特開 2024-156772 大腸菌組成物およびその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024156772

(43)【公開日】2024-11-06

(54)【発明の名称】大腸菌組成物およびその方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/108 20060101AFI20241029BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241029BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241029BHJP

   A61K 31/715 20060101ALI20241029BHJP

   C07K 14/34 20060101ALN20241029BHJP

【ＦＩ】

A61K39/108

A61K38/16 ZNA

A61P37/04

A61K47/64

A61K31/715

A61K38/16

A61K39/108 ZNA

C07K14/34

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024121820

(22)【出願日】2024-07-29

(62)【分割の表示】P 2021509187の分割

【原出願日】2019-08-20

(31)【優先権主張番号】62/722,370

(32)【優先日】2018-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/784,940

(32)【優先日】2018-12-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/881,361

(32)【優先日】2019-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

２．ＢＲＩＪ

３．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

４．ＳＰＡＮ

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ジー．ケイ． ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】アナリサ シビル アンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】ローレント オリヴァー コッロ

(72)【発明者】

【氏名】ジャンシン グウ

(72)【発明者】

【氏名】ジン―フアン キム

(72)【発明者】

【氏名】スリニヴァス コダリ

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン アーノルド ロトゥヴィン

(72)【発明者】

【氏名】ジャスティン キース モラン

(72)【発明者】

【氏名】ロサリンド パン

(72)【発明者】

【氏名】アヴァリ クリシュナ プラサド

(72)【発明者】

【氏名】マーク エドワード ラペン

(72)【発明者】

【氏名】サダーム シング

(72)【発明者】

【氏名】リング チュウ

(72)【発明者】

【氏名】スコット エリス ロンバーク

(72)【発明者】

【氏名】カレン キヨコ タカネ

(72)【発明者】

【氏名】ニシス マーチャント

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ チェン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を惹起するための組成物およびその使用方法を提供する。
【解決手段】一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖に由来する改変されたＯ多糖分子およびそのコンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。多価ワクチンを、異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に関する２つ以上の一価免疫原性組成物を組み合わせることによって調製することができる。一実施形態では、改変されたＯ多糖分子は、ｗｚｚ遺伝子を含む組換え細菌によって産生される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）表１に示される式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは３１～７０の整数である）

からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｂ）表１に示される式Ｏ１Ａ（式中、ｎは３１～５０の整数である）からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｃ）表１に示される式Ｏ２（式中、ｎは３１～７０の整数である）からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および（ｄ）表１に示される式Ｏ６：Ｋ２、式Ｏ６：Ｋ１３、式Ｏ６：Ｋ１５、または式Ｏ６：Ｋ５４（式中、ｎは３１～６０の整数である）からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物。

【請求項2】

表１に示される式Ｏ１６（式中、ｎは３１～７０の整数である）、式Ｏ１７（式中、ｎは３１～５０の整数である）、式Ｏ１８（式中、ｎは３１～５０の整数である）および式Ｏ７５（式中、ｎは３１～７０の整数である）のうちのいずれか１つから選択される構造からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原多糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

組成物中のＯ抗原多糖の総量と比較して最大で２５％の遊離糖を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

有効量の請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起するための薬剤。

【請求項5】

免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、請求項４に記載の薬剤。

【請求項6】

免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、請求項４に記載の薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／７２２，３７０号、２０１８年１２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／７８４，９４０号、および２０１９年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８８１，３６１号の優先権を主張し、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）組成物およびその方法に関する。

【背景技術】

【0003】

グラム陰性細菌の細胞壁は、外膜と、外膜の内側にペプチドグリカン層とを含む。外膜は、リン脂質、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質および膜タンパク質を含む。リポ多糖は、膜の外層に見出され、リン脂質は、その内層に見出される。

【0004】

ＬＰＳは、コアオリゴ糖を、糖モノマー反復単位を含有するＯ多糖のポリマーに連結するリピドＡ膜アンカーを含み、短い、長い、または非常に長いＯ鎖を形成する。コアオリゴ糖は個々の細菌種内でほとんど保存されているが、Ｏ多糖は血清型間で可変性であり得る。

【0005】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、生命を脅かす細菌敗血症を引き起こすことが知られるグラム陰性細菌である。莢膜（Ｋ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ抗原は両方とも、重要なビルレンス因子である。

【0006】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためのワクチンの基礎としてのＯ多糖の使用には著しい関心がある。しかしながら、従来の化学的コンジュゲーションまたはバイオコンジュゲーション手法を使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖コンジュゲートワクチンを開発する以前の試みは、全ての血清型に対するロバストな機能的免疫応答を生成できなかった。したがって、ロバストな機能的免疫応答を生成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫原性組成物に対する満たされていない必要性が存在する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

これらの必要性およびその他の必要性を満たすために、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を惹起するための組成物およびその使用方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一実施形態では、本発明は、生体プロセス開発のための改善された特性および高密度の免疫原性エピトープを有する、より長いＯ抗原リポ多糖（ＬＰＳ）を発現するように操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から得られる糖、コンジュゲート、およびそれを含む組成物に関する。例えば、一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、高コピープラスミドからサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｆｅｐＥ遺伝子を発現するように操作され、これは、異なるＯ抗原血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における長鎖ＬＰＳの産生をもたらした。

【0009】

初期の株の開発は、治療困難な、新たな多剤耐性単離物と関連する、血清型Ｏ２５ｂのＯ抗原に焦点を合わせた。ｗｚｚＢ遺伝子を、臨床大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ｂ株から欠失させた。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドを用いる形質転換の後、ここで操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ｂ株は、長鎖ＬＰＳだけを産生した。細菌表面からＯ抗原を遊離させるための酢酸を用いる化学的抽出の後、得られた長鎖Ｏ２５ｂ多糖は、従来の精製およびコンジュゲーション技術に適していた。バイオコンジュゲーションにより産生されたＯ抗原と違って、これらのより長い鎖のＯ抗原は、殺菌的であり、かつ敗血症をブロックすることができる機能的抗体を惹起する能力を独立に有する、内側および外側コアオリゴ糖を保持する。例示的なＯ２５ｂ糖コンジュゲートは驚くべきことに、非コンジュゲート化多糖よりも、哺乳動物において有意に免疫原性が高かった。

【0010】

したがって、一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも５つの反復単位の増加を含む糖に関する。

【0011】

一実施形態では、組成物は、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは１～１０００の整数である）から選択される構造を含む。表１ならびに図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａ～Ｂを参照されたい。

【0012】

本明細書で使用される場合、別途明示的に記述しない限り、用語「式中、ｎは～である」とは、群から選択される式中の「ｎ」を指す。一実施形態では、組成物は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは１～１０００の整数である）から選択される構造を含む。表１ならびに図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａ～Ｂを参照されたい。

【0013】

一実施形態では、組成物は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ２２、式Ｏ３５、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ８３、式Ｏ９１、式Ｏ１０５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１３９、式Ｏ１５３、式Ｏ１６７、および式Ｏ１７２（式中、ｎは１～１０００の整数である）から選択される構造を含む。表１ならびに図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａを参照されたい。

【0014】

一実施形態では、組成物は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、および式６２Ｄ_１（式中、ｎは１～１０００の整数である）から選択される構造を含む。表１および図９Ａ～Ｃを参照されたい。

【0015】

一実施形態では、組成物は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１から選択される構造を含まない。別の実施形態では、組成物は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を含む。表１および図１０Ｂを参照されたい。

【0016】

一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２５ｂ、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ_１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のいずれか１つから選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型である。

【0017】

一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２５ｂ、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ_１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７からなる群から選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型である。

【0018】

一実施形態では、糖は、前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一実施形態では、糖は、前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を発現させる（必ずしも過剰発現させない）ことを含む、培養物中のグラム陰性細菌によって産生されるＯ多糖の反復単位を増加させることによって産生される。好ましい実施形態では、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択される。好ましい実施形態では、発現される（必ずしも過剰発現されない）ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される。代替的な実施形態では、糖は、合成される。一実施形態では、糖は、担体タンパク質に共有結合（コンジュゲート）される。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0019】

一態様では、本発明は、糖および／またはそのコンジュゲートと、薬学的に許容できる希釈剤とを含む組成物に関する。

【0020】

別の態様では、本発明は、対象における免疫応答を誘導するための方法であって、対象に、有効量の組成物を投与することを含む方法に関する。一実施形態では、免疫応答は、抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖抗体の誘導を含む。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１Ａ～Ｂは、ｐＵＣレプリコン、細胞あたり５００～７００コピー、鎖長調節因子（図１Ａ）およびＰ１５ａレプリコン、細胞あたり１０～１２コピー、Ｏ抗原オペロン（図１Ｂ）プラスミドを描写する。

【図2】図２は、Ｋ１２＼Ｗ３１１０＼ＷｚｚＢ（配列番号２３）；Ｏ２５ａ＼ＥＴＥＣ＼ＡＴＣＣ＼ＷｚｚＢ（配列番号２２）；Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１＼ＷｚｚＢ（配列番号２１）；Ｏ２５ｂ＼２４０１＼ＷｚｚＢ（配列番号２０）；およびＯ２５ｂ＼２４０１＼ＷｚｚＢ（配列番号２０）を示す、ＷｚｚＢアミノ酸配列アラインメントである。

【図3】図３Ａ～Ｂは、異種ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ鎖長調節因子のプラスミドに基づく発現による、血清型Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂにおけるＯ抗原鎖長のモジュレーションを示す。ｗｚｚＢノックアウト株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１（Ｏ２５ａ）およびＧＡＲ２４０１（Ｏ２５ｂ）のプラスミド形質転換体中でのＬＰＳ発現の遺伝的相補性が示される。図３Ａの左側に、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルを示す；右側には、Ｏ２５ｂ ＧＡＲ ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の同様のプロファイルを示す。Ｏ２５特異的血清（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）を用いて探査した複製ゲルのイムノブロットを、図３Ｂに示す。レーン１～７と関連するＯ２５ａΔｗｘｘＢ（ノックアウト）バックグラウンド；レーン８～１５と関連するＯ２５ｂ ２４０１ΔｗｚｚＢ（ノックアウト）バックグラウンド。

【図4】図４は、宿主Ｏ２５Ｋ５Ｈ１ΔｗｚｚＢ中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドによりもたらされた長鎖Ｏ抗原発現を示す。

【図5】図５は、ＦｅｐＥアミノ酸配列アラインメントを示す。Ｏ１５７ ＦｅｐＥアミノ酸配列は、配列番号１８である；Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥアミノ酸配列は、配列番号１７である；Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥアミノ酸配列は、配列番号１６である；Ｏ２５ｂ２４０１ＦｅｐＥアミノ酸配列は、配列番号１５である；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＦｅｐＥアミノ酸配列は、配列番号１９である。

【図6】図６は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ発現は、様々な臨床単離物中で長鎖Ｏ抗原ＬＰＳを生成する。

【図7】図７Ａ～Ｂは、Ｏ２５ｂ Ｏ抗原ノックアウト宿主株中でのＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原ＬＰＳのプラスミド媒介性アラビノース誘導性発現を示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥからの結果を図７Ａに示し、Ｏ２５イムノブロットからの結果を図７Ｂに示す。図７Ａと図７Ｂの両方において、レーン１は、クローン１、アラビノースなしに由来する；レーン２は、クローン１、０．２％アラビノースに由来する；レーン３は、クローン９、アラビノースなしに由来する；レーン４は、クローン９、０．２％アラビノースに由来する；レーン５は、Ｏ５５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準に由来する；およびレーン６は、Ｏ１１１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準に由来する。

【図8】図８は、共通の宿主株中での長鎖Ｏ抗原ＬＰＳのプラスミド媒介性アラビノース誘導性発現を示す。

【図9】図９Ａ～Ｃは、骨格中に４個以下の残基を含む、ポリメラーゼ依存的経路によって合成されるＯ抗原の構造を示す。

【図10】図１０Ａは、骨格中に５個または６個の残基を含む、ポリメラーゼ依存的経路によって合成されるＯ抗原の構造を描写する；図１０Ｂは、ＡＢＣトランスポーター依存的経路によって合成されると考えられるＯ抗原を描写する。

【図11】図１１は、探索的生体プロセス株中でのＯ２５ Ｏ抗原ＬＰＳの発現を示す。

【図12】図１２Ａ～Ｂは、ＧＡＲ２８３１および’２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ株から精製された短鎖（図１２Ａ、株１、Ｏ２５ｂ ｗｔ２８３１）および長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原（図１２Ｂ、株２、Ｏ２５ｂ ２４０１ΔｗｚｚＢ／ＬＴ２ ＦｅｐＥ）のＳＥＣプロファイルおよび特性を示す。

【図13】（図１３Ａ）ウサギ試験１ ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３のワクチン接種スケジュールに関する情報；（図１３Ｂ）ウサギ試験２ ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７のワクチン接種スケジュール。

【図14】図１４Ａ～Ｃは、Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートＩｇＧ応答を示す。－●－は、出血前の結果を表す；－■－出血１（第６週）；－▲－出血２（第８週）；－◆－出血３（第１２週）。図１４Ａは、ウサギ１－３の結果を描写する（中活性化）；図１４Ｂは、ウサギ２－３の結果を描写する（低活性化）；図１４Ｃは、ウサギ３－１の結果を描写する（高活性化）。

【図15】図１５Ａ～Ｆは、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（図１５Ｄ～Ｆにおいて、－●－は、ウサギ２－１に由来する出血前の結果を表し、－■－は、ウサギ２－１に由来する第１２週の抗血清の結果を表す）と、非コンジュゲート化多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図１５Ａ～Ｃにおいて、－●－は、ウサギＡ－１に由来する出血前の結果を表し、－■－は、ウサギＡ－１に由来する第６週の抗血清の結果を表し、－▲－は、ウサギＡ－１に由来する第８週の抗血清の結果を表す）とに対するＩｇＧ応答を示す。ＭＦＩは対数尺度でプロットされ、１０００未満のＭＦＩ範囲で免疫前抗体と免疫抗体との差異を強調することに留意されたい。図１５Ａは、ウサギＡ－１の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図１５Ｂは、ウサギＡ－３の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図１５Ｃは、ウサギＡ－４の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図１５Ｄは、ウサギ２－１の結果を描写する（低活性化）；図１５Ｅは、ウサギ２－２の結果を描写する（低活性化）；および図１５Ｆは、ウサギ２－３の結果を描写する（低活性化）。

【図16】図１６Ａ～Ｃは、Ｏ２５ｂ抗血清を用いて検出された、天然のＯ２５ｂ Ｏ抗原と長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原の表面発現を示す。図１６Ａは、－●－がＯ２５ｂ ２８３１対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－■－がＯ２５ｂ ２８３１ ｗｔ対出血前の結果を表し、－▲－がＯ２５ｂ ２８３１／ｆｅｐＥ対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－▼－がＯ２５ｂ ２８３１／ｆｅｐＥ対出血前の結果を表す、結果を描写する。図１６Ｂは、－●－がＯ２５ｂ ２４０１対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－■－がＯ２５ｂ ２４０１対出血前の結果を表し、－▲－がＯ２５ｂ ２４０１／ｆｅｐＥ対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－▼－がＯ２５ｂ ２４０１／ｆｅｐＥ対出血前の結果を表す、結果を描写する。図１６Ｃは、－●－が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－■－が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２対出血前の結果を表す、結果を描写する。

【図17】図１７は、５つの公知のケモタイプの外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化された構造を示す。全てのグリコースは、別途指摘しない限り、α－アノマー配置にある。生成物がそれぞれの結合の形成を触媒する遺伝子を、破線の矢印で示す。星印は、Ｏ抗原の結合が生じるコアオリゴ糖の残基を示す。

【図18】図１８は、非コンジュゲート化遊離Ｏ２５ｂ多糖が免疫原性ではないことを示す図である（ｄＬＩＡ）。－●－は４－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－■－は、４－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－▲－は、５－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－▼－は、５－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－＊－は、６－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－＾－は、６－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す。

【図19】図１９Ａ～Ｃは、ＢＲＣウサギＯ２５ｂ ＲＡＣコンジュゲート免疫血清ＯＰＡ力価の特異性を示すグラフである。図１９Ａは、免疫前血清－●－および免疫後血清第１３週－■－のウサギ２－３のＯＰＡ力価を示す。図１９Ｂは、免疫前血清－●－および免疫後血清第１９週－■－のウサギ１－２のＯＰＡ力価を示す。図１９Ｃは、ウサギ１－２の第１９週のＯＰＡ力価特異性を示す。ウサギ１－２の免疫血清のＯＰＡ活性は、１００μｇ／ｍＬの精製非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖と共に予備インキュベートすることによって遮断される。－■－は、ウサギ１－２の免疫血清第１９週の結果を表し、－▼－は、ウサギ１－２の第１９週のｗ／Ｒ１長鎖ＯＡｇの結果を表す。

【図20】図２０Ａは、例示的な投与スケジュールを示す。図２０Ｂおよび図２０Ｃは、非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖（図２０Ｂ、Ｏ２５ｂ遊離ポリ（２μｇ））および誘導されたＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲート（図２０Ｃ、Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ_１９７ ＲＡＣ長鎖（２μｇ））により惹起されたＯ抗原Ｏ２５ｂ ＩｇＧレベルを描写するグラフを示す。－．．．－（点線）は、ナイーブなＣＤ１ Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを表す。

【図21】図２１Ａ～Ｂは、用量２後（図２１Ａ）および用量３後（図２１Ｂ）の、ＲＡＣ、ｅＴＥＣ Ｏ２５ｂ長鎖糖コンジュゲート、および単一末端糖コンジュゲートのＯＰＡ免疫原性を描写するグラフである。－○－は、単一末端の短い２μｇの結果を表し、－●－は単一末端の長い２μｇの結果を表し、－▲－は、ＲＡＣ／ＤＭＳＯの長い２μｇの結果を表し、－▼－は、ｅＴＥＣの長い２μｇの結果を表し、＊はバックグラウンド対照（ｎ＝２０）を表す。†応答率は、ワクチン接種していないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの％である。

【図22】図２２は、ｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性および改変されたレベルの多糖活性化を描写するグラフである。†応答率は、ワクチン接種していないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの％である。

【図23】図２３Ａは、例示的な投与スケジュールを示し、図２３Ｂは、Ｏ２５ｂ単離物による致死性チャレンジに由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｅＴＥＣコンジュゲートの用量で免疫されたマウスの保護を描写するグラフを示す。－◇－は、ｅＴＥＣ長鎖の１７％の活性化を表し、－△－は、ｅＴＥＣ長鎖の１０％の活性化を表し、－▽－は、ｅＴＥＣ長鎖の４％の活性化を表し、－□－は、Ｏ２５ｂ多糖を表し、－○－はワクチン接種していない対照を表す。

【図24】図２４は、単一末端コンジュゲートの例示的調製を示す略図であり、コンジュゲーションプロセスは、チオール官能基の脱マスキング時の、ジスルフィドアミンリンカーによる２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の選択的活性化を含む。次いで、ＫＤＯを、図２４に描写されるようにブロモ活性化ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートする（単一末端コンジュゲートの調製）。

【図25】図２５Ａ～Ｂは、ＣＲＭ_１９７への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖コンジュゲートの調製において使用される活性化（図２５Ａ）およびコンジュゲーション（図２５Ｂ）プロセスに関する例示的なプロセスフローダイアグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

配列識別子
配列番号１は、表４に記載される、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号２は、表４に記載される、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号３は、表４に記載される、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４は、表４に記載される、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ａのプライマー配列を記載する。
配列番号５は、表４に記載される、ｗｚｚＢ Ｐ１＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号６は、表４に記載される、ｗｚｚＢ Ｐ２＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号７は、表４に記載される、ｗｚｚＢ Ｐ３＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号８は、表４に記載される、ｗｚｚＢ Ｐ４＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号９は、表４に記載される、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号１０は、表４に記載される、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号１１は、表４に記載される、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号１２は、表４に記載される、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号１３は、表４に記載される、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ＿ｒのプライマー配列を記載する。
配列番号１４は、表４に記載される、ｇｎｄ＿ｆのプライマー配列を記載する。
配列番号１５は、図５に示されるＯ２５ｂ ２４０１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１６は、図５に示されるＯ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１７は、図５に示されるＯ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１８は、図５に示されるＯ１５７ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１９は、図５に示されるサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号２０は、図２に示されるＯ２５ｂ ２４０１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号２１は、図２に示されるＯ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２は、図２に示されるＯ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号２３は、図２に示されるＫ１２ Ｗ３１１０ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号２４は、図２に示されるサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。

【0023】

発明の詳細な説明
本発明者らは驚くべきことに、免疫原性コンジュゲートおよびその使用方法の驚くべき発見を含め、異なるＷｚｚタンパク質（例えば、ＷｚｚＢ）の操作の結果得られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原を発見した。本発明者らはさらに驚くべきことに、例えば、本明細書では（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーと呼ばれる、二価の、ヘテロ二官能性リンカーなどを介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされたそのような糖を含有する糖コンジュゲートを発見した。本発明者らはまた驚くべきことに、例えば、還元的アミノ化（ＲＡＣ）などを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含有する糖コンジュゲートを発見した。特に、ＲＡＣは、非プロトン性溶媒、好ましくは、ＤＭＳＯ（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）中または水性溶液中で行われる。本発明はさらに、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物の使用のための方法に関する。さらに、本発明者らは驚くべきことに、一部の実施形態では、中間の、または長いＯ抗原鎖を有する高分子量糖を含有する糖コンジュゲートが、相対的に短いＯ抗原鎖を有する糖コンジュゲートと比較して、免疫原性が高いことがあることを発見した。さらに、本発明者らは、一部の実施形態では、例えば、ＲＡＣまたは単一末端コンジュゲーションまたはｅＴＥＣを含む方法などにより、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に糖の複数末端活性化によって産生される糖コンジュゲートが、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に糖の単一末端活性化によって産生される糖コンジュゲートよりも免疫原性が高いことがあることを発見した。

【0024】

一実施形態では、糖は、糖のサイズを制御するために、異なるＷｚｚタンパク質（例えば、ＷｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）によって産生される。

【0025】

本明細書で使用される場合、用語「糖」は、単一の糖部分または単糖単位ならびに二糖、オリゴ糖、および多糖を形成するように共有結合した２つ以上の単一の糖部分または単糖単位の組合せを指す。糖は、線状または分枝状であってもよい。

