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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024158500
(43)【公開日】2024-11-08
(54)【発明の名称】化合物、腫瘍崩壊剤及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C07D 317/58 20060101AFI20241031BHJP
A61K 31/36 20060101ALI20241031BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241031BHJP
【ＦＩ】
C07D317/58 CSP
A61K31/36
A61K45/00
A61P35/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023073745
(22)【出願日】2023-04-27
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】袴田 航
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BA13
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】腫瘍細胞同士の接着を抑制でき、細胞毒性が低減された化合物、その化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤、及び、その腫瘍崩壊剤を含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】一般式（ａ０）で表される化合物を選択する。式中、Ｒ１は、アルコキシ基、アルキル基又は水素原子である。Ｒ２は、置換基を有してもよい炭化水素基である。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】一般式（ａ０）で表される化合物を選択する。式中、Ｒ１は、アルコキシ基、アルキル基又は水素原子である。Ｒ２は、置換基を有してもよい炭化水素基である。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（ａ０）で表される化合物。
［式中、Ｒ１は、アルコキシ基、アルキル基又は水素原子である。Ｒ２は、置換基を有してもよい炭化水素基である。］
【化1】
【請求項2】
下記一般式（ａ１）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
［式中、Ｒ１１は、炭素原子数１～３のアルコキシ基又は水素原子である。Ｒ２１は、ハロゲン原子、炭素原子数１～３のアルキル基、炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基、炭素原子数１～３のアルコキシ基、又はニトロ基である。ｎ２は、０～５の整数である。ｎ２が２以上の整数である場合、複数のＲ２１は、それぞれ同じでもよく異なってもよい。］
【化2】
【請求項3】
前記一般式（ａ１）中、Ｒ１１は、メトキシ基であり、
Ｒ２１は、ハロゲン原子、メチル基、ハロゲン化メチル基、メトキシ基、又はニトロ基である、請求項２に記載の化合物。
Ｒ２１は、ハロゲン原子、メチル基、ハロゲン化メチル基、メトキシ基、又はニトロ基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤。
【請求項5】
請求項４に記載の腫瘍崩壊剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項6】
前記腫瘍が固形悪性腫瘍であり、抗癌剤と組み合わせて用いられる、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物、腫瘍崩壊剤及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
癌の治療では、抗癌剤を用いる化学療法が多く用いられる。癌の中でも、固形癌は細胞同士が密に接着し細胞塊を形成するため、抗癌剤はその細胞塊の内部へ送達されにくい。固形癌の治療では、抗癌剤の投与量、回数を高める必要があり、その結果、患者に対し副作用を引き起しやすいという問題がある。
【0003】
これに対し、発明者らは、細胞接着に関与する細胞表面糖鎖の構築を担うゴルジマンノシダーゼに着目した。発明者らは、ゴルジマンノシダーゼ阻害剤を固形癌に接触させることにより、未成熟型Ｎ結合型糖鎖が癌細胞表面に蓄積し、癌細胞同士の接着が阻害され、固形癌の形成が阻害されることを見出した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Koyama R et al., A novel Golgi mannosidase inhibitor: Molecular design, synthesis, enzyme inhibition, and inhibition of spheroid formation, Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、非特許文献１に記載のゴルジマンノシダーゼ阻害剤は、細胞に対する毒性が高いという問題があった。そこで、本発明は、腫瘍細胞同士の接着を抑制でき、細胞毒性が低減された化合物、その化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤、及び、その腫瘍崩壊剤を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］下記一般式（ａ０）で表される化合物。
［１］下記一般式（ａ０）で表される化合物。
【0007】
【化1】
【0008】
［２］下記一般式（ａ１）で表される化合物である、［１］に記載の化合物。
【0009】
【化2】
【0010】
［３］前記一般式（ａ１）中、Ｒ１１は、メトキシ基であり、Ｒ２１は、ハロゲン原子、メチル基、ハロゲン化メチル基、メトキシ基、又はニトロ基である、［２］に記載の化合物。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤。
［５］［４］に記載の腫瘍崩壊剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
［６］前記腫瘍が固形悪性腫瘍であり、抗癌剤と組み合わせて用いられる、［５］に記載の医薬組成物。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤。
［５］［４］に記載の腫瘍崩壊剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
