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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024015783
(43)【公開日】2024-02-06
(54)【発明の名称】輸送体タンパク質の探索方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240130BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240130BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240130BHJP
C07D 213/82 20060101ALI20240130BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20240130BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240130BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240130BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240130BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240130BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240130BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N5/10 ZNA
C12N15/12
C07D213/82 CSP
A61K31/44
A61P43/00 121
A61K45/00
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022118082
(22)【出願日】2022-07-25
(71)【出願人】
【識別番号】399086263
【氏名又は名称】学校法人帝京大学
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(71)【出願人】
【識別番号】399030060
【氏名又は名称】学校法人 関西大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】出口 芳春
(72)【発明者】
【氏名】久保 義行
(72)【発明者】
【氏名】黒澤 俊樹
(72)【発明者】
【氏名】田畑 英嗣
(72)【発明者】
【氏名】手賀 悠真
(72)【発明者】
【氏名】樋口 慧
(72)【発明者】
【氏名】寺崎 哲也
(72)【発明者】
【氏名】内田 康雄
(72)【発明者】
【氏名】住吉 孝明
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C055
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR48
4B063QR62
4B063QR66
4B063QR77
4B063QR80
4B063QS05
4B063QS12
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS38
4B063QS39
4B063QX02
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB19
4B065BB25
4B065BB34
4B065BB37
4B065BC03
4B065BC05
4B065BC07
4B065BC11
4B065BC41
4B065CA24
4B065CA46
4C055AA01
4C055BA02
4C055BA52
4C055BB10
4C055CA02
4C055CA06
4C055CA58
4C055CB11
4C055DA01
4C084AA19
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC17
(57)【要約】
【課題】輸送体タンパク質の新規探索方法、及び前記新規探索方法を用いて見出された新規輸送体タンパク質分子を用いた、カチオン性薬物のスクリーニングに利用可能な技術を提供する。
【解決手段】発現ベクターは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む。ベクターセットは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を備える。輸送体タンパク質の探索方法は、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させることと、接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、を含む。
【選択図】なし
【解決手段】発現ベクターは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む。ベクターセットは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を備える。輸送体タンパク質の探索方法は、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させることと、接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現ベクター。
【請求項2】
ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える、ベクターセット。
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える、ベクターセット。
【請求項3】
請求項１に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項4】
ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を含む、細胞。
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を含む、細胞。
【請求項5】
ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、前記ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である、細胞。
内在性の、前記ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である、細胞。
【請求項6】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
（一般式（Ｉ）中、Ｘ１１は炭素数１以上１０以下のアルキル基である。ｎ１１は０以上１０以下の整数である。）
【化1】
【請求項7】
下記式（Ｉ－１）で表される、請求項６に記載の化合物。
【化2】
【請求項8】
請求項６に記載の化合物を含む、プロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブ。
【請求項9】
請求項６又は７に記載の化合物と、生理活性物質と、を含む、医薬組成物。
【請求項10】
請求項１に記載の発現ベクター、請求項２に記載のベクターセット、及び、請求項３～５のいずれか一項に記載の細胞からなる群より選ばれる１種以上と、
請求項８に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブと、
を備える、被験物質のスクリーニング用キット。
請求項８に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブと、
を備える、被験物質のスクリーニング用キット。
【請求項11】
請求項１に記載の発現ベクター、請求項２に記載のベクターセット、又は、請求項３～５のいずれか一項に記載の細胞を用いることを含む、被験物質のスクリーニング方法。
【請求項12】
請求項８に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブを更に用いる、請求項１１に記載の被験物質のスクリーニング方法。
【請求項13】
輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む、輸送体タンパク質の探索方法。
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む、輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項14】
前記接触において、前記細胞と、前記基質とを、前記輸送体タンパク質の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、請求項１３に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項15】
前記光反応性基がアリルアジド基又はジアジリン基である、請求項１３又は１４に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項16】
脳微小血管内皮細胞と、光反応性基が導入されたピリラミンとを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含み、
前記輸送体タンパク質がプロトン／有機カチオン交換輸送体である、請求項１３又は１４に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含み、
前記輸送体タンパク質がプロトン／有機カチオン交換輸送体である、請求項１３又は１４に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項17】
前記接触において、前記脳微小血管内皮細胞と、前記光反応性基が導入されたピリラミンとを、プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、請求項１６に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項18】
前記プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤がフルボキサミンである、請求項１７に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【請求項19】
前記光反応性基が導入されたピリラミンが下記式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１６に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【化3】
【請求項20】
下記式（ＩＩ）で表される化合物。
【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、輸送体タンパク質の探索方法及びその使用に関する。本発明は、具体的には、発現ベクター、ベクターセット、細胞、化合物、プロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブ、医薬組成物、被験物質のスクリーニング用キット、被験物質のスクリーニング方法、及び輸送体タンパク質の探索方法に関する。
【背景技術】
【0002】
脳には末梢組織とは異なり、血液脳関門（ＢＢＢ）というバリア機能が存在する。ＢＢＢの解剖学的実体は、脳微小血管内皮細胞であり、細胞同士が強固に密着結合しているために物理的に外敵から脳を守っている。一方で、ＢＢＢにはグルコースやアミノ酸等を輸送する輸送体（トランスポーター）が発現しており、脳神経活動に必要な栄養物質を脳内に効率的に取り込む機能を有する。
【0003】
ＢＢＢは脳神経に影響を及ぼす化学物質を排除する機能を有することがこれまでの一般常識であったが、近年、向精神薬等のカチオン性薬物を積極的に脳内に取り込むことがわかっている。代表的な例として、抗ヒスタミン薬であるジフェンヒドラミンやオキシコドンは、血液中の非結合型濃度に比べて脳内非結合型濃度は５倍以上６倍以下高くなることが知られている。発明者らは、この現象を生み出すトランスポーターがプロトン／有機カチオン交換輸送体（Ｈ＋／ＯＣ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）であることを明らかにしている（例えば、非特許文献１等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Shimomura K et al., “Functional expression of a proton-coupled organic cation (H+/OC) antiporter in human brain capillary endothelial cell line hCMEC/D3, a human blood-brain barrier mode.”, Fluids Barriers CNS, Vol. 10, No. 8, pp. 1-10, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、脳微小血管内皮細胞の細胞膜上に存在するプロトン／有機カチオン交換輸送体の分子実体は依然不明である。プロトン／有機カチオン交換輸送体は、副作用を軽減し、脳に効率的に輸送可能な新規の中枢神経系疾患治療薬の開発を促進する標的になり得ることから、該輸送体の分子解明が求められている。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、輸送体タンパク質の新規探索方法を提供する。また、前記新規探索方法を用いて見出された新規輸送体タンパク質分子を用いた、カチオン性薬物のスクリーニングに利用可能な技術を提供する。また、プロトン／有機カチオン交換輸送体の新規基質化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現ベクター。
（２） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える、ベクターセット。
（３） （１）に記載の発現ベクターを含む、細胞。
（４） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を含む、細胞。
（５） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、前記ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である、細胞。
（６） 下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
（１） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現ベクター。
（２） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える、ベクターセット。
（３） （１）に記載の発現ベクターを含む、細胞。
（４） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、を含む、細胞。
（５） ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、前記ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である、細胞。
（６） 下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
【0008】
【化1】
【0009】
（一般式（Ｉ）中、Ｘ１１は炭素数１以上１０以下のアルキル基である。ｎ１１は０以上１０以下の整数である。）
【0010】
（７） 下記式（Ｉ－１）で表される、（６）に記載の化合物。
【0011】
【化2】
【0012】
（８） （６）又は（７）に記載の化合物を含む、プロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブ。
（９） （６）又は（７）に記載の化合物と、生理活性物質と、を含む、医薬組成物。
（１０） （１）に記載の発現ベクター、（２）に記載のベクターセット、及び、（３）～（５）のいずれか一つに記載の細胞からなる群より選ばれる１種以上と、
（８）に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブと、
を備える、被験物質のスクリーニング用キット。
（１１） （１）に記載の発現ベクター、（２）に記載のベクターセット、又は、（３）～（５）のいずれか一つに記載の細胞を用いることを含む、被験物質のスクリーニング方法。
（１２） （８）に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブを更に用いる、請求項１１に記載の被験物質のスクリーニング方法。
（１３） 輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む、輸送体タンパク質の探索方法。
（１４） 前記接触において、前記細胞と、前記基質とを、前記輸送体タンパク質の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、（１３）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１５） 前記光反応性基がアリルアジド基又はジアジリン基である、（１３）又は（１４）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１６） 脳微小血管内皮細胞と、光反応性基が導入されたピリラミンとを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含み、
前記輸送体タンパク質がプロトン／有機カチオン交換輸送体である、（１３）～（１５）のいずれか一つに記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１７） 前記接触において、前記脳微小血管内皮細胞と、前記光反応性基が導入されたピリラミンとを、プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、（１６）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１８） 前記プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤がフルボキサミンである、（１７）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１９） 前記光反応性基が導入されたピリラミンが下記式（ＩＩ）で表される化合物である、（１６）～（１８）のいずれか一つに記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（９） （６）又は（７）に記載の化合物と、生理活性物質と、を含む、医薬組成物。
（１０） （１）に記載の発現ベクター、（２）に記載のベクターセット、及び、（３）～（５）のいずれか一つに記載の細胞からなる群より選ばれる１種以上と、
（８）に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブと、
を備える、被験物質のスクリーニング用キット。
（１１） （１）に記載の発現ベクター、（２）に記載のベクターセット、又は、（３）～（５）のいずれか一つに記載の細胞を用いることを含む、被験物質のスクリーニング方法。
（１２） （８）に記載のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブを更に用いる、請求項１１に記載の被験物質のスクリーニング方法。
（１３） 輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む、輸送体タンパク質の探索方法。
（１４） 前記接触において、前記細胞と、前記基質とを、前記輸送体タンパク質の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、（１３）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１５） 前記光反応性基がアリルアジド基又はジアジリン基である、（１３）又は（１４）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１６） 脳微小血管内皮細胞と、光反応性基が導入されたピリラミンとを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含み、
前記輸送体タンパク質がプロトン／有機カチオン交換輸送体である、（１３）～（１５）のいずれか一つに記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１７） 前記接触において、前記脳微小血管内皮細胞と、前記光反応性基が導入されたピリラミンとを、プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させる、（１６）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１８） 前記プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤がフルボキサミンである、（１７）に記載の輸送体タンパク質の探索方法。
（１９） 前記光反応性基が導入されたピリラミンが下記式（ＩＩ）で表される化合物である、（１６）～（１８）のいずれか一つに記載の輸送体タンパク質の探索方法。
【0013】
【化3】
【0014】
（２０） 下記式（ＩＩ）で表される化合物。
【0015】
【化4】
【発明の効果】
【0016】
上記態様の発現ベクター及びベクターセットによれば、新規輸送体タンパク質分子を発現させることができる。上記態様の細胞は、新規輸送体タンパク質分子を発現する細胞であり、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物のスクリーニングに利用することができる。上記態様の化合物は、プロトン／有機カチオン交換輸送体の基質として利用することができる。上記態様のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブは、プロトン／有機カチオン交換輸送体の機能解析に利用することができる。上記態様の医薬組成物によれば、脳に移行しにくい生理活性物質の脳への取り込みを促進することができる。上記態様の被験物質のスクリーニング用キット及び被験物質のスクリーニング方法によれば、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物をスクリーニングすることができる。上記態様の輸送体タンパク質の探索方法によれば、未知の輸送体タンパク質を探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】実施例１における新規の輸送体タンパク質の探索方法（Proteomics-based Identification of transporter by Crosslinking substrate in Keyhole；ＰＩＣＫ法）の手順及びＰＩＣＫ法で選択された候補タンパク質の機能解析のスキームを示す図である。
【図2A】実施例１におけるプロトン／有機カチオン（Ｈ＋／ＯＣ）交換輸送体を介した取り込みに対するアジド基修飾したピリラミン（ＡｚＰＹＲ）の影響を調べた結果を示すグラフである。「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【図2B】実施例１におけるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の活性に対するＡｚＰＹＲによる光架橋反応の影響を調べた結果を示すグラフである。「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【図3A】実施例１における単一遺伝子をノックダウンしたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での各遺伝子のｍＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。
【図3B】実施例１におけるネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ａ）又はＣＤ９のｓｉＲＮＡ（Ｂ）処理から４８時間後のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の明視野像である。スケールバーは１００μｍである。
【図4】実施例１における複数の遺伝子をノックダウンしたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での各遺伝子のｍＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。
【図5A】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、ＬＨＦＰＬ６、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞での各種Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊＊」はｐ＜０．０１であり、Ｍｏｃｋ細胞に対して有意差があったことを示す。
【図5B】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞での各種Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、「＊＊」はｐ＜０．０１であり、Ｍｏｃｋ細胞及びＴＭ７ＳＦ３を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に対して有意差があったことを示す。
【図5C】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞でのアンチピリンの取り込み試験の結果を示すグラフである。
【図6A】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での時間及び温度に依存したピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込み試験の結果を示すグラフである。
【図6B】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での濃度依存的なピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込み試験の結果を示すグラフである。
【図6C】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのＨ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤存在又は非存在下のピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【図6D】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みに対する細胞内ｐＨの影響を検討した結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【図6E】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みに対する細胞外ナトリウムイオン、膜電位及び代謝エネルギーの影響を検討した結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【図6F】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、ＬＨＦＰＬ６、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６をノックダウンしたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のｍＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。
【図6G】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、ＬＨＦＰＬ６、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６をノックダウンしたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、ネガティブコントロールに対して有意差があったことを示す。
【図6H】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞でのピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、ネガティブコントロールに対して有意差があったことを示す。
【図6I】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞でのＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のｍＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。
【図7】実施例１におけるヒト及びマウスの脳微小血管内皮細胞でのＴＭ７ＳＦ３、ＬＨＦＰＬ６、及びＢＢＢに存在する各種輸送体の既報に基づいたｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図8】実施例１におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのピリラミンの取り込み試験の結果を示すグラフである。
【図9】実施例１におけるＴＭ７ＳＦ３、ＬＨＦＰＬ６、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６をノックダウンしたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのガバペンチンの取り込み試験の結果を示すグラフである。「＊」はｐ＜０．０５であり、ネガティブコントロールに対して有意差があったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
≪用語の定義≫
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。
【0019】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
【0020】
本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【0021】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載する。
【0022】
本明細書において、「発現可能な状態」という用語は、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを指す。
【0023】
本明細書において、「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。
【0024】
≪輸送体タンパク質の探索方法≫
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、
輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させること（以下、「接触工程」と称する場合がある）と、
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択すること（以下、「選択工程」と称する場合がある）と、
を含む。
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、
輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させること（以下、「接触工程」と称する場合がある）と、
前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択すること（以下、「選択工程」と称する場合がある）と、
を含む。
【0025】
従来では、輸送体は単一のタンパク質分子によって構成されていると考えられていた。これに対して、発明者らは、後述する実施例に示すように、輸送体が複数のタンパク質分子から構成された複合体であるという仮説を基に、新規の輸送体タンパク質の探索方法（Proteomics-based Identification of transporter by Crosslinking substrate in Keyhole；以下、「ＰＩＣＫ法」と称する場合がある）を構築した。具体的には、従来の遺伝子レベルでの探索方法及びそれに伴う機能解析では、２分子以上のタンパク質からなる複合体をスクリーニングすることが困難であることから、網羅的にタンパク質を定量することができるプロテオミクス技術として、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ（Sequential window acquisition of all theoretical fragment ion spectra mass spectrometry）法を採用した。さらに、輸送体の候補タンパク質を細胞から効率的に抽出するために、該輸送体の基質に光反応基を導入した基質を用いることを見出した。
【0026】
すなわち、本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法では、まず、光照射下で細胞と前記基質を接触させる。これにより、輸送体の基質結合部位と前記基質との間に光反応性基を介した架橋構造を形成させて、前記基質を基質結合部位に固定化する。次に、細胞から前記基質が結合している（前記基質で標識されている）タンパク質を含む細胞膜画分を抽出し、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析して、輸送体の候補タンパク質を選択する。
【0027】
よって、本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法によれば、上記構成を有することで、未知の輸送体タンパク質を優れた特異度及び精度でスクリーニングすることができる。
【0028】
次いで、本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法の各工程について以下に詳細を説明する。
【0029】
＜接触工程＞
接触工程では、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させる。
接触工程では、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞と、光反応性基が導入された前記輸送体タンパク質の基質とを、光照射下で接触させる。
【0030】
［細胞］
細胞の種類としては、標的である輸送体タンパク質が細胞膜上に発現しているものであれば、特に限定されない。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）に存在する輸送体タンパク質を解析する場合には、脳微小血管内皮細胞やその不死化した細胞株を用いることができる。また、その他の細胞としては、肝細胞、腎臓細胞、網膜細胞、脳脊髄液関門細胞やそれらの不死化した細胞株を用いることができる。