【0026】

一実施形態では、糖は、組換えグラム陰性細菌中で産生される。一実施形態では、糖は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で産生される。一実施形態では、糖は、組換えサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞中で産生される。例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤ５５９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８９６、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ１９０２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａ ＥＴＣ ＮＲ－５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ－、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＣＶＤ１９４３、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＣＶＤ１９２５、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型パラティフィ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ ＣＶＤ１９０２、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＣＶＤ１２０８Ｓが挙げられる。一実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１ではない。糖産生に対するこの遺伝的手法は、ワクチン成分としてのＯ多糖およびＯ抗原分子の効率的な産生を可能にする。

【0027】

本明細書で使用される用語「ｗｚｚタンパク質」とは、例えば、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２などの、鎖長決定因子ポリペプチドを指す。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｅ４９９１／７６についてはＡＦ０１１９１０、Ｆ１８６についてはＡＦ０１１９１１、Ｍ７０／１－１についてはＡＦ０１１９１２、７９／３１１についてはＡＦ０１１９１３、Ｂｉ７５０９－４１についてはＡＦ０１１９１４、Ｃ６６４－１９９２についてはＡＦ０１１９１５、Ｃ２５８－９４についてはＡＦ０１１９１６、Ｃ７２２－８９についてはＡＦ０１１９１７、およびＥＤＬ９３３についてはＡＦ０１１９１９である。Ｇ７およびＢｉ３１６－４１ ｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれ、Ｕ３９３０５およびＵ３９３０６である。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するさらなるＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４５９５８１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ ＦｅｐＥについてはＡＩＧ６６８５９；サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４６１０２４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４１６５３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４１５１１９である。好ましい実施形態では、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つ、最も好ましくは、ｗｚｚＢ、より好ましくは、ｆｅｐＥである。

【0028】

例示的なｗｚｚＢ配列としては、
＞Ｏ２５ｂ ２４０１ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＥＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＥＱＶＴＫＰＱＶＱＱＴＥＤＶＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＳＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２０）
＞Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＮＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＤＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２１）
＞Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＶＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＦＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＫＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＤＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＬＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＮＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＳＫ（配列番号２２）
＞Ｋ１２ Ｗ３１１０ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＥＥＲＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＭＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２３）
＞サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＷｚｚＢ
ＭＴＶＤＳＮＴＳＳＧＲＧＮＤＰＥＱＩＤＬＩＥＬＬＬＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＶＡＶＩＩＡＩＬＬＡＶＧＹＬＭＩＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＡＡＱＶＡＴＹＴＮＡＬＮＶＬＹＧＧＮＡＰＫＩＳＥＶＱＡＮＦＩＳＲＦＳＳＡＦＳＡＬＳＥＶＬＤＮＱＫＥＲＥＫＬＴＩＥＱＳＶＫＧＱＡＬＰＬＳＶＳＹＶＳＴＴＡＥＧＡＱＲＲＬＡＥＹＩＱＱＶＤＥＥＶＡＫＥＬＥＶＤＬＫＤＮＩＴＬＱＴＫＴＬＱＥＳＬＥＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＫＱＩＥＥＡＬＲＹＡＤＥＡＫＩＴＱＰＱＩＱＱＴＱＤＶＴＱＤＴＭＦＬＬＧＳＤＡＬＫＳＭＩＱＮＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＡＹＹＱＴＫＱＴＬＬＤＩＫＮＬＫＶＴＡＤＴＶＨＶＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＶＲＲＤＳＰＫＴＡＩＴＬＶＬＡＶＬＬＧＧＭＩＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＳＹＫＰＫＡＬ（配列番号２４）
が挙げられる。

【0029】

例示的なＦｅｐＥ配列としては、
＞Ｏ２５ｂ ＧＡＲ２４０１ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＳＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＴＬＶＶＫＥＳＬＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＨＶＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１５）
＞Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＥＡＨＦＰＥＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＥＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＴＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＰＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＳＡＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＫＶＬＡＧＹＩＤＹＩＳＡＬＶＶＫＥＳＩＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＴＮＩＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＲＰＳＬＰＶＫＫＤＧＱＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＶＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＨＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１６）
＞Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＳＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＴＬＶＶＫＥＳＬＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＨＶＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１７）
＞Ｏ１５７ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＴＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＡＬＶＶＫＥＳＩＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＭＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＮＩＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＳＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１８）
＞サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＦｅｐＥ
ＭＰＳＬＮＶＫＱＥＫＮＱＳＦＡＧＹＳＬＰＰＡＮＳＨＥＩＤＬＦＳＬＩＥＶＬＷＱＡＫＲＲＩＬＡＴＶＦＡＦＡＣＶＧＬＬＬＳＦＬＬＰＱＫＷＴＳＱＡＩＶＴＰＡＥＳＶＱＷＱＧＬＥＲＴＬＴＡＬＲＶＬＤＭＥＶＳＶＤＲＧＳＶＦＮＬＦＩＫＫＦＳＳＰＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＧＡＱＩＤＥＱＤＬＨＲＡＩＶＬＬＳＥＫＭＫＡＶＤＳＮＶＧＫＫＮＥＴＳＬＦＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＲＥＥＡＱＫＶＬＡＧＹＩＱＹＩＳＤＩＶＶＫＥＴＬＥＮＩＲＮＱＬＥＩＫＴＲＹＥＱＥＫＬＡＭＤＲＶＲＬＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＨＹＳＬＥＩＡＮＡＡＧＩＫＲＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＳＲＫＬＥＩＥＫＧＶＴＤＶＡＥＩＤＧＤＬＲＮＲＱＹＨＶＥＱＬＡＡＭＮＶＳＤＶＫＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＩＩＬＡＡＬＩＧＧＭＭＡＣＧＧＶＬＬＲＨＡＭＶＳＲＫＭＥＮＡＬＡＩＤＥＲＬＶ（配列番号１９）
が挙げられる。

【0030】

一部の実施形態では、改変された糖（対応する野生型糖と比較して改変されている）を、グラム陰性細菌中でグラム陰性細菌からｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｆｅｐＥ）を発現させる（必ずしも過剰発現させない）ことによって、および／または第２のｗｚｚ遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）のスイッチを切って（すなわち、抑制して、欠失させて、除去して）、中間の、もしくは長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成することによって産生させることができる。例えば、改変された糖を、ｗｚｚ２を発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚ１のスイッチを切ることによって産生させることができる。または、別の方法では、改変された糖を、ｗｚｚｆｅｐＥを発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚＢのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｗｚｚＢを発現させる（必ず祖も過剰発現させない）が、ｗｚｚｆｅｐＥのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｆｅｐＥを発現させることによって産生させることができる。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、宿主細胞にとって異種である株に由来する。

【0031】

一部の実施形態では、糖は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つに対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一実施形態においては、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、糖は、ｆｅｐＥタンパク質に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることによって産生される。

【0032】

一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中で、ｗｚｚファミリータンパク質、好ましくは、ｆｅｐＥを発現させて、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中から、ｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現させて（必ずしも過剰発現させない）、対応する野生型Ｏ抗原と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。対応する野生型糖と比較して、反復単位の数が増加したさらなる例示的な糖については、以下のＯ多糖およびＯ抗原の記載を参照されたい。望ましい鎖長は、所与のワクチン構築物との関連で改善された、または最大の免疫原性をもたらすものである。

【0033】

別の実施形態では、糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、実施例５に記載されるような、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。

【0034】

好ましい実施形態では、本発明は、内因性ｗｚｚ Ｏ抗原長調節因子の遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）が欠失し、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にとって異種のグラム陰性細菌に由来する（第２の）ｗｚｚ遺伝子（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ）で置き換えられ、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で産生される糖に関する。一部の実施形態では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、好ましくは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するｗｚｚ遺伝子を含む。

【0035】

一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当業界で公知である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。

【0036】

一態様では、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための炭素源は、当業界で公知である。例示的な炭素源としては、限定されるものではないが、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネートおよびメチルアミンなどの、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖またはケト糖が挙げられる。好ましい実施形態では、培地は、グルコースを含む。一部の実施形態では、培地は、炭素源として、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースおよびアラビノースを含む。培養を開始する前に、全ての炭素源を培地に添加するか、または培養中に少しずつ、もしくは連続的に添加してもよい。

【0037】

組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４－２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２－６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２－４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２およびＣａＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ_４－２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２－６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２－４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２およびＣａＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏを含む。

【0038】

本明細書で使用される培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）または天然であってよく、組換え宿主細胞の培養のための十分な栄養素を含んでもよい。好ましくは、培地は、液体培地である。

【0039】

一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、さらなる炭素源をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および追加炭素源をさらに含んでもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補助炭素源は、当業界で公知である。

【0040】

一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、さらなる成分を含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、そのようなさらなる成分を含まない。

【0041】

好適な補助炭素源の実例としては、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物および糖蜜などの他の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸；ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられる。

【0042】

一部の実施形態では、培地は、窒素源をさらに含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための好適な窒素源は、当業界で公知である。好適な窒素源の実例としては、限定されるものではないが、アンモニアガスおよび水性アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩；尿素；硝酸または亜硝酸塩、および純粋な、または未精製の調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解物、コーン浸出液、カゼイン加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、ドライイースト、エタノール－酵母蒸留物、大豆粉、綿実粉などを含む、他の窒素含有材料が挙げられる。

【0043】

一部の実施形態では、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、限定されるものではないが、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の塩が挙げられる。

【0044】

一部の実施形態では、培地は、好適な増殖因子を含む。好適な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、限定されるものではないが、純粋な、もしくは部分的に精製された化合物として、または天然材料中に存在するものとしての、コエンザイムＡ、パントテン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ－６，８－チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ_１２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミンおよびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ－またはｒ－アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロアセテートなどが挙げられる。当業者であれば、当業界で公知の方法および技術に従って、経験的にその量を決定することができる。

【0045】

別の実施形態では、本明細書に記載の改変された糖（対応する野生型糖と比較した場合）は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的に生産される。糖の合成的生産または合成は、費用および時間集約的な生産プロセスの回避を容易にし得る。一実施形態では、糖は、例えば、逐次的グリコシル化戦略または逐次的グリコシル化戦略と、好適に保護された単糖中間体からの［３＋２］ブロック合成戦略との組合せを使用するなどによって合成される。例えば、チオールグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体を、グリコシル化におけるグリコシルドナーとして使用することができる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される糖は、上記のｗｚｚファミリータンパク質の操作などの組換え手段によって産生される糖と同一の構造を有する。

【0046】

産生される糖（組換えまたは合成手段による）は、例えば、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（１８０／Ｃ３株））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ_１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（７３－１株））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のうちのいずれか１つを含む、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する構造を含む。

【0047】

個々の多糖は、典型的には、例えば、透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、および／またはカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）などの当業界で公知の方法によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。

【0048】

精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応することができるようにし（例えば、担体タンパク質に直接的に、またはｅＴＥＣスペーサーなどのリンカーを介して）、次いで、本明細書にさらに記載されるように、本発明の糖コンジュゲートに組み入れることができる。

【0049】

１つの好ましい実施形態では、本発明の糖は、血清型がＯ２５ａである、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２５ｂである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１８Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ４である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１３である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ８である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ９である。

【0050】

本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかに対する参照は、当業界で公知であり、対応する血清型にとって独特である、反復単位構造（以下に記載されるようなＯ単位）を包含する血清型を指す。例えば、用語「Ｏ２５ａ」血清型（当業界では血清型「Ｏ２５」としても公知である）は、表１に示される式Ｏ２５を包含する血清型を指す。別の例として、用語「Ｏ２５ｂ」血清型とは、表１に示される式Ｏ２５ｂを包含する血清型を指す。

【0051】

本明細書で使用される場合、血清型は、別途特定されない限り、例えば、式「Ｏ１８」という用語が、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１を包含すると一般的に指すように、本明細書で一般的に称される。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「Ｏ１」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ１」を含む式の種を包含することを一般的に指す。したがって、「Ｏ１血清型」とは、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「Ｏ６」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ６」を含む式の種を一般的に指す。したがって、「Ｏ６血清型」とは、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。

【0054】

表１に記載の式名中に総称を含む式の種を一般的に指す用語の他の例としては、「Ｏ４」、「Ｏ５」、「Ｏ１８」、および「Ｏ４５」を含む。

【0055】

本明細書で使用される場合、用語「Ｏ２」とは、表１に示される式Ｏ２を指す。用語「Ｏ２ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２を包含する糖を指す。

【0056】

本明細書で使用される場合、上記の血清型に由来するＯ抗原に対する参照は、対応する血清型名と共に標識された式を包含する糖を指す。例えば、用語「Ｏ２５Ｂ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２５Ｂを包含する糖を指す。

【0057】

別の例として、用語「Ｏ１ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃなどの、用語「Ｏ１」を含む式を包含する糖を一般的に指す。

【0058】

別の例として、用語「Ｏ６ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；式Ｏ６：Ｋ１３；式Ｏ６：Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４などの、用語「Ｏ６」を含む式を包含する糖を一般的に指す。

【0059】

Ｏ多糖
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ多糖」とは、その構造が全細胞またはリピドＡを含まないという条件で、Ｏ抗原を含む任意の構造を指す。例えば、一実施形態では、Ｏ多糖は、リピドＡが結合していないリポ多糖を含む。リピドＡを除去するステップは当業界で公知であり、例として、酸を添加する熱処理を含む。例示的なプロセスは、１００℃で９０分間の１％酢酸による処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドＡを単離するプロセスと組み合わされる。リピドＡを単離するための例示的プロセスとしては、超遠心分離が挙げられる。

【0060】

一実施形態では、Ｏ多糖とは、Ｏ抗原からなる構造を指し、その場合、Ｏ多糖は、Ｏ抗原という用語と同義である。１つの好ましい実施形態では、Ｏ多糖とは、コア糖を含まない、Ｏ抗原の反復単位を含む構造を指す。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。別の好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原と、コア糖とを含む構造を指す。別の実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原、コア糖、およびＫＤＯ部分を含む構造を指す。

【0061】

ＬＰＳから、コアオリゴ糖を含むＯ多糖を精製する方法は、当業界で公知である。例えば、ＬＰＳの精製後、精製されたＬＰＳを、１００℃で９０分間にわたって１％（ｖ／ｖ）酢酸中で加熱することによって加水分解した後、４℃で５時間にわたって１４２，０００ｘｇで超遠心分離することができる。Ｏ多糖を含有する上清を凍結乾燥し、４℃で保存する。ある特定の実施形態では、Ｏ多糖の単純な精製を可能にするための莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。

【0062】

Ｏ多糖を、限定されるものではないが、ＬＰＳからリピドＡを除去するための弱酸加水分解を含む方法によって単離することができる。他の実施形態は、Ｏ多糖調製のための薬剤としてヒドラジンの使用を含んでもよい。ＬＰＳの調製を、当業界で公知の方法によって達成することができる。

【0063】

ある特定の実施形態では、Ｗｚｚタンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現しない）野生型、改変された、または弱毒化されたグラム陰性細菌株から精製されたＯ多糖が、コンジュゲートワクチンにおける使用のために提供される。好ましい実施形態では、Ｏ多糖鎖は、コンジュゲートまたは複合体化ワクチンとしてのワクチン抗原としての使用のためにｗｚｚタンパク質を発現する（必ずしも過剰発現しない）グラム陰性細菌株から精製される。

【0064】

一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍以上増加した分子量を有する。好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１倍かつ最大でも５倍増加した分子量を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２倍かつ最大でも４倍増加した分子量を有する。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量の増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。

【0065】

一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｋＤａ以上増加した分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも1ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加した分子量を有する。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２１ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも９０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも８５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも６０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも５０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４９ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４８ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４７ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４６ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４４ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４３ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４２ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４１ｋＤａ増加している。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量のそのような増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。例えば、表２１を参照されたい。

【0066】

別の実施形態では、Ｏ多糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、Ｏ多糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。

【0067】

Ｏ抗原
Ｏ抗原は、グラム陰性細菌の外膜中のリポ多糖（ＬＰＳ）の一部である。Ｏ抗原は、細胞表面上にあり、可変性細胞構成要素である。Ｏ抗原の可変性は、グラム陰性細菌の血清型決定のための基礎を提供する。現在の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型決定スキームは、Ｏ多糖１～１８１を含む。

【0068】

Ｏ抗原は、オリゴ糖反復単位（Ｏ単位）を含み、その野生型構造は、通常、広範囲の糖に由来する２～８個の残基を含有する。例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のＯ単位は、表１に示され、図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａ～Ｂも参照されたい。

【0069】

一実施形態では、本発明の糖は、１個のオリゴ糖単位であってもよい。一実施形態では、本発明の糖は、関連する血清型の１つの反復オリゴ糖単位である。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。

【0070】

一実施形態では、本発明の糖は、オリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、少数の反復単位（典型的には、５～１５の反復単位）を有し、典型的には、合成的に、または多糖の加水分解によって誘導される。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。

【0071】

好ましくは、本発明の、および本発明の免疫原性組成物中の全ての糖は、多糖である。高分子量の多糖は、抗原性表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量の多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図される。

【0072】

一部の実施形態では、それぞれ個々のＯ抗原ポリマー中の反復Ｏ単位の数（したがって、ポリマー鎖の長さおよび分子量）は、ｗｚｚ鎖長調節因子、内膜タンパク質に依存する。異なるｗｚｚタンパク質は、異なる範囲のモード長（４～１００超の反復単位）をもたらす。用語「モード長」とは、反復Ｏ単位の数を指す。グラム陰性細菌は、一方は長く、一方は短い、２つの異なるＯＡｇモード鎖長をもたらす２つの異なるＷｚｚタンパク質を有することが多い。グラム陰性細菌中でのｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）は、ある特定の長さ範囲のＯ抗原の細菌産生にシフトさせる、もしくは偏らせる、および高収率の高分子量リポ多糖の産生を増強させる、Ｏ抗原長の操作を可能にし得る。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「短い」モード長とは、少数、例えば、１～２０の反復Ｏ単位を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「長い」モード長とは、２０より大きく、最大で４０までの反復Ｏ単位の数を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「非常に長い」モード長とは、４０より大きい反復Ｏ単位を指す。

【0073】

一実施形態では、産生される糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１０反復単位、１５反復単位、２０反復単位、２５反復単位、３０反復単位、３５反復単位、４０反復単位、４５反復単位、５０反復単位、５５反復単位、６０反復単位、６５反復単位、７０反復単位、７５反復単位、８０反復単位、８５反復単位、９０反復単位、９５反復単位、または１００反復単位の増加を有する。

【0074】

別の実施形態では、本発明の糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、実施例５に記載されるような、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。

【0075】

糖中の反復単位の数を決定する方法も、当業界で公知である。例えば、多糖の分子量（コア糖またはＫＤＯ残基の分子量を含まない）を、反復単位の分子量（すなわち、式内のそれぞれの単糖の分子量の和として理論的に算出することができる、例えば、表１に示される対応する式中の構造の分子量）で除算することによって、反復単位の数（または式中の「ｎ」）を算出することができる。式内のそれぞれの単糖の分子量は、当業界で公知である。例えば、式Ｏ２５ｂの反復単位の分子量は、約８６２Ｄａである。例えば、式Ｏ１ａの反復単位の分子量は、約８４５Ｄａである。例えば、式Ｏ２の反復単位の分子量は、約８２９Ｄａである。例えば、式Ｏ６の反復単位の分子量は、約８９３Ｄａである。コンジュゲート中の反復単位の数を決定する場合、担体タンパク質の分子量およびタンパク質：多糖比を考慮に入れる。本明細書で定義される場合、「ｎ」とは、多糖分子中の反復単位の数（表１中で括弧内に示される）を指す。当業界で公知のように、生体高分子中で、反復構造は、例えば、失われる分枝などの、不完全な反復の領域が組み入れられていてもよい。さらに、細菌などの天然供給源から単離および精製された多糖は、サイズおよび分枝において不均一であり得ることが当業界で公知である。そのような場合、ｎは、集団中の分子のｎに関する平均値または中央値を表してもよい。

【0076】

一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、Ｏ抗原の少なくとも１の反復単位の増加を有する。Ｏ抗原の反復単位は、表１に示される。一実施形態では、Ｏ多糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の合計反復単位を含む。好ましくは、糖は、合計で少なくとも３から、最大でも８０の反復単位を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。

【0077】

一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式（例えば、表１に示される式など（図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａ～Ｂも参照されたい））のいずれかにおけるｎが、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である、Ｏ抗原を含む。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０、好ましくは、最大でも９０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１～最大でも９０である。好ましい実施形態では、ｎは、４０～９０、より好ましくは、６０～８５である。

【0078】

一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎが少なくとも１であり、最大でも２００である、Ｏ抗原を含む。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１００であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも４０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも９０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも８５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも６０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも５０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４９である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４８である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４７である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４６である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３６であり、最大でも４５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３７であり、最大でも４４である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３８であり、最大でも４３である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４２である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４１である。

【0079】

例えば、一実施形態では、糖におけるｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０、最も好ましくは４０である。別の実施形態では、ｎは、少なくとも３５～最大でも６０である。例えば、一実施形態では、ｎは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のいずれか１つ、好ましくは５０である。別の好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも５５～最大でも７５である。例えば、一実施形態では、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９、最も好ましくは６０である。

【0080】

糖構造を、例えば、１Ｄ、１Ｈ、および／もしくは１３Ｃを含むＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの、当業界で公知の方法および手段によって決定することができる。

【0081】

一部の実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖は、５ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、１０ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～３００ｋＤａ；５ｋＤａ～２００ｋＤａ；５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～７５ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～４０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～２００ｋＤａ；１５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１２ｋＤａ～１２０ｋＤａ；１２ｋＤａ～７５ｋＤａ；１２ｋＤａ～５０ｋＤａ；１２～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～７５ｋＤａ；４０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～６０ｋＤａ；２０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１２ｋＤａ～２０ｋＤａ；または２０ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、多糖は、７ｋＤａ～１５ｋＤａ；８ｋＤａ～１６ｋＤａ；９ｋＤａ～２５ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～７０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；１５ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～１０００ｋＤａ；２０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～４００ｋＤａ；３０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３０ｋＤａ～５０ｋＤａまたは５ｋＤａ～６０ｋＤａの分子量を有する。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。

【0082】

本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質－多糖コンジュゲートの用語「分子量」とは、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出される分子量を指す。

