の緩和または一時的緩和、および寛解（部分的かまたは完全化かどうかにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長を意味する場合もある。
【0054】
用語「予防的処置」は、本明細書で使用される場合、個体が、障害を有するかまたは障害を有するリスクを有することがわかっているかまたはその疑いがあるが、障害の症状がないかまたは最小の症状を示す場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状の発病の前に処置される。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「神経変性シヌクレイン病」は、中枢および抹消神経系の両方におけるニューロンおよびグリアの選択集団の細胞質中のアルファ－シヌクレインタンパク質の繊維性凝集によって特徴付けられる神経変性障害を指す。例としては、これらに限定されないが、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ－ＰおよびＭＳＡ－Ｃ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、純粋自律神経失調症（ＰＡＦ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント（ＬＢＶＡＤ）、レビー小体嚥下障害（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、および偶発性レビー小体病が挙げられる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」は、細胞においてＲＮＡ干渉を誘導するいずれかのＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡｉの例としては、これらに限定されないが、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。
【0057】
「ｍｉＲＮＡ足場」は、（ｉ）ＲＮＡｉによるノックダウンのために目的の遺伝子を標的化する二本鎖配列および（ｉｉ）内因性ｍｉＲＮＡのものに似ているステム－ループ構造を形成する追加の配列を含有するポリヌクレオチドを指す。ＲＮＡｉに対する目的の遺伝子を標的化する配列（例えば、短い、約２０ｎｔの配列）は、ｍｉＲＮＡ様ステム－ループを創出する配列、およびポリヌクレオチドがｍｉＲＮＡ様二次構造中にアセンブルされる場合に目的の配列と塩基対を形成して二本鎖を形成する配列にライゲーションされる。本明細書に記載されるように、この二本鎖は不完全にハイブリダイズし、例えば、この二本鎖は１つまたはそれ以上の対合していないかまたは誤対合した塩基を含有する。Ｄｉｃｅｒによるこのポリヌクレオチドの切断の際に、目的の遺伝子を標的化する配列を含有するこの二本鎖はほどかれ、ＲＩＳＣ複合体中に組み込まれる。ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲＮＡそれ自体を指すか、またはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを指す。ｍｉＲＮＡ足場の例は、ｍｉＲ－１５５配列である（Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｍら（２００２） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １２：７３５～９頁）。配列をｍｉＲＮＡ足場中にクローニングするための市販のキットは、当業界において公知である（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキット）。
【0058】
本明細書で使用される場合、「バルジ」は、二本鎖核酸中のそれと反対側の核酸に非相補的である核酸の領域を指す。例えば、バルジは、二本鎖核酸中の反対側の核酸に対して非相補的である核酸配列であって、バルジが、二本鎖核酸中の反対側の核酸に対して相補的である核酸の領域に隣接するものを指す。一部の例において、バルジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える塩基長のいずれかである。一部の例において、バルジは誤対合の結果であるか（例えば、反対側の鎖は非相補的である塩基を含有する）またはバルジは非対合の結果である（例えば、反対側の鎖はバルジに隣接する核酸に対して相補的な核酸を含むが、反対側の鎖はバルジの反対側の核酸を含有しない）。
【0059】
本明細書で使用される場合、用語「センス」核酸は、導入遺伝子の全てまたは一部をコードする配列を含む核酸である。一部の例では、導入遺伝子に関するｍＲＮＡはセンス核酸である。
【0060】
本明細書で使用される場合、「アンチセンス」核酸は、「センス」核酸に対して相補的である核酸の配列である。例えば、アンチセンス核酸は、導入遺伝子をコードするｍＲＮＡに対して相補的である。
【0061】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉの「ガイド領域」は、典型的には、相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡに結合するＲＮＡｉの鎖である。相補的な領域は、ガイド領域の全て
または一部を包含する。典型的には、相補的な領域は、少なくともシード領域を含む。多くのケースにおいて、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、ガイド領域である。
または一部を包含する。典型的には、相補的な領域は、少なくともシード領域を含む。多くのケースにおいて、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、ガイド領域である。
【0062】
本明細書で使用される場合、本明細書において同義的に使用される、ＲＮＡｉの「パッセンジャー領域」、または「非ガイド領域」は、ガイド領域に対して相補的であるＲＮＡｉの領域である。多くのケースにおいて、ＲＮＡｉのセンス領域は、パッセンジャー領域である。
【0063】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ（例えば、ｍｉＲＮＡ）の「シード領域」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの長さが約１～８ヌクレオチドの領域である。一部の例において、その標的ｍＲＮＡのシード領域および３’－ＵＴＲは、ＲＮＡｉ認識における重要な決定要素である。
【0064】
本明細書で使用される場合、「オフターゲット遺伝子サイレンシング」は、ＲＮＡｉのシード領域と、意図されないｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ中の配列との対合を指し、翻訳の抑制およびそれらの転写物の不安定化を導く（例えば、意図されないｍＲＮＡの発現を低減する）。
【0065】
本明細書における値またはパラメーターに「関して」という言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とした実施形態を包含する（説明する）。例えば、「Ｘに関して」と言及されている説明は、「Ｘ」の説明を包含する。
【0066】
単数形の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、複数形の指示対象も包含する。
【0067】
本明細書に記載の開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および／または「本質的にからなる」ことを包含することが理解される。
【0068】
ＩＩＩ．ＲＮＡｉ
一部の態様において、本発明の開示は、改良されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導するおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子として、当業界において公知である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列も、人工ｍｉＲＮＡ足場（「ｓｈｍｉＲＮＡ」）中に挿入することができる。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導する短いループ（例えば、約４～１１ヌクレオチド）によって連結されている二本鎖ＲＮＡの長さおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対を含むＲＮＡ分子として、当業界において公知である。
一部の態様において、本発明の開示は、改良されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導するおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子として、当業界において公知である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列も、人工ｍｉＲＮＡ足場（「ｓｈｍｉＲＮＡ」）中に挿入することができる。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導する短いループ（例えば、約４～１１ヌクレオチド）によって連結されている二本鎖ＲＮＡの長さおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対を含むＲＮＡ分子として、当業界において公知である。
【0069】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導し、ループによって連結されている二本鎖ＲＮＡの短い（例えば、１９～２５塩基対の）配列を含み、かつ１つまたはそれ以上のバルジ（例えば、誤対合したかまたは非対合の塩基対）を含む二本鎖ＲＮＡの１つまたはそれ以上の追加の配列を含有するＲＮＡ分子として、当業界において公知である。本明細書で使用される場合、用語「ｍｉＲＮＡ」は、内因性ｍｉＲＮＡおよび外因性または異種ｍｉＲＮＡを包含する。一部の実施形態において、「ｍｉＲＮＡ」は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡプロセシング中に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ転写物が生じる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａ－ＤＧＣＲ８によってプロセシングされ、５’フランキング領域、ガイド鎖、ループ領域、非ガイド鎖、および３’フランキング領域；または５’フランキング領域、非ガイド鎖、ループ領域、ガ
イド鎖、および３’フランキング領域を有するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが残るように１つまたはそれ以上の配列を切り出すことによってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを生じる。次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされて、ガイド鎖および非ガイド（またはパッセンジャー）鎖を有するｓｉＲＮＡを生じる。次いで、ガイド鎖をＲＩＳＣ複合体が使用して、例えば、ガイド鎖に対して相補的な標的ＲＮＡ配列を認識することによって、遺伝子サイレンシングを触媒する。ｍｉＲＮＡのさらなる説明は、例えば、ＷＯ２００８／１５０８９７において見出すことができる。ｍｉＲＮＡによる標的配列の認識は、主として、標的とｍｉＲＮＡのシード配列、例えばガイド鎖のヌクレオチド１～８（５’から３’に向かって）との対合によって決定される（例えば、Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｒ．Ｌ．ら（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：ｅ９を参照）。
イド鎖、および３’フランキング領域を有するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが残るように１つまたはそれ以上の配列を切り出すことによってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを生じる。次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされて、ガイド鎖および非ガイド（またはパッセンジャー）鎖を有するｓｉＲＮＡを生じる。次いで、ガイド鎖をＲＩＳＣ複合体が使用して、例えば、ガイド鎖に対して相補的な標的ＲＮＡ配列を認識することによって、遺伝子サイレンシングを触媒する。ｍｉＲＮＡのさらなる説明は、例えば、ＷＯ２００８／１５０８９７において見出すことができる。ｍｉＲＮＡによる標的配列の認識は、主として、標的とｍｉＲＮＡのシード配列、例えばガイド鎖のヌクレオチド１～８（５’から３’に向かって）との対合によって決定される（例えば、Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｒ．Ｌ．ら（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：ｅ９を参照）。
【0070】
ｐｒｉ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造において、二重鎖中のガイド鎖：非ガイド鎖の境界は、部分的に、相補的な塩基対合（例えば、ワトソン－クリック旗の塩基対合）を介して形成される。しかしながら、一部の実施形態において、この相補的な塩基対合は、二重鎖全体に及ばない。一部の実施形態において、境界中のバルジは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド位置に存在する。本明細書で使用される場合、用語「バルジ」は、二重鎖中でそれと反対側の核酸に対して非相補的である核酸の領域を指す。一部の実施形態において、バルジは、中央の非相補的領域の領域は結合しないが、相補的核酸の領域が互いに結合する場合に形成される。一部の実施形態において、バルジは、２つの相補的領域間に位置する核酸の２つの鎖が異なる長さを有する場合に形成される。後述するように、バルジは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。
【0071】
別の態様において、本開示において記載されるＲＮＡｉは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）に対して阻害性である。一部の実施形態において、ＳＮＣＡは、マウスＳＮＣＡである。一部の実施形態において、ＳＮＣＡは、ヒトＳＮＣＡである。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、ＳＮＣＡをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、対象におけるＳＮＣＡの発現を阻害する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、対象におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害する。一部の実施形態において、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【0072】
ＲＮＡｉベースの治療の安全性は、意図されないｍＲＮＡに結合してそれらの発現を低減する低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の能力、すなわちオフターゲット遺伝子サイレンシングとして公知の作用によって妨害される。オフターゲティングは、主として、シード領域（低分子ＲＮＡのヌクレオチド２～８）が意図されないｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ中の配列と対合して、翻訳の抑制およびそれらの転写物の不安定化を導く場合に起こる。オフターゲティングが低減されたＲＮＡｉは、ガイドおよび非ガイド配列内の塩基を置換すること；例えばＣｐＧモチーフを創出することによって、設計することができる。より有意に低いオフターゲットスコアをもたらす可能性がある置換は、ＳｉＳＰＯＴＲアルゴリズム、すなわちオフターゲティングの可能性および有力なサイレンシング能力が最小の候補配列を同定する特異性に焦点を当てたｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して評価することができる（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１月；４１（１）ｅ９頁）。ＳｉＳＰＯＴＲスコアの低減により、親のＲＮＡｉ分子と比較してより少数の可能性のあるヒトのオフターゲットを有する配列が予測される。本発明の開示の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減するように改善される。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
【0073】
一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡ（例えば、ＲＮＡリンカー）によって連結されている。一般的に当業界において公知であるように、ＲＮＡループ構造（例えば、ステム－ループまたはヘアピン）は、ＲＮＡ分子が、互いに塩基対合しないＲＮＡの配列によって隔てられた、互いに塩基対合するＲＮＡの２つの配列を含む場合に形成される。例えば、配列ＡおよびＣは、互いに塩基対合するように、相補的であるかまたは部分的に相補的であるが、配列Ｂ中の塩基は一緒に塩基対合しない場合、ＲＮＡ分子Ａ－Ｂ－Ｃでループ構造が形成される可能性がある。一部の実施形態において、ループ配列は、ＤＮＡ形態の５’－ＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣ－３’（配列番号５９）またはＲＮＡ形態の５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0074】
一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、４から５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、１３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループを形成することが可能なＲＮＡ中のヌクレオチドの数は、４から５０ヌクレオチドまたはその間の任意の整数である。一部の実施形態において、ループの０～５０％は、ループの別の部分に対して相補的である。本明細書で使用される場合、用語「ループ構造」は、核酸の２つの相補鎖をつなぐ配列である。一部の実施形態において、ループ構造の１～３ヌクレオチドは核酸の相補鎖に隣接しており、ループ構造の遠位部分の１～３ヌクレオチドに対して相補的である。例えば、ループ構造の５’末端における３つのヌクレオチドは、ループ構造の３’末端における３つのヌクレオチドに対して相補的である。
【0075】
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、異種ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、異種ｍｉＲＮＡ足場の使用は、ｍｉＲＮＡ発現を調節する；例えば、ｍｉＲＮＡ発現を増加させるかまたはｍｉＲＮＡ発現を減少させるために使用される。当業界において公知のいずれかのｍｉＲＮＡ足場を使用することができる。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲ－１５５足場から誘導される（例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５～９頁およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキットを参照）。
【0076】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、表１から選択される。
【0077】
一部の実施形態において、第１の鎖は、いずれかのガイド配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の鎖は、いずれかのガイド配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第２の鎖は、対応するパッセンジャー配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、対応するパッセンジャー配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。
【0078】
【表1】
【0079】
ＩＶ．神経変性シヌクレイン病
神経変性シヌクレイン病は、ニューロン、神経線維またはグリア細胞におけるアルファ
－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）タンパク質レベルの上昇によって特徴付けられる神経変性疾患である。主なタイプの神経変性シヌクレイン病として、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、パーキンソン病、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。
神経変性シヌクレイン病は、ニューロン、神経線維またはグリア細胞におけるアルファ
－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）タンパク質レベルの上昇によって特徴付けられる神経変性疾患である。主なタイプの神経変性シヌクレイン病として、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、パーキンソン病、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。
【0080】
神経変性シヌクレイン病の例としては、これらに限定されないが、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ－ＰおよびＭＳＡ－Ｃ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、純粋自律神経失調症（ＰＡＦ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント（ＬＢＶＡＤ）、レビー小体嚥下障害、および偶発性レビー小体病が挙げられる。
【0081】
複数のエビデンスによって、アルファ－シヌクレインレベルの上昇は神経毒性をもたらす
一方、低下は神経保護的であることが実証されている（Ｄａｕｅｒ、２００２；Ｄｒｏｌｅｔ、２００４；Ａｌｖａｒｅｚ－Ｆｉｓｃｈｅｒ、２００８；Ｋｌｉｖｅｎｙｉ、２００５；Ｍｉｔｔａｌ、２０１７；Ｊａｖｅｄ、２０１５；Ｃｏｌｅ、２０１７；Ｕｂｈｉ、２０１０；Ｌｉｍ、２０１１）。本開示において、ＳＮＣＡに対するＲＮＡｉが提供される。
一方、低下は神経保護的であることが実証されている（Ｄａｕｅｒ、２００２；Ｄｒｏｌｅｔ、２００４；Ａｌｖａｒｅｚ－Ｆｉｓｃｈｅｒ、２００８；Ｋｌｉｖｅｎｙｉ、２００５；Ｍｉｔｔａｌ、２０１７；Ｊａｖｅｄ、２０１５；Ｃｏｌｅ、２０１７；Ｕｂｈｉ、２０１０；Ｌｉｍ、２０１１）。本開示において、ＳＮＣＡに対するＲＮＡｉが提供される。
【0082】
Ｖ．神経変性シヌクレイン病を処置するための方法
一部の態様において、本発明の開示は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。
一部の態様において、本発明の開示は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法および組成物であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を投与することを含む方法および組成物を提供する。
【0083】