細胞の種類としては、標的である輸送体タンパク質が細胞膜上に発現しているものであれば、特に限定されない。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）に存在する輸送体タンパク質を解析する場合には、脳微小血管内皮細胞やその不死化した細胞株を用いることができる。また、その他の細胞としては、肝細胞、腎臓細胞、網膜細胞、脳脊髄液関門細胞やそれらの不死化した細胞株を用いることができる。
【0031】
細胞の由来とする動物種としては、哺乳動物が好ましく、具体的には、マウス、ラット、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、ヒトが好ましい。
【0032】
上記細胞を培養するための培地は、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができ、例えば、αＭＥＭ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ－Ａ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ＳＦＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＨＴＦ培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞が脳微小血管内皮細胞やその不死化した細胞株である場合には、Ｌｏｎｚａ社のＥＢＭ－２基本培地等の市販の培地を用いることもできる。
【0033】
培地は、血清含有培地であってもよく、無血清培地であってもよい。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清等）の濃度は、０ｖ／ｖ％以上２０ｖ／ｖ％以下とすることができる。
【0034】
培地は、その他公知の添加物を含んでもよい。添加物は特に限定されないが、例えば、公知の成長因子、ポリアミン類、ミネラル、糖類（例えば、グルコース等）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸等）及びその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン等）、還元剤（例えば、２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、ステロイド、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン等）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えば、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ－Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等）が挙げられる。これらを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。各添加物は公知の濃度範囲で含むことができる。
【0035】
［基質］
基質としては、標的の輸送体タンパク質の基質として公知の物質に光反応性基が導入したものを用いることができる。
基質としては、標的の輸送体タンパク質の基質として公知の物質に光反応性基が導入したものを用いることができる。
【0036】
光反応性基とは、一般に、紫外線（ＵＶ）や可視光に曝露されることで光励起され、反応性活性種に変換される反応基であり、これにより近くに存在するタンパク質のアミノ酸残基と共有結合を形成する。本実施形態においては、紫外線の照射により反応性活性種に変換される反応基が好ましく用いられる。光反応性基として具体的には、アリルアジド基、アジドメチルクマリン基、ベンゾフェノン基、アントラキノン基、ジアジリン基等が挙げられる。アリルアジド基としては、フェニルアジド基、ｏ－ヒドロキシフェニルアジド基、ｍ－ヒドロキシフェニルアジド基、テトラフルオロフェニルアジド基、ｏ－ニトロフェニルアジド基、ｍ－ニトロフェニルアジド基等が挙げられる。中でも、構造が比較的小さく、基質が輸送体タンパク質に結合する際に妨げにならないことから、アリルアジド基、又はジアジリン基が好ましく、フェニルアジド基がより好ましい。これらの光反応性基は、基質に直接結合していてもよく、炭素数１以上１０以下の鎖状アルキレン基、カルボニル基、アミド結合、エーテル結合等のリンカー構造を介して結合していてもよい。
【0037】
例えば、後述する実施例に示すように、標的の輸送体タンパク質がＢＢＢに存在するプロトン／有機カチオン（Ｈ＋／ＯＣ）交換輸送体である場合には、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質として知られている、ピリラミン、ジフェンヒドラミン等のＨ１受容体拮抗剤；ニコチン、バレニクリン等のニコチン性アセチルコリン受容体作動剤；メマンチン等のＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤；トラマドール、オキシコドン等のオピオイド受容体作動剤；ナルトレキソン等のオピオイド受容体拮抗剤、クロニジン等のアドレナリンα２受容体作動剤；プラミペキソール、Ｒ－アポモルヒネ等のドパミン受容体作動剤等に、光反応性基が導入したものを用いることができる。中でも、血液から脳内への取り込み量が顕著に高く、合成が簡便であることから、光反応性基を導入したピリラミンが好ましく、後述する式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩ）」と称する場合がある）がより好ましい。
【0038】
［阻害剤］
接触工程において、上記細胞と、上記基質とを、輸送体タンパク質の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させることが好ましい。後述する選択工程において、上記阻害剤存在条件のサンプルと、上記阻害剤非存在条件のサンプルの結果を比較することで、候補タンパク質の検出精度をより向上させることができる。輸送体タンパク質の阻害剤としては、輸送体タンパク質と、光反応性基が導入された該輸送体タンパク質の基質との結合を阻害するものであればよく、輸送体タンパク質の基質結合部位を占有することで、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質が結合することを妨げる競合的阻害剤であってもよく、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質の輸送体タンパク質への結合を直接的に阻害せず、輸送体タンパク質の基質結合部位以外の部位に結合して、輸送体タンパク質の基質との結合活性を阻害する非競合的阻害剤であってもよい。なお、阻害剤として競合的阻害剤を用いる場合には、光反応性基が導入されていないものであって、且つ、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質に使用される基質とは異なる構造の基質を用いることが好ましい。
接触工程において、上記細胞と、上記基質とを、輸送体タンパク質の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させることが好ましい。後述する選択工程において、上記阻害剤存在条件のサンプルと、上記阻害剤非存在条件のサンプルの結果を比較することで、候補タンパク質の検出精度をより向上させることができる。輸送体タンパク質の阻害剤としては、輸送体タンパク質と、光反応性基が導入された該輸送体タンパク質の基質との結合を阻害するものであればよく、輸送体タンパク質の基質結合部位を占有することで、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質が結合することを妨げる競合的阻害剤であってもよく、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質の輸送体タンパク質への結合を直接的に阻害せず、輸送体タンパク質の基質結合部位以外の部位に結合して、輸送体タンパク質の基質との結合活性を阻害する非競合的阻害剤であってもよい。なお、阻害剤として競合的阻害剤を用いる場合には、光反応性基が導入されていないものであって、且つ、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質に使用される基質とは異なる構造の基質を用いることが好ましい。
【0039】
例えば、後述する実施例に示すように、標的の輸送体タンパク質がＢＢＢに存在するＨ＋／ＯＣ交換輸送体である場合には、上述した公知のＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質のうち、光反応性基を導入されていないものであって、且つ、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質に使用される基質とは異なる構造のものを競合的阻害剤として活用することができる。また、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤としては、アミトリプチリン、メキシレチン、フルボキサミン等のＨ＋／ＯＣ交換輸送体への阻害作用が知られているものを用いることもできる。中でも、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤としては、フルボキサミン又はジフェンヒドラミンであることが好ましく、細胞への毒性が比較的弱いことから、フルボキサミンであることがより好ましい。
【0040】
［緩衝液］
接触工程では、培地を緩衝液に替えて、上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質や、必要に応じて、上記輸送体タンパク質の阻害剤を添加することで、これらの成分を細胞と接触させることができる。
接触工程では、培地を緩衝液に替えて、上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質や、必要に応じて、上記輸送体タンパク質の阻害剤を添加することで、これらの成分を細胞と接触させることができる。
【0041】
緩衝液としては、公知のものを適宜選択して使用することができるが、例えば、次に示す組成のものを使用することができる。緩衝液の組成の例示；１２２ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。
【0042】
緩衝液中の上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質の濃度は、基質の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体であって、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質が化合物（ＩＩ）である場合には、０．０１ｍＭ以上１．０ｍＭ以下とすることができ、０．０５ｍＭ以上０．７ｍＭ以下とすることができ、０．０７ｍＭ以上０．５ｍＭ以下とすることができる。
【0043】
緩衝液中の阻害剤の濃度についても、阻害剤の種類に応じて、輸送体タンパク質への阻害効果が報告されている濃度となるように適宜設定することができる。例えば、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体であって、阻害剤がフルボキサミンである場合には、０．１μＭ以上１．０ｍＭ以下とすることができ、０．５μＭ以上０．７ｍＭ以下とすることができ、１μＭ以上０．５ｍＭ以下とすることができる。
【0044】
［培養条件］
接触工程において、細胞の培養条件としては、細胞の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、公知の細胞非接着性、低接着性又は接着性培養容器に細胞を播種して、上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質や、必要に応じて、上記輸送体タンパク質の阻害剤を添加した緩衝液で培養することにより行うことができる。
接触工程において、細胞の培養条件としては、細胞の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、公知の細胞非接着性、低接着性又は接着性培養容器に細胞を播種して、上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質や、必要に応じて、上記輸送体タンパク質の阻害剤を添加した緩衝液で培養することにより行うことができる。
【0045】
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
【0046】
培養温度は３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは３７±３℃、すなわち、３４℃以上４０℃以下、より好ましくは３７±１℃、すなわち、３６℃以上３８℃以下である。
【0047】
培養期間、すなわち、細胞と上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質との接触時間は、１分間以上１時間以下とすることができ、３分間以上１０分間以下とすることができる。光照射時間は、上記接触時間と同じであってもよく、異なっていてもよいが、接触時間中の少なくとも１分間以上、好ましくは３分間以上連続して光を照射する。
【0048】
光としては、光反応性基の種類に応じて適宜選択することができるが、上述した光反応性基に対しては紫外線を照射することが好ましく、市販の紫外線照射器を用いて行うことができる。市販の紫外線照射器としては、例えば、ベンチトップトランスイルミネーター（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＡＧ社製）等を用いることができる。
【0049】
上述した阻害剤を用いる場合には、上述した阻害剤を上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質と同時に細胞に接触させてもよく、上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質と接触させる前から接触させてもよい。上述した阻害剤を上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質と接触させる前から接触させる場合には、細胞と上記光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質との接触開始の５分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分程度前に、阻害剤存在下で細胞を前培養する。
【0050】
＜選択工程＞
選択工程では、前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択する。
選択工程では、前記接触後の細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択する。
【0051】
細胞膜画分の調製は、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等の公知の分画処理方法に基づいて行うことができる。また、ＩｎｖｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭｉｎｕｔｅ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（登録商標）等の市販の試薬を用いて行うこともできる。
【0052】
細胞膜画分は、タンパク質消化酵素による分解処理によって、質量分析計で分析可能なペプチド断片とする前処理を行うことが好ましい。該分解処理は、公知の方法に従って行うことができる。例えば使用する酵素としてはトリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｎ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、リシルエンドペプチダーゼ、クロストリパイン等が挙げられる。中でも、トリプシンが好ましい。タンパク質消化酵素による分解処理条件としては、用いるタンパク質消化酵素の性質により温度や時間等の条件を適宜選択することができる。例えばトリプシンを用いる場合、３０℃以上４５℃以下で１時間以上３６時間以下であることが好ましく、３３℃以上４０℃以下で５時間以上３０時間であることがより好ましく、３５℃以上３８℃以下で１０時間以上２８時間以下であることがさらに好ましく、３６℃以上３７℃以下で１６時間以上２４時間以下であることが特に好ましい。
【0053】
上記前処理後の試料を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行う。
【0054】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法とは、２０１２年にＧｉｌｅｔらによって発表された液体クロマトグラフ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の解析手法であり、データ非依存性解析（Data-independent acquisition；ＤＩＡ）法の一つである。
【0055】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、まず、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により、ペプチドが分離される。ここで液体クロマトグラフィーとしては、具体的には、ペプチドの電荷の違いを利用して分離を行なう陽イオン交換クロマトグラフィーや、ペプチドの疎水性の違いを利用して分離を行なう逆相クロマトグラフィーを挙げることができ、両者を組み合わせたものであってもよい。
【0056】
次いで、分離された各ペプチドについて、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。質量分析におけるイオン化の方法はソフトイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）を用いることが好ましい。各種イオン化法によりイオン化したペプチドはアナライザーで質量に応じて分離される。ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、アナライザーとして四重極－飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分離計を用いる。
【0057】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法において、上記液体クロマトグラフ装置と上記タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）計は、互いに直列に接続されていてもよく、それぞれ独立した装置であってもよい。中でも、液体クロマトグラフ装置とタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を直列につないで構成された、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムが好ましく用いられる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムとして、具体的には、例えば、ＮａｎｏＬＣ ４２５システム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴＯＦ ５６００質量分析計（ＳＣＩＥＸ）から構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム等が挙げられる。
【0058】
イオン化したペプチドの検出からＭＳ／ＭＳスペクトルの取得までは、自動化した測定モードで行うことができる。ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、precursor ionsの検出強度に関係無く、すべてのprecursor ionsについてＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する。ここで、Ｑ１質量フィルターによってprecursor ionsをある程度選別し、ＭＳ／ＭＳスペクトルの取得へ進むことによってＭＳ／ＭＳスペクトルの複雑さをある程度抑えることができる。１回の測定サイクル（例えば３秒間）内で、このＱ１質量フィルター（以下、「ＳＷＡＴＨ ｗｉｎｄｏｗ」と称する場合がある）を低分子量から高分子量までシフトさせることによって、あらゆるペプチドを網羅的に検出する。４００Ｄａ以上１，２００Ｄａ以下の範囲を測定することによって概ねあらゆるペプチドを網羅できること、また１サイクルあたり３秒間程度、且つ、１つのＳＷＡＴＨ ｗｉｎｄｏｗあたり０．０５秒程度が望ましいことから、８００Ｄａの幅を６０個のＳＷＡＴＨ ｗｉｎｄｏｗでカバーするため、１つのＳＷＡＴＨ ｗｉｎｄｏｗの幅は約１３Ｄａ程度となる。ただし、ペプチドの種類が多い質量範囲では例えば５Ｄａ以下，少ない範囲では５０Ｄａ以上のｗｉｎｄｏｗを設定することによって、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複雑さを抑えることができる。このように、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、従来のデータ依存性解析（ＤＤＡ）法と異なり、すべてのprecursor ionsのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する方式であるため、ＤＤＡ法よりもさらに網羅的にペプチドを同定及び定量することができる。
【0059】
現在の質量分析装置の性能では、１つのＳＷＡＴＨ ｗｉｎｄｏｗの幅は上述の通り約１３Ｄａと広く、複数のペプチドを通過させてしまい、依然としてＭＳ／ＭＳスペクトルが複雑になるため、そのスペクトルからペプチド配列を同定することは困難である。そこで、この同定を助けるために、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、「ＳＷＡＴＨライブラリー」が用いられる。ＳＷＡＴＨライブラリーとは、あらゆるペプチドについてＭＳ／ＭＳスペクトルや保持時間の情報を収載したものである。試料が異なっても、配列が同じペプチドであれば、固有のＭＳ／ＭＳスペクトル及び保持時間を持つ、という考え方に基づいている。具体的には、ＳＷＡＴＨライブラリーは、発現するタンパク質の種類が異なる様々な組織、細胞、又はオルガネラ画分のトリプシン消化物を用意し、順次ＤＤＡ ｍｏｄｅで測定し、ペプチド同定を行うことによって作成され、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ測定データと照合される。ＳＷＡＴＨ－ＭＳ測定で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルと同じ保持時間且つ同じ質量範囲に該当するライブラリー情報を照合に用いることによって、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法の複雑なＭＳ／ＭＳスペクトルからのペプチド配列の同定を可能にする。
【0060】
このようにＳＷＡＴＨ－ＭＳ法ではライブラリーを用いて同定作業を行うことから、ライブラリーの規模が大きければ必然的にＳＷＡＴＨ－ＭＳ測定で同定及び定量されるタンパク質は増えるが、逆にライブラリーの規模が小さい場合はＳＷＡＴＨ－ＭＳ法の網羅性の利点を十分に発揮できない。そのため、発現量の比較的低いタンパク質のペプチドを網羅的に収載する観点から、オルガネラ分画やペプチド消化物の等電点電気泳動分画を行った試料をＤＤＡ測定して作成したライブラリーを用いることが好ましい。
【0061】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法ではＭＳ／ＭＳスペクトルとペプチド配列の対応（帰属）が取れたら、各保持時間のＭＳ／ＭＳスペクトルを経時的に並べていき、ＭＳ／ＭＳスペクトルのピークトップを結ぶことによって、定量可能なピークを得る。同じペプチド由来の異なるproduct ionsは全く同じ保持時間に検出されるため、保持時間がずれていた場合はピークの帰属が正しくないため、この時点で保持時間がずれていたものを排除することができる。同定の精度が良かったペプチドについて、比較したい試料間でその面積の比率を取り、同一ペプチド由来の各product ionの面積比の平均を取ることによって、該ペプチドの存在量比を計算する、該タンパク質の存在量比は、そのタンパク質に特異的な配列を持った（複数の）ペプチドの存在量比（の平均値）によって決定することができる。
【0062】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法では、得られたＭＳ／ＭＳデータを、ＳＣＩＥＸ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ、Ｐｅａｋ Ｖｉｅｗ（登録商標）（ＳＷＡＴＨ ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＭｉｃｒｏＡｐｐ等）、ＭＡＴＲＩＸ ＳＣＩＥＮＣＥ社のＭＡＳＣＯＴ等のタンパク質同定のためのソフトウェアにインポートし、上記ＳＷＡＴＨライブラリーを用いてペプチド群を同定する。同定したペプチド群の中には、信頼性の低いペプチドピークを有するものが含まれているため、同定したペプチド群のペプチドピーク（ペプチドピーク群）の中から、信頼性の高いペプチドピークを有するものを選択することが好ましい。
【0063】
取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、信頼性の低いピーク及びペプチドは、既報（参考文献１：Uchida Y et al.,“Identification and Validation of Combination Plasma Biomarker of Afamin, Fibronectin and Sex Hormone-Binding Globulin to Predict Pre-eclampsia.”, Biol Pharm Bull., Vol. 44, No. 6, pp. 804-815, 2021.）に従い、除去することができる。具体的には、コントロール群でピーク面積が１０００カウントを超える遷移を抽出する。２つの複製間でピーク面積が１０倍を超える遷移を除去する。次に、遷移が１つ又は２つしかないペプチドを除去する。さらに、インシリコペプチド選択基準を適用することにより、非特異的で信頼性の低いペプチドを除去する（上記参考文献１参照）。
【0064】
次いで、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたデータを基に所定の基準を設けて、該基準により輸送体の候補タンパク質を更に絞り込む。光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質は、輸送体の複合体タンパク質に共有結合している。そのため、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質非存在下で検出された輸送体の複合体タンパク質由来のペプチドのピーク（以下、「ピークＸ」と称する場合がある）について、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質存在下では、基質の結合によってペプチドのピークの位置がシフトすることで、ピークＸの面積が減少する、或いは、ピークＸが消失するものと考えられる。よって、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたペプチドのピーク面積について、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質非存在下でのペプチドのピーク面積に対する光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質存在下での該ペプチドのピーク面積の比を算出し、算出された面積比が特定の数値未満であるペプチドを含むタンパク質を輸送体の候補タンパク質として絞り込む。なお、上記基準は、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質への輸送体の特異性や用いる細胞の種類に応じて、数値を適宜設定することができる。
【0065】
より具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体であり、且つ、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質として、化合物（ＩＩ）を用いる場合には、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたペプチドのピーク面積について、以下の基準Ａ）を満たすペプチドを選択することで、候補タンパク質を絞り込むことができる。
基準Ａ）：化合物（ＩＩ）非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）存在下でのピーク面積の比が０．１未満であるペプチド。
基準Ａ）：化合物（ＩＩ）非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）存在下でのピーク面積の比が０．１未満であるペプチド。
【0066】
また、上述したように、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質存在下では、輸送体の複合体タンパク質中の基質結合部位における光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質が結合していないペプチドのピーク面積（ピークＸの面積）は減少するが、阻害剤の存在によって、その減少が減衰する、すなわち、上記ピークＸが回復するものと考えられる。よって、例えば、輸送体の阻害剤存在及び非存在下での検討を行った場合には、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたペプチドのピーク面積について、まず、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質及び阻害剤非存在下でのペプチドのピーク面積に対する光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質存在下であって阻害剤非存在下の該ペプチドのピーク面積の比を算出し、算出された面積比が特定の数値未満であるペプチドを含むタンパク質を輸送体の候補タンパク質として絞り込む。次いで、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質及び阻害剤非存在下でのペプチドのピーク面積に対する光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質及び阻害剤存在下での該ペプチドのピーク面積の比を算出し、算出された面積比が特定の数値範囲内であるペプチドを含むタンパク質を輸送体の候補タンパク質として絞り込む。
【0067】
より具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体であり、光反応性基が導入された輸送体タンパク質の基質として、化合物（ＩＩ）を用い、且つ、阻害剤であるフルボキサミン存在下及び非存在下のサンプルを用いる場合には、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたペプチドのピーク面積について、以下の基準Ｂ）を満たすペプチドを選択することで、候補タンパク質を絞り込むことができる。
基準Ｂ）：化合物（ＩＩ）及びフルボキサミン非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）存在下であってフルボキサミン非存在下のピーク面積の比が０．５未満であり、且つ、化合物（ＩＩ）及び阻害剤非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）及びフルボキサミン存在下でのピーク面積の比が０．５超１．５未満であるペプチド。
基準Ｂ）：化合物（ＩＩ）及びフルボキサミン非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）存在下であってフルボキサミン非存在下のピーク面積の比が０．５未満であり、且つ、化合物（ＩＩ）及び阻害剤非存在下でのピーク面積に対する化合物（ＩＩ）及びフルボキサミン存在下でのピーク面積の比が０．５超１．５未満であるペプチド。
【0068】
また、例えば、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたデータから上記のとおり絞り込まれたタンパク質について、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ等のデータベースから該タンパク質の細胞内での局在情報を得て、細胞膜に局在するタンパク質又は局在未知のタンパク質を選択することで、候補タンパク質を更に絞り込むことができる。
【0069】
また、例えば、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたデータから上記のとおり絞り込まれたタンパク質について、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ等のデータベースから該タンパク質の配列情報を得て、３つ以上の膜貫通領域を有するタンパク質を選択することで、候補タンパク質を更に絞り込むことができる。
【0070】
また、例えば、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析されたデータから上記のとおり絞り込まれたタンパク質について、Human Protein Atlas等のデータベースから該タンパク質の生体内、器官、組織及び細胞における発現及び局在の情報を得て、特定の部位で発現しているタンパク質を選択することで、候補タンパク質を更に絞り込むことができる。
【0071】
＜その他の工程＞
［絞り込み工程］
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、上記接触工程及び上記選択工程に加えて、選択工程の後に、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞において、１以上の候補タンパク質をコードする遺伝子をノックダウン又はノックアウトさせて、前記輸送体タンパク質の基質の取り込み量を測定することで、輸送体の候補タンパク質を絞り込むこと（以下、「絞り込み工程」と称する場合がある）を更に含むことができる。
［絞り込み工程］
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、上記接触工程及び上記選択工程に加えて、選択工程の後に、輸送体タンパク質が細胞膜上に発現している細胞において、１以上の候補タンパク質をコードする遺伝子をノックダウン又はノックアウトさせて、前記輸送体タンパク質の基質の取り込み量を測定することで、輸送体の候補タンパク質を絞り込むこと（以下、「絞り込み工程」と称する場合がある）を更に含むことができる。
【0072】
絞り込み工程において使用される細胞としては、上記「接触工程」において例示された細胞と同様のものが挙げられる。
【0073】
