&c=P_A1&t=2067461406)
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024157553
(43)【公開日】2024-11-07
(54)【発明の名称】固形がん患者の予後を予測するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20241030BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241030BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241030BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20241030BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241030BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20241030BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241030BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241030BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241030BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20241030BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6827 Z
A61P35/00
A61P1/18
A61P11/00
A61P1/04
A61P1/16
A61P35/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024071280
(22)【出願日】2024-04-25
(31)【優先権主張番号】P 2023071372
(32)【優先日】2023-04-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】590002389
【氏名又は名称】静岡県
(71)【出願人】
【識別番号】390037006
【氏名又は名称】株式会社エスアールエル
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】今村 泰輔
(72)【発明者】
【氏名】蘆田 良
(72)【発明者】
【氏名】杉浦 禎一
(72)【発明者】
【氏名】上坂 克彦
(72)【発明者】
【氏名】浦上 研一
(72)【発明者】
【氏名】下田 勇治
(72)【発明者】
【氏名】長嶋 剛史
(72)【発明者】
【氏名】鎌田 福美
(72)【発明者】
【氏名】山口 建
(72)【発明者】
【氏名】釼持 広知
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA17
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】本発明は、固形がん患者由来のｃｔＤＮＡにおける遺伝子変異を高感度に検出し、固形がんの有用なバイオマーカーを見いだすとともに、患者の予後予測や、治療法の有効性予測に役立てることを課題とする。
【解決手段】患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、を含み、前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける方法により、固形がん患者の予後を予測する。
【選択図】図５
【解決手段】患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、を含み、前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける方法により、固形がん患者の予後を予測する。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固形がん患者の予後を予測するための方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、
を含み、
前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける、
前記方法。
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、
を含み、
前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける、
前記方法。
【請求項2】
対象とする遺伝子が、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＣＳＤＥ１、ＮＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ－ＡＳ１、ＥＲＢＢ４、及びＰＩＫ３ＣＡからなる群から選択される１又は２以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ドライバー変異が、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３ Ｒ２１３＊、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ３０６＊、ＴＰ５３ Ｙ２２０＊、ＴＰ５３ Ｉ２５５Ｆ、ＴＰ５３ Ｎ２３９Ｄ、ＴＰ５３ Ｐ２７８Ａ、ＴＰ５３ Ｑ１９２ＹｆｓＴｅｒ１４、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３ Ｓ２４１Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＫＩＴ Ｇ５９２Ｗ、ＫＩＴ Ｋ５５８Ｎ、ＫＩＴ Ｌ５８９Ｒ、ＡＰＣ Ｅ１３０６＊、ＡＰＣ Ｒ８７６＊、ＡＰＣ Ｓ１４３６ｆｓ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｃ、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ、ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｇ、ＥＧＦＲ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ－ＡＳ１ Ｓ７６８Ｉ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｃ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｖ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＡＬＫ Ｇ１１２３Ｄ、ＢＲＡＦ Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＣＡ２ Ｐ１５１９ｆｓ、ＣＤＫＮ２Ａ Ｒ８０＊、ＧＮＡＳ Ｒ８４４Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、ＫＥＡＰ１ Ｇ４２３Ｖ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｐ１２４Ｌ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｆ１２９Ｌ、ＭＴＯＲ Ｃ１４８３Ｙ、ＥＲＢＢ４ Ｒ８４７Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｄ３５２Ｙ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、及びＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｋからなる群から選択される１又は２以上を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ドライバー変異が、体細胞変異である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
固形がんが、膵がん、肺がん、大腸がん、又は甲状腺がんである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
膵がんが、切除可能膵がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
血液試料が、固形がんの切除術前に患者から採取されたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項8】
血液試料が、血漿である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項9】
予後が、固形がんの切除術後の予後である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項10】
予後不良が、全生存期間の悪化、がんの無再発生存期間の悪化、及びがんの転移からなる群から選択される１又は２以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項11】
無再発生存期間の悪化が、切除術後６か月以内の早期再発である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
がんの転移が、肝転移である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
固形がん患者を層別化する方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること、
を含む、前記方法。
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること、
を含む、前記方法。
【請求項14】
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法であって、
請求項１３に記載の方法で前記患者を層別化すること、及び
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること、
を含む、前記方法。
請求項１３に記載の方法で前記患者を層別化すること、及び
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項16】
対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価することが、
対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること、
前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること、及び
前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること、
を含む、請求項１５に記載の方法。
対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること、
前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること、及び
前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
治療法が、薬物療法又は術後補助療法である、請求項１４～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
請求項１又は１３～１６のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、対象とする遺伝子のドライバー変異の数又はアクショナブル変異の有無を含む遺伝子変化を確認することに使用するための試薬を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固形がん患者の予後を予測するための方法、固形がん患者を層別化する方法、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法、及びそれらの方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
膵がん（Pancreatic cancer：ＰＣ）は、近年、がん関連の死因の第３位となっており
、今後１０年以内にがん関連の死因の第２位になると予想されている。治癒を達成するためには根治的切除術が不可欠だが、局所進行性及び転移性疾患のエビデンスがない患者は、すべての膵がん患者の１５～２０％を占めるにすぎない。周術期の化学療法及び／又は放射線療法レジメン、手術手技、並びに周術期管理は大きく進歩しているが、膵がんは依然として極めて予後不良な疾患である。臨床の場では、がん抗原１９－９（ＣＡ１９－９）が最も有用な分子バイオマーカーであるが、膵がんの有望な潜在バイオマーカーとして報告された分子はほとんどない。近年、膵がんの遺伝子変化をターゲットとした個別化治療開発にあたり、治療に対する感受性を特定したり、予後を予測したりするためのバイオマーカーの必要性が強調されている。また、膵がんに限らず、他の固形がん全般においても同様のバイオマーカーが依然として必要とされている。
、今後１０年以内にがん関連の死因の第２位になると予想されている。治癒を達成するためには根治的切除術が不可欠だが、局所進行性及び転移性疾患のエビデンスがない患者は、すべての膵がん患者の１５～２０％を占めるにすぎない。周術期の化学療法及び／又は放射線療法レジメン、手術手技、並びに周術期管理は大きく進歩しているが、膵がんは依然として極めて予後不良な疾患である。臨床の場では、がん抗原１９－９（ＣＡ１９－９）が最も有用な分子バイオマーカーであるが、膵がんの有望な潜在バイオマーカーとして報告された分子はほとんどない。近年、膵がんの遺伝子変化をターゲットとした個別化治療開発にあたり、治療に対する感受性を特定したり、予後を予測したりするためのバイオマーカーの必要性が強調されている。また、膵がんに限らず、他の固形がん全般においても同様のバイオマーカーが依然として必要とされている。
【0003】
セルフリー核酸が末梢血中に存在することが知られている。非侵襲的な採血を用いた腫瘍の連続的な分子モニタリング、いわゆる「リキッドバイオプシー（ＬＢ）」は、がん患者にとって理想的な選択肢となり、「個別化」がん管理を発展させる可能性がある。セルフリー循環腫瘍ＤＮＡ（circulating tumor DNA：ｃｔＤＮＡ）は、腫瘍の早期発見及び
腫瘍動態のモニタリングを改善するバイオマーカーとして期待されている（非特許文献１）。
腫瘍動態のモニタリングを改善するバイオマーカーとして期待されている（非特許文献１）。
【0004】
例えば、膵がんの主要なドライバー遺伝子のうち、ＫＲＡＳ変異は膵がん症例の多数で検出されており、そのほとんどはホットスポット（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、又はＱ６１Ｈ）に位置している。そのため、ｃｔＤＮＡ中の低存在量の点変異を定量する主な方法は、デジタルドロップレットポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）又はＫＲＡＳ変異のターゲットシークエンスであった。しかし、従来のｃｔＤＮＡアッセイでは検出感度が不十分であり、正常細胞で生じる変異（例えば、クローン性造血に関連する体細胞変異）が混在するため、がん特異的な変異を同定できなかった（非特許文献２）。また、切除可能膵がんを含む早期がんに特異的なゲノム変化の同定は困難であることが指摘されていた（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Nat Med. 2008;14(9):985-90.
【非特許文献2】Molecular oncology. 2020;14(8):1719-30.