【0083】

多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけることができる。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。機械的サイジングを、高圧ホモジェナイゼーション剪断を使用して行うことができる。上記の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖を指す。

【0084】

【表1-1】

【0085】

【表1-2】

【0086】

【表1-3】

【0087】

【表1-4】

【0088】

【表1-5】

【0089】

【表1-6】

【0090】

【表1-7】

【0091】

【表1-8】

【0092】

【表1-9】

【0093】

コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ中のリピドＡとＯ抗原外側領域との間に位置する。より具体的には、コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＯ抗原とリピドＡとの間に結合を含む多糖の部分である。この結合は、最深部の３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基のヘミケタール機能と、リピドＡのＧｌｃＮＡｃ残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株間で高い類似度を示す。それは通常、限られた数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域と、外側コア領域とを含む。

【0094】

より具体的には、内側コアは、主にＬ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース（ヘプトース）およびＫＤＯ残基から構成される。内側コアは、高度に保存されている。ＫＤＯ残基は、以下の式ＫＤＯ：

【0095】

【化1】

を含む。

【0096】

コアオリゴ糖の外側領域は、内側コア領域よりも大きな変化を示し、この領域の差異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における５つのケモタイプ：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＫ－１２を区別する。５つの既知のケモタイプの外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般構造を例示する図１７を参照されたい。ＨｅｐＩＩは、内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖は全て、（ヘキソース）_３炭水化物骨格および２つの側鎖残基と共に、構造テーマを共有するが、骨格中のヘキソースの順序ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合は全て変化し得る。Ｒ１およびＲ４外側コアオリゴ糖の構造は、非常に類似しており、単一のβ結合残基においてのみ異なっている。

【0097】

野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコアオリゴ糖は、遠位オリゴ糖の構造に基づいて、当業界では５つの異なるケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に分類される。

【0098】

好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも２つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも３つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、５つ全部のコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。

【0099】

別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含まない糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、そのような組成物は、Ｏ多糖を有する糖コンジュゲートがコアオリゴ糖を含まないにも拘わらず、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。

【0100】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型は、５つのケモタイプの１つに従って特徴付けることができる。表２は、ケモタイプに従って特徴付けられる例示的な血清型を列挙する。太字の血清型は、示されたコアケモタイプと最も一般的に関連する血清型を表す。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、それぞれの対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のいずれか１つに対する免疫応答を含む、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。

【0101】

【表2】

【0102】

一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ８、式Ｏ１８、式Ｏ９、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図１７に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。

【0103】

一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、糖中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。

【0104】

一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２１、式Ｏ４４、式Ｏ１１、式Ｏ８９、式Ｏ１６２、および式Ｏ９（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ２ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図１７に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。

【0105】

一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１５、式Ｏ１５３、式Ｏ２１、式Ｏ１７、式Ｏ１１、式Ｏ１５９、式Ｏ２２、式Ｏ８６、および式Ｏ９３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ３ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図１７に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。

【0106】

一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ８６、式Ｏ７、式Ｏ１０２、式Ｏ１６０、および式Ｏ１６６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ４ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図１７に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。

【0107】

一部の実施形態では、組成物は、Ｋ－１２ケモタイプ（例えば、式Ｏ２５ｂを有する糖および式Ｏ１６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される）を有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図１７に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２コア部分をさらに含む。

【0108】

一部の実施形態では、糖は、コア糖を含む。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分をさらに含む。

【0109】

一部の実施形態では、糖は、コア糖を含まない。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。

【0110】

コンジュゲート化Ｏ抗原
Ｏ抗原、または好ましくはＯ多糖の、タンパク質担体への化学的結合は、Ｏ抗原またはＯ多糖の免疫原性を改善し得る。しかしながら、ポリマーサイズの可変性が、生産に関する現実的課題である。商業的使用では、糖のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略、製品の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性との適合性に影響し得る。Ｏ抗原合成経路の操作によるＷｚｚファミリータンパク質鎖長調節因子の発現の制御は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む種々のグラム陰性細菌株における所望の長さのＯ抗原鎖の産生を可能にする。

【0111】

一実施形態では、精製された糖は、担体タンパク質と反応することができる活性化された糖を産生するように化学的に活性化される。活性化されたら、それぞれの糖は、担体タンパク質に別々にコンジュゲートされて、コンジュゲート、すなわち、糖コンジュゲートを形成する。本明細書で使用される場合、用語「糖コンジュゲート」とは、担体タンパク質に共有結合した糖を指す。一実施形態では、糖は、担体タンパク質に直接結合する。別の実施形態では、糖は、スペーサー／リンカーを介して担体タンパク質に結合する。

【0112】

Ｏ抗原に沿った１つもしくは複数の部位で担体をＯ抗原に結合させるスキームによって、またはコアオリゴ糖の少なくとも１つの残基を活性化するスキームによって、コンジュゲートを調製することができる。

【0113】

一実施形態では、それぞれの糖は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。

【0114】

タンパク質担体が組成物中の２個以上の糖について同じである場合、糖を、担体タンパク質の同じ分子（例えば、２個以上の異なる糖がコンジュゲートされた担体分子）にコンジュゲートすることができる。

【0115】

好ましい実施形態では、糖は、タンパク質担体の異なる分子にそれぞれ個別にコンジュゲートされる（タンパク質担体の各分子は、それにコンジュゲートされた１つの型の糖だけを有する）。前記実施形態では、糖は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。

【0116】

糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションを、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーション方法によって達成することができる。多糖の担体タンパク質へのコンジュゲーション後、糖コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。これらの技術としては、濃縮／透析濾過操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる。個々の糖コンジュゲートを精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。

【0117】

活性化。本発明はさらに、多糖がリンカーまたは担体タンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を産生する化学試薬で活性化される、本明細書に記載の実施形態のいずれかから産生される活性化された多糖に関する。一部の実施形態では、本発明の糖は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に活性化される。一部の実施形態では、活性化度は、多糖の分子量を実質的に減少させない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、多糖骨格を切断しない。一部の実施形態では、活性化度は、ＣＲＭ_１９７などの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）によって測定された場合、コンジュゲーション度に有意に影響しない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、同じ活性化度で参照多糖を有するコンジュゲートの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数と比較して、担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）を３倍有意に増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、非コンジュゲート化遊離糖のレベルを増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、最適な糖／タンパク質比を低下させない。

【0118】

一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖の糖反復単位あたりのチオールのモル数が、１～１００％、例えば、２～８０％、２～５０％、３～３０％、および４～２５％などである、活性化のパーセンテージを有する。活性化度は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。好ましくは、活性化度は、最大でも５０％、より好ましくは最大でも２５％である。一実施形態では、活性化度は、最大でも２０％である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。

【0119】

一実施形態では、多糖を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化して、シアン酸エステルを形成させる。次いで、活性化された多糖を、担体タンパク質（好ましくは、ＣＲＭ_１９７または破傷風トキソイド）上のアミノ基に直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせる。

【0120】

例えば、スペーサーは、マレイミド活性化された担体タンパク質（例えば、Ｎ－［γ－マレイミドブチリロキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用する）またはハロアセチル化された担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ－スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ－ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）、もしくはスクシンイミジル３－［ブロモアセトアミド］プロピオン酸（ＳＢＡＰ）を使用する）との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングすることができるチオール化された多糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンであってよい。一実施形態では、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応によって作製してもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を使用して担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ_１９７）にコンジュゲートする。

【0121】

コンジュゲーションのための他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基の、ＣＤＩとの反応、次いで、カルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成することができるカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、第一ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、第一ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する第一ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体と、タンパク質上のアミノ基とのカップリング（ＣＤＩ化学反応）を含んでもよい。

【0122】

分子量。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖を含む。他の実施形態では、糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～１０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、単一末端コンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、水性緩衝剤中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。

【0123】

一部の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、４００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態では、糖コンジュゲートは、２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。

【0124】

さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または５，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。

【0125】

さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。

【0126】

糖コンジュゲートの分子量を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって測定することができる。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。本発明の糖コンジュゲートを、糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）によって特徴付けることもできる。一部の実施形態では、糖コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～３（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。他の実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。さらなる実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．２である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９～１．１である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0127】

また、糖コンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋ_ｄ）によって特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、コンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイリングするために重力送りのカラム中で使用される。媒体中の小孔から排除される大きい分子は、低分子よりも迅速に溶出する。画分収集装置を使用して、カラム溶出液を収集する。画分を、糖アッセイによる比色分析で試験する。Ｋ_ｄの決定のために、分子が完全に排除される画分（Ｖ_０）、（Ｋ_ｄ＝０）、および最大保持を示す画分（Ｖ_ｉ）、（Ｋ_ｄ＝１）を確立するために、カラムを較正する。特定の試料特性に達する画分（Ｖ_ｅ）を、式Ｋ_ｄ＝（Ｖ_ｅ－Ｖ_０）／（Ｖ_ｉ－Ｖ_０）によってＫ_ｄと関連させる。

【0128】

遊離糖。本発明の糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートしていないが、それにも拘わらず、糖コンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含んでもよい。遊離糖は、糖コンジュゲートと非共有的に結合していてもよい（すなわち、非共有的に結合する、吸着する、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉される）。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約１５％の遊離多糖を含む。別の好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約８％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約６％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約５％の遊離多糖を含む。例えば、表１２、表１３、表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照されたい。

【0129】

共有結合。他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；４～２５糖反復単位毎に、または２～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。

【0130】

リシン残基。本発明の糖コンジュゲートを特徴付ける別の方法は、コンジュゲート化リシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ_１９７）中のリシン残基の数による。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を使用するアミノ酸分析によって取得することができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基数の減少をもたらす。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～７である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0131】

糖鎖の担体タンパク質上のリシンへの結合の頻度は、本発明の糖コンジュゲートを特徴付けるための別のパラメーターである。例えば、一部の実施形態では、担体タンパク質と、多糖との間の少なくとも１つの共有結合は、多糖の４糖反復単位毎に存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。Ｏアセチル化。一部の実施形態では、本発明の糖は、Ｏアセチル化されている。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０～１００％、２０～１００％、３０～１００％、４０～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、７５～１００％、８０～１００％、９０～１００％、５０～９０％、６０～９０％、７０～９０％または８０～９０％のＯアセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態では、Ｏアセチル化度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。Ｏアセチル化の％とは、１００％に対する所与の糖のパーセンテージを意味する（それぞれの反復単位はそのアセチル化された構造と比較して完全にアセチル化されている）。

【0132】

一部の実施形態では、糖コンジュゲートを、還元的アミノ化によって調製する。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、糖が担体タンパク質に直接的に共有結合された、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合されている。

【0133】

還元的アミノ化。一実施形態では、糖は、還元的アミノ化（米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００７／０２３１３４０号、第２００７／０１８４０７１号および第２００７／０１８４０７２号、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、およびＷＯ２００８／１４３７０９などに記載されている）によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。

【0134】

還元的アミノ化は、（１）糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元を含む。酸化の前に、糖を加水分解してもよい。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。

【0135】

酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本明細書で使用される用語「過ヨウ素酸塩」とは、過ヨウ素酸塩と、過ヨウ素酸との両方を指す。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ_４ ^－）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ_６ ^５－）の両方および過ヨウ素酸の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。一実施形態では、多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化される。

【0136】

一実施形態では、酸化剤は、第一ヒドロキシルを選択的に酸化するための酸化剤の存在下の、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおける、Ｎ－オキソアンモニウム塩である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を担持する。ある態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を担持する分子である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンのいずれか１つから選択される。好ましくは、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミドである。

【0137】

糖の酸化ステップの後、糖は活性化されると言われ、本明細書の以下で「活性化された」と称される。活性化された糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態では、活性化された糖および担体タンパク質は、同時凍結乾燥される。別の実施形態では、活性化された多糖および担体タンパク質は、独立に凍結乾燥される。

【0138】

一実施形態では、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行い、あり得る非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。

【0139】

コンジュゲーションプロセスの次のステップは、還元剤を使用した、コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元（いわゆる還元的アミノ化）である。好適な還元剤としては、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛などのシアノ水素化ホウ素、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）、ボラン－ピリジン、またはホウ化水素交換樹脂などのアミンボランが挙げられる。一実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。

【0140】

ある実施形態では、還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５の、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される）中で実行され、別の実施形態では、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を使用して、凍結乾燥された活性化された糖および担体タンパク質を復元することができる。

【0141】

還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基があってもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を使用してキャップすることができる。一実施形態では、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）である。コンジュゲーション（還元反応および必要に応じて、キャッピング）の後、糖コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術によって精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。糖コンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ある実施形態では、糖コンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。一実施形態では、糖コンジュゲートは、滅菌濾過される。

【0142】

好ましい実施形態では、Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。

【0143】

一態様では、本発明は、担体タンパク質、例えば、

【0144】

【化2】

（式中、ｎは、１より大きい任意の整数であるか、または１に等しい）によって表される、式Ｏ２５Ｂの糖に結合した、ＣＲＭ_１９７を含むコンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは少なくとも３１～最大でも９０、より好ましくは４０～９０、最も好ましくは６０～８５である。

【0145】

別の態様では、本発明は、表１（図９Ａ～Ｃおよび図１０Ａ～Ｂも参照されたい）に示される以下の構造のいずれか１つ（式中、ｎは１より大きい整数であるか、または１に等しい）を有する糖に結合した、担体タンパク質、例えば、ＣＲＭ_１９７を含むコンジュゲートに関する。

【0146】

理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、一部の実施形態では、安定なコンジュゲートは、抗原の重要な免疫原性エピトープの構造的完全性の保持とのバランスを保つレベルの抗原改変を必要とすると考えられる。

【0147】

アルデヒドの活性化および形成。一部の実施形態では、本発明の糖は、活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖が活性化されるそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）（または酸化度（ＤＯ））とは、活性化された多糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルを指す。例えば、一部の実施形態では、糖は、多糖の反復単位上の隣接ジオールの過ヨウ素酸塩酸化によって活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖反復単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量（ｍｅｑ）および酸化中の温度を変化させることにより、酸化度（ＤＯ）のレベルの変化が得られる。

【0148】

糖およびアルデヒド濃度は、典型的には、比色アッセイによって決定される。代替試薬は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシルラジカル）－Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）混合物であり、第一アルコール基からのアルデヒドの形成をもたらす。

【0149】

一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルが、例えば、２～８０、２～５０、３～３０、および４～２５などの、１～１００である酸化度を有する。活性化度は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、もしくは９０以上、または約１００である。好ましくは、酸化度（ＤＯ）は、少なくとも５、かつ最大でも５０、より好ましくは、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。一実施形態では、活性化度は、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。酸化度の値は、活性化のパーセンテージ（％）として表すことができる。例えば、一実施形態では、１０のＤＯ値は、活性化された糖中の合計１０の糖反復単位のうち、１の活性化された糖反復単位を指し、その場合、１０のＤＯ値は、１０％の活性化と表すことができる。

【0150】

一部の実施形態では、還元的アミノ化化学反応によって調製されたコンジュゲートは、担体タンパク質と糖とを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。

【0151】

単一末端結合コンジュゲート。一部の実施形態では、コンジュゲートは、糖が、糖の一方の末端で担体タンパク質に共有結合した、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲート化多糖は、末端糖を有する。例えば、コンジュゲートは、多糖の一方の末端（末端糖残基）が担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。一部の実施形態では、コンジュゲートは、多糖の末端糖残基がリンカーを介して担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。そのようなリンカーは、例えば、シスタミンリンカー（Ａ１）、３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）、および２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセタミド）リンカー（Ａ６）を含んでもよい。

【0152】

一部の実施形態では、糖は、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、単一末端結合コンジュゲートを形成する。例えば、実施例１８、実施例１９、実施例２０、および図２４を参照されたい。

【0153】

一部の実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはバイオコンジュゲートではない。用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製された、タンパク質（例えば、担体タンパク質）と、抗原、例えば、Ｏ抗原（例えば、Ｏ２５Ｂ）とのコンジュゲートを指し、ここで、宿主細胞機構が、抗原をタンパク質に結合する（例えば、Ｎ結合）。糖コンジュゲートは、宿主細胞中でのコンジュゲートの調製を必要としない手段、例えば、タンパク質と糖との化学的結合によるコンジュゲーションによって調製されたバイオコンジュゲート、ならびに糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）－タンパク質コンジュゲートを含む。

【0154】

チオール活性化された糖。一部の実施形態では、本発明の糖は、チオール活性化されている。糖がチオール活性化されているそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）は、活性化された多糖の糖反復単位あたりのチオールのモルを指す。糖およびチオール濃度は、典型的には、スルフヒドリルの定量化のためのエルマンアッセイによって決定される。例えば、一部の実施形態では、糖は、ジスルフィドアミンリンカーを用いた２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の活性化を含む。例えば、実施例１８および図２４を参照されたい。一部の実施形態では、糖は、二価のヘテロ二官能性リンカー（本明細書では「スペーサー」とも称される）を介して担体タンパク質に共有結合されている。リンカーは、好ましくは、糖と担体タンパク質との間のチオエーテル結合を提供し、本明細書では「チオエーテル糖コンジュゲート」と称される糖コンジュゲートをもたらす。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）などの、カルバメートおよびアミド結合をさらに提供する。例えば、実施例１３を参照されたい。

【0155】

一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と糖とを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。

【0156】

例えば、一実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を有する糖とを含む。

【0157】

ｅＴＥＣコンジュゲート
一態様では、本発明は一般に、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサー（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９５１７２７４号および国際特許出願公開ＷＯ２０１４０２７３０２に記載されている）を介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた上記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む糖コンジュゲート、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用のための方法に関する。前記糖コンジュゲートは、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバメート結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされ、担体タンパク質が、アミド結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされている、糖を含む。ｅＴＥＣスペーサーは、７個の線状原子（すなわち、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－）を含み、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。

【0158】

本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを、一般式（Ｉ）：

【0159】

【化3】

（式中、ｅＴＥＣスペーサーを含む原子は中央の囲みに含まれる）によって表すことができる。

【0160】

本発明の前記糖コンジュゲートにおいて、糖は、多糖またはオリゴ糖であってもよい。

【0161】

本発明の糖コンジュゲート中に組み入れられる担体タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、または当業者には公知のように、そのような目的にとって一般的に好適な担体タンパク質群から選択される。特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0162】

別の態様では、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）有機溶媒中で糖と炭酸誘導体とを反応させて、活性化された糖を生産するステップ；ｂ）活性化された糖と、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩とを反応させて、チオール化された糖を生産するステップ；ｃ）チオール化された糖と、還元剤とを反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む、活性化されたチオール化された糖を生産するステップ；ｄ）活性化されたチオール化された糖と、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質とを反応させて、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートを生産するステップ；ならびにｅ）チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）活性化された担体タンパク質の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とを反応させるステップを含み、それによって、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートが生産される、方法を提供する。

【0163】

よくある実施形態では、炭酸誘導体は、１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、チオール化された糖は、活性化された糖と、二官能性対称性チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との反応によって生産される。あるいは、チオール化された糖を、活性化された糖と、システアミンまたはその塩との反応によって形成させることもできる。本発明の方法によって生産されるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを、一般式（Ｉ）によって表すことができる。

【0164】

よくある実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質のリシン残基上の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基と反応して、チオエーテル結合によって活性化されたリシン残基に共有結合するＳ－カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形成する、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインである。

【0165】

他の実施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセタミドを提供するヨードアセタミド（ＩＡＡ）である。ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬と第２のキャッピング試薬との両方を用いてキャッピングすることを含むことが多い。ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システインおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡを用いてキャッピングすることを含む。

【0166】

一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。

【0167】

本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含んでもよい。一部の例では、本明細書に提供される方法によって形成される活性化されたチオール化された糖は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含み、その一部は、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質への共有的コンジュゲーションを受けない場合がある。そのような残留する遊離スルフヒドリル残基は、アチオール反応キャッピング試薬、例えば、ヨードアセタミド（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングされ、潜在的に反応性の官能基をキャッピングする。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども企図される。

【0168】

さらに、本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、残留する非コンジュゲート化担体タンパク質を含んでもよく、キャッピングプロセスステップ中に改変を受けた活性化された担体タンパク質を含んでもよい。

【0169】

一部の実施形態では、ステップｄ）は、活性化されたチオール化された糖と、活性化された担体タンパク質とを反応させる前に、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質を提供することをさらに含む。よくある実施形態では、活性化された担体タンパク質は、１つまたは複数のα－ブロモアセタミド基を含む。

【0170】

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産されたｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを提供する。

【0171】

一部の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。

【0172】

本発明の態様のそれぞれ、特に、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態について、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖などの、本明細書に記載の糖を含む。

【0173】

別の態様では、本発明は、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含み、前記免疫原性組成物が、本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。

【0174】

一部の実施形態では、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖とを含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。

【0175】

糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質中のリシン残基の数を、コンジュゲートされるリシンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物の一部の実施形態では、ＣＲＭ_１９７は、糖に共有結合した３９のうちの４～１６個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの約１０％～約４１％が糖に共有結合しているというものである。他の実施形態では、ＣＲＭ_１９７は、糖に共有結合した３９のうちの２～２０個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの約５％～約５０％が糖に共有結合しているというものである。

【0176】

よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。

【0177】

他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；または４～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。

【0178】

別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。

【0179】

担体タンパク質
本発明の糖コンジュゲートの成分は、糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。

【0180】

コンジュゲートの１つの成分は、Ｏ多糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のコアオリゴ糖にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む（図１７を参照されたい）。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のＯ抗原にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。

【0181】

用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。

【0182】

好ましい実施形態では、コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ_１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡのいずれか１つから独立に選択される。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。

【0183】

好ましい実施形態では、糖は、ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ_１９７は、毒素産生コリネファージベータのニトロソグアニジン突然変異誘発によって作出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ^－によって感染したクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生される。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。

【0184】

したがって、一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、糖がＣＲＭ_１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ_１９７を含む。

【0185】

好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性的であるが、抗原的に同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８～３８４４、１９７３）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３またはＣＲＭ１０７；ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．１９９２により記載された他の突然変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号および第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号もしくは第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片）、一部の様式で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ－ホルモル、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５もしくはＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ－Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）を含む、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６～１３）、ＯＭＰＣ（通常、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌外膜タンパク質－ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、またはその免疫学的機能等価物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６～３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４～７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を担持する外毒素Ａなど（Ｕｃｈｉｄａ Ｃａｍｅｒｏｎ ＤＭ、ＲＪ Ｃｏｌｌｉｅｒ．１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７～４９７１））からなる群から選択される。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。他の好適な担体タンパク質としては、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されている）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が挙げられる。

