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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024156878
(43)【公開日】2024-11-06
(54)【発明の名称】抗ＫＬＲＧ１抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241029BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241029BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241029BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241029BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241029BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241029BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241029BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241029BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241029BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241029BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241029BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/21
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P31/00
A61P37/04
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】31
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024127876
(22)【出願日】2024-08-02
(62)【分割の表示】P 2021539334の分割
【原出願日】2019-09-06
(31)【優先権主張番号】62/732,329
(32)【優先日】2018-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】521111504
【氏名又は名称】アブクロ，インク．
【氏名又は名称原語表記】Ａｂｃｕｒｏ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９０ Ｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ ０２４５８， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(74)【代理人】
【識別番号】100210099
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 太介
(72)【発明者】
【氏名】ステファノ ヴイ． ガラ
(72)【発明者】
【氏名】ケニス エヴァン トンプソン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】がんの治療を含む様々な治療または診断目的に有用な組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片およびその産生方法を提供する。かかる抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化効果および増殖効果を有し、がんの治療を含む様々な治療または診断目的に利用することができ、ワクチンの有効性を増加させるために有用である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片およびその産生方法を提供する。かかる抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化効果および増殖効果を有し、がんの治療を含む様々な治療または診断目的に利用することができ、ワクチンの有効性を増加させるために有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６７、配列番号７３、配列番号７９、または配列番号８５に示される、アミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗体が、ヒトキラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１（ＫＬＲＧ１）の細胞外ドメイン及び細胞外ドメインカニクイザルＫＬＲＧ１に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０に実質的に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択される少なくとも１つの配列の少なくとも１００個の連続するアミノ酸の任意の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、少なくとも約２ｎＭ、約１ｎＭ、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、または約５ｐＭのＫＤで表されるような、親和性でＫＬＲＧ１の前記細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、Ｅ－カドヘリンのＫＬＧＲ１への結合を、約５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害する、請求項５に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体が、ヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体が、ＩｇＧｉまたはＩｇＧ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体が、ＩｇＧ１λまたはＩｇＧｉκである、請求項９に記載の抗体。
【請求項11】
前記抗体が、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、またはＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８である、請求項１に記載の抗体。
【請求項12】
請求項１に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項13】
請求項１２に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、治療方法。
【請求項14】
前記薬学的組成物が、がんまたは感染症の治療または予防を必要とする対象に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記対象が、ヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
ヒトフレームワーク領域を含む抗体であって、前記抗体が、ＫＬＲＧ１に特異的に結合し、前記抗体が、ヒトまたはカニクイザルＫＬＲＧ１とＥ－カドヘリンとの間の結合を遮断することができる、前記抗体。
【請求項17】
前記抗体が、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、またはＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８に由来するＣＤＲを含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項18】
請求項１に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項19】
請求項１８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項20】
請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項21】
前記宿主細胞が、Ｅ．Ｃｏｌｉ細菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＮＳ０細胞から選択される、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項22】
前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０に示されるアミノ酸配列をコードする、請求項１８に記載の核酸。
【請求項23】
ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体またはその断片の作製方法であって、
（ａ）置換するＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠く可変ドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供することと、
（ｂ）前記レパートリーを、配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６７、配列番号７３、配列番号７９、または配列番号８５に実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、前記レパートリーの前記ＣＤＲ３領域内に前記ドナー核酸が挿入されて、可変ドメインをコードする核酸の産生物レパートリーを提供するように、組み合わせることと、
（ｃ）前記産生物レパートリーの前記核酸を発現させることと、
（ｄ）ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１の前記細胞外ドメインに特異的に結合する可変ドメインまたはその断片をコードする、工程（ｃ）からの核酸を選択することと、
（ｅ）（ｄ）の前記可変ドメインもしくはその断片、または前記可変ドメインもしくはその断片をコードする核酸を回収することと、を含む、前記方法。
（ａ）置換するＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠く可変ドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供することと、
（ｂ）前記レパートリーを、配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６７、配列番号７３、配列番号７９、または配列番号８５に実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、前記レパートリーの前記ＣＤＲ３領域内に前記ドナー核酸が挿入されて、可変ドメインをコードする核酸の産生物レパートリーを提供するように、組み合わせることと、
（ｃ）前記産生物レパートリーの前記核酸を発現させることと、
（ｄ）ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１の前記細胞外ドメインに特異的に結合する可変ドメインまたはその断片をコードする、工程（ｃ）からの核酸を選択することと、
（ｅ）（ｄ）の前記可変ドメインもしくはその断片、または前記可変ドメインもしくはその断片をコードする核酸を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項24】
請求項２３に記載の方法によって産生される抗体。
【請求項25】
ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞活性化を調節する方法であって、リンパ球を抗ＫＬＲＧ１抗体またはその断片と接触させることを含む、前記方法。
【請求項26】
前記リンパ球が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記抗体が、請求項１に記載される抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記抗体が、請求項２４に記載される抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
前記抗ＫＬＲＧ１抗体が、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ活性化を調節し、Ｅ－カドヘリンのヒト及びカニクイザルＫＬＧＲ１への結合を阻害する、請求項２５に記載の方法。
【請求項30】
請求項１に記載の抗体と交差競合する、抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項31】
請求項１に記載の抗体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野は、リンパ球共抑制性受容体キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１（ＫＬＲＧ１）の阻害に関する。
【背景技術】
【0002】
リンパ球共抑制性受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に関連する抗原ペプチド等の活性化シグナルに応答して、適応免疫系、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の作用を調節する。共抑制性受容体としては、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、及びＣＴＬＡ４が挙げられる。共抑制性受容体の作用は、一般に、共抑制性受容体の細胞外ドメインへのリガンドの結合、続いて、共抑制性受容体の細胞内ドメインに位置する免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）による細胞内ホスファターゼの動員によって実行される。共抑制性受容体の作用は、一般に、ＴＣＲ関与の免疫応答を弱めることである。近年、共抑制性受容体の活性を遮断する薬剤を使用して、がん及び感染症の有効な治療法として使用できることが示されている。
