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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024015792
(43)【公開日】2024-02-06
(54)【発明の名称】変異プロテアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20240130BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20240130BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240130BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240130BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240130BHJP
C11D 7/42 20060101ALI20240130BHJP
【ＦＩ】
C12N15/57
C12N9/50 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P21/02 C
C11D7/42
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022118096
(22)【出願日】2022-07-25
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日置 貴大
(72)【発明者】
【氏名】高比良 早紀
(72)【発明者】
【氏名】川原 彰人
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4H003
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD02
4B050LL04
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD20
4B064DA19
4B065AA15X
4B065AA15Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA57
4H003DA01
4H003DA05
4H003DA17
4H003DB01
4H003DC02
4H003EC02
4H003FA04
(57)【要約】 （修正有）
【課題】高濃度洗剤液中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアーゼの提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：前記アミノ酸配列の（ａ）１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｂ）１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｃ）１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；（ｄ）２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｅ）３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｆ）３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｇ）３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：前記アミノ酸配列の（ａ）１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｂ）１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｃ）１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；（ｄ）２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｅ）３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｆ）３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｇ）３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
【請求項2】
前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ。
【請求項3】
前記（ｅ）のアミノ酸残基と、前記（ｆ）のアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ。
【請求項4】
前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と、下記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
【請求項5】
前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、請求項４記載の変異プロテアーゼ。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項8】
請求項６記載のポリヌクレオチド又は請求項７記載のベクターを含む組換えバチルス属細菌。
【請求項9】
請求項８記載の組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
【請求項11】
塗布洗浄用の洗剤組成物である、請求項１０記載の洗剤組成物。
【請求項12】
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
【請求項13】
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
【請求項14】
前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項15】
前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項16】
前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異と、下記（Ｈ）の変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異プロテアーゼに関する。
【背景技術】
【0002】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣類や食器などに付着した食品や垢、汗などに由来するタンパク質汚れを分解して汚れの除去を促進することである。洗剤のｐＨは一般にアルカリ側にあるため、洗剤用プロテアーゼとしては、アルカリ側に至適ｐＨを有するプロテアーゼが開発されてきた。特許文献１には、タンパク質と脂質が混在する複合汚れに対して洗浄性を有する分子量約４３，０００のプロテアーゼが開示されている。特許文献２～５には、プロテアーゼの洗浄性能、液体洗剤中での安定性、液体洗剤に対する溶解性、又は酸性条件下での安定性を向上させる変異を導入して得られた変異プロテアーゼが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開公報第９９／１８２１８号
【特許文献2】特開２００８－２１２０８４号公報
【特許文献3】特開２０１０－２７３６７２号公報
【特許文献4】特開２０１３－２３３１４１号公報
【特許文献5】特開２０２０－１４５９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
シミなどの落ちにくい汚れを除去するために、液体洗剤の原液を水で薄めずに汚れに直接塗布する場合がある。食べこぼしや襟袖汚れなどのタンパク質を含む汚れに対しては、プロテアーゼを含む液体洗剤の塗布が効果的であると考えられる。しかし、液体洗剤の原液は、界面活性剤などの洗浄成分の濃度が高いため、プロテアーゼにとって過酷な条件である。液体洗剤の原液のような高濃度の洗浄成分を含む溶液中でのプロテアーゼの洗浄性能を向上させることが望まれている。
【0005】
本発明は、高濃度洗剤液中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、分子量４３，０００のプロテアーゼＫＰ４３（特許文献１参照）に由来する変異プロテアーゼが、液体洗剤の原液中でもタンパク質汚れに対する洗浄性能（以下、単に洗浄性能ともいう）が向上していることを見出した。
【0007】
したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、
を提供する。
また本発明は、前記変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する組換えバチルス属細菌を提供する。