【非特許文献3】Gastroenterology. 2019;156(1):108-18.e4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
このように、ｃｔＤＮＡの最適な検出方法についてのコンセンサスは得られておらず、切除可能膵がん等の固形がんにおけるｃｔＤＮＡの体細胞変異をパネルベースで網羅的に研究した例は報告されていない。そこで、本発明は、膵がん等の固形がんの患者由来のｃｔＤＮＡにおける遺伝子変異を高感度に検出し、固形がんの有用なバイオマーカーを見いだすとともに、患者の予後予測や、治療法の有効性予測に役立てることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、膵がん等の固形がん患者において術前血漿から抽出したセルフリーＤＮＡを用いて、４１０遺伝子を対象としたパネルベースの網羅的研究を行い、バリアントコールとペア解析（腫瘍と正常）を実施した。また、セルフリーＤＮＡで検出されたドライバー変異の数が予後に及ぼす影響について検討した。その結果、セルフリーＤＮＡで検出されたドライバー変異の数が膵がん等の固形がんの予後バイオマーカーであり、早期再発の予測因子であることを初めて見いだした。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の事項により特定されるとおりのものである。
〔１〕
固形がん患者の予後を予測するための方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、
を含み、
前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける、
前記方法。
〔２〕
対象とする遺伝子が、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＣＳＤＥ１、ＮＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ－ＡＳ１、ＥＲＢＢ４、及びＰＩＫ３ＣＡからなる群から選択される１又は２以上を含む、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕
ドライバー変異が、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３ Ｒ２１３＊、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ３０６＊、ＴＰ５３ Ｙ２２０＊、ＴＰ５３ Ｉ２５５Ｆ、ＴＰ５３ Ｎ２３９Ｄ、ＴＰ５３ Ｐ２７８Ａ、ＴＰ５３ Ｑ１９２ＹｆｓＴｅｒ１４、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３ Ｓ２４１Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＫＩＴ Ｇ５９２Ｗ、ＫＩＴ Ｋ５５８Ｎ、ＫＩＴ Ｌ５８９Ｒ、ＡＰＣ Ｅ１３０６＊、ＡＰＣ Ｒ８７６＊、ＡＰＣ Ｓ１４３６ｆｓ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｃ、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ、ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｇ、ＥＧＦＲ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ－ＡＳ１ Ｓ７６８Ｉ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｃ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｖ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＡＬＫ Ｇ１１２３Ｄ、ＢＲＡＦ Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＣＡ２ Ｐ１５１９ｆｓ、ＣＤＫＮ２Ａ Ｒ８０＊、ＧＮＡＳ Ｒ８４４Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、ＫＥＡＰ１ Ｇ４２３Ｖ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｐ１２４Ｌ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｆ１２９Ｌ、ＭＴＯＲ Ｃ１４８３Ｙ、ＥＲＢＢ４ Ｒ８４７Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｄ３５２Ｙ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、及びＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｋからなる群から選択される１又は２以上を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
ドライバー変異が、体細胞変異である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
固形がんが、膵がん、肺がん、大腸がん、又は甲状腺がんである、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
膵がんが、切除可能膵がんである、上記〔５〕に記載の方法。
〔７〕
血液試料が、固形がんの切除術前に患者から採取されたものである、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
血液試料が、血漿である、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
予後が、固形がんの切除術後の予後である、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
予後不良が、全生存期間の悪化、がんの無再発生存期間の悪化、及びがんの転移からなる群から選択される１又は２以上である、上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
無再発生存期間の悪化が、切除術後６か月以内の早期再発である、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕
がんの転移が、肝転移である、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕
固形がん患者を層別化する方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること、
を含む、前記方法。
〔１４〕
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための、上記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法であって、
上記〔１３〕に記載の方法で前記患者を層別化すること、及び
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること、
を含む、前記方法。
〔１６〕
対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価することが、
対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること、
前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること、及び
前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること、
を含む、上記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕
治療法が、薬物療法又は術後補助療法である、上記〔１４〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
上記〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、対象とする遺伝子のドライバー変異の数又はアクショナブル変異の有無を含む遺伝子変化を確認することに使用するための試薬を含む、前記キット。
〔１〕
固形がん患者の予後を予測するための方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること、
を含み、
前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付け、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける、
前記方法。
〔２〕
対象とする遺伝子が、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＣＳＤＥ１、ＮＲＡＳ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ－ＡＳ１、ＥＲＢＢ４、及びＰＩＫ３ＣＡからなる群から選択される１又は２以上を含む、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕
ドライバー変異が、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３ Ｒ２１３＊、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ３０６＊、ＴＰ５３ Ｙ２２０＊、ＴＰ５３ Ｉ２５５Ｆ、ＴＰ５３ Ｎ２３９Ｄ、ＴＰ５３ Ｐ２７８Ａ、ＴＰ５３ Ｑ１９２ＹｆｓＴｅｒ１４、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３ Ｓ２４１Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＫＩＴ Ｇ５９２Ｗ、ＫＩＴ Ｋ５５８Ｎ、ＫＩＴ Ｌ５８９Ｒ、ＡＰＣ Ｅ１３０６＊、ＡＰＣ Ｒ８７６＊、ＡＰＣ Ｓ１４３６ｆｓ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｃ、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ、ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｇ、ＥＧＦＲ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ－ＡＳ１ Ｓ７６８Ｉ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｃ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｖ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＡＬＫ Ｇ１１２３Ｄ、ＢＲＡＦ Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＣＡ２ Ｐ１５１９ｆｓ、ＣＤＫＮ２Ａ Ｒ８０＊、ＧＮＡＳ Ｒ８４４Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、ＫＥＡＰ１ Ｇ４２３Ｖ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｐ１２４Ｌ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｆ１２９Ｌ、ＭＴＯＲ Ｃ１４８３Ｙ、ＥＲＢＢ４ Ｒ８４７Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｄ３５２Ｙ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、及びＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｋからなる群から選択される１又は２以上を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
ドライバー変異が、体細胞変異である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
固形がんが、膵がん、肺がん、大腸がん、又は甲状腺がんである、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
膵がんが、切除可能膵がんである、上記〔５〕に記載の方法。
〔７〕
血液試料が、固形がんの切除術前に患者から採取されたものである、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
血液試料が、血漿である、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
予後が、固形がんの切除術後の予後である、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
予後不良が、全生存期間の悪化、がんの無再発生存期間の悪化、及びがんの転移からなる群から選択される１又は２以上である、上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
無再発生存期間の悪化が、切除術後６か月以内の早期再発である、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕
がんの転移が、肝転移である、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕
固形がん患者を層別化する方法であって、
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること、及び
前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること、
を含む、前記方法。
〔１４〕
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための、上記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法であって、
上記〔１３〕に記載の方法で前記患者を層別化すること、及び
前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること、
を含む、前記方法。
〔１６〕
対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価することが、
対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること、
前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること、及び
前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること、
を含む、上記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕
治療法が、薬物療法又は術後補助療法である、上記〔１４〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
上記〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、対象とする遺伝子のドライバー変異の数又はアクショナブル変異の有無を含む遺伝子変化を確認することに使用するための試薬を含む、前記キット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、固形がん患者の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡをドライバー変異の検出対象とすることで、検出対象を腫瘍組織とする場合と比べて、簡易かつ非侵襲的に試料を採取できる上に、高感度にドライバー変異を検出することができる。また、本発明によれば、ドライバー変異の数をバイオマーカーとすることで、高精度に患者の予後を予測することができ、さらに、治療法の有効性を予測することができる。そのため、層別化医療及び個別化医療の発展に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1(a)】患者登録及び試料採取の流れを示す図である。