一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病の症状を緩和するための方法および組成物であって、哺乳動物の神経系に、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を投与することを含む方法および組成物を提供する。一部の実施形態において、神経変性シヌクレイン病の症状としては、これらに限定されないが、パーキンソン症候群、認知障害、睡眠障害、幻視、発語障害、便秘、錐体路または小脳徴候、嗅覚消失、自律神経障害、例えば、起立性低血圧、低発汗、勃起不全、尿貯留または失禁および瞳孔機能障害が挙げられる。
【0084】
一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病の進行を予防するかまたは遅延させる方法を提供する。シヌクレイン病様ＰＤは、典型的には、振戦、動作緩慢、筋強剛、および姿勢動揺の存在によって臨床的に診断される。ＰＤからの識別は、典型的には、起立性低血圧、錐体路徴候、認知の変化または幻覚などの追加の徴候をチェックすることによって実行される。さらに、一部のシヌクレイン病は、脳の画像化によって、例えば、ＭＳＡにおける脳橋、小脳、被殻などの脳領域における異常を探すことによって、診断することができる。一部のシヌクレイン病は、ＳＮＣＡ遺伝子に必ずしも限定されない一般的突然変異に対する遺伝子型分類によって、直接的に同定することができる。疾患進行の遅延または予防は、以下の症状のいずれかにおける改善によって定義される：運動機能（動作緩慢、ジスキネジア、ジストニア、姿勢動揺、前屈姿勢、振戦、ミオクローヌスなど）、認知、睡眠障害、幻視、発語、便秘、錐体路徴候、嗅覚消失、自律神経障害、例えば、起立性低血圧、低発汗、勃起不全、尿貯留または失禁および瞳孔機能障害。
【0085】
本発明の開示の一部の態様において、本方法および組成物は、神経変性シヌクレイン病を有するヒトを処置するために使用される。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡ ｍＲＮＡを標的化するための、改善されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号５３の残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0086】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号３７のＡ残基１９は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0087】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＣＧＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号１４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＧＵＡ－３’（配列番号４３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号４３の残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0088】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ＵＧＧＧＣＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＣＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号３６の残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0089】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’－ｕＵＣＣＡＡＣＡＵＵＵＧＵＣＡＣＵＵＧＣＵ－３’（配列番号５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＡＧ
ＣＡＡＧＵＧＡＡＡＵＧＵＵＣＧＡＡ－３’（配列番号３４）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号３４の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
ＣＡＡＧＵＧＡＡＡＵＧＵＵＣＧＡＡ－３’（配列番号３４）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し、第２の鎖の配列番号３４の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0090】
本発明の開示の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減するように改善される。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
【0091】
一部の実施形態において、本発明の開示は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号２４に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号２４に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0092】
一部の実施形態において、本発明の開示は、哺乳動物の神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成す
る、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号８に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号３７に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
る、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することであって、第１の鎖および第２の鎖が二本鎖を形成する、投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのパッセンジャー鎖から２塩基（パッセンジャー鎖の開始点から数えて、塩基９～１０）を欠失することによって生じる内部バルジを含む。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号８に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号３７に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高いパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ配列によって連結されている。一部の実施形態において、ループ配列は、５’－ＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣ－３’（配列番号６０）である。
【0093】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導する、長さおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子として、当業界において公知である。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、細胞中でＲＮＡｉを誘導する短いループ（例えば、約４～１１ヌクレオチド）によって連結された二本鎖ＲＮＡのおよそ１９～２５（例えば、１９～２３）塩基対を含むＲＮＡ分子として、当業界において公知である。
【0094】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号２４に対して約９０％同一であるガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号２４に対して約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％のいずれかで同一であるガイド配列を含む。
【0095】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号２４に対して約９０％同一である非ガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号５３に対して約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％のいずれかで同一である非ガイド配列を含む。本明細書に記載のいずれかのＲＮＡｉ（例えば、ｒＡＡＶベクターの一部）は、とりわけ、神経変性シヌクレイン病を処置する際に利用することができる。別の態様において、神経変性シヌクレイン病を処置する際に、表１に記載されるいずれかのＲＮＡｉを使用することができる。
【0096】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号８に対して約９０％同一であるガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号８に対して約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％のいずれかで同一であるガイド配列を
含む。
含む。
【0097】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号３７に対して約９０％同一である非ガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号３７に対して約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％のいずれかで同一である非ガイド配列を含む。本明細書に記載のいずれかのＲＮＡｉ（例えば、ｒＡＡＶベクターの一部）は、とりわけ、神経変性シヌクレイン病を処置する際に利用することができる。別の態様において、神経変性シヌクレイン病を処置する際に、表１に記載されるいずれかのＲＮＡｉを使用することができる。
【0098】
一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡによって連結されている。一般的に当業界において公知であるように、ＲＮＡループ構造（例えば、ステム－ループまたはヘアピン）は、ＲＮＡ分子が、一緒に塩基対合しないＲＮＡの配列によって隔てられた、互いに塩基対合するＲＮＡの２つの配列を含む場合に形成される。例えば、配列ＡおよびＣは、互いに塩基対合するように相補的であるかまたは部分的に相補的であるが、配列Ｂ中の塩基は一緒に塩基対合しない場合、ＲＮＡ分子Ａ－Ｂ－Ｃでループ構造が形成される可能性がある。
【0099】
一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、４から５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、１３ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、配列番号６０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号６０の配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0100】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の送達は、脳へのウイルス粒子の注射によってなされる。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の送達は、線条体へのウイルス粒子の注射によってなされる。線条体内投与は、高度に神経変性シヌクレイン病の影響を受けている脳、線条体（被殻および尾状核を包含する）の領域に、組換えウイルス粒子を送達することである。それに加えて、理論に縛られることは望まないが、線条体に注射された組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、これらに限定されないが、投射野（例えば、皮質または黒質）などの脳の他の領域に（例えば、逆行性輸送を介して）分散させることもできると考えられる。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、対流強化送達（例えば、線条体への対流強化送達）によって送達される。
【0101】
一部の態様において、本発明の開示は、哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物の細胞におけるＳＮＣＡの蓄積を阻害するための方法であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明の開示は、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物におけるＳＮＣＡの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、本発明の開示の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＳＮＣＡは、突然変異ＳＮＣＡ（例えば、Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０Ｐ、Ｇ５１Ｄ、Ｈ５０Ｑ、Ａ５３Ｅ、Ａ２９Ｓ、Ａ１８Ｔならびにその遺伝子座の二重複および三重複のうちの１つまたはそれ以上を含むヒトＳＮＣＡ突然変異）である。一部の実施形態において、野生型ＳＮＣＡの発現および／または蓄積も阻害される。本明細書に記載されるように、理論に縛られることは望まないが、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物における突然変異ＳＮＣＡの発現および／または
蓄積の阻害は、高度に有益であるが、副作用としての（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの）同じ哺乳動物における野生型ＳＮＣＡの発現および／または蓄積の阻害は良好に許容される（例えば、意図されない副作用をわずかに生じるかまたは生じない）と考えられる。
蓄積の阻害は、高度に有益であるが、副作用としての（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの）同じ哺乳動物における野生型ＳＮＣＡの発現および／または蓄積の阻害は良好に許容される（例えば、意図されない副作用をわずかに生じるかまたは生じない）と考えられる。
【0102】
一部の実施形態において、細胞はベクター（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする発現構築物を含むベクター）を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0103】
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を投与することによって、投与部位またはその付近にニューロン（例えば、有棘細胞などの線条体ニューロン）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％から約１００％、約１０％から約５０％、約１０％から約３０％、約２５％から約７５％、約２５％から約５０％、または約３０％から約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ－ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用を、発現を検出するのに使用することができる。
【0104】
本開示の一部の実施形態において、本方法は、哺乳動物の脳に、神経変性シヌクレイン病を有する哺乳動物、例えばヒトを処置するための本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を投与することを含む。一部の実施形態において、組成物を脳の１つまたはそれ以上の位置に注射し、少なくともニューロンにおいて本発明の開示のＲＮＡｉの発現を可能にする。一部の実施形態において、組成物を脳の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多い位置のうちのいずれか１つに注射する。一部の実施形態において、組成物は、線条体に注射される。一部の実施形態において、組成物は、背側線条体に注射される。一部の実施形態において、組成物は、被殻に注射される。一部の実施形態において、組成物は、尾状核に注射される。一部の実施形態において、組成物は、被殻および尾状核に注射される。一部の実施形態において、投与経路は、脳室内、大槽内または髄腔内注射によるＣＳＦ送達を含む。一部の実施形態において、投与は、ウイルスベクターの静脈内送達も含む。
【0105】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、脳の一方の半球に投与される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、脳の両方の半球に投与される。
【0106】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、１つより多くの位置に、同時にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間以下の間隔があけられる。
【0107】
一部の実施形態において、本発明の開示は、突然変異ＳＮＣＡの活性を抑制するために、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与することによって、神経変性シヌクレイン病を有するヒトを処置するための方法
を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。
を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。
【0108】
一部の実施形態において、本方法は、突然変異ＳＮＣＡの活性を抑制するために、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０１２から１６×１０１２、６×１０１２から７×１０１２、７×１０１２から８×１０１２、８×１０１２から９×１０１２、９×１０１２から１０×１０１２、１０×１０１２から１１×１０１２、１１×１０１２から１５×１０１２、１５×１０１２から２０×１０１２、２０×１０１２から２５×１０１２、２５×１０１２から３０×１０１２、３０×１０１２から５０×１０１２、または５０×１０１２から１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０１２から１０×１０１２、１０×１０１２から２５×１０１２、または２５×１０１２から５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０９から６×１０９、６×１０９から７×１０９、７×１０９から８×１０９、８×１０９から９×１０９、９×１０９から１０×１０９、１０×１０９から１１×１０９、１１×１０９から１５×１０９、１５×１０９から２０×１０９、２０×１０９から２５×１０９、２５×１０９から３０×１０９、３０×１０９から５０×１０９または５０×１０９から１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０９から１０×１０９、１０×１０９から１５×１０９、１５×１０９から２５×１０９、または２５×１０９から５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０から６×１０１０、６×１０１０から７×１０１０、７×１０１０から８×１０１０、８×１０１０から９×１０１０、９×１０１０から１０×１０１０、１０×１０１０から１１×１０１０、１１×１０１０から１５×１０１０、１５×１０１０から２０×１０１０、２０×１０１０から２５×１０１０、２５×１０１０から３０×１０１０、３０×１０１０から４０×１０１０、４０×１０１０から５０×１０１０、または５０×１０１０から１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０から１０×１０１０、１０×１０１０から１５×１０１０、１５×１０１０から２５×１０１０、または２５×１０１０から５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
【0109】
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１×１０８～約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０８～約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。
【0110】
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。
【0111】
本発明の開示の一部の実施形態において、線条体に注射される組成物の体積は、およそ、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬのいずれか１つ、またはその間のいずれかの量より多い。
【0112】
一部の実施形態において、組成物の第１の体積を脳の第１の領域に注射し、組成物の第２の体積を脳の第２の領域に注射する。例えば、一部の実施形態において、組成物の第１の体積を尾状核に注射し、組成物の第２の体積を被殻に注射する。一部の実施形態において、組成物の１Ｘ体積を尾状核に注射し、組成物の１．５Ｘ、２Ｘ、２．５Ｘ、３Ｘ、３．５Ｘ、または４Ｘ体積を被殻に注射し、ここで、Ｘは、およそ、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬのいずれか１つ、またはその間のいずれかの量より多い体積である。
【0113】
本発明の開示の組成物（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子）は、単独で、または神経変性シヌクレイン病を処置するための１つもしくはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。逐次的な投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間、または数日（または、代替としてそれ未満）の単位であってもよい。
【0114】
本開示において記載されるいずれかのＲＮＡｉ、発現構築物、ベクター、または細胞を上記いずれかの方法において使用することができる。一部の実施形態において、表１に開示されたいずれかのＲＮＡｉ、表１のＲＮＡｉを含む発現構築物、ベクター、または細胞を上記いずれかの方法において使用することができる。
【0115】
Ｖ．ＲＮＡｉ発現構築物およびベクター
本発明の開示は、本明細書に記載のＲＮＡｉの発現のための発現構築物、ベクターおよびウイルス粒子を提供する。
本発明の開示は、本明細書に記載のＲＮＡｉの発現のための発現構築物、ベクターおよびウイルス粒子を提供する。
【0116】
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、異種ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、異種ｍｉＲＮＡ足場の使用は、ｍｉＲＮＡ発現を調節する；例えば、ｍｉＲＮＡ発現を増加させるかまたはｍｉＲＮＡ発現を低下させるために使用される。当業界において公知のいずれかのｍｉＲＮＡ足場を使用することができる。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲ－１５５足場から誘導される（例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５～９頁およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキットを参照）。一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、配列
を含み、ここで、ｍｉＲＮＡは、太字のｇｃ残基の間に挿入される。
【化1】
【0117】
一部の実施形態において、足場のｍｉＲＮＡは、配列
を含み、下線を付した通常のテキストは５’フランクを表し、イタリックのテキストはガイド配列を表し、太字のテキストはループを表し、下線を付したイタリックは非ガイド配列を表し、通常のテキストは３’フランクを表す。
【化2】