ノックダウン又はノックアウトされる候補タンパク質をコードする遺伝子の数は、１以上であればよく、２以上、３以上、４以上等の複数の遺伝子を同時にノックダウン又はノックアウトしてもよい。輸送体が２分子以上のタンパク質からなる複合体である場合には、２以上の複数の遺伝子を同時にノックダウンすることで、輸送体の候補タンパク質をより正確に特定することができる。
【0074】
また、絞り込み工程において、まず、１つの遺伝子をノックダウン又はノックアウトさせて、輸送体の候補タンパク質を絞り込んだ後、絞り込んだ候補タンパク質をコードする遺伝子のうち、２以上の複数の遺伝子を同時にノックダウン又はノックアウトさせて再度輸送体の候補タンパク質を絞り込む、２段階の絞り込みを行ってもよい。これにより、より確実に輸送体の候補タンパク質を特定することができる。
【0075】
候補タンパク質をコードする遺伝子（標的遺伝子）がノックダウンされた細胞は、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等を細胞に導入することにより、作製することができる。
【0076】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【0077】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０℃以上９５℃以下で１分程度変性させた後、３０℃以上７０℃以下で１時間以上８時間以下アニーリングさせることにより調製することができる。
【0078】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよく、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【0079】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【0080】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【0081】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。
【0082】
候補タンパク質をコードする遺伝子（標的遺伝子）がノックアウトされた細胞は、人工ヌクレアーゼＺＦＮ／ＴＡＬＥＮ／ＣＲＩＳＰＲを細胞に導入することにより、作製することができる。人工ヌクレアーゼは、標的遺伝子に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を導入し、ＤＳＢ修復機構の一つである非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）により挿入欠失変異が導入されることで、標的遺伝子が破壊されたノックアウト細胞が作製される。
【0083】
細胞において、候補タンパク質をコードする遺伝子がノックダウン又はノックアウトされていることは、該遺伝子の発現量をＲＴ－ＰＣＲ法等により測定することで確認することができる。
【0084】
次いで、得られた細胞に基質を接触させて、基質の取り込み量を測定する。基質としては、上記「接触工程」において、基質として例示されたものであって、光反応性基が導入されていないものを用いることができる。例えば、後述する実施例に示すように、標的の輸送体タンパク質がＢＢＢに存在するＨ＋／ＯＣ交換輸送体である場合には、上述した公知のＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質のうち、ピリラミン、トラマドール、ジフェンヒドラミン等を用いることができる。或いは、発明者らが新たに合成したＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質である、後述する一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と称する場合がある）を好ましく用いることができ、後述する式（Ｉ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ－１）」と称する場合がある）をより好ましく用いることができる。
【0085】
基質の取り込み量は、細胞内の基質の取り込み量（ｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を緩衝液中の基質の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）で除して算出されるＣｅｌｌ－ｔｏ－Ｍｅｄｉｕｍ ｒａｔｉｏ（μＬ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として評価することができる。細胞内のタンパク質量は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＢＣＡタンパク質アッセイ等の市販のキットを用いて測定することができる。細胞内に取り込まれた基質は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量することができる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムとしては、島津製作所製のＮｅｘｅｒａ ＸＲ ＨＰＬＣシステム及びＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製のポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えたＱＴＲＡＰ（登録商標） ４５００質量分析計で構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム等が挙げられる。
【0086】
［検証工程］
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、上記接触工程及び上記選択工程に加えて、上記絞り込み工程の後に、候補タンパク質を発現していない細胞に２以上の候補タンパク質をコードする遺伝子を形質転換し、形質転換後の細胞での前記輸送体タンパク質の基質の取り込み量を測定することで、輸送体の候補タンパク質の輸送機能を検証すること（以下、「検証工程」と称する場合がある）を更に含むことができる。
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法は、上記接触工程及び上記選択工程に加えて、上記絞り込み工程の後に、候補タンパク質を発現していない細胞に２以上の候補タンパク質をコードする遺伝子を形質転換し、形質転換後の細胞での前記輸送体タンパク質の基質の取り込み量を測定することで、輸送体の候補タンパク質の輸送機能を検証すること（以下、「検証工程」と称する場合がある）を更に含むことができる。
【0087】
検証工程において使用される候補タンパク質を発現していない細胞及び候補タンパク質をコードする遺伝子の形質転換方法については、後述する「細胞」において詳細を説明する。
【0088】
基質としては、上記「接触工程」において、基質として例示されたものであって、光反応性基が導入されていないものを用いることができる。例えば、後述する実施例に示すように、標的の輸送体タンパク質がＢＢＢに存在するＨ＋／ＯＣ交換輸送体である場合には、上述した公知のＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質のうち、ピリラミン、トラマドール、オキシコドン、バレニクリン等を用いることができる。或いは、発明者らが新たに合成したＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質である、後述する化合物（Ｉ）を好ましく用いることができ、後述する化合物（Ｉ－１）をより好ましく用いることができる。
【0089】
基質の取り込み量は、上記「絞り込み工程」に記載の方法を用いて測定することができる。
【0090】
＜好ましい実施形態＞
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法において、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体である場合には、以下に示す方法が好ましく例示される。
すなわち、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の探索方法の好ましい実施形態としては、
脳微小血管内皮細胞と、光反応性基が導入されたピリラミンとを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む。
本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法において、輸送体タンパク質がＨ＋／ＯＣ交換輸送体である場合には、以下に示す方法が好ましく例示される。
すなわち、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の探索方法の好ましい実施形態としては、
脳微小血管内皮細胞と、光反応性基が導入されたピリラミンとを、光照射下で接触させることと、
前記接触後の脳微小血管内皮細胞を破砕して、細胞膜画分を調製し、該細胞膜画分を用いて、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析を行い、輸送体の候補タンパク質を選択することと、
を含む。
【0091】
光反応性基としては、上記「基質」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、光反応性基が導入されたピリラミンとしては、化合物（ＩＩ）を用いることが特に好ましい。
【0092】
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の探索方法において、上記接触において、前記脳微小血管内皮細胞と、前記光反応性基が導入されたピリラミンとを、プロトン／有機カチオン交換輸送体の阻害剤存在下及び非存在下にて、光照射下で接触させることが好ましい。Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤としては、上記「阻害剤」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、フルボキサミンを用いることが特に好ましい。
【0093】
発明者らは、本実施形態の輸送体の探索方法を用いて、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体として、ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６（ＬＨＦＰＬ６）タンパク質、及び、トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３（ＴＭ７ＳＦ３）タンパク質を同定した。
【0094】
ＬＨＦＰＬ６は、３つの膜貫通ドメインを有し、胃癌の予後バイオマーカー及び治療標的の候補であると報告されているが、これまでその詳細な機能及び臓器分布が全く不明のタンパク質である。
【0095】
ヒトＬＨＦＰＬ６のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５７７１．１、ＸＰ＿０１１５３３１６３．１に開示されている。アミノ酸配列として具体的には、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【0096】
ヒトＬＨＦＰＬ６をコードする塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５７８０．３、ＸＭ＿０１１５３４８６１．２に開示されている。塩基配列として具体的には、例えば、配列番号２で表される塩基配列が挙げられる。
【0097】
ＴＭ７ＳＦ３は、７つの膜貫通ドメインを有し、サイトカインによる膵臓β細胞の死を抑制し、インスリン分泌を促進することが報告されている。また、ｐ５３／ＴＰ５３の下流の転写標的であり、細胞ストレスの発症を減弱させる生存恒常性因子として作用することが報告されている。
【0098】
ヒトＴＭ７ＳＦ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７６３５．１、ＸＰ＿００５２５３４４８．１、ＸＰ＿０４７２８４９４６．１、ＸＰ＿０１６８７４９５２．１、ＸＰ＿０４７２８４９４８．１、ＸＰ＿０４７２８４９４７．１、ＸＰ＿０４７２８４９５１．１、ＸＰ＿０４７２８４９５０．１、ＸＰ＿０４７２８４９５３．１、ＸＰ＿０４７２８４９４９．１、ＸＰ＿０４７２８４９５４．１、ＸＰ＿０４７２８４９５２．１に開示されている。アミノ酸配列として具体的には、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【0099】
ヒトＴＭ７ＳＦ３をコードする塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５５１．３、ＸＭ＿００５２５３３９１．５、ＸＭ＿０４７４２８９９０．１、ＸＭ＿０１７０１９４６３．３、ＸＭ＿０４７４２８９９２．１、ＸＭ＿０４７４２８９９１．１、ＸＭ＿０４７４２８９９５．１、ＸＭ＿０４７４２８９９４．１、ＸＭ＿０４７４２８９９７．１、ＸＭ＿０４７４２８９９３．１、ＸＭ＿０４７４２８９９８．１、ＸＭ＿０４７４２８９９６．１に開示されている。塩基配列として具体的には、例えば、配列番号４で表される塩基配列が挙げられる。
【0100】
後述する実施例に示すように、発明者らにより同定されたＬＨＦＰＬ６及びＴＭ７ＳＦ３を発現する細胞は、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質、すなわち、新規のカチオン性中枢神経系疾患治療薬のスクリーニングを行うのに有益である。ＬＨＦＰＬ６及びＴＭ７ＳＦ３を利用した技術の詳細については後述する。
【0101】
＜化合物（ＩＩ）＞
化合物（ＩＩ）は、下記式（ＩＩ）で表される構造を有する。具体的には、化合物（ＩＩ）は、ピリラミンのピリジン環のパラ位に、アミド結合を介して、光反応性基であるフェニルアジド基が結合した構造を有する。後述する実施例に示すように、化合物（ＩＩ）は、発明者らによって合成された新規化合物である。化合物（ＩＩ）は、上述したように、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の探索方法において、輸送体の候補タンパク質を吊り上げるための光反応性プローブとして好ましく用いることができる。
化合物（ＩＩ）は、下記式（ＩＩ）で表される構造を有する。具体的には、化合物（ＩＩ）は、ピリラミンのピリジン環のパラ位に、アミド結合を介して、光反応性基であるフェニルアジド基が結合した構造を有する。後述する実施例に示すように、化合物（ＩＩ）は、発明者らによって合成された新規化合物である。化合物（ＩＩ）は、上述したように、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の探索方法において、輸送体の候補タンパク質を吊り上げるための光反応性プローブとして好ましく用いることができる。
【0102】
【化5】
【0103】
［化合物（ＩＩ）の製造方法］
化合物（ＩＩ）は、下記反応式に示すように、下記式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩａ）」と称する場合がある）のアニリン基をフェニルアジド基に変換して、化合物（ＩＩ）を得る工程（以下、「化合物（ＩＩ）製造工程」と略記する場合がある）を含む製造方法により、製造できる。以下、工程について詳細に説明する。
化合物（ＩＩ）は、下記反応式に示すように、下記式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩａ）」と称する場合がある）のアニリン基をフェニルアジド基に変換して、化合物（ＩＩ）を得る工程（以下、「化合物（ＩＩ）製造工程」と略記する場合がある）を含む製造方法により、製造できる。以下、工程について詳細に説明する。
【0104】
【化6】
【0105】
（化合物（ＩＩ）製造工程）
化合物（ＩＩ）製造工程では、化合物（ＩＩａ）とＮ３ ＋型アジド導入剤とを反応させることで、化合物（ＩＩａ）のアニリン基をフェニルアジド基に変換して、化合物（ＩＩ）を得る。
化合物（ＩＩ）製造工程では、化合物（ＩＩａ）とＮ３ ＋型アジド導入剤とを反応させることで、化合物（ＩＩａ）のアニリン基をフェニルアジド基に変換して、化合物（ＩＩ）を得る。
【0106】
化合物（ＩＩａ）は、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、市販のものを入手して使用することができる。
【0107】
化合物（ＩＩ）製造工程で使用されるＮ３
＋型アジド導入剤としては、例えば、トリフルオロメタンスルホニルアジド、イミダゾール－１－スルホニルアジド塩酸塩及び硫酸塩、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムクロライド、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェート等が挙げられる。これらの化合物を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0108】
Ｎ３
＋型アジド導入剤の使用量は、例えば、化合物（ＩＩａ）の使用量の０．５倍モル量以上１０．０倍モル量以下とすることができる。
【0109】
化合物（ＩＩ）製造工程は、求核触媒存在下で反応を行うことができる。
求核触媒としては、例えば、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、トリエチルアミン、キノリン、ピリジン、２，６－ルチジン、イソキノリン、ジアザビシクロウンデセン等が挙げられる。
求核触媒としては、例えば、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、トリエチルアミン、キノリン、ピリジン、２，６－ルチジン、イソキノリン、ジアザビシクロウンデセン等が挙げられる。
【0110】
求核触媒の使用量は、例えば、化合物（ＩＩａ）の使用量の０．１倍モル量以上１０倍モル量以下とすることができる。
【0111】
化合物（ＩＩ）製造工程において、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることができる。
【0112】
前記非プロトン性溶媒は特に限定されないが、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカヒドロナフタレン、トルエン、トリエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、１，２－ジメトキシエタン、２－メトキシエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ピリジン、２－ブタノン、アセトン、Ｎ－メチルピロリジノン、ニトロメタン、ジクロロメタン、アセトニトリル、スルホラン、ジメチルスルホキシド、ジイソプロピルエチルアミン、酢酸イソプロピル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、炭酸プロピレン等が挙げられる。
前記非プロトン性溶媒は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記非プロトン性溶媒は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0113】
前記溶媒の使用量は、例えば、化合物（ＩＩａ）の使用量の１０倍モル量以上１０００倍モル量以下とすることができる。
【0114】
化合物（ＩＩ）製造工程において、反応温度は、１０℃以上８０℃以下とすることができる。
【0115】
化合物（ＩＩ）製造工程において、反応時間は、１０分間以上３０時間以下とすることができる。
【0116】
化合物（ＩＩ）製造工程において、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、化合物（ＩＩ）を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、化合物（ＩＩ）を取り出せばよい。また、取り出した化合物（ＩＩ）は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
【0117】
化合物（ＩＩ）は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0118】
＜化合物（Ｉ）＞
化合物（Ｉ）は、下記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。具体的には、化合物（ＩＩ）は、ピリラミンのピリジン環のパラ位に、式：「－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｘ１１」で表される基が結合した構造を有する。後述する実施例に示すように、化合物（Ｉ）は、発明者らによって合成された新規化合物である。化合物（Ｉ）は、新規のカチオン性中枢神経系疾患治療薬のスクリーニングを行う際に、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質として好ましく用いることができる。また、化合物（Ｉ）は、脳に移行しにくい生理活性物質のキャリア分子への応用が期待される。
化合物（Ｉ）は、下記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。具体的には、化合物（ＩＩ）は、ピリラミンのピリジン環のパラ位に、式：「－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１１－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｘ１１」で表される基が結合した構造を有する。後述する実施例に示すように、化合物（Ｉ）は、発明者らによって合成された新規化合物である。化合物（Ｉ）は、新規のカチオン性中枢神経系疾患治療薬のスクリーニングを行う際に、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質として好ましく用いることができる。また、化合物（Ｉ）は、脳に移行しにくい生理活性物質のキャリア分子への応用が期待される。
【0119】
【化7】
【0120】
（一般式（Ｉ）中、Ｘ１１は炭素数１以上１０以下のアルキル基である。ｎ１１は０以上１０以下の整数である。）
【0121】
［Ｘ１１］
Ｘ１１は炭素数１以上１０以下のアルキル基である。
炭素数１以上１０以下のアルキル基としては、鎖状アルキル基が好ましく、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。中でも、Ｘ１１は炭素数１以上６以下のアルキル基が好ましく、炭素数１以上４以下のアルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、又はプロピル基がさらに好ましく、エチル基が特に好ましい。
Ｘ１１は炭素数１以上１０以下のアルキル基である。
炭素数１以上１０以下のアルキル基としては、鎖状アルキル基が好ましく、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。中でも、Ｘ１１は炭素数１以上６以下のアルキル基が好ましく、炭素数１以上４以下のアルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、又はプロピル基がさらに好ましく、エチル基が特に好ましい。
【0122】
［ｎ１１］
ｎ１１は０以上１０以下の整数であり、メチレン基の数を示す。ｎ１１は１以上８以下の整数が好ましく、ｎ１１は１以上５以下の整数がより好ましく、２以上４以下の整数がさらに好ましく、３が特に好ましい。
ｎ１１は０以上１０以下の整数であり、メチレン基の数を示す。ｎ１１は１以上８以下の整数が好ましく、ｎ１１は１以上５以下の整数がより好ましく、２以上４以下の整数がさらに好ましく、３が特に好ましい。
【0123】
好ましい化合物（Ｉ）としては、例えば、Ｘ１１が炭素数１以上６以下のアルキル基であって、ｎ１１が１以上８以下の整数であるもの等が挙げられる。
【0124】
より好ましい化合物（Ｉ）としては、例えば、Ｘ１１が１以上４以下のアルキル基であって、ｎ１１が１以上５以下の整数であるもの等が挙げられる。
【0125】
さらに好ましい化合物（Ｉ）としては、例えば、Ｘ１１がメチル基、エチル基、又はプロピル基であって、ｎ１１が２以上４以下の整数であるもの等が挙げられる。
【0126】
好ましい化合物（Ｉ）としてより具体的には、下記式（Ｉ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ－１）」と称する場合がある）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ－１）は、好ましい化合物（Ｉ）の一例に過ぎず、好ましい化合物（Ｉ）はこれに限定されない。
【0127】
【化8】
【0128】
［化合物（Ｉ）の製造方法］
化合物（Ｉ）は、以下の反応式に示すように、例えば、
下記式（Ｉａ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉａ）」と略記する場合がある）と、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと、を反応させて、式（Ｉｂ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉｂ）」と略記する場合がある）を得る工程（以下、「化合物（Ｉｂ）製造工程」と略記する場合がある）；
化合物（Ｉｂ）と、４－メトキシベンジルクロリドと、を反応させて、式（Ｉｃ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉｃ）」と略記する場合がある）を得る工程（以下、「化合物（Ｉｃ）製造工程」と略記する場合がある）；及び、
化合物（Ｉｃ）を加水分解し、アミノアルキルカルボン酸エステル（一般式：「Ｘ１１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１１－ＮＨ２」で表される化合物；式中、Ｘ１１及びｎ１１は式（Ｉ）におけるＸ１１及びｎ１１と同じである）と反応させて、化合物（Ｉ）を得る工程（以下、「化合物（Ｉ）製造工程」と略記する場合がある）；
を含む製造方法により、製造できる。
化合物（Ｉ）は、以下の反応式に示すように、例えば、
下記式（Ｉａ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉａ）」と略記する場合がある）と、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと、を反応させて、式（Ｉｂ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉｂ）」と略記する場合がある）を得る工程（以下、「化合物（Ｉｂ）製造工程」と略記する場合がある）；
化合物（Ｉｂ）と、４－メトキシベンジルクロリドと、を反応させて、式（Ｉｃ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉｃ）」と略記する場合がある）を得る工程（以下、「化合物（Ｉｃ）製造工程」と略記する場合がある）；及び、
化合物（Ｉｃ）を加水分解し、アミノアルキルカルボン酸エステル（一般式：「Ｘ１１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１１－ＮＨ２」で表される化合物；式中、Ｘ１１及びｎ１１は式（Ｉ）におけるＸ１１及びｎ１１と同じである）と反応させて、化合物（Ｉ）を得る工程（以下、「化合物（Ｉ）製造工程」と略記する場合がある）；
を含む製造方法により、製造できる。
【0129】
【化9】
【0130】
（化合物（Ｉｂ）の製造工程）
化合物（Ｉｂ）の製造工程では、化合物（Ｉａ）と、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと、を反応させて、化合物（Ｉｂ）を得る。
化合物（Ｉｂ）の製造工程では、化合物（Ｉａ）と、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと、を反応させて、化合物（Ｉｂ）を得る。
【0131】
化合物（Ｉａ）（６－ブロモニコチン酸メチル）は、公知の化合物であり、市販のものを入手して使用することができる。
【0132】
Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンについても公知の化合物であり、市販のものを入手して使用することができる。
【0133】
Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンの使用量は、例えば、化合物（Ｉａ）の使用量の１．０倍モル量以上１０．０倍モル量以下とすることができる。
【0134】
化合物（Ｉｂ）の製造工程において、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることができる。
【0135】
前記非プロトン性溶媒は特に限定されないが、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカヒドロナフタレン、トルエン、トリエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、１，２－ジメトキシエタン、２－メトキシエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ピリジン、２－ブタノン、アセトン、Ｎ－メチルピロリジノン、ニトロメタン、ジクロロメタン、アセトニトリル、スルホラン、酢酸イソプロピル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、炭酸プロピレン等が挙げられる。
前記非プロトン性溶媒は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記非プロトン性溶媒は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0136】
前記溶媒の使用量は、例えば、化合物（Ｉａ）の使用量の１０倍モル量以上１０００倍モル量以下とすることができる。
【0137】
化合物（Ｉｂ）製造工程において、反応温度は、１００℃以上２００℃以下とすることができる。
【0138】
化合物（Ｉｂ）製造工程において、反応時間は、１０分間以上１０時間以下とすることができる。
【0139】
化合物（Ｉｂ）製造工程において、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、化合物（Ｉｂ）を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、化合物（Ｉ－１ｂ）を取り出せばよい。また、取り出した化合物（Ｉｂ）は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
【0140】
化合物（Ｉｂ）製造工程においては、反応終了後、化合物（Ｉｂ）を取り出さずに、次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（Ｉ）の収率が向上する点から、化合物（Ｉｂ）を上述の方法で取り出すことが好ましい。
【0141】
（化合物（Ｉｃ）の製造工程）
化合物（Ｉｃ）の製造工程では、化合物（Ｉｂ）と、４－メトキシベンジルクロリドと、を反応させて、化合物（Ｉｃ）を得る。
化合物（Ｉｃ）の製造工程では、化合物（Ｉｂ）と、４－メトキシベンジルクロリドと、を反応させて、化合物（Ｉｃ）を得る。
【0142】
４－メトキシベンジルクロリドは、公知の化合物であり、市販のものを入手して使用することができる。
【0143】
４－メトキシベンジルクロリドの使用量は、例えば、化合物（Ｉｂ）の使用量の０．５倍モル量以上５．０倍モル量以下とすることができる。
【0144】
化合物（Ｉｃ）の製造工程において、塩基存在下で反応を行うことが好ましい。
塩基としては、水素化ナトリウム；トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＤＩＥＡ）等のトリアルキルアミン等が挙げられる。これらの化合物は、単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
塩基としては、水素化ナトリウム；トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＤＩＥＡ）等のトリアルキルアミン等が挙げられる。これらの化合物は、単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0145】
塩基の使用量は、例えば、化合物（Ｉｂ）の使用量の０．１倍モル量以上５．０倍モル量以下とすることができる。
【0146】
化合物（Ｉｃ）の製造工程において、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることができる。非プロトン性溶媒としては、上記「化合物（Ｉｂ）の製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0147】
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉｂ）の使用量の１０倍モル量以上１０００倍モル量以下とすることができる。
【0148】
化合物（Ｉｃ）製造工程において、不活性ガス雰囲気下で反応を行ってもよい。
不活性ガスは特に限定されないが、例えば、窒素、アルゴン等が挙げられる。
不活性ガスは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
不活性ガスは特に限定されないが、例えば、窒素、アルゴン等が挙げられる。
不活性ガスは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0149】
化合物（Ｉｃ）製造工程において、反応温度は、１０℃以上５０℃以下とすることができる。
【0150】
化合物（Ｉｃ）製造工程において、反応時間は、１０分間以上３０時間以下とすることができる。
【0151】
化合物（Ｉｃ）製造工程において、反応終了後は、化合物（Ｉｂ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（Ｉｃ）を取り出すことができ、取り出した化合物（Ｉｃ）をさらに化合物（Ｉｂ）製造工程の場合と同様の方法で精製してもよい。
【0152】
化合物（Ｉｃ）製造工程においては、反応終了後、化合物（Ｉｃ）を取り出さずに、次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（Ｉ）の収率が向上する点から、化合物（Ｉｃ）を化合物（Ｉｂ）製造工程の場合と同様の方法で取り出すことが好ましい。
【0153】
（化合物（Ｉ）の製造工程）
化合物（Ｉ）の製造工程では、化合物（Ｉｃ）を加水分解し、アミノアルキルカルボン酸エステル（一般式：「Ｘ１１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１１－ＮＨ２」で表される化合物；式中、Ｘ１１及びｎ１１は式（Ｉ）におけるＸ１１及びｎ１１と同じである）と反応させて、化合物（Ｉ）を得る。化合物（Ｉ）の製造工程は、公知の加水分解反応と公知のアミド化反応を組み合わせた反応である。
化合物（Ｉ）の製造工程では、化合物（Ｉｃ）を加水分解し、アミノアルキルカルボン酸エステル（一般式：「Ｘ１１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１１－ＮＨ２」で表される化合物；式中、Ｘ１１及びｎ１１は式（Ｉ）におけるＸ１１及びｎ１１と同じである）と反応させて、化合物（Ｉ）を得る。化合物（Ｉ）の製造工程は、公知の加水分解反応と公知のアミド化反応を組み合わせた反応である。
【0154】
化合物（Ｉ）の製造工程における加水分解反応は、塩基存在下で反応を行うことが好ましい。