【図1(b)】体細胞変異のドライバビリティの評価法を示す図である。
【図1(c)】体細胞変異のアクショナビリティの評価法を示す図である。
【図2】（ａ）膵がん患者のＬＢで同定されたtier １及びtier ２変異の頻度を示す図である。（ｂ）膵がん患者の腫瘍組織解析で同定されたtier １及びtier ２変異の頻度を表す図である。
【図3】膵がん患者のＬＢと腫瘍組織解析におけるドライバー変異の同定結果を示す図である。各患者の血漿ｃｔＤＮＡと腫瘍組織で同定された特定の変異を比較している。
【図4】（ａ）膵がん患者のｃｔＤＮＡ陽性度による全生存期間（overall survival：ＯＳ）の解析結果を示す図である。（ｂ）膵がん患者のｃｔＤＮＡ陽性度による無再発生存期間（Recurrence-free survival：ＲＦＳ）の解析結果を示す図である。
【図5】（ａ）膵がん患者のｃｔＤＮＡで検出されたtier １変異を定量化した結果を示す図である。（ｂ）膵がん患者のドライバー変異の数によってＯＳを層別化した結果を示す図である。（ｃ）膵がん患者のドライバー変異の数によってＲＦＳを層別化した結果を示す図である。
【図6】（ａ）肺がん患者、大腸がん患者、及び甲状腺がん患者のｃｔＤＮＡで検出されたtier １変異を定量化した結果を示す図である。（ｂ）肺がん患者、大腸がん患者、及び甲状腺がん患者のドライバー変異の数によってＯＳを層別化した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（本発明の方法）
本発明は、以下に詳述する第一の方法、第二の方法、及び第三の方法に関する（これらを合わせて、「本発明の方法」ということもある。）。
本発明は、以下に詳述する第一の方法、第二の方法、及び第三の方法に関する（これらを合わせて、「本発明の方法」ということもある。）。
【0012】
（第一の方法：固形がん患者の予後を予測するための方法）
本発明の第一の方法は、固形がん患者の予後を予測するための方法である。本発明の第一の方法は、以下の（工程Ａ）及び（工程Ｂ）を含む。
（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｂ）前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること。
本発明の第一の方法は、固形がん患者の予後を予測するための方法である。本発明の第一の方法は、以下の（工程Ａ）及び（工程Ｂ）を含む。
（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｂ）前記ドライバー変異の数と前記患者の予後との関連付けをすること。
【0013】
また、上記（工程Ｂ）は、以下の（工程Ｂ－１）及び（工程Ｂ－２）を含む。
（工程Ｂ－１）前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付けること。
（工程Ｂ－２）前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付けること。
（工程Ｂ－１）前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が１以上である場合、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付けること。
（工程Ｂ－２）前記関連付けにおいて、ドライバー変異の数が２以上である場合、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付けること。
【0014】
本発明の第一の方法は、固形がん患者の予後を予測するためのあらゆる方法を含む。例えば、「固形がん患者の予後を予測するためのデータを収集する方法」、「固形がん患者の予後を予測するためのデータを作成する方法」、「固形がん患者の予後を予測するためのデータを提供する方法」、及び「固形がん患者の予後を予測する方法」等を含み得る。なお、「データ」は、「情報」及び「指標」等を含む。また、「予測」は、「評価」及び「判定」等を含む。
【0015】
（第二の方法：固形がん患者を層別化する方法）
本発明の第二の方法は、固形がん患者を層別化する方法である。本発明の第二の方法は、以下の（工程Ａ）及び（工程Ｃ）を含む。
（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｃ）前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること。
本発明の第二の方法は、固形がん患者を層別化する方法である。本発明の第二の方法は、以下の（工程Ａ）及び（工程Ｃ）を含む。
（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｃ）前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること。
【0016】
本発明の第二の方法は、例えば、「固形がん患者の予後を層別化する方法（固形がん患者を予想される予後に層別化すること）」及び「固形がん患者を治療コホートに層別化する方法」を含み得る。また、本発明の「固形がん患者を層別化する方法」は、ドライバー変異の数によって層別化された群ごとに、例えば、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するため」、「固形がん患者に対する治療法の選択を補助するため」、又は「がんの再発を予防するため」に用いることもできる。ただし、さらに高精度に固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法としては、以下の第三の方法を用いることもできる。
【0017】
（第三の方法：固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法）
本発明の第三の方法は、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法である。本発明の第三の方法は、以下の（工程Ａ）、（工程Ｃ）、及び（工程Ｄ）を含む。（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｃ）前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること。
（工程Ｄ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること。
本発明の第三の方法は、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法である。本発明の第三の方法は、以下の（工程Ａ）、（工程Ｃ）、及び（工程Ｄ）を含む。（工程Ａ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること。
（工程Ｃ）前記ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に前記患者を層別化すること。
（工程Ｄ）前記患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること。
【0018】
本発明の第三の方法は、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するためのあらゆる方法を含む。例えば、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するためのデータを収集する方法」、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するためのデータを作成する方法」、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するためのデータを提供する方法」、「固形がん患者に対する特定の薬物（薬剤）の有効性を予測するための方法」、「固形がん患者に対する薬物（薬剤）選択のための方法」、及び「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測する方法」を含み得る。なお、「データ」は、「情報」及び「指標」等を含む。また、「予測」は、「評価」及び「判定」等を含む。また、「薬物（薬剤）」とは、分子標的薬又は免疫チェックポイント阻害剤等であってよく、例えば、工程Ｄで特定されるアクショナブル変異に関連する分子又は免疫チェックポイント等を標的とする分子標的薬又は免疫チェックポイント阻害剤等であってもよい。
【0019】
本発明の方法によって得られたデータは、医師等の医療関係者に提供されてもよい。本発明の方法によって得られたデータは、患者ごとのゲノム情報に基づいた治療方針の決定のために役立てることができる。ただし、本発明の方法は、医師による診断行為を含まない。なお、本発明の方法と、他の方法とを併せて総合的な予測、評価、又は判定等を行うこともできる。
【0020】
（予後）
本発明において、「予後」は、医学的な経過に関する見通しを意味し、例えば、固形がんの切除術後の経過を意味し得る。「予後」としては、例えば、全生存期間（overall survival：ＯＳ、ある治療を開始してから死亡するまでの期間）、無再発生存期間（Recurrence-free survival：ＲＦＳ、手術等でいったん完治した患者に対し、ある治療を開始してから再発するまでの期間）、一定期間後の生存率、一定期間後の無再発率、及び転移の有無等が挙げられる。一定期間とは、例えば、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年等が挙げられる。再発には、局所再発、腹膜再発、及び遠隔臓器再発が含まれる。局所再発には、所属リンパ節への再発も含まれる。転移としては、例えば、リンパ節転移、腹膜転移、肝転移、肺転移等が挙げられ、単独の部位への転移も複数の部位への転移も含まれる。
本発明において、「予後」は、医学的な経過に関する見通しを意味し、例えば、固形がんの切除術後の経過を意味し得る。「予後」としては、例えば、全生存期間（overall survival：ＯＳ、ある治療を開始してから死亡するまでの期間）、無再発生存期間（Recurrence-free survival：ＲＦＳ、手術等でいったん完治した患者に対し、ある治療を開始してから再発するまでの期間）、一定期間後の生存率、一定期間後の無再発率、及び転移の有無等が挙げられる。一定期間とは、例えば、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年等が挙げられる。再発には、局所再発、腹膜再発、及び遠隔臓器再発が含まれる。局所再発には、所属リンパ節への再発も含まれる。転移としては、例えば、リンパ節転移、腹膜転移、肝転移、肺転移等が挙げられ、単独の部位への転移も複数の部位への転移も含まれる。
【0021】
（予後を予測する）
本発明において、「予後を予測する」は、「予後」が良好又は不良である可能性を判定又は評価することを意味する。「予後不良」としては、例えば、全生存期間の悪化（全生存期間がより短いこと）、がんの無再発生存期間の悪化（無再発生存期間がより短いこと）、一定期間後の生存率の悪化（一定期間後の生存率がより低いこと）、一定期間後の無再発率の悪化（一定期間後の無再発率がより低いこと）、及び／又はがんの転移の発生等が挙げられる。無再発生存期間の悪化としては、特に切除術後６か月以内の早期再発が挙げられる。なお、生存期間の長さに差があるかどうかについては、一般的にlog-rank検定で統計学的に比較され規定されるが、これに限定されるものではない。ある一個人の患者の生存期間が長いか短いかの予測において、生存期間が長いとは、患者の病態から予測される平均的な生存期間よりも長いことを意味し得、生存期間が短いとは、患者の病態から予測される平均的な生存期間よりも短いことを意味し得る。
本発明において、「予後を予測する」は、「予後」が良好又は不良である可能性を判定又は評価することを意味する。「予後不良」としては、例えば、全生存期間の悪化（全生存期間がより短いこと）、がんの無再発生存期間の悪化（無再発生存期間がより短いこと）、一定期間後の生存率の悪化（一定期間後の生存率がより低いこと）、一定期間後の無再発率の悪化（一定期間後の無再発率がより低いこと）、及び／又はがんの転移の発生等が挙げられる。無再発生存期間の悪化としては、特に切除術後６か月以内の早期再発が挙げられる。なお、生存期間の長さに差があるかどうかについては、一般的にlog-rank検定で統計学的に比較され規定されるが、これに限定されるものではない。ある一個人の患者の生存期間が長いか短いかの予測において、生存期間が長いとは、患者の病態から予測される平均的な生存期間よりも長いことを意味し得、生存期間が短いとは、患者の病態から予測される平均的な生存期間よりも短いことを意味し得る。
【0022】
（固形がん）
本発明において、「固形がん」としては特に制限されないが、例えば、膵がん、肺がん、大腸がん、甲状腺がん、胃がん、肝がん、脳腫瘍、食道がん、十二指腸がん、小腸がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、子宮頸部がん、子宮体がん、腎がん、脾臓がん、気管がん、気管支がん、頭頸部がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、肉腫、軟部腫瘍、骨がん及び卵巣がん等が挙げられ、好ましくは、膵がん、肺がん、大腸がん、及び甲状腺がんが挙げられ、より好ましくは膵がんが挙げられる。
本発明において、「固形がん」としては特に制限されないが、例えば、膵がん、肺がん、大腸がん、甲状腺がん、胃がん、肝がん、脳腫瘍、食道がん、十二指腸がん、小腸がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、子宮頸部がん、子宮体がん、腎がん、脾臓がん、気管がん、気管支がん、頭頸部がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、肉腫、軟部腫瘍、骨がん及び卵巣がん等が挙げられ、好ましくは、膵がん、肺がん、大腸がん、及び甲状腺がんが挙げられ、より好ましくは膵がんが挙げられる。
【0023】
（膵がん）
本発明において、膵がんは、すべての切除可能性分類の膵がん、又はすべての病期（ステージ）の膵がんを含み得る。膵がんは切除可能性によって、切除可能膵がん、切除可能境界膵がん、又は切除不能膵がんに分類される。患者の予後を予測する必要がある限り、本発明において対象とする膵がんは特に制限されないが、切除可能膵がんが特に好ましい。その場合、本発明の方法によって高精度に予後を予測することによって、手術適応の検討や治療法の選択を有効に補助することができる。なお、膵がんのステージは、早期から進行するにつれて０期～IV期に分類されるが、このうち比較的早期である０期～II期の膵がんが、おおむね切除可能膵がんに該当する。
本発明において、膵がんは、すべての切除可能性分類の膵がん、又はすべての病期（ステージ）の膵がんを含み得る。膵がんは切除可能性によって、切除可能膵がん、切除可能境界膵がん、又は切除不能膵がんに分類される。患者の予後を予測する必要がある限り、本発明において対象とする膵がんは特に制限されないが、切除可能膵がんが特に好ましい。その場合、本発明の方法によって高精度に予後を予測することによって、手術適応の検討や治療法の選択を有効に補助することができる。なお、膵がんのステージは、早期から進行するにつれて０期～IV期に分類されるが、このうち比較的早期である０期～II期の膵がんが、おおむね切除可能膵がんに該当する。
【0024】
（固形がん患者）
本発明において、固形がん患者は、哺乳動物であることが挙げられ、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。本発明において、固形がん患者の性別、年齢、種（人種）等は特に制限されないが、例えば、白色人種、黒色人種、東アジア人種等の黄色人種（例えば、日本人）が挙げられる。
