特開 2024-156869 がん治療の組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024156869

(43)【公開日】2024-11-06

(54)【発明の名称】がん治療の組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20241029BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241029BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 31/5383 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 31/4985 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 31/505 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 31/52 20060101ALI20241029BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241029BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241029BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241029BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20241029BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06 ZNA

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P43/00 111

A61K31/519

A61K31/5383

A61K31/4985

A61K31/505

A61K31/52

A61K39/395 N

A61P35/02

C07K16/28

C07K16/40

A61K45/06

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024127673

(22)【出願日】2024-08-02

(62)【分割の表示】P 2022108844の分割

【原出願日】2017-06-27

(31)【優先権主張番号】62/355,171

(32)【優先日】2016-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】507127440

【氏名又は名称】ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ジェイ・キップス

(72)【発明者】

【氏名】リーグワン・チェン

(72)【発明者】

【氏名】ビン・ツゥイ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】がんの治療のための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】この方法は、治療が必要な被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとを投与することを含む。さらに、ＢＴＫアンタゴニストと、ＲＯＲ－１アンタゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブであり、ＲＯＲ－１アンタゴニストがシルムツズマブである。
【選択図】図１７Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）アンタゴニストとを投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記ＢＴＫアンタゴニストが低分子である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、イブルチニブ、イデラリシブ、フォスタマチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９、ＢＧＢ－３１１１又はＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、抗体又は低分子である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、抗ＲＯＲ－１抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、
前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示される配列を含み、
前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体がシルムツズマブである、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、
前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に示される配列を含み、
前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、組み合わせた相乗的な量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、同時に投与されるか、又は順次投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、第１の時間点に投与され、前記ＢＴＫアンタゴニストが、第２の時間点に投与され、前記第１の時間点が、前記第２の時間点より前である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、投与の前に混合される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、約４２０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、毎日、少なくとも１４日間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、毎日、約２８日間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２８日間にわたって１回投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記ＢＴＫアンタゴニストが静脈内投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが静脈内投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記がんが、リンパ腫、白血病、骨髄腫、ＡＭＬ、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、腎細胞癌腫、結腸がん、結腸直腸がん、乳がん、扁平上皮細胞がん、メラノーマ、胃がん、脳がん、肺がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、頭頸部がん、子宮がん、腺がん又は副腎癌である、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記がんが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫又はＢ細胞白血病である、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

ＢＴＫアンタゴニストと、ＲＯＲ－１アンタゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項31】

医薬組成物であって、ＢＴＫアンタゴニストと、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記ＢＴＫアンタゴニストと前記抗ＲＯＲ－１抗体が、組み合わせた相乗的な量で存在し、前記組み合わせた相乗的な量が、治療を必要とする被験体においてがんを治療するのに有効である、医薬組成物。

【請求項32】

前記ＢＴＫアンタゴニストが低分子である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記ＢＴＫアンタゴニストが、イブルチニブ、イデラリシブ、フォスタマチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９、ＢＧＢ－３１１１又はＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブである、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが抗体又は低分子である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項36】

前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが抗ＲＯＲ－１抗体である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、
前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示される配列を含み、
前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記抗体がシルムツズマブである、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項39】

前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、
前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に示される配列を含み、
前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含む、請求項３５に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、この全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月２７日に出願された米国仮出願第６２／３５５，１７１号に対する優先権を主張する。

【0002】

ＡＳＣＩＩファイルとして提出された「配列表」、表又はコンピュータプログラムのリスト添付書類の参照
２０１７年６月１９日に作成されたファイル４８５３７－５８２００１ＷＯ ＳＬ＿ＳＴ２５．ＴＸＴに記載された配列表（１０，９１９バイト、機械フォーマットＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステム）は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された付与番号ＣＡ０８１５３４に基づく政府の援助を用いてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）シグナル伝達によるシグナル伝達は、疾患、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の発病及び／又は進行において、役割を果たすと考えられる。さらに、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を阻害する、イブルチニブ及びアカラブルチニブ（４－｛８－アミノ－３－［（２Ｓ）－１－（２－ブチノイル）－２－ピロリジニル］イミダゾ［１，５－ａ］ピラジン－１－イル｝－Ｎ－（２－ピリジニル）ベンズアミド）を含むリンパ系悪性腫瘍及び白血病悪性腫瘍におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達を標的とする薬剤は、顕著な臨床的活性を示す。Ｂ細胞シグナル伝達経路を妨害することによって、ＢＴＫ治療は、劇的なリンパ節応答を伴うが、疾患の根絶及び高リスク疾患の再発は、課題のままである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本明細書には、当技術分野におけるこれらの問題及び他の問題に対する解決策が提供される。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書で提供される組成物及び方法は、特に、白血病の治療に有用である。例えば、驚くべきことに、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を治療するために抗ＲＯＲ－１抗体とＢＣＲ阻害剤との組み合わせを使用するための、効果的な方法が、提供される。

【0007】

ある態様では、治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）アンタゴニストとを投与することを含む、方法が提供される。

【0008】

ある態様では、ＢＴＫアンタゴニストと、ＲＯＲ－１アンタゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。

【0009】

ある態様では、医薬組成物であって、ＢＴＫアンタゴニストと、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とが、組み合わせた相乗的な量で存在し、組み合わせた相乗的な量が、治療を必要とする被験体においてがんを治療するのに有効である、医薬組成物が提供される。

【0010】

ある態様では、治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法が提供される。この方法は、被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とを投与することを含む。

【0011】

別の態様では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストと、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】図１Ａ～１Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずにインキュベートし、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝５）からＣＬＬ細胞を集めた。各レーンの上部に示されるとおりＷｎｔ５ａ又はＵＣ－９６１を用いて又は用いずに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されたこれらのＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｄ）イブルチニブで治療した患者から集められ、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＵＣ－９６１で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図1B】図１Ａ～１Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝５）からＣＬＬ細胞を集めた。各レーンの上部に示されるとおりＷｎｔ５ａ又はＵＣ－９６１を用いて又は用いずに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されたこれらのＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｄ）イブルチニブで治療した患者から集められ、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＵＣ－９６１で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図1C】図１Ａ～１Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝５）からＣＬＬ細胞を集めた。各レーンの上部に示されるとおりＷｎｔ５ａ又はＵＣ－９６１を用いて又は用いずに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されたこれらのＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｄ）イブルチニブで治療した患者から集められ、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＵＣ－９６１で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図1D】図１Ａ～１Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝５）からＣＬＬ細胞を集めた。各レーンの上部に示されるとおりＷｎｔ５ａ又はＵＣ－９６１を用いて又は用いずに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されたこれらのＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１Ｄ）イブルチニブで治療した患者から集められ、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＵＣ－９６１で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図2A】図２Ａ～２Ｂ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図２Ａ）Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いない、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。細胞分裂率と共に、１つの代表的なＣＬＬサンプルを示している。（図２Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有する、ＣＬＬ細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図2B】図２Ａ～２Ｂ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図２Ａ）Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いない、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。細胞分裂率と共に、１つの代表的なＣＬＬサンプルを示している。（図２Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有する、ＣＬＬ細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図3】図３。ＣＬＬ患者に由来する異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１とイブルチニブとの相加阻害効果。記載の処理の１日前に、ＣＬＬ細胞をＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの腹膜腔に注射した。細胞注射から７日後に腹膜洗浄液を集め、ＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ４５に特異的なｍＡｂを用いた染色後の細胞数計測及びフローサイトメトリー分析によって残留ＣＬＬを決定した。グラフの各バーは、処理を行わなかったマウスから集めた細胞に対して正規化された、処理後のマウスから集めた残留ＣＬＬ細胞のパーセントを表す。示したデータは、異なる３患者に由来する、各群において５匹のマウスを用いた、平均±ＳＥＭである。Ｐ値は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算された。

【図4A】図４Ａ～４Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図４Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずにインキュベートし、そしてＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図４Ｂ）未処理ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞においてＷｎｔ５ａによって誘発された、Ｒａｃ１の活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図４Ｃ）Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずに、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞サンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図４Ｄ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図4B】図４Ａ～４Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図４Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、そしてＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図４Ｂ）未処理ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞においてＷｎｔ５ａによって誘発された、Ｒａｃ１の活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図４Ｃ）Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずに、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞サンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図４Ｄ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図4C】図４Ａ～４Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図４Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、そしてＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図４Ｂ）未処理ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞においてＷｎｔ５ａによって誘発された、Ｒａｃ１の活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図４Ｃ）Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずに、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞サンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図４Ｄ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図4D】図４Ａ～４Ｄ。ＵＣ－９６１は、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図４Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａを用いて、又は用いずにインキュベートし、そしてＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図４Ｂ）未処理ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞においてＷｎｔ５ａによって誘発された、Ｒａｃ１の活性化が測定された。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図４Ｃ）Ｗｎｔ５ａを用いて又は用いずに、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理された、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞サンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図４Ｄ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図5A】図５Ａ～５Ｃ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１及びイブルチニブの相加阻害効果。（図５Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓が示されている。（図５Ｂ）ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを毎日投与した。Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素を用いて細胞を染色した後に光散乱特徴によって決定した、上部に示した処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めた脾臓リンパ球の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図５Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１の注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの脾臓における、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の、フローサイトメトリー分析及び細胞数計測によって決定した合計数。それぞれの形状は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図5B】図５Ａ～５Ｃ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１及びイブルチニブの相加阻害効果。（図５Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓が示されている。（図５Ｂ）ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを毎日投与した。Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素を用いて細胞を染色した後に光散乱特徴によって決定した、上部に示した処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めた脾臓リンパ球の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図５Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１の注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの脾臓における、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の、フローサイトメトリー分析及び細胞数計測によって決定した合計数。それぞれの形状は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図5C】図５Ａ～５Ｃ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１及びイブルチニブの相加阻害効果。（図５Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓が示されている。（図５Ｂ）ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを毎日投与した。Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素を用いて細胞を染色した後に光散乱特徴によって決定した、上部に示した処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めた脾臓リンパ球の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図５Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１の注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの脾臓における、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の、フローサイトメトリー分析及び細胞数計測によって決定した合計数。それぞれの形状は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図6A】図６Ａ～６Ｄ．イブルチニブは、ＢＣＲシグナル伝達を阻害するが、Ｗｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達を阻害しない。（図６Ａ）各レーンの上部に示されるように、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度のＷｎｔ５ａ又はイブルチニブと共に、又はこれらなしでインキュベートしたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図６Ｂ）ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を上げつつ１時間処理し、次いで、ＢＴＫ活性部位の占有率についてアッセイした。（図６Ｃ）異なる用量のイブルチニブを用い又は用いずに処理した後のＣＬＬ細胞における、抗μによって誘発されるカルシウム動員。細胞内カルシウムにおける相対的な平均蛍光強度を時間の関数としてプロットする。「ＩｇＭ」と記載した矢印は、抗μが細胞に添加された時間を示す。（図６Ｄ）ＤｉＯＣ６及びＰＩで染色することによる細胞生存率の決定。それぞれ水平軸及び垂直軸に関し、白血病細胞の強度における緑色（ＤｉＯＣ６）及び赤色（ＰＩ）の相対的な蛍光強度を規定する、代表的な患者に由来するＣＬＬ細胞のドットマップが示されている。生細胞数（ＤｉＯＣ６^＋ＰＩ^－）は、異なる用量のイブルチニブを用いて処理した後のＣＬＬ細胞について決定した。各ドットマップに生細胞のパーセントを示している。

【図6B】図６Ａ～６Ｄ．イブルチニブは、ＢＣＲシグナル伝達を阻害するが、Ｗｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達を阻害しない。（図６Ａ）各レーンの上部に示されるように、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度のＷｎｔ５ａ又はイブルチニブと共に、又はこれらなしでインキュベートしたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図６Ｂ）ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を上げつつ１時間処理し、次いで、ＢＴＫ活性部位の占有率についてアッセイした。（図６Ｃ）異なる用量のイブルチニブを用い又は用いずに処理した後のＣＬＬ細胞における、抗μによって誘発されるカルシウム動員。細胞内カルシウムにおける相対的な平均蛍光強度を時間の関数としてプロットする。「ＩｇＭ」と記載した矢印は、抗μが細胞に添加された時間を示す。（図６Ｄ）ＤｉＯＣ６及びＰＩで染色することによる細胞生存率の決定。それぞれ水平軸及び垂直軸に関し、白血病細胞の強度における緑色（ＤｉＯＣ６）及び赤色（ＰＩ）の相対的な蛍光強度を規定する、代表的な患者に由来するＣＬＬ細胞のドットマップが示されている。生細胞数（ＤｉＯＣ６^＋ＰＩ^－）は、異なる用量のイブルチニブを用いて処理した後のＣＬＬ細胞について決定した。各ドットマップに生細胞のパーセントを示している。

【図6C】図６Ａ～６Ｄ．イブルチニブは、ＢＣＲシグナル伝達を阻害するが、Ｗｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達を阻害しない。（図６Ａ）各レーンの上部に示されるように、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度のＷｎｔ５ａ又はイブルチニブと共に、又はこれらなしでインキュベートしたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図６Ｂ）ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を上げつつ１時間処理し、次いで、ＢＴＫ活性部位の占有率についてアッセイした。（図６Ｃ）異なる用量のイブルチニブを用い又は用いずに処理した後のＣＬＬ細胞における、抗μによって誘発されるカルシウム動員。細胞内カルシウムにおける相対的な平均蛍光強度を時間の関数としてプロットする。「ＩｇＭ」と記載した矢印は、抗μが細胞に添加された時間を示す。（図６Ｄ）ＤｉＯＣ６及びＰＩで染色することによる細胞生存率の決定。それぞれ水平軸及び垂直軸に関し、白血病細胞の強度における緑色（ＤｉＯＣ６）及び赤色（ＰＩ）の相対的な蛍光強度を規定する、代表的な患者に由来するＣＬＬ細胞のドットマップが示されている。生細胞数（ＤｉＯＣ６^＋ＰＩ^－）は、異なる用量のイブルチニブを用いて処理した後のＣＬＬ細胞について決定した。各ドットマップに生細胞のパーセントを示している。

【図6D】図６Ａ～６Ｄ．イブルチニブは、ＢＣＲシグナル伝達を阻害するが、Ｗｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達を阻害しない。（図６Ａ）各レーンの上部に示されるように、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度のＷｎｔ５ａ又はイブルチニブと共に、又はこれらなしでインキュベートしたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図６Ｂ）ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を上げつつ１時間処理し、次いで、ＢＴＫ活性部位の占有率についてアッセイした。（図６Ｃ）異なる用量のイブルチニブを用い又は用いずに処理した後のＣＬＬ細胞における、抗μによって誘発されるカルシウム動員。細胞内カルシウムにおける相対的な平均蛍光強度を時間の関数としてプロットする。「ＩｇＭ」と記載した矢印は、抗μが細胞に添加された時間を示す。（図６Ｄ）ＤｉＯＣ６及びＰＩで染色することによる細胞生存率の決定。それぞれ水平軸及び垂直軸に関し、白血病細胞の強度における緑色（ＤｉＯＣ６）及び赤色（ＰＩ）の相対的な蛍光強度を規定する、代表的な患者に由来するＣＬＬ細胞のドットマップが示されている。生細胞数（ＤｉＯＣ６^＋ＰＩ^－）は、異なる用量のイブルチニブを用いて処理した後のＣＬＬ細胞について決定した。各ドットマップに生細胞のパーセントを示している。

【図7A】図７Ａ～７Ｅ。Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発する。（図７Ａ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｂ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｃ）Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した、血清を枯渇させたＴＣＬ１白血病細胞においてＲａｃ１活性化を測定した。全細胞溶解物をパラレルゲル上で泳動し、全Ｒａｃ１を調べた。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに関して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図７Ｄ）Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。１つの代表的なＴＣＬ１白血病サンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｅ）底部に示す条件下でのＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）からのＣＬＬ細胞の平均分裂割合。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。

【図7B】図７Ａ～７Ｅ。Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発する。（図７Ａ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｂ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｃ）Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した、血清を枯渇させたＴＣＬ１白血病細胞においてＲａｃ１活性化を測定した。全細胞溶解物をパラレルゲル上で泳動し、全Ｒａｃ１を調べた。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに関して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図７Ｄ）Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。１つの代表的なＴＣＬ１白血病サンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｅ）底部に示す条件下でのＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）からのＣＬＬ細胞の平均分裂割合。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。

【図7C】図７Ａ～７Ｅ。Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発する。（図７Ａ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｂ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｃ）Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した、血清を枯渇させたＴＣＬ１白血病細胞においてＲａｃ１活性化を測定した。全細胞溶解物をパラレルゲル上で泳動し、全Ｒａｃ１を調べた。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに関して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図７Ｄ）Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。１つの代表的なＴＣＬ１白血病サンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｅ）底部に示す条件下でのＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）からのＣＬＬ細胞の平均分裂割合。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。

【図7D】図７Ａ～７Ｅ。Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発する。（図７Ａ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｂ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｃ）Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した、血清を枯渇させたＴＣＬ１白血病細胞においてＲａｃ１活性化を測定した。全細胞溶解物をパラレルゲル上で泳動し、全Ｒａｃ１を調べた。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに関して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図７Ｄ）Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。１つの代表的なＴＣＬ１白血病サンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｅ）底部に示す条件下でのＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）からのＣＬＬ細胞の平均分裂割合。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。

【図7E】図７Ａ～７Ｅ。Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発する。（図７Ａ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｂ）ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（左パネル）又はこれと共に（右パネル）、ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｃ）Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した、血清を枯渇させたＴＣＬ１白血病細胞においてＲａｃ１活性化を測定した。全細胞溶解物をパラレルゲル上で泳動し、全Ｒａｃ１を調べた。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに関して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。（図７Ｄ）Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下、外因性Ｗｎｔ５ａなしで又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。１つの代表的なＴＣＬ１白血病サンプルに対するアッセイの結果を、各パネルの左下に示されている細胞の分裂率と共に示している。（図７Ｅ）底部に示す条件下でのＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）からのＣＬＬ細胞の平均分裂割合。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。ｎｓ：有意ではない。

【図8A】図８Ａ～８Ｂ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１又はイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図８Ａ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図８Ｂ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１の用量依存性阻害効果。それぞれの形状は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図8B】図８Ａ～８Ｂ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１又はイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図８Ａ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図８Ｂ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病異種移植マウスにおけるＵＣ－９６１の用量依存性阻害効果。それぞれの形状は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図9】図９。ＲＯＲ－１は、ＢＣＲシグナル伝達阻害剤によって誘発された。

【図10】図１０。ニッチ依存性動物モデルにおけるＣＬＬ細胞除去に対する、イブルチニブと合わせた抗ＲＯＲ－１抗体の相加効果。

【図11】図１１。ＲＯＲ－１ｘＴＣＬ１マウス白血病に対する、イブルチニブと合わせた抗ＲＯＲ－１抗体の相加効果。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図12B】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図12C】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図12D】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図12E】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図12F】図１２Ａ～１２Ｆ。シルムツズマブは、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。（図１２Ａ）各レーンの上部に示されるとおり、新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）なしで又はこれと共に無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。（図１２Ｂ）新しく単離したイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞、又は外因性Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしで無血清培地で培養した、単離イブルチニブ処理ＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。４つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝４）。（図１２Ｃ）イブルチニブ治療された患者（ｎ＝４）からＣＬＬ細胞を集めた。免疫ブロットの各レーンの上に示されるとおり、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）と共に又はこれらなしで処理されたＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した（図１２Ｄ）。イブルチニブを用いた治療を受けている患者から集め、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を測定した。５つの独立した実験で観察された平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１２Ｅ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理したＣＬＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。（図１２Ｆ）未処理ＣＬＬ細胞又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブ処理ＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察された、平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｄ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１３Ａ）Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＣＬＬサンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図１３Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均割合を示す。（図１３Ｃ）ＣＬＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}上で共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図１３Ｄ）試験した４患者全てについてのＳ／Ｇ２／Ｍ期における細胞の平均分率が示されている。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｄ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１３Ａ）Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＣＬＬサンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図１３Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均割合を示す。（図１３Ｃ）ＣＬＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}上で共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図１３Ｄ）試験した４患者全てについてのＳ／Ｇ２／Ｍ期における細胞の平均分率が示されている。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図13C】図１３Ａ～１３Ｄ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１３Ａ）Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＣＬＬサンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図１３Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均割合を示す。（図１３Ｃ）ＣＬＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}上で共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図１３Ｄ）試験した４患者全てについてのＳ／Ｇ２／Ｍ期における細胞の平均分率が示されている。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図13D】図１３Ａ～１３Ｄ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１３Ａ）Ｗｎｔ５ａと共に又はこれなしで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理された、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。１つの代表的なＣＬＬサンプルを、細胞分裂率と共に示している。（図１３Ｂ）バーは、底部に示す各培養条件について異なる６患者それぞれからの減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均割合を示す。（図１３Ｃ）ＣＬＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}上で共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図１３Ｄ）試験した４患者全てについてのＳ／Ｇ２／Ｍ期における細胞の平均分率が示されている。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図14A】図１４Ａ～１４Ｂ。ＣＬＬ患者に由来する異種移植片におけるシルムツズマブ及び／又はイブルチニブを用いた処理の効果。（図１４Ａ）処理の１日前に、ＣＬＬ細胞をＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの腹膜腔に注射した。細胞注射から７日後に腹膜洗浄液を集め、ＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ４５に特異的なｍＡｂを用いた染色後の細胞数計測及びフローサイトメトリー分析によって、残留ＣＬＬを決定した。各等高線図の右上に示されているパーセントは、処理後にマウスから集められた細胞の中のＣＬＬ細胞の割合を示す。（図１４Ｂ）グラフの各バーは、未処理マウスから集めた細胞の中のＣＬＬ細胞のパーセントに対して正規化された、処理後マウスから集めた細胞中のＣＬＬ細胞のパーセントを表す（１００％まで）。各群の５匹のマウスを用いた３の異なる患者から、示されるデータは、平均±ＳＥＭである。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図14B】図１４Ａ～１４Ｂ。ＣＬＬ患者に由来する異種移植におけるシルムツズマブ及び／又はイブルチニブを用いた処理の効果。（図１４Ａ）処理の１日前に、ＣＬＬ細胞をＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの腹膜腔に注射した。細胞注射から７日後に腹膜洗浄液を集め、ＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ４５に特異的なｍＡｂを用いた染色後の細胞数計測及びフローサイトメトリー分析によって残留ＣＬＬを決定した。各等高線図の右上に示されているパーセントは、処理後にマウスから集められた細胞の中のＣＬＬ細胞の割合を示す。（図１４Ｂ）グラフの各バーは、未処理マウスから集めた細胞の中のＣＬＬ細胞のパーセントに対して正規化された、処理後マウスから集めた細胞中のＣＬＬ細胞のパーセントを表す（１００％まで）。各群の５匹のマウスを用いた３の異なる患者から、示されるデータは、平均±ＳＥＭである。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図15A】図１５Ａ～１５Ｃ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１５Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンド密度の比率である。（図１５Ｂ）シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）と共に、又はこれらなしで、Ｗｎｔ５ａで処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞における、Ｒａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１５Ｃ）Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）によって処理したか又は未処理の、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝５）における、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図15B】図１５Ａ～１５Ｃ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１５Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンド密度の比率である。（図１５Ｂ）シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）と共に、又はこれらなしで、Ｗｎｔ５ａで処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞における、Ｒａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１５Ｃ）Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）によって処理したか又は未処理の、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝５）における、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図15C】図１５Ａ～１５Ｃ。シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、Ｗｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。（図１５Ａ）各レーンの上部に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に又はこれなしでインキュベートし、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）で処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞において、活性型Ｒａｃ１が測定された。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性型ＧＴＰａｓｅのバンド密度の比率である。（図１５Ｂ）シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）及び／又はイブルチニブ（０．５μＭ）と共に、又はこれらなしで、Ｗｎｔ５ａで処理したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞における、Ｒａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝５）。（図１５Ｃ）Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）及び／又はシルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）によって処理したか又は未処理の、ＣＦＳＥ標識ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝５）における、ＣＤ１５４によって誘発される増殖。バーは、底部に示す各培養条件について異なる５匹のマウスそれぞれからの、減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の平均割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図16A】図１６Ａ～１６Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫欠損マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた処理の相加阻害効果。（図１６Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓を示す。（図１６Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１６Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの、脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図16B】図１６Ａ～１６Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫欠損マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた処理の相加阻害効果。（図１６Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓を示す。（図１６Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１６Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図16C】図１６Ａ～１６Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫欠損マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた処理の相加阻害効果。（図１６Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を受けてから２５日後に集めた、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの代表的な脾臓を示す。（図１６Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、１日目に１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを１回静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝５）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の蛍光を示す、等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１６Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を１回受けたか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブの注射を毎日受けた、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２５日目のレシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝５）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図17A】図１７Ａ～１７Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫応答性マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた治療の相加阻害効果。（図１７Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を与えてから２５日後に集めた、ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの代表的な脾臓が示されている。（図１７Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、ＲＯＲ－１－ＴｇマウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、週に１回、１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝６）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１７Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を週に１回受けたか、及び／又はイブルチニブの注射を毎日受けた（５ｍｇ／ｋｇで）、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２８日目のレシピエントＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図17B】図１７Ａ～１７Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫応答性マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた治療の相加阻害効果。（図１７Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を与えてから２５日後に集めた、ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの代表的な脾臓が示されている。（図１７Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、ＲＯＲ－１－ＴｇマウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、週に１回、１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝６）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１７Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を週に１回受けたか、及び／又はイブルチニブの注射を毎日受けた（５ｍｇ／ｋｇで）、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２８日目のレシピエントＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図17C】図１７Ａ～１７Ｃ。組織適合ＲＯＲ－１^＋白血病を移植した免疫応答性マウスにおける、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた治療の相加阻害効果。（図１７Ａ）２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の静脈内注入を与えてから２５日後に集めた、ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの代表的な脾臓が示されている。（図１７Ｂ）シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせは、ＲＯＲ－１－ＴｇマウスにおけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する。ＲＯＲ－１－Ｔｇマウスに２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、週に１回、１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを静脈注射するか、又は５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを経口摂取によって毎日投与した。上部に示したとおりの処理を受けた代表的なマウス（ｎ＝６）から養子細胞移植２５日後に集めたリンパ球の、Ｂ２２０（横座表）及びヒトＲＯＲ－１（縦座標）に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂを用いて細胞を染色した後の等高線図。各等高線図の右上にあるパーセントは、白血病細胞のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋表現型を有する血液単核細胞の割合を示す。（図１７Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブの注射を週に１回受けたか、及び／又はイブルチニブの注射を毎日受けた（５ｍｇ／ｋｇで）、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を養子細胞移植してから２８日目のレシピエントＲＯＲ－１－Ｔｇマウスの脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の合計数。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図18A】図１８Ａ～１８Ｂ。ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。（図１８Ａ）ＣＬＬ細胞を分類するためのゲーティング戦略。まず、細胞を大きさ及び単一性についてゲーティングし、その後、ＰＩ排除によって、さらなる分析のために生きた細胞を特定した。ＣＦＳＥを用いて染色した後に、生きたＣＤ５及びＣＤ１９ ＣＬＬ細胞について蛍光を調べた。低いＣＦＳＥ蛍光を有する細胞のパーセントを計算することによって、ＣＬＬ細胞の分裂率を計算した。（図１８Ｂ）ＩＬ－４／１０存在下で、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（上パネル）、又はこれと共に（下パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対する結果を、各ヒストグラムの左隅下に示されている細胞の分裂率と共に示している。