【0155】
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
【0156】
塩基の使用量は、化合物（Ｉｃ）の使用量の１．０倍モル量以上５０．０倍モル量以下とすることができる。
【0157】
加水分解反応において、反応温度は、５０℃以上１５０℃以下とすることができる。
【0158】
加水分解反応において、反応時間は、１０分間以上１０時間以下とすることができる。
【0159】
加水分解反応は、酸を添加して中和することで反応を停止することができる。
酸としては、例えば塩酸等が挙げられる。
酸としては、例えば塩酸等が挙げられる。
【0160】
次いで、化合物（Ｉｃ）を加水分解して得られたカルボキサミド化合物と、アミノアルキルカルボン酸エステルと、を反応させて、アミド化合物である化合物（Ｉ）を得る。
【0161】
アミノアルキルカルボン酸エステルは、以下の一般式で表される化合物である。
【0162】
一般式： Ｘ１１－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１１－ＮＨ２
【0163】
なお、式中、Ｘ１１及びｎ１１は式（Ｉ）におけるＸ１１及びｎ１１と同じである。
【0164】
アミノアルキルカルボン酸エステルは、公知の化合物であり、市販のものを入手して使用することができる。アミノアルキルカルボン酸エステルとして具体的には、４－アミノ酪酸エチル等が挙げられる。アミノアルキルカルボン酸エステルは、塩の形態であってもよい。
【0165】
化合物（Ｉ）の製造工程におけるアミド化反応は、アミド縮合剤を用いて反応を行うことが好ましい。
【0166】
アミド縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、１－ヒドロキシ‐７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ（４，５－ｂ）ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ（４，５－ｂ）ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）等が挙げられる。これらの化合物を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0167】
アミド縮合剤の使用量は、例えば、化合物（Ｉｃ）を加水分解して得られたカルボキサミド化合物の使用量の１．１倍モル量以上１０．０倍モル量以下とすることができる。
【0168】
化合物（Ｉ）の製造工程は、塩基存在下で反応を行うことが好ましい。
【0169】
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ＤＩＥＡ等のトリアルキルアミン等が挙げられる。これらの化合物は、単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0170】
塩基の使用量は、例えば、化合物（Ｉｃ）を加水分解して得られたカルボキサミド化合物の使用量の０．１倍モル量以上１０倍モル量以下とすることができる。
【0171】
化合物（Ｉ）の製造工程において、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることができる。非プロトン性溶媒としては、上記「化合物（Ｉｂ）の製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0172】
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉｃ）を加水分解して得られたカルボキサミド化合物の使用量の１０倍モル量以上１０００倍モル量以下とすることができる。
【0173】
アミド化反応において、反応温度は、１０℃以上５０℃以下とすることができる。
【0174】
アミド化反応において、反応時間は、１０分間以上１５時間以下とすることができる。
【0175】
化合物（Ｉ）製造工程において、反応終了後は、化合物（Ｉｂ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（Ｉ）を取り出すことができ、取り出した化合物（Ｉ）をさらに化合物（Ｉｂ）製造工程の場合と同様の方法で精製してもよい。
【0176】
化合物（Ｉｂ）、化合物（Ｉｃ）、化合物（Ｉ）等の化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0177】
［Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブ］
本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブは、上記化合物（Ｉ）を含む。
本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブは、上記化合物（Ｉ）を含む。
【0178】
本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブは、プロトン／有機カチオン交換輸送体の機能解析に利用することができる。
【0179】
本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブに含まれる化合物（Ｉ）としては、Ｘ１１が炭素数１以上６以下のアルキル基であって、ｎ１１が１以上８以下の整数であるものが好ましい。
【0180】
また、本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブに含まれる化合物（Ｉ）としては、Ｘ１１が１以上４以下のアルキル基であって、ｎ１１が１以上５以下の整数であるものがより好ましい。
【0181】
また、本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブに含まれる化合物（Ｉ）としては、Ｘ１１がメチル基、エチル基、又はプロピル基であって、ｎ１１が２以上４以下の整数であるものがさらに好ましい。
【0182】
また、本実施形態のＨ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブに含まれる化合物（Ｉ）としては、化合物（Ｉ－１）が特に好ましい。
【0183】
［医薬組成物］
本実施形態の医薬組成物は、上記化合物（Ｉ）と、生理活性物質と、を含む。
本実施形態の医薬組成物は、上記化合物（Ｉ）と、生理活性物質と、を含む。
【0184】
本実施形態の医薬組成物によれば、脳に移行しにくい生理活性物質の脳への取り込みを促進することができる。よって、本実施形態の医薬組成物は、脳疾患治療用医薬組成物、特に好ましくは中枢神経系疾患治療用医薬組成物ということもできる。
【0185】
本実施形態の医薬組成物の適用対象となる脳疾患としては、中枢神経系疾患が好ましく、具体的には、例えば、脳出血、脳梗塞、細菌、真菌、寄生虫又はウイルスによる中枢神経系の感染症、神経細胞性腫瘍、神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫；パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0186】
本実施形態の医薬組成物において、上記化合物（Ｉ）と、生理活性物質と、は、コンジュゲートを形成して結合していることが好ましい。ここでいう「コンジュゲート」とは、２つ以上の物質が同時に動きうる状態を表し、その物質間が共有結合により結合しているもの、イオン結合により静電的に結合しているもの、又は、かかる結合が存在しない場合であっても立体構造により他方がもう他方の動きを制限し共に動きうる状態にあるものも含まれる。例えば上記化合物（Ｉ）を表面に修飾したリポソーム、ウイルス、エクソソーム、ポリマーミセル等の中に生理活性物質が封入されているものも「コンジュゲート」を形成していることに含まれる。中でも、上記化合物（Ｉ）と生理活性物質との結合は、その作用部位に到達する前に生理活性物質が解離することを抑制するために、共有結合からなることが好ましい。
【0187】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（Ｉ）の代わりに、化合物（Ｉ）の薬学的に許容できる塩を含んでいてもよい。なお、本明細書において、「薬学的に許容できる」とは、被験動物に適切に投与された場合に、概して、副作用を起こさない程度を意味する。
【0188】
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
【0189】
酸付加塩としては、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【0190】
塩基性塩としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩が挙げられる。
【0191】
本実施形態の医薬組成物において、生理活性物質としては、脳疾患の治療に有効なものであれば、特別な限定はなく、例えば、公知の中枢神経系疾患治療薬等の低分子化合物、核酸、ペプチド、抗体又は抗体断片、アプタマー等が挙げられる。これらの中でも、これまで脳に移行しにくかった生理活性物質が好ましく用いられる。
【0192】
抗体は、例えば、マウス等のげっ歯類の動物に、例えば、脳腫瘍由来の抗原等を免疫することによって作製することができる。また、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体は、抗体断片であってもよく、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【0193】
核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、遺伝子、又は、それらの機能を代償する人工核酸等が挙げられる。
【0194】
アプタマーとしては、例えば、脳腫瘍由来の抗原等に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【0195】
本実施形態の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができる。
【0196】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【0197】
本実施形態の医薬組成物は、更に、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【0198】
本実施形態の医薬組成物は、上記化合物（Ｉ）と、生理活性物質と、必要に応じて薬学的に許容される担体と、添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【0199】
本実施形態の医薬組成物は、上記生理活性物質以外の脳疾患の治療薬及び他の疾患の治療薬からなる群より選択される少なくとも１つと組合せて、使用してもよい。上記生理活性物質と他の薬剤とは、同一の製剤にしてもよく、別々の製剤にしてもよい。また、各製剤は、同一の投与経路で投与してもよく、別々の投与経路で投与してもよい。更に、各製剤は、同時に投与してもよく、逐次的に投与してもよいし、一定の時間乃至期間を空けて別々に投与してもよい。一実施態様において、本実施形態の医薬組成物と他の薬剤とは、これらを包含するキットとしてもよい。
【0200】
＜剤型＞
本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
【0201】
＜投与方法＞
投与する対象としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、及びそれらの細胞等が挙げられる。中でも、哺乳動物又は哺乳動物細胞が好ましく、ヒト又はヒト細胞が特に好ましい。
投与する対象としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、及びそれらの細胞等が挙げられる。中でも、哺乳動物又は哺乳動物細胞が好ましく、ヒト又はヒト細胞が特に好ましい。
【0202】
投与経路としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、及び皮下注射による投与；鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、及び経口的投与等の当業者に公知の方法により行い得る。
【0203】
本実施形態の医薬組成物の投与量は、生理活性物質の種類、投与対象の症状、投与部位、投与方法等により変動する。当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【0204】
本実施形態の医薬組成物の投与は、単回投与でもよく、複数回投与であってもよい。複数回投与である場合は、例えば、２時間以上１２時間以下の時間毎、毎日、又は２日、５日、１週間、１．５週間、数週間、１か月若しくは数か月に１回等の頻度で投与することができる。
【0205】
≪発現ベクター≫
本実施形態の発現ベクターは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む。
本実施形態の発現ベクターは、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【0206】
本実施形態の発現ベクターによれば、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体として同定された新規輸送体タンパク質分子であるＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質を発現させることができる。
【0207】
本実施形態の発現ベクターにおいて、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸を用いることができる。
【0208】
また、本実施形態の発現ベクターにおいて、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子としては、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質と複合体を形成しＨ＋／ＯＣ交換輸送体として機能するタンパク質をコードする核酸を用いることもできる。
（ａ１）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上１００％未満、好ましくは８５％以上１００％未満、より好ましくは９０％以上１００％未満、さらに好ましくは９５％以上１００％未満、よりさらに好ましくは９９％以上１００％未満、特に好ましくは９９．５％以上１００％未満、最も好ましくは９９．９％以上１００％未満である塩基配列；
（ａ２）配列番号２で表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列；
（ａ３）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ａ１）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上１００％未満、好ましくは８５％以上１００％未満、より好ましくは９０％以上１００％未満、さらに好ましくは９５％以上１００％未満、よりさらに好ましくは９９％以上１００％未満、特に好ましくは９９．５％以上１００％未満、最も好ましくは９９．９％以上１００％未満である塩基配列；
（ａ２）配列番号２で表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列；
（ａ３）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【0209】
なお、本明細書において、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の数を算出し、下記式にしたがって、配列同一性を求めることができる。
【0210】
塩基配列の配列同一性（％）＝一致した塩基の数／対象塩基配列の総塩基数×１００
【0211】
また、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１個以上４２６個以下が好ましく、１個以上３１９個以下がより好ましく、１個以上２１３個以下がさらにより好ましく、１個以上１０６個以下がさらに好ましく、１個以上２１個以下がよりさらに好ましく、１個以上１０個以下が特に好ましく、１個以上２個以下が最も好ましい。
【0212】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１質量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２質量％のＳＤＳ、２質量％の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【0213】
本実施形態の発現ベクターにおいて、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号４で表される塩基配列からなる核酸を用いることができる。
【0214】
また、本実施形態の発現ベクターにおいて、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＬＨＦＰＬ６タンパク質と複合体を形成しＨ＋／ＯＣ交換輸送体として機能するタンパク質をコードする核酸を用いることもできる。
（ｂ１）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上１００％未満、好ましくは８５％以上１００％未満、より好ましくは９０％以上１００％未満、さらに好ましくは９５％以上１００％未満、よりさらに好ましくは９９％以上１００％未満、特に好ましくは９９．５％以上１００％未満、最も好ましくは９９．９％以上１００％未満である塩基配列；
（ｂ２）配列番号４で表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列；
（ｂ３）配列番号４で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｂ１）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上１００％未満、好ましくは８５％以上１００％未満、より好ましくは９０％以上１００％未満、さらに好ましくは９５％以上１００％未満、よりさらに好ましくは９９％以上１００％未満、特に好ましくは９９．５％以上１００％未満、最も好ましくは９９．９％以上１００％未満である塩基配列；
（ｂ２）配列番号４で表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列；
（ｂ３）配列番号４で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【0215】
また、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１個以上８６３個以下が好ましく、１個以上６４７個以下がより好ましく、１個以上４３１個以下がさらにより好ましく、１個以上２１５個以下がさらに好ましく、１個以上４３個以下がよりさらに好ましく、１個以上２１個以下が特に好ましく、１個以上４個以下が最も好ましい。
【0216】
また、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれの塩基配列は、導入される宿主、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。
【0217】
一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される宿主の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される宿主における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/に掲載されている「Codon Usage Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（Nakamura Y et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”, Nucl Acids Res, vol.28, no.1, p292, 2000.）。特定の生物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。
【0218】
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれの塩基配列中の１つ又は複数のコドンは、導入対象となる宿主において、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【0219】
本実施形態で用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞で発現が可能な公知の発現ベクターを適宜選択して用いることができる。好ましくは哺乳動物細胞で発現が可能な発現ベクターを用いることができ、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。
【0220】
ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
【0221】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＸ４５９、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｚｅｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0222】
中でも、プラスミドベクターであることが好ましい。
【0223】
本実施形態の発現ベクターは、上記２種の遺伝子の発現用プロモーターとしては特に限定されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。中でも、哺乳動物細胞を宿主とした発現用のプロモーターであることが好ましい。具体的には、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター等が挙げられる。
【0224】
本実施形態の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー遺伝子、複製起点等を有していてもよい。
【0225】
選択マーカー遺伝子とは、該選択マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子を指す。選択マーカー遺伝子の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0226】
薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられる。
【0227】
蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。
【0228】
発光酵素遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。発色酵素遺伝子としては、例えば、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。
【0229】
ポリアデニル化シグナルとしては、上記ウイルスベクターに記載のウイルス由来、各種ヒト又はヒト以外の生物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等が挙げられる。
【0230】
≪ベクターセット≫
本実施形態のベクターセットは、
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える。
本実施形態のベクターセットは、
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、
を備える。
【0231】
本実施形態のベクターセットによれば、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体として同定された新規輸送体タンパク質分子であるＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質を発現させることができる。
【0232】
本実施形態のベクターセットにおいて、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0233】
本実施形態のベクターセットにおいて用いられる発現ベクターとしては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0234】
≪細胞≫
本実施形態の細胞は、以下の１種の発現ベクター（ｃ１）、又は、以下の２種の発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）で形質転換されている。
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）；及び、
ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）
本実施形態の細胞は、以下の１種の発現ベクター（ｃ１）、又は、以下の２種の発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）で形質転換されている。
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）；及び、
ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）
【0235】
なお、一般に、「形質転換」とは、宿主細胞内に外から核酸が導入されて、該宿主細胞の性質が変わることをいう。本実施形態の細胞において発現ベクターで形質転換されている状態は、発現ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡにインテグレートしている状態、細胞質中に遊離の発現ベクターの状態で含まれている状態、及びその両方が併存している状態を含む。
【0236】
本実施形態の細胞は、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体として同定された新規輸送体タンパク質分子であるＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質を発現する細胞であり、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物のスクリーニングに利用することができる。
【0237】
本実施形態において、各種発現ベクターが形質転換される細胞としては、染色体上に、内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現していない細胞であることが好ましい。或いは、各種発現ベクターが形質転換される細胞としては、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子の発現が少ない細胞であることが好ましい。ここでいう「上記２種の遺伝子の発現が比較的少ない」とは、具体的には、ヒト脳微小血管内皮細胞株であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における上記２種の遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、上記２種の遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ好ましくは５０％以下、より好ましくは０％超３０％以下、さらに好ましくは０％超１０％以下であることを意味する。上記２種の遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、例えば、形質転換前の宿主細胞を試料としたＲＴ－ＰＣＲ法により定量することができる。
上記２種の遺伝子を染色体上に有さない細胞、又は、上記２種の遺伝子の発現が比較的少ない細胞であれば、被験動物から採取された細胞であってもよく、被験動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、被験動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。また、市販の細胞を用いてもよい。被験動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。
上記２種の遺伝子を染色体上に有さない細胞、又は、上記２種の遺伝子の発現が比較的少ない細胞であれば、被験動物から採取された細胞であってもよく、被験動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、被験動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。また、市販の細胞を用いてもよい。被験動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。
【0238】
細胞の由来となる生物種としては、哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、マーモセット、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトが好ましい。すなわち、本実施形態の細胞は、ヒトに由来する細胞であることが好ましい。
【0239】
本実施形態において、細胞の種類としては、培養及び遺伝子導入が容易であることから培養細胞株であることが好ましく、具体的には、例えば、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸腺がん細胞株）、ＨＴ－２９（ヒト結腸腺がん細胞株）、Ｈｕｈ７（ヒト肝臓がん細胞株）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、Ｃ－３３Ａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト白血病Ｔ細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓尿細管上皮細胞株）、ＭＤＢＫ（ウシ腎細胞株）、ＢＨＫ（シリアンハムスター腎細胞株）、Ｎｓ０／１（マウス骨髄腫由来の細胞株）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞株）、ＰＣ１２（ラット副腎褐色細胞腫由来の細胞株）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株）等が挙げられ、これらに限定されない。
【0240】
本実施形態の細胞について、以下に詳細を説明する。
【0241】
＜第１実施形態＞
本実施形態の細胞は、上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む。
本実施形態の細胞は、上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む。
【0242】
本実施形態の細胞において、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0243】
本実施形態の細胞において用いられる発現ベクターとしては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0244】
本実施形態の細胞は、上記発現ベクター（ｃ１）を導入することで作製することができる。
【0245】
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法等が挙げられる。ベクターがウイルスベクターである場合に、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【0246】
＜第２実施形態＞
本実施形態の細胞は、上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む。
本実施形態の細胞は、上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む。
【0247】
本実施形態の細胞において、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0248】
本実施形態の細胞において用いられる発現ベクターとしては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0249】
本実施形態の細胞は、上記発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）を導入することで作製することができる。
【0250】
上記２種の発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法等が挙げられる。ベクターがウイルスベクターである場合に、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【0251】
＜第３実施形態＞
本実施形態の細胞は、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である。
本実施形態の細胞は、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない、又は、
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞における内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量と比較して、内在性の、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現量がそれぞれ５０％以下である。
【0252】
本実施形態の細胞において、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子としては、上記「発現ベクター」において例示されたものを用いることができる。
【0253】
本実施形態の細胞は、例えば、上記発現ベクター（ｃ１）、又は、上記発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）をドナーベクターとして細胞内に導入し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発する公知のゲノム編集技術を用いて作製することができる。
【0254】
上述の発現ベクターを細胞内に導入する方法としては、公知の遺伝子導入の手法を用いることができ、具体的には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法等を用いることができる。ベクターがウイルスベクターである場合に、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
【0255】
公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が使用できる。または、例えば、染色体における前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を挿入したい部位と相同な配列を、各種発現ベクターに含まれる、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれの上流及び下流に付加することにより、相同組換え修復を誘発させる方法等が使用できる。
【0256】
染色体に導入された前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子はそれぞれ、例えば、上流にプロモーター、下流にポリアデニル化シグナル等を備えていてもよい。