本発明において、固形がん患者は、哺乳動物であることが挙げられ、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。本発明において、固形がん患者の性別、年齢、種（人種）等は特に制限されないが、例えば、白色人種、黒色人種、東アジア人種等の黄色人種（例えば、日本人）が挙げられる。
【0025】
（血液試料）
血液試料は、必要に応じて適宜患者から採取して使用することができるが、特に膵がん等の固形がんの切除術前に患者から採取されたものが好ましい。その場合、本発明の方法で高精度に予後を予測することによって、切除可能膵がん等の固形がんに対する手術適応の検討や治療法の選択を有効に補助することができる。
血液試料は、必要に応じて適宜患者から採取して使用することができるが、特に膵がん等の固形がんの切除術前に患者から採取されたものが好ましい。その場合、本発明の方法で高精度に予後を予測することによって、切除可能膵がん等の固形がんに対する手術適応の検討や治療法の選択を有効に補助することができる。
【0026】
（工程Ａ）
本発明の方法は、患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること（工程Ａ）を含む。
ここで（工程Ａ）の具体的な手法は、その目的を達成しうる範囲において特に制限されないが、例えば、以下の工程（工程Ａ－１）～（工程Ａ－５）の一部又は全部を含んでいてもよい。
（工程Ａ－１）患者から採取された血液試料から血漿を分離すること。
（工程Ａ－２）血漿からセルフリーＤＮＡを抽出すること。
（工程Ａ－３）セルフリーＤＮＡ中のｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子の体細胞変異を検出すること。
（工程Ａ－４）検出された体細胞変異を、ドライバー変異であるか否かに分類すること。（工程Ａ－５）ドライバー変異に分類された体細胞変異の数を数えること。
本発明の方法は、患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認すること（工程Ａ）を含む。
ここで（工程Ａ）の具体的な手法は、その目的を達成しうる範囲において特に制限されないが、例えば、以下の工程（工程Ａ－１）～（工程Ａ－５）の一部又は全部を含んでいてもよい。
（工程Ａ－１）患者から採取された血液試料から血漿を分離すること。
（工程Ａ－２）血漿からセルフリーＤＮＡを抽出すること。
（工程Ａ－３）セルフリーＤＮＡ中のｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子の体細胞変異を検出すること。
（工程Ａ－４）検出された体細胞変異を、ドライバー変異であるか否かに分類すること。（工程Ａ－５）ドライバー変異に分類された体細胞変異の数を数えること。
【0027】
（血漿）
本発明において、患者由来の血液試料から血漿を分離して用いてもよい。血液試料から血漿を分離して用いることで、血球が排除されるために、その後の工程を効率よく行うことができる。分離方法は特に制限されないが、例えば、遠心分離又はフィルターによる方法が挙げられる。
本発明において、患者由来の血液試料から血漿を分離して用いてもよい。血液試料から血漿を分離して用いることで、血球が排除されるために、その後の工程を効率よく行うことができる。分離方法は特に制限されないが、例えば、遠心分離又はフィルターによる方法が挙げられる。
【0028】
（セルフリーＤＮＡ）
本発明において、血液試料又は血漿からのセルフリーＤＮＡの抽出方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができるが、例えば、QIAamp circulating nucleic acid kit（Qiagen社製）等の市販のキットを用いることができる。「セルフリーＤＮＡ（ｃｆ
ＤＮＡ）」とは、血中に浮遊しているＤＮＡであり、正常な血球系細胞の死滅に由来するＤＮＡのほか、がん細胞のゲノムＤＮＡに由来する循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。「ｃｔＤＮＡ」は、がん細胞が免疫によって破壊されたり、自ら細胞死（アポトーシス）を起こしたり、血中に漏出した循環腫瘍細胞が何らかの影響により血中で破壊されたりした際に、がん細胞のゲノムＤＮＡが血中に漏出したものである。なお、セルフリーＤＮＡにおいてドライバー変異が検出された場合、確率は低いものの、それが正常な血球系細胞の死滅に由来するＤＮＡ、すなわち生殖細胞系列由来のＤＮＡのドライバー変異である可能性も存在する。ただし、当該ドライバー変異が３０％未満の低変異アレル頻度であれば腫瘍細胞由来のＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）のドライバー変異である可能性が高く、当該ドライバー変異が３０％以上の高変異アレル頻度であれば正常細胞（生殖細胞系列）由来のＤＮＡのドライバー変異である可能性が高いと理解することができる。
本発明において、血液試料又は血漿からのセルフリーＤＮＡの抽出方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができるが、例えば、QIAamp circulating nucleic acid kit（Qiagen社製）等の市販のキットを用いることができる。「セルフリーＤＮＡ（ｃｆ
ＤＮＡ）」とは、血中に浮遊しているＤＮＡであり、正常な血球系細胞の死滅に由来するＤＮＡのほか、がん細胞のゲノムＤＮＡに由来する循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。「ｃｔＤＮＡ」は、がん細胞が免疫によって破壊されたり、自ら細胞死（アポトーシス）を起こしたり、血中に漏出した循環腫瘍細胞が何らかの影響により血中で破壊されたりした際に、がん細胞のゲノムＤＮＡが血中に漏出したものである。なお、セルフリーＤＮＡにおいてドライバー変異が検出された場合、確率は低いものの、それが正常な血球系細胞の死滅に由来するＤＮＡ、すなわち生殖細胞系列由来のＤＮＡのドライバー変異である可能性も存在する。ただし、当該ドライバー変異が３０％未満の低変異アレル頻度であれば腫瘍細胞由来のＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）のドライバー変異である可能性が高く、当該ドライバー変異が３０％以上の高変異アレル頻度であれば正常細胞（生殖細胞系列）由来のＤＮＡのドライバー変異である可能性が高いと理解することができる。
【0029】
（対象とする遺伝子）
本発明において、「対象とする遺伝子」のドライバー変異の検出方法は特に制限されず、公知の方法を用いることが可能であるが、特に次世代シークエンサーを用いると、多数の遺伝子のドライバー変異を効率よく検出することができる。また、多数の遺伝子を対象とする場合、パネルベースで網羅的に解析してもよく、その場合にはさらに効率よくドライバー変異を検出することができる。
本発明において、「対象とする遺伝子」のドライバー変異の検出方法は特に制限されず、公知の方法を用いることが可能であるが、特に次世代シークエンサーを用いると、多数の遺伝子のドライバー変異を効率よく検出することができる。また、多数の遺伝子を対象とする場合、パネルベースで網羅的に解析してもよく、その場合にはさらに効率よくドライバー変異を検出することができる。
【0030】
本発明において、「対象とする遺伝子」の数は特に制限されないが、多数の遺伝子を対象とすることが好ましい。多数とは、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４１０（個）等であることが挙げられる。多数の遺伝子を対象とする場合、従来技術の多くのようにＫＲＡＳ遺伝子に代表される１つの遺伝子又は少数の遺伝子を対象とするよりも、より高精度な予後の予測等を実現することができる。
【0031】
本発明において、「対象とする遺伝子」の具体的な種類は特に制限されず、例えば、ドライバー変異が検出される可能性が比較的高い遺伝子を含んでよく、また、例えば、ドライバー変異が検出される可能性が比較的高い遺伝子と比較的低い遺伝子とを含んでよく、それらを含む多数の遺伝子を解析すると、より高感度にドライバー変異を検出することができる可能性が高まる。「対象とする遺伝子」は、例えば、以下の表１に示す４１０個のがん関連遺伝子から選択される１又は２以上を含んでもよいし、含まなくてもよい。また、表１に示す４１０個の遺伝子のうちの一部又は全部（すなわち、表１に示す４１０個の遺伝子から選択される１又は２以上）と、表１に示されていない１又は２（個）以上の遺伝子とを組み合わせて対象としてもよい。
【0032】
【表1】
【0033】
また、本発明において、「対象とする遺伝子」の種類は特に制限されないが、固形がんとの関連性が高い遺伝子であることが好ましく、例えば、ＴＰ５３；ＫＲＡＳ；ＫＩＴ；ＡＰＣ；ＥＧＦＲ；ＳＭＡＤ４；ＣＳＤＥ１；ＮＲＡＳ；ＡＬＫ；ＢＲＡＦ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１；ＧＮＡＳ；ＩＤＨ２；ＫＥＡＰ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＭＴＯＲ；ＢＲＣＡ２；ＥＧＦＲ－ＡＳ１；ＥＲＢＢ４；及びＰＩＫ３ＣＡからなる群から選択される１又は２以上を含むことが好ましく、例えば、上記の群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１（個）を含むことが挙げられる。これらの固形がんとの関連性が高い遺伝子を数多く対象として含むことで、より高精度な予後予測を実現することができる。
「対象とする遺伝子」の種類や数は、対象とする固形がんの種類等に応じて選択してもよい。
「対象とする遺伝子」の種類や数は、対象とする固形がんの種類等に応じて選択してもよい。
【0034】
（ドライバー変異）
本発明において、「ドライバー変異」は、がんの発生や悪化の直接的な原因となる遺伝子変異を意味する。体細胞変異と生殖細胞系列変異とは、腫瘍組織と正常組織（例えば末梢血）とをペア解析（マッチドペア解析）することで区別することができる。また、その際、クローン性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential：ＣＨＩＰ）の除外を行うこともできる。検出された体細胞変異は、本発明において、アノテーションデータベース（ＣＧＩ、ＤｏＣＭ、ＯｎｃｏＫＢ、ＩＡＲＣ－ＴＰ５３、ＣｌｉｎＶａｒ）と順次比較することで分類することができる（図１ｂ）。tier １（病原性／発がん性変異としてデータベースに登録されている）に分類された変異を、「ドライバー変異」と定義することができる。また、tier ２（病原性／発がん性変異の可能性有りとデータベースに登録されている）に分類された変異を、「ドライバー変異の可能性が有る変異」と定義することができる。なお、本発明において、「変異」には、一塩基置換と挿入欠失が含まれる。
本発明において、「ドライバー変異」は、がんの発生や悪化の直接的な原因となる遺伝子変異を意味する。体細胞変異と生殖細胞系列変異とは、腫瘍組織と正常組織（例えば末梢血）とをペア解析（マッチドペア解析）することで区別することができる。また、その際、クローン性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential：ＣＨＩＰ）の除外を行うこともできる。検出された体細胞変異は、本発明において、アノテーションデータベース（ＣＧＩ、ＤｏＣＭ、ＯｎｃｏＫＢ、ＩＡＲＣ－ＴＰ５３、ＣｌｉｎＶａｒ）と順次比較することで分類することができる（図１ｂ）。tier １（病原性／発がん性変異としてデータベースに登録されている）に分類された変異を、「ドライバー変異」と定義することができる。また、tier ２（病原性／発がん性変異の可能性有りとデータベースに登録されている）に分類された変異を、「ドライバー変異の可能性が有る変異」と定義することができる。なお、本発明において、「変異」には、一塩基置換と挿入欠失が含まれる。
【0035】
本発明において、「ドライバー変異」の具体的な種類は特に制限されず、例えば、前述の方法によってドライバー変異と定義されるものであればよい。ただし、具体的に挙げるとすれば、例えば、以下の表２に示す変異のうち１又は２以上を挙げることができる。
【0036】
【表2】
配列番号３：ACCTACTCTATTGGGTTTTCATACAGCTAGCGGGAAAAAAGTTAAAATTGCAAAGGAATCTTTGGACAA
配列番号４：GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGAGCACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
【0037】
したがって、本発明において「ドライバー変異」は、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３ Ｒ２１３＊、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ３０６＊、ＴＰ５３ Ｙ２２０＊、ＴＰ５３ Ｉ２５５Ｆ、ＴＰ５３ Ｎ２３９Ｄ、ＴＰ５３ Ｐ２７８Ａ、ＴＰ５３ Ｑ１９２ＹｆｓＴｅｒ１４、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３ Ｓ２４１Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｒ、ＫＩＴ Ｇ５９２Ｗ、ＫＩＴ Ｋ５５８Ｎ、ＫＩＴ Ｌ５８９Ｒ、ＡＰＣ Ｅ１３０６＊、ＡＰＣ Ｒ８７６＊、ＡＰＣ Ｓ１４３６ｆｓ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｃ、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ、ＥＧＦＲ Ｅ７０９Ｇ、ＥＧＦＲ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ａ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ－ＡＳ１ Ｓ７６８Ｉ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｃ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｈ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｖ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＡＬＫ Ｇ１１２３Ｄ、ＢＲＡＦ Ｇ４６９Ｒ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＣＡ２ Ｐ１５１９ｆｓ、ＣＤＫＮ２Ａ Ｒ８０＊、ＧＮＡＳ Ｒ８４４Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｃ、ＧＮＡＳ Ｒ２０１Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、ＫＥＡＰ１ Ｇ４２３Ｖ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｐ１２４Ｌ、ＭＡＰ２Ｋ１ Ｆ１２９Ｌ、ＭＴＯＲ Ｃ１４８３Ｙ、ＥＲＢＢ４ Ｒ８４７Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｄ３５２Ｙ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、及びＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｋからなる群から選択される１又は２以上を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【0038】