また本発明は、前記組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。
また本発明は、前記変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。
さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換、
を提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法を提供する。
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、
を提供する。
また本発明は、前記変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する組換えバチルス属細菌を提供する。
また本発明は、前記組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。
また本発明は、前記変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。
さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換、
を提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法を提供する。
【発明の効果】
【0008】
本発明の変異プロテアーゼは、高濃度洗剤液（例えば、液体洗剤の原液）中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上している。本発明の変異プロテアーゼは、例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄のような、高濃度洗剤液による洗浄に用いるプロテアーゼとして有効である。例えば、本発明の変異プロテアーゼは、液体洗剤の原液又は高濃度洗剤液を汚れに直接接触させることでその汚れを洗浄するための洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【0011】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0012】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0013】
本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【0014】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）、又は国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
【0015】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置におけるアミノ酸残基」と称される。
【0017】
本明細書において、変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、ポリペプチド変異体が変異される前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドが変異される前のポリヌクレオチドである。
【0018】
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0019】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
【0020】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【0021】
本発明は、変異プロテアーゼを提供する。本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する変異プロテアーゼである：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換。
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換。
【0022】
好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異を有する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異とを有する。
【0023】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）及び（Ｄ）の変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異とを有する。別の一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）及び（Ｄ）から選択されるいずれか１つの変異とを有する。好ましくは、該（Ａ）の変異は、１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換であり、該（Ｂ）の変異は、１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換であり、該（Ｄ）の変異は、２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＬｙｓへの置換である。
【0024】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、下記（Ｈ）の変異を有する：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
前記（Ａ）～（Ｇ）のいずれかの変異に加えて前記（Ｈ）の変異を有することで、本発明の変異プロテアーゼの高濃度洗剤液中での洗浄性能がより向上する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）の変異と前記（Ｈ）の変異とを有する。好ましくは、該（Ａ）の変異は、１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換である。
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
前記（Ａ）～（Ｇ）のいずれかの変異に加えて前記（Ｈ）の変異を有することで、本発明の変異プロテアーゼの高濃度洗剤液中での洗浄性能がより向上する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）の変異と前記（Ｈ）の変異とを有する。好ましくは、該（Ａ）の変異は、１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換である。
【0025】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するものであってもよい。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異とを有する。前記（Ｅ）及び（Ｆ）の変異を有することで、本発明の変異プロテアーゼの高濃度洗剤液中での洗浄性能がより向上する。好ましくは、該（Ｅ）の変異は、３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＬｙｓへの置換であり、該（Ｆ）の変異は、３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換である。
【0026】
本発明の変異プロテアーゼの親プロテアーゼとしては、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、及び配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【0027】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するプロテアーゼが挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。本発明で親プロテアーゼとして用いられる、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ由来の変異プロテアーゼであってもよい。
【0028】
好ましくは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号１の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。より好ましくは、前記親プロテアーゼは、配列番号１における下記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置に、表１（ii）に記載のアミノ酸残基を有する。表１に示すアミノ酸残基は、前記親プロテアーゼの起源であるプロテアーゼＫＰ４３（特許文献１）、及びそれに由来する変異プロテアーゼの間で高度に保存されているアミノ酸残基である（Ｓａｅｋｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，１０３：５０１－５０８）。