【0118】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、アルファ－シヌクレインである。理論に縛られることは望まないが、その機能獲得が神経変性シヌクレイン病に関連しているポリペプチドの発現および／または活性を低減または消去するために、ＲＮＡｉを使用することができると考えられる。本発明の開示の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置することができる本発明の開示の神経変性シヌクレイン病の非限定的な例としては（標的化または供給される例示的な遺伝子が各障害の括弧内に与えられる）、パーキンソン病（ＳＮＣＡ）、多系統萎縮症またはＭＳＡ（ＳＮＣＡ）、およびレビー小体型認知症（ＳＮＣＡ）が挙げられる。
【0119】
一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉ）は、プロモーターに、機能するように連結されている。例示的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３～９）、ならびに延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７～２３およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２～１０）が挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターまたはサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであってもよい。一部の実施形態において、本発明の開示は、ＣＢＡプロモーターに、機能するように連結した、本発明の開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。例示的なプロモーターおよび説明は、例えば、米国付与前公報第２０１４０３３５０５４号に見い出すことができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ｈＥＦ１ａプロモーターである。
【0120】
構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１～５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。
【0121】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境要因、または具体的な生理学的条件の存在、例えば細胞の急性期、特定の分化状態によって制御される場合もあるし、または細胞の複製においてのみ制御される場合もある。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄなどの様々な商業的な供給源から入手可能である。他の多くの系が説明されており、当業者により容易に選択することができる。外因的に供給されたプロモーターによって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６～３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７～５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性の系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６～１７６９（１９９５）が挙げられる。Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２～５１８（１９９８））、ＲＵ４８６誘導性の系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９～２４３（１９９７）ならびにＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２～４４１（１９９７））およびラパマイシン誘導性の系（Ｍａｇａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５～２８７２（１９９７））も参照されたい。この状況において有用な可能性があるよりさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、具体的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって制御されるか、または細胞の複製においてのみ制御されるものである。
【0122】
別の実施形態において、導入遺伝子にとってネイティブのプロモーター、またはそれらのフラグメントが使用されると予想される。導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模擬することが望ましい場合、ネイティブのプロモーターが好ましい可能性がある。導入遺伝子の発現が、一時的もしくは発生的に、または組織特異的な方式で、または特異的な転写刺激に応答して制御されなければならない場合、ネイティブのプロモーターが使用される可能性がある。さらなる実施形態において、他のネイティブの発現コントロールエレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列も、ネイティブの発現を模擬するのに使用することができる。
【0123】
一部の実施形態において、制御配列は、組織特異的な遺伝子発現能をもたらす。一部のケースにおいて、組織特異的な制御配列は、組織特異的な方式で転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。このような組織特異的な制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は当業界において周知である。例示的な組織特異的な制御配列としては、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーター：ニューロンの、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３～１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１～５（１９９１））、およびニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３～８４（１９９５）
）が挙げられる。一部の実施形態において、組織特異的なプロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的なプロモーターは、当業者に明らかであると予想される。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーターである。
）が挙げられる。一部の実施形態において、組織特異的なプロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的なプロモーターは、当業者に明らかであると予想される。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーターである。
【0124】
一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。そのようなものとして、一部の実施形態において、本開示の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用することができる。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞において異種核酸を発現する。脳の細胞は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば感覚ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、錐体ニューロンなど）、グリア細胞（例えば小グリア細胞、大グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリアなど）、脳実質細胞、小グリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞などの当業界において公知のあらゆる脳の細胞を指すことができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞において異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。
【0125】
ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、およびグリア細胞において転写物（例えば、異種導入遺伝子）を発現する様々なプロモーターは当業界において公知であり、本明細書で記載される。このようなプロモーターは、通常、選択された遺伝子または異種制御配列と連結された制御配列を含んでいてもよい。多くの場合、有用な異種制御配列としては、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列から誘導された配列が挙げられる。例としては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子から誘導された配列も使用することができる。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ＣＮＳ特異的なプロモーターおよび誘導性プロモーターを使用してもよい。ＣＮＳ特異的なプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）などのＣＮＳ特異的な遺伝子から単離したプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、とりわけエクジソン、テトラサイクリン、メタロチオネイン、および低酸素に関するＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。
【0126】
本発明の開示は、本明細書に記載したように、ＲＮＡｉをコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を導入するため、またはＡＡＶウイルス粒子にパッケージ化するための組換えウイルスゲノムの使用を予期する。組換えウイルスゲノムは、ＲＮＡｉの発現を確立するためのあらゆるエレメント、例えば、プロモーター、異種核酸、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を包含し得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。
【0127】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子の有効量
を投与することにより、投与部位（例えば、線条体および／または皮質）かもしくはその近くで、または投与部位からより遠位で細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、および／またはグリア細胞）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ－ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用が、発現を検出するのに使用することができる。
を投与することにより、投与部位（例えば、線条体および／または皮質）かもしくはその近くで、または投与部位からより遠位で細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、および／またはグリア細胞）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ－ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用が、発現を検出するのに使用することができる。
【0128】
一部の態様において、本開示は、組換え自己相補性ゲノム（例えば、自己相補的なｒＡＡＶベクター）を含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ベクターゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；７，１２５，７１７号；７，４６５，５８３号；７，７８５，８８８号；７，７９０，１５４号；７，８４６，７２９号；８，０９３，０５４号；および８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇＺ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、異種核酸の相補的なコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成すると予想される。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列およびその核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。
【0129】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする第１の異種核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結されている。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号６９）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲのところでウイルスゲノムを切断しないと予想され、そのようなものとして、以下のもの：ＡＡＶのＩＴＲ、制御配列を包含する第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶのＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶのＩＴＲと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドを、５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのキャプシド中にパッケージ化されると予想される。
【0130】
ＶＩ．ウイルス粒子およびウイルス粒子を生産する方法
本発明の開示は、とりわけ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子、および哺乳動物における疾患または障害、例えば、神経変性シヌクレイン病を処置するために、それを使用する方法を提供する。
本発明の開示は、とりわけ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子、および哺乳動物における疾患または障害、例えば、神経変性シヌクレイン病を処置するために、それを使用する方法を提供する。
【0131】
ウイルス粒子
本発明の開示は、本明細書で開示されるＲＮＡｉを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、本明細書で開示される本発明の開示のＲＮＡｉを送達するためのウイルス粒子を提供する。例えば、本発明の開示は、哺乳動物における疾患または障害を処置するために、ＲＮＡｉを送達する組換えウイルス粒子；例えば、神経
変性シヌクレイン病を処置するために、ＲＮＡｉを含むｒＡＡＶ粒子を使用する方法を提供する。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲを端に有する本発明の開示のＲＮＡｉの配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている。ＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、核酸は、転写方向で構成要素に機能するように連結された目的のコード配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの核酸）、転写開始および終結配列を包含する制御配列を含み、それにより発現構築物が形成される。発現構築物は、５’および３’末端に少なくとも１つの機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列を有する。「機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列」は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージ化を目的としたＩＴＲ配列機能を意味する。全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６を参照されたい。本開示の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、少なくともキャプシド化に必須なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本開示のベクターで使用するためのＡＡＶのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有していなくてもよく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１で説明されている通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶのＩＴＲは、数々のＡＡＶ血清型のいずれかからから誘導されてもよい。４０種を超えるＡＡＶ血清型がこれまでに知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０を参照されたい。あらゆるＡＡＶ血清型の使用が、本開示の範囲内であるとみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＡＡＶ血清型から誘導されたベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、本明細書に記載されるＲＮＡｉをさらにコードする。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシド（例えば、ＷＯ２０１５１６８６６６に記載されるように）、ＡＡＶ９キャプシド、ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＰＨＰ．ｅＢキャプシド、またはＯｌｉｇ００１キャプシドを含む。
本発明の開示は、本明細書で開示されるＲＮＡｉを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、本明細書で開示される本発明の開示のＲＮＡｉを送達するためのウイルス粒子を提供する。例えば、本発明の開示は、哺乳動物における疾患または障害を処置するために、ＲＮＡｉを送達する組換えウイルス粒子；例えば、神経
変性シヌクレイン病を処置するために、ＲＮＡｉを含むｒＡＡＶ粒子を使用する方法を提供する。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲを端に有する本発明の開示のＲＮＡｉの配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている。ＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、核酸は、転写方向で構成要素に機能するように連結された目的のコード配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの核酸）、転写開始および終結配列を包含する制御配列を含み、それにより発現構築物が形成される。発現構築物は、５’および３’末端に少なくとも１つの機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列を有する。「機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列」は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージ化を目的としたＩＴＲ配列機能を意味する。全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６を参照されたい。本開示の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、少なくともキャプシド化に必須なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本開示のベクターで使用するためのＡＡＶのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有していなくてもよく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１で説明されている通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶのＩＴＲは、数々のＡＡＶ血清型のいずれかからから誘導されてもよい。４０種を超えるＡＡＶ血清型がこれまでに知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０を参照されたい。あらゆるＡＡＶ血清型の使用が、本開示の範囲内であるとみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＡＡＶ血清型から誘導されたベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、本明細書に記載されるＲＮＡｉをさらにコードする。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシド（例えば、ＷＯ２０１５１６８６６６に記載されるように）、ＡＡＶ９キャプシド、ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＰＨＰ．ｅＢキャプシド、またはＯｌｉｇ００１キャプシドを含む。
【0132】
例えば、ＡＡＶにおける核酸は、本発明において予期されるいずれかのＡＡＶ血清型の少なくとも１つのＩＴＲを含み、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉをさらにコードすることができ、ａ）第１の鎖および第２の鎖は二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖はガイド領域を含み、かつｃ）第２の鎖は非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、ガイド鎖にバルジを創出するために、塩基９および１０において２つのヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸
を含む第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、表１から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、第１および第２の鎖は、表１から選択される。
を含む第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、表１から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、以下のものをコードする５’から３’への核酸を含む：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）。一部の実施形態において、第１および第２の鎖は、表１から選択される。
【0133】
一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を包含していてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、Ａ１ＡＴスタッファー核酸である。
【0134】