ここで、例えば「ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ」とは、ＴＰ５３の２４５番目のＧ（グリシン）がＳ（セリン）に置換する変異を表す。また、例えば「ＴＰ５３ Ｒ２１３＊」とは、ＴＰ５３の２１３番目のＲ（アルギニン）が終止コドンに置換する変異を表す。また、例えば「ＡＰＣ Ｓ１４３６ｆｓ」とは、ＡＰＣの１４３６番目のＳ（セリン）にフレームシフト変異が生じたことを表す。また、例えば「ＥＧＦＲ Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌ」とは、ＥＧＦＲの７４６番目のＥ（グルタミン酸）から７５０番目のＡ（アラニン）が欠失する変異を表す。また、例えば「ＴＰ５３ Ｑ１９２ＹｆｓＴｅｒ１４」とは、フレームシフト変異の結果ＴＰ５３の１９２番目のＱ（グルタミン）以下に変異が起きて、Ｙ（チロシン）で始まる新たなリーディングフレームができ、そこから数えて１４番目のリーディングフレームが終止コドンとなる変異を表す。また、例えば、「ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ－ＡＳ１ Ｓ７６８Ｉ」とは、ＥＧＦＲと、そのアンチセンスでコードされているＥＧＦＲ－ＡＳ１の両方の同じ位置に、７６８番目のＳ（セリン）がＩ（イソロイシン）に置換する変異があることを表す。なお、アミノ酸の一文字表記は、以下のように対応する。Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン。
【0039】
なお、本発明において「ドライバー変異」は、必ずしもアミノ酸の変化をともなうものでなくてもよい。例えば、アミノ酸をコードする領域外の変異であってよく、例えば、ＣＳＤＥ１又はＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１のアミノ酸をコードする領域外の下流領域での一塩基変異を挙げることができる。また、終止コドン生成や欠失をともなう変異であってもよい。
【0040】
本発明において、「ドライバー変異の数を確認すること」は、ドライバー変異に分類された体細胞変異の数を数えることである。ドライバー変異の数は、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（個）、又はそれ以上であり得る。本発明において、ドライバー変異の数は、「０」、「１」、又は「２以上」のいずれかに分類することでよいが、「２以上」をさらに「２」、「３」、「３以上」、「４」、「４以上」、「５」、及び／又は「５以上」等に分類してもよい。また、「１以下」とは、「０」又は「１」を意味し、「１以上」とは、「１」又は「２以上」を意味し、「２以上」とは、「２」又は「３以上」を意味する。
【0041】
（工程Ｂ）
本発明の第一の方法は、ドライバー変異の数と患者の予後との関連付けをすること（工程Ｂ）を含む。ここで、（工程Ｂ）における「関連付け」は、以下の（工程Ｂ－１）及び（工程Ｂ－２）のとおり行われる。
本発明の第一の方法は、ドライバー変異の数と患者の予後との関連付けをすること（工程Ｂ）を含む。ここで、（工程Ｂ）における「関連付け」は、以下の（工程Ｂ－１）及び（工程Ｂ－２）のとおり行われる。
【0042】
（工程Ｂ－１）
本発明において、ドライバー変異の数が１以上である場合に、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付ける。
本発明において、ドライバー変異の数が１以上である場合に、ドライバー変異の数が０である場合と比較して予後不良の可能性が高いと関連付ける。
【0043】
（工程Ｂ－２）
本発明において、ドライバー変異の数が２以上である場合に、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－２）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
本発明において、ドライバー変異の数が２以上である場合に、ドライバー変異の数が１以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－２）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
【0044】
また、本発明の第一の方法は、さらに、以下の（工程Ｂ－３）、（工程Ｂ－４）及び／又は（工程Ｂ－５）を含んでもよい。
【0045】
（工程Ｂ－３）
本発明において、ドライバー変異の数が３以上である場合に、ドライバー変異の数が２以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）及び／又は（工程Ｂ－２）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－３）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
本発明において、ドライバー変異の数が３以上である場合に、ドライバー変異の数が２以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）及び／又は（工程Ｂ－２）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－３）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
【0046】
（工程Ｂ－４）
本発明において、ドライバー変異の数が４以上である場合に、ドライバー変異の数が３以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）、（工程Ｂ－２）及び／又は（工程Ｂ－３）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－４）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
本発明において、ドライバー変異の数が４以上である場合に、ドライバー変異の数が３以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）、（工程Ｂ－２）及び／又は（工程Ｂ－３）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－４）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
【0047】
（工程Ｂ－５）
本発明において、ドライバー変異の数が５以上である場合に、ドライバー変異の数が４以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）、（工程Ｂ－２）、（工程Ｂ－３）及び／又は（工程Ｂ－４）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－５）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
本発明において、ドライバー変異の数が５以上である場合に、ドライバー変異の数が４以下である場合と比較して予後不良の可能性がさらに高いと関連付ける。ここで、「さらに高い」とは、上記（工程Ｂ－１）、（工程Ｂ－２）、（工程Ｂ－３）及び／又は（工程Ｂ－４）で関連付けられる可能性と比較して、（工程Ｂ－５）で関連付けられる可能性の方が高いことを意味する。
【0048】
（関連付け）
本発明において、関連付けによって示された予後不良の可能性に関する情報等は、医師等の医療関係者に提供されてもよい。ただし、関連付け自体は医師による診断行為ではなく、いずれの者が行ってもよい。
本発明において、関連付けによって示された予後不良の可能性に関する情報等は、医師等の医療関係者に提供されてもよい。ただし、関連付け自体は医師による診断行為ではなく、いずれの者が行ってもよい。
【0049】
（工程Ｃ）
本発明の第二の方法は、ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に患者を層別化すること（工程Ｃ）を含む。
本発明の第二の方法は、ドライバー変異の数が０である群、１である群、及び２以上である群を含むいずれかの群に患者を層別化すること（工程Ｃ）を含む。
【0050】
（層別化）
本発明において、「患者を層別化すること」は、例えば、「固形がん患者の予後を層別化すること（固形がん患者を予想される予後に層別化すること）」及び「固形がん患者を治療コホートに層別化すること」を含む。層別化することにより、例えば、群ごとにより適切な治療法の選択を補助したり、群ごとに治療法の有効性を予測したりすることができる。本発明において、ドライバー変異の数が、「０である群」、「１である群」、又は「２以上である群」のいずれかに患者を層別化することでよいが、「２以上である群」をさらに「２である群」、「３である群」、「３以上である群」、「４である群」、「４以上である群」、「５である群」、及び／又は「５以上である群」等に分類してもよい。また、さらに、「６である群」、「７である群」、「８である群」、「９である群」、「１０（個）である群」、又は「それ以上である群」に患者を層別化してもよい。
本発明において、「患者を層別化すること」は、例えば、「固形がん患者の予後を層別化すること（固形がん患者を予想される予後に層別化すること）」及び「固形がん患者を治療コホートに層別化すること」を含む。層別化することにより、例えば、群ごとにより適切な治療法の選択を補助したり、群ごとに治療法の有効性を予測したりすることができる。本発明において、ドライバー変異の数が、「０である群」、「１である群」、又は「２以上である群」のいずれかに患者を層別化することでよいが、「２以上である群」をさらに「２である群」、「３である群」、「３以上である群」、「４である群」、「４以上である群」、「５である群」、及び／又は「５以上である群」等に分類してもよい。また、さらに、「６である群」、「７である群」、「８である群」、「９である群」、「１０（個）である群」、又は「それ以上である群」に患者を層別化してもよい。
【0051】
（治療法）
前述のとおり、本発明の第二の方法は、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するために用いることもできる。本発明において、治療法は、手術、薬物療法（化学療法）、術後補助療法、放射線療法、化学放射線療法、補助化学療法、ステント療法、バイパス療法、支持・緩和療法、等を含む。また、薬物は、分子標的薬又は免疫チェックポイント阻害剤等を含む。
前述のとおり、本発明の第二の方法は、固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するために用いることもできる。本発明において、治療法は、手術、薬物療法（化学療法）、術後補助療法、放射線療法、化学放射線療法、補助化学療法、ステント療法、バイパス療法、支持・緩和療法、等を含む。また、薬物は、分子標的薬又は免疫チェックポイント阻害剤等を含む。
【0052】
（工程Ｄ）
本発明の第三の方法は、患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること（工程Ｄ）を含む。
ここで（工程Ｄ）の具体的な手法は、その目的を達成しうる範囲において特に制限されないが、例えば、以下の工程（工程Ｄ－１）～（工程Ｄ－３）の一部又は全部を含んでいてもよい。
（工程Ｄ－１）対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること。
（工程Ｄ－２）前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること。
（工程Ｄ－３）前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること。
本発明の第三の方法は、患者由来の血液試料に含まれるｃｔＤＮＡにおける、対象とする遺伝子のアクショナブル変異を評価すること（工程Ｄ）を含む。
ここで（工程Ｄ）の具体的な手法は、その目的を達成しうる範囲において特に制限されないが、例えば、以下の工程（工程Ｄ－１）～（工程Ｄ－３）の一部又は全部を含んでいてもよい。
（工程Ｄ－１）対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認すること。
（工程Ｄ－２）前記アクショナブル変異が有る場合、前記アクショナブル変異の内容及びエビデンスレベルを確認すること。
（工程Ｄ－３）前記アクショナブル変異の有無、内容、又はエビデンスレベルと、治療法の有効性との関連付けをすること。
【0053】
（アクショナブル変異・ドラッガブル変異）
本発明において、検出された体細胞変異は、「ドライバー」のほか、「アクショナブル（actionable）」、及び／又は「ドラッガブル（druggable）」という観点からも評価してよい。本発明において、「アクショナブル変異」は、様々な開発段階における分子標的薬の標的となる遺伝子変異を意味する。本発明において、アクショナブル変異は、がんゲノム情報管理センター（Center for Cancer Genomics and Advanced Therapeutics：Ｃ－ＣＡＴ）が提唱するエビデンスレベルに基づき、レベルＡ～Ｅの５つに分類することができる。アクショナブル変異は、２つのステップで評価することができる。ステップ１として、アノテーションデータベースの記述に従って、薬剤の承認状況を４つのカテゴリーに分類することができる。その後、ステップ２として、データベースとクエリーの間での薬剤の承認状況及びがん種のマッチングに従って、エビデンスレベルを割り当てることができる。最も高いエビデンスレベルはレベルＡであり（このエビデンスレベルの変化を「ドラッガブル変異」と定義する）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥと続く（図１ｃ）。「ドラッガブル変異」は、同がん種に対して臨床応用可能な分子標的薬・免疫チェックポイント阻害剤の対象となる遺伝子変異を意味する。アクショナブル変異及び／又はドラッガブル変異の有無、内容、及び／又はエビデンスレベルは、治療薬の選択をはじめとする治療法の有効性を予測するために有用な情報となり得る。治療法としては、特に薬物療法又は術後補助療法が挙げられる。
本発明において、検出された体細胞変異は、「ドライバー」のほか、「アクショナブル（actionable）」、及び／又は「ドラッガブル（druggable）」という観点からも評価してよい。本発明において、「アクショナブル変異」は、様々な開発段階における分子標的薬の標的となる遺伝子変異を意味する。本発明において、アクショナブル変異は、がんゲノム情報管理センター（Center for Cancer Genomics and Advanced Therapeutics：Ｃ－ＣＡＴ）が提唱するエビデンスレベルに基づき、レベルＡ～Ｅの５つに分類することができる。アクショナブル変異は、２つのステップで評価することができる。ステップ１として、アノテーションデータベースの記述に従って、薬剤の承認状況を４つのカテゴリーに分類することができる。その後、ステップ２として、データベースとクエリーの間での薬剤の承認状況及びがん種のマッチングに従って、エビデンスレベルを割り当てることができる。最も高いエビデンスレベルはレベルＡであり（このエビデンスレベルの変化を「ドラッガブル変異」と定義する）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥと続く（図１ｃ）。「ドラッガブル変異」は、同がん種に対して臨床応用可能な分子標的薬・免疫チェックポイント阻害剤の対象となる遺伝子変異を意味する。アクショナブル変異及び／又はドラッガブル変異の有無、内容、及び／又はエビデンスレベルは、治療薬の選択をはじめとする治療法の有効性を予測するために有用な情報となり得る。治療法としては、特に薬物療法又は術後補助療法が挙げられる。
【0054】
（キット）
本発明はまた、本発明の第一の方法、第二の方法、又は第三の方法に使用するためのキットに関する（それぞれを、「第一のキット」、「第二のキット」、又は「第三のキット」ということもある。また、これらを合わせて「本発明のキット」ということもある。）。本発明のキットは、遺伝子パネル検査用キット、特にがん遺伝子パネル検査用キットとして提供されてもよい。
本発明はまた、本発明の第一の方法、第二の方法、又は第三の方法に使用するためのキットに関する（それぞれを、「第一のキット」、「第二のキット」、又は「第三のキット」ということもある。また、これらを合わせて「本発明のキット」ということもある。）。本発明のキットは、遺伝子パネル検査用キット、特にがん遺伝子パネル検査用キットとして提供されてもよい。
【0055】