【0003】
キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性を調節することによって共抑制性受容体として機能するＩＩ型膜貫通タンパク質である。その細胞外部分は、既知のリガンドがカドヘリンであるＣ型レクチンドメインを含有し、その細胞内部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介シグナル伝達の共抑制に関与する免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含有する。ＫＬＲＧ１リガンドは、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0004】
受容体キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）が、上皮細胞及び間葉細胞上のリガンドに結合するＴ細胞及びＮＫ細胞上で発現される。ＫＬＲＧ１についてのリガンドは、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、及びＲ－カドヘリンであることが記載されている。
【0005】
ヒトにおいて、ＫＬＲＧ１発現は、免疫系の細胞に限定され、特異的にはＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞に限定され、より低い程度ではＣＤ４陽性Ｔ細胞に限定される。ＫＬＲＧ１発現は、後期分化表現型と関連付けられている。抗原特異的Ｔ細胞が分化するにつれて、細胞傷害性分子の発現の増加を獲得するため、細胞傷害性の可能性が増加する。ＫＬＲＧ１の生物学的機能は、これらのＴ細胞の細胞毒性及び増殖を阻害することである。がん及び感染症において、Ｔ細胞活性を回復させることが有益であることが示されている。
【0006】
一般に、がんまたは感染症のための安全で効果的な治療方法を提供する必要性が存在する。これらの障害に関与する細胞傷害性（またはＣＤ８＋）Ｔ及びＮＫ細胞活性化の調節は、ＫＬＲＧ１経路の操作によって達成され得る。
【0007】
発明の概要
本開示は、ＫＬＲＧ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、リガンドＥ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン及びＲ－カドヘリンとのその相互作用を阻害する新規抗体またはその抗原結合断片の特性評価を提供する。本明細書に記載される抗体は、マウスハイブリドーマ技術によって誘導されたものであり、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークに移植することによってヒト化することができる。本開示はまた、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の調節（例えば、活性化）を、ＫＬＲＧ１とそのリガンドとの相互作用を調節（例えば、中和）することによって行う抗体または結合断片も提供する。本明細書に記載の抗体は、単剤療法として、または他の免疫療法剤（抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体等）と組み合わせて、または化学療法剤、もしくはがんワクチンと組み合わせて、がんを治療するための有効な治療剤として使用することができる。本明細書に記載される抗体は、感染症の有効な治療法として、または感染症に対するワクチンの有効性を増強するために使用することができる。
本開示は、ＫＬＲＧ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、リガンドＥ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン及びＲ－カドヘリンとのその相互作用を阻害する新規抗体またはその抗原結合断片の特性評価を提供する。本明細書に記載される抗体は、マウスハイブリドーマ技術によって誘導されたものであり、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークに移植することによってヒト化することができる。本開示はまた、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の調節（例えば、活性化）を、ＫＬＲＧ１とそのリガンドとの相互作用を調節（例えば、中和）することによって行う抗体または結合断片も提供する。本明細書に記載の抗体は、単剤療法として、または他の免疫療法剤（抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体等）と組み合わせて、または化学療法剤、もしくはがんワクチンと組み合わせて、がんを治療するための有効な治療剤として使用することができる。本明細書に記載される抗体は、感染症の有効な治療法として、または感染症に対するワクチンの有効性を増強するために使用することができる。
【0008】
抗体の非限定的な例示的な実施形態は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、またはＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８と称される。他の実施形態は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、またはＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８のＦｖ断片のＶＨ及び／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの１つ以上のＣＤＲを含む。他の実施形態は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８のＶＨドメインのＨ３断片を含む。
【0009】
本開示はまた、ＫＬＲＧ１抗体を含む組成物、及びヒトまたは動物を治療する方法を含む免疫応答の調節方法におけるそれらの使用を提供する。特定の実施形態では、抗ＫＬＲＧ１抗体は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を活性化することによってがんを治療または予防するために使用される。本発明の組成物による治療に感受性の障害には、限定されないが、がん及び感染症が含まれる。
【0010】
加えて、抗ＫＬＲＧ１抗体を診断的に使用して、生体試料中のＫＬＲＧ１またはその断片を検出し得る。検出されるＫＬＲＧ１の量は、ＫＬＲＧ１の発現レベルと相関し得るものであり、これは、次いで、対象におけるリンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）の活性化状態と相関する。
【0011】
本開示はまた、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８のＦｖ断片からのＶＨ及びＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供する。また、本開示のＶＨ及びＶＬドメインのいずれかからの１つ以上のＣＤＲをコードする配列を含む、単離された核酸も提供される。本開示は、かかる核酸を含むベクター及び宿主細胞も提供する。
【0012】
本開示は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８のＶＨまたはＶＬドメインに由来するかかるドメインの全てまたは一部を含む、新しいＶＨ及びＶＬドメインならびに／または機能性抗体を産生する方法をさらに提供する。
【0013】
本開示の追加の態様は、一部は以下の説明に記載され、一部は説明から明らかになるか、または本発明を実施することによって学習され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲に記載され、特に指摘されており、本開示は、特許請求の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。以下の詳細な説明は、特許請求の範囲に記載されるように本発明を限定するものではなく、本発明の様々な実施形態の例示的な表現を含む。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、説明とともに、様々な実施形態を例示するためにのみ機能し、本発明を限定するものではない。参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】抗ＫＬＲＧ１抗体が、ＣＤ８＋ヒトＴ細胞を活性化することを実証するインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）分泌アッセイの結果を示す。
【図2】抗ＫＬＲＧ１抗体が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを実証するＣＤ８＋Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図3】抗ＫＬＲＧ１抗体で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ分泌アッセイの結果と、抗体の遮断活性（ＩＣ５０に示される）との間の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
用語「抗体」は、本開示で使用される場合、インビトロまたはインビボで産生されるかどうかにかかわらず、免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語には、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、及び移植抗体が含まれる。本開示の目的のために、「インタクトな抗体」の様に、用語「インタクト」によって別段に修飾されない限り、用語「抗体」はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能、すなわち、ＫＬＲＧ１に特異的に結合する能力を保持する他の抗体断片等の抗体断片も含む。典型的には、かかる断片は、抗原結合ドメインを含むであろう。
用語「抗体」は、本開示で使用される場合、インビトロまたはインビボで産生されるかどうかにかかわらず、免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語には、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、及び移植抗体が含まれる。本開示の目的のために、「インタクトな抗体」の様に、用語「インタクト」によって別段に修飾されない限り、用語「抗体」はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能、すなわち、ＫＬＲＧ１に特異的に結合する能力を保持する他の抗体断片等の抗体断片も含む。典型的には、かかる断片は、抗原結合ドメインを含むであろう。
【0016】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」、及び「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。抗原が大きい事例では、抗原結合ドメインは、抗原の一部にのみ結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」と称される。
【0017】
抗原結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしもその両方を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片は、ＶＨドメインのみからなるが、インタクトな抗体のいくつかの抗原結合機能を依然として保持する。
【0018】
用語「レパートリー」は、発現免疫グロブリンをコードする配列に完全または部分的に由来するヌクレオチドの遺伝子学的に多様な集合を指す。配列は、例えば、Ｈ鎖についてのＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに例えば、Ｌ鎖についてのＶ及びＪセグメントのインビボ再配列によって生成される。あるいは、配列は、インビトロ刺激によって、再配列が生じることに応答して、細胞株から生成され得る。あるいは、配列の一部または全ては、例えば、再配列されていないＶセグメントをＤセグメント及びＪセグメントと組み合わせることによって、ヌクレオチド合成、ランダム変異誘発、ならびに例えば、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されるような他の方法によって、得ることができる。
【0019】
用語「特異的相互作用」及び「特異的結合」は、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、通常、中程度～高容量の低親和性を有する非特異的結合と区別されるように、高親和性及び低～中程度の容量を特徴とする。典型的には、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ－
１よりも高い、またはより好ましくは１０８Ｍ－
１よりも高い場合に特異的とみなされる。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変化させることによって、特異的結合に実質的に影響を与えることなく、低減することができる。抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に許容される時間、遮断剤（例えば、血清アルブミン、乳カゼイン）の濃度等の適切な結合条件は、日常的な技法を使用して当業者によって最適化され得る。
【0020】