一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、配列番号６５の核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、配列番号６５に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２のキャプシドタンパク質、またはこれらのキャプシドタンパク質の突然変異体を含む。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドを含む（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２）。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏ、ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１）。
ｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２）。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏ、ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１）。
【0135】
特定の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、罹患組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なるＡＡＶ血清型が使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混成の血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲを含んでいてもよいし、またはｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１のＩＴＲを含んでいてもよい。ｒＡＡＶ粒子生産のためのＡＡＶ血清型のあらゆる組合せが、本明細書に各組合せが明示的に述べられているものとして本明細書で提供される。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ１キャプシドおよび少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲを端に有する本発明の開示のｒＡＡＶベクター（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物）を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ２キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシド（例えば、ＷＯ２０１５１６８６６６に記載されるように）、ＡＡＶ９キャプシド、ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＰＨＰ．ｅＢキャプシド、またはＯｌｉｇ００１を含む。
【0136】
一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；７，１２５，７１７号；７，４６５，５８３号；７，７８５，８８８号；７，７９０，１５４号；７，８４６，７２９号；８，０９３，０５４号；および８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇＺ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってそれら全体が開示に組み入れられる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、導入遺伝子の相補的なコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することになる。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、ｒＡＡＶゲノムが第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉ）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉのアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列が、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２のポリヌクレオチド配列と鎖内の塩基対を形成することができる、ＡＡＶウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内の塩基対合を容易にする配列；例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連結されている。ヘアピン構造は、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子において当業界において公知である。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結されている。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃａａａｇｃｃｃｇｇｇｃｇｔｃｇｇｇｃｇａｃｃｔｔｔｇｇｔｃｇｃｃｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔ－３’（配列番号７０）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲのところでウイルスゲノムを切断しないと予想され、そのようなものとして、以下のもの：ＡＡＶのＩＴＲ、制御配列を包含する第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶのＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶのＩＴＲと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドを、５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのキャプシド中にパッケージ化されると
予想される。一部の実施形態において、本発明は、機能的なＡＡＶ２のＩＴＲ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする第１のポリヌクレオチド配列、Ｄ領域の欠失を含み、かつ機能的な末端分解配列を欠く突然変異ＡＡＶ２のＩＴＲ、第１のポリヌクレオチド配列の、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする配列に対して相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチド配列および機能的なＡＡＶ２のＩＴＲを含む組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。
予想される。一部の実施形態において、本発明は、機能的なＡＡＶ２のＩＴＲ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする第１のポリヌクレオチド配列、Ｄ領域の欠失を含み、かつ機能的な末端分解配列を欠く突然変異ＡＡＶ２のＩＴＲ、第１のポリヌクレオチド配列の、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする配列に対して相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチド配列および機能的なＡＡＶ２のＩＴＲを含む組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。
【0137】
ウイルス粒子の生産
当業界において公知の方法を使用して、ｒＡＡＶ粒子を生産することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号；同第６，９８９，２６４号；および同第６，９９５，００６号を参照。本発明を実施する際に、ｒＡＡＶ粒子を生産するための宿主細胞としては、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定して維持されるパッケージ細胞またはＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されるプロデューサー細胞でもある。例示的なパッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞から誘導される。ＡＡＶベクターは、当業界において公知の標準的技法を使用して精製および製剤化される。
当業界において公知の方法を使用して、ｒＡＡＶ粒子を生産することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号；同第６，９８９，２６４号；および同第６，９９５，００６号を参照。本発明を実施する際に、ｒＡＡＶ粒子を生産するための宿主細胞としては、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定して維持されるパッケージ細胞またはＡＡＶベクターゲノムが安定して維持されるプロデューサー細胞でもある。例示的なパッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞から誘導される。ＡＡＶベクターは、当業界において公知の標準的技法を使用して精製および製剤化される。
【0138】
ｒＡＡＶベクターを生産するための当業界において公知の方法としては、これらに限定されないが、トランスフェクション、安定な細胞株の生産、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドなどの感染性のハイブリッドウイルスの生産系が挙げられる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生産するためのｒＡＡＶ生産培養は全て、１）好適な宿主細胞、例えば、ヒトから誘導された細胞株、例えばＨｅＬａ、Ａ５４９、または２９３細胞、または昆虫から誘導された細胞株、例えばバキュロウイルス生産系のケースではＳＦ－９など；２）野生型または突然変異アデノウイルス（例えば温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接する核酸（例えば治療用核酸）；ならびに５）ｒＡＡＶ生産を支持する好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、あらゆるＡＡＶ血清型由来でもよい。一般的に、ただし必須ではないが、ｒｅｐ遺伝子産物が複製されるように機能してｒＡＡＶゲノムをパッケージ化できる限りは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物は、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型を有する。ｒＡＡＶベクターを生産するために、当業界において公知の好適な培地を使用することができる。これらの培地としては、これらに限定されないが、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産された培地、例えば改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）など、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されたもの、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地などの特注の調合物が挙げられ、これらのそれぞれは、特に組換えＡＡＶベクターの生産で使用するための特注の培地調合物に関して、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。
【0139】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、三重のトランスフェクション方法、例えば下記に示される例示的な三重のトランスフェクション方法によって生産することができる
。簡単に言えば、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、（例えば、リン酸カルシウム方法を使用して）細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトしてもよいし、さらに、ウイルスを収集し、場合により精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。
。簡単に言えば、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、（例えば、リン酸カルシウム方法を使用して）細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトしてもよいし、さらに、ウイルスを収集し、場合により精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。
【0140】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株の方法、例えば下記に示される例示的なプロデューサー細胞株の方法によって生産することができる（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３～２６９で参照されているものも参照されたい）。簡単に言えば、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）は、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター－異種核酸配列を含有するプラスミドで安定してトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングしてｒＡＡＶ生産のためのリードクローンを選択してもよいし、次いでこれを生産バイオリアクターに拡大して、ｒＡＡＶ生産を開始させるためのヘルパーとしてアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）で感染させることもできる。その後ウイルスを回収してもよいし、アデノウイルスを不活性化させるか（例えば、熱によって）および／または除去してもよいし、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって、ｒＡＡＶ粒子を生産した。
【0141】
一部の態様において、本明細書で開示されるいずれかのｒＡＡＶ粒子を生産するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が生産される条件下で宿主細胞を培養することであって、宿主細胞が、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であって、前記ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれが、ＡＡＶの複製および／またはキャプシド化タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する本明細書に記載される本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶのヘルパー機能を含む、培養すること；ならびに（ｂ）宿主細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を回収することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号６１（図１Ａ）または配列番号６３（図１Ｂ）のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲなどからなる群より選択される。一部の実施形態において、前記キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、またはバリアントＡＡＶ６キャプシド、例えば、米国付与前公報第２０１２／０１６４１０６号に記載のＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国付与前公報第２０１３／０３２３２２６号に記載の改変されたＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンキャプシド突然変異体、ヘパリン結合キャプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９キャプシド、または米国付与前公報第２０１２／００６６７８３号に記載の他のいずれかのキャプシド）、ＡＡＶ２
Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キ
メラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号または国際公報ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶキャプシドからなる群より選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＷＯ２０１５１６８６６６に記載されるＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢまたはＯｌｉｇ００１キャプシドである。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドタンパク質である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドおよびＡＡＶ２のＩＴＲおよび本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えゲノムを含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。用語「精製される」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するかまたはそれから最初に調製されるときに存在する可能性もある他の要素の少なくとも一部を欠いているｒＡＡＶ粒子の調製物を包含する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解産物または生産培養上清などの源となる混合物からそれを富化するための精製技術を使用して調製することができる。富化は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率、または感染力などによって測定してもよいし、または富化は、源となる混合物中に存在する第２の干渉する可能性がある物質、例えば生産培養物の汚染物質などの汚染物質、またはヘルパーウイルス、培地の要素などの製造過程の汚染物質に関して測定することができる。
Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キ
メラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号または国際公報ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶキャプシドからなる群より選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＷＯ２０１５１６８６６６に記載されるＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢまたはＯｌｉｇ００１キャプシドである。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドタンパク質である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドおよびＡＡＶ２のＩＴＲおよび本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えゲノムを含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。用語「精製される」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するかまたはそれから最初に調製されるときに存在する可能性もある他の要素の少なくとも一部を欠いているｒＡＡＶ粒子の調製物を包含する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解産物または生産培養上清などの源となる混合物からそれを富化するための精製技術を使用して調製することができる。富化は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率、または感染力などによって測定してもよいし、または富化は、源となる混合物中に存在する第２の干渉する可能性がある物質、例えば生産培養物の汚染物質などの汚染物質、またはヘルパーウイルス、培地の要素などの製造過程の汚染物質に関して測定することができる。
【0142】
アデノウイルスベクター粒子を生産するための多数の方法が当業界において公知である。例えば、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターでは、アデノウイルスベクターのゲノムおよびヘルパーアデノウイルスのゲノムが、パッケージ細胞株（例えば、２９３細胞株）中にトランスフェクトされる。一部の実施形態において、ヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージングシグナルに隣接する組換え部位を含有し、かつ両ゲノムは、リコンビナーゼを発現するパッケージ細胞株中にトランスフェクトされ（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを使用することができる）、その結果、目的のアデノウイルスベクターは、ヘルパーアデノウイルスよりも効率的にパッケージ化される（例えば、Ａｌｂａ， Ｒ． ら （２００５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１８～２７頁を参照）。アデノウイルスベクターは、本明細書に記載のものなど、標準的な方法を使用して回収および精製することができる。
【0143】
レンチウイルスベクター粒子を生産するための多数の方法が当業界において公知である。例えば、第三世代のレンチウイルスベクターでは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を有する目的のレンチウイルスゲノムを含有するベクターは、ｒｅｖ遺伝子を含有するベクターと一緒にパッケージ細胞株（例えば、２９３細胞株）中に同時にトランスフェクトされる。目的のレンチウイルスゲノムは、Ｔａｔの非存在下で転写を促進するキメラＬＴＲも含有する（Ｄｕｌｌ， Ｔ．ら（１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３～７１頁を参照）。レンチウイルスベクターは、本明細書に記載の方法（例えば、Ｓｅｇｕｒａ ＭＭら （２０１３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． １３（７）：９８７～１０１１頁）を使用して回収および精製することができる。
【0144】
ＨＳＶ粒子を生産するための多数の方法が当業界において公知である。ＨＳＶベクターは、本明細書に記載のものなど、標準的な方法を使用して回収および精製することができる。例えば、複製－欠陥ＨＳＶベクターでは、前初期（ＩＥ）遺伝子の全てを欠く目的のＨＳＶゲノムは、ウイルス生産に必要な遺伝子、例えば、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ０を提供する相補性細胞株中にトランスフェクトされる（例えば、Ｓａｍａｎｉｅ
ｇｏ， Ｌ．Ａ．ら（１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：３３０７～２０頁を参照）。ＨＳＶベクターは、記載される方法（例えば、Ｇｏｉｎｓ， ＷＦら、（２０１４）
Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁）を使用して回収および精製することができる。
ｇｏ， Ｌ．Ａ．ら（１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：３３０７～２０頁を参照）。ＨＳＶベクターは、記載される方法（例えば、Ｇｏｉｎｓ， ＷＦら、（２０１４）
Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁）を使用して回収および精製することができる。
【0145】
本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書において提供される。医薬組成物は、本明細書に記載のあらゆる投与様式に好適である。本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子の医薬組成物を脳に導入することができる。例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子を線条体内に投与することができる。ｒＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＨＳＶ粒子を含む、本発明の開示の組換えウイルス粒子のいずれかを使用することができる。
【0146】
一部の実施形態において、本明細書に記載の本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。このような担体は当業界において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射（例えば、線条体内への投与）に好適である。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えレンチウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射（例えば、線条体内への投与）に好適である。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えアデノウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射（例えば、線条体内への投与）に好適である。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えＨＳＶ粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射（例えば、線条体内への投与）に好適である。
【0147】
このような医薬的に許容される担体は、滅菌された液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油などであってもよい。塩類溶液および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために採用することができる。医薬組成物は、追加成分、例えば保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性の湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、単回単位の剤形または複数回投与の剤形でパッケージ化することができる。組成物は、一般的に、滅菌された実質的に等張の溶液として製剤化される。
【0148】
ＶＩＩ．製造品およびキット
本明細書に記載の方法において使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様において、キットは、好適なパッケージにおいて、本明細書に記載の組成物（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子などの、本発明の開示の組換えウイルス粒子）を含む。本明細書に記載の組成物（例えば、線条体内組成物）のための好適なパッケージは、当業界において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ（例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製造品をさらに滅菌および／または密封することができる。
本明細書に記載の方法において使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様において、キットは、好適なパッケージにおいて、本明細書に記載の組成物（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子などの、本発明の開示の組換えウイルス粒子）を含む。本明細書に記載の組成物（例えば、線条体内組成物）のための好適なパッケージは、当業界において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ（例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製造品をさらに滅菌および／または密封することができる。
【0149】
本発明は、本明細書に記載の組成物を含むキットも提供し、本明細書に記載の使用など、組成物を使用する方法に関する説明書をさらに含んでもよい。本明細書に記載のキット
は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載のいずれかの方法を実行するための説明書を含む添付文書などの、商業的および使用者の観点から所望の他の材料をさらに含んでもよい。例えば、一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される霊長類に対して、哺乳動物の脳内に少なくとも１×１０９ゲノムコピーを送達するために（例えば、線条体内への投与）本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子、霊長類の脳内に注射するのに好適な医薬的に許容される担体、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および霊長類の脳内への注射を実行（例えば、線条体内への投与）するための説明書を含む添付文書のうちの１つまたはそれ以上の組成物を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えウイルス粒子を用いて、神経変性シヌクレイン病を処置するための説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って、本明細書に記載の組換えウイルス粒子を使用するための説明書を含む。
は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載のいずれかの方法を実行するための説明書を含む添付文書などの、商業的および使用者の観点から所望の他の材料をさらに含んでもよい。例えば、一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される霊長類に対して、哺乳動物の脳内に少なくとも１×１０９ゲノムコピーを送達するために（例えば、線条体内への投与）本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子、霊長類の脳内に注射するのに好適な医薬的に許容される担体、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および霊長類の脳内への注射を実行（例えば、線条体内への投与）するための説明書を含む添付文書のうちの１つまたはそれ以上の組成物を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えウイルス粒子を用いて、神経変性シヌクレイン病を処置するための説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って、本明細書に記載の組換えウイルス粒子を使用するための説明書を含む。
【0150】
ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
１．第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、ガイド領域を含み、ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびにｃ）第２の鎖は、非ガイド領域を含む、ＲＮＡｉ。
１．第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二本鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、ガイド領域を含み、ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびにｃ）第２の鎖は、非ガイド領域を含む、ＲＮＡｉ。
【0151】
２．ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）を含む、実施形態１のＲＮＡｉ。
【0152】
３．第１の鎖は、配列番号２４に対して約９０％の同一性または配列番号５３に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１のＲＮＡｉ。
【0153】
４．ガイド領域は、核酸配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）を含み、非ガイド領域は、配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）を含む、実施形態１のＲＮＡｉ。
【0154】
５．第２の鎖は、配列番号３７に対して約９０％の同一性または配列番号３７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１のＲＮＡｉ。
【0155】
６．第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、実施形態１～５のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0156】
７．ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む、実施形態６のＲＮＡｉ。
【0157】
８．ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む、実施形態６または７のＲＮＡｉ。
【0158】
９．ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む、実施形態６～８のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0159】
１０．ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む、実施形態６～８のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0160】
１１．ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む、実施形態１０のＲＮＡｉ。
【0161】
１２．ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、実施形態１１のＲＮＡｉ。
【0162】
１３．ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、実施形態１～１２のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0163】
１４．ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、実施形態１～１３のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0164】
１５．ポリペプチドは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）である、実施形態１４のＲＮＡｉ。
【0165】
１６．アルファシヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレインである、実施形態１５のＲＮＡｉ。
【0166】
１７．神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、実施形態１４～１６のいずれか１つのＲＮＡｉ。
【0167】
１８．実施形態１～１７のいずれか１つのＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物。
【0168】
１９．ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、実施形態１８の発現構築物。
【0169】
２０．ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている、実施形態１８または１９の発現構築物。
【0170】
２１．プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ
ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される、実施形態２０の発現構築物。
ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される、実施形態２０の発現構築物。
【0171】
２２．イントロンをさらに含む、実施形態１８～２１のいずれか１つの発現構築物。
【0172】
２３．イントロンは、ＣＢＡイントロンまたはｈＥＦ１アルファイントロンである、実施形態２２の発現構築物。
【0173】
２４．イントロンは、キメライントロンである、実施形態２２の発現構築物。
【0174】
２５．発現ベクターは自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである、実施形態２２の発現構築物。
【0175】
２６．ポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態１８～２５のいずれか１つの発現構築物。
【0176】
２７．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである、実施形態２６の発現構築物。
【0177】
２８．実施形態１８～２７のいずれか１つの発現構築物を含むベクター。
【0178】
２９．組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、実施形態２８のベクター。
【0179】
３０．発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する、実施形態２９のｒＡＡＶベクター。
【0180】
３１．発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する、実施形態３０のｒＡＡＶベクター。
【0181】
３２．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、実施形態３０または３１のｒＡＡＶベクター。
【0182】
３３．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、実施形態３０～３２のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
【0183】
３４．スタッファー核酸をさらに含む、実施形態３０～３３のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
【0184】
３５．スタッファー核酸は、ＲＮＡｉをコードする核酸の上流または下流に配置されている、実施形態３４のｒＡＡＶベクター。
【0185】
３６．自己相補的なｒＡＡＶベクターである、実施形態３０～３５のいずれか１つのｒＡＡＶベクター。
【0186】
３７．ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、実施形態３６のｒＡＡＶベクター。
【0187】
３８．第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、実施形態３７のｒＡＡＶベクター。
【0188】
３９．実施形態２９～３８いずれか１つのｒＡＡＶベクターを含む細胞。
【0189】
４０．実施形態２９～３８のいずれか１つのｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子
。
。
【0190】
４１．ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、実施形態４０のｒＡＡＶ粒子。
【0191】
４２．ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、実施形態４０または４１のｒＡＡＶ粒子。
【0192】
４３．ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、実施形態４０または４１のｒＡＡＶ粒子。
【0193】
４４．ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、実施形態４３のｒＡＡＶ粒子。
【0194】
４５．実施形態４０～４４のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
【0195】
４６．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態４５の組成物。
【0196】
４７．実施形態１～１７のいずれか１つのＲＮＡｉを含むキット。
【0197】
４８．実施形態４０～４４のいずれか１つのＡＡＶ粒子を含むキット。
【0198】
４９．実施形態４５または４６の組成物を含むキット。
【0199】
５０．使用するための説明書をさらに含む、実施形態４７～４９のいずれか１つのキット。
【0200】
５１．哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法。
【0201】
５２．第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－Ｅ１パッセンジャー－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む、実施形態５１の方法。
【0202】
５３．哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡ
ＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法。
ＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法。
【0203】
５４．神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む第１の鎖、および第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法。
【0204】
５５．第２の核酸は、配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸または配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む、実施形態５４の方法。
【0205】
５６．神経変性疾患を有する哺乳動物におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に、配列５’－ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣ－３’（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ－３’（配列番号５３）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖、または配列５’－ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡ－３’（配列番号８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’－ＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ－３’（配列番号３７）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを投与することを含む方法。
【0206】
５７．第１の鎖は、配列番号２４の配列を有する核酸配列または配列番号８の配列を有する核酸を含む、実施形態５１～５６のいずれか１つの方法。
【0207】
５８．第２の鎖は、配列番号５３の配列を有する核酸または配列番号３７の配列を有する核酸を含む、実施形態５２、５３、５５、または５６のいずれか１つの方法。
【0208】
５９．第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、実施形態５１～５８のいずれか１つの方法。
【0209】
６０．ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む、実施形態５９の方法。
【0210】
６１．ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む、実施形態５９または６０の方法。
【0211】
６２．ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む、実施形態５９～６１のいずれか１つの方法。
【0212】
６３．ＲＮＡｉは、５’から３’に向かって、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む、実施形態５９～６１のいずれか１つの方法。
【0213】
６４．ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３の核酸配列を含む、実施形態６３の方法。
【0214】
６５．ＲＮＡｉは、配列番号６１または配列番号６３のヌクレオチド配列に対して約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、実施形態６４の方法。
【0215】
６６．ＲＮＡｉは、発現構築物にコードされている、実施形態５１～６５のいずれか１つの方法。
【0216】
６７．ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、実施形態５１～６６のいずれか１つの方法。
【0217】
６８．ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに、機能するように連結されている、実施形態５１～６７のいずれか１つの方法。
【0218】
６９．プロモーターは、哺乳動物の脳内でＲＮＡｉを発現することが可能である、実施形態６８の方法。
【0219】
７０．プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ
ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、およびヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターから選択される、実施形態６９の方法。
ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター、およびヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターから選択される、実施形態６９の方法。
【0220】
７１．プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβーアクチンプロモーターを含むハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）である、実施形態６８～７０のいずれか１つの方法。
【0221】
７２．発現構築物は、イントロンをさらに含む、実施形態６６～７１のいずれか１つの方法。
【0222】
７３．イントロンは、ＣＢＡイントロンである、実施形態７２の方法。
【0223】
７４．イントロンは、キメライントロンである、実施形態７２の方法。
【0224】
７５．発現構築物は自己相補的なベクターであり、イントロンはデルタキメライントロンである、実施形態７４の方法。
【0225】
７６．核酸は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態６６～７５のいずれか１つの方法。
【0226】