【図18B】図１８Ａ～１８Ｂ。ＣＤ１５４を用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されたＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。（図１８Ａ）ＣＬＬ細胞を分類するためのゲーティング戦略。まず、細胞を大きさ及び単一性についてゲーティングし、その後、ＰＩ排除によって、さらなる分析のために生きた細胞を特定した。ＣＦＳＥを用いて染色した後に、生きたＣＤ５及びＣＤ１９ ＣＬＬ細胞について蛍光を調べた。低いＣＦＳＥ蛍光を有する細胞のパーセントを計算することによって、ＣＬＬ細胞の分裂率を計算した。（図１８Ｂ）ＩＬ－４／１０存在下で、外因性Ｗｎｔ５ａなしで（上パネル）、又はこれを用いて（下パネル）、野生型ＨｅＬａ細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的なＣＬＬサンプルに対する結果を、各ヒストグラムの左隅下に示されている細胞の分裂率と共に示している。

【図19A】図１９Ａ～１９Ｂ。外因性Ｗｎｔ５ａを用い、又は用いずに、シルムツズマブ又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞の細胞周期の分析。（図１９Ａ）白血病細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的な白血病サンプルが示されている。（図１９Ｂ）３種類全てのサンプルについて、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期における白血病細胞の平均割合を示している。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図19B】図１９Ａ～１９Ｂ。外因性Ｗｎｔ５ａを用い、又は用いずに、シルムツズマブ又はイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞の細胞周期の分析。（図１９Ａ）白血病細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的な白血病サンプルが示されている。（図１９Ｂ）３種類全てのサンプルについて、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期における白血病細胞の平均割合を示している。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図20A】図２０Ａ－２０Ｂ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるシルムツズマブ又はイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図２０Ａ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図２０Ｂ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるシルムツズマブの用量依存性阻害効果。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図20B】図２０Ａ－２０Ｂ。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるシルムツズマブ又はイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図２０Ａ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるイブルチニブの用量依存性阻害効果。（図２０Ｂ）ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病移植マウスにおけるシルムツズマブの用量依存性阻害効果。それぞれの記号は、個々のマウスにおいて見出される白血病細胞の数を表す。各動物群（ｎ＝６）について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図21】図２１。Ｗｎｔ５ａ及び／又はＣＤ１５４によって誘発されるＴＣＬ１白血病細胞増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。ＩＬ－４／１０存在下で、外因性Ｗｎｔ５ａなしで、又はこれと共に、野生型ＨｅＬａ細胞又はＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と５日間共培養した、ＣＦＳＥ標識ＴＣＬ１白血病細胞（ｎ＝３）の蛍光。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値を計算した。

【図22A】図２２Ａ～２２Ｃ。原発性ＭＣＬにおける抗原発現、及びＭＣＬ患者血漿におけるＷｎｔ５ａレベル。（図２２Ａ）ＣＤ５及びＣＤ１９を発現するＭＣＬ細胞に対するゲーティング（左上）。網掛けされたヒストグラムは、他の表面抗原に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂで染色された、ゲーティングされたＭＣＬ細胞の蛍光を示す。ＣＬＬ細胞とは対照的に、ＭＣＬ細胞は、ＣＤ２００（右上）又はＣＤ２３（左下）に特異的なｍＡｂで染色することができなかった。ＣＬＬと同様に、ＭＣＬは、高レベルのＲＯＲ－１を発現する（右下）。白色のヒストグラムは、同位体コントロール抗体で染色された細胞の蛍光を示す。（図２２Ｂ）ＭＣＬ対ＣＬＬにおけるＲＯＲ－１のΔＭＦＩ。ｎｓ＝有意ではない。（図２２Ｃ）年齢を合わせたコントロール被験体に対する、ＭＣＬ患者における血漿Ｗｎｔ５ａ（１群あたりｎ＝４；Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。

【図22B】図２２Ａ～２２Ｃ。原発性ＭＣＬにおける抗原発現及び、ＭＣＬ患者血漿におけるＷｎｔ５ａレベル。（図２２Ａ）ＣＤ５及びＣＤ１９を発現するＭＣＬ細胞に対するゲーティング（左上）。網掛けされたヒストグラムは、他の表面抗原に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂで染色された、ゲーティングされたＭＣＬ細胞の蛍光を示す。ＣＬＬ細胞とは対照的に、ＭＣＬ細胞は、ＣＤ２００（右上）又はＣＤ２３（左下）に特異的なｍＡｂで染色することができなかった。ＣＬＬと同様に、ＭＣＬは、高レベルのＲＯＲ－１を発現する（右下）。白色のヒストグラムは、同位体コントロール抗体で染色された細胞の蛍光を示す。（図２２Ｂ）ＭＣＬ対ＣＬＬにおけるＲＯＲ－１のΔＭＦＩ。ｎｓ＝有意ではない。（図２２Ｃ）年齢を合わせたコントロール被験体に対する、ＭＣＬ患者における血漿Ｗｎｔ５ａ（１群あたりｎ＝４；Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。

【図22C】図２２Ａ～２２Ｃ。原発性ＭＣＬにおける抗原発現と、ＭＣＬ患者血漿におけるＷｎｔ５ａレベル。（図２２Ａ）ＣＤ５及びＣＤ１９を発現するＭＣＬ細胞に対するゲーティング（左上）。網掛けされたヒストグラムは、他の表面抗原に特異的な蛍光色素コンジュゲートｍＡｂで染色された、ゲーティングされたＭＣＬ細胞の蛍光を示す。ＣＬＬ細胞とは対照的に、ＭＣＬ細胞は、ＣＤ２００（右上）又はＣＤ２３（左下）に特異的なｍＡｂで染色することができなかった。ＣＬＬと同様に、ＭＣＬは、高レベルのＲＯＲ－１を発現する（右下）。白色のヒストグラムは、同位体コントロール抗体で染色された細胞の蛍光を示す。（図２２Ｂ）ＭＣＬ対ＣＬＬにおけるＲＯＲ－１のΔＭＦＩ。ｎｓ＝有意ではない。（図２２Ｃ）年齢を合わせたコントロール被験体に対する、ＭＣＬ患者における血漿Ｗｎｔ５ａ（１群あたりｎ＝４；Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。

【図23A】図２３Ａ～２３Ｄ。ＭＣＬ細胞におけるＲａｃ１活性化及び細胞周期の分析。（図２３Ａ）イムノブロットの各レーンの上に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに、イブルチニブ（０．５μＭ）を用いて、又は用いずに、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに処理したＭＣＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。（図２３Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞、又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブで処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝３）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図２３Ｃ）ＭＣＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図２３Ｄ）試験したＭＣＬ患者全てについてのＳ／Ｇ２期における細胞の平均分率が示されている（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ＝有意ではない。

【図23B】図２３Ａ～２３Ｄ。ＭＣＬ細胞におけるＲａｃ１活性化及び細胞周期の分析。（図２３Ａ）イムノブロットの各レーンの上に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに、イブルチニブ（０．５μＭ）を用いて、又は用いずに、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに処理したＭＣＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。（図２３Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞、又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブで処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝３）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図２３Ｃ）ＭＣＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図２３Ｄ）試験したＭＣＬ患者全てについてのＳ／Ｇ２期における細胞の平均分率が示されている（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ＝有意ではない。

【図23C】図２３Ａ～２３Ｄ。ＭＣＬ細胞におけるＲａｃ１活性化及び細胞周期の分析。（図２３Ａ）イムノブロットの各レーンの上に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに、イブルチニブ（０．５μＭ）を用いて、又は用いずに、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに処理したＭＣＬ細胞において、活性型Ｒａｃ１を測定した。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。（図２３Ｂ）未処理ＣＬＬ細胞、又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブで処理したＣＬＬ細胞における、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１の活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝３）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図２３Ｃ）ＭＣＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図２３Ｄ）試験したＭＣＬ患者全てについてのＳ／Ｇ２期における細胞の平均分率が示されている（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ＝有意ではない。

【図23D】図２３Ａ～２３Ｄ。ＭＣＬ細胞におけるＲａｃ１活性化及び細胞周期の分析。（図２３Ａ）活性化されたＲａｃ１を、イムノブロットの各レーンの上に示されるように、Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに、イブルチニブ（０．５μＭ）を用いて、又は用いずに、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに治療されたＭＣＬ細胞で測定した。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。（図２３Ｂ）治療を行っていないか、又はシルムツズマブ及び／又はイブルチニブで治療したＣＬＬ細胞における、Ｒａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発される活性化。５つの独立した実験で観察される平均Ｒａｃ１活性化が示される（ｎ＝３）。それぞれのレーンの下の数字は、未処理サンプルに対して正規化された、全ＧＴＰａｓｅに対する活性化されたもののバンドＩＯＤの比率である。各群について、データは平均±ＳＥＭとして示される。テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図２３Ｃ）ＭＣＬ細胞を、ＩＬ－４／１０又はＷｎｔ５ａ存在下で、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共培養し、次いで、シルムツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）又はイブルチニブ（０．５μＭ）で４日間処理し、ＰＩ染色後に細胞周期の分析を行った。１つの代表的なＣＬＬサンプルが示されている。（図２３Ｄ）試験したＭＣＬ患者全てについてのＳ／Ｇ２期における細胞の平均分率が示されている（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭとして示され、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算される場合、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ＝有意ではない。

【発明を実施するための形態】

【0013】

定義
本発明の様々な実施形態及び態様が本明細書に示され、説明されているが、このような実施形態及び態様が単なる例示として提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には数多くの変形、変更及び置換が可能である。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において採用されてもよいことが理解されるべきである。

【0014】

本明細書で使用される章の見出しは、編成目的のみのためのものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての文書又は文書の一部は、限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び論文を含め、あらゆる目的のためにこの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0015】

本明細書で使用される略語は、化学分野及び生物学分野の中での従来の意味を有する。本明細書に記載の化学構造及び式は、化学分野で知られている化学原子価の標準規則に従って構築される。

【0016】

置換基が、左から右に書かれた従来の化学式によって特定される場合、構造を右から左へ書くことから生じる化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば－ＣＨ_２Ｏ－は、－ＯＣＨ_２－と等価である。

【0017】

「アルキル」という用語は、それ自体又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖（すなわち、非分枝鎖）又は分枝鎖の非環状炭素鎖（又は炭素）、又はこれらの組み合わせを意味し、完全に飽和していてもよく、一飽和又は多飽和であってもよく、指定の炭素原子数を含む二価及び多価の基（すなわち、Ｃ_１－Ｃ_１０は、１～１０個の炭素を意味する）を含んでいてもよい。飽和炭化水素基の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、（シクロヘキシル）メチル、これらの同族体及び異性体、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合を有するもの又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されないが、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－及び３－プロピニル、３－ブチニル、及びもっと高級の同族体及び異性体が挙げられる。アルコキシは、酸素リンカー（－Ｏ－）を介して分子の残りの部分に結合したアルキルである。アルキル部分は、アルケニル部分であってもよい。アルキル部分は、アルキニル部分であってもよい。アルキル部分は、完全に飽和していてもよい。アルケニルは、１つ以上の二重結合に加えて、１つ以上の二重結合及び／又は１つ以上の三重結合を含んでいてもよい。アルキニルは、１つ以上の三重結合に加えて、１つ以上の多い三重結合及び／又は１つ以上の二重結合を含んでいてもよい。

【0018】

「アルキレン」という用語は、それ自体又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、限定されないが、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－によって例示されるように、アルキルから誘導される二価の基を意味する。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は１～２４個の炭素原子を含み、１０個以下の炭素原子を含む基が本発明において好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキル基又はアルキレン基である。「アルケニレン」という用語は、それ自体又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、アルケンから誘導される二価の基を意味する。

【0019】

「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体又は別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも１個の炭素原子と、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ及びＳ）とを含み、窒素原子及び硫黄原子が、任意選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が、任意選択的に四級化されていてもよい、安定な直鎖又は分枝鎖の非環状の基、又はこれらの組み合わせを意味する。ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ及びＳ）は、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、又はアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に、配置されてもよい。例としては、限定されないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ－_２－ＣＨ_３及び－ＣＮが挙げられる。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３のように、２個又は３個までのヘテロ原子が連続していてもよい。ヘテロアルキル部分は、１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロアルキル部分は、２個の任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロアルキル部分は、３個の任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロアルキル部分は、４個の任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロアルキル部分は、５個の任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロアルキル部分は、８個の任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。「ヘテロアルケニル」という用語は、それ自体又は別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも１つの二重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルケニルは、任意選択的に、１つ以上の二重結合に加えて、１つより多い二重結合及び／又は１つ以上の三重結合を含んでいてもよい。「ヘテロアルキニル」という用語は、それ自体又は別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも１つの三重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルキニルは、任意選択的に、１つ以上の三重結合に加えて、１つより多い三重結合及び／又は１つ以上の二重結合を含んでいてもよい。

【0020】

同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、限定されないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－によって例示されるように、ヘテロアルキルから誘導される二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖末端の一方又は両方を占有していてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン連結基及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の向きは、連結基の式が書かれている方向によって暗示されるものではない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－及び－Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２－の両方を表す。上記のように、ヘテロアルキル基は、本明細書で使用される場合、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＯＲ’、－ＳＲ’及び／又は－ＳＯ_２Ｒ’などの、ヘテロ原子によって分子の残りの部分に接続する基を含む。「ヘテロアルキル」が引用され、続いて－ＮＲ’Ｒ’’などのような特定のヘテロアルキル基が列挙される場合、ヘテロアルキル及び－ＮＲ’Ｒ’’といった用語は、重複するものではなく、又は相互に排他的ではないことが理解されるだろう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は、明瞭性を追加するために列挙される。したがって、「ヘテロアルキル」との用語は、本明細書中では、－ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基を除外するものであると解釈されるべきではない。

【0021】

「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体、又は他の用語との組み合わせで、特に明記しない限り、「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の非芳香環バージョンをそれぞれ意味し、ここで、非水素原子との結合に関与する全ての炭素原子価に起因して、１つ以上の環を構成する炭素は、必ずしも水素に結合している必要はない。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合している位置を占有していてもよい。シクロアルキルの例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル、３－ヒドロキシ－シクロブタ－３－エニル－１，２－ジオン、１Ｈ－１，２，４－トリアゾリル－５（４Ｈ）－オン、４Ｈ－１，２，４－トリアゾリルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定されないが、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられる。「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」は、単独で、又は別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキル及びヘテロシクロアルキルから誘導される二価の基を意味する。ヘテロシクロアルキル部分は、１個の環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロシクロアルキル部分は、２個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロシクロアルキル部分は、３個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロシクロアルキル部分は、４個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロシクロアルキル部分は、５個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。ヘテロシクロアルキル部分は、８個までの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ又はＰ）を含んでいてもよい。

【0022】

「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキル」という用語は、限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、４－クロロブチル、３－ブロモプロピルなどを含む。

【0023】

「アシル」という用語は、特に明記しない限り、－Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここでＲは、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、置換又は非置換のアリール、又は置換又は非置換のヘテロアリールである。

【0024】

「アリール」という用語は、特に明記しない限り、多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、単環、又は一緒に縮合しているか（すなわち、縮合環アリール）、又は共有結合した多環（好ましくは１～３個の環）であってもよい。縮合環アリールは、縮合環の少なくとも１つがアリール環である、縮合した複数の環を指す。「ヘテロアリール」との用語は、Ｎ、Ｏ又はＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含有するアリール基（又は環）を指し、窒素原子及び硫黄原子は、任意選択的に酸化されており、窒素原子は、任意選択的に四級化されている。したがって、「ヘテロアリール」という用語は、縮合環ヘテロアリール基（すなわち、縮合環の少なくとも１つがヘテロ芳香環である、複数の縮合した環）を含む。５，６－縮合環ヘテロアリーレンは、１つの環が５員であり、他の環が６員であり、少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、縮合した２つの環を指す。同様に、６，６－縮合環ヘテロアリーレンは、１つの環が６員であり、他の環が６員であり、少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、縮合した２つの環を指す。また、６，５－縮合環ヘテロアリーレンは、１つの環が６員であり、他の環が５員であり、少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、縮合した２つの環を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子又はヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合していてもよい。アリール基及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、４－ビフェニル、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンゾイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル及び６－キノリルが挙げられる。上述のアリール環系及びヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下に記載される許容される置換基の群から選択される。「アリーレン」及び「ヘテロアリーレン」は、単独で、又は別の置換基の一部として、それぞれアリール及びヘテロアリールから誘導される二価の基を意味する。アリール基及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピリジニル、ピリミジニル、チオフェニル、チエニル、フラニル、インドリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、チアナフタニル、ピロロピリジニル、インダゾリル、キノリニル、キノキサリニル、ピリドピラジニル、キナゾリノニル、ベンゾイソオキサゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチオフェニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリルチエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル又はキノリルが挙げられる。上述の例は、置換又は非置換であってもよく、上述の各ヘテロアリールの例の二価の基は、ヘテロアリーレンの非限定的な例である。ヘテロアリール部分は、１個の環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を含んでいてもよい。ヘテロアリール部分は、２個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を含んでいてもよい。ヘテロアリール部分は、３個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を含んでいてもよい。ヘテロアリール部分は、４個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を含んでいてもよい。ヘテロアリール部分は、５個の任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ又はＳ）を含んでいてもよい。アリール部分は、単環を有していてもよい。アリール部分は、２個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。アリール部分は、３個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。アリール部分は、４個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。ヘテロアリール部分は、１個の環を有していてもよい。ヘテロアリール部分は、２個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。ヘテロアリール部分は、３個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。ヘテロアリール部分は、４個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。ヘテロアリール部分は、５個の任意選択的に異なる環を有していてもよい。

【0025】

縮合環ヘテロシクロアルキルアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキルヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキルシクロアルキルは、シクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルキルは、別のヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキルアリール、縮合環ヘテロシクロアルキルヘテロアリール、縮合環ヘテロシクロアルキルシクロアルキル又は縮合環ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルキルは、それぞれ独立して、非置換であってもよく、又は本明細書に記載の１つ以上の置換基で置換されていてもよい。

【0026】

「オキソ」という用語は、本明細書で使用される場合、炭素原子に二重結合により結合した酸素を意味する。

【0027】

「アルキルスルホニル」という用語は、本明細書で使用される場合、式－Ｓ（Ｏ_２）－Ｒ’を有する部分を意味し、ここで、Ｒ’は、上で定義した置換又は非置換のアルキル基である。Ｒ’は、特定数の炭素（例えば、「Ｃ_１－Ｃ_４アルキルスルホニル」）を含んでいてもよい。

【0028】

上述の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）はそれぞれ、示された基の置換型及び非置換型の両方を含む。それぞれの種類の基のための好ましい置換基を、以下に提供する。

【0029】

アルキル基及びヘテロアルキル基の置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）は、限定されないが、０から（２ｍ’＋１）までの範囲の数の－ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ_２Ｒ’、－ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＯＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ＝（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、－ＣＮ、－ＮＯ_２から選択される種々の基の１つ以上であってもよく、ここで、ｍ’は、このような基の合計炭素原子数である。Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、それぞれ好ましくは、独立して、水素、置換又は非置換のヘテロアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、置換又は非置換のアリール（例えば、１～３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のアルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、例えば、それぞれのＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基が、これらの基が１つより多く存在する場合と同様に、Ｒ基は、それぞれ独立して選択される。Ｒ’とＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と合わさって、４、５、６又は７員を形成することができる。例えば、－ＮＲ’Ｒ’’としては、限定されないが、１－ピロリジニル及び４－モルホリニルが挙げられる。置換基の上述の考察から、当業者は、「アルキル」という用語を、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えば、ハロアルキル（例えば、－ＣＦ_３及び－ＣＨ_２ＣＦ_３）及びアシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）を含むことを意味すると理解するだろう。

【0030】

アルキル基について記載した置換基と同様に、アリール基及びヘテロアリール基の置換基は、様々であり、例えば、ゼロから、芳香族環系での占有されていない価数の合計数までの数の－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ_２Ｒ’、－ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＯＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ＝（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－Ｒ’、－Ｎ_３、－ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１－Ｃ_４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキルから選択され、ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、好ましくは、独立して、水素、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のヘテロアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、置換又は非置換のアリール及び置換又は非置換のヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、例えば、それぞれのＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基が、これらの基が１つより多く存在する場合と同様に、Ｒ基は、それぞれ独立して選択される。

【0031】

２つ以上の置換基が接続し、任意選択的にアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基又はヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。このようないわゆる環形成置換基は、必ずしもそうではないが、典型的には、環の基本構造に結合していることが見出される。複数の実施形態では、環形成置換基は、基本構造の隣接する原子に結合している。例えば、環基本構造の隣接する原子に結合した２個の環形成置換基は、縮合環構造を生成する。別の実施形態では、環形成置換基は、基本構造の単一の原子に結合している。例えば、環基本構造の単一の原子に結合した２個の環形成置換基は、スピロ環構造を生成する。さらに別の実施形態では、環形成置換基は、基本構造の隣接していない原子に結合している。

【0032】

アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、任意選択的に、式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＲＲ’）_ｑ－Ｕ－の環を形成し、ここで、Ｔ及びＵは、独立して、－ＮＲ－、－Ｏ－、－ＣＲＲ’－又は単結合であり、ｑは、０～３の整数である。アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、任意選択的に、式－Ａ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｂ－の置換基と置き換わっていてもよく、ここで、Ａ及びＢは、独立して、－ＣＲＲ’－、－Ｏ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－又は単結合であり、ｒは、１～４の整数である。このようにして形成された新しい環の単結合の１つが、任意選択的に、二重結合と置き換わっていてもよい。又は、アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち２つが、任意選択的に、式－（ＣＲＲ’）_ｓ－Ｘ’－（Ｃ’’Ｒ’’Ｒ’’’）_ｄ－の置換基と置き換わっていてもよく、ここで、ｓ及びｄは、独立して、０～３の整数であり、Ｘ’は、－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－又は－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、好ましくは、独立して、水素、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のヘテロアルキル、置換又は非置換のシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、置換又は非置換のアリール、及び置換又は非置換のヘテロアリールから選択される。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」又は「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）及びケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。

【0034】

「置換基」は、本明細書で使用される場合、以下の部分から選択される基を意味する：
（Ａ）オキソ、ハロゲン、－ＣＦ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び
（Ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール：
（ｉ）オキソ、ハロゲン、－ＣＦ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び
（ｉｉ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール：
（ａ）オキソ、ハロゲン、－ＣＦ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び
（ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール：オキソ、ハロゲン、－ＣＦ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアリール、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール。

【0035】

「大きさが制限された置換基（ｓｉｚｅ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」又は「大きさが制限された置換基（ｓｉｚｅ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書で使用される場合、「置換基」について上に記載した全ての置換基から選択される基を意味し、ここで、それぞれの置換又は非置換のアルキルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_２０アルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキルは、置換又は非置換の２～２０員ヘテロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキルは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_８シクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキルは、置換又は非置換の３～８員ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のアリールは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリールであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアリールは、置換又は非置換の５～１０員ヘテロアリールである。

【0036】

「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」又は「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書で使用される場合、「置換基」について上に記載した全ての置換基から選択される基を意味し、ここで、それぞれの置換又は非置換のアルキルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_８アルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキルは、置換又は非置換の２～８員ヘテロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキルは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_７シクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキルは、置換又は非置換の３～７員ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のアリールは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリールであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアリールは、置換又は非置換の５～９員ヘテロアリールである。

【0037】

幾つかの実施形態では、本明細書の化合物に記載の各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換されている。より具体的には、幾つかの実施形態では、本明細書の化合物に記載の置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン及び／又は置換ヘテロアリーレンは、それぞれ、少なくとも１つの置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基の少なくとも１つ又は全てが、少なくとも１つの大きさが制限された置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基の少なくとも１つ又は全てが、少なくとも１つの低級置換基で置換されている。

【0038】

本明細書の化合物の他の実施形態では、それぞれの置換又は非置換のアルキルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_２０アルキルであってもよく、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキルは、置換又は非置換の２～２０員ヘテロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキルは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_８シクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキルは、置換又は非置換の３～８員ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のアリールは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリールであり、及び／又はそれぞれの置換又は非置換のヘテロアリールは、置換又は非置換の５～１０員ヘテロアリールである。本明細書の化合物の幾つかの実施形態では、それぞれの置換又は非置換のアルキレンは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_２０アルキレンであってもよく、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキレンは、置換又は非置換の２～２０員ヘテロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキレンは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_８シクロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換又は非置換の３～８員ヘテロシクロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のアリーレンは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリーレンであり、及び／又はそれぞれの置換又は非置換のヘテロアリーレンは、置換又は非置換の５～１０員ヘテロアリーレンである。