本発明のキットは、それぞれの目的に応じて必要な試薬を含む。具体的には、対象とする遺伝子のドライバー変異の数又はアクショナブル変異の有無を含む遺伝子変化を確認することに使用するための試薬を含む。本発明のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数又はアクショナブル変異の有無を確認することに使用するための試薬を含むが、１又は２以上の他の遺伝子変異又は遺伝子変化に関して検出、確認、又は評価等することに使用するための試薬をさらに含んでもよい。なお、本発明において、「遺伝子変異」とは、一塩基置換及び挿入欠失を意味し、「遺伝子変化」とは、「遺伝子変異」と、「構造異常」（融合遺伝子）と、「発現異常」（がん遺伝子の増幅及びがん抑制遺伝子の欠損）との全てを意味する。また、本発明のキットは、試薬に加え、さらにその他のものを含んでもよい。その他のものとしては、特に制限されないが、例えば、容器、用具、使用方法若しくは使用手順に関する取扱説明書、本発明の方法を実施するための説明書、その他の添付文書、記録媒体、解析プログラム、遺伝子変異や遺伝子異常に関するデータベース等を含んでもよい。なお、試薬やその他のものは、いずれも１又は２以上含まれていてもよい。また、本発明のキットは、次世代シークエンサー等の遺伝子解析装置やコンピューター等の情報処理装置等と組み合わせて使用してもよい。
【0056】
（試薬）
本発明において、「試薬」としては、例えば、プライマー、プローブ、酵素、バッファー、安定剤、担体、溶媒、洗浄液、その他のＰＣＲ用試薬、その他のシークエンス用試薬、その他のハイブリダイゼーション用試薬等が挙げられる。プライマー又はプローブは、酵素、蛍光物質、発光物質、発色物質、放射性物質、その他の化学物質等によって標識されたものであってもよい。なお、プライマー又はプローブは、１又は２以上の他のプライマー又はプローブと組み合わせて、プライマーセット又はプローブセットとしてキットに含まれてもよい。また、複数のプローブを含むパネルがキットに含まれてもよい。本発明において、試薬としては、例えば、表１に示された遺伝子から選択される１又は２以上を対象とするプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが挙げられ、表２に示された遺伝子から選択される１又は２以上を対象とするプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが好ましく、特に、表２に示されたドライバー変異から選択される１又は２以上を検出できるように設計されたプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが好ましい。プライマー又はプローブの塩基配列は、対象とする遺伝子の塩基配列情報に基づき定法により適宜設計することができ、例えば、対象とする遺伝子において特に対象とするゲノム範囲の塩基配列の全部若しくは一部と相補的な塩基配列又はそれと同一性の高い塩基配列を有するプライマー又はプローブとして設計することができる。対象とするゲノム範囲としては、例えば、対象とする遺伝子のホットスポットの変異ポジション又は変異領域（エキソン）を含む数塩基～数千塩基からなる塩基配列を挙げることができ、例えば、表３に示されたゲノム範囲から選択される１又は２以上を挙げることができる。
本発明において、「試薬」としては、例えば、プライマー、プローブ、酵素、バッファー、安定剤、担体、溶媒、洗浄液、その他のＰＣＲ用試薬、その他のシークエンス用試薬、その他のハイブリダイゼーション用試薬等が挙げられる。プライマー又はプローブは、酵素、蛍光物質、発光物質、発色物質、放射性物質、その他の化学物質等によって標識されたものであってもよい。なお、プライマー又はプローブは、１又は２以上の他のプライマー又はプローブと組み合わせて、プライマーセット又はプローブセットとしてキットに含まれてもよい。また、複数のプローブを含むパネルがキットに含まれてもよい。本発明において、試薬としては、例えば、表１に示された遺伝子から選択される１又は２以上を対象とするプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが挙げられ、表２に示された遺伝子から選択される１又は２以上を対象とするプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが好ましく、特に、表２に示されたドライバー変異から選択される１又は２以上を検出できるように設計されたプライマー又はプローブを１又は２以上を含むことが好ましい。プライマー又はプローブの塩基配列は、対象とする遺伝子の塩基配列情報に基づき定法により適宜設計することができ、例えば、対象とする遺伝子において特に対象とするゲノム範囲の塩基配列の全部若しくは一部と相補的な塩基配列又はそれと同一性の高い塩基配列を有するプライマー又はプローブとして設計することができる。対象とするゲノム範囲としては、例えば、対象とする遺伝子のホットスポットの変異ポジション又は変異領域（エキソン）を含む数塩基～数千塩基からなる塩基配列を挙げることができ、例えば、表３に示されたゲノム範囲から選択される１又は２以上を挙げることができる。
【0057】
（第一のキット）
本発明の第一のキットは、「固形がん患者の予後を予測するための方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第一のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬を含む。
本発明の第一のキットは、「固形がん患者の予後を予測するための方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第一のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬を含む。
【0058】
（第二のキット）
本発明の第二のキットは、「固形がん患者を層別化する方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第二のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬を含む。
本発明の第二のキットは、「固形がん患者を層別化する方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第二のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬を含む。
【0059】
（第三のキット）
本発明の第三のキットは、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第三のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬と、対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認することに使用するための試薬とを含む。
本発明の第三のキットは、「固形がん患者に対する治療法の有効性を予測するための方法に使用するため」という用途が特定されたキットである。本発明の第三のキットは、対象とする遺伝子のドライバー変異の数を確認することに使用するための試薬と、対象とする遺伝子のアクショナブル変異の有無を確認することに使用するための試薬とを含む。
【0060】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例0061】
［実施例１］
膵がん患者を対象とした検討
１．材料及び方法
１－１．患者及び試料
本研究は、参加したすべての患者から書面による同意を得て、静岡県立静岡がんセンターの倫理審査委員会の承認を得て行われた。静岡県立静岡がんセンター病院でがんの摘出手術を受け、十分な量の新鮮ながん組織を提供できる患者を対象とした。２０１４年１月から２０１９年３月までに、合計１０３例の膵がんが解析された。すべての腫瘍組織が病理学的に膵がんと診断された。さらに、患者の体細胞及び生殖細胞のゲノム変化を同定するため、全エクソンシークエンス（Whole Exome Sequencing：ＷＥＳ）のコントロールとして末梢血を採取し、腫瘍組織についてはがん遺伝子パネル（Comprehensive Cancer Panel：ＣＣＰ）シークエンスを実施した。リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy：ＬＢ）のために血漿試料を採取した。このうち、血漿試料が入手できた切除可能膵がん患者３３名がこの研究に登録された（図１ａ）。切除可能性は、ＮＣＣＮ（National Comprehensive Cancer Network）ガイドラインの分類に従って定義された。
膵がん患者を対象とした検討
１．材料及び方法
１－１．患者及び試料
本研究は、参加したすべての患者から書面による同意を得て、静岡県立静岡がんセンターの倫理審査委員会の承認を得て行われた。静岡県立静岡がんセンター病院でがんの摘出手術を受け、十分な量の新鮮ながん組織を提供できる患者を対象とした。２０１４年１月から２０１９年３月までに、合計１０３例の膵がんが解析された。すべての腫瘍組織が病理学的に膵がんと診断された。さらに、患者の体細胞及び生殖細胞のゲノム変化を同定するため、全エクソンシークエンス（Whole Exome Sequencing：ＷＥＳ）のコントロールとして末梢血を採取し、腫瘍組織についてはがん遺伝子パネル（Comprehensive Cancer Panel：ＣＣＰ）シークエンスを実施した。リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy：ＬＢ）のために血漿試料を採取した。このうち、血漿試料が入手できた切除可能膵がん患者３３名がこの研究に登録された（図１ａ）。切除可能性は、ＮＣＣＮ（National Comprehensive Cancer Network）ガイドラインの分類に従って定義された。
【0062】
１－２．腫瘍組織の次世代シークエンシング
詳細な実験プロトコル及びシークエンスデータの解析手順は、既報のとおりである（Biomedical research (Tokyo, Japan). 2016;37(6):359-66.; Biomedical research (Tokyo, Japan).2016;37(6):367-79.； Cancer science.2020;111(2):687-99.）。簡潔に言えば、新鮮な外科検体は病理医によって評価され、２０ｍｇを超える重量の腫瘍試料を採取した。さらに、患者の体細胞及び生殖細胞のゲノム変化を同定するため、固形腫瘍試料のＷＥＳ及びＣＣＰシークエンスのコントロールとして末梢血を採取した。ＤＮＡは、QIAampDNA Blood Mini Kit （Qiagen社製）を用いて、製造業者の説明書に従って組織及び末梢血試料から抽出した。
詳細な実験プロトコル及びシークエンスデータの解析手順は、既報のとおりである（Biomedical research (Tokyo, Japan). 2016;37(6):359-66.; Biomedical research (Tokyo, Japan).2016;37(6):367-79.； Cancer science.2020;111(2):687-99.）。簡潔に言えば、新鮮な外科検体は病理医によって評価され、２０ｍｇを超える重量の腫瘍試料を採取した。さらに、患者の体細胞及び生殖細胞のゲノム変化を同定するため、固形腫瘍試料のＷＥＳ及びＣＣＰシークエンスのコントロールとして末梢血を採取した。ＤＮＡは、QIAampDNA Blood Mini Kit （Qiagen社製）を用いて、製造業者の説明書に従って組織及び末梢血試料から抽出した。
【0063】
ＷＥＳ用ライブラリーはIon AmpliSeq Exome RDY Kit（Thermo Fisher Scientific社製）、ＣＣＰ用ライブラリーはIon AmpliSeq library Kit 2.0（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、それぞれ製造業者の推奨プロトコルに従って構築した。構築したライブラリーは定量ＰＣＲで定量し、半導体ＤＮＡシークエンサー（Ion Torrent Proton Sequencer, Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造元の指示に従ってＤＮＡ塩基配列を決定した。ＷＥＳ及びＣＣＰにおける平均リード深度（解析対象領域１塩基あたりの配列読取回数）は、それぞれ１３０と１１６９であった。
【0064】
シークエンサーで得られた生のバイナリデータは、Torrent Suiteソフトウェア（ver.4.4, Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、参照ヒトゲノム（UCSC hg19）にマッピングするシークエンスリードに変換された。このとき、腫瘍試料と血液試料の配列データを個別に解析し、マッピング結果をBAMファイルとして保存した。２つのBAMファイルをIon Reporterシステムにアップロードし、AmpliSeq exometumor-normal pair workflow（ver. 4.4；Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、COSMIC及びClinVarにそれぞれ登録された体細胞変異及び病因性変異を指定したCustomHotspotファイルにより同時解析した。
【0065】
１－３．ＬＢの次世代シークエンシング
血液試料２０ｍＬをＥＤＴＡチューブに採取し、抽出から２時間以内に２回遠心分離（１９００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）して血漿を分離した。その後、血漿を分注し、－８０℃で保存した。ｃｆＤＮＡは、QIAamp circulating nucleic acid kit（Qiagen社製）を用いて血漿試料から抽出し、Qubit 3.0 Fluorometer及びhigh sensitivity assay kits（Thermo Fisher Scientific社製）を使用して定量した。ｃｆＤＮＡ試料の品質は、Agilent 4200 TapeStation（AgilentTechnologies社製）で解析した。試料は、約１６５ｂｐのピークを示し、ゲノムＤＮＡの著しい汚染の形跡がなく、少なくとも３０ｎｇの試料が利用可能である場合に、さらなる次世代シークエンシング研究に受け入れられると判断した。
血液試料２０ｍＬをＥＤＴＡチューブに採取し、抽出から２時間以内に２回遠心分離（１９００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）して血漿を分離した。その後、血漿を分注し、－８０℃で保存した。ｃｆＤＮＡは、QIAamp circulating nucleic acid kit（Qiagen社製）を用いて血漿試料から抽出し、Qubit 3.0 Fluorometer及びhigh sensitivity assay kits（Thermo Fisher Scientific社製）を使用して定量した。ｃｆＤＮＡ試料の品質は、Agilent 4200 TapeStation（AgilentTechnologies社製）で解析した。試料は、約１６５ｂｐのピークを示し、ゲノムＤＮＡの著しい汚染の形跡がなく、少なくとも３０ｎｇの試料が利用可能である場合に、さらなる次世代シークエンシング研究に受け入れられると判断した。
【0066】
ターゲットキャプチャーパネルは、ＪＣＧＡ研究（Cancer science.2020;111(2):687-99.）で報告したように、４０のドラッガブル（druggable）遺伝子又は潜在的なアクショナブル（actionable）遺伝子の全コーディング領域と、３７０の遺伝子のホットスポット領域とを選択し、表３に示す４１０の遺伝子を対象として特別に設計した。
【0067】
【表3】
【0068】
パネルは Agilent SureDesign Web application（v. 7.5；Agilent Technologies社製）を使用して、コーディングエクソンと非翻訳領域をカバーするように設計した。このパネルは、２倍の密度とバランスのとれたブースティングで、２つのプローブグループに分かれた最大１３，４００個のプローブを包含し、３８．６２７Ｍｂｐの標的領域を網羅している。