【0029】
【表1】
【0030】
本発明の変異体の親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）でタンパク質分解活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）に至適ｐＨを有するポリペプチドである。より好ましくは、該親プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ（特許文献１参照）が有する次の酵素学的性質のいずれかを有する：１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該プロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中（２０ｍＭブリットン・ロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置した後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上であることをいう；２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す；３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で活性が阻害される；４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。より好ましくは、当該親プロテアーゼは、上記１）～４）の酵素学的性質を全て有する。
【0031】
本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、配列番号１のアミノ酸配列の前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことによって製造することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、前記（Ｈ）の変異を施すことによって製造することができる。
【0032】
したがって、本発明の変異プロテアーゼは、下記（ａ）～（ｇ）のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ。
好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ。
好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0033】
好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基を有する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する。
【0034】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する。別の一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）及び（ｄ）のうちのいずれか１つのアミノ酸残基とを有する。好ましくは、該（ａ）のアミノ酸残基はＡｒｇであり、該（ｂ）のアミノ酸残基はＡｒｇであり、該（ｄ）のアミノ酸残基はＬｙｓである。
【0035】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に加えて、下記（ｈ）のアミノ酸残基を有する：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）及び（ｈ）のアミノ酸残基を有する。好ましくは、該（ａ）のアミノ酸残基はＡｒｇである。
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）及び（ｈ）のアミノ酸残基を有する。好ましくは、該（ａ）のアミノ酸残基はＡｒｇである。
【0036】
一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するものであってもよい。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ｅ）及び（ｆ）のアミノ酸残基を有する。好ましくは、該（ｅ）のアミノ酸残基はＬｙｓであり、該（ｆ）のアミノ酸残基はＡｒｇである。
【0037】
本発明の変異プロテアーゼは、界面活性剤を高濃度で含有する洗剤液（いわゆる高濃度洗剤液）中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアーゼである。より詳細には、本発明の変異プロテアーゼは、高濃度洗剤液中において配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼよりも高い洗浄性能を発揮することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、濃縮液体洗剤の原液中において配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼよりも高い洗浄性能を発揮することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、通常洗浄に使用される程度に水で希釈した洗剤液（いわゆる通常の洗剤液）中では、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと少なくとも同等、又はそれ以上の洗浄性能を発揮することができる。したがって、本発明の変異プロテアーゼは、洗剤用酵素として使用でき、特に、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）に用いるための洗剤用の酵素として使用できる。例えば、本発明の変異プロテアーゼは、その原液又は高濃度洗剤液を汚れに直接塗布することでその汚れを洗浄するための濃縮液体洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。また例えば、本発明の変異プロテアーゼは、その原液又は高濃度洗剤液に汚れを浸漬することでその汚れを洗浄するための濃縮液体洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。
【0038】
本明細書における「タンパク質汚れ」としては、例えば、タンパク質を含む食品、タンパク質を含む身体由来成分（例えば血液、尿、垢、汗、皮脂等）などによる汚れが挙げられる。「タンパク質汚れ」のより具体的な例としては、衣類への食べこぼし、襟袖汚れなどが挙げられる。
【0039】
本明細書における「洗剤液」は、液体洗剤の原液、及び、液体洗剤又は固形洗剤（例えば粉末洗剤）を水で希釈して得られた洗剤水溶液を包含する。本明細書において、「高濃度洗剤液」とは、界面活性剤を高濃度で含有する洗剤液をいい、好ましくは、界面活性剤を１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、例えば１０～９０質量％、好ましくは２０～９０質量％、より好ましくは２０～７５質量％含有する洗剤液をいう。高濃度洗剤液の例としては、濃縮液体洗剤の原液、またはそれを高濃度で含有する水溶液が挙げられる。本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、好ましくは４０～９０質量％、より好ましくは４５～９０質量％、さらに好ましくは５０～７５質量％含有する液体洗剤をいう。該「濃縮液体洗剤」の例としては、衣料用液体洗剤であれば、水槽式洗濯機で水３０Ｌに対する標準使用量が７～１３ｇ又はそれ以下と表示されているものを挙げることができる。
【0040】
本明細書において、「高濃度洗剤液による洗浄」とは、洗浄対象（例えば、布、及び、食器や調理器具等の硬質表面）上の汚れに高濃度洗剤液を直接接触させ、必要に応じて所定時間放置又は洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。「高濃度洗剤液による洗浄」の例としては、塗布洗浄、及び漬け置き洗浄が挙げられる。「塗布洗浄」とは、洗浄対象の汚れに高濃度洗剤液を直接塗布し、必要に応じて所定時間放置又は洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。「漬け置き洗浄」とは、洗浄対象の汚れを高濃度洗剤液中に浸漬し、必要に応じて所定時間放置又は該高濃度洗剤液中で洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。したがって、前記高濃度洗剤液による洗浄において、洗浄対象の汚れに高濃度洗剤液を直接接触させる手段としては、該汚れに対する該高濃度洗剤液の塗布（例えばロールオン、スプレー、滴下などによる）、該汚れの該高濃度洗剤液への浸漬、などが挙げられる。