【0039】

幾つかの実施形態では、それぞれの置換又は非置換のアルキルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_８アルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキルは、置換又は非置換の２～８員ヘテロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキルは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_７シクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキルは、置換又は非置換の３～７員ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換又は非置換のアリールは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリールであり、及び／又はそれぞれの置換又は非置換のヘテロアリールは、置換又は非置換の５～９員ヘテロアリールである。幾つかの実施形態では、それぞれの置換又は非置換のアルキレンは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_８アルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロアルキレンは、置換又は非置換の２～８員ヘテロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のシクロアルキレンは、置換又は非置換のＣ_３－Ｃ_７シクロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換又は非置換の３～７員ヘテロシクロアルキレンであり、それぞれの置換又は非置換のアリーレンは、置換又は非置換のＣ_６－Ｃ_１０アリーレンであり、及び／又はそれぞれの置換又は非置換のヘテロアリーレンは、置換又は非置換の５～９員ヘテロアリーレンである。幾つかの実施形態では、化合物は、以下の実施例の章、図面又は表に記載の化学種である。

【0040】

「薬学的に許容される塩」との用語は、本明細書に記載される化合物上にみられる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸又は塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が、相対的に酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、無希釈で、又は適切な不活性溶媒中で、このような化合物の中性形態と、十分な量の所望な塩基とを接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、又はマグネシウム塩、又は同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が、相対的に塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は、無希釈で、又は適切な不活性溶媒中で、このような化合物の中性形態と、十分な量の所望な酸とを接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸又は亜リン酸などの有機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的非毒性の有機酸から誘導される塩が挙げられる。アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、グルクロン酸又はガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６：１－１９（１９７７）を参照）。特定の具体的な本発明の化合物は、塩基性官能基と酸性官能基を両方とも含み、この化合物を塩基付加塩又は酸付加塩に変換することができる。当業者に知られている他の薬学的に許容される担体は、本発明に適している。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性溶媒又は他のプロトン性溶媒に可溶性な傾向がある。他の場合に、この調製物は、ｐＨ範囲が４．５～５．５の１ｍＭ～５０ｍＭのヒスチジン、０．１％～２％のショ糖、２％～７％のマンニトール中、凍結乾燥させた粉末であってもよく、これを使用前にバッファーと合わせる。

【0041】

したがって、本発明の化合物は、塩として、例えば、薬学的に許容される酸との塩として存在していてもよい。本発明は、このような塩を含む。このような塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例えば、（＋）－酒石酸塩、（－）－酒石酸塩、又はラセミ体混合物を含む、これらの混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、及びアミノ酸（例えばグルタミン酸）との塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に知られている方法によって調製されてもよい。

【0042】

化合物の中性形態は、好ましくは、塩と塩基又は酸とを接触させ、親化合物を従来の様式で単離することによって再生される。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解度など特定の物理特性において、種々の塩形態とは異なっている。

【0043】

本明細書には、プロドラッグ形態であってもよい薬剤（例えば、化合物、薬物、治療薬剤）が提供される。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、最終的な薬剤（例えば、化合物、薬物、治療薬剤）を与えるように選択した生理学的条件下で容易に化学変化を受ける化合物である。さらに、プロドラッグは、ｅｘ ｖｉｖｏ環境で、化学的方法又は生化学的方法によって、薬剤（例えば、化合物、薬物、治療薬剤）に変換することができる。本明細書に記載のプロドラッグとしては、生体系（例えば被験体の生体系）に対し、薬剤（例えば、化合物、薬物、治療薬剤）を与えるように選択した生理学的条件下で容易に化学変化を受ける化合物が挙げられる。

【0044】

特定の本発明の化合物は、溶媒和していない形態及び溶媒和した形態（水和した形態を含む）で存在していてもよい。一般的に、溶媒和した形態は、溶媒和していない形態と等価であり、本発明の範囲内に包含される。特定の本発明の化合物は、複数の結晶形態又はアモルファス形態で存在していてもよい。一般的に、全ての物理形態は、本発明のために想定される使用にとって等価であり、本発明の範囲内であることが意図されている。

【0045】

本明細書で使用される場合、「塩」との用語は、本発明の方法で使用される化合物の酸又は塩基の塩を指す。許容される塩の具体例は、鉱物酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸など）の塩、有機酸（酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸など）の塩、第四級アンモニウム（ヨウ化メチル、ヨウ化エチルなど）の塩である。

【0046】

本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学的又はキラル中心）又は二重結合を有する。エナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、アミノ酸の（Ｒ）－又は（Ｓ）－又は（Ｄ）－又は（Ｌ）－として、絶対立体化学の観点から定義されてもよい立体異性体形態は、本発明の範囲内に包含される。本発明の化合物は、合成及び／又は単離するにはあまりにも不安定であることが当該分野で知られているものを含まない。本発明は、ラセミ体及び光学的に純粋な形態の化合物を含むことを意味する。光学活性な（Ｒ）－及び（Ｓ）－又は（Ｄ）－及び（Ｌ）－異性体は、キラルなシントン又はキラル試薬を用いて調製することができ、又は従来の技術を用いて分割することができる。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合又は他の幾何学的な不斉中心を含み、他に特定しない限り、化合物は、Ｅ及びＺの幾何異性体の両方を含むことが意図される。

【0047】

本明細書で使用される場合、「異性体」との用語は、同じ数及び種類の原子を有し、したがって同じ分子量であるが、原子の構造配置又は立体配置に関して異なる化合物を指す。

【0048】

「互変異性体」との用語は、本明細書で使用される場合、平衡状態で存在し、１つの異性体形態から別の異性体形態に容易に変換される２つ以上の構造異性体のうちの１つを指す。

【0049】

本発明の特定の化合物が互変異性体の形態で存在してもよいことは当業者には明らかであり、そのような化合物の全ての互変異性体は、本発明の範囲内である。

【0050】

特に明記しない限り、本明細書に示される構造は、その構造の全ての立体化学的形態も含むことを意味する。すなわち、各不斉中心について、Ｒ及びＳの立体配置を有する。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学異性体、エナンチオマー及びジアステレオマー混合物は、本発明の範囲内である。

【0051】

特に明記しない限り、本明細書に示される構造は、１つ以上の同位体が濃縮された原子が存在するという点でのみ異なる化合物も含むことを意味する。例えば、水素が重水素又はトリチウムと置き換わっており、又は炭素が^１３Ｃ又は^１４Ｃを豊富に含む炭素と置き換わっていることを除き、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。

【0052】

本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子の１つ以上に、天然とは異なる割合の原子同位体も含んでいてもよい。例えば、化合物は、例えば、トリチウム（^３Ｈ）、ヨウ素－１２５（^１２５Ｉ）、又は炭素－１４（^１４Ｃ）などの放射性同位元素で放射性標識されてもよい。放射性であろうとなかろうと、本発明の化合物の全ての同位体変化は、本発明の範囲内に包含される。

【0053】

「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」及び「アナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）」は、相互に置き換え可能に用いられ、化学及び生物学の範囲内の通常の明瞭な意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照化合物」）と構造的に類似しているが、組成において異なっている（例えば、ある原子の異なる元素の原子との置換によって、又は特定の官能基の存在若しくはある官能基の別の官能基との置換若しくは参照化合物の１つ以上のキラル中心の絶対立体化学によって、異なっている）化学化合物を、その異性体を含めて指す。したがって、アナログは、参照化合物に対し、機能及び外観において似ているか又は同等であるが、構造又は由来は似ていないか又は同等ではない化合物である。

【0054】

記号

【0055】

【化1】

は、分子又は化学式の残りに対する化学部分の接続点を示す。

【0056】

複数の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、Ｒ^２及び／又は他の変数の複数の例を含んでいてもよい。このような実施形態では、各変数は、任意選択的に異なっていてもよく、さらに明確にするために、各群を区別するために適切に標識されていてもよい。例えば、各Ｒ^２が異なる場合、これらは、例えば、それぞれＲ^２．１、Ｒ^２．２、Ｒ^２．３及び／又はＲ^２．４と呼ばれてもよく、Ｒ^２の定義は、Ｒ^２．１、Ｒ^２．２、Ｒ^２．３及び／又はＲ^２．４によって仮定される。Ｒ^２の定義内で使用される変数、及び／又は複数の例で現われかつ異なっている他の変数は、同様に、さらに明確にするために、各群を区別するために適切に標識されていてもよい。幾つかの実施形態では、化合物は、本明細書（例えば、ある態様では、実施形態、実施例、特許請求の範囲、表、スキーム、図又は図面）に記載の化合物である。

【0057】

「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」との用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上を意味する。これに加え、「１つの（ａ（ａｎ））・・・で置換された」との句は、本明細書で使用される場合、明記された基が、示されている置換基のいずれか又は全てのうち１つ以上で置換されていてもよいことを意味する。例えば、ある基（例えば、アルキル基又はヘテロアリール基）が、「非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキルで置換されているか、又は非置換の２～２０員環ヘテロアルキル」である場合、この基は、１つ以上の非置換Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル及び／又は１つ以上の非置換の２～２０員環ヘテロアルキルを含んでいてもよい。

【0058】

ある部分がＲ置換基で置換されている場合、その基は、「Ｒ置換され」と呼ばれてもよい。ある部分がＲ置換されている場合、その部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換されており、各Ｒ置換基は、任意選択的に異なっていてもよい。例えば、本明細書のある部分が、Ｒ^１２置換されたアルキル又は非置換アルキルである場合、複数のＲ^１２置換基が、アルキル部分に接続していてもよく、各Ｒ^１２置換基は、任意選択的に異なっていてもよい。Ｒ置換された部分が、複数のＲ置換基で置換されている場合、各Ｒ置換基は、Ｒ’、Ｒ’’などのプライム記号（’）を用い、本明細書で区別されてもよい。例えば、ある部分が、Ｒ^１２置換されたアルキル又は非置換アルキルであり、その部分が複数のＲ^１２置換基で置換されている場合、複数のＲ^１２置換基は、Ｒ^１２’、Ｒ^１２’’、Ｒ^１２’’’などとして区別されてもよい。複数の実施形態では、複数のＲ置換基は、３個である。複数の実施形態では、複数のＲ置換基は、２個である。

【0059】

複数の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４及び／又は他の変数の複数の場合を含んでいてもよい。このような実施形態では、各変数は、任意選択的に異なっていてもよく、さらに明確にするために、各群を区別するために適切に標識されていてもよい。例えば、各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３及び／又はＲ^１４が異なっている場合、これらは、例えば、それぞれ、Ｒ^１．１、Ｒ^１．２、Ｒ^１．３、Ｒ^１．４、Ｒ^２．１、Ｒ^２．２、Ｒ^２．３、Ｒ^２．４、Ｒ^３．１、Ｒ^３．２、Ｒ^３．３、Ｒ^３．４、Ｒ^４．１、Ｒ^４．２、Ｒ^４．３、Ｒ^４．４、Ｒ^５．１、Ｒ^５．２、Ｒ^５．３、Ｒ^５．４、Ｒ^６．１、Ｒ^６．２、Ｒ^６．３、Ｒ^６．４、Ｒ^７．１、Ｒ^７．２、Ｒ^７．３、Ｒ^７．４、Ｒ^９．１、Ｒ^９．２、Ｒ^９．３、Ｒ^９．４、Ｒ^１０．１、Ｒ^１０．２、Ｒ^１０．３、Ｒ^１０．４、Ｒ^１１．１、Ｒ^１１．２、Ｒ^１１．３、Ｒ^１１．４、Ｒ^１２．１、Ｒ^１２．２、Ｒ^１２．３、Ｒ^１２．４、Ｒ^１３．１、Ｒ^１３．２、Ｒ^１３．３、Ｒ^１３．４、Ｒ^１４．１、Ｒ^１４．２、Ｒ^１４．３及び／又はＲ^１４．４と呼ばれてもよく、Ｒ^１の定義は、Ｒ^１．１、Ｒ^１．２、Ｒ^１．３及び／又はＲ^１．４によって仮定され、Ｒ^２の定義は、Ｒ^２．１、Ｒ^２．２、Ｒ^２．３及び／又はＲ^２．４によって仮定され、Ｒ^３の定義は、Ｒ^３．１、Ｒ^３．２、Ｒ^３．３及び／又はＲ^３．４によって仮定され、Ｒ^４の定義は、Ｒ^４．１、Ｒ^４．２、Ｒ^４．３及び／又はＲ^４．４によって仮定され、Ｒ^５の定義は、Ｒ^５．１、Ｒ^５．２、Ｒ^５．３及び／又はＲ^５．４によって仮定され、Ｒ^６の定義は、Ｒ^６．１、Ｒ^６．２、Ｒ^６．３及び／又はＲ^６．４によって仮定され、Ｒ^７の定義は、Ｒ^７．１、Ｒ^７．２、Ｒ^７．３及び／又はＲ^７．４によって仮定され、Ｒ^９の定義は、Ｒ^９．１、Ｒ^９．２、Ｒ^９．３及び／又はＲ^９．４によって仮定され、Ｒ^１０の定義は、Ｒ^１０．１、Ｒ^１０．２、Ｒ^１０．３及び／又はＲ^１０．４によって仮定され、Ｒ^１１の定義は、Ｒ^１１．１、Ｒ^１１．２、Ｒ^１１．３及び／又はＲ^１１．４によって仮定され、Ｒ^１２の定義は、Ｒ^１２．１、Ｒ^１２．２、Ｒ^１２．３及び／又はＲ^１２．４によって仮定され、Ｒ^１３の定義は、Ｒ^１３．１、Ｒ^１３．２、Ｒ^１３．３及び／又はＲ^１３．４によって仮定され、Ｒ^１４の定義は、Ｒ^１４．１、Ｒ^１４．２、Ｒ^１４．３及び／又はＲ^１４．４によって仮定される。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３及び／又はＲ^１４の定義内で使用される変数及び／又は複数の場合で現われ、異なっている他の変数は、同様に、さらに明確にするために、各群を区別するために適切に標識されていてもよい。

【0060】

本発明の化合物の記載は、当業者に知られている化学結合の原理によって制限される。したがって、ある基が、多くの置換基の１つ以上によって置換され得る場合、このような置換は、化学結合の原理と合致し、かつ、本質的に不安定ではなく、かつ／又は周囲条件（例えば、水系、中性、幾つかの既知の生理学的条件）下で不安定である蓋然性が高いことが当業者に知られている化合物を、与えるように選択される。例えば、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールは、当業者に知られている化学結合の原理に従って、環ヘテロ原子を介して分子の残りに接続することにより、本質的に不安定な化合物を避ける。

【0061】

抗体は、複雑な内部構造を有する、大きく複雑な分子である（分子量が約１５０，０００又は約１３２０アミノ酸）。天然抗体分子は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、それぞれの対が、１つの軽鎖と１つの重鎖とを含む。次に、それぞれの軽鎖と重鎖は、標的抗原に結合する際に関与する可変（「Ｖ」）領域と、免疫系の他の構成要素と相互作用する定常（「Ｃ」）領域の２つの領域からなる。軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、三次元空間で合わさって、抗原（例えば、細胞表面上の受容体）に結合する可変領域を形成する。それぞれの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の中に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３個の短いセグメント（平均で１０アミノ酸長）が存在する。抗体可変ドメイン中の６個のＣＤＲ（軽鎖から３個、重鎖から３個）が三次元空間で一緒に折り畳まれ、標的抗原にドッキングする実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置及び長さは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３，１９８７によって正確に定義されている。ＣＤＲに含まれない可変領域の部分は、フレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれ、ＣＤＲのための環境を形成する。

【0062】

「抗体」との用語は、当技術分野において一般的に知られている意味に従って使用される。抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼで消化することによって産生される多くの十分に特性決定されたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下にある抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’_２（これ自体がジスルフィド結合によってＶ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１に結合した軽鎖であるＦａｂのダイマー）を形成する。Ｆ（ａｂ）’_２を穏和な条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊することによってＦ（ａｂ）’_２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換してもよい。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編集、第３版、１９９３）を参照）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化という観点で定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的に、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成されてもよいことを理解するであろう。したがって、抗体との用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の改変によって産生される抗体フラグメント、又は組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成される抗体フラグメント（例えば一本鎖Ｆｖ）、又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるものも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照）。

【0063】

モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野で公知の任意の技術を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．７７－９６ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）を参照）。「モノクローナル」抗体（ｍＡｂ）は、単一クローンから誘導される抗体を指す。一本鎖抗体の製造技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するように適合させることができる。また、トランスジェニックマウス又は他の有機体（例えば、他の哺乳動物）を使用し、ヒト化抗体を発現させてもよい。又は、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）を参照）。

【0064】

ｍＡｂのエピトープは、その抗原のうち、ｍＡｂが結合する領域である。２つの抗体が、それぞれが、抗原に対する他の抗体の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する。すなわち、競争結合アッセイで測定される場合、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の片方の抗体が、他方の抗体の結合を少なくとも３０％、しかし、好ましくは５０％、７５％、９０％、又は９９％まで阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５、１９９０を参照）。又は、２つの抗体のうち、一方の抗体の結合を減らすか又はなくす、抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の抗体への結合を減らすか又はなくす場合、この２つの抗体は、同じエピトープを有する。２つの抗体のうち一方の抗体の結合を減らすか又はなくす幾つかのアミノ酸変異が、他方の抗体への結合を減らすか又はなくす場合、この２つの抗体は、重複するエピトープを有する。

【0065】

抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとして存在するか、又は種々のペプチダーゼで消化することによって産生される多くの十分に特性決定されたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下にある抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（これ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂのダイマー）を形成する。Ｆ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊することによってＦ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換してもよい。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の一部を有する抗原結合（ｄｉｎｇｉｎｇ）部位である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編集、第３版、１９９３）を参照）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化という観点で定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的に、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成されてもよいことを理解するであろう。したがって、抗体との用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の改変によって産生される抗体フラグメント、又は組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成される抗体フラグメント（例えば一本鎖Ｆｖ）、又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるものも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照）。

【0066】

一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、典型的には、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドに連結する。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はトレオニンも豊富な場合がある。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はこの逆でもよい。

【0067】

本発明の適切な抗体の調製及び本発明による使用のための、例えば組換え抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のために、当技術分野で公知の多くの技術を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、ｐｐ．７７－９６、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；及びＧｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）を参照）。目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーを、ハイブリドーマ又は形質細胞から製造することもできる。重鎖及び軽鎖の遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版、１９９７）を参照）。一本鎖抗体又は組換え抗体の製造技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するように適合させることができる。また、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物のような生物を用いて、ヒト化抗体又はヒト抗体を発現させることができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照）。又は、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）を参照）。抗体は、二重特異性であってもよく、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができてもよい（例えば、ＷＯ第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９（１９９１）；及びＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照）。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート、例えば、２つの共有結合した抗体、又は免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９を参照）。

【0068】

非ヒト抗体のヒト化又は霊長類化のための方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，５３０，１０１号；第５，８５９，２０５号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，７７７，０８５号；第６，１８０，３７０号；第６，２１０，６７１号；及び第６，３２９，５１１号；ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第０１７３４９４号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２；及びＶｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４を参照）。ヒト化抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３にさらに記載されている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法に従って行うことができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４），Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５－９２（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２），Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９－４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９－２１７（１９９４）を参照）。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい部分が、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置き換えられているヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域をコードする第１の配列と、所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第２の配列とを含むポリヌクレオチドは、合成的に、又は適切なｃＤＮＡとゲノムＤＮＡセグメントを組み合わせることによって製造することができる。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から周知の方法に従って単離することができる。

【0069】

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なっているか又は改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域に連結するか、又はキメラ抗体に新しい特性を与える全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に連結するように、定常領域又はその一部が変更、置換又は交換されているか；又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる抗原特異性又は改変された抗原特異性を有する可変領域と改変、置換又は交換されている、抗体分子である。本発明の好ましい抗体、及び本発明によって使用するための好ましい抗体には、ヒト化及び／又はキメラモノクローナル抗体が含まれる。

【0070】

治療薬剤を抗体にコンジュゲートさせる技術は、よく知られている（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（編集），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」 ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（編集），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（編集），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８（１９８２）を参照）。本明細書で使用される場合、「抗体－薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」との用語は、抗体にコンジュゲート又は他の様式で共有結合した治療薬剤を言う。本明細書で言及する「治療薬剤」は、がんなどの疾患を処置又は予防するのに有用な組成物である。

【0071】

タンパク質又はペプチドに言及するとき、抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」、又は「特異的に（又は選択的に）免疫反応性である」という句は、しばしばタンパク質及び他の生物製剤の異種集合の中のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０倍～１００倍を超えて、特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とは特異的に免疫反応性ではない抗体のサブセットのみを得るように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成されてもよい。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用可能なイムノアッセイのフォーマット及び条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照）。

【0072】

「リガンド」は、受容体に結合することができる薬剤、例えばポリペプチド又は他の分子を指す。

【0073】

「接触」は、通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子又は細胞を含む化学化合物）が、反応、相互作用、又は物理的に接触するほど十分に近づくことを可能にする過程を指す。しかしながら、得られた反応生成物は、添加された試薬同士の間の反応から直接的に生成されてもよく、又は１種以上の添加された試薬から反応混合物中で生成することができる中間体から生成されてもよいことを理解されたい。

【0074】

「接触」との用語は、２つの種を反応させ、相互作用させ、又は物理的に接触させることを含んでいてもよく、２つの種は、例えば、本明細書で与えられるような医薬組成物であってもよい。複数の実施形態において、接触は、例えば、本明細書に記載の医薬組成物を、細胞又は患者と相互作用させることを含む。

【0075】

別に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語及び科学用語は、当技術分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９）を参照。本明細書に記載されたものと類似又は等価な任意の方法、デバイス及び材料を、本発明の実施において使用することができる。以下の定義は、本明細書において頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。

【0076】

「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそれらの一重鎖形態又は二本鎖形態のポリマー及びそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドの直鎖配列を指す。「ヌクレオチド」との用語は、典型的には、ポリヌクレオチドの１個の単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はそれらの改変されたバージョンであってもよい。本明細書で想定されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、及び一本鎖及び二本鎖のＤＮＡとＲＮＡの混合物を含むハイブリッド分子が挙げられる。本明細書で使用される核酸は、天然に存在する核酸と同じ基本的な化学構造を有する核酸も指す。このようなアナログは、改変された糖類及び／又は改変された環置換基を有するが、天然に存在する核酸と同じ基本的な化学構造を保持している。核酸模倣物とは、核酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然に存在する核酸と同様の様式で機能する構造を有する化学化合物を指す。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0077】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」との用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で相互に置き換え可能に用いられ、このとき、ポリマーは、複数の実施形態では、アミノ酸からなっていない部分にコンジュゲートしていてもよい。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「融合タンパク質」は、単一部分として組換えにより発現される、２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。

【0078】

「ペプチジル」及び「ペプチジル部分」との用語は、一価ペプチドを意味する。

【0079】

「アミノ酸」との用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、及び天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びに後で改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合したα炭素を有する化合物を指す。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する構造を有する化学化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然アミノ酸」との用語は、天然には見出されないアミノ酸アナログ、合成アミノ酸及びアミノ酸模倣物を指す。

【0080】

アミノ酸は、一般的に知られている３文字の記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号のいずれかによって、本明細書で言及されてもよい。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードによって言及されてもよい。

【0081】

「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された改変体」は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの縮重のために、多くの核酸配列が、任意の所定のタンパク質をコードするであろう。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アラニンというアミノ酸をコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載されている対応するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。このような核酸変異は、保存的に改変された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変し、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において、暗黙のものである。

【0082】

アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の１個のアミノ酸又は少ないパーセントのアミノ酸を変更、付加又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、改変によって、アミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸へと置換される、「保存的に改変された改変体」であることを認識するだろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表は、当技術分野で周知である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間同族体及び対立遺伝子に加えられ、除外されない。

【0083】

以下の８つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）。
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）。
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）。
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。

【0084】

「～を参照するとともにナンバリングされた」又は「～に対応する」との用語は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチドの配列のナンバリングという観点で使用される場合、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチドの配列を参照配列と比較したときに、明記された参照配列の残基のナンバリングを指す。あるタンパク質中のアミノ酸残基は、そのタンパク質内で所与の残基と同じ本質的な構造的位置を占める場合、所与の残基に「対応する」。当業者は、異なるナンバリングシステムを用いた他のタンパク質において、あるタンパク質（例えば、ＲＯＲ－１）の具体的な位置に対応する残基の同一性及び配置をすぐに認識するだろう。例えば、タンパク質（例えば、ＲＯＲ－１）との単純は配列アラインメントを行うことによって、このタンパク質の具体的な位置に対応する残基の同一性及び配置は、このタンパク質に対してアラインメントする他のタンパク質配列において特定される。例えば、選択した残基が、１３８位のグルタミン酸と同じ本質的な空間関係又は他の構造関係を占める場合、選択したタンパク質中の選択した残基は、１３８位のグルタミン酸に対応する。幾つかの実施形態では、選択したタンパク質が、あるタンパク質との最大ホモロジーのためにアラインメントされる場合、グルタミン酸１３８とアラインメントする、アラインメントされた選択したタンパク質中の位置は、グルタミン酸１３８に対応すると言われる。一次配列のアラインメントの代わりに、三次元構造のアラインメントを使用してもよく、例えば、選択したタンパク質の構造が、１３８位のグルタミン酸との最大対応性のためにアラインメントされる場合、全体的な構造を比較する。この場合、構造モデルにおいて、グルタミン酸１３８と同じ本質的な位置を占めるアミノ酸は、グルタミン酸１３８残基に対応すると言われる。

【0085】

「配列同一性のパーセント」は、比較ウィンドウにわたって、２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、この比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部が、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較すると、付加又は欠失（例えばギャップ）を含んでいてもよい。このパーセントは、マッチした位置の数を得るために、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定することによって計算され、このマッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の合計数で割り算し、その結果に１００を掛け算し、配列同一性のパーセントを得る。