語句「実質的に示される」は、本発明の関連ＣＤＲ、ＶＨ、またはＶＬドメインが、その配列が示される特定の領域（例えば、ＣＤＲ）と同一であるか、または実質的でない差異のみを有することを意味する。実質的でない差異としては、マイナーなアミノ酸変化、例えば、特定の領域の配列中の任意の５個のアミノ酸のうちの１または２個の置換が挙げられる。
【0021】
用語「ＫＬＲＧ１活性」は、ＫＬＲＧ１に関連する１つ以上のリンパ球共抑制性活性を指す。例えば、ＫＬＲＧ１活性は、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞活性化の調節を意味し得る。
【0022】
用語「調節する」及びその類似の用語は、抗ＫＬＲＧ１抗体との相互作用に起因する、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化に関連するＫＬＲＧ１の活性の低下または増加を指し、その低下または増加は、同じ抗体の不在下でのＫＬＲＧ１の活性と比較される。活性の低下または増加は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。ＫＬＲＧ１活性が低下すると、用語「調節的」及び「調節する」は、用語「阻害的」及び「阻害する」と互換性がある。ＫＬＲＧ１活性が増加すると、用語「調節的」及び「調節する」は、用語「活性化」及び「活性化する」と互換性がある。ＫＬＲＧ１の活性は、実施例６に記載されるもの等のＴ細胞及びＮＫ細胞活性化アッセイを使用して定量的に決定することができる。
【0023】
用語「治療」及び「治療方法」は、治療処置及び予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／防止（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要としているものには、既に特定の医学的障害を患っている人、及び最終的に障害を発症する可能性のある人（すなわち、予防措置を必要としているもの）が含まれ得る。
【0024】
用語「有効量」は、ＫＬＲＧ１の活性を低下させて、患者の症状の改善をもたらすか、または所望の生物学的転帰、例えば、ＫＬＲＧ１の活性の低下、リンパ球共抑制応答の調節、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化の増加、または細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞によるＩＦＮγの放出の増加を達成するのに十分な投与量または量を指す。
【0025】
用語「単離された」は、その天然環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、細胞物質またはそれが由来する細胞または組織源からの他のタンパク質を実質的に含まない。用語「単離された」はまた、単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与されるのに十分に純粋であるか、または少なくとも７０～８０％（ｗ／ｗ）純粋であること、より好ましくは少なくとも８０～９０％（ｗ／ｗ）純粋であること、さらにより好ましくは９０～９５％純粋であること、及び最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物を指す。
【0026】
抗ＫＬＲＧ１抗体
本開示は、新規の抗原結合断片を含む抗ＫＬＲＧ１抗体を提供する。
本開示は、新規の抗原結合断片を含む抗ＫＬＲＧ１抗体を提供する。
【0027】
一般に、抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリを用いて実施されるファージディスプレイ法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７）を使用して作製することができる。他の抗体産生技法については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。本発明は、任意の特定の供給源、起源種、または産生方法に限定されない。
【0028】
免疫グロブリンとしても知られるインタクトな抗体は、通常には、各々約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖及び各々約５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。抗体には、λ鎖及びκ鎖と呼ばれる２つのタイプの軽鎖がある。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主要なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、及びＭに割り当てられ得、ならびにこれらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。
【0029】
異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構成は、当該技術分野で周知である。抗体構造の概説については、上記のＨａｒｌｏｗらを参照されたい。簡単に説明すると、各軽鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）から構成されている。各重鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ）、及びヒンジ領域から構成されている。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、ＣＨ１と呼ばれる。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域からなり、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変配列の３つの領域の足場を形成する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を担うほとんどの残基を含有する。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称される。重鎖のＣＤＲ成分はＨ１、Ｈ２、及びＨ３と呼ばれ、軽鎖のＣＤＲ成分はＬ１、Ｌ２、及びＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３、特にＨ３は、抗原結合ドメイン内の分子多様性の最大の源である。Ｈ３は、例えば、２つのアミノ酸残基まで短いか、または２６を超えることもできる。
【0030】
Ｆａｂ断片（断片抗原結合）は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合されたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬドメインからなる。宿主細胞で共発現したときにＦｖ中の非共有結合ＶＨ及びＶＬドメインが解離する傾向を克服するために、いわゆる一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を構築することができる。ｓｃＦｖにおいて、柔軟で十分に長いポリペプチドが、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端またはＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端、のいずれかを連結する。最も一般に、１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドは、リンカーとして使用されるが、他のリンカーも当該技術分野で既知である。
【0031】
抗体多様性は、可変領域及び種々の体細胞事象をコードする複数の生殖細胞系遺伝子の組み合わせ集合の結果である。体細胞事象には、完全なＶＨ領域を作製するための多様部（Ｄ）遺伝子セグメント及び結合部（Ｊ）遺伝子セグメントとの可変部遺伝子セグメントの再構成、ならびに完全なＶＬ領域を作製するための可変部遺伝子及び結合部遺伝子セグメントの再構成が含まれる。再構成プロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部でアミノ酸の喪失または付加をもたらす。これらの多様性のメカニズムは、抗原曝露の前に発達中のＢ細胞において生じる。抗原刺激後、Ｂ細胞内で発現した抗体遺伝子は体細胞変異を起こす。
【0032】
生殖細胞系遺伝子セグメントの推定数、これらのセグメントのランダムな再構成、及びランダムＶＨ－ＶＬ対合に基づいて、最大１．６×１０７個の異なる抗体を産生することができた（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。抗体の多様性に寄与する他のプロセス（体細胞変異等）を考慮に入れると、１×１０１０個以上の異なる抗体が潜在的に生成され得ると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９５）。抗体の多様性に多くのプロセスが関与するために、独立して生成された抗体がＣＤＲにおいて同一のアミノ酸配列を有する可能性はほとんどない。
【0033】
本開示は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する新規のＣＤＲを提供する。ＣＤＲを担持するための構造は、一般に、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその一部であり、ＣＤＲが天然に存在するＶＨ及びＶＬのＣＤＲに対応する位置に位置する。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されているように決定することができる。
【0034】
ヒト化抗ＫＬＲＧ１抗体のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を配列表に示し、表１に記載されるように列挙する。
【表1】
【0035】
抗体の特定の非限定的な例示的実施形態は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、及びＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７と称される。例示的な実施形態のＶＨ及びＶＬドメイン内のＣＤＲのアミノ酸配列を、配列表に示し、表２に記載されるように列挙する。
【表2】
【0036】
マウス抗ＫＬＲＧ１抗体のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を配列表に示し、表３に記載されるように列挙する。
【表3-1】
【表3-2】
【0037】
抗体の特定の非限定的な例示的実施形態は、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８と称される。例示的な実施形態のＶＨ及びＶＬドメイン内のＣＤＲのアミノ酸配列を配列表に示し、表４に記載されているように列挙する。
【表4-1】
【表4-2】
【0038】
抗ＫＬＲＧ１抗体は、任意選択的に、抗体定常領域またはその一部を含んでもよい。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端に、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインを付着していてもよい。同様に、ＶＨドメインに基づく特異的抗原結合ドメインは、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ、ならびにＩｇＧ１及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、アイソタイプサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部を付着していてもよい。例示的な実施形態では、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８抗体は、ヒトＩｇＧ１λまたはＩｇＧ１κの重鎖及び軽鎖のＣ末端断片を含む。そのＣ末端断片のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい）。
【0039】
ある特定の実施形態は、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８からのＦｖ断片のＶＨ及び／またはＶＬドメインを含む。さらなる実施形態は、これらのＶＨ及びＶＬドメインのうちのいずれかの少なくとも１つのＣＤＲを含む。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８に示されるＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む抗体は、本発明の範囲内に包含される。一実施形態は、例えば、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０６、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８のうちの少なくとも１つから選択される抗体のＶＨドメインのＨ３断片を含む。
【0040】
ある特定の実施形態では、ＶＨ及び／またはＶＬドメインは生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｅｄ）されていてもよく、すなわち、これらのドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、生殖系列細胞によって産生されるものと一致するように従来の分子生物学技法を使用して変異される。他の実施形態では、フレームワーク配列は、コンセンサス生殖系列配列から乖離したままである。
【0041】
ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトまたはマウスＫＬＲＧ１のＥＣＤ内のエピトープに、少なくとも約２ｎＭ、１ｎｍ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、または５ｐＭのＫＤで表される親和性で特異的に結合する。ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１のＥＣＤのアミノ酸配列は、表６に列挙されるように、配列番号８９及び配列番号９０で示される。