【0069】
ライブラリーは、SureSelectXT HS2 DNA System with Pre-Capture Pooling protocol（Agilent Technologies社製）に従ってカスタム遺伝子パネルを使用して調製した。ｃｆＤＮＡのライブラリーは、公開されたアプリケーションノートに記載されているように、断片化ステップをバイパスした２５ｎｇのＤＮＡから開始して調製した。ライブラリーは、NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1 .5（300 cycles）（illumina社製）を使用して、NovaSeq 6000（illumina社製）プラットフォームで配列決定した。バリアントコールとペア解析（腫瘍と正常）は、DRAGEN Bio-IT Platform（v. 4.2；illumina社製）を使用して実施した。
【0070】
１－４．ドライバー変異とアクショナブル変異の評価
体細胞変異を、変異のリストとアノテーションデータベースを順次比較することで分類した（図１ｂ）。tier １に分類された変異をドライバー変異と定義し、tier ２に分類された変異をドライバー変異の可能性が有る変異と定義した（Cancerscience. 2020;111(2):687-99.）。アクショナブル変化は、がんゲノム情報管理センター（Centerfor Cancer Genomics and Advanced Therapeutics：Ｃ－ＣＡＴ）が提唱するエビデンスレベルに基づき、レベルＡ～Ｅの５つに分類した。アクショナブル変異は、２つのステップで評価した。ステップ１として、アノテーションデータベースの記述に従って、薬剤の承認状況を４つのカテゴリーに分類した。その後、ステップ２として、データベースとクエリーの間での薬剤の承認状況及びがん種のマッチングに従って、エビデンスレベルを割り当てた。最も高いエビデンスレベルはレベルＡであり（このエビデンスレベルの変異をドラッガブル変異と定義した）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥと続く（図１ｃ）。
体細胞変異を、変異のリストとアノテーションデータベースを順次比較することで分類した（図１ｂ）。tier １に分類された変異をドライバー変異と定義し、tier ２に分類された変異をドライバー変異の可能性が有る変異と定義した（Cancerscience. 2020;111(2):687-99.）。アクショナブル変化は、がんゲノム情報管理センター（Centerfor Cancer Genomics and Advanced Therapeutics：Ｃ－ＣＡＴ）が提唱するエビデンスレベルに基づき、レベルＡ～Ｅの５つに分類した。アクショナブル変異は、２つのステップで評価した。ステップ１として、アノテーションデータベースの記述に従って、薬剤の承認状況を４つのカテゴリーに分類した。その後、ステップ２として、データベースとクエリーの間での薬剤の承認状況及びがん種のマッチングに従って、エビデンスレベルを割り当てた。最も高いエビデンスレベルはレベルＡであり（このエビデンスレベルの変異をドラッガブル変異と定義した）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥと続く（図１ｃ）。
【0071】
１－５．治療方針及び手術成績
研究期間中、切除可能膵がんに対するネオアジュバント療法は実施されなかったため、本コホートでネオアジュバント療法を受けた患者はいなかった。外科的切除は既報の通り行われた（World journal of surgery. 2012;36(12):2888-94.）。通常、Ｓ－１（The Lancet. 2016;388(10041):248-57.）を用いた補助化学療法が選択された。
研究期間中、切除可能膵がんに対するネオアジュバント療法は実施されなかったため、本コホートでネオアジュバント療法を受けた患者はいなかった。外科的切除は既報の通り行われた（World journal of surgery. 2012;36(12):2888-94.）。通常、Ｓ－１（The Lancet. 2016;388(10041):248-57.）を用いた補助化学療法が選択された。
【0072】
１－６．手術成績及び病理学的成績の定義
切除標本は病理医により検査され、米国がん合同委員会／国際対がん連合（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣ）病期分類システム第８版（AJCC Cancer Staging Manual. Springer International Publishing. 2017.）に基づき評価した。最終的な手術断端は、切除断端のいずれかに腫瘍細胞が顕微鏡的に検出された場合、陽性と判断した。切除後の再発は、初回再発時の病変部位により、局所再発、腹膜再発、及び遠隔臓器再発に分類した。局所再発には、所属リンパ節への再発も含まれる。初回再発時に複数の部位に転移があった症例は、重複してカウントした。
切除標本は病理医により検査され、米国がん合同委員会／国際対がん連合（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣ）病期分類システム第８版（AJCC Cancer Staging Manual. Springer International Publishing. 2017.）に基づき評価した。最終的な手術断端は、切除断端のいずれかに腫瘍細胞が顕微鏡的に検出された場合、陽性と判断した。切除後の再発は、初回再発時の病変部位により、局所再発、腹膜再発、及び遠隔臓器再発に分類した。局所再発には、所属リンパ節への再発も含まれる。初回再発時に複数の部位に転移があった症例は、重複してカウントした。
【0073】
１－７．統計解析
連続変数は中央値とＩＱＲ（四分位範囲）で表し、Mann-Whitney U検定で比較した。生存率はKaplan-Meier法で計算し、差の統計的有意性を評価するためにlog-rank検定を用いた。すべての統計解析は、JMPソフトウェアパッケージ（version 14.0 for Mac；SAS Institute社製）を用いて行った。Ｐ値＜０．０５は統計的有意性を示すとみなした。
連続変数は中央値とＩＱＲ（四分位範囲）で表し、Mann-Whitney U検定で比較した。生存率はKaplan-Meier法で計算し、差の統計的有意性を評価するためにlog-rank検定を用いた。すべての統計解析は、JMPソフトウェアパッケージ（version 14.0 for Mac；SAS Institute社製）を用いて行った。Ｐ値＜０．０５は統計的有意性を示すとみなした。
【0074】
２．結果
２－１．臨床病理学的特徴
本コホートは、２０１４年１月から２０１９年３月までに静岡がんセンター病院で治療を受けた切除可能膵がん患者３３名の血漿及びペア腫瘍検体から構成されている。臨床病理学的特徴を表６にまとめた。組織型は全例腺がんであり、腺扁平上皮がんやその他の特殊型は含まれなかった。病理学的病期はステージ IIB（４２．４％）が最も多く、次いでステージ III（２７．２％）であった。ネオアジュバント療法を受けた患者はいなかった。追跡期間の中央値は３８．０カ月であった。３年及び５年の全生存率（ＯＳ）は、それぞれ５４．４％及び３２．３％であった。
２－１．臨床病理学的特徴
本コホートは、２０１４年１月から２０１９年３月までに静岡がんセンター病院で治療を受けた切除可能膵がん患者３３名の血漿及びペア腫瘍検体から構成されている。臨床病理学的特徴を表６にまとめた。組織型は全例腺がんであり、腺扁平上皮がんやその他の特殊型は含まれなかった。病理学的病期はステージ IIB（４２．４％）が最も多く、次いでステージ III（２７．２％）であった。ネオアジュバント療法を受けた患者はいなかった。追跡期間の中央値は３８．０カ月であった。３年及び５年の全生存率（ＯＳ）は、それぞれ５４．４％及び３２．３％であった。
【0075】
２－２．膵がんのＬＢにおけるドライバー変異とアクショナブル変異
３３例のうち、３０例（９０．９％）のＬＢから、のべ３９個のtier １変異（表４）と、のべ９３個のtier ２変異（表５）が検出された（図２ａ）。tier １変異は２１例（６３．６％）で検出され、tier ２変異は２９例（８７．９％）で検出された。tier １変異を有する遺伝子を頻度の高い順に並べると以下のようになった。ＴＰ５３（２７．３％）、ＫＲＡＳ（１５．２％）、ＫＩＴ（１２．１％）、ＡＰＣ（９．１％）、ＥＧＦＲ（６．１％）、ＳＭＡＤ４（６．１％）、ＣＤＫＮ２Ａ（３．０％）、ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１（３．０％）、ＧＮＡＳ（３．０％）、ＩＤＨ２（３．０％）、ＫＥＡＰ１（３．０％）、ＭＡＰ２Ｋ１（３．０％）、及びＭＴＯＲ（３．０％）。
３３例のうち、３０例（９０．９％）のＬＢから、のべ３９個のtier １変異（表４）と、のべ９３個のtier ２変異（表５）が検出された（図２ａ）。tier １変異は２１例（６３．６％）で検出され、tier ２変異は２９例（８７．９％）で検出された。tier １変異を有する遺伝子を頻度の高い順に並べると以下のようになった。ＴＰ５３（２７．３％）、ＫＲＡＳ（１５．２％）、ＫＩＴ（１２．１％）、ＡＰＣ（９．１％）、ＥＧＦＲ（６．１％）、ＳＭＡＤ４（６．１％）、ＣＤＫＮ２Ａ（３．０％）、ＣＤＫＮ２Ａ－ＡＳ１（３．０％）、ＧＮＡＳ（３．０％）、ＩＤＨ２（３．０％）、ＫＥＡＰ１（３．０％）、ＭＡＰ２Ｋ１（３．０％）、及びＭＴＯＲ（３．０％）。
【0076】
頻度５％以上のtier ２変異を有する遺伝子を頻度の高い順に並べると以下のようになった。ＴＰ５３（４２．４％）、ＥＧＦＲ（９．１％）、ＣＢＬ（９．１％）、ＪＡＫ１（９．１％）、ＫＩＴ（６．１％）、ＣＤＫＮ１Ｂ（６．１％）、ＣＴＮＮＢ１（６．１％）、ＥＧＦＲ－ＡＳ１（６．１％）、ＥＲＢＢ２（６．１％）、ＥＲＲＦＩ１（６．１％）、ＫＭＴ２Ｄ（６．１％）、ＫＭＴ２Ｄ（６．１％）、ＭＳＨ２（６．１％）、ＮＦ２（６．１％）、ＮＯＴＣＨ１（６．１％）、ＰＩＫ３ＣＡ（６．１％）、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ（６．１％）、ＲＵＮＸ１（６．１％）、及びＳＭＡＲＣＡ４（６．１％）。
【0077】
【表4】
【0078】
【表5】
CCCAGGGCTCCTCGTTCCATCTCCGCTTCTCGCCTCCACTGCTGCTGGGCTGGGGGCTCCCCACACGGATGCTGACTTCTTGGAAGGCTGAAGCCTCTGGGCCCTGGGAGCCAGCACCAGGACCAAGGACAGCCGACTCACCAGGGATCAGAAGTTGTGATTCCTCTGAGCCTAGATCAGGCCTGCAGGCTTTGGGGGCCCCCAGAAAATCTGGGACCTCACTGTGACATCGCTGTAACCAGCCAGGATCTAGGGAGCCCAGCCGCTGGCTCAGGGATGCCTGCAGATGCTGGAGCCGGCCTGGCCTTGGCTGGGGCTCAGGGAGCTGTGGAGGCTCATCACTGACTTTTTCTGCAAAGGAGGGGACAGGCCCTGTACCTGGGGGCTTTGGGGTGGATGCCTTAGATGAGGCTCTTCCTAGAGGCCACGGTCTGCGGCCCAGGGCTGGTCCGGCCTGGGAGGGGAACAACAGAACAGCAGGAGGAACTCAGGCCCCTGAGCTACTGTAGACTCTAAAACCTACCTGAGTCCCCACGCTCAATTGTAGAGCAGGCTAATTAGCACAAGGCTGGACTAGAAAGGGAGTCAAGGGCGAAGGCCCCGAGAAGCTCCCTGAAGACTCGTGCCCTGGTTGGCACAGGGGCCCGTGCCTGTCTGTGTGGAAAAAATGACAAGAGGGCGACCCGGACCGGAAGCAGCTGTGGACCTAGCGTGGACTCACTGCCTGCCCACTCCTCACCTGCAGGGTGCCTTTCAGATTGGCCTTGAGCCGCTGCCCGTAGTCCGGCACCGAGCCCTGGCGGCTCCGCCCTGGCGTAGACTGTGGACTCTTGGTCGCAGCCCGATTCAGATGGGGCCCCCAGCAGCGGGGCTCTGGC
【0079】
３３例において、レベルＡ及びレベルＢのアクショナブル変異は確認されなかった。２６のレベルＣの変異が１８例（５４．５％）で同定され、８のレベルＤの変異が８例（２４．２％）で同定された。レベルＣ又はＤの変異を有する遺伝子を頻度の高い順に並べると以下のようになった。ＫＩＴ（２４．２％）、ＫＲＡＳ（２４．２％）、ＰＤＧＦＲＡ（２１．２％）、ＴＰ５３（１５．２％）、ＥＧＦＲ（９．１％）、ＡＬＫ（３．０％）、ＩＤＨ２（３．０％）、及びＮＲＡＳ（３．０％）。
【0080】
２－３．膵がんの腫瘍組織解析におけるドライバー変異
手術後の新鮮な外科検体を用いて、ＷＥＳ及びＣＣＰのディープシークエンスを実施した（図２ｂ）。ＷＥＳでは、tier１変異としてＫＲＡＳ（４８．５％）及びＴＰ５３（６．１％）が同定され、tier ２変異として、ＴＰ５３（２１．２％）、ＣＤＫＮ２Ａ（６．１％）、ＡＲＩＤ３Ａ（３．０％）、ＤＮＭＴ３Ａ（３．０％）、ＫＭＴ２Ｄ（３．０％）、ＰＡＬＢ２（３．０％）、及びＳＦ３８１（３．０％）が同定された。
手術後の新鮮な外科検体を用いて、ＷＥＳ及びＣＣＰのディープシークエンスを実施した（図２ｂ）。ＷＥＳでは、tier１変異としてＫＲＡＳ（４８．５％）及びＴＰ５３（６．１％）が同定され、tier ２変異として、ＴＰ５３（２１．２％）、ＣＤＫＮ２Ａ（６．１％）、ＡＲＩＤ３Ａ（３．０％）、ＤＮＭＴ３Ａ（３．０％）、ＫＭＴ２Ｄ（３．０％）、ＰＡＬＢ２（３．０％）、及びＳＦ３８１（３．０％）が同定された。
【0081】
ＣＣＰでは、ＫＲＡＳ（６６．７％）及びＴＰ５３（６．１％）のみがtier １変異として同定され、ＴＰ５３（３３．３％）、ＫＭＴ２Ｄ（９．１％）、ＣＤＫＮ２Ａ（６．１％）、ＤＮＭＴ３Ａ（３．０％）、ＨＮＦ１Ａ（３．０％）、ＭＩＴＦ（３．０％）、ＭＵＴＹＨ（３．０％）、ＰＡＬＢ２（３．０％）、ＲＥＣＱＬ４（３．０％）、及びＳＦ３８１（３．０％）がtier ２変異として同定された。
【0082】
腫瘍組織を用いたＷＥＳ及びＣＣＰの統合解析の結果、ＷＥＳでは、２６例（７８．８％）の腫瘍組織標本から、のべ２４個のtier １変異と、のべ２９個のtier ２変異が検出され、ＣＣＰでは、２２例（６６．７％）で、のべ２５個のtier １変異が検出され、１９例（５７．６％）で、のべ３０個のtier ２変異が検出された。
【0083】
２－４．ＬＢと腫瘍組織解析におけるドライバー変異の同定
ＬＢの有効性を腫瘍組織解析の有効性と比較するために、ＬＢと、対応する腫瘍組織とをＷＥＳ及び／又はＣＣＰで解析した（図３）。ＬＢと腫瘍組織解析のtier １変異検出の一致率は４２．４％（１４／３３）であった。さらに、３３例中２例（６．１％）の腫瘍組織では複数のtier １変異が同定された。これは、ｃｔＤＮＡの解析では３３例中９例（２７．３％）で複数のtier １変異が明らかになったこととは対照的である。
ＬＢの有効性を腫瘍組織解析の有効性と比較するために、ＬＢと、対応する腫瘍組織とをＷＥＳ及び／又はＣＣＰで解析した（図３）。ＬＢと腫瘍組織解析のtier １変異検出の一致率は４２．４％（１４／３３）であった。さらに、３３例中２例（６．１％）の腫瘍組織では複数のtier １変異が同定された。これは、ｃｔＤＮＡの解析では３３例中９例（２７．３％）で複数のtier １変異が明らかになったこととは対照的である。
【0084】
ＫＲＡＳ変異はｃｔＤＮＡ５例（１５．２％）と腫瘍組織２２例（６６．７％）でtier１変異として検出された。ＬＢと腫瘍組織解析のＫＲＡＳ変異状況の一致率は３０．３％（１０／３４）であった。ＴＰ５３変異は、ｃｔＤＮＡと腫瘍組織のそれぞれ９例（２７．３％）と２例（６．１％）でtier １変異として検出された。ＬＢと腫瘍組織解析のＴＰ５３変異状態の一致率は７２．７％（２４／３４）であった。頻度は低いが、ＬＢはＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、及びＮＲＡＳ等、腫瘍組織解析では検出されなかった他の多くのドライバー変異を検出することができた。