【0086】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一の」との用語又は「同一性」の率は、同じ（すなわち、特定の領域にわたって、比較ウィンドウにわたって最大対応性について比較され、アラインメントされ、又は以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定される場合、指定された領域にわたって、又は手動のアラインメント及び視覚観察によって、例えば、本発明の全ポリペプチド配列又は本発明のポリペプチドの個々のドメインの６０％の同一性、任意選択的に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性）であるか、又は明記されたパーセントの同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを含む２つ以上の配列又は部分配列を指す。このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、試験配列の相補体も指す。任意選択的に、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドの領域、又はより好ましくは長さが１００～５００又は１０００以上のヌクレオチドの範囲にわたって存在する。

【0087】

配列比較のために、典型的には１つの配列が、参照配列として作用し、この配列と試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、部分配列の座標が指定され、必要な場合には、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用してもよく、又は代替パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性の率を計算する。

【0088】

「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、例えば、全長配列又は２０～６００、約５０～約２００、又は約１００～約１５０アミノ酸又はヌクレオチドからなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、２つの配列を最適にアラインメントした後、ある配列を、同じ数の連続した位置を有する参照配列と比較してもよい。比較のための配列アラインメント方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施によって、又は手動のアラインメント及び視覚観察（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって、行うことができる。

【0089】

配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ウェブサイトでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを含み、データベース配列中の同じ長さの文字列を用いてアラインメントしたときに、幾つかの陽性値の閾値スコアＴにマッチするか、又は満足する。Ｔは、隣接文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）。これらの初期の隣接文字列ヒットは、これらを含有するさらに長いＨＳＰを見つけるためのサーチを開始するための種子として作用する。文字列ヒットを、累積アラインメントスコアが増加していく限り、各配列に沿って両方向に延ばす。ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（マッチする残基の対について報償スコア；常に０より大きい）及びＮ（ミスマッチの残基についてペナルティスコア；常に０より小さい）を用い、累積スコアを計算する。アミノ酸配列について、累積スコアを計算するために、スコアリングマトリックスを使用する。それぞれの方向での文字列ヒットの伸張は、累積アラインメントスコアが、最大達成値から量Ｘだけ小さくなったときに止められる。累積スコアは、１つ以上の陰性スコア残基アラインメントの体積に起因して、又はいずれかの配列の末端が到達するとき、ゼロ又はゼロ未満になる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定付ける。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、文字列長（Ｗ）１１、予想（Ｅ）又は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、文字列長３、予想（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５）、アラインメント（Ｂ）５０、予想（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び量鎖の比較を使用する。

【0090】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの指標は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を与える。例えば、核酸は、参照配列と類似であるとみなされる。参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率は、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である。

【0091】

２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一である指標は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、この２つのペプチドは、保存的置換によってのみ異なっている。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載するように、その２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを用いて配列を増幅させることができることである。

【0092】

「単離された」との用語は、タンパク質に適用される場合、タンパク質が、それらが自然状態で会合している他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。これは、好ましくは、均質な状態であるが、乾燥状態又は水溶液のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。「精製された」との用語は、タンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示す。特に、この用語は、少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度であることを意味する。

【0093】

タンパク質又はペプチドに言及するとき、抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」、又は「特異的に（又は選択的に）免疫反応性である」という句は、タンパク質及び他の生物製剤の異種集合の中のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定のタンパク質に結合し、そのサンプル中に存在する他のタンパク質に対し、顕著な量で実質的に結合しない。典型的には、具体的又は選択的な反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍を超えて１００倍までである。

【0094】

本明細書で使用される「細胞」は、ゲノムＤＮＡを保存又は複製するのに十分な代謝又は他の機能を実行する細胞を指す。細胞は、例えば、インタクトな膜の存在、特定の色素による染色、子孫を産生する能力、又は配偶子の場合には、第２配偶子と結合し、生存可能な子孫を産生する能力を含め、当技術分野で周知の方法によって同定することができる。細胞は、原核細胞及び真核細胞を含んでいてもよい。原核細胞としては、細菌が挙げられるが、これに限定されない。真核細胞としては、酵母細胞及び植物及び動物由来の細胞、例えば哺乳動物、昆虫（例えばスポドプテラ）及びヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0095】

本明細書で定義される場合、タンパク質－阻害剤（例えば、受容体アンタゴニスト又はシグナル伝達経路阻害剤）相互作用に関して、「阻害」、「阻害する」、「阻害すること」などの用語は、阻害剤が存在しない状態でのタンパク質の活性又は機能に対し、タンパク質の活性又は機能に負の影響を与える（例えば、低下させる）（例えば、受容体又はタンパク質の活性を低下させる）ことを意味する。幾つかの実施形態では、阻害は、疾患（例えば、がん）又はその疾患の症状の低減を指す。したがって、阻害は、少なくとも部分的に、刺激を部分的に若しくは完全に遮断すること、活性化を低減するか、防止するか、若しくは遅らせること、又はシグナル伝達若しくは酵素活性若しくはタンパク質（例えば受容体）の量を不活性化するか、脱感作するか、若しくはダウンレギュレートすることを含む。同様に、「阻害剤」は、例えば、結合、部分的又は全体的な遮断、低減、防止、遅延、不活性化、脱感作、又は活性のダウンレギュレーションによって、受容体又は別のタンパク質を阻害する化合物又はタンパク質である。

【0096】

「ＢＴＫアンタゴニスト」との用語は、本明細書で提供される場合、コントロールと比較して、ＢＴＫ活性を阻害することが可能な物質を指す。ＢＴＫの阻害された活性は、コントロールにおける活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はさらに小さくてもよい。特定の場合には、阻害は、コントロールと比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又はそれ以上である。ＢＴＫアンタゴニストは、ＢＴＫアンタゴニストが存在しない状態と比較して、少なくとも部分的に、刺激を部分的に若しくは完全に遮断すること、活性化を低減するか、防止するか、若しくは遅らせること、又はＢＴＫのシグナル伝達若しくは活性若しくは量を不活性化するか、脱感作するか、若しくはダウンレギュレーションすることによって、ＢＴＫ活性を阻害する。

【0097】

「ＲＯＲ－１アンタゴニスト」との用語は、本明細書で提供される場合、コントロールと比較して、ＲＯＲ－１活性を阻害することが可能な物質を指す。ＲＯＲ－１の阻害された活性は、コントロールにおける活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はさらに小さくてもよい。特定の場合には、阻害は、コントロールと比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又はそれ以上である。ＲＯＲ－１アンタゴニストは、ＲＯＲ－１アンタゴニストが存在しない状態と比較して、少なくとも部分的に、刺激を部分的に若しくは完全に遮断すること、活性化を低減するか、防止するか、若しくは遅らせること、又はＲＯＲ－１のシグナル伝達若しくは活性若しくは量を不活性化するか、脱感作するか、若しくはダウンレギュレーションすることによって、ＲＯＲ－１活性を阻害する。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、抗体又は低分子である。

【0098】

「アンタゴニスト」との用語は、本明細書で阻害剤の代わりに使用されてもよい。

【0099】

「治療に有効な用量又は量」とは、本明細書で使用される場合、投与される効果（例えば、疾患を治療するか、又は予防する）を生じる用量を意味する。実際の投与量及び製剤は、治療の目的に依存し、既知の技術を用い、当業者によって確認され得る（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照）。例えば、所与のパラメータについて、治療に有効な量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、又は少なくとも１００％の増加又は減少を示す。治療効能は、何「倍」の増加又は減少として表すこともできる。例えば、治療に有効な量は、標準コントロールに対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれ以上の効果を有し得る。治療に有効な用量又は量は、ある疾患の１つ以上の症状を軽減してもよい。治療に有効な用量又は量は、投与される効果が、ある疾患が進行するリスクがある人を治療することである場合、その疾患又は疾患の１つ以上の症状の発症を予防するか、又は遅らせてもよい。

【0100】

「抗がん剤」は、通常の意味に従って使用され、抗腫瘍特性又は細胞の成長又は増殖を阻害する能力を有する組成物（例えば、化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、モジュレーター）を指す。幾つかの実施形態では、抗がん剤は、化学療法薬である。幾つかの実施形態では、抗がん剤は、がんを処置する方法において有用性を有する、本明細書において特定される薬剤である。幾つかの実施形態では、抗がん剤は、がんを処置するために、ＦＤＡ又は米国以外の国の同様の規制当局によって承認された薬剤である。抗がん剤の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ１及びＭＥＫ２）阻害剤（例えば、ＸＬ５１８、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３５９０１、セルメチニブ／ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２／トラメチニブ、ＧＤＣ－０９７３、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－３００、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＴＡＫ－７３３、ＰＤ３１８０８８、ＡＳ７０３０２６、ＢＡＹ８６９７６６）、アルキル化薬剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロロエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メイファラン）、エチレンイミン及びメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン）、トリアゼン（デカルバジン））、抗代謝物（例えば、５－アザチオプリン、ロイコボリン、カペシタビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、葉酸アナログ（例えば、メトトレキセート）、又はピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル、フロキソウリジン、シタラビン）、プリンアナログ（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）など）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル、ドセタキセルなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、白金系化合物又は白金を含有する薬剤（例えば、シスプラチン、オキサロプラチン、カルボプラチン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン、アミノグルテチミド）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド）、抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン）、酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）、分裂促進因子によって活性化されたタンパク質キナーゼシグナル伝達の阻害剤（例えば、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ０３２５９０１、ＡＲＲＹ－１４２８８６、ＳＢ２３９０６３、ＳＰ６００１２５、ＢＡＹ ４３－９００６、ウォルトマンニン又はＬＹ２９４００２、Ｓｙｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体（例えば、リツキサン）、ゴシポール、ゲナセンス、ポリフェノールＥ、クロロフシン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ブリオスタチン、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、５－アザ－２’－デオキシシチジン、オールトランスレチノイン酸、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ．ＲＴＭ．）、ゲルダナマイシン、１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン（１７－ＡＡＧ）、フラボピリドール、ＬＹ２９４００２、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ＢＡＹ １１－７０８２、ＰＫＣ４１２、ＰＤ１８４３５２、２０－ｅｐｉ－１、２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５－エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ－ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗腹側形態形成タンパク質－１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調整剤；アポトーシス制御剤；アプリン酸；ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロンアザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β－アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ウイルスＩＬ－２；カペシタビン；カルボキサミド－アミノ－トリアゾール；カルボキシａｍｉｄｏトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨から誘導される阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ－ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コムブレタスタチンＡ４；コムブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム；サイペマイシン；シタラビン オクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシフォサミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ－５－アザシチジン；９－ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エピリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドホスフェート；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；フォルフェニメックス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸がリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；メキサメチレンビスアセタミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イルマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子－１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４－；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン－Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロムブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルートテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテーアゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞成長因子－サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋結核菌細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；外発性腫瘍抑制因子１に基づく治療；マスタード抗がん薬；マイカペルオキシドＢ；マイコバクテリウム細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ－アセチルジナリン；Ｎ置換されたベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調整剤；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６－ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパラガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金－トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピル ビス－アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａ系免疫調整剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリエチレン接合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン脱メチル化物；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ １模倣物；セムスチン；細胞老化に由来する阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル形質導入阻害剤；シグナル形質導入調整剤；一本軽鎖抗原結合タンパク質；シゾフラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテイト；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；
ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スティピアミド；ストロマリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性な血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキセート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロフォスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレゾール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；ジノスタチンスチマラマー、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロスタノロン；ダウゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イイモホシン；インターロイキンＩ１（組換えインターロイキンＩＩ又はｒｌＬｓｕｂ．２を含む）、インターフェロンα－２ａ；インターフェロンα－２ｂ；インターフェロンα－ｎ１；インターフェロンα－ｎ３；インターフェロンβ－１ａ；インターフェロンγ－１ｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メチュレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾトシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；ビングリシネートスルフェート；硫酸ビンリューロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン、Ｇ２－Ｍ期において細胞を抑止し及び／又は微小管の生成又は安定性を調整する薬剤（例えば、Ｔａｘｏｌ^ＴＭ（すなわち、パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ^ＴＭ、タキサン骨格を含む化合物、エルブロゾール（すなわち、Ｒ－５５１０４）、ドラスタチン１０（すなわち、ＤＬＳ－１０及びＮＳＣ－３７６１２８）、イセチオン酸ミボブリン（すなわち、ＣＩ－９８０として）、ビンクリスチン、ＮＳＣ－６３９８２９、ディスコデルモライド（すなわち、ＮＶＰ－ＸＸ－Ａ－２９６として）、ＡＢＴ－７５１（Ａｂｂｏｔｔ、すなわち、Ｅ－７０１０）、アルトルヒルチン（例えば、アルトルヒルチンＡ及びアルトルヒルチンＣ）、スポンギスタチン（例えば、スポンギスタチン１、スポンギスタチン２、スポンギスタチン３、スポンギスタチン４、スポンギスタチン５、スポンギスタチン６、スポンギスタチン７、スポンギスタチン８及びスポンギスタチン９）、塩酸セマドチン（すなわち、ＬＵ－１０３７９３及びＮＳＣ－Ｄ－６６９３５６）、エポチロン（例えば、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ（すなわち、デスオキシエポチロンＡ又はｄＥｐｏＡ）、エポチロンＤ（すなわち、ＫＯＳ－８６２、ｄＥｐｏＢ及びデスオキシエポチロンＢ）、エポチロンＥ、エポチロンＦ、エポチロンＢ Ｎ－オキシド、エポチロンＡ Ｎ－オキシド、１６－アザ－エポチロンＢ、２１－アミノエポチロンＢ（すなわち、ＢＭＳ－３１０７０５）、２１－ヒドロキシエポチロンＤ（すなわち、デスオキシエポチロンＦ及びｄＥｐｏＦ）、２６－フルオロエポチロン、オーリスタチンＰＥ（すなわち、ＮＳＣ－６５４６６３）、ソブリドチン（すなわち、ＴＺＴ－１０２７）、硫酸ビンクリスチン、クリプトフィシン５２（すなわち、ＬＹ－３５５７０３）、ビチレブアミド、チュブリシンＡ、カナデンソール、センタウレイジン（すなわち、ＮＳＣ－１０６９６９）、オンコシジンＡ１（すなわち、ＢＴＯ－９５６及びＤＩＭＥ）、フィジアノリドＢ、ラウリマリド、ナルコシン（ＮＳＣ－５３６６としても知られる）、ナスカピン、ヘミアステリン、バナドセンアセチルアセトネート、モンサトロール、イナノシン（すなわち、ＮＳＣ－６９８６６６）、エロイテロビン（例えば、レスメチルエロイテロビン、デサエチルエロイテロビン、イソエロイテロビンＡ及びＺ－エロイテロビン）、カリベオシド、カリベオリン、ハリコンドリンＢ、ジアゾナミドＡ、タッカロノリドＡ、ジオゾスタチン、（－）－フェニラヒスチン（すなわち、ＮＳＣＬ－９６Ｆ０３７）、ミオセベリンＢ、レスベラスタチンリン酸ナトリウム、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、例えば、ゴセレリン又はロイプロリド、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプリル酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、免疫刺激薬（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン－２、α－インターフェロンなど）、モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ－ＤＲ及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体－カリケアマイシン接合体、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－シュードモナス外毒素接合体など）、放射免疫療法（例えば、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ又は^１３１Ｉなどに接合した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）、トリプトリド、ホモハリングトニン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イトラコナゾール、ビンデシン、セリバスタチン、ビンクリスチン、デオキシアデノシン、セルトラリン、ピタバスタチン、イリノテカン、クロファジミン、５－ノニルオキシトリプタミン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）標的治療又は治療薬（例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ^ＴＭ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ^ＴＭ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ^ＴＭ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ^ＴＭ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ^ＴＭ）、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ^ＴＭ）、アファチニブ／ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ－１０３３／カネルチニブ、ネラチニブ／ＨＫＩ－２７２、ＣＰ－７２４７１４、ＴＡＫ－２８５、ＡＳＴ－１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＲＲＹ－３８０、ＡＧ－１４７８、ダコミチニブ／ＰＦ２９９８０４、ＯＳＩ－４２０／デスメチルエルロチニブ、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８、ペリチニブ／ＥＫＢ－５６９、ＣＵＤＣ－１０１、ＷＺ８０４０、ＷＺ４００２、ＷＺ３１４６、ＡＧ－４９０、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＢＭＳ－５９９６２６）、ソラフェニブ、イマチニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ホルモン治療など。

【0101】

「イブルチニブ」との用語は、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（Ｒ）、ＰＣＩ ３２７６５などとしても知られており、通常の一般的な意味において、１－［（３Ｒ）－３－［４－アミノ－３－（４－フェノキシフェニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］ピペリジン－１－イル］プロパ－２－オン－１－オン（ＣＡＳ登録番号９３６５６３－９６－１）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第７，５１４，４４４号；第８，００８，３０９号；第８，４９７，２７７号；第８，４７６，２８４号；第８，６９７，７１１号、第８，７０３，７８０号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0102】

「イデラリシブ」との用語は、ＣＡＬ１０１、ＧＳ－１１０１、Ｚｙｄｅｌｉｇ（Ｒ）などとしても知られており、通常の一般的な意味において、５－フルオロ－３－フェニル－２－［（１Ｓ）－１－（７Ｈ－プリン－６－イルアミノ）プロピル］－４（３Ｈ）－キナゾリノン（ＣＡＳ登録番号８７０２８１－８２－６）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第９，４６９，６４３号；第９，４９２，４４９号；第８，１３９，１９５号；第８，４９２，３８９号；第８，８６５，７３０号、第９，１４９，４７７号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0103】

「Ｒ４０６」などの用語は、通常の一般的な意味において、６－（（５－フルオロ－２－（（３，４，５－トリメトキシフェニル）アミノ）ピリミジン－４－イル）アミノ）－２，２－ジメチル－２Ｈ－ピリド［３，２－ｂ］［１，４］オキサジン－３（４Ｈ）－オンベンゼンスルホネートを指す。

【0104】

「フォスタマチニブ」などの用語は、通常の一般的な意味において、６－（（５－フルオロ－２－（（３，４，５－トリメトキシフェニル）アミノ）ピリミジン－４－イル）アミノ）－２，２－ジメチル－２Ｈ－ピリド［３，２－ｂ］［１，４］オキサジン－３（４Ｈ）－オンベンゼンスルホネート（ＣＡＳ登録番号９０１１１９－３５－５又は１０２５６８７－５８－４（二ナトリウム塩））を指す。フォスタマチニブは、Ｒ４０６のプロドラッグである。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第７，４４９，４５８号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0105】

「アカラブルチニブ」との用語は、ＡＣＰ－１９６などとしても知られており、通常の一般的な意味において、４－［８－アミノ－３－［（２Ｓ）－１－ブタ－２－イノイルピロリジン－２－イル］イミダゾ［１，５－ａ］ピラジン－１－イル］－Ｎ－ピリジン－２－イルベンズアミド（ＣＡＳ登録番号１４２０４７７－６０－６）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１４０１５５３８５号、第２０１６０１５１３６４号、第２０１６０１５９８１０号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0106】

「ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９」などの用語は、通常の一般的な意味において、６－アミノ－７－（４－フェノキシフェニル）－９－［（３Ｓ）－１－プロパ－２－エノイルピペリジン－３－イル］プリン－８－オン（ＣＡＳ登録番号１３５１６３６－１８－４）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８，９４０，７２５号及び第８，５５７，８０３号、米国特許出願第２０１５００９４２９９号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0107】

「ＢＧＢ－３１１１」などの用語は、通常の一般的な意味において、２－（４－フェノキシフェニル）－７－（１－プロパ－２－エノイルピペリジン－４－イル）－１，５，６，７－テトラヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（ＣＡＳ登録番号１６３３３５０－０６－７）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１５０２５９３５４号及び第２０１６００８３３９２号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0108】

「ＣＣ－２９２」などの用語は、ＡＶＬ－２９２、スペブルチニブなどとしても知られ、通常の一般的な意味において、Ｎ－［３－［［５－フルオロ－２－［４－（２－メトキシエトキシ）アニリノ］ピリミジン－４－イル］アミノ］フェニル］プロパ－２－エナミド（ＣＡＳ登録番号１２０２７５７－８９－８）を指す。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８，３３８，４３９号に開示される化合物のいずれか１つである。

【0109】

「シルムツズマブ」、「ＵＣ－９６１」及び「９９９６１．１」といった用語は、ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）の細胞外ドメインに結合可能なヒト化モノクローナル抗体を指す。複数の実施形態では、シルムツズマブは、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第１４／４２２，５１９号に開示される抗体又はそのフラグメントのいずれか１つである。

【0110】

本明細書で使用される場合、「約」との用語は、明記された値を含む、ある値の範囲を意味し、当業者は、明記された値と合理的に同様であると考えるだろう。複数の実施形態では、約は、当技術分野で一般的に受け入れられる測定を用いた標準偏差以内であることを意味する。複数の実施形態では、約は、明記された値の±１０％に広がる範囲を意味する。複数の実施形態では、約は、明記された値を意味する。

【0111】

「疾患」又は「状態」との用語は、本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置することができる患者又は被験体の状態又は健康状態を指す。複数の実施形態では、疾患は、がん（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えばメルケル細胞癌）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、メラノーマ、乳がん、神経芽腫）である。この疾患は、自己免疫性、炎症性、がん性、感染性、代謝性、発達性、心血管性、肝臓、腸、内分泌腺、神経学的又は他の疾患であってもよい。

【0112】

本明細書で使用される場合、「がん」との用語は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、神経内分泌腫瘍、癌腫及び肉腫を含む、哺乳動物にみられるあらゆるタイプのがん、新生物又は悪性腫瘍を指す。本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置され得る例示的ながんとしては、リンパ腫、肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、子宮頸がん、結腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、骨髄腫、甲状腺がん、白血病、前立腺がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲ陽性、ＥＲ陰性、化学療法抵抗性、ハーセプチン抵抗性、ＨＥＲ２陽性、ドキソルビシン抵抗性、タモキシフェン抵抗性、腺管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣がん、前立腺がん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形神経膠芽腫、神経膠腫、メラノーマ、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、神経膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮癌（例えば、頭部、頸部又は食道）、結腸直腸がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は多発性骨髄腫が挙げられる。さらなる例としては、甲状腺がん、内分泌系がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頸部がん、食道がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がん又は髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖器管がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌又は外分泌の新生物、髄様甲状腺がん、髄様甲状腺癌腫、メラノーマ、結腸直腸がん、結腸直腸がん、乳頭様甲状腺がん、肝細胞癌、乳頭のパジェット病、葉状腺腫瘍、小葉癌、腺管癌、膵臓星状細胞がん、肝星状細胞がん又は前立腺がんが挙げられる。

【0113】

「白血病」との用語は、広く、血液形成器官の進行性悪性疾患を指し、一般に、血液及び骨髄における白血球及びこの前駆体の増殖及び発達の歪みを特徴とする。白血病は、一般に、（１）急性又は慢性の疾患の期間及び特徴、（２）関与する細胞の種類；骨髄（骨髄性）、リンパ球（リンパ性）又は単球性；及び（３）血液白血病又は無白血病（亜白血性）における異常細胞の数が増加していること、又は増加していないことを基準として、臨床的に分類される。本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置し得る例示的な白血病としては、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血芽球細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ細胞性白血病、リンパ行性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病又は未分化細胞性白血病が挙げられる。

【0114】

「肉腫」という用語は、胎芽の結合組織のような物質で形成され、原線維又は同種の物質に埋め込まれた密に集まった細胞から一般的に構成される腫瘍を広く指す。本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置し得る例示的な肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛上皮腫、胎芽性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発多発性色素出血性肉腫、Ｂ細胞免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポージ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球性肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢肉腫、滑膜肉腫又は毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。

【0115】

「メラノーマ」という用語は、皮膚及び他の組織のメラノサイト系から生じる腫瘍を意味するのに用いられる。本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置し得るメラノーマとしては、例えば、末端部黒子黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫又は表在拡大型黒色腫が挙げられる。

【0116】

「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を引き起こしやすい上皮細胞で形成された悪性の新生物を指す。本明細書で提供される化合物、医薬組成物又は方法で処置し得る例示的な癌腫としては、例えば、髄様甲状腺癌腫、家族性髄様甲状腺癌腫、腺房癌腫、腺癌腫、腺嚢胞癌腫、腺様嚢胞癌腫、癌腫腺腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫、基底細胞性癌腫、類基底細胞癌腫、基底扁平上皮癌腫、細気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原生癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞性癌腫、絨毛膜癌腫、膠様癌腫、コメド癌腫、コーパス癌腫、篩状癌腫、胴甲性癌腫、クタノイム癌腫、円柱状癌腫、円柱細胞性癌腫、腺管癌腫、導管性癌腫、デュラム癌腫、胎生期癌腫、脳様癌腫、エピエルモイド癌腫、上皮腺様癌腫、外方増殖性癌腫、潰瘍性癌腫、線維性癌腫、ゼラチン状癌腫、ゼラチン様癌腫、巨細胞癌腫、巨細胞性癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血液様癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子様癌腫、副腎様癌腫、幼児型胎児性癌腫、原位置癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、クロンペチャー癌腫、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫、レンズ様癌腫、脂肪腫性癌腫、小葉癌腫、リンパ上皮癌腫、骨髄癌腫、髄様癌腫、黒色癌腫、モル癌腫、粘液性癌腫、ミューシパーラム癌腫、粘液細胞癌腫、粘液性類表皮癌腫、粘膜癌腫、粘液癌腫、粘液腫性癌腫、鼻咽頭癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化癌腫、類骨癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫、転移前癌腫、有棘細胞癌腫、髄質様癌腫、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純性癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫、球状細胞癌腫、紡錘体細胞癌腫、海綿状癌腫、鱗状癌腫、扁平上皮癌腫、ストリング癌腫、毛細血管拡張性癌腫、毛細管拡張様癌腫、移行上皮癌腫、結節性癌腫、管状癌腫、結節状癌腫、ゆうぜい癌腫又は絨毛性癌腫が挙げられる。