【0042】
本発明の抗体はまた、例えば、ＫＬＲＧ１の全てまたは一部を含む組換えタンパク質を含む他のタンパク質と結合し得ることが企図される。
【0043】
当業者であれば、本発明の抗体を使用して、ＫＬＲＧ１と多少異なるタンパク質を検出、測定、及び阻害し得ることを認識するであろう。抗体は、標的タンパク質が、配列番号８９または配列番号９０に示される配列中の少なくとも１３０、１００、８０、６０、４０、または２０個の連続するアミノ酸の任意の配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上同一である配列を含む限り、結合の特異性を保持することが予想される。同一性パーセントは、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７のアルゴリズム等の標準的なアライメントアルゴリズムによって決定される。
【0044】
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照されたい）、ならびに二次構造及び三次構造分析を実施して、開示された抗体及び抗原とのそれらの複合体によって想定される特定の３Ｄ構造を特定することができる。かかる方法には、限定されないが、Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７－１３）、及び現在開示されている抗体の仮想表現のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が含まれる。
【0045】
誘導体
本開示は、ＫＬＲＧ１に特異的な抗体を得るための方法も提供する。かかる抗体におけるＣＤＲは、表１及び３に特定されるＶＨ及びＶＬの特異的配列に限定されず、ＫＬＲＧ１に特異的に結合する能力を保持するこれらの配列のバリアントを含み得る。かかるバリアントは、当該技術分野で周知の技法を使用して、当業者によって表１及び３に列挙される配列から誘導され得る。例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加は、ＦＲ内及び／またはＣＤＲ内で行われ得る。ＦＲの変更は通常、抗体の安定性及び免疫原性を改善するように設計されるが、ＣＤＲの変更は、典型的には、その標的に対する抗体の親和性を増加させるように設計される。ＦＲのバリアントには、天然に存在する免疫グロブリンアロタイプも含まれる。かかる親和性の増加変化は、ＣＤＲを改変し、その標的に対する親和性抗体を試験することを含む日常的な技法によって経験的に決定され得る。例えば、保存的アミノ酸置換は、開示されるＣＤＲのうちのいずれか１つ内で行われ得る。種々の改変は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載される方法に従って行うことができる。これらには、限定されないが、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、したがって「サイレント」変化を生じるヌクレオチド配列が含まれる。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表５を参照）。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基もまた、アラニンで置換され得る（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５－６７、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１－２４を参照されたい）。
本開示は、ＫＬＲＧ１に特異的な抗体を得るための方法も提供する。かかる抗体におけるＣＤＲは、表１及び３に特定されるＶＨ及びＶＬの特異的配列に限定されず、ＫＬＲＧ１に特異的に結合する能力を保持するこれらの配列のバリアントを含み得る。かかるバリアントは、当該技術分野で周知の技法を使用して、当業者によって表１及び３に列挙される配列から誘導され得る。例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加は、ＦＲ内及び／またはＣＤＲ内で行われ得る。ＦＲの変更は通常、抗体の安定性及び免疫原性を改善するように設計されるが、ＣＤＲの変更は、典型的には、その標的に対する抗体の親和性を増加させるように設計される。ＦＲのバリアントには、天然に存在する免疫グロブリンアロタイプも含まれる。かかる親和性の増加変化は、ＣＤＲを改変し、その標的に対する親和性抗体を試験することを含む日常的な技法によって経験的に決定され得る。例えば、保存的アミノ酸置換は、開示されるＣＤＲのうちのいずれか１つ内で行われ得る。種々の改変は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載される方法に従って行うことができる。これらには、限定されないが、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、したがって「サイレント」変化を生じるヌクレオチド配列が含まれる。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表５を参照）。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基もまた、アラニンで置換され得る（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５－６７、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１－２４を参照されたい）。
【表5】
【0046】
本発明の抗体の誘導体及び類似体は、組換え及び合成方法を含む当該技術分野で周知の様々な技法によって産生することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びＢｏｄａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【0047】
一実施形態では、本発明のＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインの作製方法は、本開示のＶＨドメインのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入するステップと、そのようにして提供されるＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと任意選択的に組み合わせるステップと、ＫＬＲＧ１への特異的結合についてＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組み合わせ（複数可）を試験するステップと、任意選択的に、かかる抗原結合ドメインがＫＬＲＧ１活性を調節する能力を試験するステップとを含む。ＶＬドメインは、表１及び３に示されるアミノ酸配列と同一であるか、または実質的に同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【0048】
本明細書に開示されるＶＬドメインの１つ以上の配列バリアントが１つ以上のＶＨドメインと組み合わされる類似の方法を用いることができる。
【0049】
本開示のさらなる態様は、ＫＬＲＧ１に特異的に結合する抗原結合断片を調製する方法を提供する。方法は、
（ａ）置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供することと、
（ｂ）レパートリーを、ＶＨＣＤＲ３（すなわち、Ｈ３）に関して本明細書に実質的に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、レパートリーのＣＤＲ３領域内にドナー核酸が挿入されて、ＶＨドメインをコードする核酸の産生物レパートリーを提供するように、組み合わせることと、
（ｃ）産生物レパートリーの核酸を発現させることと、
（ｄ）ＫＬＲＧ１に特異的な結合断片を選択することと、
（ｅ）特異的結合断片またはそれをコードする核酸を回収することと、を含む。
（ａ）置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠くＶＨドメインをコードする核酸の開始レパートリーを提供することと、
（ｂ）レパートリーを、ＶＨＣＤＲ３（すなわち、Ｈ３）に関して本明細書に実質的に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、レパートリーのＣＤＲ３領域内にドナー核酸が挿入されて、ＶＨドメインをコードする核酸の産生物レパートリーを提供するように、組み合わせることと、
（ｃ）産生物レパートリーの核酸を発現させることと、
（ｄ）ＫＬＲＧ１に特異的な結合断片を選択することと、
（ｅ）特異的結合断片またはそれをコードする核酸を回収することと、を含む。
【0050】
この場合もさらに、本発明のＶＬＣＤＲ３（すなわち、Ｌ３）を、置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠くかのいずれかを含む、ＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わされる類似の方法が用いられ得る。ドナー核酸は、実質的に配列番号７～２４及び４１～８８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸から選択され得る。
【0051】
本発明のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）をコードする配列は、組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：７７９－７８３）によって記載された方法論を使用して、それぞれのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに導入され得る。特に、可変ドメイン領域の５’末端に向けられるか、またはそれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域へのコンセンサスプライマーと併用して、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供することができる。レパートリーは、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができる。類似の技法を使用して、ＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルされ得、シャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインは、同種のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わされて、本発明のＫＬＲＧ１特異的抗体を作製する。次に、レパートリーは、好適な抗原結合断片を選択できるように、ＷＯ９２／０１０４７に記載されるようなファージディスプレイシステム等の好適な宿主系に表示され得る。
【0052】
類似のシャッフルまたは組み合わせ技法はまた、βラクタマーゼ遺伝子に関連して技法を説明するが、このアプローチが抗体の生成のために使用され得ることを観察しているＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９－３９１）によっても開示されている。
【0053】
さらなる実施形態では、１つ以上の選択されたＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用して、本明細書に開示される配列に由来する１つ以上の配列を担持する新規のＶＨまたはＶＬ領域を生成してよい。かかる技法の１つ、エラープローンＰＣＲは、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６－３５８０）によって記載されている。
【0054】
使用され得る別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲに変異誘発を向けることである。かかる技法は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９－３８１３）、及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１－５６７）によって記載されている。
【0055】
同様に、１つ以上、または３つ全てのＣＤＲを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーに移植することができ、これらは次に、ＫＬＲＧ１に特異的な抗原結合断片についてスクリーニングされる。
【0056】
免疫グロブリン可変ドメインの一部は、実質的に本明細書に記載されるＣＤＲのうちの少なくとも１つ、及び任意選択的に、本明細書に記載されるｓｃＦｖ断片からの介在フレームワーク領域を含む。この部分は、ＦＲ１及びＦＲ４のうちのいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み得、その５０％は、ＦＲ１のＣ末端５０％及びＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、通常、天然に存在する可変ドメイン領域と会合しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技法による抗体の構築は、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによってコードされるＮ末端残基またはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップとしては、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの産生における）、または以下でさらに詳細に考察されるようなタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が挙げられる。
【0057】