【0186】

一部の実施形態では、担体タンパク質は、例えば、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、フラゲリン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される。一実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）である。別の実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）ではない。一実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンである。別の実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンではない。

【0187】

好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ_１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡからなる群から独立に選択される。ある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。

【0188】

好ましい実施形態では、本発明の莢膜糖は、ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ_１９７は、毒素産生コリネファージベータ（Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ.ら、１９７１、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８～１１）のニトロソグアニジン突然変異誘発によって創出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ－により感染したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。ＣＲＭ_１９７およびその産生に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号に見出すことができる。

【0189】

したがって、よくある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、莢膜多糖がＣＲＭ_１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ_１９７を含む。

【0190】

組成物およびワクチン
本発明者らはさらに、少なくとも１つの上記の糖を含む組成物および少なくとも１つの上記コンジュゲートを含む組成物を発見した。１つの好ましい実施形態では、組成物は、免疫原性組成物である。別の実施形態では、組成物は、ワクチンである。

【0191】

一態様では、免疫原性組成物は、本明細書に開示される糖のいずれかを含む。好ましい態様では、免疫原性組成物は、本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれか１つを含む。

【0192】

一実施形態では、免疫原性組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、好ましくは、血清型Ｏ２５ｂに由来する少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１、好ましくは、血清型Ｏ１ａに由来する少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に由来する少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に由来する少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。

【0193】

一実施形態では、免疫原性組成物は、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも２つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも３つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくはＯ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のそれぞれに由来する糖コンジュゲートを含む。

【0194】

好ましい実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの糖コンジュゲートを、個別にＣＲＭ_１９７にコンジュゲートする。

【0195】

したがって、組成物は、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。好ましい実施形態では、組成物は、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。例えば、組成物は、２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型（または「ｖ」、価数）から１２種の異なる血清型（１２ｖ）までのＯ抗原を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、３種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１２種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１３種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１４種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１５種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１６種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１７種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１８種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、１９種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、２０種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。

【0196】

好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖の数は、１種の血清型（または「ｖ」、価数）から２６種の異なる血清型（２６ｖ）までの範囲であってよい。一実施形態では、１種の血清型が存在する。一実施形態では、２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２６種の異なる血清型が存在する。糖を担体タンパク質にコンジュゲートして、本明細書に記載の糖コンジュゲートを形成させる。

【0197】

一態様では、組成物は、Ｏ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清群に由来するＯ抗原を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０種の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。

【0198】

別の態様では、組成物は、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、組成物は、２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型までのＯ多糖を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。

【0199】

好ましい実施形態では、組成物は、Ｏ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型までのＯ多糖を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。

【0200】

最も好ましい実施形態では、組成物は、Ｏ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型までのＯ多糖を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0201】

別の好ましい実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。

【0202】

別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１７（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１５（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１８Ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ７５（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ４（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１６（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１３（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ７（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。

【0203】

別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ８（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ８（式中、ｎは１～２０、好ましくは２～５、より好ましくは３である）を含む。式Ｏ８は、例えば、図１０Ｂに示される。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ９（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９（式中、ｎは１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９は、例えば、図１０Ｂに示される。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９ａ（式中、ｎは１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９ａは、例えば、図１０Ｂに示される。

【0204】

一部の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）のいずれか１つから選択される。例えば、図１０Ｂを参照されたい。

【0205】

上記のように、組成物は、コンジュゲート化Ｏ多糖（抗原）の任意の組合せを含んでもよい。１つの例示的な実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ｂを含む多糖、式Ｏ１Ａを含む多糖、式Ｏ２を含む多糖、および式Ｏ６を含む多糖を含む。より具体的には、そのような組成物は、（ｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉｉ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；および（ｉｖ）ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖を含む。

【0206】

一実施形態では、組成物は、血清型がＯ２５ａではない、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する少なくとも１つのＯ多糖を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ａを含む糖を含まない。そのような組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂを含むＯ多糖、式Ｏ１Ａを含むＯ多糖、式Ｏ２を含むＯ多糖、および式Ｏ６を含むＯ多糖を含んでもよい。

【0207】

一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。

【0208】

一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは１５±２である）を含む、組成物に関する。一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは１７±２である）を含む、組成物に関する。一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは５５±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは５１±２である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。

【0209】

一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２５Ｂに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも５０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。

【0210】

一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ１ａ（式中、ｎは３９±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ１ａ（式中、ｎは１３±２である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。

【0211】

一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ１Ａに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも５０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。

【0212】

一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２（式中、ｎは４３±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２（式中、ｎは４７±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２（式中、ｎは１７±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ２（式中、ｎは１８±２である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。

【0213】

一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも５０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。

【0214】

一態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ６（式中、ｎは４２±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ６（式中、ｎは５０±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ６（式中、ｎは１７±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が式Ｏ６（式中、ｎは１８±２である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。

【0215】

一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ６に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも５０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。

【0216】

一態様では、組成物は、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートであって、糖が式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む、コンジュゲートを含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのコンジュゲートが担体タンパク質に共有結合した糖を含み、糖が前記式のいずれか１つから選択される構造を含む、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９のさらなるコンジュゲートから、最大でも３０のさらなるコンジュゲートをさらに含む。

【0217】

組成物の投与量
各用量中の糖コンジュゲートの量は、典型的なワクチンにおいて有意で有害な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が用いられ、およびそれがどのように提供されるかに応じて変化するであろう。

【0218】

免疫原性組成物中の特定の糖コンジュゲートの量を、そのコンジュゲート（コンジュゲート化および非コンジュゲート化）に関する全多糖に基づいて算出することができる。例えば、２０％遊離多糖を含む糖コンジュゲートは、１００ｇの多糖用量中に約８０ｇのコンジュゲート化多糖と、約２０ｇの非コンジュゲート化多糖を有するであろう。糖コンジュゲートの量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に応じて変化し得る。糖濃度は、ウロン酸アッセイによって決定することができる。

【0219】

免疫原性組成物中の異なる多糖成分の「免疫原性量」は異なっていてもよく、それぞれ、約１．０ｇ、約２．０ｇ、約３．０ｇ、約４．０ｇ、約５．０ｇ、約６．０ｇ、約７．０ｇ、約８．０ｇ、約９．０ｇ、約１０．０ｇ、約１５．０ｇ、約２０．０ｇ、約３０．０ｇ、約４０．０ｐｇ、約５０．０ｐｇ、約６０．０ｐｇ、約７０．０ｐｇ、約８０．０ｐｇ、約９０．０ｐｇ、または約１００．０ｇの任意の特定の多糖抗原を含んでもよい。一般に、それぞれの用量は、所与の血清型について、０．１ｇ～１００ｇ、特に、０．５ｇ～２０ｇ、より特には、１ｇ～１０ｇ、さらにより特には、２ｇ～５ｇの多糖を含むであろう。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。一実施形態では、それぞれの用量は、所与の血清型について、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇまたは２０ｇの多糖を含むであろう。

【0220】

担体タンパク質量。一般に、それぞれの用量は、５ｇ～１５０ｇの担体タンパク質、特に、１０ｇ～１００ｇの担体タンパク質、より特には、１５ｇ～１００ｇの担体タンパク質、より特には、２５～７５ｇの担体タンパク質、より特には、３０ｇ～７０ｇの担体タンパク質、より特には、３０～６０ｇの担体タンパク質、より特には、３０ｇ～５０ｇの担体タンパク質、さらにより特には、４０～６０ｇの担体タンパク質を含むであろう。一実施形態では、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態では、それぞれの用量は、約２５ｇ、約２６ｇ、約２７ｇ、約２８ｇ、約２９ｇ、約３０ｇ、約３１ｇ、約３２ｇ、約３３ｇ、約３４ｇ、約３５ｇ、約３６ｇ、約３７ｇ、約３８ｇ、約３９ｇ、約４０ｇ、約４１ｇ、約４２ｇ、約４３ｇ、約４４ｇ、約４５ｇ、約４６ｇ、約４７ｇ、約４８ｇ、約４９ｇ、約５０ｇ、約５１ｇ、約５２ｇ、約５３ｇ、約５４ｇ、約５５ｇ、約５６ｇ、約５７ｇ、約５８ｇ、約５９ｇ、約６０ｇ、約６１ｇ、約６２ｇ、約６３ｇ、約６４ｇ、約６５ｇ、約６６ｇ、約６７ｇ、６８ｇ、約６９ｇ、約７０ｇ、約７１ｇ、約７２ｇ、約７３ｇ、約７４ｇまたは約７５ｇの担体タンパク質を含むであろう。一実施形態では、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

【0221】

アジュバント
一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１、２または３つのアジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。抗原は、主に送達系として、主に免疫モジュレーターとして作用するか、または両方の強力な特徴を有してもよい。好適なアジュバントとしては、ヒトを含む哺乳動物中での使用にとって好適なものが挙げられる。

【0222】

ヒトにおいて使用することができる公知の好適な送達系型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタニドなどの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子が挙げられる。

【0223】

ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）を含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬまたは０．２ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で約０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。ヒトにおいて使用することができる公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、アクイラ（Ａｑｕｉｌｌａ）樹皮からのサポニン抽出物（ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ－ＡＱなどのＴＬＲ４アゴニスト、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）またはＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン、ＡＳ０１などが挙げられる。

【0224】

ヒトにおいて使用することができる送達特性と免疫調節特性との両方を示す公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ２００６／１３４４２３およびＷＯ２００７／０２６１９０を参照されたい）またはＴＬＲ４アゴニストと水中油エマルジョンとの組合せであるＧＬＡ－ＥＭが挙げられる。

【0225】

限定されるものではないが、動物実験などの獣医学的適用のために、当業者であれば、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル－ＭＤＰと称される）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと称される）、および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを使用することができる。

【0226】

本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとしては、限定されるものではないが、（１）例えば、（ａ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック遮断ポリマーＬ１２１、およびマイクロメートル以下のエマルジョンにマイクロ流体化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）などの、水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含む、または含まない）；（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、または使用することができるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）もしくはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それから生成される粒子（ＩＳＣＯＭはさらなる洗剤を含まなくてもよい（例えば、ＷＯ００／０７６２１））などのサポニンアジュバント；（３）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２１１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）；（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（９）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）；（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１３）組成物の効能を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－２５アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ノル－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。

【0227】

本発明の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、したがって、これらの用語は、別途指摘しない限り、互換的に使用される。免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、場合により、ある特定の好ましい塩基の文脈内で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチドである、１つまたは複数の免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する。ＣｐＧ免疫刺激モチーフのメチル化状態は一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基を指す。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’グアニンにリン酸結合によって連結された５’非メチル化シトシンを含有し、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ－９）への結合によって免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化するが、あたかもＣｐＧモチーフが非メチル化されたかのように強力ではない、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有してもよい。ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のパリンドロームを含んでもよく、次いで、ＣｐＧジヌクレオチドを包含してもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を含む、いくつかの発行された特許、公開特許出願、および他の刊行物に記載されている。

【0228】

本発明のある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目に記載されたＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。

【0229】

様々なクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドが同定されている。これらのものは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目により詳細に記載されている。本発明の方法は、これらの様々なクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用を包含する。

【0230】

製剤
本発明の免疫原性組成物を、液体形態（すなわち、溶液もしくは懸濁液）または凍結乾燥形態で製剤化することができる。有利には、液体製剤を、その包装形態から直接投与することができ、かくして、それらは、そうでなければ凍結乾燥された本発明の組成物にとって必要とされる水性媒体中での復元を必要とすることがなく、注射にとって理想的である。

【0231】

本発明の免疫原性組成物の製剤化を、当業界で認識された方法を使用して達成することができる。例えば、個々のコンジュゲートを、生理的に許容できるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例としては、限定されるものではないが、水、緩衝塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる。

【0232】

本開示は、本明細書に開示される糖コンジュゲートの組合せのいずれかと、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。

【0233】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物製剤は、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または薬学的に許容できる担体を含む。一実施形態では、薬学的に許容できる希釈剤としては、滅菌水、注射用水、滅菌等張塩水または生物学的緩衝剤が挙げられる。多糖－タンパク質コンジュゲートおよび／またはタンパク質免疫原を、従来の様式で、そのような希釈剤または担体と混合する。本明細書で使用される場合、薬学的に許容できる「担体」という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与と適合する、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、当業者には明らかであり、大部分は投与経路に依存するであろう。

【0234】

例えば、免疫原性組成物製剤中に存在してもよい賦形剤としては、保存剤、化学安定剤および懸濁剤または分散剤が挙げられる。典型的には、安定剤、保存剤などは、標的レシピエント（例えば、ヒト対象）における効能について最良の製剤を決定するために最適化される。保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。安定化成分の例としては、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ－Ｚアミン、リン酸二水素カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および粉乳が挙げられる。

【0235】

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、液体形態、好ましくは、水性液体形態にある。

【0236】

本開示の免疫原性組成物は、緩衝剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、糖などの凍結防止剤、およびフリーラジカルスカベンジャーもしくはキレート剤などの酸化防止剤のうちの１つもしくは複数、またはそれらの任意の複数の組合せを含んでもよい。

【0237】

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、緩衝剤を含む。ある実施形態では、前記緩衝剤は、約３．５～約７．５のｐＫａを有する。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤またはクエン酸緩衝剤である。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、１ｍＭ～１０ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝剤である。１つの特定の実施形態では、コハク酸緩衝剤の最終濃度は、約５ｍＭである。

【0238】

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、塩を含む。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せのいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

【0239】

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、限定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤を含む。ある実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリソルベート６５（ＴＷＥＥＮ（商標）６５）、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリソルベート８５（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ－１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００、オクトキシノール４０、ノノキシノール－９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン－６６０ヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－１５、Ｓｏｌｕｔｏｌ Ｈ１５）、ポリオキシエチレン－３５－リシノレエート（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ）、大豆レシチンおよびポロキサマーのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリソルベート６５（ＴＷＥＥＮ（商標）６５）、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリソルベート８５（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ－１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００、オクトキシノール４０、ノノキシノール－９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン－６６０ヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－１５、Ｓｏｌｕｔｏｌ Ｈ１５）、ポリオキシエチレン－３５－リシノレエート（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ）、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。一部の実施形態では、組成物は、限定されるものではないが、ＢＲＩＪ５８、ＢＲＩＪ３５、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１１４、ＮＰ４０、ＳＰＡＮ８５、およびプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ１２１などの、ポリオキシエチレンアルキルエーテルのいずれか１つをさらに含む。１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％～１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％～１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％～１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。

【0240】

ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、５．５～７．５のｐＨ、より好ましくは、５．６～７．０のｐＨ、さらにより好ましくは、５．８～６．０のｐＨを有する。

【0241】

一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填した容器を提供する。一実施形態では、容器は、バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵器、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンのいずれか１つから選択される。一実施形態では、容器は、バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵器、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、容器はシリコン処理される。ある実施形態では、本発明の容器は、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）および／またはポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性物質－エラストマー）製である。ある実施形態では、本発明の容器は、ガラス製である。

【0242】

一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填したシリンジを提供する。ある特定の実施形態では、シリンジは、シリコン処理される、および／またはガラス製である。

【0243】

注射のための本発明の免疫原性組成物の典型的な用量は、０．１ｍＬ～２ｍＬの容量、より好ましくは、０．２ｍＬ～１ｍＬ、さらにより好ましくは、約０．５ｍＬの容量を有する。
したがって、上記で定義された容器またはシリンジは、０．１ｍＬ～２ｍＬの容量、より好ましくは０．２ｍＬ～１ｍＬ、さらにより好ましくは約０．５ｍＬの容量の本明細書に定義される免疫原性組成物のいずれかを充填される。

【0244】

本発明の組成物を、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内的、静脈内的、皮内的、鼻内的、皮下的、腹腔内的などの１つまたは複数の公知の方法によって対象に投与し、それに応じて製剤化することができる。

【0245】

一実施形態では、本発明の組成物は、液体調製物の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸器内粘膜注射により投与される。本発明の組成物を、単回用量バイアル、複数用量バイアルとして、または予め充填されたシリンジとして製剤化することができる。

【0246】

別の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、かくして、経口投与にとって好適な形態で、すなわち、固体または液体調製物として製剤化される。固体経口製剤としては、錠剤、カプセル剤、ピル剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油などが挙げられる。液体製剤のための薬学的に許容できる担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョンまたは油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。

【0247】

水性担体としては、塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。油の例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産油、またはミルクもしくは卵に由来する脂質である。

【0248】

医薬組成物は、等張性、低張性または高張性であってもよい。輸注または注射のための医薬組成物は、好ましくは、それが投与される時に本質的に等張性である。保存のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であってよい。医薬組成物が保存のために高張性である場合、それを、投与前に等張性溶液となるように希釈してもよい。等張剤は、塩などのイオン性等張剤または炭水化物などの非イオン性等張剤であってもよい。イオン性等張剤の例としては、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_３、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２が挙げられる。非イオン性等張剤の例としては、限定されるものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。

【0249】

また、少なくとも１つの薬学的に許容できる添加剤が緩衝剤であることも好ましい。一部の目的について、例えば、医薬組成物が輸注または注射のためのものである場合、組成物が５～９、例えば、６～８などの４～１０の範囲のｐＨに溶液を緩衝化することができる緩衝剤を含むことが望ましいことが多い。緩衝剤は、例えば、Ｔｒｉｓ、酢酸、グルタミン酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、リン酸、クエン酸、炭酸、グリシン酸、Ｌ－ヒスチジン、グリシン、コハク酸およびトリエタノールアミン緩衝剤のいずれか１つから選択することができる。緩衝剤はさらに、例えば、特に、医薬製剤が非経口的使用のためのものである場合、非経口的使用のためのＵＳＰ適合性緩衝剤から選択することができる。例えば、緩衝剤を、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸などの一塩基酸；アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸などの二塩基酸、クエン酸およびリン酸などの多塩基酸；ならびにアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、およびＴｒｉｓなどの塩基のいずれか１つから選択することができる。非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射のための）としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルおよび固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養素補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルデキストロースなどに基づくものが挙げられる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容できるアジュバントを添加した、または添加しない、水および油などの滅菌液体である。一般に、水、塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ－８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ－２０）、およびポロキサマー１８８（ＰＩ８８）が、特に、注射溶液のための好ましい液体担体である。油の例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産油、またはミルクもしくは卵に由来する脂質である。

【0250】

製剤は、界面活性剤をさらに含んでもよい。好ましい界面活性剤としては、限定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にはＴＷＥＥＮと呼ばれる）、特に、ＰＳ－２０およびＰＳ－８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名の下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が変化してもよい、オクトキシノール（オクトキシノール－９（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；ホスファチジルコリンなどのリン脂質（レシチン）；ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（ＢＲＩＪ界面活性剤として知られる）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ＢＲＩＪ３０）；ならびにソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ８５）およびソルビタンモノラウレートなどの、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に知られる）が挙げられる。エマルジョン中に含有させるための好ましい界面活性剤は、ＰＳ－２０またはＰＳ－８０である。界面活性剤の混合物、例えば、ＰＳ－８０／ＳＰＡＮ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ－８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）などのオクトキシノールとの組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

【0251】

製剤はまた、ｐＨ緩衝化塩水溶液を含んでもよい。緩衝剤は、例えば、Ｔｒｉｓ、酢酸、グルタミン酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、リン酸、クエン酸、炭酸、グリシン酸、Ｌ－ヒスチジン、グリシン、コハク酸、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミン緩衝剤のいずれか１つから選択することができる。緩衝剤は、４～１０、５．２～７．５、または５．８～７．０の範囲のｐＨに溶液を緩衝化することができる。ある特定の態様では、緩衝剤は、リン酸、コハク酸、Ｌ－ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸またはクエン酸緩衝剤のいずれか１つから選択される。緩衝剤はさらに、例えば、特に、医薬製剤が非経口的使用のためのものである場合、非経口的使用のためのＵＳＰ適合性緩衝剤から選択することができる。緩衝剤の濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭまたは５ｍＭ～５０ｍＭの範囲であろう。ある特定の態様では、緩衝剤は、５ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度のＬ－ヒスチジン緩衝剤、または１ｍＭ～１０ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝剤である。ある特定の態様では、Ｌ－ヒスチジンは、２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度にある。

【0252】

塩水溶液（すなわち、ＮａＣｌを含む溶液）が好ましいが、製剤化にとって好適な他の塩としては、限定されるものではないが、ＣａＣｌ_３、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２ならびにそれらの組合せが挙げられる。限定されるものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールなどの非イオン性等張剤を、塩の代わりに使用することができる。好適な塩範囲としては、限定されるものではないが、２５ｍＭ～５００ｍＭまたは４０ｍＭ～１７０ｍＭが挙げられる。一態様では、塩水は、場合により、２０ｍＭ～１７０ｍＭの濃度で存在するＮａＣｌである。好ましい実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを含むＬ－ヒスチジン緩衝剤を含む。

【0253】

別の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系において送達される。例えば、薬剤を、静脈内輸注、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を使用して投与することができる。別の実施形態では、例えば、ミクロスフェアまたはインプラント中のポリマー材料が使用される。

【0254】

活性
一実施形態では、本明細書に記載の糖は、オプソニン活性を誘導することができる。別の実施形態では、本明細書に記載の糖は、オプソニンおよび食作用活性（例えば、オプソニン貪食作用活性）を誘導することができる。

【0255】

本発明者らは驚くべきことに、対応する野生型糖と比較して反復単位が増加した糖が、野生型糖と比較して、哺乳動物において免疫応答の増加を誘導することを発見した。本発明者らはまた驚くべきことに、担体タンパク質と、対応する野生型糖と比較して反復単位が増加した糖とを含むコンジュゲートを含む組成物が、担体タンパク質と、対応する野生型糖とを含むコンジュゲートを含む組成物を投与した哺乳動物と比較して、哺乳動物における免疫応答の増加を誘導することも発見した。メカニズムまたは理論によって束縛されないが、反復単位が増加した糖は、保存されたエピトープが増加していてもよく、免疫応答の増加をもたらし得る。

【0256】

オプソニン活性またはオプソニン化とは、オプソニン（例えば、抗体または補体因子）が抗原（例えば、本明細書に記載の糖またはそのコンジュゲート）に結合し、抗原の食細胞または貪食細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、および多形核白血球（ＰＭＮＬ）への結合を容易にするプロセスを指す。例えば、莢膜の存在のため典型的には貪食されない被包性細菌などの一部の細菌は、オプソニン抗体でコーティングされた場合、食細胞によって認識される可能性が高くなる。一実施形態では、糖は、例えば、オプソニンである抗体などの免疫応答を誘導する。一実施形態では、オプソニン活性は、グラム陰性細菌、好ましくは、エシェリキア（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の少なくとも１つの株に対するものである。