【0041】
本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、前述した高濃度洗剤液中で親プロテアーゼより高い洗浄性能を維持できる限り、親プロテアーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。ただし、好ましくは本発明の変異プロテアーゼは、少なくとも配列番号１の３０位、６８位、及び２５５位におけるアミノ酸残基が親プロテアーゼと同じである。より好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１における前記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、親プロテアーゼと同じである。
【0042】
本発明において、親プロテアーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当該技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親プロテアーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親ポリヌクレオチドともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることにより、目的の変異プロテアーゼを得ることができる。
【0043】
親ポリヌクレオチドへの目的の変異の導入は、例えば基本的には、該親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２－８８）の任意の手法により行うことができる。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【0044】
親ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親ポリヌクレオチドにおける変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
【0045】
親ポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、親プロテアーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成することにより調製することができる。あるいは、親ポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、それを保持する微生物株から公知の手段で抽出することができる。変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された、変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【0046】
したがって、本発明はまた、変異プロテアーゼ遺伝子を提供する。本発明の変異プロテアーゼ遺伝子は、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドである。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【0047】
本発明はまた、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４（特開２０１３－２３３１４１号公報）、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＡ６４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド；分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），１６３－１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【0048】
本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する場合、前記ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。
【0049】
本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含有するベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を宿主に導入することにより製造することができる。したがって、該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードする外来のポリヌクレオチドを含む。
【0050】
前記形質転換体の宿主としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞が挙げられる。該宿主は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。
【0051】
宿主の形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。
【0052】
前記本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の変異プロテアーゼを製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。変異プロテアーゼ製造のための該形質転換体の培養は、当業者に一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、該微生物宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であればよい。該培地は、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ－マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。該培地には、形質転換体に導入した薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）の種類に対応した薬剤を添加してもよい。また、誘導性プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
【0053】
あるいは、本発明の変異プロテアーゼは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【0054】
当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明の変異プロテアーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから分離又は精製することができる。あるいは、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮した培養上清や溶菌液上清等の溶液を、粗酵素液としてそのまま使用することができる。発現された変異プロテアーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
【0055】
本発明において用いるＤＮＡ抽出、ｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の手順は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２００１，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。さらに、枯草菌の遺伝子組換え実験については、例えば吉川博文著、“７．２ 枯草菌系”「続生化学実験講座１．遺伝子研究法II」，１９８６，東京化学同人社（東京），ｐ１５０－１６９等の、枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
【0056】
本発明の製造方法により得られた変異プロテアーゼは、親プロテアーゼと比べて、高濃度洗剤液中での洗浄性能が向上しており、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）用の洗剤に用いるプロテアーゼとして有用である。したがって、本発明の別の態様は、上述したとおりに親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法であり得る。
【0057】
本発明の変異プロテアーゼは、洗剤用酵素として有用であり、特に、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）用の洗剤に配合する酵素としてより好適である。したがって、本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。該洗剤組成物は、固形（例えば粉末）洗剤組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物であり、より好ましくは濃縮液体洗剤である。また該洗剤組成物は、好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用の洗剤組成物である。