【0117】

本明細書で使用される場合、「転移」、「転移性」及び「転移性がん」との用語は互換的に使用することができ、ある器官又は別の隣接していない器官又は身体の一部からの増殖性の疾患又は障害（例えば、がん）の広がりを指す。がんは、原発部位、例えば乳房で起こり、この部位は原発腫瘍、例えば原発性乳がんと呼ばれる。原発腫瘍又は原発部位の幾つかのがん細胞は、局所領域の周囲の正常組織に透過して浸潤する能力、及び／又はリンパ系又は血管系（この系を通って体内の他の部位及び組織に循環する）の壁を貫通する能力を、獲得する。原発腫瘍のがん細胞から形成された第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性又は二次性腫瘍と呼ばれる。がん細胞が転移するとき、転移性腫瘍及びこの細胞は、元の腫瘍のものと類似していると推定される。したがって、肺がんが乳房に転移する場合、乳房の部位の二次性腫瘍は、異常な肺細胞からなり、異常な乳房細胞は含まれない。胸部の二次性腫瘍は、転移性肺がんと呼ばれる。したがって、転移性がんという語句は、被験体が原発腫瘍を有しているか又は過去に有しており、１つ以上の二次性腫瘍を有する疾患を指す。非転移性がん又は転移性ではないがんを有する被験体との句は、被験体が原発腫瘍を有するが、１つ以上の二次性腫瘍を有さない疾患を指す。例えば、転移性肺がんとは、原発性肺腫瘍の病歴を有するか、又はこれを有する被験体における疾患及び例えば乳房における第２の位置又は複数の位置に１つ以上の二次的腫瘍を有する疾患を指す。

【0118】

疾患（例えば、糖尿病、がん（例えば、前立腺がん、腎臓がん、転移性がん、メラノーマ、去勢抵抗性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、神経膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮癌（頭部、頸部又は食道）、結腸直腸がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は多発性骨髄腫）に関連する物質又は物質の活性又は機能という内容で、「関連する」又は「と関連する」との用語は、物質又は物質の活性又は機能によって、疾患（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えばメルケル細胞癌）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、メラノーマ、乳がん、神経芽細胞腫）が（全体的又は部分的に）引き起こされるか、又は疾患の症状が（全体的又は部分的に）引き起こされることを意味する。

【0119】

「患者」又は「それを必要とする被験体」は、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物を投与することによって処置することができる疾患又は状態に罹患しているか又はこの傾向がある生物を指す。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ及び他の非哺乳動物が挙げられる。幾つかの実施形態では、患者はヒトである。

【0120】

方法
本明細書で提供される方法は、とりわけ、がんの治療に有用である。複数の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、ＲＯＲ－１を発現するがんの効果的な治療を与える。ある態様では、治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、この方法が、被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）アンタゴニストとを投与することを含む、方法が提供される。

【0121】

別の態様では、治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法が提供される。この方法は、被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とを投与することを含む。

【0122】

「ブルトン型チロシンキナーゼ」との用語は、チロシンタンパク質キナーゼＢＴＫとしても知られており、本明細書で使用される場合、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、又はＢＴＫ活性（例えば、ＢＴＫと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の活性）を維持するその改変体又はホモログの組換え型又は天然に存在する形態のいずれかを指す。幾つかの態様において、改変体又はホモログは、天然に存在するＢＴＫタンパク質と比較して、配列全体又は配列の一部（例えば、５０、１００、１５０又は２００個の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。複数の実施形態では、ＢＴＫタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ０１６８７によって同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、又はこれと実質的な同一性を有する改変体又はホモログである。

【0123】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、低分子である。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、イブルチニブ、イデラリシブ、フォスタマチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９、ＢＧＢ－３１１１又はＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、イブルチニブである。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、イデラリシブである。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、フォスタマチニブである。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、アカラブルチニブである。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９である。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、ＢＧＢ－３１１１である。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、ＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、Ｒ４０６である。

【0124】

本明細書で提供される「ＲＯＲ－１」との用語は、ＲＯＲ－１活性を維持するチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）又はこの改変体又はホモログ（例えば、ＲＯＲ－１と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の活性）の組換え型又は天然に存在する形態のいずれかを指す。幾つかの態様において、改変体又はホモログは、天然に存在するＲＯＲ－１タンパク質と比較して、配列全体又は配列の一部（例えば、５０、１００、１５０又は２００個の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１タンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿００５００３．１によって同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、又はこれと実質的な同一性を有する改変体又はホモログである。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列である。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。

【0125】

ＲＯＲ－１アンタゴニストが抗体である場合には、抗体は、ＲＯＲ－１ポリペプチドに特異的に結合する。したがって、複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、抗ＲＯＲ－１抗体である。複数の実施形態では、抗ＲＯＲ－１抗体は、ヒト化抗体である。

【0126】

抗ＲＯＲ－１抗体は、ＲＯＲ－１ポリペプチドの一部又はそのフラグメントに結合可能なアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ）を含んでいてもよい。したがって、複数の実施形態では、抗体は、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、ヒト化重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示される配列を含み、ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む。

【0127】

複数の実施形態では、抗体は、シルムツズマブである。本明細所で定義されるようなシルムツズマブは、本明細書でＵＣ－９６１又は９９９６１．１とも呼ばれる。シルムツズマブの開発及び構造は、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第１４／４２２，５１９号に開示される。

【0128】

複数の実施形態では、抗体は、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、ヒト化重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に示される配列を含み、ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含む。配列番号７、８、９、１０、１１、１２によって示されるアミノ酸配列（すなわちＣＤＲ）を含む抗体は、本明細書で抗体Ｄ１０と呼ばれることがある。抗体Ｄ１０の開発及び構造は、その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる米国特許第９，２１７，０４０号に開示される。

【0129】

複数の実施形態では、抗体は、ＲＯＲ－１アミノ酸１３０～１６０又はそのフラグメントに結合する。複数の実施形態では、抗体は、ＲＯＲ－１の１３８位に対応する位置にグルタミン酸を含むペプチドに結合する。複数の実施形態では、抗体は、ＲＯＲ－１タンパク質の細胞外ドメインの３’末端又は中央のＩｇ様領域のいずれかに特異的に結合する。複数の実施形態では、抗体は、１～１４７位からのＲＯＲ－１タンパク質の細胞外ドメインのＩｇ様領域の３’末端に結合する。

【0130】

複数の実施形態では、この抗体は、転移を阻害する。複数の実施形態では、この抗体は、抗体フラグメントである。複数の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。複数の実施形態では、抗体は、ヒト化されている。複数の実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。複数の実施形態では、抗体は、一本鎖の軽鎖抗体である。

【0131】

複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５５０ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約６００ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約６５０ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約７００ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約７５０ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約８００ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約８５０ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約９００ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約９５０ｐＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１．５ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約２ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約２．５ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約３ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約３．５ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約４ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約４．５ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５ｎＭ～約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５．５ｎＭ～約６ｎＭである。

【0132】

複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５５０ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが６００ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが６５０ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが７００ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが７５０ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが８００ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが８５０ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが９００ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが９５０ｐＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが１ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが１ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが１．５ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが２ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが２．５ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが３ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが３．５ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが４ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが４．５ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５ｎＭ～６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５．５ｎＭ～６ｎＭである。

【0133】

複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約５．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約４．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約４ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約２．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約２ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約１．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約１ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約９５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約９００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約８５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約８００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約７５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約７００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約６５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約６００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭ～約５５０ｐＭである。

【0134】

複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～５．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～４．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～４ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～２．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～２ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～１．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～１ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～９５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～９００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～８５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～８００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～７５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～７００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～６５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～６００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭ～５５０ｐＭである。

【0135】

複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約６００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが６００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約６５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが６５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約７００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが７００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約７５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが７５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約８００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが８００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約８５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが８５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約９００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが９００ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約９５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが９５０ｐＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが１ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約１．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが１．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約２ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが２ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約２．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが２．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが３ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが３．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約４ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが４ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約４．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが４．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約５．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが５．５ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが約６ｎＭである。複数の実施形態では、抗体は、結合アフィニティが６ｎＭである。

【0136】

複数の実施形態では、抗体は、約４０ｎＭ未満（例えば、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１ｎＭ）のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、４０ｎＭ未満（例えば、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１ｎＭ）のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約３５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、３５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約２５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、２５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約２０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、２０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約１５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、１５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約１０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、１０ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約９ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、９ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約８ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、８ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約７ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、７ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約６ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、６ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約４ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、４ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約３ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、３ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約２ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、２ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約１ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、１ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約０．５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、０．５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約０．２５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、０．２５ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、約０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。複数の実施形態では、抗体は、０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでＲＯＲ－１タンパク質に結合する。

【0137】

複数の実施形態では、抗体は、シルムツズマブであり、本明細書では、９９９６１．１又はＵＣ－９６１とも呼ばれる。複数の実施形態では、抗体は、Ｄ１０である。

【0138】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとが、組み合わせた相乗的な量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とが、組み合わせた相乗的な量で投与される。「組み合わせた相乗的な量」は、本明細書で使用される場合、相乗効果（すなわち、相加効果よりも大きな効果）をもたらす第１の量（例えば、ＢＴＫアンタゴニストの量）と第２の量（例えば、ＲＯＲ－１アンタゴニストの量）との合計を指す。したがって、「シナジー」、「相乗作用」、「相乗的な」、「組み合わせた相乗的な量」及び「相乗的な治療効果」との用語は、相互に置き換え可能に用いられ、組み合わせて投与された化合物の測定された効果を指し、測定された効果は、単一薬剤として単独で投与されたそれぞれの化合物の個々の効果の合計よりも大きい。

【0139】

複数の実施形態では、相乗的な量は、ＲＯＲ－１アンタゴニストとは別個に使用されるときのＢＴＫアンタゴニストの量の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％であってもよい。複数の実施形態では、相乗的な量は、ＢＴＫアンタゴニストとは別個に使用されるときのＲＯＲ－１アンタゴニストの量の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％であってもよい。

【0140】

相乗効果は、ＢＴＫ活性を減らす効果及び／又はＲＯＲ－１活性を減らす効果であってもよい。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとの間のシナジーによって、個々に単独に使用するときのＢＴＫアンタゴニストの減少又はＲＯＲ－１アンタゴニストの減少の合計よりも、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％、又はもっと多くの減少（例えば、ＢＴＫ活性の減少又はＲＯＲ－１活性の減少）をもたらしてもよい。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとの間のシナジーによって、個々に単独に使用するときのＢＴＫアンタゴニスト又はＲＯＲ－１アンタゴニストの阻害の合計よりも、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％、又はもっと多くのＢＴＫタンパク質及び／又はＲＯＲ－１タンパク質の阻害をもたらしてもよい。

【0141】

相乗効果は、がんを治療する効果、例えば、リンパ腫（すなわち、リンパ腫を治療する相乗効果）、白血病（すなわち、白血病を治療する相乗効果）、骨髄腫（すなわち、骨髄腫を治療する相乗効果）、ＡＭＬ（すなわち、ＡＭＬを治療する相乗効果）、Ｂ－ＡＬＬ（すなわち、Ｂ－ＡＬＬを治療する相乗効果）、Ｔ－ＡＬＬ（すなわち、Ｔ－ＡＬＬを治療する相乗効果）、腎細胞癌腫（すなわち、腎細胞癌腫を治療する相乗効果）、結腸がん（すなわち、結腸がんを治療する相乗効果）、結腸直腸がん（すなわち、結腸直腸がんを治療する相乗効果）、乳がん（すなわち、乳がんを治療する相乗効果）、扁平上皮細胞がん（すなわち、扁平上皮細胞がんを治療する相乗効果）、メラノーマ（すなわち、メラノーマを治療する相乗効果）、胃がん（すなわち、胃がんを治療する相乗効果）、脳がん（すなわち、脳がんを治療する相乗効果）、肺がん（すなわち、肺がんを治療する相乗効果）、膵臓がん（すなわち、膵臓がんを治療する相乗効果）、子宮頸がん（すなわち、子宮頸がんを治療する相乗効果）、卵巣がん（すなわち、卵巣がんを治療する相乗効果）、肝臓がん（すなわち、肝臓がんを治療する相乗効果）、膀胱がん（すなわち、膀胱がんを治療する相乗効果）、前立腺がん（すなわち、前立腺がんを治療する相乗効果）、精巣がん（すなわち、精巣がんを治療する相乗効果）、甲状腺がん（すなわち、甲状腺がんを治療する相乗効果）、頭頸部がん（すなわち、頭頸部がんを治療する相乗効果）、子宮がん（すなわち、子宮がんを治療する相乗効果）、腺がん（すなわち、腺がんを治療する相乗効果）、副腎がん（すなわち、副腎がんを治療する相乗効果）、慢性リンパ性白血病（すなわち、慢性リンパ性白血病を治療する相乗効果）、小リンパ球性リンパ腫（すなわち、小リンパ球性リンパ腫を治療する相乗効果）、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫（すなわち、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫を治療する相乗効果）、バーキットリンパ腫（すなわち、バーキットリンパ腫を治療する相乗効果）及びＢ細胞白血病（すなわち、Ｂ細胞白血病を治療する相乗効果）を治療する効果であってもよい。

【0142】

ＢＴＫアンタゴニスト及びＲＯＲ－１アンタゴニストは、同時に（例えば混合物として）、別個ではあるが同時に（例えば、別個の静脈ラインを介して）、又は順次（例えば、一方の薬剤が最初に投与され、その後、第２の薬剤が投与される）、組み合わせて投与されてもよい。したがって、組み合わせとの用語は、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストの併用、同時投与又は逐次投与を指すために使用される。

【0143】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、同時に投与されるか、又は順次投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、同時に投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、順次投与される。一連の治療の間、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、所定の時間に順次投与され、他の時間に同時に投与されてもよい。

【0144】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとが順次投与される場合、ＲＯＲ－１アンタゴニストが、第１の時間点に投与され、ＢＴＫアンタゴニストが、第２の時間点に投与され、第１の時間点が、第２の時間点より前である。又は、複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとが順次投与される場合、ＢＴＫアンタゴニストが、第１の時間点に投与され、ＲＯＲ－１アンタゴニストが、第２の時間点に投与され、第１の時間点が、第２の時間点より前である。

【0145】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とは、同時に投与されるか、又は順次投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とは、同時に投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とは、順次投与される。一連の治療の間、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とは、所定の時間に順次投与され、他の時間に同時に投与されてもよい。

【0146】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とが順次投与される場合、抗ＲＯＲ－１抗体が、第１の時間点に投与され、ＢＴＫアンタゴニストが、第２の時間点に投与され、第１の時間点が、第２の時間点より前である。又は、複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とが順次投与される場合、ＢＴＫアンタゴニストが、第１の時間点に投与され、抗ＲＯＲ－１抗体が、第２の時間点に投与され、第１の時間点が、第２の時間点より前である。

【0147】

処置の経過は、被験体の特定の特徴及び選択された処置の種類に応じて、個々の基準で最もよく決定される。本明細書に開示されているような処置は、毎日、１日に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、又は治療に有効な任意の適用可能な回数で被験体に投与することができる。処置は、単独で、又は本明細書に開示されるか、又は当技術分野で公知の他の処置と組み合わせて投与されてもよい。さらなる処置は、第１の処置と同時に、異なる時間に、又は全く異なる治療スケジュールで（例えば、第１の処置は毎日であってもよく、さらなる処置は週に１回）投与することができる。

【0148】

ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとが同時に投与される場合、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、混合物として投与されてもよい。したがって、複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとは、投与の前に混合される。

【0149】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約２ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、２ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、１５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約４２０ｍｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、４２０ｍｇの量で投与される。

【0150】

複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約２ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、２ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約３ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、３ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。

【0151】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約２ｍｇ／ｋｇで投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、２ｍｇ／ｋｇで投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約１ｍｇ／ｋｇで投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、１ｍｇ／ｋｇで投与される。

【0152】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１４日間（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５又は５０日間）にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１５日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１６日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１７日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１８日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも１９日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２０日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２１日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２２日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２３日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２４日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２５日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２６日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２７日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２８日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも２９日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３０日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３１日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３２日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３３日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３４日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも３５日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも４０日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも４５日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、少なくとも５０日間にわたって投与される。

【0153】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、約２８日間にわたって投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、毎日、２８日間にわたって投与される。

【0154】

複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、約２８日間にわたって１回投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、２８日間にわたって１回投与される。

【0155】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストは、静脈内投与される。複数の実施形態では、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、静脈内投与される。

【0156】

複数の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。複数の実施形態では、被験体は、ヒトである。

【0157】

上述の通り、本明細書で提供される方法及び組成物は、その実施形態を含め、がんの治療に有用であり、具体的には、ＲＯＲ－１を発現するがんの治療に有用である。複数の実施形態では、がんは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、ＡＭＬ、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、腎細胞癌腫、結腸がん、結腸直腸がん、乳がん、扁平上皮細胞がん、メラノーマ、胃がん、脳がん、肺がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、頭頸部がん、子宮がん、腺癌又は副腎がんである。複数の実施形態では、がんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫又はＢ細胞白血病である。

【0158】

その実施形態を含めて本明細書で提供されるＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストの投与される組み合わせは、変動してもよい。例えば、具体的なＢＴＫアンタゴニスト（例えば、イブルチニブ）が、具体的なＲＯＲ－１アンタゴニスト（例えば、シルムツズマブ）と組み合わせて投与されてもよい。したがって、複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるイデラリシブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるフォスタマチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるアカラブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるＯＮＯ／ＧＳ－４０５９は、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるＢＧＢ－３１１１は、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）は、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストであるＲ４０６は、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与される。

【0159】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0160】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0161】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0162】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0163】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0164】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0165】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0166】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0167】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0168】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0169】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0170】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0171】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0172】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0173】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0174】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0175】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0176】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0177】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0178】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0179】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0180】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0181】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0182】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0183】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、１５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0184】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、４２０ｍｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0185】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、４２０ｍｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、２ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0186】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、４２０ｍｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0187】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、４２０ｍｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、５ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0188】

複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストイブルチニブは、ＲＯＲ－１アンタゴニストであるシルムツズマブと組み合わせて投与され、イブルチニブは、４２０ｍｇの量で静脈内投与され、シルムツズマブは、１０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与される。さらなる一実施形態では、イブルチニブは、毎日、２８日間にわたって投与され、シルムツズマブは、２８日間にわたって１回投与される。

【0189】

医薬組成物
本明細書で提供されるＢＴＫアンタゴニストとＲＯＲ－１アンタゴニストとを含む組成物は、その実施形態を含め、さらに医薬組成物として想定される。したがって、ある態様では、ＢＴＫアンタゴニストと、ＲＯＲ－１アンタゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。

【0190】

別の態様では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストと、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。複数の実施形態では、ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体は、組み合わせた相乗的な量で存在し、組み合わせた相乗的な量は、治療を必要とする被験体においてがんを治療するのに有効である。

【0191】

本明細書で提供される医薬組成物に含まれるＢＴＫアンタゴニスト及びＲＯＲ－１アンタゴニストは、その実施形態を含めて本明細書に記載されるＢＴＫアンタゴニスト及び／又はＲＯＲ－１アンタゴニストのいずれか１つであってもよい。例えば、ＢＴＫアンタゴニストは、イブルチニブであってもよく、ＲＯＲ－１アンタゴニストは、シルムツズマブであってもよい。同様に、本明細書で提供される医薬組成物は、ＢＴＫアンタゴニスト及びＲＯＲ－１アンタゴニストの投与される量が、本明細書に記載される量のいずれか１であるように配合されてもよい。例えば、イブルチニブは、組成物の投与によって、約５ｍｇ／ｋｇ又は４２０ｍｇの投薬量が得られるような量で存在していてもよく、シルムツズマブは、約２ｍｇ／ｋｇの投薬量が得られる量で存在していてもよい。

【0192】

提供される組成物は、とりわけ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの処方及び投与に適している。適切な担体及び賦形剤並びにこれらの製剤は、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ編集、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的に又は他の点で、望ましくないものではない物質を意味する。すなわち、この物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こさずに、又はこれが含まれる医薬組成物の他の成分と有害な様式で相互作用をせずに、被験体に投与される。被験体に投与される場合、担体は、任意選択的に、活性成分の分解を最小限にし、被験体における有害な副作用を最小限に抑えるように、任意に選択される。

【0193】

本発明によって提供される医薬組成物は、活性成分（例えば、実施形態又は実施例を含む本明細書に記載の組成物）が治療に有効な量、すなわち意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。特定の用途に有効な実際の量は、とりわけ、処置される状態に依存する。疾患を処置するための方法において投与される場合、本明細書に記載の組換えタンパク質は、所望の結果（例えば、標的分子の活性を調節し、及び／又は疾患の症状の進行を低減するか、なくすか、又は遅らせる）を達成するために有効な量の活性成分を含むだろう。本発明の化合物の治療に有効な量の決定は、特に本明細書の詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0194】

提供される組成物は、単一の薬剤又は複数の薬剤を含むことができる。投与のための組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した、本明細書に記載の薬剤を含む。種々の水性担体、例えば緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌されてもよい。組成物は、適切な生理学的条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及びバッファー、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてもよい。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は様々に変化してもよく、選択される特定の投与様式及び被験体の必要性に応じて、主として体液量、粘度、体重などに基づいて選択される。

【0195】

遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、及び油中で調製することもできる。通常の貯蔵条件及び使用条件で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含んでいてもよい。

【0196】

医薬組成物は、鼻腔内用又は吸入可能な溶液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤によって送達することができる。鼻用溶液は、点鼻又はスプレーで鼻腔に投与されるように設計された水溶液であってもよい。鼻用溶液は、鼻の分泌物と多くの点で似ているように調製することができる。したがって、鼻用水溶液は、通常、等張性であり、５．５から６．５のｐＨを維持するために、わずかに緩衝化される。さらに、必要に応じて、眼用製剤及び適切な薬物安定剤に使用されるものと同様の抗菌防腐剤が、製剤に含まれていてもよい。様々な市販の鼻用製剤が知られており、例えば、抗生物質及び抗ヒスタミン剤を含んでいてもよい。

【0197】

経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤又は散剤の形態をとる。幾つかの実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体を含むか、又は硬質又は軟質ゼラチンカプセルに封入されてもよく、又は錠剤に圧縮してもよく、又は食用の食べ物に直接組み込まれてもよい。経口治療用投与の場合、活性化合物は賦形剤と共に組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハースなどの形態で使用されてもよい。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。組成物及び製剤のパーセントは、もちろん変えることができ、便宜的に単位重量の約２から約７５％、好ましくは２５～６０％の間であってもよい。このような組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。

【0198】

例えば、水溶液での非経口投与のためには、溶液は適切に緩衝化され、液体希釈剤はまず十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされるべきである。水溶液、特に滅菌水性媒体は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の投与に特に適している。例えば、１回の投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、又は提案された注入部位に注入することができる。

【0199】

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物又は構築物を適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。有効成分と任意の追加の所望な成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥技術を用い、滅菌注射溶液を再構築するための滅菌粉末を調製することができる。直接注射のために、さらに濃縮された、又は高度に濃縮された溶液の調製も想定されている。ＤＭＳＯは、非常に迅速な透過のための溶媒として使用することができ、高濃度の活性薬剤を小さな面積に送達する。

【0200】

化合物の製剤は、アンプル及びバイアルのような単位用量又は複数用量の密封容器で提供することができる。したがって、組成物は単位剤形であってもよい。このような形態では、製剤は、適切な量の活性成分を含む単位用量に細分される。したがって、組成物は、投与方法に依存して種々の単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形には、粉末、錠剤、丸薬、カプセル及びロゼンジが含まれるが、これらに限定されない。

【0201】

哺乳動物に投与される投与量及び頻度（単回投与又は複数回投与）は、種々の因子、例えば当該哺乳動物が別の疾患に罹患しているかどうか及び投与経路；レシピエントの大きさ、年齢、性別、健康、体重、体格指数、ボディマス指数及び食事；治療される疾患の症状の性質及び程度（例えば、がんの症状及びこのような症状の重篤度）；同時治療の種類、治療される疾患による合併症又は他の健康関連の問題に依存して、様々であってもよい。他の治療計画又は薬剤を、本発明の方法及び化合物と共に使用することができる。確立された投与量（例えば、頻度及び持続時間）の調節及び操作は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0202】

本明細書に記載される任意の組成物（例えば、提供される細胞透過性コンジュゲート）について、治療に有効な量は、細胞培養アッセイから最初に決定することができる。目標濃度は、本明細書に記載の方法を用いて測定するか、又は当技術分野で公知の方法を用いて測定したとき、本明細書に記載の方法を達成することができる活性化合物の濃度である。当技術分野で周知のように、ヒトにおける使用のための有効な量は、動物モデルから決定することもできる。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であることがわかっている濃度を達成するように製剤化することができる。ヒトの用量は、有効性をモニタリングし、上述のように用量を上側又は下側に調節することによって調整することができる。上述の方法及び他の方法に基づいてヒトにおいて最大の効能を達成するために用量を調節することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0203】

投与量は、患者及び使用される化合物の要求に応じて変わり得る。本発明の文脈において患者に投与される用量は、時間の経過と共に患者における有益な治療応答に影響を及ぼすのに十分な量であるべきである。用量の大きさは、有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。特定の状況のための適切な投与量の決定は、医師の技能の範囲内である。一般に、処置は、化合物の最適用量よりも低い、より少ない用量で開始される。その後、状況の下で最適な効果に達するまで、用量を少しずつ増加させる。

【0204】

投与量及び間隔は、処置される特定の臨床適応症に有効な投与化合物のレベルを提供するために、個々に調整することができる。これにより、個体の疾患状態の重篤度に見合った治療計画を提供する。

【0205】

本明細書で提供される教示を利用して、実質的な毒性を引き起こさず、しかも特定の患者によって示された臨床症状を処置するのに有効であるような、有効な予防的又は治療的処置計画を計画することができる。この計画には、化合物の効力、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の存在及び重症度などの要因を考慮して、活性化合物の慎重な選択が必要である。