【0257】

食作用活性または貪食作用とは、貪食細胞が材料を飲み込み、その材料をその細胞質中に封入するプロセスを指す。一実施形態では、糖は、例えば、貪食を容易にする抗体などの免疫応答を誘導する。一実施形態では、食作用活性は、グラム陰性細菌、好ましくは、エシェリキア（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の少なくとも１つの株に対するものである。例えば、本明細書に記載の単離された糖に対して生じたウサギ抗体は、示されるように、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ貪食アッセイにより、補体の存在下で糖を発現する株のオプソニン貪食作用を特異的に媒介することができてもよい。

【0258】

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の糖は、殺菌性免疫応答を誘導することができる。一実施形態では、殺菌活性は、グラム陰性細菌、好ましくは、エシェリキア（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の少なくとも１つの株に対するものである。

【0259】

オプソニン化、貪食作用、および／または殺菌活性を測定するための方法は、当業界で公知であり、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで細菌量の減少を測定すること（例えば、エシェリキア（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ）をチャレンジした哺乳動物中の菌血症レベルを測定すること）、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで細菌細胞殺傷を測定すること（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイ）などによる。一実施形態では、糖は、例えば、熱で殺傷したグラム陰性細菌に対して生じた抗血清と比較するなど、適切な対照と比較して、オプソニン、貪食、および／または殺菌活性を誘導することができる。

【0260】

機能的抗体および補体の存在下で貪食エフェクター細胞による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の殺傷を測定するオプソニン貪食作用アッセイは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂなどの、特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ワクチンの有効性を評価するための代替手段であってもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、試験しようとする熱不活化ヒト血清、分化したＨＬ－６０細胞（貪食細胞）および外因性補体供給源（例えば、子ウサギ補体）の混合物を一緒にインキュベートすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイを行うことができる。オプソニン貪食作用がインキュベーション中に進行し、抗体および補体でコーティングされた細菌細胞はオプソニン貪食作用時に殺傷される。オプソニン貪食作用からの逃れる生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を塗布することによって決定される。ＯＰＡ力価は、試験血清を含まない対照ウェルと比較して細菌数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数と定義される。ＯＰＡ力価は、この５０％殺傷カットオフを間に含む２つの希釈率から内挿される。

【0261】

１：８以上の終点力価は、これらの殺傷型ＯＰＡにおける陽性の結果であると考えられる。

【0262】

一部の実施形態では、対象は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への自然の曝露（例えば、成人対象の場合）のため、ワクチン接種前に血清型特異的ＯＰＡ力価を有し得る。

【0263】

したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂなどの特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型とその応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。

【0264】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。

【0265】

本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を、ＯＰＡ力価の増加の可能性を比較することによって行うこともできる。

【0266】

したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂなどの特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型とその応答について比較して、ＯＰＡ力価の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、ヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させることができる。

【0267】

一態様では、組成物は、少なくとも１種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型は、例えば、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（１８０／Ｃ３株））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ_１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（７３－１株））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のうちのいずれか１つを含む、任意の血清型であってもよい。一実施形態では、血清型は、Ｏ２５ａである。別の実施形態では、血清型は、Ｏ２５ｂである。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１Ａである。別の実施形態では、血清型は、Ｏ２である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１７である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１５である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１８Ａである。別の実施形態では、血清型は、Ｏ７５である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ４である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１６である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ１３である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ７である。別の実施形態では、血清型は、Ｏ８である。

【0268】

好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも２種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも３種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１０種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１２種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１３種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１４種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１５種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１６種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１７種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１８種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも１９種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、組成物は、少なくとも２０種の異なる血清型に対する免疫応答を誘導する。

【0269】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定された場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ糖などの特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型糖に結合することができる。好ましくは、増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＭの産生の増加を含んでもよい。

【0270】

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法では、ワクチン接種された対象の血清に由来する抗体を、固相支持体に吸着された多糖と共にインキュベートする。結合した抗体は、酵素コンジュゲート化二次検出抗体を使用して検出される。ＥＬＩＳＡは、ヒト血清中に存在する型特異的ＩｇＧ抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖抗体を測定する。ヒト血清の希釈液を型特異的多糖被覆マイクロタイタープレートに添加する場合、その多糖に特異的な抗体は、マイクロタイタープレートに結合する。プレートに結合した抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ標識抗体、次いで、ｐ－ニトロフェニルホスフェート基質を使用して検出される。着色した最終生成物の光密度は、血清中に存在する抗Ｏ抗原多糖抗体の量に比例する。

【0271】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。

【0272】

一部の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、初回投薬の約３０日後、好ましくは初回投薬の約６０日後などの初回投薬後に、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも５，０００かつ最大でも２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルまで、哺乳動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する抗体の産生を増加させるのに有効である。好ましい実施形態では、組成物は、初期投薬後に、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも５，０００かつ最大でも２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルまで、哺乳動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する抗体の産生を増加させるのに有効である。

【0273】

一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に結合することができる。例えば、組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定された場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ抗体を惹起することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、それぞれの血清型に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定された場合、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定された場合、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増加させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも５０％の対象において組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイによって決定された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増加させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、組成物中の糖の反復単位に対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増加させる。

【0274】

方法
別の態様では、本発明は、対象に、有効量の本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与することを含む、対象、例えば、ヒト対象の感染を防止する方法に関する。

【0275】

別の態様では、本発明は、対象に、有効量の本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与することを含む、対象、例えば、ヒト対象の感染を処置する方法に関する。

【0276】

別の態様では、本発明は、対象に、有効量の本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与することを含む、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を誘導する方法に関する。

【0277】

別の態様では、本発明は、対象に、有効量の本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与することを含む、対象、例えば、ヒト対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導する方法に関する。

【0278】

本明細書で使用される場合、本明細書に記載の組成物を対象に投与する文脈における用語「有効量」とは、予防および／または治療効果を有する組成物の量を指す。ある特定の実施形態では、「有効量」とは、以下の効果：（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の重症度を低減させるか、もしくは改善する；（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の持続期間を低減させる；（ｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の進行を防止する；（ｉｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の退縮を引き起こす；（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の発達もしくは開始を防止する；（ｖｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染もしくはそれと関連する症状の再発を防止する；（ｖｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染と関連する臓器不全を低減する；（ｖｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を有する対象の入院を減少させる；（ｉｘ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を有する対象の入院の長さを減少させる；（ｘ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を有する対象の生存を増加させる；（ｘｉ）対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を除去する；（ｘｉｉ）対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製を阻害する、もしくは低減する；および／または（ｘｉｉｉ）別の療法の予防もしくは治療効果を増強もしくは改善する、のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ以上を達成するのに十分である組成物の量を指す。

【0279】

ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、薬剤としての使用のためのものである。本明細書に記載の免疫原性組成物を、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための様々な治療または予防方法において使用することができる。特に、本明細書に記載の免疫原性組成物を使用して、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染、疾患または状態を防止、処置または改善することができる。

【0280】

かくして、一態様では、本発明は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と関連する感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0281】

一態様では、本発明は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と関連する感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0282】

一態様では、本発明は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0283】

一態様では、本発明の免疫原性組成物は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされる感染、疾患または状態を防止、処置または改善するための方法における使用のためのものである。別の態様では、本発明の組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされる感染、疾患または状態に対して哺乳動物を保護するための方法における使用のためのものである。

【0284】

一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物はいずれも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による感染に対して対象を免疫する方法における使用のためのものである。

【0285】

一態様では、本発明は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされる感染、疾患または状態を防止、処置または改善するための薬剤の製造のための本明細書に開示される免疫原性組成物の使用を対象とする。

【0286】

ある実施形態では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による感染に対して対象を免疫するための薬剤の製造のための、本明細書に開示される免疫原性組成物の使用を対象とする。

【0287】

ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。より特には、本明細書に記載の免疫原性組成物を使用して、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を防止することができる。かくして、一態様では、本発明は、対象における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による感染を防止する方法であって、対象に、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0288】

一部のそのような実施形態では、感染は、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、肺炎、菌血症、および敗血症、ならびに他の血流感染のいずれか１つから選択される。例えば、新生児髄膜炎と関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型としては、血清型Ｏ１、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ１６、Ｏ１８およびＯ８３が挙げられる。したがって、一実施形態では、組成物は、式Ｏ１、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ８３のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含むコンジュゲート、ならびにそのコンジュゲートの任意の組合せを含む。別の例として、菌血症と関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型としては、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、Ｏ１５およびＯ７５が挙げられる。したがって、別の実施形態では、組成物は、式Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、Ｏ１６およびＯ７５のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む少なくとも１つのコンジュゲート、ならびにそのコンジュゲートの任意の組合せを含む。さらなる例として、Ｏ１：Ｋ１：Ｈ７またはＯ２：Ｋ１：Ｈ４、Ｏ２：Ｋ１：Ｈ５、Ｏ２：Ｋ１：Ｈ６、およびＯ２：Ｋ１：Ｈ７などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１およびＯ２株が、ヒトおよび動物における尿路感染、敗血症、および新生児髄膜炎の原因病原体として同定された。Ｏ１とＯ２血清群は両方とも、ヒト患者において菌血症および敗血症を引き起こす多くの株を構成する。したがって、一実施形態では、組成物は、式Ｏ１を有する糖を含むコンジュゲートと、式Ｏ２を有する糖を含むコンジュゲートとを含む。

【0289】

したがって、これらの使用および方法によって哺乳動物において免疫応答を生じさせることによって、ＥｘＰＥＣおよび非ＥｘＰＥＣ株を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染に対して哺乳動物を保護することができる。本発明は、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型などの腸病原型を含む、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する幅広い保護を提供するのに特に有用である。かくして、限定されるものではないが、腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿路感染（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に、新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（乳幼児、旅行者、急性、持続性など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿などを含む疾患に対して哺乳動物を保護することができる。

【0290】

一態様では、ワクチン接種される対象は、ヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌなどの哺乳動物である。好ましくは、ワクチン接種される対象は、ヒトである。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーまたは成人である；ワクチンが治療的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくはティーンエイジャーまたは成人である。小児について意図されるワクチンを、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために、成人に投与してもよい。

【0291】

本発明のワクチンを使用して、小児と成人との両方を処置することができる。かくして、ヒト患者は、１歳未満、１～５歳、５～１５歳、１５～５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチンを受けるための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、好ましくは６５歳以上）、若者（例えば、５歳以下）、入院患者、医療従事者、軍関係者、妊娠女性、慢性疾患者、または免疫不全患者である。ワクチンは、これらの群についてのみ適しているわけではないが、集団中でより一般的に使用することができる。

【0292】

本発明のワクチンは、外科手術を予想している患者、または他の入院患者にとって特に有用である。それらはまた、カテーテルを挿入される患者においても有用である。それらはまた、思春期の女性（例えば、１１～１８歳）および慢性尿路感染を有する患者においても有用である。

【0293】

ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路によって投与する。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下注射によって投与する。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内または皮下注射によって投与する。

【0294】

ある実施形態では、本発明は、（ｉ）対象に、免疫学的に有効量の本明細書に定義される免疫原性組成物のいずれかを注射するステップ；（ｉｉ）前記対象から血清試料を収集するステップ；（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用殺傷アッセイ（ＯＰＡ）によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対するオプソニン貪食作用殺傷活性について前記血清試料を試験するステップを含む方法を対象とする。

【0295】

対象
本明細書に開示されるように、本明細書に記載の免疫原性組成物を、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための様々な治療または予防方法において使用することができる。

【0296】

好ましい実施形態では、前記対象は、ヒトである。最も好ましい実施形態では、前記対象は、新生児（すなわち、３カ月齢より下）、乳児（すなわち、３カ月齢から１歳まで）または幼児（すなわち、１歳から４歳まで）である。

【0297】

ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。

【0298】

ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、１歳未満であってよい。例えば、ワクチン接種される対象は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１または約１２カ月齢であってもよい。ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、約２、４または６カ月齢である。別の実施形態では、ワクチン接種される対象は、２歳未満である。例えば、ワクチン接種される対象は、約１２～約１５カ月齢であってもよい。一部の場合、わずか１用量の本発明による免疫原性組成物が必要とされるが、一部の環境下では、第２、第３または第４の用量を投与してもよい。

【0299】

ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、１８歳未満であってよい。例えば、ワクチン接種される対象は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、または約１７歳であってもよい。例えば、ワクチン接種される対象は、約１０～約１８歳であってもよい。一部の場合、わずか１用量の本発明による免疫原性組成物が必要とされるが、一部の環境下では、第２、第３または第４の用量を投与してもよい。

【0300】

別の実施形態では、ワクチン接種される対象は、１８歳以上のヒトであってもよい。例えば、ワクチン接種される対象は、約１８～約５０歳であってもよい。一部の場合、わずか１用量の本発明による免疫原性組成物が必要とされるが、一部の環境下では、第２、第３または第４の用量を投与してもよい。

【0301】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される対象は、５０歳以上のヒト、より好ましくは５５歳以上のヒトである。ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上または８０歳以上のヒトである。ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、免疫障害のある個体、ヒトである。免疫障害のある個体は一般に、感染性因子によるチャレンジに対して正常な体液性または細胞性防御を上昇させる能力の減弱または低減を示す人と定義される。

【0302】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される免疫障害のある対象は、免疫系を害し、尿路感染に対して保護する、またはそれを処置するには不十分な抗体応答をもたらす疾患または状態に罹患している。

【0303】

ある実施形態では、前記疾患は、原発性免疫不全障害である。好ましくは、前記原発性免疫不全障害は、複合ＴおよびＢ細胞免疫不全、抗体不全、明確に定義された症候群、免疫脱調節疾患、食細胞傷害、先天性免疫不全、自己炎症障害、および補体欠損症のいずれか１つから選択される。

【0304】

本発明の特定の実施形態では、ワクチン接種される免疫障害のある対象は、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、慢性心臓または肺障害、鬱血性心不全、糖尿病、慢性肝疾患、アルコール依存症、肝硬変、髄液漏、心筋症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脾臓機能障害（鎌状赤血球病など）、脾臓機能の欠如（無脾症）、血液悪性腫瘍、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ腫、腎不全、ネフローゼ症候群および喘息のいずれか１つから選択される疾患に罹患している。

【0305】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される対象は、栄養不良に罹患している。

【0306】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される対象は、感染に対する身体の抵抗性を低下させる薬物または処置をとっている。

【0307】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される対象は、喫煙者である。

【0308】

本発明のある実施形態では、ワクチン接種される対象は、１リットルあたり５ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり４ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり３ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり２ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり１ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．５ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．３ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．１ｘ１０^９細胞未満の白血球細胞数（白血球数）を有する。

【0309】

白血球細胞数（白血球数）：血液中の白血球細胞（ＷＢＣ）の数。ＷＢＣは通常、ＣＢＣ（完全血球算定）の一部として測定される。ＷＢＣは、血液中で感染と闘う細胞であり、赤血球として知られる赤（酸素運搬）血球細胞とは異なる。好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）、バンド細胞（わずかに未熟な好中球）、Ｔ型リンパ球（Ｔ細胞）、Ｂ型リンパ球（Ｂ細胞）、単球、好酸球、および好塩基球を含む、様々な型の白血球細胞が存在する。全ての型の白血球細胞が、白血球細胞数に反映される。白血球細胞数の正常範囲は通常、血液１立方ミリメートルあたり４，３００～１０，８００細胞である。これも白血球数と呼ばれ、１リットルあたり４．３～１０．８ｘ１０^９細胞として国際単位で表すことができる。

【0310】

ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、好中球減少症に罹患している。例えば、ワクチン接種される対象は、１リットルあたり２ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり１ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．５ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．１ｘ１０^９細胞未満、または１リットルあたり０．０５ｘ１０^９細胞未満の好中球数を有してもよい。

【0311】

低い白血球細胞数または「好中球減少症」は、循環血液中の異常に低レベルの好中球を特徴とする状態である。好中球は、感染を防止し、感染と闘うのを助ける特定の種類の白血球細胞である。がん患者が好中球減少症を経験する最も一般的な理由は、化学療法の副作用としてである。化学療法誘導性好中球減少症は、患者の感染リスクを増大させ、がん処置を中断させる。

【0312】

ある実施形態では、ワクチン接種される対象は、５００／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数、または３００／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数、または２００／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数、１００／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数、７５／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数、または５０／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞数を有する。

【0313】

ＣＤ４細胞試験は、通常、１ｍｍ^３中の細胞数として報告される。正常なＣＤ４数は、５００～１６００であり、ＣＤ８数は、３７５～１１００である。ＣＤ４数は、ＨＩＶを有する人々においては劇的に低下する。

【0314】

本発明のある実施形態では、本明細書に開示される任意の免疫障害のある対象は、ヒト男性またはヒト女性である。

【0315】

レジメン
一部の場合、わずか１用量の本発明による免疫原性組成物が有効であり、より高い免疫欠損の状態などの他の環境下では、第２、第３または第４の用量を投与してもよい。初回ワクチン接種の後、対象は、十分に間隔を空けた１回または数回の追加免疫を受けてもよい。

【0316】

ある実施形態では、本発明による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、単回用量である。別の実施形態では、前記単回用量スケジュールは、少なくとも２歳の健康な人のためのものである。

【0317】

ある実施形態では、本発明による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、複数回用量スケジュールである。別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月から約２カ月の間隔で隔てられた一連の２用量を含む。ある実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた一連の２用量、または約２カ月の間隔で隔てられた一連の２用量を含む。

【0318】

別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月から約２カ月の間隔で隔てられた一連の３用量を含む。別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた一連の３用量、または約２カ月の間隔で隔てられた一連の３用量を含む。

【0319】

別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月から約２カ月の間隔で隔てられた一連の３用量、次いで、第１の用量の約１０カ月から約１３カ月後の第４の用量を含む。別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた一連の３用量、次いで、第１の用量の約１０カ月から約１３カ月後の第４の用量、または約２カ月の間隔で隔てられた一連の３用量、次いで、第１の用量の約１０カ月から約１３カ月後の第４の用量を含む。

【0320】

ある実施形態では、複数回用量スケジュールは、第１の年齢での少なくとも１用量（例えば、１、２または３用量）、次いで、少なくとも１回の幼児用量を含む。

【0321】

ある実施形態では、複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約１カ月から約２カ月の間隔で隔てられた一連の２または３用量（例えば、用量間は２８～５６日）、次いで、１２～１８カ月齢での幼児用量を含む。ある実施形態では、複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約１カ月から約２カ月の間隔で隔てられた一連の３用量（例えば、用量間は２８～５６日）、次いで、１２～１５カ月齢での幼児用量を含む。別の実施形態では、前記複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約２カ月の間隔で隔てられた一連の２用量、次いで、１２～１８カ月齢での幼児用量を含む。

【0322】

ある実施形態では、複数回用量スケジュールは、２、４、６、および１２～１５カ月齢での４用量連続のワクチンを含む。

【0323】

ある実施形態では、初回用量は、０日目に与えられ、１回または複数回の追加用量は、約２～約２４週の範囲の間隔で、好ましくは４～８週の投薬間隔で与えられる。

【0324】

ある実施形態では、初回用量は０日目に与えられ、追加用量は約３カ月後に与えられる。

【0325】

キットおよびプロセス
ある実施形態では、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを対象とする。

【0326】

ある実施形態では、前記情報リーフレットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する機能的抗体を惹起する組成物の能力を含む。

【0327】

ある実施形態では、前記情報リーフレットは、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を含む。ある実施形態では、前記情報リーフレットは、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１に対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を含む。ある実施形態では、前記情報リーフレットは、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を含む。ある実施形態では、前記情報リーフレットは、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を含む。

【0328】

ある実施形態では、本発明は、免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを生産するためのプロセスであって、（ｉ）本開示の免疫原性組成物を生産するステップおよび（ｉｉ）同キット中で、前記免疫原性組成物と情報リーフレットとを組み合わせるステップを含み、前記情報リーフレットが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する機能的抗体を惹起する前記組成物の能力を記載する、プロセスを対象とする。

【0329】

ある実施形態では、本発明は、免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを生産するためのプロセスであって、（ｉ）本開示の免疫原性組成物を生産するステップおよび（ｉｉ）同キット中で、前記免疫原性組成物と情報リーフレットとを組み合わせるステップを含み、前記情報リーフレットが、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する抗Ｏ抗原抗体を惹起する組成物の能力を記載する、プロセスを対象とする。

【0330】

ある実施形態では、本発明は、免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを生産するためのプロセスであって、（ｉ）本開示の免疫原性組成物を生産するステップおよび（ｉｉ）同キット中で、前記免疫原性組成物と情報リーフレットとを組み合わせるステップを含み、前記情報リーフレットが、ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を記載する、プロセスを対象とする。

【0331】

ある実施形態では、本発明は、免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを生産するためのプロセスであって、（ｉ）本開示の免疫原性組成物を生産するステップ；（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する機能的抗体を惹起する前記組成物の能力を記載する情報リーフレットを印刷するステップ；（ｉｉｉ）同キット中で、前記免疫原性組成物と前記情報リーフレットとを組み合わせるステップを含むプロセスを対象とする。

【0332】

ある実施形態では、本発明は、免疫原性組成物と情報リーフレットとを含むキットを生産するためのプロセスであって、（ｉ）本開示の免疫原性組成物を生産するステップ；（ｉｉ）ヒト集団において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するＯＰＡ力価を惹起する組成物の能力を記載する情報リーフレットを印刷するステップ；（ｉｉｉ）同キット中で、前記免疫原性組成物と前記情報リーフレットとを組み合わせるステップを含むプロセスを対象とする。

【実施例0333】

本発明をより良く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示に過ぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。以下の実施例は、本発明の一部の実施形態を例示するものである。

【0334】

（実施例１）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株
臨床株および派生株を、表３に列挙する。さらなる参照株は、Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、臨床Ｏ２５ａ血清型株；およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２を含んでいた。

【0335】

標的オープンリーディングフレームを除去するが、短いｓｃａｒ配列を残す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の遺伝子ノックアウトを構築した。

【0336】

簡単にするために、加水分解されたＯ抗原鎖およびコア糖を、Ｏ多糖（ＯＰＳ）の次に示す。

【0337】

【表3】

【0338】

（実施例２）
ｗｚｚＢ、ｆｅｐＥおよびＯ抗原遺伝子クラスタークローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー

【0339】

【表4】

【0340】

（実施例３）
プラスミド
プラスミドベクターおよびサブクローンを、表５に列挙する。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ遺伝子を担持するＰＣＲ断片を、精製ゲノムＤＮＡから増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔに提供される高コピー数プラスミド中にサブクローニングした（図１）。このプラスミドは、ｐＵＣレプリコンに基づく。プライマーＰ３およびＰ４を使用して、その天然プロモーターと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｗｚｚＢ遺伝子を増幅したが、それらは、それぞれ、ＵＤＰ－グルコース－６－デヒドロゲナーゼおよびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする近位および遠位遺伝子中の領域に結合するように設計される（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＧ１６５５ ＮＣ＿０００９１３．３に注釈されている）。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ遺伝子およびプロモーターを含有するＰＣＲ断片を、以前に記載されたプライマーを使用して増幅した。同様の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥプライマーを、利用可能なＧｅｎｂａｎｋゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ（ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１の場合）に基づいて設計した。低コピー数プラスミドｐＢＡＤ３３を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でＯ抗原生合成遺伝子を発現させた。プラスミドを最初に改変して、５’プロモーターおよび３’６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子と相同なユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いＰＣＲ断片のクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ法による）を容易にした（表５）。Ｏ２５ｂ生合成オペロンを含有するｐＢＡＤ３３サブクローンを、図１に例示する。

【0341】

【表5】

【0342】

（実施例４）
Ｏ抗原精製
発酵ブロスを、酢酸で処理して、１～２％の最終濃度（４．１の最終ｐＨ）にした。ＯＡｇの抽出および脱脂を、酸処理したブロスを１００℃に２時間加熱することによって達成した。酸加水分解の終わりに、バッチを周囲温度に冷却し、１４％ＮＨ_４ＯＨを添加して、６．１の最終ｐＨにした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。遠心分離液に、リン酸ナトリウム中のＣａＣｌ_２を添加し、得られたスラリーを室温で３０ｍｉｎインキュベートした。遠心分離によって固体を除去し、１０ｋＤａ膜を使用して遠心分離液を１２倍に濃縮した後、水に対して２回透析濾過した。次いで、ＯＡｇを保持する保持液を、カーボンフィルターを使用して精製した。カーボン濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウムを用いて１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。最終硫酸アンモニウム濃度は２Ｍであった。硫酸アンモニウム処理したカーボン濾液を、泳動緩衝剤として２Ｍ硫酸アンモニウムを含む膜を使用してさらに精製した。ＯＡｇは流出液中に収集された。長いＯＡｇについては、ＨＩＣ濾液を濃縮した後、５ｋＤａ膜を使用して水（２０倍透析容量）に対して緩衝剤交換した。短い（天然）ＯＡｇ多糖については、ＭＷＣＯをさらに低減させて、収率を増強した。

【0343】

（実施例５）
Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション
第１のセットの長鎖Ｏ２５ｂ多糖－ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを、過ヨウ素酸塩酸化、次いで、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションを使用して生産した（表７）。コンジュゲートは、酸化レベルを変化させることによって３つの活性化レベル（低、中および高）で変化する。還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して、凍結乾燥された活性化された多糖と、ＤＭＳＯ媒体中で復元された凍結乾燥されたＣＲＭ_１９７とを反応させることによって、コンジュゲートを生産した。コンジュゲーション反応を２３℃で２４ｈにわたって実行した後、水素化ホウ素ナトリウムを使用して３ｈにわたってキャッピングした。コンジュゲーションクエンチングステップの後、５ｍＭコハク酸塩／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を使用して、１００Ｋ ＭＷＣＯの再生セルロース膜を用いる限外濾過／透析濾過によって、コンジュゲートを精製した。コンジュゲートの最終濾過を、０．２２μｍ膜を使用して実施した。

【0344】

別途明示的に指摘されない限り、以下の実施例を通して開示されるコンジュゲートは、コア糖部分を含む。

【0345】

１．１．異種ポリメラーゼ鎖長調節因子によって提供される長鎖Ｏ抗原発現
初期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株構築は、Ｏ２５血清型に焦点を当てた。目標は、異種ｗｚｚＢまたはｆｅｐＥ遺伝子がＯ２５ ｗｚｚＢノックアウト株においてより長い鎖長を提供するかどうかを見るためにそれらを過剰発現させることであった。最初に、血液単離物をＰＣＲによってスクリーニングして、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂサブタイプの株を同定した。次に、株を、アンピシリンに対する感受性についてスクリーニングした。ｗｚｚＢ欠失が導入された１つのアンピシリン感受性Ｏ２５ｂ単離物ＧＡＲ２４０１が同定された。同様に、ｗｚｚＢ欠失を、Ｏ２５ａ株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１中で行った。これらの突然変異の遺伝的相補性について、ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１に由来するｗｚｚＢ遺伝子を、高コピーＰＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩクローニングベクター中にサブクローニングし、エレクトロポレーションによって両株に導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２に由来するさらなるｗｚｚＢ遺伝子；同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ、ＮＲ－５、Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ－およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２に由来するｆｅｐＥ遺伝子をクローニングし、導入した。

【0346】

ｗｚｚＢノックアウト株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１（Ｏ２５ａ）およびＧＡＲ２４０１（Ｏ２５ｂ）のプラスミド形質転換体中でのＬＰＳ発現の遺伝的相補性が図２に示される。細菌を、ＬＢ培地中で一晩増殖させ、ＬＰＳをフェノールで抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４～１２％アクリルアミド）により分解し、染色した。ゲルの各ウェルに、同数の細菌細胞（約２ＯＤ_６００単位）から抽出されたＬＰＳを載せた。ＬＰＳのサイズを、内部天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準から、および広い鎖長分布を示す（１つの反復単位によって異なる）試料のサブセットから認識できるラダーを計測することによって見積もった。図３のパネルＡの左側に、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルを示す；右側には、Ｏ２５ｂ ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の同様のプロファイルを示す。Ｏ２５特異的血清を用いて精査した複製ゲルのイムノブロットを、図３のパネルＢに示す。

【0347】

この実験の結果は、相同なｗｚｚＢ遺伝子の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａΔｗｚｚＢ宿主への導入が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｗｚｚＢと同様、短いＯ２５ ＬＰＳ（１０～２０ｘ）の発現を回復させることを示す。ＧＡＲ２４０１に由来するＯ２５ｂ ｗｚｚＢ遺伝子の導入は回復させないが、これは、この株に由来するＷｚｚＢ酵素が欠損していることを示唆している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷｚｚＢアミノ酸配列の比較は、Ａ２１０ＥおよびＰ２５３Ｓ置換が原因であり得ることを示唆する。重要なことには、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５Ｈ１に由来するサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥは、非常に長い（ＶＬ）ＯＡｇ ＬＰＳを発現する能力をもたらし、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥによってもたらされるものをサイズにおいて超えるＯＡｇが生じる。

【0348】

同様のパターンの発現が、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体について観察された：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａまたはＫ１２株ｗｚｚＢは、短いＬＰＳを産生する能力を回復させた。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥは最も長いＬＰＳを生成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥはそれよりわずかに短いＬＰＳを生成したが、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｗｚｚＢは中間サイズの長いＬＰＳ（Ｌ）をもたらした。非常に長いＬＰＳを産生する他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥ遺伝子の能力を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａΔｗｚｚＢの形質転換体を用いる別の実験において評価した。ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ株およびＯ１５７シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素産生株に由来するｆｅｐＥ遺伝子も、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥについて生成されたＬＰＳの長さほどではないが、非常に長いＬＰＳを産生する能力をもたらした（図４）。ＦｅｐＥアミノ酸配列のアラインメントを、図５に示す。

【0349】

サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥが、評価されたポリメラーゼ調節因子の最も長いＬＰＳを生成する血清型Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ株において確立されたら、本発明者らは次に、それが他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型においても非常に長いＬＰＳを産生するかどうかを決定しようとした。血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、Ｏ１５およびＯ７５の野生型菌血症単離物に、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドおよび抽出されたＬＰＳを形質転換した。図６に示される結果は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥが血液感染と関連する他の一般的な血清型において非常に長いＬＰＳを作る能力をもたらすことができることを確認するものである。結果はまた、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥのプラスミドに基づく発現が、これらの株において内因性ｗｚｚＢによって通常示される鎖長の制御を無効化するようであることも示す。

【0350】

１．２．一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株におけるＯ抗原のプラスミドに基づく発現
生体プロセス発達の観点から、複数の株の代わりに一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主において異なる血清型のＯ抗原を産生する能力は、個々の抗原の製造を大きく単純化するであろう。この目的のために、異なる血清型に由来するＯ抗原遺伝子クラスターをＰＣＲによって増幅し、アラビノース調節性プロモーターの制御下で低コピー数プラスミド（ｐＢＡＤ３３）中にクローニングした。このプラスミドは、異なる（ｐ１５ａ）レプリコンおよび異なる選択マーカー（クロラムフェニコール対カナマイシン）を担持するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドと適合する（同時に存在し得る）。最初の実験において、ｐＢＡＤ３３ Ｏ２５ｂオペロンプラスミドサブクローンを、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドと共に、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ中に同時トランスフェクトし、形質転換体を、０．２％アラビノースの存在下または非存在下で増殖させた。図７に示される結果は、非常に長いＯ抗原ＬＰＳがアラビノース依存的様式で産生されることを示した。

【0351】

他の血清型からクローニングされたＯ抗原遺伝子クラスターも同様に評価し、その結果を図８に示した。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥとｐＢＡＤ３３－ＯＡｇプラスミドとの同時発現により、Ｏ１、Ｏ２（４つのクローンのうちの２つについて）、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５血清型に対応する検出可能な長鎖ＬＰＳが得られた。未知の理由から、ｐＢＡＤ３３－Ｏ６プラスミドは、試験した４つ全部の単離物において検出可能なＬＰＳをもたらすことができなかった。発現レベルは可変性であったが、結果は、一般的な宿主中での長鎖Ｏ抗原の発現が実現可能であることを示している。しかしながら、一部の場合、例えば、プラスミドプロモーター配列の改変による、発現を改善するためのさらなる最適化が必要であり得る。

【0352】

サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドを含む、または含まない異なる血清型Ｏ２５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に由来するＬＰＳのプロファイルを、図１１に示す。２つの株を、Ｏ抗原の発酵、抽出および精製について試験した：天然の短いＯ２５ｂ ＯＡｇの産生については、ＧＡＲ２８３１；および長いＯ２５ｂ ＯＡｇの産生については、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ。図１１のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに示される対応する短い、および長い形態のＬＰＳは赤色で強調される。多糖を、酢酸を用いて発酵した細菌から直接抽出し、精製した。精製された短い、および長い、または非常に長いＯ２５ｂ多糖のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを、図１２に示す。２つのロットの短い多糖（ＧＡＲ２８３１由来）の特性を、単一の非常に長い多糖調製物（ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ株由来）と比較する。長いＯ抗原の分子量は、短いＯ抗原のそれよりも３．３倍大きく、反復単位数は約６５（非常に長い）と約２０であると見積もられた。表６を参照されたい。

【0353】

【表6】

【0354】

非常に長いＯ２５ｂ Ｏ抗原多糖を、従来の還元的アミノ化プロセスを使用して、ジフテリアトキソイドＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた。３つの異なるロットの糖コンジュゲートを、変化する過ヨウ素酸塩活性化度で調製した：中（５．５％）、低（４．４％）および高（８．３％）。得られる調製物および非コンジュゲート化多糖は、内毒素夾雑物を含まないことが示された（表７）。

【0355】

４匹のウサギの群（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅのメス）に、図１３Ａに示されるスケジュールに従って、１０ｍｃｇの糖コンジュゲートおよび２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバントをそれぞれワクチン接種し、血清を採取した（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）。１０ｍｃｇ用量は、細菌糖コンジュゲートの評価においてウサギに慣用的に投与される範囲の下端であることは注目に値する（２０～５０ｍｃｇがより典型的である）。また、１群のウサギには、別の試験（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＧＢ－０６９８）において、同じ用量（１０ｍｃｇの多糖＋２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバント）および同一の投与スケジュールを使用して、非コンジュゲート化多糖をワクチン接種した。

【0356】

カルボキシビーズを、非コンジュゲート化Ｏ２５ｂの長い多糖を予め結合させたメチル化ヒト血清アルブミンで被覆したＬＵＭＩＮＥＸアッセイにおいて、３つのＯ２５ｂ糖コンジュゲート調製物に対するウサギ抗体応答を評価した。血清試料中のＯ２５ｂ特異的ＩｇＧ抗体の存在を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。最良に応答するウサギ（４匹の各群に由来する１匹）において第０週（免疫前）、第６週（用量２後、ＰＤ２）、第８週（用量３後、ＰＤ３）および第１２週（用量４後、ＰＤ４）で採取した血清中で観察された免疫応答のプロファイルを、図１４に示す。１２匹のウサギのいずれにおいても、有意な免疫前血清ＩｇＧ力価は検出されなかった。対照的に、Ｏ２５ｂ抗原特異的抗体応答が、３つ全部の群におけるウサギに由来するワクチン接種後血清において検出され、低活性化糖コンジュゲート群の応答は、中または高活性化糖コンジュゲート群よりもわずかに高い傾向があった。最大応答は、用量３後の時点までに観察された。低活性化群の１匹のウサギおよび高活性化群の１匹のウサギは、ワクチン接種に応答することができなった（非応答動物）。

【0357】

長いＯ２５ｂ ＯＡｇ多糖の免疫原性に対するＣＲＭ_１９７担体タンパク質コンジュゲーションの影響を評価するために、非コンジュゲート化多糖をワクチン接種したウサギに由来する血清中の抗体の存在を、低活性化ＣＲＭ_１９７糖コンジュゲートをワクチン接種したウサギに由来する血清と比較した（図１５）。意外なことに、遊離多糖は免疫原性ではなく、免疫血清および免疫前血清においてＩｇＧ応答を実質的に惹起しなかった（パネルＡ）。対照的に、ある血清希釈率範囲（１：１００～１：６４００）にわたって、Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ_１９７をワクチン接種した４匹のウサギのうちの３匹に由来するＰＤ４血清中で、免疫前血清レベルより約１０倍高いＯ２５ｂ ＯＡｇ特異的ＩｇＧ平均蛍光強度値（ＭＦＩ）が観察された。これらの結果は、１０ｍｃｇの用量レベルでＯ２５ｂ ＯＡｇ多糖に対するＩｇＧ抗体を生成するための担体タンパク質コンジュゲーションの必要性を示している。

【0358】

ＴＳＡプレート上で増殖させた細菌を、ＰＢＳ中に懸濁し、２．０のＯＤ_６００に調整し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定した。４％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１ｈブロックした後、細菌を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の免疫前およびＰＤ３免疫血清の連続希釈液と共にインキュベートし、結合したＩｇＧを、ＰＥ標識二次Ｆ（ａｂ）抗体を用いて検出した。

【0359】

Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ_１９７によって惹起されたＯ２５ｂ抗体の特異性を、インタクトな細菌を用いるフローサイトメトリー実験において示した。ＩｇＧの全細胞への結合を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター中でＰＥコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。

【0360】

図１６に示されるように、免疫前のウサギ抗体は、野生型血清型Ｏ２５ｂ単離物ＧＡＲ２８３１およびＧＡＲ２４０１またはＫ－１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に結合することができなかったが、マッチさせたＰＤ３抗体は濃度依存的様式でＯ２５ｂ細菌を染色した。ＯＡｇを発現する能力を欠く陰性対照Ｋ－１２株は、その表面上の露出した内側コアオリゴ糖エピトープの存在に十中八九起因して、ＰＤ３抗体の非常に弱い結合しか示さなかった。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドの、野生型Ｏ２５ｂ単離物への導入により、より長いＯＡｇ多糖によって提供されるより高い密度の免疫原性エピトープと一致して、有意に増強された染色が得られた。

【0361】

結論：記載された結果は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥがサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種における非常に長いＯ抗原多糖の決定因子であるだけでなく、異なるＯ抗原血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対して、非常に長いＯＡｇを作る能力をもたらすことができることを示している。精製および適切な担体タンパク質への化学的コンジュゲーションを容易にすることによって、ならびにより高い分子量の複合体の形成を介して免疫原性を潜在的に増強することによって、生体プロセス発達に関する特性が改善されたＯ抗原ワクチン多糖を生産するために、この特性を活用することができる。

【0362】

（実施例６）
初期ウサギ試験は第１のポリクローナル抗体試薬およびＲＡＣ Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ_１９７に対するＩｇＧ応答を生成した
長鎖Ｏ２５ｂ多糖－ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを、過ヨウ素酸塩酸化、次いで、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションを使用して生産した（表７）。表１７も参照されたい。

【0363】

【表7】

【0364】

ウサギ試験１（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）（実施例５にも上記されている）では、１０μｇのＬ－、Ｍ－またはＨ－活性化ＲＡＣ（＋ＱＳ２１）を用いる５匹のウサギ／群が、図１３Ａに示されるスケジュールに従って組成物を受けた。非コンジュゲート化遊離Ｏ２５ｂ多糖は、追跡ウサギ試験（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＧＢ－０６９８）において免疫原性ではないことが観察された（図１８を参照されたい）。

【0365】

ウサギ試験２（ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７）では、Ｌ－ＲＡＣ（ＡｌＯＨ_３、ＱＳ２１、またはアジュバントなし）を用いる２匹のウサギ／群が、図１３Ｂに示されるスケジュールに従って組成物を受けた。

【0366】

ウサギ４－１、４－２、５－１、５－２、６－１、および６－２は、実施例５に記載された非常に長い非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ多糖を受け、第１８週の血清を試験した。

【0367】

より具体的には、５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、１００μｇのＡｌＯＨ_３アジュバントを含む組成物を、ウサギ４－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、１００μｇのＡｌＯＨ_３アジュバントを含む組成物を、ウサギ４－２に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、５０μｇのＱＳ－２１アジュバントを含む組成物を、ウサギ５－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、５０μｇのＱＳ－２１アジュバントを含む組成物を、ウサギ５－２に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂを含み、アジュバントを含まない組成物を、ウサギ６－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂを含み、アジュバントを含まない組成物を、ウサギ６－２に投与した。

【0368】

（実施例７）
Ｏ２５ｂ ＲＡＣコンジュゲートを用いたウサギ試験：ｄＬＩＡ血清希釈力価
試験１（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）に由来する最良に応答するウサギに対する、ウサギ試験２（ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７）のＯ２５ｂ ｄＬＩＡ血清希釈力価。これらの実験のために、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のポリリシンコンジュゲートを、以前に記載されたメチル化血清アルブミン長鎖Ｏ抗原混合物の代わりにＬｕｍｉｎｅｘカルボキシビーズ上に受動的に吸着させる、改変された直接結合Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実行した。ポリリシン－Ｏ２５ｂコンジュゲートの使用は、アッセイの感度およびＩｇＧ濃度依存的応答の質を改善し、曲線適合の使用（４パラメーター非線形式）によって血清希釈率の決定を可能にした。第１の試験に由来する最も高い力価のウサギに由来する血清中のＯ２５ｂＩｇＧ力価を、表８中の第２の試験のウサギに由来する血清と比較する。

【0369】

【表8】

【0370】

第２のウサギ試験におけるより高用量（５０／２０μｇ対１０μｇ）は、ＩｇＧ力価を改善しなかった。

【0371】

２カ月の休止は、ＩｇＧ応答を促進する（より短い間隔については観察されなかった）。

【0372】

ミョウバンは、ＱＳ２１またはアジュバントなしと比較して、ウサギにおけるＩｇＧ応答を増強するようである。

【0373】

子ウサギ補体（ＢＲＣ）および好中球の供給源としてのＨＬ６０細胞を用いるオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を確立して、Ｏ抗原糖コンジュゲートの機能的免疫原性を測定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１の予め凍結された細菌ストックを、３７℃でＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）培地中で増殖させた。細胞をペレット化し、２０％グリセロールを添加したＰＢＳ中、１ｍｌあたり１ＯＤ_６００単位の濃度で懸濁し、凍結した。予め滴定し解凍した細菌を、１％ゼラチンを含むＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）中で０．５ｘ１０^５ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、１０μＬ（１０^３ＣＦＵ）を、Ｕ底組織培養マイクロプレート中、２０μＬの連続希釈した血清と混合し、混合物を、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３０ｍｉｎ、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯ Ｓｈａｋｅｒ）で振とうした。１０μｌの２．５％補体（子ウサギ血清、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ ３１０６１－３、ＨＢＧ中で予め希釈）および２０μＬのＨＬ－６０細胞（０．７５ｘ１０^７／ｍｌ）および４０μＬのＨＢＧをＵ底組織培養マイクロプレートに添加し、混合物を５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４５ｍｉｎ、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯ Ｓｈａｋｅｒ）で振とうした。続いて、それぞれ１００μＬの反応液のうちの１０μＬを、１００μＬの水を加え、減圧濾過し、１５０μＬの５０％ＬＢを加えることによって調製された、予め湿らせたＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮＨＴＳ ＨＶフィルタープレートの対応するウェルに移した。フィルタープレートを減圧濾過し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）分析装置およびＩＭＭＵＮＯＣＡＰＴＵＲＥソフトウェアを使用して、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ色素および脱染溶液を用いて固定、染色、および脱染した後、コロニーを数えた。ＯＰＡ活性の特異性を確立するために、免疫血清を、１００μｇ／ｍＬの精製された長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原と共に予備インキュベートした後、ＯＰＡ反応における他のアッセイ成分と混合した。ＯＰＡアッセイは、ＨＬ６０細胞または補体に対する観察される殺傷の依存性を証明するために、これらの成分を含まない対照反応を含む。

【0374】

両方のウサギ試験に由来する代表的なウサギに由来するマッチさせた免疫前およびワクチン接種後の血清試料を、アッセイにおいて評価し、血清希釈力価を決定した（表９、図１９Ａ～Ｂ）。非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖と共に予備インキュベートすることにより、ＯＰＡの特異性を示す殺菌活性が遮断された（図１９Ｃ）。表９はＯＰＡ力価を示す。

【0375】

ウサギ２－３に、以下のように投薬した：ウサギ２－３の投薬：１０／１０／１０／１０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋ＱＳ２１、用量４後（ＰＤ）に出血させた。ウサギ１－２に、以下のように投薬した：５０／２０／２０／２０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋Ａｌ（ＯＨ）_３、ＰＤ４に出血させた。