【0058】
本発明の洗剤組成物における本発明の変異プロテアーゼの含有量は、プロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．１～２５０００Ｕが好ましく、０．１～５０００Ｕがより好ましく、０．１～２５００Ｕがさらに好ましい。本明細書におけるプロテアーゼの活性（Ｕ）は、以下の方法により測定される：１／１５Ｍリン酸緩衝液（例えばｐＨ７．４、和光純薬りん酸緩衝剤粉末（１６７－１４４９１）１包（１包中Ｎａ2ＨＰＯ4（無水）７．６ｇ。ＫＨ2ＰＯ4（無水）１．８ｇ含有）を１Ｌのイオン交換水に溶解した溶液）０．９ｍＬ、４０ｍＭＧｌｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－ｐ－ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温する。これに酵素液０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定する。ここで酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを生成する量とする。
【0059】
本発明の洗剤組成物は、本発明の変異プロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上組み合わせて用いることができる。本発明の洗剤組成物における該界面活性剤の含有量は、好ましくは１０～９０質量％、より好ましくは１０～８０質量％、さらに好ましくは３０～７５質量％である。本発明の洗剤組成物が濃縮液体洗剤の場合、該洗剤組成物における該界面活性剤の含有量は、好ましくは４０～９０質量％、より好ましくは４５～９０質量％、さらに好ましくは５０～７５質量％である。
【0060】
非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８～Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６～３５）〔特開２０１０－２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＡＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３～３０、ｍ＝１～５、ｌ＋ｎ＝１４～５０）〔特開２０１０－２６５４４５号公報、特開２０１１－６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０～３０、ｎ＝０～５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０～１、ｍ＝１４～５０、ｎ＝１～５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５～３０、ｎ＝１～５）〔特開２０１０－２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ－Ｈ及び／又はＲ2－ＣＯＯ－（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０～５、ｎ＝２～１０、ｐ＝０～５、ｑ＝２～１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２５４８８１号公報〕；
Ｒ1－ＣＯＯ－（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３～５、ｎ＝８～２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＰＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＰＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０－Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５～１５、ｎ＝１～３）〔特開平８－１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）－（ＥＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０～２０）〔特開２００８－７７０６号公報、特開２００９－７４５１号公報、特開２００９－１５５５９４号公報、特開２００９－１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）－（ＡＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ｍ＝５～３０）〔特開２００９－１４４００２号公報、特開２００９－１７３８５８号公報、特開２０１０－１８９６１２号公報〕；ならびに、
脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。
Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６～３５）〔特開２０１０－２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＡＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３～３０、ｍ＝１～５、ｌ＋ｎ＝１４～５０）〔特開２０１０－２６５４４５号公報、特開２０１１－６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０～３０、ｎ＝０～５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０～１、ｍ＝１４～５０、ｎ＝１～５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５～３０、ｎ＝１～５）〔特開２０１０－２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ－Ｈ及び／又はＲ2－ＣＯＯ－（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０～５、ｎ＝２～１０、ｐ＝０～５、ｑ＝２～１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２５４８８１号公報〕；
Ｒ1－ＣＯＯ－（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３～５、ｎ＝８～２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＰＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＰＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０－Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５～１５、ｎ＝１～３）〔特開平８－１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）－（ＥＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０～２０）〔特開２００８－７７０６号公報、特開２００９－７４５１号公報、特開２００９－１５５５９４号公報、特開２００９－１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）－（ＡＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ｍ＝５～３０）〔特開２００９－１４４００２号公報、特開２００９－１７３８５８号公報、特開２０１０－１８９６１２号公報〕；ならびに、
脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。
【0061】
陰イオン界面活性剤としては、例えばカルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、α－オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。
【0062】
陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。好ましくは炭素数８～２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８～２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
【0063】