７７．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態７６の方法。
【0227】
７８．発現構築物は、ベクターによってコードされる、実施形態６６～７７のいずれか１つの方法。
【0228】
７９．ベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、実施形態７８の方法。
【0229】
８０．発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する、実施形態７９の方法。
【0230】
８１．発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する、実施形態８０の方法。
【0231】
８２．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、実施形態８０または８１の方法。
【0232】
８３．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、実施形態８０～８２のいずれか１つの方法。
【0233】
８４．ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に向かって、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、実施形態８３の方法。
【0234】
８５．プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、実施形態８４の方法。
【0235】
８６．イントロンは、キメライントロン、デルタキメライントロンまたは短縮されたキメライントロンである、実施形態８４の方法。
【0236】
８７．キメライントロンは、ＣＢＡ＋ウサギベータグロブリンイントロンである、実施形態８６の方法。
【0237】
８８．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態８４～８７のいずれか１つの方法。
【0238】
８９．ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に向かって、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、キメライントロン、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、実施形態８３の方法。
【0239】
９０．ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む、実施形態８９の方法。
【0240】
９１．スタッファー核酸は、ヒトＡ１ＡＴ遺伝子のイントロン１を含む、実施形態９０の方法。
【0241】
９２．ベクターは、自己相補的なベクターである、実施形態７９～９１のいずれか１つの方法。
【0242】
９３．ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列および該ＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、実施形態９２の方法。
【0243】
９４．第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の
突然変異を含む、実施形態９３の方法。
突然変異を含む、実施形態９３の方法。
【0244】
９５．ベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている、実施形態７９～９４のいずれか１つの方法。
【0245】
９６．ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、実施形態９５の方法。
【0246】
９７．ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、実施形態９５または９６の方法。
【0247】
９８．ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、実施形態９５または９６の方法。
【0248】
９９．ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、実施形態９５～９８のいずれか１つの方法。
【0249】
１００．ｒＡＡＶウイルス粒子はＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターはＡＡＶ２のＩＴＲを含む、実施形態９９の方法。
【0250】
１０１．実施形態９５～１００のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、実施形態５１～１００のいずれか１つの方法。
【0251】
１０２．組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態１０１の方法。
【実施例0252】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解される。しかしながら、これらは本開示の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は単に例示の目的のためであり、それらの観点で様々な改変または変化が当業者に示唆されると予想され、本出願の本質および趣旨ならびに添付の特許請求の範囲のうちに包含されることが理解される。
【0253】
実施例１：ｓｈｍｉＲＮＡはインビトロでヒトＳＮＣＡ標的を低減する。
インビトロでのＳＮＣＡ発現の低減を実証するために、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびｈＥＦ１ａプロモーター／イントロンの制御下で、候補ＲＮＡｉ配列をコードするプラスミドおよびヒトＳＮＣＡ ｃＤＮＡ Ａ（ＮＭ＿０００３４５．３）をコードするプラスミドで、続いて、ＴｂｇｈポリＡ配列を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＳＮＣＡ ｃＤＮＡおよびｍｉＲＮＡプラスミドを同時にトランスフェクトした。
インビトロでのＳＮＣＡ発現の低減を実証するために、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびｈＥＦ１ａプロモーター／イントロンの制御下で、候補ＲＮＡｉ配列をコードするプラスミドおよびヒトＳＮＣＡ ｃＤＮＡ Ａ（ＮＭ＿０００３４５．３）をコードするプラスミドで、続いて、ＴｂｇｈポリＡ配列を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＳＮＣＡ ｃＤＮＡおよびｍｉＲＮＡプラスミドを同時にトランスフェクトした。
【0254】
方法
ｓｉＲＮＡおよびプラスミド
ヒト／マカク／マウスのＳＮＣＡに対して最大の相同性を有するように、ＲＮＡｉ配列を内部で設計する一方で、このことと低いオフターゲティングの可能性との均衡を保った
。従来のｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａによって合成された。ヒトトランスクリプトームのオフターゲットをｓｉＳＰＯＴＲアルゴリズム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｓｐｏｔｒ．ｉｃｔｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｓｉｓｐｏｔｒ／ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）を使用して予測した。
ｓｉＲＮＡおよびプラスミド
ヒト／マカク／マウスのＳＮＣＡに対して最大の相同性を有するように、ＲＮＡｉ配列を内部で設計する一方で、このことと低いオフターゲティングの可能性との均衡を保った
。従来のｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａによって合成された。ヒトトランスクリプトームのオフターゲットをｓｉＳＰＯＴＲアルゴリズム（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｓｐｏｔｒ．ｉｃｔｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｓｉｓｐｏｔｒ／ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）を使用して予測した。
【0255】
ＳＮＣＡを標的化するＲＮＡｉ配列を発現するプラスミドをサイトメガロウイルスエンハンサーおよびｈＥＦ１ａプロモーター／イントロンによって駆動されるマウスのｍｉｒ１５５足場内に埋め込んだ。ＲＮＡｉ配列は、表１中に見い出すことができる。
【0256】
インビトロ細胞培養およびトランスフェクション
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を約７０～９０％コンフルエンシーまで増殖させた。Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｍｉＲＮＡ形式のプラスミドとして）またはＲＮＡｉＭＡＸ（ｓｉＲＮＡ形式として）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中での細胞溶解によって全細胞抽出物を調製し、－２０℃で保存する前に５分間沸騰させた。
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を約７０～９０％コンフルエンシーまで増殖させた。Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｍｉＲＮＡ形式のプラスミドとして）またはＲＮＡｉＭＡＸ（ｓｉＲＮＡ形式として）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中での細胞溶解によって全細胞抽出物を調製し、－２０℃で保存する前に５分間沸騰させた。
【0257】
ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリー
細胞溶解物を４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＧＸ（商標））にランした。タンパク質をニトロセルロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標））に移し、５％の脱脂乳中でブロックし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を洗い流し、ＨＲＰタグ付き二次抗体と共にインキュベートし、Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｌＤｏｃ（商標）撮像装置上で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を使用して、バンドを定量した。タンパク質のローディングについての対照をとるために、アルファ－シヌクレインタンパク質レベルをＧＡＰＤＨまたはベータチューブリンに対して正規化した。使用した抗体：アルファ－シヌクレイン（ＢＤ ６１０７８７）、ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ｇ８７９５）、Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＭＭＳ－４３５Ｐ－１００）。ＨＲＰ－ヤギ抗マウスまたはウサギ（ＣＳＴ ７０７６）。
細胞溶解物を４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＧＸ（商標））にランした。タンパク質をニトロセルロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標））に移し、５％の脱脂乳中でブロックし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を洗い流し、ＨＲＰタグ付き二次抗体と共にインキュベートし、Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｌＤｏｃ（商標）撮像装置上で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を使用して、バンドを定量した。タンパク質のローディングについての対照をとるために、アルファ－シヌクレインタンパク質レベルをＧＡＰＤＨまたはベータチューブリンに対して正規化した。使用した抗体：アルファ－シヌクレイン（ＢＤ ６１０７８７）、ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ｇ８７９５）、Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＭＭＳ－４３５Ｐ－１００）。ＨＲＰ－ヤギ抗マウスまたはウサギ（ＣＳＴ ７０７６）。
【0258】
結果
図２に示されるように、ｓｈｍｉＲＮＡは、インビトロでヒトＳＮＣＡタンパク質レベルを低減した。１９／２７の配列に関して、タンパク質レベルの５０％を超える低減を示す。
図２に示されるように、ｓｈｍｉＲＮＡは、インビトロでヒトＳＮＣＡタンパク質レベルを低減した。１９／２７の配列に関して、タンパク質レベルの５０％を超える低減を示す。
【0259】
実施例２：ｓｈｍｉＲＮＡはインビトロでマウスＳＮＣＡ標的を低減する。
この実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したＲＮＡｉ配列およびマウスＳＮＣＡ ｃＤＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトしたことを除いて、実施例１と類似する方法を使用した。
この実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示したＲＮＡｉ配列およびマウスＳＮＣＡ ｃＤＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトしたことを除いて、実施例１と類似する方法を使用した。
【0260】
結果
図３に示されるように、示したｍｉＲＮＡは、インビトロでマウスＳＮＣＡタンパク質レベルを低減し、１４／２７の配列は、５０％を超えるタンパク質レベルの低減を示した。
図３に示されるように、示したｍｉＲＮＡは、インビトロでマウスＳＮＣＡタンパク質レベルを低減し、１４／２７の配列は、５０％を超えるタンパク質レベルの低減を示した。
【0261】
実施例３：ｓｉＲＮＡはインビトロでヒトおよびマウスＳＮＣＡ標的を低減する。
ｓｉＲＮＡ形式を使用する追加の実験をＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１およびＥ２について実行し、標的の低減に関する追加のデータを提供したが、これは、これらが、ラットのＳＮＣＡ低減を必要とする将来的な神経変性の動物モデルを選択する際の柔軟性を可能にする、ラットのＳＮＣＡに対する完全な、または有意な、相
同性を有する追加の構成を有するように設計されたためである。
ｓｉＲＮＡ形式を使用する追加の実験をＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１およびＥ２について実行し、標的の低減に関する追加のデータを提供したが、これは、これらが、ラットのＳＮＣＡ低減を必要とする将来的な神経変性の動物モデルを選択する際の柔軟性を可能にする、ラットのＳＮＣＡに対する完全な、または有意な、相
同性を有する追加の構成を有するように設計されたためである。
【0262】
方法
インビトロでの細胞培養およびトランスフェクション
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｅｐ中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を約７０～９０％コンフルエンシーまで増殖させた。Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｍｉＲＮＡ形式のプラスミドとして）またはＲＮＡｉＭＡＸ（ｓｉＲＮＡ形式として）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中での細胞溶解によって全細胞抽出物を調製し、－２０℃で保存する前に５分間沸騰させた。
インビトロでの細胞培養およびトランスフェクション
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｅｐ中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を約７０～９０％コンフルエンシーまで増殖させた。Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｍｉＲＮＡ形式のプラスミドとして）またはＲＮＡｉＭＡＸ（ｓｉＲＮＡ形式として）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中での細胞溶解によって全細胞抽出物を調製し、－２０℃で保存する前に５分間沸騰させた。
【0263】
ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリー
細胞溶解物を４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＧＸ（商標））にランした。タンパク質をニトロセルロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標））に移し、５％の脱脂乳中でブロックし、一次抗体と４Ｃで一晩インキュベートした。一次抗体を洗い流し、ＨＲＰタグ付き二次抗体と共にインキュベートし、Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｌＤｏｃ（商標）撮像装置上で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を使用して、バンドを定量した。タンパク質のローディングについての対照をとるために、アルファ－シヌクレインタンパク質レベルをＧＡＰＤＨまたはベータチューブリンに対して正規化した。使用した抗体：アルファ－シヌクレイン（ＢＤ ６１０７８７）、ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ｇ８７９５）、Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＭＭＳ－４３５Ｐ－１００）。ＨＲＰ－ヤギ抗マウスまたはウサギ（ＣＳＴ ７０７６）。
細胞溶解物を４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＧＸ（商標））にランした。タンパク質をニトロセルロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ（登録商標））に移し、５％の脱脂乳中でブロックし、一次抗体と４Ｃで一晩インキュベートした。一次抗体を洗い流し、ＨＲＰタグ付き二次抗体と共にインキュベートし、Ｆｅｍｔｏ ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｌＤｏｃ（商標）撮像装置上で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を使用して、バンドを定量した。タンパク質のローディングについての対照をとるために、アルファ－シヌクレインタンパク質レベルをＧＡＰＤＨまたはベータチューブリンに対して正規化した。使用した抗体：アルファ－シヌクレイン（ＢＤ ６１０７８７）、ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ｇ８７９５）、Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＭＭＳ－４３５Ｐ－１００）。ＨＲＰ－ヤギ抗マウスまたはウサギ（ＣＳＴ ７０７６）。
【0264】
結果
図４Ａ～４Ｄに示されるように、示したｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ形式でのそれらの性能に基づいて期待されるように、インビトロでヒトおよびマウスのＳＮＣＡレベルを低減した。
図４Ａ～４Ｄに示されるように、示したｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ形式でのそれらの性能に基づいて期待されるように、インビトロでヒトおよびマウスのＳＮＣＡレベルを低減した。
【0265】
実施例４：示したＲＮＡｉの毒性および神経保護特性。
成熟ドーパミン様ニューロンに分化したＬｕｎｄヒト中脳（ＬＵＨＭＥＳ）細胞（１０）を使用して、候補ｓｈｍｉＲＮＡの毒性および神経保護特性を評価した。
成熟ドーパミン様ニューロンに分化したＬｕｎｄヒト中脳（ＬＵＨＭＥＳ）細胞（１０）を使用して、候補ｓｈｍｉＲＮＡの毒性および神経保護特性を評価した。
【0266】
方法
インビトロ細胞培養およびトランスフェクション
ＬＵＨＭＥＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９２７）の細胞を、プラスミドＤＮＡの電気穿孔を可能にするために一部修正を加えて、（１０）に記載されるように増殖および分化させた。簡潔には、ＬＵＨＭＥＳ細胞を、ポリ－Ｌ－オルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングしたフラスコで、増殖培地（１０）中で継代培養した。ドーパミン作動性細胞の分化は、追加の分化培地（１０）によって開始した。２日後に細胞を分離し、所望のＤＮＡと共に電気穿孔し（製造業者の説明書に従うＬＯＮＺＡ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘシステム）、９６ウェルプレートの回収培地中に再度プレーティングして、電気穿孔毒性を最少化した。トランスフェクションの４時間後に、培地を分化培地に戻した。特定の実験のために、トランスフェクション後の指定日に、細胞を処置および回収した。
インビトロ細胞培養およびトランスフェクション
ＬＵＨＭＥＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９２７）の細胞を、プラスミドＤＮＡの電気穿孔を可能にするために一部修正を加えて、（１０）に記載されるように増殖および分化させた。簡潔には、ＬＵＨＭＥＳ細胞を、ポリ－Ｌ－オルニチンおよびフィブロネクチンでコーティングしたフラスコで、増殖培地（１０）中で継代培養した。ドーパミン作動性細胞の分化は、追加の分化培地（１０）によって開始した。２日後に細胞を分離し、所望のＤＮＡと共に電気穿孔し（製造業者の説明書に従うＬＯＮＺＡ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘシステム）、９６ウェルプレートの回収培地中に再度プレーティングして、電気穿孔毒性を最少化した。トランスフェクションの４時間後に、培地を分化培地に戻した。特定の実験のために、トランスフェクション後の指定日に、細胞を処置および回収した。
【0267】
インビトロ神経保護アッセイ
上記のように調製したＬＵＨＭＥＳ細胞を分化の６日目（トランスフェクションの４日目）に示した濃度のロテノンで処理した。ロテノンによる処置の４８時間後に、製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッ
セイを使用して細胞生存率を測定した。処置の２４時間後に、ＤＣＦＤＡキット（Ａｂｃａｍ）によって、活性酸素種（ＲＯＳ）生成を測定した。値を未処置の対照トランスフェクト細胞に対して正規化した。
上記のように調製したＬＵＨＭＥＳ細胞を分化の６日目（トランスフェクションの４日目）に示した濃度のロテノンで処理した。ロテノンによる処置の４８時間後に、製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッ
セイを使用して細胞生存率を測定した。処置の２４時間後に、ＤＣＦＤＡキット（Ａｂｃａｍ）によって、活性酸素種（ＲＯＳ）生成を測定した。値を未処置の対照トランスフェクト細胞に対して正規化した。
【0268】
統計分析
細胞生存率についての実験からのデータをコンパイルし、Ｄ１およびＥ１配列を使用して、ロテノンに誘導された毒性に対する神経保護の％に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡノックダウンの％をランク付けした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ｖ６）を使用して計算した場合、パーセントＳＮＣＡノックダウンは、神経保護の度合と有意に相関した。