【0206】

「薬学的に許容される賦形剤」及び「薬学的に許容される担体」は、被験体に対する有効な薬剤の投与及び被験体による吸収を助け、患者に重大で有害な毒性作用を引き起こさずに、本発明の組成物に含めることができる物質を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、水、ＮａＣｌ、通常の生理食塩水、乳酸Ｒｉｎｇｅｒ液、通常のショ糖、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、甘味料、風味剤、塩溶液（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ液）、アルコール、油、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン及び色素などが挙げられる。このような製剤は、滅菌され、必要に応じて、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、バッファー、着色剤及び／又は芳香物質などの本発明の化合物と有害な反応を起こさない補助剤と混合されてもよい。当業者は、他の医薬賦形剤が本発明において有用であることを認識するであろう。

【0207】

「薬学的に許容される塩」との用語は、当技術分野で周知の様々な有機及び無機の対イオンから誘導される塩を指し、単なる例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどを含み、分子が塩基性官能基を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機又は無機酸の塩が挙げられる。

【0208】

「調製」との用語は、担体としてカプセル化材料を用い、活性成分が他の担体を伴って、又は伴わずに、活性成分が担体に囲まれ、これにより担体と会合するカプセルを与える、活性化合物の製剤を含むことを意図している。同様に、カシェ剤及びロゼンジ剤も含まれる。錠剤、散剤、カプセル、丸剤、カシェ剤及びロゼンジ剤は、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。

【0209】

複数の実施形態では、医薬組成物は、イブルチニブと、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、イデラリシブと、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、フォスタマチニブと、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、アカラブルチニブと、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９と、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、ＢＧＢ－３１１１と、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、ＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）と、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。複数の実施形態では、医薬組成物は、Ｒ４０６と、シルムツズマブと、薬学的に許容される賦形剤とからなる。

【0210】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【0211】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【0212】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【0213】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【0214】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量１５ｍｇ／ｋｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【0215】

複数の実施形態では、医薬組成物は、用量４２０ｍｇに相当する量のイブルチニブと、用量１ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量４２０ｍｇに相当する量のイブルチニブと、用量２ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量４２０ｍｇに相当する量のイブルチニブと、用量３ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量４２０ｍｇに相当する量のイブルチニブと、用量５ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、用量４２０ｍｇに相当する量のイブルチニブと、用量１０ｍｇ／ｋｇに相当する量のシルムツズマブとを含む。

【実施例0216】

ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）シグナル伝達によるシグナル伝達は、疾患、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の発病及び／又は進行において、役割を果たすと考えられる。ＣＬＬ生物学におけるこのカスケードの重要性は、ＢＣＲシグナル伝達を遮断することを意図する低分子キナーゼ阻害剤を用いた臨床的活性を示す臨床試験によって明確にされるようである。しかし、ＢＣＲシグナル伝達を遮断することを意図したほとんど全ての阻害剤は、完全応答（ＣＲ）を有することができず、このことは、ＢＣＲシグナル伝達を相殺する他の機構が、ＢＣＲシグナル伝達を用いた治療跡のＣＬＬのＣＲに関与し得ることを示唆している。出願人らは、特に、ＲＯＲ－１（ＣＬＬの生存シグナル）が阻害剤によって誘発され、この効果の主要因となり得ることを発見した。

【0217】

受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を有する患者からのリンパ腫及び白血病細胞の細胞表面で発現するが、正常なＢ細胞又は他の産後組織では発現しない、がん胚細胞抗原である。ＲＯＲ－１に対するリガンドＷｎｔ５ａの結合によって、グアニン交換因子（ＧＥＦ）の動員が起こり、Ｒａｃ１及びＲｈｏＡを活性化し、疾患に関連する化学走性及び増殖を促進する。ＢＴＫＢＴＫ及びＲＯＲ－１の同時阻害を用いたＢＣＲ及びＲＯＲ－１シグナル伝達経路の標的化は、まだ報告されていない。ここに提示される研究は、原発性ＣＬＬサンプルにおいて、新規及び選択的な抗ＲＯＲ－１抗体シルムツズマブと合わせたイブルチニブの活性を評価した。ＢＴＫ阻害剤及び抗ＲＯＲ－１抗体を両方用いる治療は、単一薬剤のみを用いた治療と比較すると、ＣＬＬ細胞の生存率をさらに下げ、組み合わせると、さらに破壊されたリガンドがシグナル伝達を誘発するため、相乗的な成長阻害を誘発した。ここで、これらのキナーゼの同時標的化は、臨床的活性を顕著に高めるだろう。

【0218】

さらに、抗ＲＯＲ－１とイブルチニブの組み合わせ治療を用いて観察された、高められた効能は、予想されない便益であった。具体的には、イブルチニブと、細胞が介在する抗主要反応性を示す抗ＣＤ２０抗体とを組み合わせても、この高められた効能は示さなかった。実際に、イブルチニブが、ＣＤ２０の活性を妨害することが示された。

【0219】

［実施例１］
慢性リンパ性白血病の治療のためのシルムツズマブ（ＵＣ－９６１）とイブルチニブとの組み合わせ
概要
イブルチニブは、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を可逆的に阻害する低分子であり、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達を遮断することによって慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者における効能を示すが、完全応答（ＣＲ）又は長期寛解は誘発しない。ＲＴＫ様オーファン受容体－１（ＲＯＲ－１）は、Ｗｎｔ５ａのための受容体であり、ＣＬＬ進行における非標準的なＷｎｔシグナル伝達において重要な役割を果たす。この試験では、出願人らは、ＣＬＬ細胞においてＷｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達が介在する活性に対するイブルチニブの効果を試験した。出願人らは、Ｗｎｔ５ａが、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｒａｃ１活性化を誘発することができるが、イブルチニブ処理は、Ｗｎｔ５ａ非存在下でＣＬＬ増殖を阻害することができる（これは、Ｗｎｔ５ａ刺激によって反転した）ことを、発見した。このような効果は、ヒト化抗ＲＯＲ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、シルムツズマブ（ＵＣ－９６１）によって遮断された。さらに、ＵＣ－９６１とイブルチニブとを用いる組み合わせ治療は、ＣＬＬ増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで顕著に阻害し、そしてＲＯＲ－１＋白血病細胞の生着をｉｎ ｖｉｖｏで顕著に阻害し、これは、それぞれの薬剤単独よりも効果的であった。この試験の結果は、ＣＬＬ及び他のＲＯＲ－１を発現するＢ細胞腫瘍を有する患者のための治療としてＵＣ－９６１とイブルチニブを合わせるための論理的根拠を与える。

【0220】

緒言
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介するシグナル伝達は、ＣＬＬの発病及び進行に重要な役割を果たす。ＢＣＲの架橋によって、ＣＤ７９ａ／ｂ及びＳｒｃファミリーキナーゼＬＹＮのリン酸化が起こり、チロシンキナーゼＳｙｋの動員及び活性化が起こり、下流のシグナル伝達事象のカスケードを誘発し、Ｂ細胞の生存を高める。ＣＬＬ生物学におけるこのカスケードの重要性は、ＢＣＲシグナル伝達にとって重要である、Ｓｙｋ、Ａｋｔ及びＢＴＫなどのキナーゼの低分子阻害時の治療効果によって明確にされるようである。イブルチニブは、ＢＴＫの阻害剤であり、治療を無期限に続けている限り、大部分の患者において長期臨床応答を誘発することができる。しかし、大部分の患者は、一般的に、部分応答（ＰＲ）のみを達成する。さらに、患者は、実際には、決して完全応答（ＣＲ）を達成せず、延長された単剤薬剤治療の後でさえ、検出可能な最小残留疾患（ＭＲＤ）を欠く。

【0221】

イブルチニブが深いＣＲを達成することができないことは、ＢＴＫの阻害剤によって遮断されない代替的な生存シグナル伝達経路の存在に起因するものであろう。このような経路の１つは、ＲＯＲ－１を介するシグナル伝達によって誘発されるものであり、がん胚性抗原は、ＣＬＬ細胞上で発現するが、正常な産後組織では発現しない。出願人らは、ＲＯＲ－１が、Ｗｎｔ５ａの受容体として働くことができ、これは、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｃ１）の活性化を導く非標準的なＷｎｔシグナル伝達を誘発し、そして白血病細胞の増殖及び生存を高めることができることを、発見した。Ｗｎｔ５ａによるＲａｃ１の活性化は、ＣＬＬ患者の臨床試験において現在評価を行っているファーストインクラスのヒト化モノクローナル抗体である抗ＲＯＲ－１ ｍＡｂ（ＵＣ－９６１）によって阻害することができた。

【0222】

この試験では、出願人らは、ＢＣＲシグナル伝達阻害剤イブルチニブ存在下でのＷｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達を観察し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＣＬＬ治療のために、イブルチニブとヒト化抗ＲＯＲ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、シルムツズマブ（ＵＣ－９６１）の組み合わせ効果を調べた。

【0223】

結果
ＵＣ－９６１は、イブルチニブ存在下、ＣＬＬ細胞におけるＷｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する。Ｗｎｔ５ａは、ＣＬＬ細胞を含めた種々の細胞型において、Ｒａｃ１の活性化を誘発することができる。出願人らは、イブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａがＲａｃ１活性化を誘発することができるかどうかを評価した。このために、出願人らは、ＣＬＬ細胞を、イブルチニブを用い、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度で２時間処理し、次いで、この細胞を外因性Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した。イムノブロット分析は、Ｗｎｔ５ａを用いた処理が、Ｒａｃ１活性化を誘発し、このような活性化を、超生理学的であると考えられる濃度であり、ＢＴＫ占有率１００％を生じ、以前の報告と一致している（図６Ｂ）１μＭの濃度であってもイブルチニブによって遮断することができない（図６Ａ）ことを示した。さらに、０．２５μＭ程度の低いイブルチニブの濃度は、抗μを用いたＢＣＲ結合によって誘発されるカルシウムの流れを完全に阻害し（図Ｓ１１Ｃ）、実際にＣＬＬ細胞生存率に影響を与えることはない（図６Ｄ）。

【0224】

ＣＬＬ患者血漿におけるイブルチニブの最大濃度は、約０．５μＭである。このように、出願人らは、ＣＬＬ細胞を、その後の試験で０．５μＭのイブルチニブで処理した。出願人らは、ＵＣ－９６１を用い、又は用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を試験した。出願人らは、ＣＬＬ細胞を、イブルチニブ、ＵＣ－９６１、又はイブルチニブとＵＣ－９６１の組み合わせで２時間前処理し、次いで、この細胞を、Ｗｎｔ５ａ組換えタンパク質を用い、又は用いずに３０分間処理した。イブルチニブは、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害しなかったが、ＵＣ－９６１の処理は、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を、外因性Ｗｎｔ５ａを用いて処理しなかったＣＬＬ細胞で観察されるＲａｃ１活性化に匹敵するレベルまで減少させた（図１Ａ～１Ｂ）。さらに、ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせは、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１も基底レベルまで阻害した（図１Ａ～１Ｂ）。

【0225】

出願人らは、イブルチニブを用いた治療を受けている患者のＣＬＬ細胞をＷｎｔ５ａで刺激することができるかどうかを調べた。このために、血液単核細胞を、４２０ｍｇ ＱＤの標準的な治療用量でイブルチニブを用いた治療を受けている患者から集めた。単離されたＣＬＬ細胞を、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＵＣ－９６１を用い、又は用いずにインキュベートした。ウェスタンブロット分析は、Ｗｎｔ５ａが、これらの患者に由来するＣＬＬ細胞においてＲａｃ１活性化を誘発し、一方、ＵＣ－９６１のインキュベートは、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害したことを示した；活性Ｒａｃ１のレベルは、治療を行っていないサンプルのレベルと同様であった（図１Ｃ～１Ｄ）。これらの結果は、イブルチニブが、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害しないことを示す。

【0226】

ＵＣ－９６１は、イブルチニブ存在下、ＣＬＬ細胞のＷｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。Ｒａｃ１－ＧＴＰａｓｅの活性化は、増殖を高めることができる。出願人らは、外因性インターロイキン（ＩＬ）－４及びＩＬ－１０存在下、ＣＤ１５４を発現する細胞（ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}）と共培養することによって、ＣＬＬ細胞の増殖を誘発した。このような培養物に外因性Ｗｎｔ５ａを添加すると、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された細胞の蛍光強度から推定される細胞分裂率が顕著に高まった。この効果は、ＵＣ－９６１によって阻害することができた（図２Ａ）。対照的に、野生型ＨｅＬａ細胞と共培養したＣＬＬ細胞は、ＩＬ－４／１０及び／又はＷｎｔ５ａ存在下でさえ、増殖を誘発しなかった（図７Ａ～７Ｂ）。出願人らの結果は、Ｗｎｔ５ａによって誘発される増殖を、ＵＣ－９６１によって、Ｗｎｔ５ａを用いない培養物で観察されるものと匹敵するレベルまで阻害することができることを示した。イブルチニブを用いた処理は、ＣＤ１５４によって誘発されるＣＬＬ細胞増殖を阻害することができた。しかし、外因性Ｗｎｔ５ａは、イブルチニブ存在下で細胞分裂の割合も高めることができ（図２Ａ）、このことはＵＣ－９６１によって阻害することができた（図２Ａ）。異なる患者（Ｎ＝６）のＣＬＬ細胞を用い、同じ効果が観察された（図２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＵＣ－９６１が、イブルチニブを用いた処理によって影響を受けず、Ｗｎｔ５ａシグナル伝達を遮断することができたことを示す。

【0227】

ＣＬＬ患者に由来する異種移植におけるＵＣ－９６１とイブルチニブの組み合わせ。出願人らは、免疫欠損Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスの腹膜腔にＣＬＬを移植し、異種移植を生成した。出願人らは、ＵＣ－９６１とイブルチニブの組み合わせが、このような異種移植においてＣＬＬ細胞を激減させる能力を試験した。このために、出願人らは、ＡＩＭ－Ｖ培地中の１×１０^７個の生存可能な原発性ＣＬＬ細胞を、各マウスの腹膜腔に注射した。１日後、マウスは、未処理であったか、又は毎日、１５ｍｇ／ｋｇの用量のイブルチニブを経口摂取によって与えられ、及び／又はＵＣ－９６１を１ｍｇ／ｋｇで１回与えられた。７日後に、ＣＬＬ細胞を腹膜洗浄（ＰＬ）によって集め、フローサイトメトリーによって試験した。ＰＬあたり計算されたＣＬＬ細胞数は、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理したマウス群において、コントロールの処理未処理マウスから集めた数よりも有意に少なかった。しかし、ＵＣ－９６１及びイブルチニブの両方で処理した動物は、単剤薬剤イブルチニブ又はＵＣ－９６１で処理したものを含め、それぞれの他の群よりも、ＰＬあたりのＣＬＬ細胞を顕著に減らした（図３）。これらのデータは、この異種移植モデルにおいて、白血病細胞の激減における、イブルチニブに対するＵＣ－９６１の相加効果を示す。

【0228】

ＵＣ－９６１は、イブルチニブ存在下、Ｗｎｔ５ａによって高められたＲａｃ１活性化と、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の増殖を阻害する。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を、白血病が進行したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１二重トランスジェニックマウスから単離した。出願人らは、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を、イブルチニブ又はＵＣ－９６１で２時間前処理し、次いで、この細胞を、Ｗｎｔ５ａ組換えタンパク質を用い、又は用いずに３０分間処理した。ヒトＣＬＬ細胞を用いた出願人らの知見と同様に、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化は、ＵＣ－９６１によって阻害することができたが、イブルチニブによっては阻害することができなかった（図４Ａ～４Ｂ）。ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせもまた、Ｒａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発される活性化を基底レベルまで阻害した（図４Ａ～４Ｂ）。しかし、Ｗｎｔ５ａ治療は、ＲＯＲ－１の発現を欠く単一のトランスジェニックＴＣＬ１マウスに由来する白血病細胞においてＲａｃ１活性化を誘発することができなかった（図８Ａ）。

【0229】

再び、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を、外因性ＩＬ－４及びＩＬ－１０存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}と共に培養すると増殖を誘発することができた。外因性Ｗｎｔ５ａ処理の添加は、ＣＦＳＥで標識された細胞の蛍光から推定することができる細胞分裂率と細胞分裂数とを顕著に高めた（図４Ｃ～４Ｄ）。ヒトＣＬＬ細胞と同様に、野生型ＨｅＬａ細胞と共培養したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞は、ＩＬ－４／１０及び／又はＷｎｔ５ａ存在下でさえ、増殖を誘発しなかった（図８Ｂ）。イブルチニブを用いた治療は、ＣＤ１５４によって誘発されるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖を部分的に阻害することができた。ＵＣ－９６１は、イブルチニブなしで、ＣＤ１５４及びＩＬ－４／１０に応答して、Ｗｎｔ５ａがＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖を高める能力を阻害することができなかった（図４Ｃ～４Ｄ）。一方、Ｗｎｔ５ａは、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞及びＩＬ－４／１０と共培養されたＲＯＲ－１陰性のＴＣＬ１－白血病細胞の増殖を高めなかった。

【0230】

ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病を生着したマウスにおけるＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせ
出願人らは、ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせが、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおいて、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋）の生着を阻害する能力を調べた。出願人らは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに、各２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、この動物を、１５、５、１．６７ｍｇ／ｋｇのイブルチニブで毎日、又は一回用量が１０、３、１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を用いて処理した。２５日後に、動物を屠殺し、脾臓を調べた。イブルチニブ及びＵＣ－９６１は、用量依存性の様式で、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の増殖を阻害した。出願人らは、組み合わせ試験のために、１ｍｇ／ｋｇの単回用量のＵＣ－９６１と５ｍｇ／ｋｇの１日用量のイブルチニブとを選択した。ＵＣ－９６１又はイブルチニブ単独で処理されたマウスは、処理を行わなかった同腹子よりも顕著に小さな脾臓を有しており、ＵＣ－９６１とイブルチニブの併用処理によって、脾臓の大きさが最大限小さくなった（図５Ａ）。出願人らは、フローサイトメトリーを介し、脾臓におけるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の割合を調べた（図５Ｂ）。脾臓あたりのＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞のパーセント及び全細胞数は、処理を受けなかったマウスと比較して、ＵＣ－９６１又はイブルチニブで処理されたマウスにおいて、顕著に低かった。しかし、ＵＣ－９６１及びイブルチニブの両方で処理した動物は、単剤薬剤イブルチニブ又はＵＣ－９６１で処理したものを含め、それぞれの他の群よりも、脾臓あたりのＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を顕著に減らした（図５Ｃ）。

【0231】

考察
ＣＬＬは、リンパ節（ＬＮ）及び骨髄（ＢＭ）などの組織区画で増殖する、モノクローナル成熟ＣＤ５^＋Ｂ細胞の増殖によって特徴付けられる。腫瘍増殖の違いは、おそらく、ＣＬＬの異種性臨床経路の主要因であり、悪性リンパ球間の遺伝的違いと腫瘍増殖を引き起こす外的シグナルの活性とを反映している。ＣＬＬ細胞は、細胞との相互作用、増殖及び生存のために腫瘍微細環境に存在する可溶性因子に依存する。ｉｎ ｖｉｖｏでＣＬＬの増殖及び生存を補助し得る経路の中で、ＢＣＲシグナル伝達は、重要な１つのようである。ＢＴＫは、ＢＣＲシグナル伝達に関与し、ＣＬＬ進行の多くの態様にとって必要である。この試験において、出願人らは、イブルチニブの処理によって、ＢＴＫが１００％阻害され、ＩｇＭによって誘発されるＢＣＲシグナル伝達（例えば、カルシウムの流れ）を阻害し、ＣＤ１５４が介在するＣＬＬ増殖を減らすことを示した。

【0232】

細胞の経路は、高速道路よりも多くの同様のネットワークを操作する。がんは、多様な病的シグナル伝達遺伝子制御機構を使用し、その生存、増殖、悪性表現型を促進する。出願人らは、ＲＯＲ－１がＣＬＬ中で発現し、ＣＬＬ進行に寄与することを報告している。この機能的試験から、ＲＯＲ－１のリガンドであるＷｎｔ５ａは、ＲＯＲ－１を刺激してＣＬＬ細胞においてＲａｃ１を活性化すること、及びＷｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達がＣＬＬ進行にとって重要であることがわかった。出願人らは、Ｒａｃ１活性化及びＣＬＬ増殖にとって重要であることが示されているＷｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達の機能に対するイブルチニブの効果を調べた。出願人らは、イブルチニブは、既に報告されているデータと合致して、ＣＤ１５４によって誘発されるＣＬＬ増殖を阻害することができるが、外因性ＩＬ－４／１０存在下、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞と共培養すると、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化及びＷｎｔ５ａによって高められたＣＬＬ増殖を阻害することはできないことを発見した。さらに、Ｗｎｔ－５ａは、イブルチニブの治療に対し、患者におけるＲａｃ１活性化を顕著に誘発した。ＣＬＬ患者は、ＣＬＬ細胞の耐性クローンに起因して、イブルチニブに対する主な耐性を示した。このことは、イブルチニブが、特にＬＮ及びＢＭの微細環境中でＣＬＬ生物学にとって重要である、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるシグナル伝達を遮断しないという事実によって説明されるだろう。イブルチニブは、ＦｃγＲが介在するカルシウムシグナル伝達及びサイトカイン産生を遮断するが、アクチン重合及び食作用を担うＲａｃ活性化には何の影響もないことが報告されている。

【0233】

ある経路の阻害に応答して活性化され、そして薬物耐性及び臨床的再発を引き起こし得る、複数の冗長性（すなわち代替経路）が存在するため、併用療法は、多くの腫瘍を効果的に治療することが、しばしば求められる。研究者らは、白血病治療のための他の薬物とイブルチニブとを用いた併用療法に関与している。Ｍｃｌ－１及びＢｃｌ－ＸＬの減少と共に、Ｂｃｌ－２タンパク質の増加も観察され、イブルチニブ治療されたＣＬＬ細胞の生存機構を示唆していた。イブルチニブとＢｃｌ－２阻害剤（ＡＢＴ－１９９）との組み合わせは、マントル細胞リンパ腫細胞において、ＢＴＫ及びＢｃｌ－２経路の撹乱によって、増殖阻害及びアポトーシスに対して相乗効果を示した。ＢＴＫ及びＰＩ３Ｋは、ＢＣＲシグナル伝達を別個に制御し、イブルチニブ及びＰＩ３Ｋ阻害剤（イデラリシブ）の併用療法によって、増殖及び生存を促進するニッチからのＭＣＬ細胞及びＣＬＬ細胞のより顕著な動員を引き起こす。さらに、イブルチニブ及び抗ＣＤ２０ ｍＡｂｓの組み合わせ試験は、イブルチニブが、ＣＬＬ細胞でのＣＤ２０発現を実質的に減らし、それに続いて、相補体が介在する細胞死を減らすことを示した。イブルチニブと抗ＣＤ２０ ｍＡｂのこの負の相互作用は、併用療法の効能を下げるかもしれない。これらの試験は全て、イブルチニブとの併用療法を行うときに、ＢＣＲシグナル伝達と代替的なシグナル伝達との間の可能な相互作用又はクロストークを特定するのに重要であることを示した。

【0234】

出願人らは、ここで、ＵＣ－９６１が、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化において有意な阻害活性を示し、それによって、Ｗｎｔ５ａによって高められたＣＬＬ増殖を阻害することを示した。さらに、ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせを投与すると、それぞれの薬剤単独によって引き起こされるものより大きい相加効果に起因して、レシピエントＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおいて白血病細胞を根絶した。

【0235】

ＵＣ－９６１及びイブルチニブは、互いの効果を強化する。その結果、併用療法は、その成長を促進するニッチにおいて増殖速度を下げるだけではなく、そこからのＣＬＬ細胞のより顕著な動員の低減をももたらすことが予想される。ＢＴＫ及びＲＯＲ－１は、その組み合わせが使用される際に、完全に占められている必要はないため、薬物クリアランス及びタンパク質ターンオーバーという観点から、その効果は、さらに強く、長く続く場合もある。さらに、より少ない用量が与えられてもよく、このことは、効能／毒性比にとって有益であろう。しかし、主として重要なのは、経路の１つより多くの鍵となる構成要素を標的とすることで、元来の治療耐性を克服し得、かつこれから起こる（単剤）治療耐性を克服するか、又は防ぎ得ることである。例えば、ＵＣ－９６１は、予後が悪いことに関連することが特定されている、ＢＴＫ上のイブルチニブ結合部位の変異、ＢＴＫ軸中のさらなる分子（例えば、ＰＬＣγ２）における変異、ＳＦ３Ｂ１変異を有する、イブルチニブ治療した患者において、なお有益であり得る。

【0236】

合わせて考えると、ＣＬＬ又はＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ ｖｉｖｏ系における、出願人らのＵＣ－９６１の使用は、治療薬物としてのＵＣ－９６１の効力を裏付けるものであり、ＣＬＬ及びおそらくは活性なＢＣＲシグナル伝達及び／又は腫瘍微小環境に依存してＢ細胞悪性腫瘍を発現する他のＲＯＲ－１のために、イブルチニブとの併用療法をさらに調査する価値がある。

【0237】

方法
細胞及びサンプル調製
ＣＬＬ標本
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｍｏｏｒｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで、ＣＬＬ患者から血液サンプルを集めた。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた密度遠心分離によってＰＢＭＣを単離し、液体窒素中で生存可能に保存するために、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１０％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁させた。９５％を超えるＣＤ１９^＋ＣＤ５^＋ＣＬＬ細胞を含めサンプルを、この試験全体でさらに精製することなく使用した。

【0238】

イブルチニブ占有率アッセイ
ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を増やしつつ（０、０．２５、０．５又は１μＭ）、１時間処理した。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上述のようにＢＴＫ占有率アッセイを行うまで、－８０℃で保存した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、ＢＴＫ占有率を比較した。

【0239】

カルシウム流動アッセイ
ＣＬＬ細胞を、０、０．２５、０．５又は１．０μＭのイブルチニブと共に３０分間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）中、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を欠く２ｍＭのＦｌｕｏ－４ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にロードした。抗ヒトＩｇＭ Ｆ（ａｂ）_２を用いた刺激のために、細胞を３７℃に維持した。記載するように、カルシウム放出をフローサイトメトリー分析によって監視した。