両性イオン活性剤としては、例えばアルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０～１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
【0064】
本発明の洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、キレート剤、本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。
【0065】
水溶性ポリマーとしては、例えば、（i）炭素数２～５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（i）又は（ii）のいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０－２７５４６８号公報、特開平１０－０６０４９６号公報）；アルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９－１５５６０６号公報）、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該水溶性ポリマーの含有量は、好ましくは０．２～１０質量％、より好ましくは０．４～５質量％である。
【0066】
水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２～６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、好ましくは１～４０質量％、より好ましくは１～３５質量％である。
【0067】
アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２－Ｃ４のアルカノールを１～３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、好ましくは０～２０質量％、より好ましくは０～１０質量％である。
【0068】
有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの塩等の多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類、などが挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、好ましくは０～５質量％、より好ましくは０～３質量％である。
【0069】
キレート剤とは、金属イオンと配位結合をすることができる化合物をいう。洗剤組成物に添加されたキレート剤は、洗濯用水又は汚れの中のカルシウムイオン、マグネシウムイオン等の洗浄に悪影響を及ぼす金属イオンを封鎖する作用を有する。本発明の洗剤組成物に含まれ得るキレート剤の例としては、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１－ヒドロキシエチリデン－１，１－ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、及びこれらのアルカリ金属又は低級アミン塩、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物におけるキレート剤の含有量は、好ましくは０．１～５質量％、より好ましくは０．１～４質量％である。
【0070】
再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸－ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸－メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸－酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９－６２６１４号公報の請求項１～２１（１頁３欄５行～３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができる。本発明の洗剤組成物における当該再汚染防止剤及び分散剤の含有量は、それぞれ０．０１～１０質量％が好ましい。
【0071】
色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１～１０質量％が好ましい。
【0072】
漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤を、当該洗剤組成物中１～１０質量％含有させることが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を、当該洗剤組成物中０．０１～１０質量％含有させることができる。
【0073】
蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該蛍光剤の含有量は０．００１～２質量％が好ましい。
【0074】
本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β－グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素、ならびにそれらの２種以上の混合物が挙げられる。
【0075】
酵素安定化剤としては、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ヒドロキシ化合物、蟻酸などが挙げられ、酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられ、可溶化剤としては、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などが挙げられる。さらに、本発明の洗剤組成物は、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１－トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ－リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤などを含有していてもよい。
【0076】
本発明の変異プロテアーゼを配合することができる洗剤組成物の好ましい例としては、特開２０１７－００８３０３号公報に記載される液体洗剤組成物、及び特開２０１３－１２９７２９号公報に記載される液体洗剤組成物が挙げられる。これらの洗剤組成物に本発明の変異プロテアーゼを配合することにより、本発明の洗剤組成物を調製することができる。
【0077】
本発明の洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましい例としては、衣料又は布製品（例えばシーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）の洗浄用の洗剤組成物、及び台所用（例えば食器又は調理器具用）の洗剤組成物が挙げられる。好ましくは、本発明に係る洗剤組成物は、高濃度洗剤液による洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、さらに好ましくは、塗布洗浄用の洗剤組成物である。
【0078】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0079】
〔１〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
〔２〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔３〕好ましくは、前記（ｅ）のアミノ酸残基と、前記（ｆ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔４〕好ましくは、前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と、下記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
〔５〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔４〕記載の変異プロテアーゼ。
〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔８〕〔６〕記載のポリヌクレオチド又は〔７〕記載のベクターを含む組換えバチルス属細菌。
〔９〕〔８〕記載の組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
〔１０〕前記組換えバチルス属細菌を培養することを含む、〔８〕記載の方法。
〔１１〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
〔１２〕好ましくは高濃度洗剤液による洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、さらに好ましくは塗布洗浄用の洗剤組成物である、〔１１〕記載の洗剤組成物。