【0257】
プロモーター及びポリアデニル化シグナルとしては、上記「発現ベクター」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0258】
前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれをさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に作動可能に連結してもよい。
【0259】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列、例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位と、発現させたい遺伝子、本実施形態においては、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子、本実施形態においては、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子の転写を指向するものを意味する。
【0260】
また、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれの導入が起きた細胞を効率よく選択するために、選択マーカー遺伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に作動可能に連結してもよい。
【0261】
また、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子は、同一染色体上であってもよく、異なる染色体上であってもよい。
【0262】
前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が導入される遺伝子座としては、セーフハーバー座位であることが好ましい。
【0263】
なお、本明細書における「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。
【0264】
ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ、本実施形態においては、前記ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、前記ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子それぞれをセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を有することが好ましい。
【0265】
本明細書において、「プロトスペーサー隣接モチーフ」とは、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断の際に、Ｃａｓタンパク質に認識される配列を指す。ＰＡＭの配列及び位置は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭは標的配列の３’側直後に隣接する必要がある。Ｃａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭの配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌種によって異なっている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＣａｓ９タンパク質に対応する「ＮＡＡＡＡＣ」である（「Ｒ」はＡ又はＧ；「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）。
【0266】
セーフハーバー座位としては、例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＡＡＶＳ１遺伝子座等が挙げられる。
【0267】
≪被験物質のスクリーニング用キット≫
本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットは、
上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）；
上記第１実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む細胞；
上記第２実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む細胞；並びに、
上記第３実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない細胞；
からなる群より選ばれる１種以上と、
上記Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブと、
を備える。
本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットは、
上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）；
上記第１実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む細胞；
上記第２実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む細胞；並びに、
上記第３実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない細胞；
からなる群より選ばれる１種以上と、
上記Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブと、
を備える。
【0268】
本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットによれば、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物をスクリーニングすることができる。すなわち、本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットは、脳疾患治療薬、特に好ましくは中枢神経系疾患治療薬のスクリーニング用キットということもできる。ここでいう脳疾患としては、上記「化合物（Ｉ）」の「医薬組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0269】
発現ベクター（ｃ１）～（ｃ３）、第１～３実施形態の細胞、及び、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブについては、上述したとおりである。
【0270】
本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットは、上記発現ベクター（ｃ１）又は上記発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）を含む場合に、さらに、ベクター導入用のトランスフェクション試薬を備えていてもよい。
【0271】
ベクター導入用のトランスフェクション試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬及びリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８－０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１－３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【0272】
本実施形態の被験物質のスクリーニング用キットは、上記第１～３実施形態の細胞のいずれかを含む場合に、さらに、細胞培養用培地を備えていてもよい。
【0273】
細胞培養用培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。
【0274】
前記細胞培養用培地としては、上記「輸送体タンパク質の探索方法」の「接触工程」において培地として例示されたものを用いることができる。
【0275】
≪被験物質のスクリーニング方法≫
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法は、
上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）；
上記第１実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む細胞；
上記第２実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む細胞；又は、
上記第３実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない細胞；
を用いることを含む。
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法は、
上記１種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）；
上記２種の発現ベクター、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）；
上記第１実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ１）を含む細胞；
上記第２実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ２）、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター（ｃ３）を含む細胞；又は、
上記第３実施形態の細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子が染色体に挿入されており、
内在性の、ＬＨＦＰＬ６タンパク質をコードする遺伝子、及び、ＴＭ７ＳＦ３タンパク質をコードする遺伝子を有さない細胞；
を用いることを含む。
【0276】
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法によれば、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物をスクリーニングすることができる。すなわち、本実施形態の被験物質のスクリーニング方法は、脳疾患治療薬、特に好ましくは中枢神経系疾患治療薬のスクリーニング方法ということもできる。ここでいう脳疾患としては、上記「化合物（Ｉ）」の「医薬組成物」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0277】
発現ベクター（ｃ１）～（ｃ３）、及び、第１～３実施形態の細胞については、上述したとおりである。
【0278】
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法について、以下に詳細を説明する。
【0279】
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法において、発現ベクター（ｃ１）又は発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）を用いる場合には、まず、発現ベクター（ｃ１）又は発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）を細胞に形質転換する（以下、「形質転換工程」と称する場合がある）。
【0280】
形質転換工程において、発現ベクター（ｃ１）又は発現ベクター（ｃ２）及び（ｃ３）の細胞への形質転換方法は、上記「細胞」の第１～３実施形態に記載の方法を用いることができる。また、形質転換される細胞としては、上記「細胞」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0281】
次いで、形質転換された細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現している細胞に被験物質を接触させて、細胞内への被験物質の取り込み量を測定する（以下、「測定工程」と称する場合がある）。
【0282】
測定工程で用いられる被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリー、合成化合物ライブラリー、既存薬ライブラリー、代謝物ライブラリー、並びに、脳破砕液、脳脊髄液、及び脳間質液等の生体試料が挙げられる。また、被験物質としては、新薬を用いることができる。
【0283】
測定工程において、細胞内への被験物質の取り込み量は、上記「輸送体タンパク質の探索方法」の「絞り込み工程」に記載の基質の取り込み量の測定方法と同様の方法を用いて測定することができる。
【0284】
次いで、形質転換されていない細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現していない細胞における被験物質の取り込み量に対する、形質転換された細胞、すなわち、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現している細胞における被験物質の取り込み量の比較に基づいて、被験物質を評価する（以下、「評価工程」と称する場合がある）。
【0285】
具体的には、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現していない細胞における被験物質の取り込み量に対する、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現している細胞における被験物質の取り込み量が有意に増加した場合に、被験物質が脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物であると評価する。
【0286】
一方で、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現していない細胞における被験物質の取り込み量に対して、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現している細胞における被験物質の取り込み量が同程度である、或いは、有意に低下した場合に、被験物質は脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物ではないと評価する。
【0287】
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法において、第１～３実施形態の細胞のいずれかの細胞を用いる場合には、上記測定工程及び上記評価工程を行うことで、被験物質をスクリーニングすることができる。
【0288】
本実施形態の被験物質のスクリーニング方法は、上記Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブを更に用いてもよい。
【0289】
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブについては、上記「Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブ」に記載のとおりである。
【0290】
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブ、すなわち、化合物（Ｉ）は、後述する実施例に示すように、ＬＨＦＰＬ６タンパク質及びＴＭ７ＳＦ３タンパク質が細胞膜上に発現している細胞に効率的に取り込まれる。よって、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体用基質プローブは、本実施形態の被験物質のスクリーニング方法において、ポジティブコントロールとして用いることができる。
【実施例0291】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0292】
［実施例１］
従来の輸送体分子は、タンパク質１分子で働くものが主流であった。これに対して、発明者らは、「Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体は、複数の分子が関与するタンパク質複合体である」という仮説を立てて、分子の探索及び機能の検証を行った。
従来の輸送体分子は、タンパク質１分子で働くものが主流であった。これに対して、発明者らは、「Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体は、複数の分子が関与するタンパク質複合体である」という仮説を立てて、分子の探索及び機能の検証を行った。
【0293】
ここで、従来の遺伝子レベルでの探索手法とそれに伴う機能解析では、上記複数の分子が関与するタンパク質複合体を解析できないことから、新規の輸送体タンパク質の探索方法（Proteomics-based Identification of transporter by Crosslinking substrate in Keyhole；以下、「ＰＩＣＫ法」と称する）を構築した。本ＰＩＣＫ法では、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤存在下及び非存在下において、アジド基修飾したＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質でタンパク質を標識し、次いで、標識されたタンパク質を含むサンプルを、プロテオミクス技術、具体的にはＳＷＡＴＨ－ＭＳ法により解析し、解析結果から標的タンパク質を選択することで、スクリーニングされるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の特異度及び検出精度を高めた。ＰＩＣＫ法の手順及びＰＩＣＫ法で選択された候補タンパク質の機能解析のスキームを図１に示す。
【0294】
まず、本実施例で使用した材料、各種物性の測定方法、及び評価方法を以下に説明する。
【0295】
（材料、各種物性の測定方法、及び評価方法）
１．試薬等
本実施例で使用した試薬は、特に指定がない限り、富士フィルム和光純薬工業及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。酒石酸バレニクリン（以下、単に「バレニクリン」と称する場合がある）とマレイン酸フルボキサミン（以下、単に「フルボキサミン」と称する場合がある）は、それぞれａｂｃａｍ及び東京化成工業から購入した。
１．試薬等
本実施例で使用した試薬は、特に指定がない限り、富士フィルム和光純薬工業及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。酒石酸バレニクリン（以下、単に「バレニクリン」と称する場合がある）とマレイン酸フルボキサミン（以下、単に「フルボキサミン」と称する場合がある）は、それぞれａｂｃａｍ及び東京化成工業から購入した。
【0296】
また、本実施例で使用した緩衝液の組成は以下に示すとおりである。
・取り込み用緩衝液：１２２ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
・グルコースフリー緩衝液：１２２ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ３－Ｏ－メチルグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３、ｐＨ７．４
・ナトリウムイオンフリー緩衝液：１２２ｍＭ ＬｉＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、又は、
１２２ｍＭ 塩化コリン、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
・膜電位フリー緩衝液：１２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
・取り込み用緩衝液：１２２ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
・グルコースフリー緩衝液：１２２ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ３－Ｏ－メチルグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３、ｐＨ７．４
・ナトリウムイオンフリー緩衝液：１２２ｍＭ ＬｉＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、又は、
１２２ｍＭ 塩化コリン、３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
・膜電位フリー緩衝液：１２５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＨＣＯ３、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
【0297】
２．細胞培養
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニット及びＳＶ４０Ｔ抗原のレンチウィルス形質導入によって不死化されたヒト脳微小血管内皮細胞株である。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ＩＮＳＥＲＭからのライセンスに基づいてＰｉｅｒｒｅ－Ｏｌｉｖｅｒ Ｃｏｕｒａｕｄ博士（フランス パリのコシャン研究所）から提供された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ウシ胎児血清、成長因子（ＶＥＧＦ、Ｒ３ ＩＧＦ、ｈＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びヒドロコルチゾン）、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＨＥＰＥＳを添加したＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）により、ラットＩ型コラーゲンでコーティングされたディッシュ上で培養した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清、１ｗ／ｖ％ペニシリン－ストレプトマイシン及びＮａＨＣＯ３（最終濃度１．５ｇ／Ｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ、高グルコース、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により、ポリ－Ｄ－リジンコーティングディッシュで培養した。これらの細胞を、９５ｖ／ｖ％の空気及び５ｖ／ｖ％のＣＯ２の雰囲気下で維持した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニット及びＳＶ４０Ｔ抗原のレンチウィルス形質導入によって不死化されたヒト脳微小血管内皮細胞株である。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ＩＮＳＥＲＭからのライセンスに基づいてＰｉｅｒｒｅ－Ｏｌｉｖｅｒ Ｃｏｕｒａｕｄ博士（フランス パリのコシャン研究所）から提供された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ウシ胎児血清、成長因子（ＶＥＧＦ、Ｒ３ ＩＧＦ、ｈＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びヒドロコルチゾン）、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＨＥＰＥＳを添加したＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）により、ラットＩ型コラーゲンでコーティングされたディッシュ上で培養した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清、１ｗ／ｖ％ペニシリン－ストレプトマイシン及びＮａＨＣＯ３（最終濃度１．５ｇ／Ｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ、高グルコース、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により、ポリ－Ｄ－リジンコーティングディッシュで培養した。これらの細胞を、９５ｖ／ｖ％の空気及び５ｖ／ｖ％のＣＯ２の雰囲気下で維持した。
【0298】
取り込み試験では、２５～３５継代のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ラットＩ型コラーゲンでコーティングされた２４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に４．０×１０４細胞/ｃｍ２の密度で播種した。細胞がコンフルエンスに達した後、各種化合物の取り込みを評価した。細胞を取り込み用緩衝液で洗浄し、取り込み用緩衝液と共に３７℃又は４℃で２０分間前培養した。前培養後、薬物及び化合物を含む取り込み用緩衝液を各ウェルに加えた。細胞を３７℃又は４℃で指定期間培養した後、氷冷取り込み用緩衝液で３回洗浄して、取り込みを停止した。細胞をスクレーパーで２００μＬのＨ２Ｏに回収し、分析まで－３０℃に設定した冷凍庫に保管した。細胞タンパク質含有量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して決定した。
【0299】
３．取り込み試験
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞及びＨＥＫ２９３細胞を用いた取り込み試験は、既報に従って実施した。具体的には、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を４．０×１０４細胞/ｃｍ２の密度で播種した。また、ポリ－Ｄ－リジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でコーティングされた２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３細胞を４．０×１０４細胞/ｃｍ２の密度で播種した。取り込み試験は播種から３日後（細胞がコンフルエンスに達した後）に実施した。細胞を取り込み用緩衝液で洗浄し、新しい取り込み用緩衝液で３７℃、２０分間前培養した後、指定された時間に化合物の取り込みを測定した。各試験での取り込みは、細胞対培地（Ｃ／Ｍ）比（μＬ／ｍｇタンパク質）を計算することによって評価した。各ウェルのタンパク質含有量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して決定した。薬物及び化合物は、Ｎｅｘｅｒａ ＸＲ ＨＰＬＣシステム（島津製作所）及びポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えたＱＴＲＡＰ（登録商標） ４５００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）質量分析計で構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって定量化した。各薬物及び化合物の測定方法とイオン化条件の詳細は、以下に示すとおりである。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞及びＨＥＫ２９３細胞を用いた取り込み試験は、既報に従って実施した。具体的には、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を４．０×１０４細胞/ｃｍ２の密度で播種した。また、ポリ－Ｄ－リジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でコーティングされた２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３細胞を４．０×１０４細胞/ｃｍ２の密度で播種した。取り込み試験は播種から３日後（細胞がコンフルエンスに達した後）に実施した。細胞を取り込み用緩衝液で洗浄し、新しい取り込み用緩衝液で３７℃、２０分間前培養した後、指定された時間に化合物の取り込みを測定した。各試験での取り込みは、細胞対培地（Ｃ／Ｍ）比（μＬ／ｍｇタンパク質）を計算することによって評価した。各ウェルのタンパク質含有量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して決定した。薬物及び化合物は、Ｎｅｘｅｒａ ＸＲ ＨＰＬＣシステム（島津製作所）及びポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えたＱＴＲＡＰ（登録商標） ４５００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）質量分析計で構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって定量化した。各薬物及び化合物の測定方法とイオン化条件の詳細は、以下に示すとおりである。
【0300】
サンプルをメタノール及び内部標準アルプレノロールを含む移動相で希釈した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質薬物用のＸＲ－ＯＤＳ（２．０×３０ｍｍ、２．２μｍ、島津製作所）及びピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））用のＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（２．０×５０ｍｍ、２．５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で行った。グラジエント分析用の移動相は、溶媒Ａ（０．２ｖ／ｖ％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液）及び溶媒Ｂ（メタノール）であった。
【0301】
ＸＲ－ＯＤＳを使用したＬＣグラジエントは次のようにプログラムした；０－０．２分 ０ｖ／ｖ％溶媒Ｂ、０．２－１．３分 ９９ｖ／ｖ％溶媒Ｂまで直線増加、１．３－２．０分まで一定（９９ｖ／ｖ％溶媒Ｂ）、その後、初期条件（０ｖ／ｖ％Ｂ）に戻して、システムを平衡化するために０．６分間保持（流量７００μＬ／分）。
【0302】
Ｈｙｄｒｏ－ＲＰを使用したグラジエントは次のようにプログラムした；０－１分 ０ｖ／ｖ％溶媒Ｂ、１－２分 ９５ｖ／ｖ％溶媒Ｂまで直線増加、２－４分まで一定（９５ｖ／ｖ％溶媒Ｂ）、その後、初期条件（０ｖ／ｖ％Ｂ）に戻して、システムを平衡化するために１分間保持（流量４００μＬ／分）。
【0303】
カラム温度は４０℃に設定した。Ａｎａｌｙｓｔ１．６．１ソフトウェアを使用して、データを収集し、ＱＴＲＡＰ（登録商標） ４５００システムを制御した。試験化合物のＭＲＭ遷移を表１に示す。
【0304】
【表1】
【0305】
４．光反応性プローブ（アジド－ピリラミン（ＡｚＰＹＲ））の設計、合成、及び評価
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を特定するために、ＡｚＰＹＲを光親和性プローブとして設計した。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である下記式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩａ）」と称する場合がある）は比較的反応の遅いＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質であるという事実に基づいて、化合物（ＩＩａ）のフェニル基にアジド基を導入した。光反応性基であるアジド基はサイズが比較的小さいため、輸送体の基質をアジド基で修飾したとしても、基質の構造を大きく変化させることはなく、輸送体の結合部位に接触できるものと考え、アジド基修飾した新規基質化合物（化合物（ＩＩ））を合成した。
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を特定するために、ＡｚＰＹＲを光親和性プローブとして設計した。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である下記式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩａ）」と称する場合がある）は比較的反応の遅いＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質であるという事実に基づいて、化合物（ＩＩａ）のフェニル基にアジド基を導入した。光反応性基であるアジド基はサイズが比較的小さいため、輸送体の基質をアジド基で修飾したとしても、基質の構造を大きく変化させることはなく、輸送体の結合部位に接触できるものと考え、アジド基修飾した新規基質化合物（化合物（ＩＩ））を合成した。
【0306】
【化10】
【0307】
化合物（ＩＩａ）のアニリン部分をフェニルアジドに変換するために、上記反応式のとおり、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェートを使用して、化合物（ＩＩａ）からＡｚＰＹＲ（化合物（ＩＩ））を合成した。具体的な合成方法は以下に示すとおりである。
【0308】
すなわち、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）中において、化合物（ＩＩａ）（３０ｍｇ）、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェート（２３ｍｇ）、及びジメチルアミノピリジン（９．６ｍｇ）の混合物を室温（２５℃程度）で６時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えることにより反応を停止し、有機相を分離した。水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機相の減圧下での濾液の濃縮及び粗生成物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１（容量比））により、標的生成物（化合物（ＩＩ））（N-(2-Azidophenyl)-6-((2-(dimethylamino)ethyl)(4-methoxybenzyl)amino) nicotinamide；ＡｚＰＹＲ）（２１ｍｇ、６６質量％）を得た。
【0309】
ＡｚＰＹＲ（化合物（ＩＩ））の１Ｈ ＮＭＲ分析、１３Ｃ ＮＭＲ分析、及び質量分析の結果を以下に示す。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.28 (s, 6H), 2.52 (t, J = 7.3 Hz), 3.71 (t, J = 7.3 Hz), 3.79 (s, 3H), 4.79(s, 2H), 6.53 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.11-7.21 (m, 5H), 7.93 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.50 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 45.8, 46.7, 51.5, 55.3, 56.6, 105.3, 114.1, 117.6, 118.1, 120.7, 124.1, 125.6, 127.8, 128.1, 129.5, 129.9, 136.6, 147.9, 158.8, 159.7, 164.0.