【0376】

【表9】

【0377】

（実施例８）
非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖および誘導されたＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲートにより惹起されるＯ抗原Ｏ２５ｂ ＩｇＧレベル
１０匹のＣＤ－１マウスの群に、皮下注射により、０．２または２．０μｇ／動物のＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲートを、第０、５および１３週で投与し、免疫原性試験のために第３週（用量１後、ＰＤ１）、第６週（用量２後、ＰＤ２）および第１３週（用量３後、ＰＤ３）の時点で採血した。抗原特異的ＩｇＧのレベルを、内部標準としてのＯ２５ｂ特異的マウスｍＡｂを用いる定量的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（実施例７の詳細を参照されたい）によって決定した。ベースラインＩｇＧレベル（点線）を、２０匹の無作為に選択されたワクチン非接種マウスからプールされた血清中で決定した。遊離非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖免疫原は、任意の時点でベースラインレベルを超えるＩｇＧを誘導しなかった。対照的に、ＩｇＧ応答は、Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ１９７ ＲＡＣ長鎖コンジュゲート糖コンジュゲートの２回投与後に観察された：ロバストで均一なＩｇＧ応答が、ＰＤ３までに観察され、ＰＤ２で中間レベルおよびより変動性のＩｇＧレベルが観察された。ＧＭＴ ＩｇＧ値（ｎｇ／ｍｌ）は９５％ＣＩエラーバーと共に示される。図２０を参照されたい。

【0378】

（実施例９）
Ｏ２５ｂ子ウサギ補体（ＢＲＣ）ＯＰＡの特異性
Ａ～Ｂ）ウサギ２～３および１～２に由来するＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原免疫後血清（マッチさせた免疫前対照血清ではなく）は、殺菌性ＯＰＡ活性を示す。Ｃ）ウサギ１～２に由来する免疫血清のＯＰＡ活性を、１００μｇ／ｍＬの長鎖Ｏ抗原Ｏ２５ｂ多糖と共に予備インキュベートすることによって遮断した。ＧＡＲ２８３１細菌株を、３７℃で１ｈ、ＨＬ６０、２．５％ＢＲＣおよび血清の連続希釈液と共にインキュベートし、フィルタープレート上のマイクロコロニーを計測することにより（ＣＦＵ）、生存する細菌を数えた。図１９を参照されたい。

【0379】

（実施例１０）
ＲＡＣおよびｅＴＥＣ Ｏ２５ｂ長鎖糖コンジュゲートは、単一末端糖コンジュゲートよりも免疫原性が高い
カルバペネム耐性フルオロキノロン（ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｌｏｎｅ）耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣ ＯＰＡアッセイ。２０匹のＣＤ－１マウスの群に、図２１に示されるのと同じスケジュールに従って２μｇの糖コンジュゲートをワクチン接種し、用量２後（ＰＤ２）（パネルＡ）および用量３後（ＰＤ３）（パネルＢ）の時点でＯＰＡ応答を決定した。バーは、９５％ＣＩを含むＧＭＴを示す。ワクチン非接種ベースラインを超える応答動物率が示される。異なる群に由来する対数変換データを評価して、Ｗｅｌｃｈの補正を行った対応のないｔ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、差異が統計的に有意であるかどうかを評価した。結果を、表１０にまとめる。図２１を参照されたい。２μｇのｅＴＥＣ Ｏ１ａ長鎖糖コンジュゲートをワクチン接種したマウスにおいては、ＰＤ２およびＰＤ３でのＯ１ａに対するＯＰＡ力価（データは示さない）は、表１０に示される、それぞれ、ＰＤ２およびＰＤ３でのＯ２５ｂに対するＯＰＡ力価よりも高いことが観察された。

【0380】

【表10】

【0381】

（実施例１１）
多糖活性化のレベルを改変することによってｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性を改善することができる
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣ ＯＰＡアッセイ。２０匹のＣＤ－１マウスの群に、０．２μｇまたは２μｇの示された長鎖Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートをワクチン接種し、ＯＰＡ応答をＰＤ２の時点で決定した。４％活性化と１７％活性化の群に由来する集約された対数変換データを評価して、Ｗｅｌｃｈの補正を行った対応のないｔ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、ＯＰＡ応答の差異が統計的に有意であることを確認した。個々の群に関するＧＭＴおよび応答動物率を、表１１にまとめる。図２２を参照されたい。

【0382】

【表11】

【0383】

（実施例１２）
負荷試験は、長鎖大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣコンジュゲートが３つの用量後に保護を惹起することを示す
示されたスケジュールに従って２μｇの用量で免疫された２０匹のＣＤ－１マウスの群に、１ｘ１０^９個のＧＡＲ２８３１株の細菌をＩＰによりチャレンジした。その後の生存を、６日間にわたってモニタリングした。４％、１０％または１７％のレベルで活性化されたｅＴＥＣ糖コンジュゲートをワクチン接種したマウスの群は、致死的感染から保護されたが、ワクチン非接種対照マウスまたは２μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖多糖をワクチン接種したマウスは保護されなかった。図２３を参照されたい。

【0384】

（実施例１３）
ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの調製のためのプロセス
糖の活性化およびシスタミン二塩酸塩を用いたチオール化。糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の水分含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析によって決定し、０．１～１．０％、典型的には０．５％の水分含量に達するように調整する。

【0385】

活性化を開始させるために、１，１’－カルボニル－ジ－１，２，４－トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液を、ＤＭＳＯ中、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新鮮に調製する。様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１～１０モル当量）を用いて糖を活性化し、ｒｔまたは３５℃で１～５時間、反応を進行させる。活性化反応溶液中の残留ＣＤＩ／ＣＤＴをクエンチするために、水を添加した。添加される水の量を決定し、最終水分含量が総水分量の２～３％となるように計算を実施する。反応をｒｔで０．５時間進行させた。５０ｍｇ／ｍＬの濃度の無水ＤＭＳＯ中でシスタミン二塩酸塩を新鮮に調製する。活性化された糖を、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩と反応させる。あるいは、活性化された糖を、１～２モル当量のシスタミン塩酸塩と反応させる。チオール化反応をｒｔで５～２０時間進行させて、チオール化された糖を生産する。チオール化レベルは、添加されるＣＤＴ／ＣＤＩの量によって決定される。

【0386】

活性化されたチオール化された糖の還元および精製。チオール化された糖の反応混合物に、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液を添加し、ｒｔで３～５時間進行させる。次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化された糖の透析濾過を、３０～４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施する。活性化されたチオール化された糖の保持液のアリコートを取り出し、糖濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。

【0387】

ブロモアセチル化された担体タンパク質の活性化および精製。担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。

【0388】

担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、最初に活性化の前にｐＨ約７で、８±３℃で保持する。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。

【0389】

活性化の程度を、伝導率検出が抑制されたイオン交換液体クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）によるトータルブロミドアッセイによって決定する。活性化されたブロモアセチル化されたタンパク質上の結合した臭化物を、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得る遊離臭化物と共に定量する。タンパク質上の残存する共有結合した臭化物を、試料をアルカリ性２－メルカプトエタノール中で加熱することによってイオン性臭化物に変換することによって遊離させる。

【0390】

ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７の活性化および精製。１０ｍＭリン酸緩衝化０．９％ＮａＣｌ ｐＨ７（ＰＢＳ）を用いてＣＲＭ_１９７を５ｍｇ／ｍＬに希釈した後、１Ｍストック溶液を使用して０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ７．０にした。２０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡＡＮＳを、ＣＲＭ_１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．３５（ｗ：ｗ）で添加した。反応混合物を３℃～１１℃で３０ｍｉｎ～１時間にわたってインキュベートした後、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用する限外濾過／透析濾過によって精製した。精製された活性化されたＣＲＭ_１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによってアッセイして、タンパク質濃度を決定した後、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。凍結保護剤としてスクロースを５％ｗｔ／ｖｏｌとなるように添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションに必要となるまで－２５℃で保存した。

【0391】

ＣＲＭ_１９７のリシン残基のブロモアセチル化は非常に一貫しており、利用可能な３９個のリシンから１５～２５個のリシンの活性化が得られた。この反応は、高収率の活性化されたタンパク質を生産した。

【0392】

活性化されたチオール化された糖の、ブロモアセチル化された担体タンパク質へのコンジュゲーション。続いて、ブロモアセチル化された担体タンパク質および活性化されたチオール化された糖を添加する。糖／タンパク質インプット比は０．８±０．２である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させる。

【0393】

残存する反応性官能基のキャッピング。担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、キャッピング試薬としての２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。

【0394】

ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの精製。コンジュゲーション反応（ＩＡＡキャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施する。次いで、糖コンジュゲート保持液を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートを、アッセイのために取り出す。残りの糖コンジュゲートを、５℃で保存する。表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照されたい。

【0395】

（実施例１４）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５Ｂ ＥＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂリポ多糖の活性化。凍結乾燥された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥されたＯ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液の水分含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析によって決定した。Ｏ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液にＷＦＩを添加することによって水分含量を調整して、０．５％の水分含量を達成した。

【0396】

活性化を開始させるために、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を、ＤＭＳＯ溶液中、１００ｍｇ／ｍＬとして新鮮に調製した。チオール化ステップの前に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖を、様々な量のＣＤＩで活性化した。ＣＤＩ活性化を、ｒｔまたは３５℃で１～３時間にわたって実行した。活性化反応溶液中の残留ＣＤＩをクエンチするために、水を添加した。添加される水の量を決定し、最終水分含量が総水分量の２～３％となるように計算を実施する。反応をｒｔで０．５時間進行させた。

【0397】

活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖のチオール化。シスタミン二塩酸塩を、無水ＤＭＳＯ中で新鮮に調製し、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩を、活性化された多糖の反応溶液に添加した。反応をｒｔで２０±４時間進行させた。

【0398】

活性化されたチオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖の還元および精製。チオール化された糖の反応混合物に、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液を添加し、ｒｔで３～５時間進行させた。次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化された糖の透析濾過を、５Ｋ ＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用いて４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施した。チオール化されたＯ２５ｂ多糖保持液を、糖濃度アッセイとチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイとの両方のために取り出した。活性化プロセスのフローダイアグラムを、図２５Ａに提供する。

【0399】

コンジュゲーションプロセス－チオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖の、ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション。実施例１３に記載されたように、ブロモアセチル化によってＣＲＭ_１９７担体タンパク質を別々に活性化した後、コンジュゲーション反応のために活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖と反応させた。ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７と、チオール化されたＯ２５ｂ多糖とを、反応容器中で一緒に混合した。糖／タンパク質インプット比は０．８±０．２であった。反応ｐＨを、８．０～１０．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させた。

【0400】

ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７およびチオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖上の反応基のキャッピング。ＣＲＭ_１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってキャッピングした後、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて、チオール化されたＯ２５ｂ－多糖の残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。

【0401】

ｅＴＥＣ結合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートの精製。コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍのフィルターを通して濾過した。Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートの透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用いて実行した。５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して透析濾過を実施した。次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ糖コンジュゲート１００Ｋ保持液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５℃で保存した。

【0402】

コンジュゲーションプロセスのフローダイアグラムを、図２５Ｂに提供する。

【0403】

結果
いくつかのバッチの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートに関する反応パラメーターおよび特性評価データを、表１２に示す。シスタミン二塩酸塩を用いるＣＤＩ活性化－チオール化は、４１～９２％の糖収率および５％未満から１４％の遊離糖を有する糖コンジュゲートを生成した。表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８も参照されたい。

【0404】

【表12】

【0405】

（実施例１５）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖－ＣＲＭ_１９７ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製のための手順（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６に由来するＯ抗原に適用される）
多糖の活性化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。活性化を開始させるために、様々な量の１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１～１０モル当量）を多糖溶液に添加し、ｒｔまたは３５℃で１～５時間、反応を進行させる。次いで、水（２～３％、ｖ／ｖ）を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＩをクエンチした。反応をｒｔで０．５時間進行させた後、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩を添加する。反応をｒｔで５～２０時間進行させた後、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理して、チオール化された糖を生産する。チオール化レベルは、添加されるＣＤＩの量によって決定される。

【0406】

次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化された糖の透析濾過を、３０～４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施する。活性化されたチオール化された糖の保持液のアリコートを取り出し、糖濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。

【0407】

担体タンパク質（ＣＲＭ_１９７）の活性化
ＣＲＭ_１９７（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、最初に活性化の前にｐＨ約8で、８±３℃で保持する。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。

【0408】

コンジュゲーション
続いて、活性化されたＣＲＭ_１９７および活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を、リアクターに添加し、混合する。糖／タンパク質インプット比は１±０．２である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させる。担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、キャッピング試薬としての２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。次いで、反応混合物を、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施される限外濾過／透析濾過を使用して精製する。次いで、精製されたコンジュゲートを、０．２μｍフィルターを通して濾過する。表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照されたい。

【0409】

（実施例１６）
一般的手順－還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によるＯ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、２５ｂ由来）多糖のコンジュゲーション
ジメチルスルホキシド中でのコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）
多糖の活性化
計算された量の５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）の連続添加によって１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０±０．２）中で多糖酸化を実行して、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要に応じて、反応ｐＨを、近似的に、ｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を４℃に冷却した。酸化を、約０．０９～０．１３モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加によって開始させた。酸化反応を、近似的に、２０±４ｈにわたって５±３℃で実施した。

【0410】

活性化された多糖の濃度および透析濾過を、５Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを使用して実行した。透析濾過を、２０倍透析容量のＷＦＩに対して実施した。次いで、精製された活性化された多糖を５±３℃で保存した。精製された活性化された糖を、特に、（ｉ）比色アッセイによる糖濃度；（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度；（ｉｉｉ）酸化度；および（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性評価する。

【0411】

活性化された多糖と、スクロース賦形剤との混合、および凍結乾燥
活性化された多糖を、スクロースと、活性化された多糖１グラムあたり２５グラムのスクロースの比で混合した。次いで、混ぜ合わせた混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥の後、凍結乾燥された活性化された多糖を含有するボトルを、－２０±５℃で保存した。計算された量のＣＲＭ_１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ_１９７を、－２０±５℃で保存した。

【0412】

凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。多糖の完全な溶解時に、復元のために等量の無水ＤＭＳＯを、凍結乾燥されたＣＲＭ_１９７に添加した。

【0413】

コンジュゲーションおよびキャッピング
復元された活性化された多糖を、反応容器中で復元されたＣＲＭ_１９７と混ぜ合わせた後、完全に混合して、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始する前に透明な溶液を得た。反応溶液中の最終多糖濃度は、約１ｇ／Ｌであった。反応混合物に０．５～２．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３±２℃で２０～４８ｈインキュベートすることによって、コンジュゲーションを開始させた。２モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）を添加することによってコンジュゲーション反応を終結させて、未反応のアルデヒドをキャッピングした。このキャッピング反応は、２３±２℃で３±１ｈにわたって継続した。

【0414】

コンジュゲートの精製
１００～３００ＫのＭＷＣＯの膜を使用する接線流濾過による精製に備えて、コンジュゲート溶液を、冷やした５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈した。

【0415】

希釈されたコンジュゲート溶液を、５μｍフィルターに通過させ、媒体として５ｍＭコハク酸塩／０．９％塩水（ｐＨ６．０）を使用して透析濾過を実施した。透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、０．２２μｍフィルターを通して移した。コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩／０．９％塩水（ｐＨ６）を用いて、約０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖濃度までさらに希釈した。あるいは、１００～３００ＫのＭＷＣＯの膜を使用する接線流濾過によって２０ｍＭヒスチジン－０．９％塩水（ｐＨ６．５）を使用して、コンジュゲートを精製する。最後の０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照されたい。

【0416】

（実施例１７）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６から適用される、水性緩衝剤（ＲＡＣ／水性）中でのコンジュゲーション
多糖の活性化および透析濾過を、ＤＭＳＯに基づくコンジュゲーションについてのものと同じ様式で実施した。

【0417】

濾過した活性化された糖を、血清型に応じて、０．４～２ｗ／ｗの範囲の多糖のタンパク質に対する質量比でＣＲＭ_１９７と混合した。このインプット比を選択して、得られるコンジュゲート中の多糖のＣＲＭ_１９７に対する比を制御した。

【0418】

次いで、混ぜ合わせた混合物を凍結乾燥した。コンジュゲーション時に、多糖とタンパク質との混合物を、血清型に応じて５～２５ｇ／Ｌの範囲の多糖濃度で０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中に溶解し、血清型に応じてｐＨを６．０～８．０に調整した。０．５～２．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、２３±２℃で２０～４８ｈにわたってインキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始させた。１～２モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）を添加することによってコンジュゲーション反応を終結させて、未反応のアルデヒドをキャッピングした。

【0419】

あるいは、濾過した活性化された糖および計算された量のＣＲＭ_１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中への溶解時に混合した後、上記のようにコンジュゲーションを進行させることができる。

【0420】

【表13】

【0421】

（実施例１８）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖－ＣＲＭ_１９７単一末端コンジュゲートの調製のための手順
グラム陰性細菌の外膜の一般的な成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、リピドＡ、コア領域、およびＯ抗原（Ｏ特異的多糖またはＯ多糖とも呼ばれる）を含む。異なる血清型のＯ抗原反復単位は、その組成、構造および血清学的特徴において異なる。本発明で使用されるＯ抗原は、その鎖末端に２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）と呼ばれる糖単位を含有するコアドメインに結合される。多糖鎖の無作為活性化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、またはカルボジイミドを用いる活性化）に基づく一部のコンジュゲーション法とは異なる。本発明は、チオール官能基のアンマスク時に、ジスルフィドアミンリンカーを用いたＫＤＯの選択的活性化を含むコンジュゲーションプロセスを開示し、次いで、それは図２４（単一末端コンジュゲートの調製）に描写されるようにブロモ活性化されたＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートされる。

【0422】

シスタミンリンカー（Ａ１）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖およびシスタミン（５０～２５０モル当量のＫＤＯ）を、リン酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを６．０～７．０に調整した。混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物を３７℃で４８～７２ｈにわたって撹拌した。室温に冷却し、等量のリン酸緩衝剤で希釈する際に、混合物をトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した（１．２モル当量のシスタミンを添加した）。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。

【0423】

次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ_１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。担体タンパク質上の未反応のブロモ残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照されたい。

【0424】

（実施例１９）
３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖と、３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（５～５０モル当量のＫＤＯ）とを、酢酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを４．５～５．５に調整した。混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物を２３～３７℃で２４～７２ｈ撹拌した。次いで、混合物を、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した（１．２モル当量の３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカーを添加した）。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。

【0425】

次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ_１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。担体タンパク質上の未反応のブロモ残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。

【0426】

（実施例２０）
２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセトアミド）リンカー（Ａ６）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖と、２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセトアミド）（５～５０モル当量のＫＤＯ）とを酢酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを４．５～５．５に調整した。次いで、混合物を２３～３７℃で２４～７２ｈ撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物をさらに３～２４ｈ撹拌した。次いで、混合物を、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（１．２モル当量のリンカーを添加した）で処理した。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。

【0427】

次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ_１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによって、担体タンパク質上の未反応のブロモ残基をクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。

【0428】

（実施例２１）
ブロモ活性化されたＣＲＭ_１９７の調製
ＣＲＭ_１９７を、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ８．０±０．２中で調製し、５±３℃に冷却した。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。

【0429】

【表14】

【0430】

【表15】

【0431】

【表16】

【0432】

【表17】

【0433】

【表18】

【0434】

（実施例２２）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ－Ａｇ－ＴＴコンジュゲートの調製
凍結乾燥した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂ長鎖多糖、ロット番号７０９７６６－３０（約６．９２ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約３９ｋＤａ）、５０ｍｇを、破傷風トキソイド（ＴＴ）コンジュゲーションのために使用した。

【0435】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１ａ長鎖多糖７１０９５８－１４２－３（約６．３ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４．３ｋＤａ）（５０ｍｇ、７．９４ｍＬ）を凍結乾燥した。

【0436】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６長鎖多糖７１０７５８－１２１－１（約１６．８ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４ｋＤａ）（５０ｍｇ、２．９８ｍＬ）を凍結乾燥した。

【0437】

上記の凍結乾燥した多糖のそれぞれをＷＦＩ中に溶解して、約５～１０ｍｇ／ｍＬにし、０．５ｍＬ（１ｍＬアセトニトリル中の１００ｍｇの１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）溶液）を添加し、ＲＴで撹拌した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）０．２Ｍ（２ｍＬ）を添加し、ＲＴで撹拌した。

【0438】

破傷風トキソイド（ＴＴ）の調製：ＴＴ（１００ｍｇ、４７ｍｌ）を約２０ｍＬに濃縮し、濾過チューブを使用して塩水で２回洗浄した（２ｘ５０ｍＬ）。その後、それをＨＥＰＥＳおよび塩水で希釈して、最終ＨＥＰＥＳ濃度を約０．２５Ｍにした。

【0439】

ＴＴを上記のように調製し、反応液のｐＨを約９．１～９．２に調整した。反応混合物をＲＴで撹拌した。

【0440】

２０～２４ｈ後、反応をグリシン（０．５ｍＬ）でクエンチした。その後、それを、ＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用して濃縮し、塩水に対して透析濾過を実施した。濾過し、分析した。表１９を参照されたい。

【0441】

【表19】

【0442】

（実施例２３）
Ｏ抗原の発酵、精製、およびコンジュゲーションのさらなる結果
以下に記載される例示的なプロセスは一般に、全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に適用可能である。それぞれの多糖の生産は、バッチ式生産発酵、次いで、下流の精製前の化学的不活化を含んでいた。

【0443】

株および保存。短鎖Ｏ抗原の生合成のために用いられた株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の臨床野生型株であった。長鎖Ｏ抗原を、天然ｗｚｚｂ遺伝子の欠失を有するようにＷａｎｎｅｒ－Ｄａｔｓｅｎｋｏ法によって操作された短鎖生産株の派生株を用いて生産し、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に由来する「長鎖」伸長機能ｆｅｐＥによって補完した。Ｔ７プロモーター領域が欠失された、高コピーｃｏｌＥ１ベース「トポ」ベクターまたはｃｏｌＥ１ベースベクターｐＥＴ３０ａの低コピー派生株上のその天然プロモーターから、ｆｅｐＥ機能を発現させた。

【0444】

無動物ＬＢまたは最少培地中で細胞を少なくとも３．０のＯＤ_６００まで増殖させることによって、細胞バンクを調製した。次いで、ブロスを新鮮な媒体中に希釈し、８０％グリセロールと混合して、２．０ＯＤ_６００／ｍＬを有する２０％グリセロール最終濃度を得た。