〔１３〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１４〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１５〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異と、下記（Ｈ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
〔２〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔３〕好ましくは、前記（ｅ）のアミノ酸残基と、前記（ｆ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔４〕好ましくは、前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と、下記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
〔５〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔４〕記載の変異プロテアーゼ。
〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔８〕〔６〕記載のポリヌクレオチド又は〔７〕記載のベクターを含む組換えバチルス属細菌。
〔９〕〔８〕記載の組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
〔１０〕前記組換えバチルス属細菌を培養することを含む、〔８〕記載の方法。
〔１１〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
〔１２〕好ましくは高濃度洗剤液による洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、さらに好ましくは塗布洗浄用の洗剤組成物である、〔１１〕記載の洗剤組成物。
〔１３〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１４〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１５〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異と、下記（Ｈ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
【実施例0080】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0081】
実施例１ 変異プロテアーゼの作製
特許文献５の参考例１に記載される野生型ＫＰ４３プロテアーゼ発現プラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡは、テトラサイクリン耐性遺伝子及び、バチルス・エスピー ＫＳＭ－６４株のアルカリセルラーゼＫ－６４遺伝子由来のプロモーター領域に連結された野生型ＫＰ４３プロテアーゼのコード配列全長を含む。ｐＨＡ６４ＴＳＡを鋳型として、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によってＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子に部位特異的変異を繰り返し導入することで配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。得られた配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを鋳型として、同様の手法で、親酵素である配列番号１のプロテアーゼに対して以下のアミノ酸置換：Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、又はＳ１９１Ｆ、を有する変異プロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。以下、これらのプラスミドから発現される変異プロテアーゼを、各々Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、及びＳ１９１Ｆと称する。
特許文献５の参考例１に記載される野生型ＫＰ４３プロテアーゼ発現プラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡは、テトラサイクリン耐性遺伝子及び、バチルス・エスピー ＫＳＭ－６４株のアルカリセルラーゼＫ－６４遺伝子由来のプロモーター領域に連結された野生型ＫＰ４３プロテアーゼのコード配列全長を含む。ｐＨＡ６４ＴＳＡを鋳型として、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によってＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子に部位特異的変異を繰り返し導入することで配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。得られた配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを鋳型として、同様の手法で、親酵素である配列番号１のプロテアーゼに対して以下のアミノ酸置換：Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、又はＳ１９１Ｆ、を有する変異プロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。以下、これらのプラスミドから発現される変異プロテアーゼを、各々Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、及びＳ１９１Ｆと称する。
【0082】
作製した親酵素又は変異プロテアーゼを発現するプラスミドを用いて、宿主菌であるバチルス・エスピーＫＳＭ９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５６６）を形質転換した。形質転換はエレクトロポレーション法を用いて行い、形質転換後の細胞をスキムミルク含有アルカリ寒天培地〔１％スキムミルク（ディフコ）、１％バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．０５％炭酸ナトリウム、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に塗抹して３０℃で数日間培養した。寒天培地上に生育したコロニーのうち、スキムミルク溶解斑が見られるものをプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体として選抜した。取得した形質転換体を５ｍＬの種母培地〔６．０％ポリペプトンＳ、０．０５％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．２５％炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。次いで２０ｍＬの主培地〔８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離してプロテアーゼを含む培養上清を取得した。培養上清中に含まれるタンパク質濃度はプロテインアッセイラピッドキッドワコーII（富士フィルム和光純薬）を使用して測定した。
【0083】
実施例２ 変異プロテアーゼの塗布洗浄力評価
市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した各変異プロテアーゼを含む培養上清を、タンパク濃度が０．１ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験組成物）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照組成物）を同様の手順で調製した。得られた液体洗剤組成物を用いて、襟袖汚れモデルである人工汚染布ＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／（ＣＯＮＳＵＭＥＲＴＥＣ）を塗布洗浄した。すなわち、１．５ｃｍ四方に裁断したＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／上に試験組成物又は対照組成物を２０μＬ滴下し、５分間静置した後、汚染布をターゴトメーター（上島製作所）の洗浄槽内の２０℃に保温した６００ｍＬの水道水中に移し、６０ｒｐｍで１０分間洗浄した。塗布洗浄後の汚染布を洗浄槽から取り出し、水道水ですすぎ、乾燥させた。塗布洗浄前後の汚染布、及び別途準備した汚染布の原布の明度（Ｌ値）を分光測色計ｃｍ－７００ｄ（コニカミノルタ）を用いて測定し、以下の式を用いて汚染布の洗浄率を算出した。
洗浄率（％）＝（Ｌ2－Ｌ1）／（Ｌ0－Ｌ1） × １００