細胞生存率についての実験からのデータをコンパイルし、Ｄ１およびＥ１配列を使用して、ロテノンに誘導された毒性に対する神経保護の％に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡノックダウンの％をランク付けした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ｖ６）を使用して計算した場合、パーセントＳＮＣＡノックダウンは、神経保護の度合と有意に相関した。
【0269】
結果
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＳＮＣＡノックダウンはそれ自体は毒性ではなく、細胞死を有意に防ぎ（図５Ａ）、ロテノン依存性ＲＯＳ生成を低下させる（図５Ｂ）。対照、Ｄ１およびＥ１配列は、それ自体の細胞生存率を変更しなかった。対照のトランスフェクト細胞のロテノン処理によって約７５％の細胞死がもたらされたが、ＳＮＣＡノックダウンベクターによるトランスフェクションはこの毒性からの有意な保護をもたらした。
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＳＮＣＡノックダウンはそれ自体は毒性ではなく、細胞死を有意に防ぎ（図５Ａ）、ロテノン依存性ＲＯＳ生成を低下させる（図５Ｂ）。対照、Ｄ１およびＥ１配列は、それ自体の細胞生存率を変更しなかった。対照のトランスフェクト細胞のロテノン処理によって約７５％の細胞死がもたらされたが、ＳＮＣＡノックダウンベクターによるトランスフェクションはこの毒性からの有意な保護をもたらした。
【0270】
図６に示されるように、細胞生存率についての実験からのデータをコンパイルし、ロテノンに誘導された毒性に対する神経保護のパーセントに対して、Ｄ１およびＥ１配列を使用するＳＮＣＡ ｍＲＮＡノックダウンの％をランク付けした。ＳＮＣＡノックダウンの度合は、神経保護の度合と有意に正に相関し、Ｄ１およびＥ１配列を使用するＳＮＣＡ ｍＲＮＡの低減が有効な神経保護戦略であることを実証した。
【0271】
実施例５：Ｄ１およびＥ１ベクターによるインビボでの標的ノックダウン
ＳＮＣＡのインビボでのノックダウンを決定するために、Ｄ１、Ｅ１または対照のＲＮＡｉ配列をコードするＡＡＶベクターを野生型マウスのＳＮｃ中に注射した。注射の１カ月後にＳＮｃ組織を回収した。ＲＮＡを単離し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのレベルをＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって定量した。転写物の相対的レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。
ＳＮＣＡのインビボでのノックダウンを決定するために、Ｄ１、Ｅ１または対照のＲＮＡｉ配列をコードするＡＡＶベクターを野生型マウスのＳＮｃ中に注射した。注射の１カ月後にＳＮｃ組織を回収した。ＲＮＡを単離し、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのレベルをＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって定量した。転写物の相対的レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【0272】
方法
ウイルスベクター
インビボ試験に関するｒＡＡＶウイルスを生産するために、修飾ＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシド（ＷＯ ２０１５１６８６６６ Ａ２）を使用して、ＡＡＶウイルス生産のための１．６ｋｂのＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ２のＩＴＲプラスミド中に、ｍｉｒ１５５カセットをクローニングした。全てのウイルスベクターを２９３細胞中でトリプルトランスフェクション法によって生産し、（１１）に記載されるように精製した。力価をｑＰＣＲによって決定し、ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬとして、または全ベクターゲノム（ｖｇ）として表現した。
ウイルスベクター
インビボ試験に関するｒＡＡＶウイルスを生産するために、修飾ＡＡＶ２ＨＢＫＯキャプシド（ＷＯ ２０１５１６８６６６ Ａ２）を使用して、ＡＡＶウイルス生産のための１．６ｋｂのＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ２のＩＴＲプラスミド中に、ｍｉｒ１５５カセットをクローニングした。全てのウイルスベクターを２９３細胞中でトリプルトランスフェクション法によって生産し、（１１）に記載されるように精製した。力価をｑＰＣＲによって決定し、ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬとして、または全ベクターゲノム（ｖｇ）として表現した。
【0273】
動物
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０～１２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから購入した。食餌および水を自由に摂取でき、室温、湿度を制御され、かつ１２：１２時間の明／暗サイクル下の各ケージにおいて、動物を４頭からなる群において飼育した。
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０～１２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから購入した。食餌および水を自由に摂取でき、室温、湿度を制御され、かつ１２：１２時間の明／暗サイクル下の各ケージにおいて、動物を４頭からなる群において飼育した。
【0274】
定位注射
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ、Ｆｒａ
ｎｃｅ）およびキシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ；Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の混合物（体積１０ｍＬ／Ｋｇ）の腹腔内注射により、マウスを深麻酔した。動物は、定位フレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）に配置する前に、マウスの頭皮を剃り、Ｖｅｔｉｄｉｎｅ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｎｃｅ）で消毒し、局所麻酔ブピバカイン（５ｍｌ／ｋｇの体積で２ｍｇ／ｋｇ；Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を頭蓋骨の皮膚に皮下注射し、Ｅｍｌａ（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）を耳に適用した。手術中、ビタミンＡ Ｄｕｌｃｉｓによって眼を光から保護し、電気毛布で体温を３７℃の一定に保った。
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ、Ｆｒａ
ｎｃｅ）およびキシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ；Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の混合物（体積１０ｍＬ／Ｋｇ）の腹腔内注射により、マウスを深麻酔した。動物は、定位フレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）に配置する前に、マウスの頭皮を剃り、Ｖｅｔｉｄｉｎｅ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｎｃｅ）で消毒し、局所麻酔ブピバカイン（５ｍｌ／ｋｇの体積で２ｍｇ／ｋｇ；Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を頭蓋骨の皮膚に皮下注射し、Ｅｍｌａ（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）を耳に適用した。手術中、ビタミンＡ Ｄｕｌｃｉｓによって眼を光から保護し、電気毛布で体温を３７℃の一定に保った。
【0275】
注射座標上の頭蓋骨に小さな穴を開けた。可撓性プラスチックチューブを用いて２５μＬのシリンジに接続し、次いで、微小灌流ポンプに接続した３３ゲージのカニューレ（ＯＤ ０．２５４ｍｍ；Ｐｈｙｍｅｐ）を以下の座標の左黒質緻密部（ＳＮｐｃ）中の片側に挿入した：ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（２００８）のマウスのアトラスに従って、ＡＰ＝前項からー２．９２ｍｍ；ＭＬ＝１．２５ｍｍ；ＤＶ：硬膜からー４．５ｍｍ。無作為化の後、マウス（ｎ＝１０／群）にＡＡＶを注射した。０．２μＬ／分の流量で注入を実行し、１μＬの最終体積を注射した。
【0276】
最終注射の後に、逆流を回避するために、カニューレをさらに５分間ＳＮｐｃ中で維持した。次いで、カニューレをマウスの脳からゆっくりと除去し、頭皮を縫合して閉じた。マウスは、毎日モニターされ、手術後に、カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ ｓｃ；体積５ｍｌ／ｋｇ；Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標）、Ｚｏｅｔｉｓ）の皮下注射を受け、約２００μＬの滅菌食塩水を腹腔内注射して、脱水を防止した。次いで、動物が完全に覚醒するまで、ＭｅｄｉＨｅａｔ（登録商標）Ｗａｒｍｉｎｇ Ｃａｂｉｎｅｔ内に配置した。注射の１カ月後に、イソフルラン４％で動物を麻酔し、免疫組織化学および生化学分析のために脳を処理した。全ての実験は盲検で行った。
【0277】
統計分析
該当する場合、多重比較（ダネット検定）を用いる一元ＡＮＯＶＡを使用するＰｒｉｓｍソフトウエア（バージョン６、Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標））を使用して統計を実行した。
該当する場合、多重比較（ダネット検定）を用いる一元ＡＮＯＶＡを使用するＰｒｉｓｍソフトウエア（バージョン６、Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標））を使用して統計を実行した。
【0278】
結果
図７に示されるように、Ｄ１およびＥ１ベクターは、対照のＲＮＡｉに対して、それぞれＳＮＣＡ ｍＲＮＡの５５％および６６％のノックダウンを示し、ＳＮＣＡ標的化ｍｉＲＮＡのＡＡＶ介在の送達を使用して、標的構造におけるインビボでの有意な標的ｍＲＮＡノックダウンを実証した。
図７に示されるように、Ｄ１およびＥ１ベクターは、対照のＲＮＡｉに対して、それぞれＳＮＣＡ ｍＲＮＡの５５％および６６％のノックダウンを示し、ＳＮＣＡ標的化ｍｉＲＮＡのＡＡＶ介在の送達を使用して、標的構造におけるインビボでの有意な標的ｍＲＮＡノックダウンを実証した。
【0279】
図８に示されるように、ＳＮＣＡアンチセンスプローブは、対側半球に対して吻側から尾側の３つの異なる解剖学レベルで標的低下を明らかに示す。対照のＲＮＡｉウイルスは、未注射半球に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少を全く示さず、作用の特異性を実証した。図９に示されるように、ＶＴＡにおけるアルファ－シヌクレインタンパク質シグナルは、細胞体シヌクレイン発現を観察するために飽和される必要があり、その脳領域におけるＳＮＣＡ低減の決定をいずれも排除した。
【0280】
実施例６：ＡＡＶーＤ１ベクターは、ＳＮｃ免疫組織化学によってマウスＳＮＣＡ ｍＲＮＡを低減する。
実施例５に記載したように、対照またはＤ１ ＡＡＶベクターの１ｅ９ ＧＣをマウスの片側に注射した。１カ月後に、組織を回収し、免疫組織化学（ＩＨＣ）のために冠状断片を処理し、黒質緻密部におけるアルファ－シヌクレインタンパク質レベルを評価した。
実施例５に記載したように、対照またはＤ１ ＡＡＶベクターの１ｅ９ ＧＣをマウスの片側に注射した。１カ月後に、組織を回収し、免疫組織化学（ＩＨＣ）のために冠状断片を処理し、黒質緻密部におけるアルファ－シヌクレインタンパク質レベルを評価した。
【0281】
追加の方法
免疫組織化学およびＩＳＨ
脳を４℃で少なくとも２日間４％のホルムアルデヒド中で浸漬固定し、３０％ショ糖溶液中で凍結保存し、次いで、凍結した。凍結した脳を黒質（ｓｎ）の前後軸全体に沿って連続冠状断片に切断した。断片をｐｂｓ－０．４％のアジ化ナトリウム中に配置し、４℃で保存した。
免疫組織化学およびＩＳＨ
脳を４℃で少なくとも２日間４％のホルムアルデヒド中で浸漬固定し、３０％ショ糖溶液中で凍結保存し、次いで、凍結した。凍結した脳を黒質（ｓｎ）の前後軸全体に沿って連続冠状断片に切断した。断片をｐｂｓ－０．４％のアジ化ナトリウム中に配置し、４℃で保存した。
【0282】
無作為に選択した一連の２０μｍの厚さの浮動性断片を使用し、α－ｓｙｎに対するマウスのモノクローナル一次抗体（マウスモノクローナル、１：２０００、クローン４２、ＢＤ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫標識を実行した。この抗体は、シナプス膜だけでなく、腹側被蓋野（ＶＴＡ）およびＳＮのｄａ神経細胞体内にも主に局在化するマウスのα－Ｓｙｎタンパク質の内因性レベルを検出することができる。
【0283】
断片を０．１ｍのｐｂｓ－０．１５％のトリトン、ウシの皮膚由来の０．２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ９３９１）溶液中で３回濯ぎ、ブロッキング緩衝液（すなわち、０．１ｍ ＰＢＳ－ウシ血清由来の１０％のアルブミン、Ｓｉｇｍａ、Ａ８０２２）中で３０分間前処理した。次いで、これらを室温の０．１ｍ ＰＢＳ中で一次抗体溶液と共に一晩インキュベートした。０．１ｍ ＰＢＳ－０．１５％のトリトン、０．２％のゼラチン中で濯いだ後、蛍光色素がコンジュゲートした抗体（ヤギ抗マウス６４７、Ａｂｃａｍ １５０１１９）を二次抗体として使用した（０．１ｍ ＰＢＳ中１：４００、暗所、室温で９０分間インキュベーション）。断片を０．１ｍ ＰＢＳ－０．２％のゼラチン溶液中で２回、ＰＢＳ ０．１ｍ中で１回濯ぎ、固定した（ｆｌｅｘ ｓｌｉｄｅ、Ｄａｋｏ）。ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐ３６９３１）を用いて断片にカバーガラスをかけた。
【0284】
蛍光免疫標識の定性画像分析をスライドスキャナーシステム（蛍光性能を有するＢＸ６１顕微鏡を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＤｏｔＳｌｉｄｅシステム）で実行した。
【0285】
結果
図９に示されるように、同じ動物の反対側のＳＮｃまたは対照を注射された動物と比較して、細胞体中のＳＮＣＡタンパク質は、Ｄ１によって明らかに低減される。隣接する脳断片からのＩＳＨ画像（下のパネル、実施例５により処理された）は、Ｄ１ ＲＮＡｉベクターによるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの対応する低減を示したが、対照ベクターは示さなかった。これらのデータは、ｍｉＲＮＡ標的化ＳＮＣＡのＡＡＶ送達が所望の脳領域における耐久性ｍＲＮＡノックダウンを示すことを実証する。
図９に示されるように、同じ動物の反対側のＳＮｃまたは対照を注射された動物と比較して、細胞体中のＳＮＣＡタンパク質は、Ｄ１によって明らかに低減される。隣接する脳断片からのＩＳＨ画像（下のパネル、実施例５により処理された）は、Ｄ１ ＲＮＡｉベクターによるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの対応する低減を示したが、対照ベクターは示さなかった。これらのデータは、ｍｉＲＮＡ標的化ＳＮＣＡのＡＡＶ送達が所望の脳領域における耐久性ｍＲＮＡノックダウンを示すことを実証する。
【0286】
実施例７：ベクターＡＡＶｒｈ．１０におけるＥ１によるインビボでの標的ノックダウン
ＳＮＣＡのインビボでのノックダウンを決定し、ＳＮＣＡのノックダウンがＡＡＶ血清型に依存しないことを実証するために、Ｅ１または対照のＲＮＡｉ配列をコードするＡＡＶ．ｒｈ１０ベクターを野生型マウスのＳＮｃ中に注射した。以前に記載したように、対照またはＡＡＶ．ｒｈ１０ Ｅ１ベクターの１０ｅ９ ＧＣをマウスの片側に注射した。注射の１カ月後にＳＮｃ組織を回収した。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現をインサイチュハイブリダイゼーションで定量し、ＳＮＣＡタンパク質を免疫組織化学によって検出した。
ＳＮＣＡのインビボでのノックダウンを決定し、ＳＮＣＡのノックダウンがＡＡＶ血清型に依存しないことを実証するために、Ｅ１または対照のＲＮＡｉ配列をコードするＡＡＶ．ｒｈ１０ベクターを野生型マウスのＳＮｃ中に注射した。以前に記載したように、対照またはＡＡＶ．ｒｈ１０ Ｅ１ベクターの１０ｅ９ ＧＣをマウスの片側に注射した。注射の１カ月後にＳＮｃ組織を回収した。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現をインサイチュハイブリダイゼーションで定量し、ＳＮＣＡタンパク質を免疫組織化学によって検出した。
【0287】
方法
ウイルスベクター
インビボ試験に関するｒＡＡＶウイルスを生成するために、ＡＡＶのｒｈ．１０血清型のキャプシド（Ｇａｏ， Ｇ． Ｐ．ら、２００２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９： １１８５４～１１８５９頁）を使用して、ＡＡＶウイ
ルス産生のための１．６ｋｂ ＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ２のＩＴＲプラスミド中に、ｍｉｒ１５５カセットをクローニングした。全てのウイルスベクターを２９３細胞中でトリプルトランスフェクション法によって生産し、（１１）に記載されるように精製した。力価をｑＰＣＲによって決定し、ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬとして、または全ベクターゲノム（ｖｇ）として表現した。
ウイルスベクター
インビボ試験に関するｒＡＡＶウイルスを生成するために、ＡＡＶのｒｈ．１０血清型のキャプシド（Ｇａｏ， Ｇ． Ｐ．ら、２００２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９： １１８５４～１１８５９頁）を使用して、ＡＡＶウイ
ルス産生のための１．６ｋｂ ＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ２のＩＴＲプラスミド中に、ｍｉｒ１５５カセットをクローニングした。全てのウイルスベクターを２９３細胞中でトリプルトランスフェクション法によって生産し、（１１）に記載されるように精製した。力価をｑＰＣＲによって決定し、ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬとして、または全ベクターゲノム（ｖｇ）として表現した。
【0288】
動物
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０～１２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから購入した。食餌および水を自由に摂取でき、室温、湿度を制御され、かつ１２：１２時間の明／暗サイクル下の各ケージにおいて、動物を４頭からなる群で飼育した。
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０～１２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから購入した。食餌および水を自由に摂取でき、室温、湿度を制御され、かつ１２：１２時間の明／暗サイクル下の各ケージにおいて、動物を４頭からなる群で飼育した。
【0289】
定位注射
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）およびキシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ；Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の混合物（体積１０ｍＬ／Ｋｇ）の腹腔内注射により、マウスを深麻酔した。動物を定位フレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）に配置する前に、マウスの頭皮を剃り、Ｖｅｔｉｄｉｎｅ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｎｃｅ）で消毒し、局所麻酔ブピバカイン（５ｍｌ／ｋｇの体積で２ｍｇ／ｋｇ；Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を頭蓋骨の皮膚に皮下注射し、Ｅｍｌａ（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）を耳に適用した。手術中、ビタミンＡ Ｄｕｌｃｉｓによって眼を光から保護し、電気毛布で体温を３７℃の一定に保った。
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）およびキシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ；Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の混合物（体積１０ｍＬ／Ｋｇ）の腹腔内注射により、マウスを深麻酔した。動物を定位フレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）に配置する前に、マウスの頭皮を剃り、Ｖｅｔｉｄｉｎｅ（Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｎｃｅ）で消毒し、局所麻酔ブピバカイン（５ｍｌ／ｋｇの体積で２ｍｇ／ｋｇ；Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を頭蓋骨の皮膚に皮下注射し、Ｅｍｌａ（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）を耳に適用した。手術中、ビタミンＡ Ｄｕｌｃｉｓによって眼を光から保護し、電気毛布で体温を３７℃の一定に保った。
【0290】
注射座標上の頭蓋骨に小さな穴を開けた。可撓性プラスチックチューブ（Ｔｙｇｏｎ ０．２５４＊０．７６２、ｒｅｆ．ＡＡＤ０４０９１）を用いて２５μＬのシリンジ（Ｅｘｍｉｒｅ、ｒｅｆ．ＭＳ＊ＧＦ２５）に接続し、次いで、微小灌流ポンプ（ＣＭＡ ４００４）に接続した３３ゲージのカニューレ（ＯＤ ０．２５４ｍｍ；Ｐｈｙｍｅｐ）を以下の座標の左黒質緻密部（ＳＮｐｃ）中の片側に挿入した：ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（２００８）のマウスのアトラスに従って、ＡＰ＝前項から－２．９２ｍｍ；ＭＬ＝１．２５ｍｍ；ＤＶ：硬膜から－４．５ｍｍ。無作為化の後、マウス（ｎ＝１０／群）にＡＡＶを注射した。０．２μＬ／分の流量で注入を実行し、１μＬの最終体積を注射した。最終注射の後に、逆流を回避するために、カニューレをさらに５分間ＳＮｐｃ中で維持した。次いで、カニューレをマウスの脳からゆっくりと除去し、頭皮を縫合して閉じた。マウスは、毎日モニターされ、手術後に、カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ ｓｃ；体積５ｍｌ／ｋｇ；Ｒｉｍａｄｙｌ、Ｚｏｅｔｉｓ）の皮下注射を受け、約２００μＬの滅菌食塩水を腹腔内注射して、脱水を防止した。次いで、動物が完全に覚醒するまで、ＭｅｄｉＨｅａｔ（登録商標）Ｗａｒｍｉｎｇ Ｃａｂｉｎｅｔ（Ｐｅｃｏ ｓｅｒｖｉｃｅｓ）内に配置した。注射の１カ月後に、イソフルラン４％で動物を麻酔し、免疫組織化学および生化学分析のために脳を処理した。全ての実験を盲検で行った。
【0291】
免疫組織化学およびＩＳＨ