【0085】
２－５．切除可能膵がん患者におけるＬＢ及び腫瘍組織解析でのドライバー変異の同定に従った臨床病理学的因子
ＬＢの陽性及び腫瘍組織解析の陽性は、tier １変異が同定されたか否かで定義された。３３名の患者のうち、２１名（６３．６％）がｃｔＤＮＡ陽性、２２名（６６．７％）が腫瘍組織陽性と分類された。定義に従った臨床病理学的因子を表６に示す。ｃｔＤＮＡ陽性群はｃｔＤＮＡ陰性群に比べＣＡ１９－９値が有意に高かった（Ｐ＝０．０１７）。腫瘍組織陽性群では、腫瘍組織陰性群に比べ、切除断端が陰性であることが多かった（Ｐ＝０．０３１）。
ＬＢの陽性及び腫瘍組織解析の陽性は、tier １変異が同定されたか否かで定義された。３３名の患者のうち、２１名（６３．６％）がｃｔＤＮＡ陽性、２２名（６６．７％）が腫瘍組織陽性と分類された。定義に従った臨床病理学的因子を表６に示す。ｃｔＤＮＡ陽性群はｃｔＤＮＡ陰性群に比べＣＡ１９－９値が有意に高かった（Ｐ＝０．０１７）。腫瘍組織陽性群では、腫瘍組織陰性群に比べ、切除断端が陰性であることが多かった（Ｐ＝０．０３１）。
【0086】
【表6】
【0087】
２－６．切除可能膵がん患者におけるｃｔＤＮＡ陽性度の治療成績への影響
ｃｔＤＮＡ陽性群では、全生存期間（overall survival：ＯＳ）がｃｔＤＮＡ陰性群に比べ有意に悪化した（中央値、２５．６カ月ｖｓ．未到達、Ｐ＝０．００９、図４ａ）。無再発生存期間（Recurrence-free survival：ＲＦＳ）もｃｔＤＮＡ陽性群は陰性群に比べ有意に悪化した（中央値、１０．９ヶ月ｖｓ．未到達、Ｐ＝０．００１、図４ｂ）。ＯＳに関するＣｏｘ比例ハザード解析（表７）では、ｃｔＤＮＡ陽性が独立した予後因子（Ｐ＝０．０１９）であり、リンパ節転移（Ｐ＝０．００４）も生存率低下の独立した予測因子であることが明らかになった。ｃｔＤＮＡ陽性が再発のパターンに与える影響を調べるため、ｃｔＤＮＡ陽性と初回再発部位及び切除術後の時間との相関を評価した（表８）。ｃｔＤＮＡ陽性群はｃｔＤＮＡ陰性群に比べ、肝転移率が高かった（Ｐ＝０．００７）。また、ｃｔＤＮＡ陰性群では、再発した患者全員（１００％、４／４）が局所再発であり、遠隔臓器（肺や肝臓等）への再発は認められなかった。術後６カ月以内の早期再発は、ｃｔＤＮＡ陽性群で有意に多く認められた（Ｐ＝０．０１３）。
ｃｔＤＮＡ陽性群では、全生存期間（overall survival：ＯＳ）がｃｔＤＮＡ陰性群に比べ有意に悪化した（中央値、２５．６カ月ｖｓ．未到達、Ｐ＝０．００９、図４ａ）。無再発生存期間（Recurrence-free survival：ＲＦＳ）もｃｔＤＮＡ陽性群は陰性群に比べ有意に悪化した（中央値、１０．９ヶ月ｖｓ．未到達、Ｐ＝０．００１、図４ｂ）。ＯＳに関するＣｏｘ比例ハザード解析（表７）では、ｃｔＤＮＡ陽性が独立した予後因子（Ｐ＝０．０１９）であり、リンパ節転移（Ｐ＝０．００４）も生存率低下の独立した予測因子であることが明らかになった。ｃｔＤＮＡ陽性が再発のパターンに与える影響を調べるため、ｃｔＤＮＡ陽性と初回再発部位及び切除術後の時間との相関を評価した（表８）。ｃｔＤＮＡ陽性群はｃｔＤＮＡ陰性群に比べ、肝転移率が高かった（Ｐ＝０．００７）。また、ｃｔＤＮＡ陰性群では、再発した患者全員（１００％、４／４）が局所再発であり、遠隔臓器（肺や肝臓等）への再発は認められなかった。術後６カ月以内の早期再発は、ｃｔＤＮＡ陽性群で有意に多く認められた（Ｐ＝０．０１３）。
【0088】
【表7】
【0089】
【表8】
【0090】
２－７．膵がん患者のＬＢにおけるドライバー変異の数を評価することの有用性
ＬＢで検出されたtier １変異を定量化した（図５ａ）。ＬＢでは、３３例中２１例（６３．６％）で少なくとも１つのtier １変異が同定された。さらに、３３例中９例（２７．３％）でｃｔＤＮＡに複数のtier１変異が確認され、１名の患者で最大５つの変異が確認された。変異の数によって患者のＯＳが層別化され、変異の数が増えるほどＯＳは悪化する傾向にあった（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．０５４；１ｖｓ．≧２、Ｐ＝０．１４７、図５ｂ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の３年ＯＳは７５．０％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の３年ＯＳは５８．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の３年ＯＳは２２．２％であった。変異の数によってＲＦＳも層別化され、変異の数が増えるほどＲＦＳは悪化する傾向を示した（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．００４；１ｖｓ．≧２、Ｐ＝０．１８９、図５ｃ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の２年ＲＦＳは６６．７％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の２年ＲＦＳは３３．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の２年ＲＦＳは２２．２％であった。術後６ヶ月以内の早期再発は、tier １変異が１つの群（１／１２、８．３％）に比べ、tier １変異が２つ以上の群（５／９、５５．６％）で有意に多く認められた（Ｐ＝０．０１８）。
ＬＢで検出されたtier １変異を定量化した（図５ａ）。ＬＢでは、３３例中２１例（６３．６％）で少なくとも１つのtier １変異が同定された。さらに、３３例中９例（２７．３％）でｃｔＤＮＡに複数のtier１変異が確認され、１名の患者で最大５つの変異が確認された。変異の数によって患者のＯＳが層別化され、変異の数が増えるほどＯＳは悪化する傾向にあった（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．０５４；１ｖｓ．≧２、Ｐ＝０．１４７、図５ｂ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の３年ＯＳは７５．０％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の３年ＯＳは５８．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の３年ＯＳは２２．２％であった。変異の数によってＲＦＳも層別化され、変異の数が増えるほどＲＦＳは悪化する傾向を示した（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．００４；１ｖｓ．≧２、Ｐ＝０．１８９、図５ｃ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の２年ＲＦＳは６６．７％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の２年ＲＦＳは３３．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の２年ＲＦＳは２２．２％であった。術後６ヶ月以内の早期再発は、tier １変異が１つの群（１／１２、８．３％）に比べ、tier １変異が２つ以上の群（５／９、５５．６％）で有意に多く認められた（Ｐ＝０．０１８）。
【0091】
３．考察
実施例１では、切除可能膵がんの術前血漿試料を用い、ｃｔＤＮＡの網羅的な遺伝子解析を行った。その結果、６５％の症例で体細胞ドライバー変異が検出された。ＬＢによりドライバー変異が陽性となった症例では、遠隔転移再発が有意に早期かつ高頻度に認められ、予後不良であることがわかった。検出されたドライバー変異には、ＫＲＡＳだけでなく、膵臓発がんの主要なドライバー遺伝子として認識されているＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４も含まれていた。また、検出頻度は低いものの、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、ＮＲＡＳといった他のドライバー変異も見つかっており、これらはアクショナブル変異に含まれる。特に膵がんでは、腫瘍内の豊富な線維性間質、腫瘍組織の不均一性、及び解剖学的特徴から、腫瘍組織を用いた遺伝子変異の診断は比較的困難である（an official journal of the American Association for CancerResearch.2017;23(20):6094-100.）。ＬＢの特徴は、これらの困難を克服するために有用であると認識され、特に膵がんに対する有用性が期待される。切除可能膵がん患者の予後は、ｃｔＤＮＡの網羅的なゲノムプロファイリングの結果によって層別化された。膵がん患者の予後予測に有用であることに加え、ｃｔＤＮＡの網羅的ゲノムプロファイリングは、ＬＢ所見に基づく膵がんの個別化医療を発展させるための基盤資源となり得る。
実施例１では、切除可能膵がんの術前血漿試料を用い、ｃｔＤＮＡの網羅的な遺伝子解析を行った。その結果、６５％の症例で体細胞ドライバー変異が検出された。ＬＢによりドライバー変異が陽性となった症例では、遠隔転移再発が有意に早期かつ高頻度に認められ、予後不良であることがわかった。検出されたドライバー変異には、ＫＲＡＳだけでなく、膵臓発がんの主要なドライバー遺伝子として認識されているＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４も含まれていた。また、検出頻度は低いものの、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ２、ＫＥＡＰ１、ＫＩＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＴＯＲ、ＮＲＡＳといった他のドライバー変異も見つかっており、これらはアクショナブル変異に含まれる。特に膵がんでは、腫瘍内の豊富な線維性間質、腫瘍組織の不均一性、及び解剖学的特徴から、腫瘍組織を用いた遺伝子変異の診断は比較的困難である（an official journal of the American Association for CancerResearch.2017;23(20):6094-100.）。ＬＢの特徴は、これらの困難を克服するために有用であると認識され、特に膵がんに対する有用性が期待される。切除可能膵がん患者の予後は、ｃｔＤＮＡの網羅的なゲノムプロファイリングの結果によって層別化された。膵がん患者の予後予測に有用であることに加え、ｃｔＤＮＡの網羅的ゲノムプロファイリングは、ＬＢ所見に基づく膵がんの個別化医療を発展させるための基盤資源となり得る。
【0092】
さらに、ＬＢ試料から検出されたドライバー変異の数が予後に及ぼす影響についても検討した。その結果、ＬＢで検出されたドライバー変異の数が増えるほど予後が悪化すること、ｃｔＤＮＡで複数のドライバー変異が確認された症例では、早期再発が有意に増加することが明らかとなった。本発明者らは、ＬＢで検出されたドライバー変異の数が膵がんの予後バイオマーカーであり、早期再発の予測因子であることを初めて報告する。ＫＲＡＳのみならず他の遺伝子の変異も調査し、治療過程を通じてドライバー変異の数をモニターすることで、より正確に予後を予測できることが示唆された。
【0093】
［実施例２］
膵がん以外の固形がん患者を対象とした検討
１．材料及び方法
１－１．患者及び試料
肺がん患者１４名、大腸がん患者１６名、及び甲状腺がん患者１名の合計３１名を対象として、実施例１と同様の方法にて、ＬＢのために各がんの切除術前に患者から血漿試料を採取し、ドライバー変異の評価を行った。ただし、ターゲットキャプチャーパネルは、表９に示す７０の遺伝子を対象として特別に設計した。
膵がん以外の固形がん患者を対象とした検討
１．材料及び方法
１－１．患者及び試料
肺がん患者１４名、大腸がん患者１６名、及び甲状腺がん患者１名の合計３１名を対象として、実施例１と同様の方法にて、ＬＢのために各がんの切除術前に患者から血漿試料を採取し、ドライバー変異の評価を行った。ただし、ターゲットキャプチャーパネルは、表９に示す７０の遺伝子を対象として特別に設計した。
【0094】
【表9】
【0095】
２．結果
２－１．ＬＢにおけるドライバー変異
３１例のうち、２２例（７１．０％）のＬＢから、のべ４１個のtier １変異（表１０）が検出された。
２－１．ＬＢにおけるドライバー変異
３１例のうち、２２例（７１．０％）のＬＢから、のべ４１個のtier １変異（表１０）が検出された。
【0096】
【表10】
配列番号３：ACCTACTCTATTGGGTTTTCATACAGCTAGCGGGAAAAAAGTTAAAATTGCAAAGGAATCTTTGGACAA
配列番号４：GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGAGCACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
【0097】
２－２．ＬＢにおけるドライバー変異の数を評価することの有用性
ＬＢで検出されたtier １変異を定量化した（表１１、図６ａ）。ＬＢでは、３１例中２２例（７１．０％）で少なくとも１つのtier １変異が同定された。さらに、３１例中１１例（３５．５％）でｃｔＤＮＡに複数のtier１変異が確認され、１名の患者で最大６つの変異が確認された。変異の数によって患者の各がんの切除術後のＯＳが層別化され、変異の数が増えるほどＯＳは悪化する傾向にあった（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．０４０４、図６ｂ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の３年ＯＳは５５．６％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の３年ＯＳは２７．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の３年ＯＳは９．１％であった。
ＬＢで検出されたtier １変異を定量化した（表１１、図６ａ）。ＬＢでは、３１例中２２例（７１．０％）で少なくとも１つのtier １変異が同定された。さらに、３１例中１１例（３５．５％）でｃｔＤＮＡに複数のtier１変異が確認され、１名の患者で最大６つの変異が確認された。変異の数によって患者の各がんの切除術後のＯＳが層別化され、変異の数が増えるほどＯＳは悪化する傾向にあった（ドライバー変異の数、０ｖｓ．１、Ｐ＝０．０４０４、図６ｂ）。具体的には、tier １変異の数が０である場合、患者の３年ＯＳは５５．６％であり、tier １変異の数が１である場合、患者の３年ＯＳは２７．３％であり、tier １変異の数が≧２である場合、患者の３年ＯＳは９．１％であった。
【0098】
【表11】
【0099】
３．考察
実施例２では、肺がん、大腸がん、及び甲状腺がんの患者を対象として、ＬＢ試料から検出されたドライバー変異の数が予後に及ぼす影響について検討した。その結果、膵がん患者を対象とした実施例１と同様に、ＬＢで検出されたドライバー変異の数が増えるほど予後が悪化することが明らかとなった。
これらの結果から、ＬＢで検出されたドライバー変異の数は、膵がんのみならず、広く固形がんにおいて有用な予後バイオマーカーであることが示唆された。
実施例２では、肺がん、大腸がん、及び甲状腺がんの患者を対象として、ＬＢ試料から検出されたドライバー変異の数が予後に及ぼす影響について検討した。その結果、膵がん患者を対象とした実施例１と同様に、ＬＢで検出されたドライバー変異の数が増えるほど予後が悪化することが明らかとなった。
これらの結果から、ＬＢで検出されたドライバー変異の数は、膵がんのみならず、広く固形がんにおいて有用な予後バイオマーカーであることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0100】
本発明は、がん遺伝子パネル検査又はそのためのキット等への応用が期待されるため、特に医薬分野において有効に利用可能である。
【図1(a)】
【図1(b)】
【図1(c)】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】