【0240】

細胞増殖アッセイ
原発性ＣＬＬ又はＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の増殖アッセイを、記載のように実施した。白血病細胞をカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって標識し、２４ウェルトレイ内で、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン（ＩＬ）－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を追加した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中、照射されたＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞（８０００Ｒａｄ；８０Ｇｒａｙ）の層の上に、ＣＬＬ／ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞の比率１５：１で、１．５×１０^６／ウェル／ｍｌで播種した。Ｗｎｔ５ａ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＵＣ－９６１（１０μｇ／ｍｌ）は、本文中で示される通りである。ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。Ｍｏｄｆｉｔ ＬＴソフトウェア（バージョン３．０、Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）を既に記載したように細胞増殖の分析に使用した。

【0241】

Ｒａｃ１活性化アッセイ
Ｒａｃ１活性化アッセイ試薬は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎから購入し、製造業者の指示に従って使用した。簡単に言うと、ＧＴＰに結合した活性なＲａｃ１を、ＰＡＫ－ＰＢＤビーズを用いてプルダウンし、次いで、イムノブロット分析を行った。全細胞溶解物のイムノブロットを使用し、全Ｒａｃ１を評価した。バンドの積分光学密度（ＩＯＤ）を濃度測定によって評価し、Ｇｅｌ－Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ４．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＭＤ）を用いて分析した。

【0242】

イムノブロット分析
ウェスタンブロット分析を上述のように行った。各サンプルから等量の全タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって画分に分け、ポリビニリデンジフルオリド膜上でブロッティングした。Ｒａｃ１に特異的な一次ｍＡｂを用いてウェスタンブロット分析を行い、これをセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と接合した二次抗体を用いて検出した。

【0243】

ヒトＣＬＬ患者に由来する異種移植試験
６～８週齢のＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウス（最初に、Ｃａｔｒｉｏｎａ Ｊａｍｉｅｓｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンディエゴから得た）を、特定の病原体を含まない条件で、層流のキャビネット内に入れ、適宜給餌した。出願人らは、ＡＩＭ－Ｖ培地中の２×１０^７個の生存可能な原発性ＣＬＬ細胞を、各マウスの腹膜腔に注射した。次の日に、１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を腹腔内に１回注射し、イブルチニブを毎日、１５ｍｇ／ｋｇで経口摂取によって投与した。７日後に、腹腔に全体積１２ｍＬのダルベッコＰＢＳを注射することによって、腹膜洗浄液（ＰＬ）を抽出した。ＰＬ細胞の全回収率を、Ｇｕａｖａ計測を用いることによって決定した。その後、マウス及びヒトＦｃブロッカーを用いて、４℃で３０分間、細胞をブロックし、種々のヒト細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ４５）で染色し、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。出願人らは、各ＰＬにおいて、ＰＬ中のＣＬＬ細胞のパーセントに、全ＰＬ細胞数計測数を掛け算することによって、ＣＬＬ細胞の数を計算した。ヒトＩｇＧで治療されたマウス由来の残留する白血病細胞を、１００％でベースラインとして設定した。各治療群は、少なくとも６匹のマウスを含んでおり、データは、平均±ＳＥＭとして表された。

【0244】

ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病養子細胞移植試験
出願人らは、免疫欠損Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおいて、ＵＣ－９６１とイブルチニブとの組み合わせの抗白血病活性を評価した。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病Ｂ細胞（ＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋）を脾臓から単離し、密度勾配遠心分離によって濃縮し、滅菌ＰＢＳに懸濁させ、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－レシピエントマウスに、動物あたり２×１０^４個の細胞を静脈注射した。移植のために使用されるサンプルは、フローサイトメトリーによって、９５％より多くが白血病Ｂ細胞であると実証された。ＵＣ－９６１の用量依存性処理について、レシピエントマウスは、未処理であるか、又は１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を１日目に１回静脈注射した。イブルチニブの用量依存性処理について、レシピエントマウスは、未処理であるか、又は１５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１．６７ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを１日目から開始して毎日経口投与した。併用療法のために、レシピエントマウスは、未処理であるか、又は１ｍｇ／ｋｇのＵＣ－９６１を１回、静脈注射されたか、及び／又は１日目から開始して、５ｍｇ／ｋｇのイブルチニブを毎日投与した。全てのマウスを２５日目に屠殺し、脾細胞の単独細胞懸濁物を、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解溶液中の低張溶解物によって赤血球細胞から除去し、洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中の２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）に懸濁させ、発色色素が接合したｍＡｂの最適化された濃度を用い、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ５（５３－７．３）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）及びＲＯＲ－１（４Ａ５）の表面発現のために染色した。４色のマルチパラメータフローサイトメトリーによって、デュアルレーザＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いて細胞を調べ、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。全リンパ球のうちのＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定し、この数に全脾臓細胞数計測を掛け算することによって、脾臓あたりの白血病細胞の合計数を計算した。

【0245】

統計学
正規分布のための条件を満足するデータセットについて、コルモゴロフ－スミルノフ検定によって決定されるように、データを平均±ＳＥＭとして示す。平均間の差の統計学的有意性は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって評価された。０．０５未満のＰ値は、有意であると考えた。有意性の分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。

【0246】

［実施例２］
組み合わせ研究
ＣＬＬ細胞を異なるＢＣＲ阻害剤で処理し、そしてＲＯＲ－１発現について調べた。ＲＯＲ－１発現は、ＢＣＲ阻害剤処理の後に有意に誘発された。出願人らは、免疫不全Ｒａｇ２／共通のγ－軽鎖ノックアウトマウス（Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－）の腹膜腔において、ＢＣＲシグナル伝達阻害剤によって誘発されるＲＯＲ－１発現が増加したＣＬＬ細胞を培養し、その後、コントロールＩｇ、抗ＲＯＲ－１抗体、イブルチニブ、又は抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの組み合わせで処理された。ＣＬＬ細胞は、抗ＲＯＲ－１抗体又はイブルチニブを単独で用いる処理よりも、抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブとの組み合わせを用いる処理に対して、感度が高かった。抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブとの組み合わせが、ヒト－ＲＯＲ－１を発現するマウス白血病細胞の養子細胞移植を阻害する能力を、免疫不全レシピエントマウスで試験した。６匹のＲＡＧ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに、１ｍｇ／ｋｇのヒト化抗ヒトＲＯＲ－１ ｍＡｂ ＵＣ－９６１を静脈内注射した。２時間後、全てのマウスに、ＲＯＲ－１ｘＴＣＬ１トランスジェニックから誘導される１ｘ１０^４ ＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏヒトＲＯＲ－１^＋マウス白血病細胞を静脈注射した。イブルチニブの毎日の処理を、白血病異種移植の次の日に開始した。コントロール動物と比較すると、単剤薬剤、抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの併用処理によって処理された動物は、悪性腫瘍細胞が蓄積する主要な臓器である脾臓において、白血病細胞が９０％より多く減少した。

【0247】

図９に示されるように、ＣＬＬ細胞を異なるＢＣＲ阻害剤で処理し、そしてＲＯＲ－１発現について調べた。ＲＯＲ－１発現は、ＢＣＲ阻害剤処理の後に有意に誘発された。

【0248】

図１０に示されるように、出願人らは、免疫不全Ｒａｇ２／共通のγ－軽鎖ノックアウトマウス（Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－）の腹膜腔において、ＢＣＲシグナル伝達阻害剤によって誘発されるＲＯＲ－１発現が増加したＣＬＬ細胞を培養し、その後、コントロールＩｇ、抗ＲＯＲ－１抗体、イブルチニブ、又は抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの組み合わせで処理した。ＣＬＬ細胞は、抗ＲＯＲ－１抗体又はイブルチニブを単独で用いる処理よりも、抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの組み合わせを用いる処理に対して、感度が高かった。

【0249】

図１１に示されるように、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスに、ＲＯＲ－１ｘＴＣＬ１トランスジェニックマウスに由来する１ｘ１０^４個のＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏヒトＲＯＲ－１^＋マウス白血病細胞を静脈注射し、その後、次の日に、コントロールＩｇ、抗ＲＯＲ－１抗体、イブルチニブ、又は抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの組み合わせで処理した。抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの併用処理によって、悪性腫瘍細胞が蓄積する主要な臓器である脾臓において、抗ＲＯＲ－１抗体又はイブルチニブのみの処理と比較して、白血病細胞が顕著に減少した。

【0250】

［実施例３］
シルムツズマブは、イブルチニブで処理された慢性リンパ性白血病におけるＷｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する
概要
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介するシグナル伝達は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の発病及び進行において重要な役割を果たす。このことは、ＢＣＲシグナル伝達を遮断し得るブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤であるイブルチニブの臨床的な有効性によって明確にされる。しかし、イブルチニブは、継続した治療がなければ、完全応答（ＣＲ）又は長期寛解を誘発することができず、このことは、代替的な経路もまた、ＢＣＲシグナル伝達とは独立してＣＬＬ成長／生存に寄与することを示唆している。ＲＯＲ－１は、Ｗｎｔ５ａのための受容体であり、Ｒａｃ１の活性化を促進し、ＣＬＬ細胞の増殖及び生存を高めることができる。この試験では、出願人らは、イブルチニブで治療された患者のＣＬＬ細胞が、Ｒａｃ１を活性化したことを発見した。さらに、Ｗｎｔ５ａは、ＢＴＫ及びＢＣＲシグナル伝達を完全に阻害するのに有効な濃度のイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞のＲａｃ１活性化を誘発し、増殖を高めることができた。Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化は、抗ＲＯＲ－１ ｍＡｂであるシルムツズマブ（ＵＣ－９６１）によって遮断することができた。出願人らは、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた処理は、ｉｎ ｖｉｖｏで白血病細胞を激減させる際に、いずれかの薬剤を単独で用いた処理よりも有意に効果的であることを発見した。この試験は、シルムツズマブが、ＣＬＬ又は他のＲＯＲ－１^＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の治療において、イブルチニブの活性を高め得ることを示す。

【0251】

緒言
ＣＬＬ細胞は、細胞との相互作用、増殖及び生存のために腫瘍微細環境に存在する可溶性因子に依存する。ｉｎ ｖｉｖｏでＣＬＬの増殖及び生存を補助し得る経路の中で、ＢＣＲシグナル伝達は、重要な役割を果たす。ＢＣＲの架橋によって、ＣＤ７９α／β及びＳｒｃファミリーキナーゼＬＹＮのリン酸化が起こり、チロシンキナーゼＳｙｋの動員及び活性化が起こり、下流のシグナル伝達事象のカスケードを誘発し、Ｂ細胞の生存を高める。ＣＬＬ生物学におけるこのカスケードの重要性は、ＢＣＲシグナル伝達において重要な役割を果たす細胞内キナーゼの低分子阻害剤（例えば、ＳＹＫ、ホスフィノシチド ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、又はブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ））の臨床的活性によって明確にされるようである。イブルチニブは、ＣＬＬ患者の治療において非常に有効であることがわかっているＢＴＫの低分子阻害剤である。しかし、優れた臨床的活性にもかかわらず、イブルチニブは、一般的に、連続治療を行わない状態で、疾患を根絶することも、又は持続的な応答を誘発することもできない。

【0252】

イブルチニブが完全応答を誘発することができないことは、ＢＴＫの阻害剤によって遮断されない代替的な生存シグナル伝達経路に起因するものであろう。このような経路の１つは、ＲＯＲ－１を介するシグナル伝達によって誘発されるものであり、がん胚性抗原は、ＣＬＬ細胞上で発現するが、正常な産後組織では発現しない。出願人らは、ＲＯＲ－１が、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ（例えば、Ｒａｃ１）の活性化を導く非標準的なＷｎｔシグナル伝達を誘発することができ、白血病細胞の増殖及び生存を高めることができるＷｎｔ５ａの受容体として役立ち得ることを発見した。Ｗｎｔ５ａによるＲａｃ１の活性化は、ＣＬＬ患者の臨床試験において現在評価を行っているファーストインクラスのヒト化モノクローナル抗体である抗ＲＯＲ－１ ｍＡｂであるシルムツズマブ（ＵＣ－９６１）によって阻害することができた。

【0253】

この試験では、出願人らは、Ｗｎｔ５ａ／ＲＯＲ－１シグナル伝達が、イブルチニブを用いた処理によって影響を受けるかどうかを観察し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣＬＬ細胞に対するイブルチニブ及びシルムツズマブの活性を調べた。

【0254】

材料及び方法
血液サンプル及び動物
一般的なＢ細胞ＣＬＬについて診断及び免疫表現型の基準を満足したＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｍｏｏｒｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで、血液サンプルをＣＬＬ患者から集め、Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（ＩＲＢ承認番号０８０９１８）を準拠して、書面でインフォームドコンセントを行った。ＰＢＭＣは、記載したように単離された。マウスを用いた全ての実験を、実験室動物の世話及び使用についてのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのガイドラインと、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏが承認した試験プロトコルに従って実施した。全てのマウスは、年齢と性別が合致していた。

【0255】

ＢＴＫ占有率アッセイ
ＣＬＬ細胞を、イブルチニブの濃度を増やしつつ（０、０．２５、０．５又は１μＭ）、１時間処理した。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、上述のようにＢＴＫ占有率アッセイを行うまで、－８０℃で保存した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、ＢＴＫ占有率を比較した。

【0256】

カルシウム流動アッセイ
ＣＬＬ細胞を、０、０．２５、０．５又は１．０μＭのイブルチニブと共に３０分間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）中、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を欠く２ｍＭのＦｌｕｏ－４ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にロードした。抗ヒトＩｇＭ Ｆ（ａｂ）_２を用いた刺激のために、細胞を３７℃に維持した。記載するように、カルシウム放出をフローサイトメトリー分析によって監視した。

【0257】

Ｒａｃ１活性化アッセイ
Ｒａｃ１活性化アッセイのための試薬を、既に記載したように、出願人らの実験室で製造した。Ｒａｃ１の除去及びイムノブロット分析を記載したように行った。

【0258】

細胞増殖アッセイ
出願人らは、既に記載したものに従って白血病細胞増殖アッセイを行った。これらの分析のために、出願人らは、特徴的な光散乱と、ＰＩを除外する能力を用い、生存ＣＤ５^＋ＣＤ１９^＋細胞に対してゲーティングした（図１８Ａ～１８Ｂ）。

【0259】

細胞周期分析
白血病細胞（１ｘ１０^７）を１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、１ｍｌの冷たいエタノールを添加することによって、４℃で一晩固定した。細胞を７００ｘｇで２分間回転させ、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ペレット化した細胞を、１％ＢＳＡ及び１μｌのＲＮａｓｅ（１００ｍｇ／ｍｌ）を含有する５００μｌのＰＢＳに懸濁させた。ＰＮａｓｅを添加し、ＲＮＡを消化させた。ＰＩ溶液（３８ｍＭクエン酸ナトリウム中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０）、１μｌの沸騰させたＲＮａｓｅ Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）及びＰＩ染色溶液（３８ｍＭクエン酸ナトリウム中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０；６０μｌ）を細胞に加え、室温、暗室で１時間インキュベートした。直後に、細胞を、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。

【0260】

ＣＬＬ患者に由来する異種移植
６～８週齢のＲａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウス（最初に、Ｃａｔｒｉｏｎａ Ｊａｍｉｅｓｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンディエゴから得た）を、特定の病原体を含まない条件で、層流のキャビネット内に入れ、適宜給餌した。出願人らは、ＡＩＭ－Ｖ培地中の２×１０^７個の生存可能な原発性ＣＬＬ細胞を、各マウスの腹膜腔に注射した。次の日に、１ｍｇ／ｋｇのシルムツズマブを腹腔内に１回注射し、イブルチニブを毎日、１５ｍｇ／ｋｇで経口摂取によって投与した。７日後に、腹腔に全体積１２ｍＬのダルベッコＰＢＳを注射することによって、腹膜洗浄液（ＰＬ）を抽出した。ＰＬ細胞の全回収率を、Ｇｕａｖａ計測を用いることによって決定した。その後、マウス及びヒトＦｃブロッカーを用いて、４℃で３０分間、細胞をブロックし、種々のヒト細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ４５）で染色し、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。出願人らは、各ＰＬにおいて、ＰＬ中のＣＬＬ細胞のパーセントに、全ＰＬ細胞数計測数を掛け算することによって、ＣＬＬ細胞の数を計算した。ヒトＩｇＧで処理されたマウス由来の残留する白血病細胞を、１００％でベースラインとして設定した。各処理群は、少なくとも５匹のマウスを含んでおり、データは、平均±ＳＥＭとして表された。

【0261】

ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病養子細胞移植試験
出願人らは、既に記載したように、免疫不全Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－又は免疫応答性ＲＯＲ－１－トランスジェニックマウスにおいて、シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせの抗白血病活性を評価した。

【0262】

統計学的分析
データを平均±ＳＥＭとして示す。データセットの正規分布は、コルモゴロフ－スミルノフ検定によって決定された。平均間の差の統計学的有意性は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって評価された。出願人らは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用し、本文中に記載される統計方法を用い、有意性のレベルを計算した。ｐ≦０．０５は、有意であるとみなされた。

【0263】

結果
イブルチニブは、ＣＬＬにおいて、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害することができない。出願人らは、イブルチニブを１日あたり４２０ｍｇの標準的な用量で摂取した患者の血液単核細胞を調べた。イブルチニブを摂取していない患者のＣＬＬ細胞について示したように、新しく単離されたＣＬＬ細胞は、活性化されたＲａｃ１を有しており、無血清培地中の培養物において、外因性Ｗｎｔ５ａを提供しない限り、時間経過に伴って減少した（図１２Ａ～１２Ｂ）。さらに、イブルチニブ治療された患者に由来するＣＬＬ細胞を、Ｗｎｔ５ａ及び／又はシルムツズマブを用い、又は用いずにインキュベートした。イムノブロット分析は、Ｗｎｔ５ａが、試験した全ての患者に由来するＣＬＬ細胞においてＲａｃ１活性化を誘発することを示し、一方、シルムツズマブを用いた処理は、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害した（図１２Ｃ～１２Ｄ）。これらの結果は、イブルチニブを用いた治療が、ＲＯＲ－１依存性のＷｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害しないことを示す。

【0264】

出願人らは、イブルチニブを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＬＬ細胞の処理が、ＣＬＬにおいて、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害することができるかどうかを調べた。このために、出願人らは、未治療の患者から集めたＣＬＬ細胞を、０、０．２５、０．５又は１．０μＭの濃度でイブルチニブと共に２時間インキュベートし、次いで、細胞を外因性Ｗｎｔ５ａで３０分間処理した。イムノブロット分析は、イブルチニブが、１μＭのイブルチニブ濃度であっても、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を遮断することができないことを示した（図６Ａ）。この濃度は、ＢＴＫの１００％占有率を達成し、ＢＴＫ活性の阻害を達成するのに必要な量の大過剰である（図６Ｂ）。一方、出願人らは、イブルチニブは、０．２５μＭ程度の低い濃度で、ＣＬＬ細胞の生存率に激しい影響を与えることなく（図６Ｄ）、抗ＩｇＭによって誘発されるカルシウムの流れを阻害した（図６Ｃ）。

【0265】

この薬物で治療された患者におけるイブルチニブのピーク血漿濃度は、約０．５μＭであり、１００％の占有率及びＢＴＫの阻害に影響を与え得る濃度である。したがって、イブルチニブを、その後の試験のために０．５μＭで使用した。出願人らは、イブルチニブ及び／又はシルムツズマブを用い、又は用いずに、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を試験した。ＣＬＬ細胞を、イブルチニブ、シルムツズマブ、又はイブルチニブとシルムツズマブとの両方と共に２時間培養し、次いで、外因性Ｗｎｔ５ａを用いて３０分間刺激した。比較のために、同じＣＬＬサンプルに由来する細胞を、並行してＷｎｔ５ａを用いずに培養した。Ｗｎｔ５ａを用いたＣＬＬ細胞の治療は、Ｗｎｔ５ａを用いて処理しなかったＣＬＬ細胞よりも有意に高いレベルまで、Ｒａｃ１の活性化を誘発した（図１２Ｅ～１２Ｆ）。シルムツズマブを用いた処理は、ＣＬＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害することができたが、イブルチニブは阻害することができなかった（図１２Ｅ～１２Ｆ）。予想されるように、イブルチニブは、シルムツズマブがＷｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化を阻害する能力を遮断しなかった（図１２Ｅ～１２Ｆ）。

【0266】

シルムツズマブは、イブルチニブ処理されたＣＬＬ細胞のＷｎｔ５ａによって高められる増殖を阻害する。Ｒａｃ１－ＧＴＰａｓｅの活性化は、増殖を高めることができ、一方、Ｒａｃ１の消失によって、造血細胞の成長を弱める。出願人らは、ＣＤ１５４を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}）並びに組換えインターロイキン（ＩＬ）－４及びＩＬ－１０と白血病細胞を共培養することによって、ＣＬＬ細胞の増殖を誘発した。ＣＬＬ細胞とＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞とＩＬ－４／１０との共培養物に外因性Ｗｎｔ５ａを添加すると、ＣＬＬ細胞の分裂割合が顕著に高まった。シルムツズマブを用いたＣＬＬ細胞の処理は、ＣＬＬ細胞のＷｎｔ５ａによって高められる増殖を遮断することができたが、イブルチニブは、遮断することができなかった（図１３Ａ）。異なる患者（ｎ＝６）のＣＬＬ細胞について同じ効果が観察された（図１３Ｂ）。ＩＬ４／１０及び／又はＷｎｔ５ａ単独では、ＣＬＬ細胞増殖を誘発することができなかった（図１８Ａ～１８Ｂ）。さらに、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で透過処理された白血病細胞に対する細胞周期の分析は、Ｓ／Ｇ２／Ｍにおいて、Ｗｎｔ５ａが、ＣＤ１５４によって刺激される白血病細胞機能を高めることを示した（図１３Ｃ～１３Ｄ）。Ｗｎｔ５ａが、Ｓ／Ｇ２／Ｍにおける細胞の割合を高める能力は、シルムツズマブを用いた処理によって阻害することができたが、イブルチニブを用いた処理によっては阻害することができなかった（図１３Ｃ～１３Ｄ）。

【0267】

ＣＬＬ患者に由来する異種移植におけるシルムツズマブ及び／又はイブルチニブの活性。出願人らは、免疫不全Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスのＣＬＬ細胞を腹膜腔に移植し、イブルチニブ及び／又はシルムツズマブを用いた処理が、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＬＬ細胞を激減させるかどうかを調べた。このために、出願人らは、ＡＩＭ－Ｖ培地中の１×１０^７個の生存可能な原発性ＣＬＬ細胞を、各マウスの腹膜腔に注射した。１日後、マウスは、未処理であったか、又は毎日、１５ｍｇ／ｋｇの用量のイブルチニブを経口摂取によって与えられたか、及び／又はシルムツズマブを１ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射によって１回与えられた。７日後に、ＣＬＬ細胞を腹膜洗浄（ＰＬ）によって集め、集めた腹膜細胞におけるＣＬＬ細胞の割合をフローサイトメトリーによって調べた（図１４Ａ）。ＰＬにおけるＣＬＬ細胞のパーセント及び合計数は、なんら処理を受けなかったマウスよりも、シルムツズマブ又はイブルチニブを用いて処理されたマウスにおいて、顕著に低かった。しかし、シルムツズマブとイブルチニブとで処理されたマウスのＰＬ中で、いずれかの薬剤単独で処理されたマウスのＰＬよりも顕著に低いＣＬＬ細胞が見出された（図１４Ｂ）。

【0268】

シルムツズマブは、Ｗｎｔ５ａによって高められたＲａｃ１活性化と、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の増殖を阻害するが、イブルチニブは阻害しない。ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞が、ＲＯＲ－１^＋白血病が進行したＲＯＲ－１×ＴＣＬ１二重トランスジェニックマウスから単離された。出願人らは、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を、イブルチニブ又はシルムツズマブで２時間前処理し、次いで、この細胞を、Ｗｎｔ５ａを用い、又は用いずに３０分間培養した。ヒトＣＬＬ細胞を用いた知見と同様に、Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化は、シルムツズマブによって阻害することができたが、イブルチニブによっては阻害することができなかった（図１５Ａ～１５Ｂ）。シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせも、Ｒａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発される活性化を、未処理細胞で観察されるレベルまで阻害した（図１５Ａ～１５Ｂ）。しかし、Ｗｎｔ５ａ処理は、ＲＯＲ－１の発現を欠く白血病が進行する単一のトランスジェニックＴＣＬ１マウスの白血病細胞においてＲａｃ１活性化を誘発することができなかった（図７Ｃ）。

【0269】

再び、出願人らは、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の増殖を、組換えＩＬ－４／１０存在下、この細胞とＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}とを共培養することによって誘発した。外因性Ｗｎｔ５ａは、細胞分裂数のパーセントを有意に高めた（図１５Ｃ）。ヒトＣＬＬ細胞を用いる場合、Ｗｎｔ５ａ及び／又はＩＬ－４／１０単独では、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１トランスジェニックマウスのＲＯＲ－１^＋白血病細胞の増殖を誘発することはできず（図１５Ｃ）、このことは、この効果についてＣＤ１５４の依存性を示している。初期の試験と一致して、Ｗｎｔ５ａは、ＨｅＬａ_{ＣＤ１５４}細胞及びＩＬ－４／１０と共に共培養したＲＯＲ－１陰性のＴＣＬ１－白血病細胞の増殖を高めず（図２１Ａ）、このことは、この効果についてのＲＯＲ－１の依存性を示している。イブルチニブを用いた治療は、Ｗｎｔ５ａが、ＣＤ１５４によって誘発されるＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖を高める能力を阻害することができなかった。一方、シルムツズマブは、ＣＤ１５４及びＩＬ－４／１０に応答して、Ｗｎｔ５ａがＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞増殖を高める能力を遮断した（図１５Ｃ）。