脳を４℃で少なくとも２日間４％のホルムアルデヒド中で浸漬固定し、３０％ショ糖溶液中で凍結保存し、次いで、凍結した。凍結した脳を黒質（ＳＮ）の前後軸全体に沿って連続冠状断片に切断した。断片をＰＢＳ－４％のアジ化ナトリウム中に配置し、４℃で保存した。
脳を４℃で少なくとも２日間４％のホルムアルデヒド中で浸漬固定し、３０％ショ糖溶液中で凍結保存し、次いで、凍結した。凍結した脳を黒質（ＳＮ）の前後軸全体に沿って連続冠状断片に切断した。断片をＰＢＳ－４％のアジ化ナトリウム中に配置し、４℃で保存した。
【0292】
無作為に選択した一連の２０μｍの厚さの浮動性断片を使用し、α－ｓｙｎに対するマウスのモノクローナル一次抗体（マウスモノクローナル、１：２０００、クローン４２、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫標識を実行した。この抗体は、シナプス膜だけでなく、腹側被蓋野（ＶＴＡ）およびＳＮのＤＡ神
経細胞体内にも主に局在化するマウスのα－Ｓｙｎタンパク質の内因性レベルを検出することができる。
経細胞体内にも主に局在化するマウスのα－Ｓｙｎタンパク質の内因性レベルを検出することができる。
【0293】
α－ｓｙｎのＩＨＣの酵素による顕色のために、一次抗体溶液中でのインキュベーション後に、断片をビオチン化マウスＩｇＧ（ＢＡ ９２００ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌｏｔ Ｓ０９１３、１／４００希釈）と９０分間、次いで、ペルオキシダーゼが連結したアビジン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＡＢＣキット Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ ＰＫ ６１００、１／２００希釈）と３０分間、室温でインキュベートした。断片をペルオキシダーゼ基質溶液（０．１ＭのＰＢＳ中０．００３％の過酸化水素、０．０５％の四塩酸ジアミノベンジジンを含有する）中で簡単にインキュベートし、最終的に、０．９％のＮａＣｌ溶液中で濯いだ。最終的に、断片をスライド上に固定し、室温で乾燥させ、脱水し、Ｅｕｋｉｔｔを使用してカバーガラスをかけた。
【0294】
α－ｓｙｎのＩＳＨ研究では、スライド上に固定した２０μｍの厚みのクライオスタット断片に関する完全に自動化されたＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ（標的特異的シグナルを増幅させるが、非特異的ハイブリダイゼーションからのバックグラウンドノイズは増幅させないことによってＲＮＡのＩＳＨのシグナル・ノイズ比を改善する）をＲｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＸＴ（ＶＳ） ａｕｔｏｍａｔｅ．（ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＶＳアンチセンスプローブ－
Ｈｓ－ＳＮＣＡ（カタログ番号３１３２８９）にランし、対照のセンスプローブ（カタログ番号５１１０７９）を４３℃で２時間ハイブリダイズさせ、続いて、ＲＮＡｓｃｏｐｅを増幅させ、ＶＳ検出試薬を使用してＲｅｄ色素原を検出した。ＲＮＡｓｃｏｐｅのプローブを本明細書に記載されるように設計する。染色したスライドを４０Ｘの対物レンズを使用して、ＶＳ１２０ Ｏｌｙｍｐｕｓのシステムでスキャンした。
Ｈｓ－ＳＮＣＡ（カタログ番号３１３２８９）にランし、対照のセンスプローブ（カタログ番号５１１０７９）を４３℃で２時間ハイブリダイズさせ、続いて、ＲＮＡｓｃｏｐｅを増幅させ、ＶＳ検出試薬を使用してＲｅｄ色素原を検出した。ＲＮＡｓｃｏｐｅのプローブを本明細書に記載されるように設計する。染色したスライドを４０Ｘの対物レンズを使用して、ＶＳ１２０ Ｏｌｙｍｐｕｓのシステムでスキャンした。
【0295】
統計分析
該当する場合、多重比較（ダネット検定）を用いる一元ＡＮＯＶＡを使用するＰｒｉｓｍソフトウエア（バージョン６、Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標））を使用して統計を実行した。
該当する場合、多重比較（ダネット検定）を用いる一元ＡＮＯＶＡを使用するＰｒｉｓｍソフトウエア（バージョン６、Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標））を使用して統計を実行した。
【0296】
結果
図１０に示されるように、同じ動物の反対側のＳＮｃまたは対照を注射された動物と比較して、細胞体中のＳＮＣＡタンパク質は、ＡＡＶｒｈ中の構築物Ｅ１によって明らかに低減される。１０キャプシド（上のパネル）。隣接する脳断片からのＩＳＨ画像（下のパネル）は、ＡＡＶｒｈ．１０によるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの対応する標的の低減を示すが、反対側の半球では示さなかった。対照のＲＮＡｉウイルスは、未注射半球に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少を全く示さず、作用の特異性を実証した。Ｅ１によるＳＮＣＡのノックダウン効率は、少なくともベクターの黒質内注射の後には、キャプシドの血清型に依存しないことが本明細書において実証される。
図１０に示されるように、同じ動物の反対側のＳＮｃまたは対照を注射された動物と比較して、細胞体中のＳＮＣＡタンパク質は、ＡＡＶｒｈ中の構築物Ｅ１によって明らかに低減される。１０キャプシド（上のパネル）。隣接する脳断片からのＩＳＨ画像（下のパネル）は、ＡＡＶｒｈ．１０によるＳＮＣＡ ｍＲＮＡの対応する標的の低減を示すが、反対側の半球では示さなかった。対照のＲＮＡｉウイルスは、未注射半球に対して、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの減少を全く示さず、作用の特異性を実証した。Ｅ１によるＳＮＣＡのノックダウン効率は、少なくともベクターの黒質内注射の後には、キャプシドの血清型に依存しないことが本明細書において実証される。
【0297】
実施例８：Ｄ１およびＥ１の可能性のあるオフターゲット
Ｌｕｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ（ＬＵＨＭＥＳ）細胞を培養して分化させ、次いで、最適化したマウスの内因性ｍｉＲ－１５５足場（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でＤ１、Ｅ１、またはＣＴＬ３（対照）のｍｉｃｒｏＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした。ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞から全ＲＮＡを単離し、ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、次世代シーケンシングライブラリーを調製し、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ機器（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ ＮＪ）でシーケンシングした。
Ｌｕｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ（ＬＵＨＭＥＳ）細胞を培養して分化させ、次いで、最適化したマウスの内因性ｍｉＲ－１５５足場（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でＤ１、Ｅ１、またはＣＴＬ３（対照）のｍｉｃｒｏＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした。ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞から全ＲＮＡを単離し、ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、次世代シーケンシングライブラリーを調製し、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ機器（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ ＮＪ）でシーケンシングした。
【0298】
Ａｒｒａｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ、Ａ Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、ＳａｎｏｆｉのＧｅｎｏｍｉｃｓ群で、シーケンシング分析を実行した。精度の低いリードを除去し、残っているリードをヒトゲノムに対してマッピングし、続いて、一元ＡＮＯＶＡにより処置群の中で有意に差示的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）を決定した。０．０５未満のｐ値を有するＣＴＬ３に対して、Ｄ１とＥ１の両方によって下方調節された遺伝子は、アルファ－シヌクレインをノックダウンした結果であると考えられ、０．０５未満のｐ値を有する、少なくとも１．２分の一に下方調節された残っている遺伝子を可能性のあるオフターゲットとして分類した。アルファ－シヌクレインは、Ｄ１によって２２％、およびＥ１によって３０％ノックダウンされ、図１１において下に示した個々のデータ点を有する。Ｄ１およびＥ１に関する可能性のあるオフターゲットを表２および３に列挙する。Ｄ１リストのＴＮＦＲＳＦ６Ｂは、ＮＣＫＵデータベースのみの予測腫瘍抑制因子であり、Ｅ１リストの遺伝子はいずれも、ＮＣＫＵまたはＴＳＧｅｎｅデータベースのいずれかにおいて、腫瘍抑制因子であると予測されなかった。可能性のあるオフターゲットのＤ１およびＥ１リストの両方は、ｍｉＲａｎｄａ、ｓｉＳＰＯＴＲ、およびＴａｒｇｅｔＲａｎｋ（データは含まれない）アルゴリズムを使用して同定したＤ１およびＥ１のｍｉｃｒｏＲＮＡに関する予測標的と重複した。
【0299】
【表2】
【0300】
【表3】
【0301】
参照文献
1. S. T. Baek et al., Off-target effect of doublecortin family shRNA on neuronal migration associated with endogenous microRNA dysregulation. Neuron 82, 1255-1262 (2014).
2. W. Dauer et al., Resistance of alpha -synuclein null mice to the parkinsonian neurotoxin MPTP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 14524-14529 (2002).
3. R. E. Drolet, B. Behrouz, K. J. Lookingland, J. L. Goudreau, Mice lacking alpha-synuclein have an attenuated loss of striatal dopamine following prolonged
chronic MPTP administration. Neurotoxicology25, 761-769 (2004).
4. D. Alvarez-Fischer et al., Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and alpha-synuclein-deleted mice. Experimental neurology 210, 182-193 (2008).
5. P. Klivenyi et al., Mice lacking alpha-synuclein are resistant to mitochondrial toxins. Neurobiology of disease 21, 541-548 (2006).
6. S. Mittal et al., beta2-Adrenoreceptor is a regulator of the alpha-synuclein gene driving risk of Parkinson's disease. Science 357, 891-898 (2017).
7. H. Javed et al., Development of Nonviral Vectors Targeting the Brain as a Therapeutic Approach For Parkinson's Disease and Other Brain Disorders. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 24, 746-758 (2016).
8. K. Ubhi et al., Alpha-synuclein deficient mice are resistant to toxin-induced multiple system atrophy. Neuroreport 21, 457-462 (2010).
9. Y. Lim et al., alpha-Syn suppression reverses synaptic and memory defects in a mouse model of dementia with Lewy bodies. The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience 31, 10076-10087 (2011).
10. S. Schildknecht et al., Generation of genetically-modified human differentiated cells for toxicological tests and the study of neurodegenerative diseases.
Altex30, 427-444 (2013).
11. X. Xiao, J. Li, R. J. Samulski, Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of virology 72, 2224-2232 (1998).
1. S. T. Baek et al., Off-target effect of doublecortin family shRNA on neuronal migration associated with endogenous microRNA dysregulation. Neuron 82, 1255-1262 (2014).
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3. R. E. Drolet, B. Behrouz, K. J. Lookingland, J. L. Goudreau, Mice lacking alpha-synuclein have an attenuated loss of striatal dopamine following prolonged
chronic MPTP administration. Neurotoxicology25, 761-769 (2004).
4. D. Alvarez-Fischer et al., Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and alpha-synuclein-deleted mice. Experimental neurology 210, 182-193 (2008).
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7. H. Javed et al., Development of Nonviral Vectors Targeting the Brain as a Therapeutic Approach For Parkinson's Disease and Other Brain Disorders. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 24, 746-758 (2016).
8. K. Ubhi et al., Alpha-synuclein deficient mice are resistant to toxin-induced multiple system atrophy. Neuroreport 21, 457-462 (2010).
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official journal of the Society for Neuroscience 31, 10076-10087 (2011).
10. S. Schildknecht et al., Generation of genetically-modified human differentiated cells for toxicological tests and the study of neurodegenerative diseases.
Altex30, 427-444 (2013).
11. X. Xiao, J. Li, R. J. Samulski, Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of virology 72, 2224-2232 (1998).
【0302】
配列
全てのポリペプチド配列は、別段の指定がない限り、Ｎ末端からＣ末端に向かって表される。全ての核酸配列は、別段の指定がない限り、５’から３’に向かって表される。
全てのポリペプチド配列は、別段の指定がない限り、Ｎ末端からＣ末端に向かって表される。全ての核酸配列は、別段の指定がない限り、５’から３’に向かって表される。
【0303】
Ｄ１－ループ－パッセンジャー－ＲＮＡ
ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ（配列番号６１）
ＵＧＣＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＧＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＵＡ（配列番号６１）
【0304】
Ｄ１－ループ－パッセンジャー－ＤＮＡ
ＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡ（配列番号６２）
ＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡ（配列番号６２）
【0305】
Ｅ１－ループ－パッセンジャー－ＲＮＡ
ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ（配列番号６３）
ＵＧＧＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＣＵＣＡＧＵＣＡＡＵＧＵＧＣＣＵＡ（配列番号６３）
【0306】
Ｅ１－ループ－パッセンジャー－ＤＮＡ
ＴＧＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＡ（配列番号６４）
ＴＧＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＡ（配列番号６４）
【0307】
Ｄ１のベクターゲノム配列
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＡＣＧＴＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ
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【0308】
Ａ１ＡＴスタッファー核酸
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、
ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は二本鎖を形成し；
ｂ）該第１の鎖は、ガイド領域を含み、該ガイド領域は、配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびに
ｃ）該第２の鎖は、非ガイド領域を含む、前記ＲＮＡｉ。
ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は二本鎖を形成し；
ｂ）該第１の鎖は、ガイド領域を含み、該ガイド領域は、配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含み；ならびに
ｃ）該第２の鎖は、非ガイド領域を含む、前記ＲＮＡｉ。
【請求項2】
ガイド領域は、核酸配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項3】
ガイド領域は、核酸配列５'－ＡＣＵＧＣＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＡＣＵＧＡＧ－３'（配列番号２９）を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項4】
第２の鎖は、配列５'－ＣＵＣＡＧＵＵＣＡＵＧＵＧＣＧＣＡＧＵ－３'（配列番号５８）に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項5】
第２の鎖は、核酸配列５'－ＣＵＣＡＧＵＵＣＡＵＧＵＧＣＧＣＡＧＵ－３'（配列番号５８）に対して約９０％の同一性を有する核酸を含む、請求項４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項6】
第２の鎖は、核酸５'－ＣＵＣＡＧＵＵＣＡＵＧＵＧＣＧＣＡＧＵ－３'（配列番号５８）を含む、請求項４に記載のＲＮＡｉ。
【請求項7】
第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項8】
ＲＮＡリンカーは、４から５０ヌクレオチドを含む、請求項７に記載のＲＮＡｉ。
【請求項9】
ループ構造は、４から２０ヌクレオチドを含む、請求項７または８に記載のＲＮＡｉ。
【請求項10】
ＲＮＡｉは、低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項11】
ＲＮＡｉは、神経変性シヌクレイン病に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項12】
ポリペプチドは、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）である、請求項１１に記載のＲＮＡｉ。
【請求項13】
アルファシヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレインである、請求項１２に記載のＲＮＡｉ。
【請求項14】
神経変性シヌクレイン病は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現構築物。
【請求項16】
ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項１５に記載の発現構築物。
【請求項17】
請求項１５または１６に記載の発現構築物を含むベクター。
【請求項18】
組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
発現構築物は、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する、請求項１８に記載のベクター。
【請求項20】
発現構築物は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する、請求項１９に記載のベクター。
【請求項21】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項１９または２０に記載のベクター。
【請求項22】
ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項23】
哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための医薬組成物であって、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉを含む前記医薬組成物。
【請求項24】
哺乳動物における神経変性シヌクレイン病を処置するための医薬組成物であって、請求項１７～２３のいずれか１項に記載のベクターを含む前記医薬組成物。
【外国語明細書】