HRMS (ESI) m/z calcd for C24H28N7O2 446.2299(M+H)+, found 446.2298.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.28 (s, 6H), 2.52 (t, J = 7.3 Hz), 3.71 (t, J = 7.3 Hz), 3.79 (s, 3H), 4.79(s, 2H), 6.53 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.11-7.21 (m, 5H), 7.93 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.50 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 45.8, 46.7, 51.5, 55.3, 56.6, 105.3, 114.1, 117.6, 118.1, 120.7, 124.1, 125.6, 127.8, 128.1, 129.5, 129.9, 136.6, 147.9, 158.8, 159.7, 164.0.
HRMS (ESI) m/z calcd for C24H28N7O2 446.2299(M+H)+, found 446.2298.
【0310】
なお、以下の反応式に示すように、ＡｚＰＹＲ（化合物（ＩＩ））に対してＵＶ（３００ｎｍ超）を照射することで、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体と共有結合する活性フェニルニトレンが生成される。
【0311】
【化11】
【0312】
ＡｚＰＹＲのＨ＋／ＯＣ交換輸送体への結合能力を確認するために、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込み活性に対するＡｚＰＹＲの阻害効果を調べた。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞による０．５分間のジフェンヒドラミン（ＤＰＨ）（１μＭ）及びピリラミン（ＰＹＲ）（５μＭ）の取り込みを、０．４ｍＭのＡｚＰＹＲの存在下又は非存在下において３７℃で測定した。光架橋反応のために、細胞を紫外線下で、ＡｚＰＹＲで３７℃、５分間前処理した。未反応のＡｚＰＹＲは、緩衝液中での培養によって除去した。
【0313】
５．ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞でのＡｚＰＹＲ及び輸送体複合体の架橋
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をプラスチックディッシュに播種した。コンフルエンスに達した後、細胞をＨ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤（フルボキサミン（ＦＬＶ）又はＤＰＨ）の存在下又は非存在下において緩衝液で前培養した。細胞を、阻害剤（０．５ｍＭ ＦＬＶ又は０．５ｍＭ ＤＰＨ）の存在下及び非存在下において、ベンチトップトランスイルミネーター（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＡＧ）によって生成されたＵＶ光（３０２ｎｍ）下、０．１ｍＭ ＡｚＰＹＲで３７℃、５分間前処理した。次に、氷冷緩衝液で２回洗浄し、セルスクレーパーでＰＢＳ（－）に移した。ＡｚＰＹＲ及び阻害剤の非存在下で、ＵＶを照射した細胞も対照として収集した。細胞懸濁液を１０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットは、ＳＷＡＴＨ解析まで－８０℃で保存した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をプラスチックディッシュに播種した。コンフルエンスに達した後、細胞をＨ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤（フルボキサミン（ＦＬＶ）又はＤＰＨ）の存在下又は非存在下において緩衝液で前培養した。細胞を、阻害剤（０．５ｍＭ ＦＬＶ又は０．５ｍＭ ＤＰＨ）の存在下及び非存在下において、ベンチトップトランスイルミネーター（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＡＧ）によって生成されたＵＶ光（３０２ｎｍ）下、０．１ｍＭ ＡｚＰＹＲで３７℃、５分間前処理した。次に、氷冷緩衝液で２回洗浄し、セルスクレーパーでＰＢＳ（－）に移した。ＡｚＰＹＲ及び阻害剤の非存在下で、ＵＶを照射した細胞も対照として収集した。細胞懸濁液を１０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットは、ＳＷＡＴＨ解析まで－８０℃で保存した。
【0314】
６．ＰＩＣＫ法で選定された候補輸送体タンパク質のＳＷＡＴＨ解析
細胞膜画分は、Ｍｉｎｕｔｅ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（登録商標）（ＩｎｖｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、上記「５．」及び図１のスキームのステップ（２）に示す条件のように処理されたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞から単離した。細胞膜画分のトリプシン消化及びＭｏｎｏＳｐｉｎ Ｃ１８を用いたペプチドの脱塩は、既報（参考文献２：Tezuka K et al., “Activation of Annexin A2 signaling at the blood-brain barrier in a mouse model of multiple sclerosis.”, J Neurochem., Vol. 160, Issue 6, pp. 662-674, 2022.）に従い、実行した。得られたペプチドサンプルを、エレクトロスプレーイオン化トリプルＴＯＦ ５６００質量分析計（ＳＣＩＥＸ）と組み合わせたＮａｎｏＬＣ ４２５システム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注入した。ＳＷＡＴＨ－ＭＳデータは既報（参考文献３：Uchida Y et al., “Establishment and validation of highly accurate formalin-fixed paraffin-embedded quantitative proteomics by heat-compatible pressure cycling technology using phase-transfer surfactant and SWATH-MS.”, Sci Rep., Vol. 10, No. 11271. 2020.）に従い、取得した。ＳＷＡＴＨクロマトグラムからのデータ抽出は、既報（参考文献４：Sato R et al., “An Atlas of the Quantitative Protein Expression of Anti-Epileptic-Drug Transporters, Metabolizing Enzymes and Tight Junctions at the Blood-Brain Barrier in Epileptic Patients.”, Pharmaceutics., Vol. 13, Issue 12, 2122, pp. 1-13, 2021.）に従い、１０％の誤検出率閾値を使用して、Ｐｅａｋｖｉｅｗ（登録商標）（ＳＣＩＥＸ）のＳＷＡＴＨ ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＭｉｃｒｏＡｐｐを使用して実行した。信頼性の低いピーク及びペプチドは、既報（参考文献１：Uchida Y et al.,“Identification and Validation of Combination Plasma Biomarker of Afamin, Fibronectin and Sex Hormone-Binding Globulin to Predict Pre-eclampsia.”, Biol Pharm Bull., Vol. 44, No. 6, pp. 804-815, 2021.）に従い、除去した。具体的には、コントロール群でピーク面積が１０００カウントを超える遷移を抽出した。２つの複製間でピーク面積が１０倍を超える遷移を除去した。次に、遷移が１つ又は２つしかないペプチドを除去した。さらに、インシリコペプチド選択基準を適用することにより、非特異的で信頼性の低いペプチドを除去した（上記参考文献１参照）。残りのペプチドについては、ペプチドレベルでのピーク面積を、異なる遷移間のシグナル強度の差を正規化した後の平均値として計算した。
細胞膜画分は、Ｍｉｎｕｔｅ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（登録商標）（ＩｎｖｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、上記「５．」及び図１のスキームのステップ（２）に示す条件のように処理されたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞から単離した。細胞膜画分のトリプシン消化及びＭｏｎｏＳｐｉｎ Ｃ１８を用いたペプチドの脱塩は、既報（参考文献２：Tezuka K et al., “Activation of Annexin A2 signaling at the blood-brain barrier in a mouse model of multiple sclerosis.”, J Neurochem., Vol. 160, Issue 6, pp. 662-674, 2022.）に従い、実行した。得られたペプチドサンプルを、エレクトロスプレーイオン化トリプルＴＯＦ ５６００質量分析計（ＳＣＩＥＸ）と組み合わせたＮａｎｏＬＣ ４２５システム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注入した。ＳＷＡＴＨ－ＭＳデータは既報（参考文献３：Uchida Y et al., “Establishment and validation of highly accurate formalin-fixed paraffin-embedded quantitative proteomics by heat-compatible pressure cycling technology using phase-transfer surfactant and SWATH-MS.”, Sci Rep., Vol. 10, No. 11271. 2020.）に従い、取得した。ＳＷＡＴＨクロマトグラムからのデータ抽出は、既報（参考文献４：Sato R et al., “An Atlas of the Quantitative Protein Expression of Anti-Epileptic-Drug Transporters, Metabolizing Enzymes and Tight Junctions at the Blood-Brain Barrier in Epileptic Patients.”, Pharmaceutics., Vol. 13, Issue 12, 2122, pp. 1-13, 2021.）に従い、１０％の誤検出率閾値を使用して、Ｐｅａｋｖｉｅｗ（登録商標）（ＳＣＩＥＸ）のＳＷＡＴＨ ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＭｉｃｒｏＡｐｐを使用して実行した。信頼性の低いピーク及びペプチドは、既報（参考文献１：Uchida Y et al.,“Identification and Validation of Combination Plasma Biomarker of Afamin, Fibronectin and Sex Hormone-Binding Globulin to Predict Pre-eclampsia.”, Biol Pharm Bull., Vol. 44, No. 6, pp. 804-815, 2021.）に従い、除去した。具体的には、コントロール群でピーク面積が１０００カウントを超える遷移を抽出した。２つの複製間でピーク面積が１０倍を超える遷移を除去した。次に、遷移が１つ又は２つしかないペプチドを除去した。さらに、インシリコペプチド選択基準を適用することにより、非特異的で信頼性の低いペプチドを除去した（上記参考文献１参照）。残りのペプチドについては、ペプチドレベルでのピーク面積を、異なる遷移間のシグナル強度の差を正規化した後の平均値として計算した。
【0315】
続いて、図１のスキームに示されているステップ（４）、（５）、及び（６）に従って、候補輸送体タンパク質を絞り込んだ。
【0316】
ステップ（４）において、以下の仮説１）～３）に基づいて、ペプチドピーク面積比が基準１）又は２）を満たすペプチドを選択した。なお、化合物処理中の細胞毒性が高かったことから、ＡｚＰＹＲ及びＤＰＨ存在下の条件のデータは、使用しなかった。
仮説１）ＡｚＰＹＲは、輸送体複合体に共有結合する：
仮説２）輸送体複合体のＡｚＰＹＲ結合部位としてのペプチド（ＡｚＰＹＲ非標識ペプチド）のピーク面積は、阻害剤処理によって減少が弱まる。
仮説３）輸送体複合体へのＡｚＰＹＲの結合親和性は高いものと考えられることから、阻害剤はＡｚＰＹＲと輸送体複合体の結合を強く抑制しない可能性がある。
仮説１）ＡｚＰＹＲは、輸送体複合体に共有結合する：
仮説２）輸送体複合体のＡｚＰＹＲ結合部位としてのペプチド（ＡｚＰＹＲ非標識ペプチド）のピーク面積は、阻害剤処理によって減少が弱まる。
仮説３）輸送体複合体へのＡｚＰＹＲの結合親和性は高いものと考えられることから、阻害剤はＡｚＰＹＲと輸送体複合体の結合を強く抑制しない可能性がある。
【0317】
基準１）コントロールに対するＡｚＰＹＲ存在下でのピーク面積比が０．５未満、且つ、コントロールに対するＡｚＰＹＲ及びＦＬＶ存在下でのピーク面積比が０．５超１．５未満
基準２）コントロールに対するＡｚＰＹＲ存在下でのピーク面積比が０．１未満
基準２）コントロールに対するＡｚＰＹＲ存在下でのピーク面積比が０．１未満
【0318】
次いで、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の生のピークデータの形状及び強度に基づいて、信頼性の低いペプチドを除外した。
【0319】
また、ステップ（５）において、まず、細胞膜に局在するタンパク質又は局在未知のタンパク質を選択した。次いで、３つ又は３つ以上の膜貫通領域を有するタンパク質を選択した。
【0320】
また、ステップ（６）において、ピリラミンは、様々な臓器の活動に活発に関与していることから、Human Protein Atlasデータベースに基づいて、候補タンパク質が複数の臓器で発現していることを確認した。
【0321】
７．単一又は複数の遺伝子のノックダウンによる機能的スクリーニング
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ｓｉＲＮＡ処理の前日に、２．７５×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。それらは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）及び１つの標的遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡ（表５及び表６）それぞれ最終濃度５ｎＭを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２４時間インキュベートした。次に、培地をＥＢＭ－２培地に交換し、細胞をｓｉＲＮＡなしでさらに４８時間培養した。コントロール群として、細胞を標的特異的ｓｉＲＮＡの代わりに同量のネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）と共にインキュベートした。標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡの情報を以下の表２に示す。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、ｓｉＲＮＡ処理の前日に、２．７５×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。それらは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）及び１つの標的遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡ（表５及び表６）それぞれ最終濃度５ｎＭを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２４時間インキュベートした。次に、培地をＥＢＭ－２培地に交換し、細胞をｓｉＲＮＡなしでさらに４８時間培養した。コントロール群として、細胞を標的特異的ｓｉＲＮＡの代わりに同量のネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）と共にインキュベートした。標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡの情報を以下の表２に示す。
【0322】
【表2】
【0323】
標的遺伝子のノックダウンを確認するために、付属のマニュアルに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞からの全ＲＮＡ抽出を行った。全ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とリボヌクレアーゼ阻害剤（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の組み合わせで実行した。簡単に説明すると、１μｇの全ＲＮＡを２５０ｎｇのランダムプライマー及び付属のｄＮＴＰと混合し、６５℃で５分間インキュベートした。次に、混合物を定義された量のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素及びリボヌクレアーゼ阻害剤と混合し、５０℃で６０分間及び７０℃で１５分間インキュベートした。ＰＣＲは、１０ｎｇのｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌのセンス／アンチセンスプライマー、及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の混合物を使用して、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、次のサーモサイクリングプログラムに従って実行した；５０℃で２分間及び９５℃で２分間の保持ステージを１サイクル、９５℃で３秒間及び６０℃で０．５分間のＰＣＲ反応ステージを４０サイクル、及び９５℃で０．２５分間、６０℃で１分間、９５℃で０．５分間の解離曲線ステージを１サイクル。プライマー配列を以下の表３に示す。各標的タンパク質の相対的ｍＲＮＡ発現は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ；ハウスキーピング遺伝子）のｍＲＮＡ発現で補正したΔＣｔ法によって計算した。
【0324】
【表3】
【0325】
８．公知の基質を用いた機能獲得分析による第１の検証
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３（ＴＭ７ＳＦ３）及び／又はＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質（ＬＨＦＰＬ６）を発現するＨＥＫ２９３細胞を作製して、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の輸送におけるこれらの分子の関与を評価した。ＴＭ７ＳＦ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６５５１．３）又はＬＨＦＰＬ６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７８０．３）のコード領域を含むｐｃＤＮＡＴＭ３．１（＋）ベクター及びｐｃＤＮＡＴＭ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターをそれぞれＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から購入した。細胞を、ベクター及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６時間インキュベートした。その後、培地を、抗生物質を含まないＤ－ＭＥＭに交換した。一過性の発現のために、細胞をさらに４８時間インキュベートし、取り込み試験に使用した。安定して発現する細胞を得るために、細胞を２４時間インキュベートした後に、抗生物質（４００μｇ／ｍＬゼオシン及びＧ４１８）を含む培地で培養して耐性細胞を得た。これら耐性細胞を増殖及びクローン化し、取り込み試験に使用した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のｍＲＮＡ発現は、上記「７．」に記載の定量的ＰＣＲ法によって測定した。
トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー３（ＴＭ７ＳＦ３）及び／又はＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質（ＬＨＦＰＬ６）を発現するＨＥＫ２９３細胞を作製して、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の輸送におけるこれらの分子の関与を評価した。ＴＭ７ＳＦ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６５５１．３）又はＬＨＦＰＬ６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７８０．３）のコード領域を含むｐｃＤＮＡＴＭ３．１（＋）ベクター及びｐｃＤＮＡＴＭ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターをそれぞれＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から購入した。細胞を、ベクター及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６時間インキュベートした。その後、培地を、抗生物質を含まないＤ－ＭＥＭに交換した。一過性の発現のために、細胞をさらに４８時間インキュベートし、取り込み試験に使用した。安定して発現する細胞を得るために、細胞を２４時間インキュベートした後に、抗生物質（４００μｇ／ｍＬゼオシン及びＧ４１８）を含む培地で培養して耐性細胞を得た。これら耐性細胞を増殖及びクローン化し、取り込み試験に使用した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のｍＲＮＡ発現は、上記「７．」に記載の定量的ＰＣＲ法によって測定した。
【0326】
９．新規の基質（ピリラミン類似体）を用いた第２の検証
（１）化合物（Ｉ－１）の合成
ピリラミン類似体である化合物（Ｉ－１）の合成の反応式を以下に示す。
（１）化合物（Ｉ－１）の合成
ピリラミン類似体である化合物（Ｉ－１）の合成の反応式を以下に示す。
【0327】
【化12】
【0328】
市販の６－ブロモニコチン酸メチル（式（Ｉａ）で表される化合物；以下、「化合物（Ｉａ）」と称する場合がある）をピリジン中でＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンと反応させて、２級アミン（式（Ｉｂ）で表される化合物；以下、「化合物（Ｉｂ）」と称する場合がある）を得た。次いで、化合物（Ｉｂ）を４－メトキシベンジルクロリドと反応させて、Ｎ－アルキル化してベンジル誘導体（式（Ｉｃ）で表される化合物；以下、「化合物（Ｉｃ）」と称する場合がある）を得た。その後、化合物（Ｉｃ）を加水分解し、４－アミノ酪酸エチルでアミド化して、化合物（Ｉ－１）を得た。具体的な合成方法については、以下に説明する。
【0329】
（１－１）化合物（Ｉｂ）の合成
まず、メチル６－ブロモニコチネート（化合物（Ｉａ））（１．６８３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（１．７ｍＬ、１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１４０℃で３時間還流した。溶媒を除去した後、残留物にＨ２Ｏを加えた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／２（容量比））により精製して、化合物（Ｉｂ）（Methyl 6-[[2-(dimethylamino)ethyl]amino]-3-pyridinecarboxylate）（６４０ｍｇ、９１質量％）を白色の固体として得た。
まず、メチル６－ブロモニコチネート（化合物（Ｉａ））（１．６８３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（１．７ｍＬ、１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１４０℃で３時間還流した。溶媒を除去した後、残留物にＨ２Ｏを加えた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／２（容量比））により精製して、化合物（Ｉｂ）（Methyl 6-[[2-(dimethylamino)ethyl]amino]-3-pyridinecarboxylate）（６４０ｍｇ、９１質量％）を白色の固体として得た。
【0330】
化合物（Ｉｂ）の融点、１Ｈ ＮＭＲ分析、１３Ｃ ＮＭＲ分析、赤外吸収分光（ＩＲ）分析、及び質量分析の結果を以下に示す。
ｍｐ：30-32℃.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 2.26 (s, 6H), 2.54 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39-3.42 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 5.59 (br, 1H), 6.36 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 2.1, 8.9 Hz, 1H), 8.74 (d, J = 2.1 Hz, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 38.9, 45.0, 51.5, 57.5, 114.8, 138.1, 151.5, 160.7, 166.5.