実施例に例示される実施形態は、ＶＨ及びＶＬドメインの「マッチング」対を含むが、代替の実施形態が、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかからの単一のＣＤＲのみを含有する抗原結合断片を含み得ることを当業者は認識するであろう。単鎖特異的結合ドメインのうちのいずれか１つを使用して、例えば、ＫＬＲＧ１に結合することができる２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することができる相補的ドメインをスクリーニングすることができる。スクリーニングは、ＷＯ９２／０１０４７に開示されている、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、結果として生じる２鎖特異的結合ドメインを記載されているファージディスプレイ技法に従って選択する、いわゆる階層的デュアルコンビナトリアルアプローチ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｄｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用するファージディスプレイスクリーニング法によって達成され得る。
【0058】
本明細書に記載される抗ＫＬＲＧ１抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体等）、毒素、放射性同位体、細胞傷害性剤または細胞増殖抑制剤に連結することができる。例えば、抗体は、化学架橋または組換え法によって連結することができる。抗体はまた、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つに連結することができる。抗体は、例えば、それらの循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾され得る。例示的なポリマー及びそれらを付着させる方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、及び同第４，６０９，５４６号に示す。
【0059】
開示される抗体はまた、天然パターンとは異なるグリコシル化パターンを有するように改変してもよい。例えば、１つ以上の炭水化物部分が欠失され、及び／または１つ以上のグリコシル化部位を元の抗体に付加することができる。本開示の抗体へのグリコシル化部位の付加は、当該技術分野で既知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって達成され得る。抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドを抗体のアミノ酸残基に化学的または酵素的にカップリングすることによるものである。かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９－３０６に記載される。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２、及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１により及びＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０により記載されるように化学的にまたは酵素的に達成することができる。抗体はまた、検出可能な、または機能的な標識でタグ付けしてもよい。検出可能な標識には、従来の化学的作用を使用して抗体に付着し得る１３１Ｉまたは９９Ｔｃ等の放射標識が含まれる。検出可能な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素標識も含まれる。検出可能な標識は、特定の同族検出可能な部分、例えば、標識アビジン、への結合を介して検出され得る、ビオチン等の化学部分をさらに含む。
【0060】
ＣＤＲ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０に示されるものと実質的ではない場合のみ異なる抗体は、本発明の範囲内に包含される。典型的には、アミノ酸は、同様の電荷、疎水性、または立体化学的特性を有する関連アミノ酸によって置換される。かかる置換は、職人の通常の技能内にあるであろう。ＣＤＲとは異なり、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなく、ＦＲにおいてより実質的な変更が行われ得る。ＦＲへの変更には、限定されないが、非ヒト由来のヒト化または、抗原接触または結合部位の安定化に重要な特定のフレームワーク残基の操作、例えば、定常領域のクラスもしくはサブクラスの変更、米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号、ならびにＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７－２６６２、及びＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９－３２４に記載されるような、Ｆｃ受容体結合等のエフェクター機能を変化させ得る特定のアミノ酸残基の変更、あるいは定常領域が由来する種の変更が含まれる。
【0061】
当業者は、上述の修飾が包括的ではなく、本開示の教示に照らして当業者にとって多くの他の修飾が明らかであることを理解するであろう。
【0062】
核酸、クローニング及び発現系
本開示は、開示された抗体をコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成または組換えであってもよい。本明細書に示されるヌクレオチド配列への言及は、文脈上別段の必要がない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、Ｔの代わりにＵが置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
本開示は、開示された抗体をコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成または組換えであってもよい。本明細書に示されるヌクレオチド配列への言及は、文脈上別段の必要がない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、Ｔの代わりにＵが置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【0063】
本明細書に提供される核酸は、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨドメイン、及び／またはＶＬドメインのコード配列を含む。
【0064】
本開示はまた、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨドメイン、及び／またはＶＬドメインをコードする少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、ファージミド、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
【0065】
本開示は、上記の１つ以上の構築物を含む宿主細胞をさらに提供する。
【0066】
任意のＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸、ならびにコードされる産生物の作製方法も提供される。本方法は、コードする核酸からコードされる産生物を発現することを含む。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成することができる。発現による産生後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または特異的結合メンバーを、任意の好適な技法を使用して単離し、及び／または精製し、次いで必要に応じて使用してもよい。
【0067】
抗原結合断片、ＶＨ及び／またはＶＬドメイン、ならびにコードする核酸分子及びベクターは、それらの天然環境から、実質的に純粋もしくは均質な形態で、または核酸の場合、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸もしくは起源の遺伝子を含まないかもしくは実質的に含まずに、単離及び／または精製することができる。
【0068】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は、当該技術分野で周知である。抗体の産生に好適な細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄｓ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照されたい。簡潔には、好適な宿主細胞としては、細菌、植物細胞、哺乳動物細胞、ならびに酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞が挙げられる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。本発明と適合する任意のタンパク質発現系を使用して、開示される抗体を産生し得る。好適な発現系としては、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄｓ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９に記載されるトランスジェニック動物が挙げられる。
【0069】
好適なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有するように選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドまたはウイルス、例えば、ファージまたはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技法及びプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【0070】
本開示のさらなる態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる態様は、かかる核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技法を用いることができる。真核細胞の場合、好適な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、及び、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、または昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用した形質導入を含み得る。細菌細胞の場合、好適な技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及び細菌ファージを使用したトランスフェクションを含み得る。細胞内への核酸の導入に続いて、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を引き起こすか、またはそれを可能にすることができる。
【0071】
使用方法
開示される抗ＫＬＲＧ１抗体は、免疫応答のＫＬＲＧ１関連調節を調節することが可能である。特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化は、ＫＬＲＧ１シグナル伝達の調節によって媒介される。開示される抗体は、それらの使用方法に応じて、ＫＬＲＧ１のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。本抗体を使用して、哺乳動物、特にヒトにおける医学的障害を予防、診断、または治療することができる。本発明の抗体は、ＫＬＲＧ１またはＫＬＲＧ１発現細胞を単離するためにも使用することができる。さらに、抗体を使用して、障害の危険性にあるもしくはその影響を受けやすい、または異常なＫＬＲＧ１発現もしくは機能に関連する障害を有する対象を治療することができる。
開示される抗ＫＬＲＧ１抗体は、免疫応答のＫＬＲＧ１関連調節を調節することが可能である。特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化は、ＫＬＲＧ１シグナル伝達の調節によって媒介される。開示される抗体は、それらの使用方法に応じて、ＫＬＲＧ１のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。本抗体を使用して、哺乳動物、特にヒトにおける医学的障害を予防、診断、または治療することができる。本発明の抗体は、ＫＬＲＧ１またはＫＬＲＧ１発現細胞を単離するためにも使用することができる。さらに、抗体を使用して、障害の危険性にあるもしくはその影響を受けやすい、または異常なＫＬＲＧ１発現もしくは機能に関連する障害を有する対象を治療することができる。
【0072】
本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞活性化の調節が望ましい状況で、例えば、ある種の癌及び感染症において、使用することができる。
【0073】
リンパ球活性化の減少が望ましい場合、本発明の抗ＫＬＲＧ１抗体は、細胞傷害性（またはＣＤ８＋）Ｔ及びＮＫ細胞活性化のＫＬＲＧ１関連弱毒化を高めるために、ＫＬＲＧ１に対するアゴニストとして使用することができる。
【0074】
ある特定の状況下において、がんまたは感染症を治療するために、患者の免疫応答を誘発または増強することが望ましい場合がある。開示される方法によって治療または予防される障害には、限定されないが、微生物（例えば、細菌）、ウイルス（例えば、インフルエンザ等の全身性ウイルス感染症、ヘルペスまたは帯状疱疹等のウイルス性皮膚疾患）、または寄生虫による感染、ならびに癌（例えば、黒色腫及び前立腺癌）が含まれる。
【0075】