【0445】

種培養および発酵のために使用される培地。用いられる種および発酵培地は、以下の製剤を共有する：ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４－２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２－６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２－４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２およびＣａＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ。

【0446】

種および発酵条件。種を、単一の種バイアルから０．１％で接種した。種フラスコを３７℃で１６～１８時間インキュベートし、典型的には１０～２０ＯＤ_６００／ｍＬを達成した。

【0447】

発酵を、１０Ｌステンレススチール製定置蒸気滅菌発酵器中で実施した。

【0448】

発酵培地の接種は、典型的には、１０ＯＤ_６００の種から１：１０００であった。１０ｇ／Ｌのバッチ式グルコース上で増殖が進行する期間であるバッチ期は、典型的には８時間続く。グルコース消耗時に、溶解酸素の突然の上昇があり、その時点でグルコースを発酵液に供給した。次いで、発酵は典型的には１６～１８時間進行し、１２０を超えるＯＤ_６００／ｍＬの収穫を得る。

【0449】

血清型Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂに関する短鎖／長鎖Ｏ抗原生産の初期評価。Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂのための野生型株を、バッチ様式で補給最小培地中でＯＤ_６００＝１５～２０まで発酵させた。酸素消費の突然の減少をもたらすグルコース消耗時に、増殖制限グルコース供給を、グルコース溶液から１６～１８時間にわたって適用した。１２４～１４５ＯＤ_６００単位／ｍＬの細胞密度に達した。続いて、収穫ブロスのｐＨを約３．８に調整し、２時間にわたって９５℃に加熱した。次いで、加水分解されたブロスを２５℃に冷却し、ｐＨ６．０にし、遠心分離して固体を除去した。次いで、得られた上清を、Ｏ抗原の定量化のためにＳＥＣ－ＨＰＬＣカラムに印加した。２２４０～４１８０ｍｇ／Ｌの範囲の生産性が得られた。これらのバッチに由来する精製された短鎖Ｏ抗原の分子量は、１０～１５ｋＤａの範囲であることがわかった。また、Ｏ２およびＯ６加水分解物のＳＥＣクロマトグラフィーが、Ｏ１ａおよびＯ２５ｂ加水分解物中では明らかでない異なる別々の夾雑多糖を示すこともわかった。

【0450】

長鎖型のＯ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂ Ｏ抗原に、高コピーのカナマイシン選択性トポプラスミド上に異種性の相補的ｆｅｐＥ遺伝子を担持する、ｗｚｚｂ欠失型のそれぞれの株の発酵によってアクセスした。発酵を、カナマイシン選択ではあるが、短鎖に関して実施した。１２４～１７７のＯＤ_６００／ｍＬで観察された最終細胞密度は、３５００～９８５０ｍｇ／ＬのＯ抗原生産性と関連していた。長鎖Ｏ抗原の相補性に基づく合成は、親短鎖株におけるものと少なくとも同程度の生産性があり、場合によっては、より高い生産性があった。精製されたＯ抗原多糖の分子量は、３３～４９ｋＤａであったか、または対応する短鎖のサイズの約３倍であった。

【0451】

Ｏ２およびＯ６に関する長鎖加水分解物は、長鎖抗原の場合、主要なＯ抗原ピーク上で肩として観察される、夾雑多糖ピークの証拠を示す；Ｏ１およびＯ２５ｂは、短鎖親に関してより容易に認められるように、夾雑多糖の生産の証拠を示さないことがわかった。

【0452】

増殖速度抑制は、ｆｅｐＥがないトポレプリコンの存在と関連することがわかった。さらに、Δｗｚｚｂ突然変異自体は増殖速度に対して有害な効果を有しなかったが、これは、増殖速度の乱れがプラスミドベクターによって伝達されたことを示している。

【0453】

Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５ Ｏ抗原の生産のための株の評価。血清型Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５の複数の野生型株を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって、発酵において望ましくない多糖を産生するそれらの傾向について評価した。Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５に関する株を、存在しない夾雑多糖として、ならびに１０００ｍｇ／Ｌを超えるＯ抗原を産生するその能力について、およびΔｗｚｚｂ形質の導入のためのＷａｎｎｅｒ－Ｄａｔｓｅｎｋｏ組換えを可能にする抗生物質感受性プロファイルのディスプレイについて選択した。

【0454】

一般に、カナマイシン耐性であることがわかっているＯ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５ ｗｚｚｂ株へのｆｅｐＥの導入を可能にする、クロラムフェニコール選択型のトポ－ｆｅｐＥおよびｐＥＴ－ｆｅｐＥを構築した。得られるトポ－ｆｅｐＥおよびｐＥＴ－ｆｅｐＥ担持株を、クロラムフェニコール選択を用いて発酵させ、酸加水分解されたブロスに由来する上清をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって評価した。高コピー（トポ）と低コピー（ｐＥＴ）の両方のｆｅｐＥ構築物は、それぞれに関して、親野生型と同等である生産性でＯ抗原の合成を指示した。潜在的に干渉する多糖の発現は観察されなかった。

【0455】

ｗｚｚｂプラスミド担持株に関する増殖速度の評価により、Ｏ１１、Ｏ１３およびＯ２１が、ｐＥＴ－ｆｅｐＥによってではなく、トポ－ｆｅｐＥの存在によって遅延されることを示された；Ｏ１６およびＯ７５株は、レプリコンの選択とは無関係に許容し得る増殖速度を示した。

【0456】

【表20】

【0457】

多糖のための精製プロセスは、Ｏ抗原を遊離させるための酸加水分解を含んでいた。発酵リアクター中の血清型特異的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の粗懸濁液を酢酸で直接処理して、３．５±０．５の最終ｐＨにし、酸性化されたブロスを少なくとも１時間にわたって９５±５℃の温度に加熱した。この処理は、オリゴ糖およびリピドＡの近位末端で、ＫＤＯ間の不安定な結合を切断し、かくして、Ｏ－Ａｇ鎖を遊離させる。遊離したＯ－Ａｇを含有する酸性化されたブロスを２０±１０℃に冷却した後、ＮＨ_４ＯＨを使用してｐＨ７±１．０に中和した。このプロセスは、いくつかの遠心分離、濾過、および濃縮／透析濾過操作ステップをさらに含んでいた。

【0458】

【表21-1】

【0459】

【表21-2】

【0460】

以下の項目は、本発明のさらなる実施形態を説明する。

【0461】

Ｃ１．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖。

【0462】

Ｃ２．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、式Ｏ６２Ｄ_１、式Ｏ２２、式Ｏ３５、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ８３、式Ｏ９１、式Ｏ１０５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１３９、式Ｏ１５３、式Ｏ１６７、および式Ｏ１７２（式中、ｎは２０～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１に記載の糖。

【0463】

Ｃ３．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、および式６２Ｄ_１（式中、ｎは２０～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ２に記載の糖。

【0464】

Ｃ４．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ２１、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、項目Ｃ２に記載の糖。

【0465】

Ｃ５．式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１から選択される構造を含まない、項目Ｃ１に記載の糖。

【0466】

Ｃ６．式Ｏ１２から選択される構造を含まない、項目Ｃ１に記載の糖。

【0467】

Ｃ７．前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって生産される、項目Ｃ４に記載の糖。

【0468】

Ｃ８．ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される、項目Ｃ７に記載の糖。

【0469】

Ｃ９．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢである、項目Ｃ７に記載の糖。

【0470】

Ｃ１０．ｗｚｚファミリータンパク質がｆｅｐＥである、項目Ｃ７に記載の糖。

【0471】

Ｃ１１．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、項目Ｃ７に記載の糖。

【0472】

Ｃ１２．ｗｚｚファミリータンパク質がサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来する、項目Ｃ７に記載の糖。

【0473】

Ｃ１３．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ７に記載の糖。

【0474】

Ｃ１４．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目Ｃ７に記載の糖。

【0475】

Ｃ１５．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ７に記載の糖。

【0476】

Ｃ１６．糖が合成的に合成される、項目Ｃ１に記載の糖。

【0477】

Ｃ１７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0478】

Ｃ１８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0479】

Ｃ１９．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0480】

Ｃ２０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0481】

Ｃ２１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0482】

Ｃ２２．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ２１のいずれか一項に記載の糖。

【0483】

Ｃ２３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0484】

Ｃ２４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0485】

Ｃ２５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0486】

Ｃ２６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0487】

Ｃ２７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１６のいずれか一項に記載の糖。

【0488】

Ｃ２８．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ２１のいずれか一項に記載の糖。

【0489】

Ｃ２９．リピドＡを含まない、項目Ｃ１からＣ２２のいずれか一項に記載の糖。

【0490】

Ｃ３０．多糖が１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ、または５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する、項目Ｃ１からＣ２９のいずれか一項に記載の糖。

【0491】

Ｃ３１．２０～４０ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ１からＣ３０のいずれか一項に記載の糖。

【0492】

Ｃ３２．４０，０００～６０，０００ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ１からＣ３１のいずれか一項に記載の糖。

【0493】

Ｃ３３．ｎが３１～９０の整数である、項目Ｃ１からＣ３２のいずれか一項に記載の糖。

【0494】

Ｃ３４．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲート。

【0495】

Ｃ３５．担体タンパク質に共有結合した、項目Ｃ１から項目Ｃ３３のいずれか一項に記載の糖を含むコンジュゲート。

【0496】

Ｃ３６．担体タンパク質が、例えば、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、項目Ｃ３４から項目Ｃ３５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0497】

Ｃ３７．担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、項目Ｃ３４から項目Ｃ３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0498】

Ｃ３８．担体タンパク質が破傷風トキソイド（ＴＴ）である、項目Ｃ３４から項目Ｃ３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0499】

Ｃ３９．還元的アミノ化によって調製されている、項目Ｃ３４から項目Ｃ３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0500】

Ｃ４０．ＣＤＡＰ化学反応によって調製されている、項目Ｃ３４から項目Ｃ３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0501】

Ｃ４１．単一末端結合コンジュゲート化糖である、項目Ｃ３４から項目Ｃ３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0502】

Ｃ４２．（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ３４から項目Ｃ３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0503】

Ｃ４３．糖が（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、項目Ｃ４２に記載のコンジュゲート。

【0504】

Ｃ４４．ＣＲＭ_１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合した２～２０個、または４～１６個のリシン残基を含む、項目Ｃ４２から項目Ｃ４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0505】

Ｃ４５．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、項目Ｃ３４から項目Ｃ４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0506】

Ｃ４６．糖のタンパク質に対する比が少なくとも０．５であり、最大でも２である、項目Ｃ３４から項目Ｃ４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0507】

Ｃ４７．糖のタンパク質に対する比が０．４～１．７である、項目Ｃ３４から項目Ｃ４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0508】

Ｃ４８．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ４１から項目Ｃ４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【0509】

Ｃ４９．担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートであって、糖が、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を含む、コンジュゲート。

【0510】

Ｃ５０．項目Ｃ１から項目Ｃ３３のいずれか一項に記載の糖と、薬学的に許容できる希釈剤とを含む組成物。

【0511】

Ｃ５１．項目Ｃ３４から項目Ｃ４９のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容できる希釈剤とを含む組成物。

【0512】

Ｃ５２．組成物中の糖の総量と比較して最大でも約２５％の遊離糖を含む、項目Ｃ５１に記載の組成物。

【0513】

Ｃ５３．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ５０から項目Ｃ５１のいずれか一項に記載の組成物。

【0514】

Ｃ５４．アルミニウムをさらに含む、項目Ｃ５０からＣ５１のいずれか一項に記載の組成物。

【0515】

Ｃ５５．ＱＳ－２１をさらに含む、項目Ｃ５０から項目Ｃ５１のいずれか一項に記載の組成物。

【0516】

Ｃ５６．ＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目Ｃ５０から項目Ｃ５１のいずれか一項に記載の組成物。

【0517】

Ｃ５７．アジュバントを含まない、項目Ｃ５０から項目Ｃ５１のいずれか一項に記載の組成物。

【0518】

Ｃ５８．多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む組成物。

【0519】

Ｃ５９．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ５８に記載の組成物。

【0520】

Ｃ６０．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ５８に記載の組成物。

【0521】

Ｃ６１．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ５８に記載の組成物。

【0522】

Ｃ６２．多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、項目Ｃ１から項目Ｃ１６のいずれか一項に記載の糖を含む組成物。

【0523】

Ｃ６３．（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、組成物。

【0524】

Ｃ６４．Ｏ１Ａ抗原、Ｏ６抗原、およびＯ２抗原がそれぞれ以下の式を含む、項目Ｃ６３に記載の組成物。

【0525】

Ｃ６５．担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、項目Ｃ６３に記載の組成物。

【0526】

Ｃ６６．ａ）有機溶媒中で、糖と、１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とを反応させて、活性化された糖を生産するステップ；ｂ）活性化された糖と、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩とを反応させて、チオール化された糖を生産するステップ；ｃ）チオール化された糖と、還元剤とを反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化されたチオール化された糖を生産するステップ；ｄ）活性化されたチオール化された糖と、１つまたは複数のα－ハロアセトアミド基を含む活性化された担体タンパク質とを反応させて、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートを生産するステップ；ならびにｅ）チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）活性化された担体タンパク質の非コンジュゲート化α－ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とを反応させるステップを含み、それによって、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートが生産され、糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むコンジュゲートを作製する方法。

【0527】

Ｃ６７．糖が項目Ｃ１から項目Ｃ３３のいずれか一項に記載の糖を含む、項目Ｃ６６に記載の方法。

【0528】

Ｃ６８．キャッピングステップｅ）が、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、および／または（ｉｉ）第２のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドとを反応させることを含む、項目Ｃ６６から項目Ｃ６７のいずれか一項に記載の方法。

【0529】

Ｃ６９．トリアゾールまたはイミダゾールとの反応によって糖を混合して、混合された糖を提供するステップをさらに含み、ステップａ）の前に、混合された糖がシェル凍結され、凍結乾燥され、有機溶媒中で復元される、項目Ｃ６６から項目Ｃ６８のいずれか一項に記載の方法。

【0530】

Ｃ７０．ステップｃ）で生産されたチオール化された多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、項目Ｃ６６から項目Ｃ６９のいずれか一項に記載の方法。

【0531】

Ｃ７１．透析濾過によるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの精製をさらに含む、項目Ｃ６６から項目Ｃ７０のいずれか一項に記載の方法。

【0532】

Ｃ７２．ステップａ）における有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）およびヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）のいずれか１つ、またはその混合物から選択される極性非プロトン性溶媒である、項目Ｃ６６から項目Ｃ７１のいずれか一項に記載の方法。

【0533】

Ｃ７３．ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４－２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２－６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２－４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２およびＣａＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏを含む培地。

【0534】

Ｃ７４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するために使用される、項目Ｃ７３に記載の培地。

【0535】

Ｃ７５．培地中で組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養すること；前記培地中で前記細胞を培養することによって前記糖を生産することを含み、それによって、前記細胞が前記糖を産生する、項目Ｃ１からＣ３３のいずれか一項に記載の糖を生産するための方法。

【0536】

Ｃ７６．培地が、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４－２Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、ＣｏＣｌ_２－６Ｈ_２Ｏ、ＣｕＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏ、ＭｎＣｌ_２－４Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２およびＣａＣｌ_２－２Ｈ_２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0537】

Ｃ７７．培地が大豆加水分解物を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0538】

Ｃ７８．培地が酵母抽出物を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0539】

Ｃ７９．培地が大豆加水分解物および酵母抽出物をさらに含まない、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0540】

Ｃ８０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択される異種ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0541】

Ｃ８１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択されるサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0542】

Ｃ８２．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ８１に記載の方法。

【0543】

Ｃ８３．培養が、１２０ＯＤ６００／ｍＬを超える収率をもたらす、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0544】

Ｃ８４．糖を精製することをさらに含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0545】

Ｃ８５．精製ステップが、以下のいずれか１つ：透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、およびカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を含む、項目Ｃ７５に記載の方法。

【0546】

Ｃ８６．対象に項目Ｃ５０から項目Ｃ６２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導するための方法。

【0547】

Ｃ８７．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0548】

Ｃ８８．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＩｇＧ抗体の誘導を含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0549】

Ｃ８９．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性の誘導を含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0550】

Ｃ９０．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体の誘導を含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0551】

Ｃ９１．免疫応答が初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0552】

Ｃ９２．組成物が、式Ｏ２５（式中、ｎは４０～１００の整数である）を含む糖を含み、免疫応答が、初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0553】

Ｃ９３．哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染；肺炎、菌血症、および敗血症から選択される状態のいずれか１つのリスクがある、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0554】

Ｃ９４．哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染；肺炎、菌血症、および敗血症から選択される状態のいずれか１つを有する、項目Ｃ７３に記載の方法。

【0555】

Ｃ９５．（ｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、または（ｉｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的である、対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ５０から項目Ｃ６５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【0556】

Ｃ９６．対象が尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ９５に記載の方法。

【0557】

Ｃ９７．対象が菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ９５に記載の方法。

【0558】

Ｃ９８．対象が敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ９５に記載の方法。

【0559】

Ｃ９９．（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、組成物。

【0560】

Ｃ１００．Ｏ１Ａ抗原、Ｏ６抗原、およびＯ２抗原がそれぞれ以下の式を含む、項目Ｃ１に記載の組成物。

【0561】

Ｃ１０１．担体タンパク質が、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ_１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒されたバリアント、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質からなる群から選択される、項目Ｃ１に記載の組成物。

【0562】

Ｃ１０２．（ｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、または（ｉｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的である、対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ５１に記載の組成物を投与することを含む方法。

【0563】

Ｃ１０３．対象が尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ１０２に記載の方法。

【0564】

Ｃ１０４．対象が菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１０２に記載の方法。

【0565】

Ｃ１０５．対象が敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１０２に記載の方法。

【0566】

Ｃ１０６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも５個の反復単位の増加を含む糖。

【0567】

Ｃ１０７．糖が式Ｏ２５ａを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ａである、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0568】

Ｃ１０８．糖が式Ｏ２５ｂを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂである、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0569】

Ｃ１０９．糖が式Ｏ２を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２である、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0570】

Ｃ１１０．糖が式Ｏ６を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６である、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0571】

Ｃ１１１．糖が式Ｏ１を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１である、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0572】

Ｃ１１２．糖が式Ｏ１７を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１７である、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0573】

Ｃ１１３．式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0574】

Ｃ１１４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２５ｂ、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７からなる群から選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型である、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0575】

Ｃ１１５．糖が、前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を過剰発現させることを含む、培養物中のグラム陰性細菌によって産生されるＯ多糖の反復単位を増加させることによって生産される、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0576】

Ｃ１１６．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚ_ＳＦ、ｗｚｚ_ＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚ_ｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される、項目Ｃ１１５に記載の糖。

【0577】

Ｃ１１７．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢである、項目Ｃ１１５に記載の糖。

【0578】

Ｃ１１８．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｆｅｐＥである、項目Ｃ１１５に記載の糖。

【0579】

Ｃ１１９．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、項目Ｃ１１５に記載の糖。

【0580】

Ｃ１２０．合成的に合成される、項目Ｃ１０６に記載の糖。

【0581】

Ｃ１２１．担体タンパク質の共有結合されている、項目Ｃ１０６に記載の糖を含むコンジュゲート。

【0582】

Ｃ１２２．担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、項目Ｃ１２１に記載のコンジュゲート。

【0583】

Ｃ１２３．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１２１に記載のコンジュゲート。

【0584】

Ｃ１２４．前記糖が、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも５個の反復単位の増加を含む、項目Ｃ１２１に記載のコンジュゲート。

【0585】

Ｃ１２５．薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む、項目１に記載の糖を含む組成物。

【0586】

Ｃ１２６．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１２５に記載の組成物。

【0587】

Ｃ１２７．アルミニウムをさらに含む、項目Ｃ１２５に記載の組成物。

【0588】

Ｃ１２８．ＱＳ－２１をさらに含む、項目Ｃ１２５に記載の組成物。

【0589】

Ｃ１２９．アジュバントを含まない、項目Ｃ１２５に記載の組成物。

【0590】

Ｃ１３０．対象に、項目Ｃ１２５に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。

【0591】

Ｃ１３１．薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１２１に記載のコンジュゲートを含む組成物。

【0592】

Ｃ１３２．対象に、項目Ｃ１３１に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。

【0593】

Ｃ１３３．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１３０またはＣ１３２に記載の方法。

【0594】

Ｃ１３４．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体がＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３３に記載の方法。

【0595】

Ｃ１３５．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３３に記載の方法。

【0596】

Ｃ１３６．多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む免疫原性組成物。

【0597】

Ｃ１３７．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0598】

Ｃ１３８．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0599】

Ｃ１３９．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0600】

Ｃ１４０．糖が７５～１００％のＯアセチル化度を有する、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0601】

Ｃ１４１．担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0602】

Ｃ１４２．ＣＲＭ_１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合された２～２０個のリシン残基を含む、項目Ｃ１４１に記載の免疫原性組成物。

【0603】

Ｃ１４３．ＣＲＭ_１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合された４～１６個のリシン残基を含む、項目Ｃ１４１に記載の免疫原性組成物。

【0604】

Ｃ１４４．さらなる抗原をさらに含む、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0605】

Ｃ１４５．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0606】

Ｃ１４６．アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムに基づくアジュバントである、項目Ｃ１４５に記載の免疫原性組成物。

【0607】

Ｃ１４７．アジュバントを含まない、項目Ｃ１３６に記載の免疫原性組成物。

【0608】

Ｃ１４８．担体タンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖コンジュゲートが還元的アミノ化を使用して調製されている、免疫原性組成物。

【0609】

Ｃ１４９．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0610】

Ｃ１５０．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0611】

Ｃ１５１．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0612】

Ｃ１５２．糖が７５～１００％のＯアセチル化度を有する、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0613】

Ｃ１５３．担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0614】

Ｃ１５４．さらなる抗原をさらに含む、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0615】

Ｃ１５５．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0616】

Ｃ１５６．アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムに基づくアジュバントである、項目Ｃ１５５に記載の免疫原性組成物。

【0617】

Ｃ１５７．アジュバントを含まない、項目Ｃ１４８に記載の免疫原性組成物。

【0618】

Ｃ１５８．対象に、項目Ｃ１３６からＣ１５７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。

【0619】

Ｃ１５９．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１５８に記載の方法。

【0620】

Ｃ１６０．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体がＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３３に記載の方法。

【0621】

Ｃ１６１．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３３に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-08-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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