IR (ATR) 2952, 1716, 1608 cm-1.
HRMS (ESI) m/z calcd for C11H17N3O2 224.1394(M+H)+, found 224.1397.
ｍｐ：30-32℃.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 2.26 (s, 6H), 2.54 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39-3.42 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 5.59 (br, 1H), 6.36 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 2.1, 8.9 Hz, 1H), 8.74 (d, J = 2.1 Hz, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 38.9, 45.0, 51.5, 57.5, 114.8, 138.1, 151.5, 160.7, 166.5.
IR (ATR) 2952, 1716, 1608 cm-1.
HRMS (ESI) m/z calcd for C11H17N3O2 224.1394(M+H)+, found 224.1397.
【0331】
（１－２）化合物（Ｉｃ）の合成
化合物（Ｉｂ）（３５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１．５ｍＬ）に、アルゴン下、０℃で水素化ナトリウム（油中６０ｖ／ｖ％）（９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で３０分間撹拌し、０℃に冷却し、その後、４－メトキシベンジルクロリド（４３Ｌ、０．３１ｍｍｏｌ）で処理した。２５℃で一晩撹拌した後、混合物をＨ２Ｏで処理し、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を乾燥させて、溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／１０（容量比））により精製して、化合物（Ｉｃ）（Methyl 6-{[2-(dimethylamino)ethyl][(4-methoxyphenyl)methyl]amino}pyridine-3-carboxylate）（１９ｍｇ、３４質量％）を淡黄色の油状物として得た。
化合物（Ｉｂ）（３５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１．５ｍＬ）に、アルゴン下、０℃で水素化ナトリウム（油中６０ｖ／ｖ％）（９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で３０分間撹拌し、０℃に冷却し、その後、４－メトキシベンジルクロリド（４３Ｌ、０．３１ｍｍｏｌ）で処理した。２５℃で一晩撹拌した後、混合物をＨ２Ｏで処理し、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を乾燥させて、溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／１０（容量比））により精製して、化合物（Ｉｃ）（Methyl 6-{[2-(dimethylamino)ethyl][(4-methoxyphenyl)methyl]amino}pyridine-3-carboxylate）（１９ｍｇ、３４質量％）を淡黄色の油状物として得た。
【0332】
（１－３）化合物（Ｉ－１）の合成
化合物（Ｉｃ）（１９２ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５．６ｍＬ）に、６Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液（２．８ｍＬ）を加えた。混合物を１００℃で３０分間撹拌し、１Ｎ 塩酸で中和した後、水分を蒸発させた。残留物にメタノールを加え、混合物を濾過した。濾液を真空で蒸発させて、粗カルボキサミドを得て、これをさらに精製することなく次のステップに直接使用した。カルボキサミドのＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（８３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１１８ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間反応させ、次に４－アミノ酪酸エチル塩酸塩（１０３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１９０Ｌ、１．１１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で３．５時間撹拌し、次に水を加え、水溶液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。得られた有機相を塩水で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／５（容量比））によって精製して、化合物（Ｉ－１）（4-[[[6-[[2-(dimethylamino)ethyl]-[(4-methoxyphenyl)methyl]amino]-3-pyridinyl]carboxyl]amino] butanoate）（１８４ｍｇ、７４質量％）を淡黄色の油状物として得た。
化合物（Ｉｃ）（１９２ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５．６ｍＬ）に、６Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液（２．８ｍＬ）を加えた。混合物を１００℃で３０分間撹拌し、１Ｎ 塩酸で中和した後、水分を蒸発させた。残留物にメタノールを加え、混合物を濾過した。濾液を真空で蒸発させて、粗カルボキサミドを得て、これをさらに精製することなく次のステップに直接使用した。カルボキサミドのＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（８３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１１８ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間反応させ、次に４－アミノ酪酸エチル塩酸塩（１０３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１９０Ｌ、１．１１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２５℃で３．５時間撹拌し、次に水を加え、水溶液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。得られた有機相を塩水で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝１／５（容量比））によって精製して、化合物（Ｉ－１）（4-[[[6-[[2-(dimethylamino)ethyl]-[(4-methoxyphenyl)methyl]amino]-3-pyridinyl]carboxyl]amino] butanoate）（１８４ｍｇ、７４質量％）を淡黄色の油状物として得た。
【0333】
化合物（Ｉ－１）の１Ｈ ＮＭＲ分析、１３Ｃ ＮＭＲ分析、ＩＲ分析、及び質量分析の結果を以下に示す。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.93 (dd, J = 6.9, 6.9 Hz, 2H), 2.26 (s, 6H), 2.42 (t, J =6.9 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.48 (dt, J = 5.5, 6.9 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.12(q, J = 7.6 Hz, 2H), 4.74 (s, 2H), 6.33 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.83 (d, J =8.9 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.82 (dd, J = 2.8, 8.9 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 14.1, 24.5, 32.0, 39.4, 45.7, 46.6, 51.4, 55.2, 56.5, 60.6, 104.9, 114.0, 117.9, 128.1, 129.8, 136.4, 147.5, 158.7, 159.5, 166.2, 173.8.
IR (ATR) 2936, 1729, 1600, 1501 cm-1.
HRMS (ESI) m/z calcd for C24H34N4O4 443.2653 (M+H)+, found 443.2654.
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.93 (dd, J = 6.9, 6.9 Hz, 2H), 2.26 (s, 6H), 2.42 (t, J =6.9 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.48 (dt, J = 5.5, 6.9 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.12(q, J = 7.6 Hz, 2H), 4.74 (s, 2H), 6.33 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.83 (d, J =8.9 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.82 (dd, J = 2.8, 8.9 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 14.1, 24.5, 32.0, 39.4, 45.7, 46.6, 51.4, 55.2, 56.5, 60.6, 104.9, 114.0, 117.9, 128.1, 129.8, 136.4, 147.5, 158.7, 159.5, 166.2, 173.8.
IR (ATR) 2936, 1729, 1600, 1501 cm-1.
HRMS (ESI) m/z calcd for C24H34N4O4 443.2653 (M+H)+, found 443.2654.
【0334】
（２）化合物（Ｉ－１）を用いた取り込み試験
ピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みメカニズムは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での取り込み試験によって分析した。
ピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みメカニズムは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での取り込み試験によって分析した。
【0335】
まず、ナトリウムイオンと膜電位が取り込みに及ぼす影響を調べるために、取り込み緩衝液中の塩化ナトリウムを、塩化リチウム及び塩化カリウム、又は、塩化コリン及び塩化カリウムに置き換えた。さらに、取り込みに対する代謝エネルギーの影響は、取り込み緩衝液中のグルコースを代謝不可能な３－Ｏ－メチル－グルコースに置き換え、０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を添加することによって評価した。細胞内ｐＨの影響は、取り込み緩衝液に３０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌを添加することで評価した。細胞内ｐＨの酸性化のために、ＮＨ４Ｃｌは前培養段階から含むようにした。アルカリ化のために、ＮＨ４Ｃｌをピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））と同時に加えた。各試験に使用した取り込み緩衝液の組成は、上記「１．」に記載したとおりである。
【0336】
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の阻害プロファイルを評価するために、さまざまな阻害剤（１ｍＭ）をピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））と同時に添加した。使用した阻害剤は、ＰＹＲ、ＤＰＨ、クロニジン（ＣＬＯ）、メマンチン（ＭＥＭ）、バレニクリン（ＶＡＲ）、トラマドール（ＴＲＡ）、ナルトレキソン（ＮＡＬ）（Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質及び阻害剤）、ＭＰＰ＋（ＯＣＴｓ及び原形質膜モノアミントランスポーター（ＰＭＡＴ）の基質及び阻害剤）、ＰＡＨ（ＯＡＴｓ及び有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）の基質及び阻害剤）、ＴＥＡ（ＯＣＴｓ及びＭＡＴＥ１の基質及び阻害剤）、並びに、Ｌ－カルニチン（ＯＣＴＮ２の基質）である。
【0337】
インビトロでの取り込み結果から速度論的パラメーターを推定するために、取り込みデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用した非線形最小二乗回帰分析によって、以下の式に適合させて、ピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みを分析した。
【0338】
Ｖ ＝ （Ｖｍａｘ×Ｓ）／（Ｋｍ＋Ｓ）＋（Ｋｄ×Ｓ）
【0339】
上記式で、Ｖはピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の初期取り込み速度、Ｖｍａｘは最大取り込み速度、Ｓは取り込み用緩衝液内の濃度、Ｋｍはミカエリス定数、Ｋｄは不飽和取り込みクリアランスである。
【0340】
ピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））の取り込みにおけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の関与は、上記「７．」で作製されたノックダウンｈＣＭＥＣ/Ｄ３細胞、及び、上記「８．」で作製されたＴＭ７ＳＦ３及び／又はＬＨＦＰＬ６発現ＨＥＫ２９３細胞を使用して評価した。
【0341】
１０．統計解析
全ての値は、平均±標準誤差として表した。データの統計分析は、スチューデントのｔ検定と一元配置分散分析に続いたダネットの検定を使用して実行し、それぞれ単一及び複数の比較が行われた。Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１の値は、統計的に有意な差を表すものと見なした。図の凡例で特に指定されていない限り、ダネットの検定による有意差分析が実行された。
全ての値は、平均±標準誤差として表した。データの統計分析は、スチューデントのｔ検定と一元配置分散分析に続いたダネットの検定を使用して実行し、それぞれ単一及び複数の比較が行われた。Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１の値は、統計的に有意な差を表すものと見なした。図の凡例で特に指定されていない限り、ダネットの検定による有意差分析が実行された。
【0342】
（結果）
１．Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体に対するＡｚＰＹＲの結合
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体へのＡｚＰＹＲの結合を確認するために、代表的な基質であるＰＹＲ及びＤＰＨのＨ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込みに対するＡｚＰＹＲの阻害効果をｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を使用して調べた。
１．Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体に対するＡｚＰＹＲの結合
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体へのＡｚＰＹＲの結合を確認するために、代表的な基質であるＰＹＲ及びＤＰＨのＨ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込みに対するＡｚＰＹＲの阻害効果をｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を使用して調べた。
【0343】
０．４ｍＭ ＡｚＰＹＲは、ＰＹＲ及びＤＰＨの取り込みを大幅に減少させた（図２Ａ）。紫外線下でのＡｚＰＹＲによるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の前処理は、ＰＹＲ及びＤＰＨの取り込みの有意且つ不可逆的な減少を引き起こしたが、室内光下での前処理は、中程度の可逆的な減少を引き起こした（図２Ｂ）。
これらの結果から、合成されたＡｚＰＹＲがＨ＋／ＯＣ交換輸送体に結合し、効率的に光標識することが示唆された。
これらの結果から、合成されたＡｚＰＹＲがＨ＋／ＯＣ交換輸送体に結合し、効率的に光標識することが示唆された。
【0344】
２．ＳＷＡＴＨに基づいたＨ＋／ＯＣ交換輸送体のスクリーニング
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を特定するためのスキームを図１に示す。
ＡｚＰＹＲはＵＶ照射時にＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質結合部位に共有結合し、阻害剤はＡｚＰＹＲのＨ＋／ＯＣ交換輸送体への結合を抑制すると仮定した。Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体へのＡｚＰＹＲの特異的結合を区別するために、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤であると報告されているＤＰＨとＦＬＶを使用した。しかし、１ｍＭでのＤＰＨ処理により、ＵＶ照射に使用した条件下でディッシュへのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の付着が低下したため、最終的にＤＰＨの使用を中止した。
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を特定するためのスキームを図１に示す。
ＡｚＰＹＲはＵＶ照射時にＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質結合部位に共有結合し、阻害剤はＡｚＰＹＲのＨ＋／ＯＣ交換輸送体への結合を抑制すると仮定した。Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体へのＡｚＰＹＲの特異的結合を区別するために、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤であると報告されているＤＰＨとＦＬＶを使用した。しかし、１ｍＭでのＤＰＨ処理により、ＵＶ照射に使用した条件下でディッシュへのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の付着が低下したため、最終的にＤＰＨの使用を中止した。
【0345】
ＳＷＡＴＨ解析では、細胞膜画分をトリプシンで消化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定するため、個々のトリプシンペプチドを個別に定量した。コントロールに対するＡｚＰＹＲ存在下でのピーク面積比（ＡｚＰＹＲ／コントロール比）が０．５未満、且つ、コントロールに対するＡｚＰＹＲ及びＦＬＶ存在下でのピーク面積比（（ＡｚＰＹＲ＋ＦＬＶ）／コントロール比）が０．５超１．５未満にある場合、ペプチドはＨ＋／ＯＣ交換輸送体の候補タンパク質に由来すると仮定した。
【0346】
さらに、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体に対するＡｚＰＹＲの親和性が高い場合、結合は阻害剤によって強く抑制されない可能性があることから、ＡｚＰＹＲ／コントロール比が０．１未満（（ＡｚＰＹＲ＋ＦＬＶ）／コントロール比の値に関係なく）のペプチドも、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の候補タンパク質に由来すると仮定した。
【0347】
これらの基準を満たすタンパク質の中から、次に示す特徴を有する１６のタンパク質を選択した：１）細胞膜で発現している；２）３つ以上の膜貫通領域を含む；３）複数の臓器で発現している（表４）。
【0348】
【表4】
【0349】
表４に示すように、ＬＨＦＰＬテトラスパンサブファミリーメンバー６タンパク質（ＬＨＦＰＬ６）、ＰＲＡ１ファミリータンパク質３（ＡＲＬ６ＩＰ５）、溶質キャリアファミリー４３メンバー３（ＳＬＣ４３Ａ３）、ＣＤ６３抗原（ＣＤ６３）、及びアクアポリン－３（ＡＱＰ３）では、ＡｚＰＹＲ／コントロール比が０．１未満であった。他の１１のタンパク質は、ＡｚＰＹＲ／コントロール比が０．５未満、且つ、（ＡｚＰＹＲ＋ＦＬＶ）／コントロール比が０．５超１．５未満の分子として選択された。
ＡｚＰＹＲ及びＤＰＨ存在下でのピーク面積（ＡｚＰＹＲ＋ＤＰＨ）の値は、ＤＰＨ処理中の細胞接着が少ないため、基準として使用しなかった。しかしながら、これらの１６のタンパク質について、参照データとして、コントロールに対するＡｚＰＹＲ及びＤＰＨ存在下でのピーク面積比（（ＡｚＰＹＲ＋ＤＰＨ）／コントロール比）の値も表４に記載した。
ＡｚＰＹＲ及びＤＰＨ存在下でのピーク面積（ＡｚＰＹＲ＋ＤＰＨ）の値は、ＤＰＨ処理中の細胞接着が少ないため、基準として使用しなかった。しかしながら、これらの１６のタンパク質について、参照データとして、コントロールに対するＡｚＰＹＲ及びＤＰＨ存在下でのピーク面積比（（ＡｚＰＹＲ＋ＤＰＨ）／コントロール比）の値も表４に記載した。
【0350】
３．単一遺伝子のノックダウンによる第１の機能的スクリーニング
第１の機能的スクリーニングとして、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質及び非基質であるガバペンチンの取り込みに対する単一遺伝子ノックダウンの影響を評価した。ｓｉＲＮＡ処理によるｍＲＮＡの減少を図３Ａに示す。また、取り込み試験の結果を表５に示す。なお、表５において、「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
第１の機能的スクリーニングとして、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質及び非基質であるガバペンチンの取り込みに対する単一遺伝子ノックダウンの影響を評価した。ｓｉＲＮＡ処理によるｍＲＮＡの減少を図３Ａに示す。また、取り込み試験の結果を表５に示す。なお、表５において、「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【0351】
【表5】
【0352】
図３Ａに示すように、ＳＬＣ１２Ａ５、ＳＬＣ４３Ａ３、及びＡＱＰ３以外では、全ての標的ｍＲＮＡの発現量が７１％以上減少した。
【0353】
また、ＴＣＩＲＧ１のノックダウンは、統計的に有意ではなかったが、表５に示すように、ＰＹＲ、ＴＲＡ、及びＤＰＨの取り込みをそれぞれ５０、４３、及び１６％減少させた。また、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のノックダウンにより、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みがそれぞれ３０％及び２５％以上減少した。一方、これらの遺伝子のノックダウンはガバペンチンの取り込みを減少させなかった。これは、その効果がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質に特異的であることを示唆している。
【0354】
ＣＤ９のノックダウンはＰＹＲ、ＴＲＡ、及びＤＰＨの取り込みを減少させたが、図３Ｂに示すように、細胞の形態が著しく変化した。
【0355】
以上のことから、候補分子としてＴＣＩＲＧ１、ＴＭ７ＳＦ３、及びＬＨＦＰＬ６に焦点を当てた。
【0356】
４．複数遺伝子のノックダウンによる第２の機能的スクリーニング