抗ＫＬＲＧ１抗体による細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞活性化は、Ｔ及びＮＫ細胞応答を増強する。かかる場合、抗体はＫＬＲＧ１のアンタゴニストとして作用する。したがって、いくつかの実施形態では、抗体を使用して、ＫＬＲＧ１に関連する下方制御活性、すなわち、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞活性化の下方制御に関連する活性を阻害または低減することができる。実施例で示されるように、拮抗する抗ＫＬＲＧ１抗体によるＫＬＲＧ１／Ｅ－カドヘリン相互作用の遮断は、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞活性化におけるＫＬＲＧ１経路の下方制御的役割と一致して、これらの細胞によるＴ細胞増殖応答及びＩＦＮγ分泌の増強をもたらす。様々な実施形態では、抗体は、Ｅ－カドヘリンのＫＬＲＧ１への結合を、約５０ｎＭ未満、及びより好ましくは約４０、３０、２０、１０、または５ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害する。Ｅ－カドヘリン結合の阻害は、実施例６に記載されるように、または当該技術分野で既知の技法を使用して測定することができる。
【0076】
本発明の抗体または抗体組成物は、治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象の年齢、状態、及び性別、ならびに対象の症状の重症度によって変化し得る。抗体の治療有効量は、約０．００１～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１～約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、治療の観察された効果に合わせて必要に応じて調整され得る。適切な用量は、治療を行う医師によって臨床的適応に基づいて選択される。
【0077】
抗体は、投与後の最も長い時間にわたって抗体の循環レベルを最大化するため、ボーラス用量として与えられてもよい。ボーラス投与後にも持続注入を使用することもできる。
【0078】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）はまた、患者から単離し、本発明の抗体とともにエクスビボでインキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化は、対象から免疫細胞を取り出し、免疫細胞をインビトロで本発明の抗ＫＬＲＧ１抗体と接触させることによって調節することができる）。かかる実施形態では、抗ＫＬＲＧ１抗体は、免疫細胞の表面上のＫＬＲＧ１分子がかかる抗体に結合すると「架橋」するように、多価形態で使用されてもよい。例えば、抗ＫＬＲＧ１抗体は、固体支持体、例えば、ビーズに結合することができるか、または二次抗体を介して架橋することができる。次に、免疫細胞は、当該技術分野で知られる方法を使用して単離され、患者に再移植され得る。
【0079】
別の態様では、本発明の抗体は、ＫＬＲＧ１を発現する細胞への別の治療薬または細胞傷害性剤（例えば、毒素）の送達のための標的化剤として使用することができる。本方法は、治療剤もしくは細胞傷害性剤にカップリングされた抗ＫＬＲＧ１抗体を、または抗体のＫＬＲＧ１への結合を可能にする条件下で投与することを含む。
【0080】
本発明の抗体は、生体試料中のＫＬＲＧ１の存在を検出するためにも使用し得る。検出されるＫＬＲＧ１の量は、ＫＬＲＧ１の発現レベルと相関し得るものであり、これは、次いで、対象における免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の活性化状態と相関する。
【0081】
抗体を用いる検出方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降を含む。抗体は、ＫＬＲＧ１を検出するためにこれらの技法のうちの１つ以上を組み込む診断キットにおいて提供され得る。かかるキットは、他の構成要素、パッケージ、説明書、またはタンパク質の検出を補助するための他の材料を含有してもよい。
【0082】
抗体が診断目的である場合、例えば、リガンド基（ビオチン等）または検出可能なマーカー基（蛍光基、放射性同位体、または酵素等）でそれらを修飾することが望ましい場合がある。必要に応じて、本発明の抗体は、従来の技法を使用して標識され得る。好適な検出可能な標識としては、例えば、フルオロフォア、発色団、放射性原子、電子高密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｎｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ）、酵素、及び特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、典型的には、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素に変換する能力によって検出することができる。検出のために、好適な結合パートナーには、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧ及びプロテインＡ、ならびに当技術分野で既知の多数の受容体リガンド対が含まれるが、これらに限定されない。他の置換及び可能性は、当業者には容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物と見なされる。
【0083】
本発明の抗体は、治療薬として有効なＫＬＲＧ１経路の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法に使用することができる。かかるスクリーニングアッセイでは、ＫＬＲＧ１と本発明の抗体とを組み合わせることによって第１の結合混合物を形成し、第１の結合混合物（Ｍ０）中の結合の量を測定する。ＫＬＲＧ１、抗体、及びスクリーニングされる化合物または薬剤を組み合わせることによって第２の結合混合物も形成され、第２の結合混合物（Ｍ１）中の結合の量を測定する。試験される化合物は、実施例に示されるように、別の抗ＫＬＲＧ１抗体であってもよい。次に、第１及び第２の結合混合物中の結合の量を、例えば、Ｍ１／Ｍ０比を計算することによって比較する。化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較して第２の結合混合物における結合の減少が観察される場合、免疫応答のＫＬＲＧ１関連の下方調節を調節することができると考えられる。結合混合物の製剤化及び最適化は、当業者のレベル内であり、かかる結合混合物はまた、結合を増強または最適化するために必要な緩衝液及び塩を含有し得、追加の対照アッセイが本発明のスクリーニングアッセイに含まれ得る。したがって、ＫＬＲＧ１抗体結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％を超えて低下させることが見出される化合物を同定し、次いで、必要に応じて、後述の他のアッセイまたは動物モデルにおいて障害を改善する能力について二次的にスクリーニングしてもよい。ＫＬＲＧ１と抗体との間の結合の強度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴に基づく技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定することができ、これらは全て、当該技術分野で周知である技法である。
【0084】
次いで、化合物は、実施例に記載されるようにインビトロでまたは動物モデルで試験してもよい。例えば、動物試験に従って決定される予備用量、及びヒト投与のための投与量スケーリングは、当該技術分野で許容される慣行に従って実施される。毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイまたは動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量範囲の策定に使用することができる。１つの動物モデルにおいて達成される治療有効投与量は、当該技術分野で既知の換算係数を使用して、ヒトを含む別の動物で使用するために変換し得る（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９－２４４）。
【0085】
薬学的組成物及び投与方法
本開示は、抗ＫＬＲＧ１抗体を含む組成物を提供する。かかる組成物は、薬学的使用及び患者への投与に好適であり得る。組成物は典型的には、本発明の１つ以上の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。語句「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的投与と適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。組成物はまた、補足的、追加的、または増強された治療機能を提供する他の活性化合物を含有してもよい。薬学的組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含有されてもよい。
本開示は、抗ＫＬＲＧ１抗体を含む組成物を提供する。かかる組成物は、薬学的使用及び患者への投与に好適であり得る。組成物は典型的には、本発明の１つ以上の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。語句「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的投与と適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。組成物はまた、補足的、追加的、または増強された治療機能を提供する他の活性化合物を含有してもよい。薬学的組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含有されてもよい。
【0086】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与を達成するための方法は、当業者には知られている。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮であってもよい。局所投与もしくは経口投与され得る、または粘膜を横断して伝達することが可能であり得る組成物を得ることも可能であり得る。
【0087】
皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁物として、典型的には、以下の成分の１つ以上を含み：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；アセテート、シトレートまたはホスフェート等の緩衝液；及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧を調整するための薬剤を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。かかる製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入してもよい。注射に好適な薬学的組成物は、滅菌注射液もしくは分散液を即時調製するための滅菌水溶液もしくは分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌である必要があり、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。製造及び保存条件下で安定であるべきであり、また、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール，例えばマンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエーテレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、及び／または界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【0088】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮することができる。経口投与の場合、抗体は、賦形剤と組み合わせることができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。薬学的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分のうちのいずれか、または同様の性質の化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン等の結合剤、デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはコーンスターチ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料等の香味剤。
【0089】
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によって行うこともできる。経粘膜または経皮投与のために、浸透するバリアに適切な浸透剤を製剤に使用する。かかる浸透剤は一般に当該技術分野で既知であり、例えば、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、例えば、ロゼンジ、鼻スプレー、吸入器、または座薬の使用によって達成され得る。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、腸、口、または肺の粘膜を横断して伝達することが可能であり得る（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号に記載されるＦｃＲｎ受容体媒介経路を介するもの）。経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野で一般に知られているように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化され得る。吸入による投与のために、抗体は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で送達され得る。