（Ｌ0：汚染布の原布のＬ値、Ｌ1：洗浄前の汚染布のＬ値、Ｌ2：洗浄後の汚染布のＬ値）。
対照組成物に対する各試験組成物の相対洗浄率（試験組成物での洗浄率／対照組成物での洗浄率）を算出し、塗布洗浄における各変異プロテアーゼの親プロテアーゼに対する相対洗浄力（相対塗布洗浄力）を評価した。
市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した各変異プロテアーゼを含む培養上清を、タンパク濃度が０．１ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験組成物）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照組成物）を同様の手順で調製した。得られた液体洗剤組成物を用いて、襟袖汚れモデルである人工汚染布ＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／（ＣＯＮＳＵＭＥＲＴＥＣ）を塗布洗浄した。すなわち、１．５ｃｍ四方に裁断したＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／上に試験組成物又は対照組成物を２０μＬ滴下し、５分間静置した後、汚染布をターゴトメーター（上島製作所）の洗浄槽内の２０℃に保温した６００ｍＬの水道水中に移し、６０ｒｐｍで１０分間洗浄した。塗布洗浄後の汚染布を洗浄槽から取り出し、水道水ですすぎ、乾燥させた。塗布洗浄前後の汚染布、及び別途準備した汚染布の原布の明度（Ｌ値）を分光測色計ｃｍ－７００ｄ（コニカミノルタ）を用いて測定し、以下の式を用いて汚染布の洗浄率を算出した。
洗浄率（％）＝（Ｌ2－Ｌ1）／（Ｌ0－Ｌ1） × １００
（Ｌ0：汚染布の原布のＬ値、Ｌ1：洗浄前の汚染布のＬ値、Ｌ2：洗浄後の汚染布のＬ値）。
対照組成物に対する各試験組成物の相対洗浄率（試験組成物での洗浄率／対照組成物での洗浄率）を算出し、塗布洗浄における各変異プロテアーゼの親プロテアーゼに対する相対洗浄力（相対塗布洗浄力）を評価した。
【0084】
各変異プロテアーゼの相対塗布洗浄力（各変異プロテアーゼを含む試験組成物の相対洗浄率）を表２及び図１に示す。Ｓ１９１Ｆを除くいずれの変異プロテアーゼも相対塗布洗浄力が１を上回っており、親酵素よりも明白に高い塗布洗浄力を示した。
【0085】
【表2】
【0086】
配列番号１の親プロテアーゼに対する１９１位の変異の効果について表３及び図２にまとめた。配列番号１の１９１位のセリン（Ｓ）をアルギニン（Ｒ）に置換したプロテアーゼ（Ｓ１９１Ｒ）は、親プロテアーゼと比べて塗布洗浄力が向上した。一方、１９１位のフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｓ１９１Ｆ）は塗布洗浄力に影響を与えなかった。８２位グルタミンと１９１位アルギニンを有する変異体（Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ）はさらに高い塗布洗浄力を示した。
【0087】
【表3】
【0088】
実施例３ 変異プロテアーゼの安定性評価
市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した変異プロテアーゼＥ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒを含む培養上清を、タンパク濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験サンプル）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照サンプル）を同様の手順で調製した。酵素配合直後（０ｈ）、及び４０℃で２週間保存した後（２ｗ）の試験サンプルのプロテアーゼ活性を以下の方法で測定した。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）１錠を、１ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファーに懸濁し、基質溶液とした。０ｈ及び２ｗの試験サンプルは、それぞれ０．１Ｍリン酸バッファーで６０倍に希釈した。基質溶液に該希釈したサンプルを１ｍＬ添加し、４０℃で３０分間インキュベートした。２％リン酸三ナトリウム水溶液を１０ｍＬ添加して反応を停止し、攪拌後に反応液を１ｍＬずつ１．５ｍＬチューブに分取した。１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を分取して５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験サンプルの代わりに酵素を加えていない加熱失活液体洗剤を用いて同様に測定した吸光度をブランクとし、試験サンプルの吸光度とブランクとの差分を活性値とした。同様の手順で、０ｈ及び２ｗの対照サンプルの活性値を求めた。２ｗのサンプルの活性値を０ｈのサンプルの活性値で割ることで二週間後の残存活性率を求め、その値を１／１４乗することで４０℃処理による１日当たりの活性維持率を求めた。１日当たりの活性維持率を底とする０．５の対数を求めてプロテアーゼ活性の半減期（日）とした。変異プロテアーゼの半減期を親プロテアーゼの半減期で割ることで相対安定性を求めた。変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒの相対安定性は１．８９であり、Ｅ８２Ｑ及びＳ１９１Ｒの変異導入によってプロテアーゼの安定性が大きく向上した。特許文献３には、８２Ｅ又は８２Ｑを有するプロテアーゼが液体洗剤中での安定性が高いことが記載されている。一方、本実施例の変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒは、８２Ｅを有する親プロテアーゼと比べて安定性が向上しており、Ｓ１９１Ｒの変異がプロテアーゼの安定性をさらに向上させることが示唆された。
市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した変異プロテアーゼＥ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒを含む培養上清を、タンパク濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験サンプル）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照サンプル）を同様の手順で調製した。酵素配合直後（０ｈ）、及び４０℃で２週間保存した後（２ｗ）の試験サンプルのプロテアーゼ活性を以下の方法で測定した。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ ＡＫ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）１錠を、１ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファーに懸濁し、基質溶液とした。０ｈ及び２ｗの試験サンプルは、それぞれ０．１Ｍリン酸バッファーで６０倍に希釈した。基質溶液に該希釈したサンプルを１ｍＬ添加し、４０℃で３０分間インキュベートした。２％リン酸三ナトリウム水溶液を１０ｍＬ添加して反応を停止し、攪拌後に反応液を１ｍＬずつ１．５ｍＬチューブに分取した。１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を分取して５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験サンプルの代わりに酵素を加えていない加熱失活液体洗剤を用いて同様に測定した吸光度をブランクとし、試験サンプルの吸光度とブランクとの差分を活性値とした。同様の手順で、０ｈ及び２ｗの対照サンプルの活性値を求めた。２ｗのサンプルの活性値を０ｈのサンプルの活性値で割ることで二週間後の残存活性率を求め、その値を１／１４乗することで４０℃処理による１日当たりの活性維持率を求めた。１日当たりの活性維持率を底とする０．５の対数を求めてプロテアーゼ活性の半減期（日）とした。変異プロテアーゼの半減期を親プロテアーゼの半減期で割ることで相対安定性を求めた。変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒの相対安定性は１．８９であり、Ｅ８２Ｑ及びＳ１９１Ｒの変異導入によってプロテアーゼの安定性が大きく向上した。特許文献３には、８２Ｅ又は８２Ｑを有するプロテアーゼが液体洗剤中での安定性が高いことが記載されている。一方、本実施例の変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒは、８２Ｅを有する親プロテアーゼと比べて安定性が向上しており、Ｓ１９１Ｒの変異がプロテアーゼの安定性をさらに向上させることが示唆された。
【0089】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図1】
【図2】
【配列表】