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体は複数のタンパク質で構成されている可能性があると仮定したことから、第２の機能的スクリーニングとして、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みに対する複数の遺伝子ノックダウンの影響を評価した。ｓｉＲＮＡ処理によるｍＲＮＡの減少を図４に示す。また、取り込み試験の結果を表６に示す。なお、表６において、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体は複数のタンパク質で構成されている可能性があると仮定したことから、第２の機能的スクリーニングとして、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞におけるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みに対する複数の遺伝子ノックダウンの影響を評価した。ｓｉＲＮＡ処理によるｍＲＮＡの減少を図４に示す。また、取り込み試験の結果を表６に示す。なお、表６において、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１であり、コントロールに対して有意差があったことを示す。
【0357】
【表6】
【0358】
図４に示すように、ｍＲＮＡの発現量はｓｉＲＮＡ処理群で６０％以上減少した。
【0359】
ＴＣＩＲＧ１及びＬＨＦＰＬ６のノックダウンでは、ＯＸＹとＶＡＲの取り込みをそれぞれ２５％及び３９％減少させたが、ＰＹＲ及びＴＲＡの取り込みにはほとんど影響しなかった。ＴＣＩＲＧ１及びＴＭ７ＳＦ３のノックダウンでは、ＴＣＩＲＧ１及びＬＨＦＰＬ６のノックダウンと同様の結果であった。
【0360】
一方、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のノックダウンにより、すべてＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みが３１％以上減少し、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の組み合わせがＨ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込みに重要である可能性が示唆された。
【0361】
５．公知の基質を用いた機能獲得分析による第１の検証
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込みにおけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の関与を検証するために、ＨＥＫ２９３細胞を使用して機能獲得分析を実施した。結果を図５Ａに示す。
Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体を介した取り込みにおけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の関与を検証するために、ＨＥＫ２９３細胞を使用して機能獲得分析を実施した。結果を図５Ａに示す。
【0362】
図５Ａに示すように、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）とＬＨＦＰＬ６のみを一過的に発現する細胞の間で、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みに違いはみられなかった。
【0363】
一方、ＰＹＲ、ＴＲＡ、及びＶＡＲの取り込みは、ＴＭ７ＳＦ３のみを一過的に発現する細胞で２１～３４％増加したが、統計的に有意な差はなかった。
【0364】
さらに、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の両方を過剰発現している細胞は、ＰＹＲ及びＴＲＡの取り込みがそれぞれ４３％及び４０％増加した。統計的に有意な差はなかったが、ＯＸＹ及びＶＡＲの取り込みもそれぞれ３１％及び９７％増加した。
【0365】
輸送機能をさらに検証するために、ＴＭ７ＳＦ３のみ、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の両方を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を作製して、同様の取り込み試験を行った。結果を図５Ｂに示す。
【0366】
図５Ｂに示すように、ＴＭ７ＳＦ３のみ、又は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の両方を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞では、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みの時間依存的な増加を示した。ＴＭ７ＳＦ３の安定発現細胞は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）と比較して、１分及び５分で有意に高いＴＲＡの取り込みを示し、０．２５、１、及び５分で有意に高いＶＡＲ取り込みを示した。
【0367】
ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の安定発現細胞、並びに、ＴＭ７ＳＦ３の安定発現細胞では、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）と比較して、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みが５分で、大きく増加する傾向があった。ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を一過性に発現する細胞とは対照的に、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の共発現の効果は、これらの遺伝子を安定して発現する細胞では相加的ではなかった。
【0368】
なお、図５Ｃに示すように、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を発現していないＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）、ＴＭ７ＳＦ３の安定発現細胞、並びに、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の安定発現細胞において、受動拡散マーカーであるアンチピリンの取り込みは変化しなかった。
【0369】
６．新規の基質（ピリラミン類似体）を用いた第２の検証
第２の検証では、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の機能に関与しているかどうかをさらに調べるために、新しい細胞膜透過性基質であるピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））を合成した。具体的な合成方法は、上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「９．（１）」に示したとおりである。
第２の検証では、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の機能に関与しているかどうかをさらに調べるために、新しい細胞膜透過性基質であるピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））を合成した。具体的な合成方法は、上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「９．（１）」に示したとおりである。
【0370】
【0371】
図６Ａに示すように、ピリラミン類似体のＣ／Ｍ比は０．５分から５分まで直線的に増加し、初期取り込み速度（５分まで）は９．７１μＬ／ｍｇタンパク質／分と計算された。さらに、この取り込みは４℃で約９０％減少した。
【0372】
図６Ｂに示すように、ピリラミン類似体の取り込みは、可飽和成分のＫｍが８．８５±２．１５μＭ、Ｖｍａｘが０．４８７±０．０５２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／分、不飽和成分のＫｄが０．４６７±０．２６０μＬ／ｍｇタンパク質／分であった。
【0373】
図６Ｃに示すように、ピリラミン類似体の取り込みは、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質及び／又は阻害剤であるＰＹＲ、ＭＥＭ、ＤＰＨ、ＣＬＯ、ＶＡＲ、ＮＡＬ、及びＴＲＡによって有意に阻害された（＜１６．７％まで）が、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質又は阻害剤ではないＭＰＰ＋、ＰＡＨ、ＴＥＡ、及びＬ－カルニチンによって阻害されなかった。
【0374】
図６Ｄに示すように、ピリラミン類似体の取り込み試験におけるＣ／Ｍ比は、細胞内の酸性化によって１６５％に増加し、アルカリ化によって４６％に減少した。
【0375】
図６Ｅに示すように、ピリラミン類似体の取り込みは、エネルギー枯渇剤であるＮａＮ３によっても減少したが、細胞外ナトリウムイオンをリチウムイオン、コリン、又はカリウムイオンで置換しても影響を受けなかった。
【0376】
以上の結果から、ピリラミン類似体の輸送特性は、これまでに報告されているＨ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の輸送特性と一致していた。
【0377】
ピリラミン類似体の取り込みに対するＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の寄与を評価するために、これらの遺伝子がｓｉＲＮＡでノックダウンされたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を使用して検討を行った。結果を図６Ｆ及び図６Ｇに示す。なお、図６Ｆ及び図６Ｇにおいて、「ＴＭ ｓｉＲＮＡ」はＴＭ７ＳＦ３がノックダウンされたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞、「ＬＨ ｓｉＲＮＡ」はＬＨＦＰＬ６がノックダウンされたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞、「ＴＭ＋ＬＨ ｓｉＲＮＡ」はＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６両方がノックダウンされたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を示す。以降の図において、同様の意味で用いられる。
【0378】
図６Ｆに示すように、ｓｉＲＮＡの導入により、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６それぞれの発現が８０％以上抑制された。ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のダブルノックダウンでも同様の結果であった。
【0379】
図６Ｇに示すように、ＴＭ７ＳＦ３をノックダウンした細胞、ＬＨＦＰＬ６をノックダウンした細胞、及びＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６をノックダウンした細胞では、それぞれネガティブコントロールと比較して、０．５～５分でのピリラミン類似体の取り込みについて、０．５分で２３．６、２３．７、４０．４％、１分で３８．５、３６．８、５８．１％、５分で６２．７、２７．６、３３．９％減少した。また、これらの細胞でのＣ／Ｍ比は、３０分でそれぞれ６１．９％、５６．２％、及び７０．５％に大幅に減少したが、ノックダウンの効果は時間依存的に減少した。
【0380】
【0381】
図６Ｈに示すように、０．５分でのピリラミン類似体のＣ／Ｍ比は、ＴＭ７ＳＦ３発現細胞、並びに、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６発現細胞で、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のいずれも発現していない細胞（Ｍｏｃｋ）と比較して、それぞれ３２１％及び１８１％に増加した）。これらの細胞におけるＣ／Ｍ比の増加は、取り込み時間が長くなるにつれて減衰した。
【0382】
図６Ｉに示すように、ＴＭ７ＳＦ３発現細胞、並びに、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６発現細胞において、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のいずれも発現していない細胞（Ｍｏｃｋ）と比較して、ＴＭ７ＳＦ３ ｍＲＮＡの発現量が４０倍以上、ＬＨＦＰＬ６ ｍＲＮＡの発現量が１５倍以上、増加した。
【0383】
（考察）
本実施例では、ＰＩＣＫ法及び細胞透過性を有するピリラミン類似体による機能分析を組み合わせて、ＢＢＢでのＨ＋／ＯＣ交換輸送体の構成タンパク質を探索及び検証した。
その結果、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の両方がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の活性に関与していることが示された。
本実施例では、ＰＩＣＫ法及び細胞透過性を有するピリラミン類似体による機能分析を組み合わせて、ＢＢＢでのＨ＋／ＯＣ交換輸送体の構成タンパク質を探索及び検証した。
その結果、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の両方がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の活性に関与していることが示された。
【0384】
光反応性アジド化合物を使用した輸送体のスクリーニングは、１９８０年代及び１９９０年代に実施されていた。例えば、このアプローチは、ウサギの小腸Ｎａ＋，Ｄ－グルコース膜輸送体、及びラット肝臓の粗面小胞体のＡＴＰ輸送体を研究するために使用された。アジド基のサイズが小さいため、このような架橋は、標的輸送体の基質構造又は基質認識に比較的ほとんど影響を及ぼさないと考えられている。そのため、図１のスキームに基づいて、輸送体同定法としてＰＩＣＫ法を考案した。
【0385】
ＰＩＣＫ法は、阻害剤を利用したアジド修飾輸送体基質の使用と、優れたカバレッジ及び精度を提供するプロテオミクス技術を組み合わせて、標的輸送体の同定の特異度及び精度を高める。この方法では、非特異的結合をできるだけ避けることが重要であり、これは、いくつかの異なるタイプの阻害剤を組み合わせて使用し、光反応性基質と細胞間の反応時間を非常に短くすることによって達成できる。原則として、輸送体複合体内では、基質に結合するタンパク質が存在する可能性が高く、周囲のサブユニットが容易に識別される可能性は低くなる。アジドによる標識反応は十分に特異的ではないため、ＳＷＡＴＨ分析の追加基準であるＨ＋／ＯＣ交換輸送体の阻害剤であるＦＬＶによる阻害も導入した。ＡｚＰＹＲはＨ＋／ＯＣ交換輸送体のＰＹＲ結合ポケットに親和性を示し（図２Ａ）、ＵＶ照射はアジド基とＨ＋／ＯＣ交換輸送体の不可逆反応を引き起こした（図２Ｂ）。
【0386】
ＳＷＡＴＨ－ＭＳは、コントロール（ＡｚＰＹＲ及びＦＬＶ非存在下）、ＡｚＰＹＲ存在下、並びに、ＡｚＰＹＲ及びＦＬＶ存在下のサンプルに対しても実行され、上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「６．」に示す基準に基づいて、最終的に１６の候補タンパク質（表４）が得られた。
【0387】
ＰＩＣＫ法によって選択された候補タンパク質の第１の機能的スクリーニングでは、ＴＣＩＲＧ１、ＴＭ７ＳＦ３、及びＬＨＦＰＬ６が選択された。これらのタンパク質のノックダウンは、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質輸送に影響を及ぼしたためである（表５）。
【0388】
Ｌ型アミノ酸輸送体がＬＡＴ１（ＳＬＣ７Ａ５）及び４Ｆ２ｈｃ（ＳＬＣ３Ａ２／ＣＤ９８）の複合体であることに注目して、２つ又は３つ全ての候補がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の活性に関与している可能性があると仮定した。７つの推定膜貫通ドメインを持つＴＭ７ＳＦ３は、サイトカインによる膵臓ベータ細胞の死を抑制し、インスリン分泌を促進することが報告されている。ＴＭ７ＳＦ３は、ｐ５３／ＴＰ５３の下流の転写標的であり、ＥＲストレスの発生を弱める生存促進恒常性因子として機能する。
また、３つの推定膜貫通ドメインを持つＬＨＦＰＬ６は、胃癌の予後バイオマーカー及び治療標的の候補である。
また、３つの推定膜貫通ドメインを持つＬＨＦＰＬ６は、胃癌の予後バイオマーカー及び治療標的の候補である。
【0389】
これら２つのタンパク質は多様な組織で発現している。興味深いことに、脳微小血管内皮細胞におけるＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のｍＲＮＡの発現量は、ＢＢＢの他の輸送体のｍＲＮＡの発現量に匹敵する（図７）。実際、マウスでは、ＴＭ７ＳＦ３の発現はＢＣＲＰの発現よりも大きく、ＢＢＢでの薬物流出に寄与している（図７）。ヒトでは、ＬＨＦＰＬ６はＧＬＵＴ１及びＬＡＴ１よりも高度に発現している（図７）。
したがって、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６はＢＢＢでの輸送に寄与する可能性がある。ＴＣＩＲＧ１はＶ－ＡＴＰａｓｅのサブユニットであり、一部の細胞型の細胞内成分のｐＨを酸性化及び維持する役割を果たし、細胞外環境を酸性化する原形質膜も標的としている。
したがって、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６はＢＢＢでの輸送に寄与する可能性がある。ＴＣＩＲＧ１はＶ－ＡＴＰａｓｅのサブユニットであり、一部の細胞型の細胞内成分のｐＨを酸性化及び維持する役割を果たし、細胞外環境を酸性化する原形質膜も標的としている。
【0390】
第２の機能的スクリーニングでは、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６両方のノックダウンにより、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みが最も減少した。一方、ＴＣＩＲＧ１ノックダウンの効果は比較的弱く（表６）、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の活性にＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６が関与していることを強く示唆した。
【0391】
機能獲得分析では、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質の取り込みに対するＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の寄与を検証した。ＴＭ７ＳＦ３の一過的な発現及び安定した発現の両方において、基質の取り込みを増加させる傾向があったが、ＬＨＦＰＬ６の発現はほとんど影響を与えなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。特に、ＨＥＫ２９３細胞でのＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の発現は、基質の初期の取り込み量にほとんど影響を与えなかった。しかし、ＴＭ７ＳＦ３発現細胞において、比較的親水性の基質であるＶＡＲの基質の初期の取り込み量の増加が観察された（図５Ｂ）。生体膜を介した薬物の浸透は、膜、原形質膜、及び細胞内結合を取り巻く攪拌されていない水層の影響を受ける。したがって、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体が存在する原形質膜上の現象を検出するには、原形質膜の透過性が律速である化合物を使用することが重要である。そのため、上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「９．（１）」に示したとおり、新規化合物であるピリラミン類似体（化合物（Ｉ－１））を合成した。
【0392】
ピリラミン類似体の初期取り込み速度は９．７１μＬ／ｍｇタンパク質／分と計算され、これはＰＹＲよりも約５０倍遅く（図８）、原形質膜透過性が初期取り込み速度の律速であることを意味する。さらに、ピリラミン類似体が、Ｈ＋／ＯＣ交換輸送体の基質として十分な特性を含むことが証明された（図６Ａ～図６Ｅ）。この結果は、ピリラミン類似体がＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６の機能を明らかにするのに適していることを示唆した。
【0393】
実際、ピリラミン類似体の取り込みは、０．５～３０分の任意の時点でＴＭ７ＳＦ３及び／又はＬＨＦＰＬ６をノックダウンすることによって大幅に減少した（図６Ｇ）。一方、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６のノックダウンは、ガバペンチンの取り込み（ＬＡＴ１の基質）に影響を与えなかった（図９）。さらに、ピリラミン類似体の取り込みは、ＴＭ７ＳＦ３を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞において０．５分で３．２倍の増加を示した（図６Ｈ）。
【0394】
以上の全ての結果から、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の構成要素である可能性があることが示唆された。
【0395】
（結論）
光反応性標識プローブ及びＳＷＡＴＨ－ＭＳを使用した包括的なプロテオミクス分析を組み合わせたＰＩＣＫ法を開発し、ＢＢＢでの様々なＣＮＳ薬物の輸送に関与するＨ＋／ＯＣ交換輸送体の分子成分を特定した。上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「６．」に示す基準に基づいて、１６の候補タンパク質が選択された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での候補タンパク質をコードする遺伝子のノックダウン及び阻害剤を用いた試験、並びに、候補タンパク質を過剰発現する細胞での取り込み試験の結果は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の構成成分であることを示した。この結果から、効果的なＣＮＳ薬と新しいドラッグデリバリーシステムの開発を促進することが期待される。ＰＩＣＫ法は、他の輸送体の探索にも適用できることが予想される。
光反応性標識プローブ及びＳＷＡＴＨ－ＭＳを使用した包括的なプロテオミクス分析を組み合わせたＰＩＣＫ法を開発し、ＢＢＢでの様々なＣＮＳ薬物の輸送に関与するＨ＋／ＯＣ交換輸送体の分子成分を特定した。上記材料、各種物性の測定方法、及び評価方法の「６．」に示す基準に基づいて、１６の候補タンパク質が選択された。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞での候補タンパク質をコードする遺伝子のノックダウン及び阻害剤を用いた試験、並びに、候補タンパク質を過剰発現する細胞での取り込み試験の結果は、ＴＭ７ＳＦ３及びＬＨＦＰＬ６がＨ＋／ＯＣ交換輸送体の構成成分であることを示した。この結果から、効果的なＣＮＳ薬と新しいドラッグデリバリーシステムの開発を促進することが期待される。ＰＩＣＫ法は、他の輸送体の探索にも適用できることが予想される。
【産業上の利用可能性】
【0396】
本実施形態の発現ベクター及びベクターセットによれば、新規輸送体タンパク質分子を発現させることができる。本実施形態の細胞は、新規輸送体タンパク質分子を発現する細胞であり、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物のスクリーニングに利用することができる。本実施形態の化合物は、プロトン／有機カチオン交換輸送体の基質として利用することができる。本実施形態のプロトン／有機カチオン交換輸送体用基質プローブは、プロトン／有機カチオン交換輸送体の機能解析に利用することができる。本実施形態の医薬組成物によれば、脳に移行しにくい生理活性物質の脳への取り込みを促進することができる。本実施形態の被験物質のスクリーニング用キット及び被験物質のスクリーニング方法によれば、脳に効率的に取り込まれるカチオン性薬物をスクリーニングすることができる。本実施形態の輸送体タンパク質の探索方法によれば、未知の輸送体タンパク質を探索することができる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】