【0090】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、体からの急速な排出から化合物を保護する担体、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出処方物を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される抗体を含有するリポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【0091】
経口組成物または非経口組成物を、投与の容易さ及び投与量の均一性のために用量単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）に製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用される「用量単位形態」という用語は、治療される対象のために単位として用いられる投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
【0092】
本発明の組成物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、それは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
【0093】
本発明で使用される任意の組成物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。好適なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＫＬＲＧ１／カドヘリン結合アッセイ、免疫学的アッセイ他のアッセイ、例えば、実施例に記載されるようなアッセイが挙げられる。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量範囲の策定に使用することができる。用量は、ＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（即ち、症状の最大半量阻害を達成する抗体の濃度）を達成するために動物モデルで策定できる。血漿における循環レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の投与量の効果を、好適なバイオアッセイによって監視することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び使用される投与経路に応じて変化し得る。
【0094】
以下の実施例は、本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではない。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変更することなく実施され得る多数の修正及び変形を認識するであろう。かかる変更及び変形は、本発明の範囲内に包含される。本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例0095】
実施例１：組換えタンパク質の産生
組換えタンパク質は、標準分子クローニング及び発現プロトコルによって産生され、ヒトＫＬＲＧ１ ＥＣＤ（配列番号８９）、カニクイザルＫＬＲＧ１ ＥＣＤ（配列番号９０）、及びヒトＥ－カドヘリン（配列番号９１）が含まれ、これらのアミノ酸配列は、以下の表６に示される。組換えタンパク質を、それぞれのｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、哺乳動物ＨＥＫ２９３中で一過性トランスフェクションすることによって、ＦＣ融合またはＨＩＳタグ付きバージョンとして産生した。発現したタンパク質の精製は、ＦＣ融合バージョンについてはプロテインＡ親和性樹脂、及びＨＩＳタグ付きタンパク質についてはニッケル－ＮＴＡ樹脂を使用してクロマトグラフィーによって行われた。精製した全てのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって特徴付けて、純度及び分子量を確認した。
組換えタンパク質は、標準分子クローニング及び発現プロトコルによって産生され、ヒトＫＬＲＧ１ ＥＣＤ（配列番号８９）、カニクイザルＫＬＲＧ１ ＥＣＤ（配列番号９０）、及びヒトＥ－カドヘリン（配列番号９１）が含まれ、これらのアミノ酸配列は、以下の表６に示される。組換えタンパク質を、それぞれのｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、哺乳動物ＨＥＫ２９３中で一過性トランスフェクションすることによって、ＦＣ融合またはＨＩＳタグ付きバージョンとして産生した。発現したタンパク質の精製は、ＦＣ融合バージョンについてはプロテインＡ親和性樹脂、及びＨＩＳタグ付きタンパク質についてはニッケル－ＮＴＡ樹脂を使用してクロマトグラフィーによって行われた。精製した全てのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって特徴付けて、純度及び分子量を確認した。
【表6】
【0096】
抗体の全長抗原への結合を試験するために、免疫化抗原として、及び機能的Ｔ細胞アッセイにおける標的細胞として使用されるように、安定した細胞株が開発された。開発された細胞株には、完全長ヒトＫＬＲＧ１を発現するＣＨＯ及び完全長カニクイザルＫＬＲＧ１を発現するＣＨＯが含まれる。安定な細胞株を、目的のタンパク質をコードするｐＣＤＮＡ４プラスミドでＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって得た。トランスフェクション後、細胞を５００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８に曝露して、安定した組み込まれたプラスミドを選択した。細胞株を、発現についてＦＡＣＳによってさらに特徴付け、均質かつ安定した発現を選択するために選別した。
【0097】
ＣＤ３アゴニスト及びＥ－カドヘリンで二重トランスフェクトされた安定なＣＨＯ細胞を、ヒトＴ細胞のＫＬＲＧ１の遮断の効果を実証するための機能アッセイに使用した。ＣＤ３アゴニスト及びＥ－カドヘリンの共発現を、適切な抗体を用いた２色のＦＡＣＳによって確認した。
【0098】
実施例２：抗ＫＬＲＧ１抗体の生成
抗体ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２及びＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７は、ＫＬＲＧ１の細胞外ドメインに対するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ヒトＫＬＲＧ１に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を、ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１による雌ＢＡＬＢ／ｃマウスならびにＳＪＬマウスの標準免疫化、ならびにその後ハイブリドーマのスクリーニングによって生成した。多様な数の抗体ヒットを生成するために、いくつかの免疫戦略が採用されてきた。簡潔に述べると、ＳＪＬ及びＢａｌｂ／ｃマウスに、ｃＤＮＡ、組換え抗原、または目的の抗原を発現するＣＨＯ細胞のいずれかで繰り返し免疫化させた。抗原特異的抗体力価をＥＬＩＳＡによって定期的に監視し、適切な力価、通常は１：１０００～１：１００００の希釈因子に到達したときに動物を屠殺した。屠殺したマウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生し、その後培養し、単一細胞にサブクローニングした。安定したクローンをスケールアップし、条件培地を収集し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって抗ＫＬＲＧ１抗体の発現について試験した。
抗体ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２及びＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７は、ＫＬＲＧ１の細胞外ドメインに対するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ヒトＫＬＲＧ１に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を、ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１による雌ＢＡＬＢ／ｃマウスならびにＳＪＬマウスの標準免疫化、ならびにその後ハイブリドーマのスクリーニングによって生成した。多様な数の抗体ヒットを生成するために、いくつかの免疫戦略が採用されてきた。簡潔に述べると、ＳＪＬ及びＢａｌｂ／ｃマウスに、ｃＤＮＡ、組換え抗原、または目的の抗原を発現するＣＨＯ細胞のいずれかで繰り返し免疫化させた。抗原特異的抗体力価をＥＬＩＳＡによって定期的に監視し、適切な力価、通常は１：１０００～１：１００００の希釈因子に到達したときに動物を屠殺した。屠殺したマウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生し、その後培養し、単一細胞にサブクローニングした。安定したクローンをスケールアップし、条件培地を収集し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって抗ＫＬＲＧ１抗体の発現について試験した。
【0099】
実施例３：抗ＫＬＲＧ１遮断抗体の選択
ハイブリドーマ産生抗体を、ヒトＫＬＲＧ１ ＥＣＤ及びカニクイザルＫＲＧ１ ＥＣＤへの結合についてスクリーニングした。両方の抗原間の交差反応性を有する抗体を選択して、スクリーニングの次の段階に進み、ＫＬＲＧ１とＥ－カドヘリンとの間の相互作用を中和するそれらの能力を決定した。抗体を、ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１へのそれらの結合ＥＣ５０に従ってランク付けし、Ｅ－カドヘリン競合アッセイにおいて、それらのＩＣ５０に従ってさらに優先順位付けした。合計４８個の抗体をこれらの基準に従って選択した。細胞系アッセイにおける機能特性評価のために、８つの抗体が優先された。表３は、選択された８つのマウス抗体の可変領域アミノ酸配列をまとめ、表４は、選択された８つのマウス抗体のＣＤＲ領域を示す。抗体を、表７に要約される配列ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）モチーフの存在に従ってさらにランク付けした。ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２のＣＤＲ－Ｌ１に脱アミド部位（ＮＧ）が見出され、これは薬物材料の安定性製造可能性及び活性に影響を及ぼし得る。この潜在的なライアビリティを取り除くために、一連の変異体を構築し、試験した。具体的には、ＮＧモチーフは、結合のルース（ｌｏｏｓ）なしでＮＡ、ＱＧ、及びＫＧ配列で置換することができる。マウス抗体は、ＣＤＲ領域をヒトフレームワークに移植することによってヒト化することができる。表１は、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１）、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２）、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７）のヒト化構築物の可変領域配列の例を示す。さらに、親和性、効力、または生物物理学的特徴を改善するために、ＣＤＲ領域に保存的変異を行うことができる。表５は、ＣＤＲ領域に行われ得る保存的変異のリストをまとめている。モノクローナル抗体を、互いに競合するそれらの能力に従ってエピトープビニングした。抗体は、３つの異なるビンにグループ化することができることが見出され、ＢＩＮ１には、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５が含まれる。ＢＩＮ２には、ＭＡＢ２５、ＭＡＢ０３１が含まれる。ＢＩＮ３には、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８が含まれる。抗体を、可変マウス領域をヒトＩｇＧ定常フレームワーク上にクローニングすることによってキメラとして産生し、機能アッセイで試験して、ヒトＴ細胞上でのそれらの機能活性を決定し、本明細書に記載した。