【0270】

ヒトＣＬＬ細胞について示したように、ＰＩを用いて透過処理されたＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞についての細胞周期の分析は、Ｗｎｔ５ａが、Ｓ／Ｇ２／Ｍにおいて、ＣＤ１５４によって刺激されるＲＯＲ－１＋白血病細胞の分率を増やすことができることを示した（図１９Ａ～１９Ｂ）。さらに、Ｗｎｔ５ａが、Ｓ／Ｇ２／ＭにおいてＲＯＲ－１＋白血病細胞の分率を高める能力は、シルムツズマブを用いた治療によって阻害することができたが、イブルチニブを用いた治療によっては阻害することができなかった（図１９Ａ～１９Ｂ）。

【0271】

シルムツズマブ及び／又はイブルチニブを用いた、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病を移植した免疫欠損マウスの治療。出願人らは、Ｒａｇ２^－／－γ_ｃ ^－／－マウスにおいてシルムツズマブ及び／又はイブルチニブが、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞の生着を阻害する能力を調べた。出願人らは、各動物に、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞を移植し、次いで、毎日、イブルチニブを１５、５、１．６７ｍｇ／ｋｇで経口摂取によって投与するか、又はシルムツズマブを１、３又は１０ｍｇ／ｋｇで静脈注射によって１回投薬した。２５日後に、動物を屠殺し、各動物の脾臓を調べた。イブルチニブ（図２０Ａ）又はシルムツズマブ（図２０Ｂ）は、用量依存性の様式で、脾臓白血病細胞の数を減らした。出願人らは、組み合わせ試験のために、１ｍｇ／ｋｇの用量のシルムツズマブと５ｍｇ／ｋｇの１日用量のイブルチニブとを選択した。シルムツズマブ又はイブルチニブ単独で処理された移植マウスは、なんら処理を受けていない移植動物よりも顕著に小さな脾臓を有しているが、シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせを用いて処理されたマウスは、脾臓の大きさが最も大きく縮小していた（図１６Ａ）。さらに、脾臓における白血病細胞の平均割合及び数は、未処理移植マウスと比較して、シルムツズマブ又はイブルチニブを用いて処理したマウスにおいて、顕著に低かった（図１６Ｂ～１６Ｃ）。しかし、シルムツズマブとイブルチニブとで処理した移植動物は、全ての他の群よりも、脾臓あたりの白血病細胞の割合及び数が顕著に低かった（図１６Ｂ～１６Ｃ）。

【0272】

シルムツズマブ及び／又はイブルチニブを用いた、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病を移植した免疫応答性マウスの治療。出願人らは、シルムツズマブ及び／又はイブルチニブが、免疫応答性ヒトＲＯＲ－１トランスジェニック（ＲＯＲ－１－Ｔｇ）マウスにおいて、ＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞（ＣＤ５^＋Ｂ２２０^ｌｏｗＲＯＲ－１^＋）の生着を阻害する能力を調べた。出願人らは、２×１０^４個のＲＯＲ－１×ＴＣＬ１白血病細胞をＲＯＲ－１－Ｔｇマウスに注射し、未処理としたか、イブルチニブを５ｍｇ／ｋｇで経口摂取によって毎日投与するか、又は週に１回、シルムツズマブを１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投薬した。２８日後に、動物を屠殺し、各動物の脾臓を調べた。シルムツズマブ又はイブルチニブ単独で処理された移植マウスは、なんら処理を受けていない移植動物よりも顕著に小さな脾臓を有しているが、シルムツズマブとイブルチニブとの組み合わせを用いて処理されたマウスは、脾臓の大きさが最も大きく縮小していた（図１７Ａ）。さらに、脾臓における白血病細胞の平均割合及び数は、未処理マウスよりも、シルムツズマブ又はイブルチニブを用いて処理されたマウスにおいて、顕著に低かった（図１７Ｂ～１７Ｃ）。しかし、シルムツズマブとイブルチニブとで処理された移植動物は、全ての他の群よりも、脾臓あたりの白血病細胞の割合及び数が顕著に低かった（図１７Ｂ～１７Ｃ）。

【0273】

考察
この試験では、出願人らは、ＢＴＫを阻害する能力によってＢＣＲシグナル伝達を阻害するのに非常に効果的であるイブルチニブを用いた治療を受けている患者のＣＬＬ細胞を調べた。まず、出願人らは、イブルチニブを用いて治療された患者のＣＬＬ細胞が、活性型Ｒａｃ１を有していることに着目した。この活性型Ｒａｃ１は、出願人らが、外因性Ｗｎｔ５ａを含む培地を追加しない限り、無血清培地中の培養物において、時間経過に伴って減少した。さらに、出願人らは、ＣＬＬ細胞を含めた様々な種類の細胞で示されるように、Ｗｎｔ５ａが、ＣＬＬを誘発してＲａｃ１を活性化させることを発見した。その後の試験は、Ｗｎｔ５ａが、１００％の占有率及びＢＴＫ及びＢＣＲシグナル伝達の阻害を達成するのに必要なレベルを超えている超生理学的濃度のイブルチニブを用いて処理されたＣＬＬ細胞においてさえ、Ｒａｃ１活性化を誘発することができることを示した。この試験で示されるＷｎｔ５ａシグナル伝達は、シルムツズマブが、Ｒａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発される活性化を阻害する能力によって示されるように、ＲＯＲ－１に依存した。出願人らは、イブルチニブが、複数のシグナル伝達経路に影響を与え得る細胞内シグナルトランスデューサとして機能するＲＯＲ－１依存性のＲａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発される活性化を遮断することができないと結論付けた。

【0274】

活性型Ｒａｃ１は、抗がん治療の有効性を減少させるかもしれない。以前の試験は、活性型Ｒａｃ１が、細胞毒性薬物に対するＣＬＬ細胞の耐性を高めることができることを発見した。ある試験は、活性型Ｔ細胞及び線維芽細胞は、ＣＬＬ細胞を誘発してＲａｃ１を活性化させ、そしてフルダラビン一リン酸の細胞毒性の影響に対する耐性を獲得させることができることを発見した。活性型Ｒａｃ１の阻害によって、この薬物に対するこれらのＣＬＬ細胞の感度を回復させることができた。別の試験では、Ｒａｃ１は、ＣＬＬにおいて過剰に発現するＢｃｌ－２と相互作用し、Ｂｃｌ－２の機能を高めることがわかった。急性白血病細胞が関与する別の試験は、活性型Ｒａｃ１の阻害剤であるＮＳＣ－２３７６６を用いた処理によって、白血病細胞のためのＢｃｌ－２アンタゴニストの細胞毒性を高めることができることを見出した。リンパ腫細胞におけるｐ５３の最終的な消失は、Ｒａｃ１の活性化の増加と関係があり、これは、ＮＳＣ－２３７６６又はＲａｃ１のドミナントネガティブ形態であるＲａｃ１Ｎ１７によって阻害されて、自然発生するアポトーシス又は薬物によって誘発されるアポトーシスの速度を容量依存性に高め得る。ことによると、イブルチニブを用いて治療された患者のＣＬＬ細胞において観察された活性型Ｒａｃ１は、補助シグナルを与え、イブルチニブを用いて治療された患者の白血病細胞の生存を高める。

【0275】

さらに、Ｗｎｔ５ａシグナル伝達は、イブルチニブで治療した患者において、白血病細胞増殖を促進することもできた。Ｗｎｔ５－シグナル伝達の機能的な結果は、ＣＤ１５４によって誘発される増殖を高めるＷｎｔ５ａの能力（外因性ＩＬ４／１０又はＩＬ－２１存在下で、ＣＬＬ増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発することができる）によって部分的に示される。イブルチニブは、おそらくはＢＣＲ経路及びＢＣＲ非依存的経路を阻害する能力に部分的に起因して、ＣＤ１５４によって誘発されるＣＬＬ細胞増殖を阻害することができるが、出願人らは、イブルチニブが、ＲＯＲ－１依存性シグナル伝達を介してＣＤ１５４によって誘発されるＣＬＬ増殖を高めるＷｎｔ５ａの能力を阻害することができないが、シルムツズマブを用いた治療によってこれを遮断することができることを発見した。

【0276】

Ｗｎｔ５ａは、ＣＬＬ微細環境内の細胞によって産生される蓋然性が最も高いが、ＣＬＬ患者の血漿も、高レベルのＷｎｔ５ａを有している。Ｗｎｔ５ａは、ＣＬＬ細胞自体によっても産生される場合があり、自己分泌活性化を可能にする。実際に、ある試験は、Ｗｎｔ５ａ自己分泌シグナル伝達におそらくは起因して、高レベルのＷｎｔ５ａを発現し得るＣＬＬ細胞が、明らかに運動性及び遊走反応を高めることを発見した。出願人らは、初期の試験で、Ｗｎｔ５ａが、ＲｈｏＡの活性化を介し、ケモカインへと向かうＣＬＬ細胞の移動を高めることができることも示した。しかし、ＢＴＫが、ケモカイン受容体（例えばＣＸＣＲ４）を介してＣＬＬシグナル伝達において顕著な役割を果たすため、出願人らは、ＢＴＫとは比較的独立したシグナル伝達経路を介してＣＤ１５４によって誘発される増殖を高めることができる、Ｗｎｔ５ａがＲａｃ１を活性化する能力に着目した。

【0277】

Ｗｎｔ５ａ－ＲＯＲ－１シグナル伝達経路が、イブルチニブを用いて治療されたＣＬＬ細胞内で失われていないように見えるため、出願人らは、イブルチニブとシルムツズマブとを用いた処理の相乗効果ではなく、相加効果について調べた。組織適合性ＲＯＲ－１^＋白血病又はヒトＣＬＬ異種移植片を移植したマウスについて、出願人らは、シルムツズマブ及びイブルチニブを両方とも用いた処理は、ｉｎ ｖｉｖｏで白血病細胞を激減させる際に、いずれかの薬剤を単独で用いた処理よりも有意に効果的であることを発見した。この試験は、シルムツズマブが、ＣＬＬ又は他のＲＯＲ－１^＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の治療において、イブルチニブの活性を高め得ることを示す。

【0278】

併用療法は、がん患者を治療する際にさらに有効であることが多い。観察を続け、他の薬物（例えば、ベネトクラックス又は抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）と組み合わせたイブルチニブの活性を評価する。シルムツズマブ及びイブルチニブが、独立したシグナル伝達経路を標的とするため、これらは、マウスモデルからの白血病細胞の除去において明らかな相乗効果を有する。白血病細胞の成長／生存を引き起こす１つより多くのシグナル伝達経路を標的とすることによって、シルムツズマブとイブルチニブとを用いる併用療法は、イブルチニブ単剤療法を受けている患者において時々起こるＢＴＫの阻害剤に対する耐性を獲得するリスクを軽減することもできる。

【0279】

合わせると、治療薬の効能及び薬物耐性という観点から、これらの前臨床観察は、シルムツズマブとイブルチニブとを用いた併用療法に対する合理的根拠を与え、又はＣＬＬ又はＲＯＲ－１を発現する他のＢ細胞悪性腫瘍を有する患者について、ＢＴＫの他の阻害剤（例えばアカラブルチニブ）を与える。

【0280】

［実施例４］
マントル細胞リンパ腫についての抗ＲＯＲ－１抗体とイブルチニブの組み合わせ
出願人らのグループによる最近の試験は、イブルチニブで治療された患者のＣＬＬ細胞が、活性型Ｒａｃ１を含んでいることを示した。さらに、Ｗｎｔ５ａは、ＢＴＫ及びＢＣＲシグナル伝達を完全に阻害するのに有効な濃度のイブルチニブで処理されたＣＬＬ細胞のＲａｃ１活性化を誘発し、増殖を高めることができた。Ｗｎｔ５ａによって誘発されるＲａｃ１活性化は、抗ＲＯＲ－１ ｍＡｂであるシルムツズマブ（ＵＣ－９６１）によって遮断することができた。出願人らは、シルムツズマブ及びイブルチニブを用いた処理は、ｉｎ ｖｉｖｏで白血病細胞を激減させる際に、いずれかの薬剤を単独で用いた処理よりも有意に効果的であることを発見した。この試験は、シルムツズマブが、ＣＬＬ又は他のＲＯＲ－１^＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の治療において、イブルチニブの活性を高め得ることを示す。したがって、出願人らは、Ｒａｃ１のＷｎｔ５ａによって誘発されるＲＯＲ－１依存性の活性化について、ＭＣＬ患者の原発性リンパ腫細胞を調べた。ＭＣＬ細胞を、イブルチニブ、シルムツズマブ、又はイブルチニブとシルムツズマブとの両方で２時間培養し、次いで、外因性Ｗｎｔ５ａを用い、３０分間刺激した。比較のために、同じＭＣＬサンプルに由来する細胞を、並行してＷｎｔ５ａを用いずに培養した。ＣＬＬ細胞について述べた通り、Ｗｎｔ５ａは、ＲＯＲ－１依存性の様式で、原発性ＭＣＬ細胞の活性化を誘発した。例えば、Ｗｎｔ５ａは、原発性ＭＣＬ細胞においてＲａｃ１活性化を誘発した（図２３Ａ）。シルムツズマブは、原発性ＣＬＬ細胞において出願人らが観察したのと同様に、原発性ＭＣＬ細胞において、Ｗｎｔ５ａがＲａｃ１活性化を誘発する能力を阻害することができたが、イブルチニブは、阻害することができなかった。

【0281】

Ｒａｃ１－ＧＴＰａｓｅの活性化は、増殖を高めることができ、一方、Ｒａｃ１の消失によって、造血細胞の成長が弱められる。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＤＮＡ含有量／細胞周期の分析に最も一般的に使用される染料である。ＣＤ４０結合及びＩＬ－４曝露に対するＭＣＬ細胞の応答性を評価するために、出願人らは、リンパ腫細胞と、ＣＤ１５４を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａＣＤ１５４）と、組換えＩＬ－４及びＩＬ－１０とを共培養することによって、原発性ＭＣＬ細胞の増殖を誘発した。ＣＬＬ細胞について述べた通り、ＰＩ系細胞周期試験を用いて評価されるように、ＭＣＬ細胞とＨｅＬａＣＤ１５４細胞とＩＬ－４／１０との共培養物に外因性Ｗｎｔ５ａを添加すると、Ｓ／Ｇ２期においてＭＣＬ細胞の割合が顕著に高まった。出願人らは、ＰＩを用いて透過処理されたＭＣＬ細胞について、細胞周期の分析も行い、Ｗｎｔ５ａの刺激によって、Ｓ／Ｇ２においてＣＤ１５４によって刺激されたＭＣＬ細胞の分率が顕著に増加することがわかった（図２３Ｂ）。Ｗｎｔ５ａが、Ｓ／Ｇ２における原発性ＭＣＬ細胞の割合を高める能力は、ＣＬＬ細胞について既に示したように、シルムツズマブを用いた処理によって阻害することができたが、イブルチニブを用いた処理によっては阻害することができなかった。

【0282】

これらのデータは、ＭＣＬにおけるＲＯＲ－１シグナル伝達の機能的な重要性と、このリンパ腫においてシルムツズマブが、ＲＯＲ－１が介在する発がん活性を阻害する能力を示す。ＭＣＬにおけるシルムツズマブの活性は、出願人らがＣＬＬにおいて観察したものと同一であり、出願人らは、３匹の異なる動物モデルにおいて、白血病細胞の除去においてシルムツズマブがイブルチニブと共に相乗的な抗腫瘍活性を有することを発見した。

【0283】

［実施例５］
慢性リンパ性白血病及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療のための候補薬物
新規なＢＴＫ阻害剤であるイブルチニブ及びホスファチジル－４－５－ビホスフェート ３－キナーゼ－δ阻害剤イデラリシブ（ＣＡＬ－１０１）は、単独で、又はイブルチニブを用いた１時間の抗ＣＤ２０抗体前処理と組み合わせて、慢性リンパ性白血病及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を治療するための候補薬物であり、抗ＣＤ２０抗体が介在する細胞株又は慢性リンパ性白血病サンプルの間接的な細胞死を増加させなかった。イブルチニブを用いた前処理は、相補体の活性化又は相補体が介在する溶解を阻害しなかった。対照的に、イブルチニブは、精製された形態又は全血アッセイにおいて、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、オファツムマブ又はオビヌツズマブによって誘発される全ての細胞が介在する機構を強力に阻害した。ナチュラルキラー細胞の活性化、これらの細胞による抗体依存性細胞毒性、マクロファージ又は好中球による食作用は、半数硬化濃度０．３～３μＭでイブルチニブによって阻害することができる。連続的な経口イブルチニブ治療を行った患者から単離されたナチュラルキラー細胞の抗ＣＤ２０が介在する活性化の分析は、繰り返しの薬物投薬が、これらの細胞をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することを示唆している。ホスファチジル－４－５－ビホスフェート ３－キナーゼ－δ阻害剤イデラリシブは、同様に、抗ＣＤ２０抗体によって誘発される免疫細胞が介在する機構を阻害することが示されているが、この薬物の１０μＭでの効果は、同じ濃度でのイブルチニブを用いて観察された効果よりも弱かった。任意の理論によって束縛されることを望まないが、抗ＣＤ２０抗体とこれらのキナーゼ阻害剤を併用した治療計画の設計は、これら２種類の薬物の間の複数の負の相互作用を考慮すべきであると考えられる。

【0284】

【表1】

【0285】

非公式な配列表
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｈ１（配列番号１）：ＧＹＡＦＴＡＹＮ
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）：ＦＤＰＹＤＧＧＳ
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｈ３（配列番号３）：ＧＷＹＹＦＤＹ
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）：ＫＳＩＳＫＹ
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｌ２（配列番号５）：ＳＧＳ
９９９６１．１ ＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）：ＱＱＨＤＥＳＰＹ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｈ１（配列番号７）：ＧＦＳＬＴＳＹＧ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｈ２（配列番号８）：ＩＷＡＧＧＦＴ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｈ３（配列番号９）：ＲＧＳＳＹＳＭＤＹ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｌ１（配列番号１０）：ＳＮＶＳＹ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｌ２（配列番号１１）：ＥＩＳ
Ｄ１０ ＣＤＲ Ｌ３（配列番号１２）：ＱＱＷＮＹＰＬＩＴ
全量ヒトＲＯＲ－１タンパク質（配列番号１３）：

【0286】

【化2】

【0287】

１３８位にグルタミン酸を含むヒトＲＯＲ－１の２１アミノ酸伸張（配列番号１４）：ＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰ

【0288】

１３８位にグルタミン酸を含むヒトＲＯＲ－１の１５アミノ酸伸張（配列番号１５）：ＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰ

【0289】

Ｐ．実施形態
実施形態Ｐ１。治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体とを投与することを含む、方法。

【0290】

実施形態Ｐ２。前記ＢＴＫアンタゴニストが、ＣＡＬ１０１、Ｒ４０６又はイブルチニブである、実施形態Ｐ１に記載の方法。

【0291】

実施形態Ｐ３。前記ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブである、実施形態Ｐ１～Ｐ２のいずれかに記載の方法。

【0292】

実施形態Ｐ４。前記抗ＲＯＲ－１抗体がシルムツズマブである、実施形態Ｐ１～Ｐ３のいずれかに記載の方法。

【0293】

実施形態Ｐ５。前記ＢＴＫアンタゴニストと抗ＲＯＲ－１抗体が、組み合わせた相乗的な量で投与される、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれかに記載の方法。

【0294】

実施形態Ｐ６。前記ＢＴＫアンタゴニスト抗ＲＯＲ－１抗体が、同時に投与されるか、又は順次投与される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれかに記載の方法。

【0295】

実施形態Ｐ７。前記がんが、リンパ腫又は腺癌である、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれかに記載の方法。

【0296】

実施形態Ｐ８。前記リンパ腫が、慢性リンパ性白血病、小リンパ球性リンパ腫、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫又はバーキットリンパ腫である、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれかに記載の方法。

【0297】

実施形態Ｐ９。前記腺癌が、結腸腺癌又は乳腺癌である、実施形態Ｐ１～Ｐ８のいずれかに記載の方法。

【0298】

実施形態Ｐ１０。医薬組成物であって、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）と、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記ＢＴＫアンタゴニストと前記抗ＲＯＲ－１抗体が、組み合わせた相乗的な量で存在し、前記組み合わせた相乗的な量が、治療を必要とする被験体においてがんを治療するのに有効である、医薬組成物。

【0299】

実施形態
実施形態１．治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）アンタゴニストとを投与することを含む、方法。

【0300】

実施形態２。前記ＢＴＫアンタゴニストが低分子である、実施形態１に記載の方法。

【0301】

実施形態３。前記ＢＴＫアンタゴニストが、イブルチニブ、イデラリシブ、フォスタマチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９、ＢＧＢ－３１１１又はＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である、実施形態１又は２に記載の方法。

【0302】

実施形態４。前記ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブである、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。

【0303】

実施形態５。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、抗体又は低分子である、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。

【0304】

実施形態６。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、抗ＲＯＲ－１抗体である、実施形態１～５のいずれかに記載の方法。

【0305】

実施形態７。前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示される配列を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む、実施形態５～６のいずれかに記載の方法。

【0306】

実施形態８。前記抗体がシルムツズマブである、実施形態３～７のいずれかに記載の方法。

【0307】

実施形態９。前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に示される配列を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含む、実施形態５～６のいずれかに記載の方法。

【0308】

実施形態１０。前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、組み合わせた相乗的な量で投与される、実施形態１～９のいずれかに記載の方法。

【0309】

実施形態１１。前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、同時に投与されるか、又は順次投与される、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。

【0310】

実施形態１２。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、第１の時間点に投与され、前記ＢＴＫアンタゴニストが、第２の時間点に投与され、前記第１の時間点が、前記第２の時間点より前である、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。

【0311】

実施形態１３。前記ＢＴＫアンタゴニストと前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、投与の前に混合される、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。

【0312】

実施形態１４。前記ＢＴＫアンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。

【0313】

実施形態１５。前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。

【0314】

実施形態１６。前記ＢＴＫアンタゴニストが、約４２０ｍｇの量で投与される、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。

【0315】

実施形態１７。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、実施形態１～１６のいずれかに記載の方法。

【0316】

実施形態１８。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２ｍｇ／ｋｇの量で投与される、実施形態１～１７のいずれかに記載の方法。

【0317】

実施形態１９。前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２ｍｇ／ｋｇで投与される、実施形態１～１５又は１７～１８のいずれかに記載の方法。

【0318】

実施形態２０。前記ＢＴＫアンタゴニストが、約５ｍｇ／ｋｇの量で投与され、前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約１ｍｇ／ｋｇで投与される、実施形態１～１５又は１７のいずれかに記載の方法。

【0319】

実施形態２１。前記ＢＴＫアンタゴニストが、毎日、少なくとも１４日間にわたって投与される、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。

【0320】

実施形態２２。前記ＢＴＫアンタゴニストが、毎日、約２８日間にわたって投与される、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。

【0321】

実施形態２３。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが、約２８日間にわたって１回投与される、実施形態１～２２のいずれかに記載の方法。

【0322】

実施形態２４。前記ＢＴＫアンタゴニストが静脈内投与される、実施形態１～２３のいずれかに記載の方法。

【0323】

実施形態２５。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが静脈内投与される、実施形態１～２４のいずれかに記載の方法。

【0324】

実施形態２６。前記被験体が哺乳動物である、実施形態１～２５のいずれかに記載の方法。

【0325】

実施形態２７。前記被験体がヒトである、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。

【0326】

実施形態２８。前記がんが、リンパ腫、白血病、骨髄腫、ＡＭＬ、Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、腎細胞癌腫、結腸がん、結腸直腸がん、乳がん、扁平上皮細胞がん、メラノーマ、胃がん、脳がん、肺がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、甲状腺がん、頭頸部がん、子宮がん、腺癌又は副腎がんである、実施形態１～２７のいずれかに記載の方法。

【0327】

実施形態２９。前記がんが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、周辺細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫又はＢ細胞白血病である、実施形態１～２８のいずれかに記載の方法。

【0328】

実施形態３０。ＢＴＫアンタゴニストと、ＲＯＲ－１アンタゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【0329】

実施形態３１。医薬組成物であって、ＢＴＫアンタゴニストと、抗ＲＯＲ－１抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記ＢＴＫアンタゴニストと前記抗ＲＯＲ－１抗体が、組み合わせた相乗的な量で存在し、前記組み合わせた相乗的な量が、治療を必要とする被験体においてがんを治療するのに有効である、医薬組成物。

【0330】

実施形態３２。前記ＢＴＫアンタゴニストが低分子である、実施形態３０又は３１に記載の医薬組成物。

【0331】

実施形態３３。前記ＢＴＫアンタゴニストが、イブルチニブ、イデラリシブ、フォスタマチニブ、アカラブルチニブ、ＯＮＯ／ＧＳ－４０５９、ＢＧＢ－３１１１又はＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）である、実施形態３０～３２のいずれかに記載の医薬組成物。

【0332】

実施形態３４。前記ＢＴＫアンタゴニストがイブルチニブである、実施形態３０～３３のいずれかに記載の医薬組成物。

【0333】

実施形態３５。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが抗体又は低分子である、実施形態３０～３４のいずれかに記載の医薬組成物。

【0334】

実施形態３６。前記ＲＯＲ－１アンタゴニストが抗ＲＯＲ－１抗体である、実施形態３０～３５のいずれかに記載の医薬組成物。

【0335】

実施形態３７。前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示される配列を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示される配列を含む、実施形態３５又は３６に記載の医薬組成物。

【0336】

実施形態３８。前記抗体がシルムツズマブである、実施形態３５～３７のいずれかに記載の医薬組成物。

【0337】

実施形態３９。前記抗体が、ヒト化重鎖可変領域と、ヒト化軽鎖可変領域とを含み、前記ヒト化重鎖可変領域が、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に示される配列を含み、前記ヒト化軽鎖可変領域が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含む、実施形態３５又は３６に記載の医薬組成物。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-08-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

治療を必要とする被験体においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記被験体に、治療に有効な量のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）アンタゴニストとチロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）アンタゴニストとを投与することを含む、方法。