ハイブリドーマ産生抗体を、ヒトＫＬＲＧ１ ＥＣＤ及びカニクイザルＫＲＧ１ ＥＣＤへの結合についてスクリーニングした。両方の抗原間の交差反応性を有する抗体を選択して、スクリーニングの次の段階に進み、ＫＬＲＧ１とＥ－カドヘリンとの間の相互作用を中和するそれらの能力を決定した。抗体を、ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１へのそれらの結合ＥＣ５０に従ってランク付けし、Ｅ－カドヘリン競合アッセイにおいて、それらのＩＣ５０に従ってさらに優先順位付けした。合計４８個の抗体をこれらの基準に従って選択した。細胞系アッセイにおける機能特性評価のために、８つの抗体が優先された。表３は、選択された８つのマウス抗体の可変領域アミノ酸配列をまとめ、表４は、選択された８つのマウス抗体のＣＤＲ領域を示す。抗体を、表７に要約される配列ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）モチーフの存在に従ってさらにランク付けした。ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２のＣＤＲ－Ｌ１に脱アミド部位（ＮＧ）が見出され、これは薬物材料の安定性製造可能性及び活性に影響を及ぼし得る。この潜在的なライアビリティを取り除くために、一連の変異体を構築し、試験した。具体的には、ＮＧモチーフは、結合のルース（ｌｏｏｓ）なしでＮＡ、ＱＧ、及びＫＧ配列で置換することができる。マウス抗体は、ＣＤＲ領域をヒトフレームワークに移植することによってヒト化することができる。表１は、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０１）、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０２）、及びＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７（ＡＢＣ＿ＨＧ１Ｎ０７）のヒト化構築物の可変領域配列の例を示す。さらに、親和性、効力、または生物物理学的特徴を改善するために、ＣＤＲ領域に保存的変異を行うことができる。表５は、ＣＤＲ領域に行われ得る保存的変異のリストをまとめている。モノクローナル抗体を、互いに競合するそれらの能力に従ってエピトープビニングした。抗体は、３つの異なるビンにグループ化することができることが見出され、ＢＩＮ１には、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０１、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０２、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０３、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０４、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０５が含まれる。ＢＩＮ２には、ＭＡＢ２５、ＭＡＢ０３１が含まれる。ＢＩＮ３には、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０７、ＡＢＣ＿Ｇ１Ｎ０８が含まれる。抗体を、可変マウス領域をヒトＩｇＧ定常フレームワーク上にクローニングすることによってキメラとして産生し、機能アッセイで試験して、ヒトＴ細胞上でのそれらの機能活性を決定し、本明細書に記載した。
【表7】
【0100】
実施例４：ＦＡＣＳによるＫＬＲＧ１への抗体結合（ＥＣ５０）及び阻害及びＫＬＲＧ１／Ｅ－カドヘリン相互作用（ＩＣ５０）の特性評価
細胞発現ヒト及びカニクイザル－ＫＬＲＧ１への抗ＫＬＲＧ１モノクローナル抗体の結合をＦＡＣＳによって実行した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を安定にトランスフェクトして、完全長ヒトＫＬＲＧ１（ＣＨＯ－ヒト－ＫＬＲＧ１）及びカニクイザルＫＬＲＧ１（ＣＨＯ－カニクイザル－ＫＬＲＧ１）を発現させた。ＥＣ５０値は、１～１００ｎＭの範囲の濃度で様々な濃度の抗ＫＬＲＧ１モノクローナル抗体をインキュベートし、蛍光プローブと直接コンジュゲートした抗マウス検出抗体を使用して標識細胞の蛍光を測定することによって決定した。
細胞発現ヒト及びカニクイザル－ＫＬＲＧ１への抗ＫＬＲＧ１モノクローナル抗体の結合をＦＡＣＳによって実行した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を安定にトランスフェクトして、完全長ヒトＫＬＲＧ１（ＣＨＯ－ヒト－ＫＬＲＧ１）及びカニクイザルＫＬＲＧ１（ＣＨＯ－カニクイザル－ＫＬＲＧ１）を発現させた。ＥＣ５０値は、１～１００ｎＭの範囲の濃度で様々な濃度の抗ＫＬＲＧ１モノクローナル抗体をインキュベートし、蛍光プローブと直接コンジュゲートした抗マウス検出抗体を使用して標識細胞の蛍光を測定することによって決定した。
【0101】
Ｅ－カドヘリン／ＫＬＲＧ１結合を阻害するモノクローナル抗体の能力をＦＡＣＳによって測定した。ＣＨＯ－ｈＫＬＲＧ１細胞へのＥ－カドヘリンの結合は、最初に、ＫＬＲＧ１発現細胞を様々な濃度のＨＩＳのタグ付き組換えＥ－カドヘリンとインキュベートすることによって決定し、抗ＨＩＳ検出抗体を用いたＦＡＣＳによって検出した。Ｅ－カドヘリン／ＫＬＲＧ１相互作用のＥＣ５０を、この方法によって１μＭと決定した。各モノクローナル抗体のＩＣ５０値を、０．１～１００ｎＭのモノクローナル抗体の濃度を変化させる関数としてＥ－カドヘリン結合の喪失を監視することによって決定した。ＥＣ５０及びＩＣ５０値を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを使用して計算し、表８にまとめる。
【表8】
【0102】
実施例５：結合キネティクスの測定
ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１に対するヒト化抗体の結合キネティクスを、ＯＣＴＥＴ（登録商標）測定によって決定した。ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓは、バイオレイヤーインターフェロメトリー（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）技術を使用して、タンパク質及びその他の生体分子のそれらのパートナーへの結合をリアルタイムで直接監視し、速度論的結合定数の分析を提供する。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｏｒｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｂｌｉ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌを参照されたく、その内容は、それに関連する全てのリンク及びサブリンクを含め、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実験セットアップは、ストレプトアビジンＯＣＴＥＴ（登録商標）センサー上にビオチン化組換え抗原（ヒト－ＫＬＲＧ－ＥＣＤまたはカニクイザル－ＫＬＲＧ１－ＥＣＤ）を固定化して抗原負荷センサー（ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｅｄ ｓｅｎｓｏｒ）を産生することからなる。負荷センサーは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）機器中で１００～０．１ｎＭの様々な濃度の各ヒト化抗体に曝露され、抗体／抗原複合体の会合速度定数（Ｋｏｎ）を測定するために６００秒間データを収集する。次のステップでは、センサーを、抗体を有しない１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液の溶液に６００秒間曝露して、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を観察する。次いで、得られたデータをＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析ソフトウェアを使用して１：１の結合キネティクスモデルに適合させてＫＤを計算する。この方法によって誘導される速度論的結合パラメータを、３つのヒト化抗体について表９にまとめる。
ヒト及びカニクイザルＫＬＲＧ１に対するヒト化抗体の結合キネティクスを、ＯＣＴＥＴ（登録商標）測定によって決定した。ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓは、バイオレイヤーインターフェロメトリー（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）技術を使用して、タンパク質及びその他の生体分子のそれらのパートナーへの結合をリアルタイムで直接監視し、速度論的結合定数の分析を提供する。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｏｒｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｂｌｉ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌを参照されたく、その内容は、それに関連する全てのリンク及びサブリンクを含め、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実験セットアップは、ストレプトアビジンＯＣＴＥＴ（登録商標）センサー上にビオチン化組換え抗原（ヒト－ＫＬＲＧ－ＥＣＤまたはカニクイザル－ＫＬＲＧ１－ＥＣＤ）を固定化して抗原負荷センサー（ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｅｄ ｓｅｎｓｏｒ）を産生することからなる。負荷センサーは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）機器中で１００～０．１ｎＭの様々な濃度の各ヒト化抗体に曝露され、抗体／抗原複合体の会合速度定数（Ｋｏｎ）を測定するために６００秒間データを収集する。次のステップでは、センサーを、抗体を有しない１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液の溶液に６００秒間曝露して、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を観察する。次いで、得られたデータをＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析ソフトウェアを使用して１：１の結合キネティクスモデルに適合させてＫＤを計算する。この方法によって誘導される速度論的結合パラメータを、３つのヒト化抗体について表９にまとめる。
【表9】
【0103】
実施例６：ＫＬＲＧ１遮断抗体の機能活性の特性評価
ＫＬＲＧ１とそのリガンドとの相互作用の遮断は、ＩＦＮγの産生及びＴ細胞の増殖（増殖指数）に対するＫＬＲＧ１シグナル伝達における抗体媒介性遮断の効果を測定することにより、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化効果を有する。免疫系の細胞に対するＫＬＲＧ１遮断の効果を実証するため、健康なドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ３アゴニスト及びＥ－カドヘリン（ｅＡＰＣ）を共発現するＣＨＯ細胞株と共培養して試験した。このアッセイは、ＣＤ３刺激がＥ－カドヘリンの阻害効果によって打ち消される２つの競合するシグナルをＴ細胞に提供することによって機能する。ＫＬＲＧ１シグナル伝達が抗ＫＬＲＧ１抗体によって遮断されると、抑制性シグナルが破壊され、細胞表面上で発現されるＣＤ３アゴニストとの相互作用に従ってＴ細胞が活性化される。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表１０及び図１にまとめる。
ＫＬＲＧ１とそのリガンドとの相互作用の遮断は、ＩＦＮγの産生及びＴ細胞の増殖（増殖指数）に対するＫＬＲＧ１シグナル伝達における抗体媒介性遮断の効果を測定することにより、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化効果を有する。免疫系の細胞に対するＫＬＲＧ１遮断の効果を実証するため、健康なドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ３アゴニスト及びＥ－カドヘリン（ｅＡＰＣ）を共発現するＣＨＯ細胞株と共培養して試験した。このアッセイは、ＣＤ３刺激がＥ－カドヘリンの阻害効果によって打ち消される２つの競合するシグナルをＴ細胞に提供することによって機能する。ＫＬＲＧ１シグナル伝達が抗ＫＬＲＧ１抗体によって遮断されると、抑制性シグナルが破壊され、細胞表面上で発現されるＣＤ３アゴニストとの相互作用に従ってＴ細胞が活性化される。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって測定し、結果を表１０及び図１にまとめる。
【表10】
【0104】
このデータは、Ｅ－カドヘリンがヒトＴ細胞対して阻害効果を有し、遮断抗体によるＫＬＲＧ１シグナル伝達の遮断によって逆転することができることを実証する。
【0105】
表１１及び図２に提示されるデータは、ＫＬＲＧ１／Ｅ－カドヘリン相互作用の遮断が、ｅＡＰＣに応答する増殖指数を測定することによって、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をもたらすことを実証する。このアッセイでは、ｈ－エカドヘリン及びＣＤ３アゴニスト剤でＣＨＯ細胞を安定的に形質導入することによってｅＡＰＣを産生した。次に、このように産生したｅＡＰＣを、１０マイクログラム／ｍｌの試験抗体またはアイソタイプ対照の存在下で健康なボランティアから単離したばかりのＣＤ８＋Ｔ細胞と３日間共インキュベートした。陽性対照試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３を安定的に発現するが抑制性リガンドＥ－カドヘリンの発現を欠くＣＨＯ細胞とインキュベートすることによって調製し、したがって、ＣＨＯ細胞上に発現される抗ＣＤ３によるＣＤ８＋Ｔ細胞の非抑制性刺激を可能にした。結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が予想通りＣＤ３刺激に応答して増殖し、ｅＡＰＣ上の抑制性リガンドＥ－カドヘリン共発現がＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを示す。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、中和抗体によるＫＬＲＧ１の遮断によって回復することができる。
【表11】
【0106】
表１２及び図３に提示されるデータは、ＩＦＮγ分泌アッセイにおけるＴ細胞活性と抗ＫＬＲＧ１中和剤抗体の遮断活性との間の相関を示す。各抗体のＩＣ５０値はＥ－カドヘリン結合阻害研究から導き出され、ＣＤ８＋Ｔ細胞ＩＦＮγ放出アッセイで測定したＩＦＮγ産生レベルに対してプロットした。相関は、より低いＩＣ５０値（例えば、より強力なＫＬＲＧ１／Ｅ－カドヘリン結合の遮断剤）を有する抗体が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるより高いレベルのＩＦＮγ放出をもたらすことを示す。このデータは、ＫＬＲＧ１の抗体遮断がＥ－カドヘリン依存的様式でＴ細胞活性の回復をもたらすことを示す。
【表12】
【図1】
【図2】
【図3】
【外国語明細書】