［６］前記腫瘍が固形悪性腫瘍であり、抗癌剤と組み合わせて用いられる、［５］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、腫瘍細胞同士の接着を抑制でき、細胞毒性が低減された化合物、その化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤、及び、その腫瘍崩壊剤を含む医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実験例２において、ＯＶＣＡＲ－３細胞に対してＫＩＦ又はＤＭＪを作用させた後、Ｃｏｎ－Ａ及びＳＤＬにより細胞の糖鎖を観察した結果を示す図である。
【図2】実験例２において、ＯＶＣＡＲ－３細胞に対して化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）を作用させた後、Ｃｏｎ－Ａ及びＳＤＬにより細胞の糖鎖を観察した結果を示す図である。
【図3】実験例３において、ＯＶＣＡＲ－３細胞スフェロイドに対して化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）を作用させた後、スフェロイドの崩壊活性を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書及び本特許請求の範囲において、「アルキル基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の１価の飽和炭化水素基を包含するものとする。アルコキシ基中のアルキル基も同様である。
「アルキレン基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の２価の飽和炭化水素基を包含するものとする。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
「アルキレン基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の２価の飽和炭化水素基を包含するものとする。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【0014】
［化合物］
一実施形態において、本発明は、下記一般式（ａ０）で表される化合物（以下、化合物（ａ０）ともいう）を提供する。
一実施形態において、本発明は、下記一般式（ａ０）で表される化合物（以下、化合物（ａ０）ともいう）を提供する。
【0015】
【化3】
【0016】
式（ａ０）中、Ｒ１は、アルコキシ基、アルキル基又は水素原子である。
Ｒ１におけるアルコキシ基としては、例えば、炭素原子数１～５のアルコキシ基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルコキシ基が好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉｓｏ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、又はｔｅｒｔ－ブトキシ基が好ましく、メトキシ基、エトキシ基がより好ましく、メトキシ基が更に好ましい。
Ｒ１におけるアルキル基としては、例えば、炭素原子数１～５のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、又はｔｅｒｔ－ブチル基が好ましく、メチル基又はエチル基がより好ましく、メチル基が更に好ましい。
Ｒ１におけるアルコキシ基としては、例えば、炭素原子数１～５のアルコキシ基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルコキシ基が好ましい。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉｓｏ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、又はｔｅｒｔ－ブトキシ基が好ましく、メトキシ基、エトキシ基がより好ましく、メトキシ基が更に好ましい。
Ｒ１におけるアルキル基としては、例えば、炭素原子数１～５のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１～３のアルキル基が好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、又はｔｅｒｔ－ブチル基が好ましく、メチル基又はエチル基がより好ましく、メチル基が更に好ましい。
【0017】
式（ａ０）中、Ｒ２は、置換基を有してもよい炭化水素基である。
Ｒ２における炭化水素基としては、鎖状の炭化水素基、又は環状の炭化水素基が挙げられる。
Ｒ２における炭化水素基としては、鎖状の炭化水素基、又は環状の炭化水素基が挙げられる。
【0018】
Ｒ２における、鎖状の炭化水素基は、直鎖状又は分岐鎖状である。Ｒ２における、鎖状の炭化水素基は、飽和脂肪族炭化水素基でもよいし、不飽和脂肪族炭化水素基でもよく、通常は飽和であることが好ましい。Ｒ２における直鎖状炭化水素基は、炭素原子数１～１０が好ましく、炭素原子数１～６がより好ましい。Ｒ２における分岐鎖状炭化水素基は、炭素原子数３～１０が好ましく、炭素原子数３～６がより好ましい。
鎖状の飽和脂肪族炭化水素基としては、炭素原子数１～１０の１価の鎖状飽和炭化水素基が挙げられる。炭素原子数１～１０の１価の鎖状飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基等が挙げられる。
鎖状の飽和脂肪族炭化水素基としては、炭素原子数１～１０の１価の鎖状飽和炭化水素基が挙げられる。炭素原子数１～１０の１価の鎖状飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基等が挙げられる。
【0019】
Ｒ２における、環状の炭化水素基は、脂肪族炭化水素基でもよいし、芳香族炭化水素基でもよいし、また、多環式基でも単環式基でもよい。
単環式基である脂肪族炭化水素基としては、モノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましい。該モノシクロアルカンとしては、炭素原子数３～６のものが好ましく、具体的にはシクロペンタン、シクロヘキサン等が挙げられる。
多環式基である脂肪族炭化水素基としては、ポリシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、該ポリシクロアルカンとしては、炭素原子数７～１２のものが好ましく、具体的にはアダマンタン、ノルボルナン、イソボルナン、トリシクロデカン、テトラシクロドデカン等が挙げられる。
単環式基である脂肪族炭化水素基としては、モノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましい。該モノシクロアルカンとしては、炭素原子数３～６のものが好ましく、具体的にはシクロペンタン、シクロヘキサン等が挙げられる。
多環式基である脂肪族炭化水素基としては、ポリシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましく、該ポリシクロアルカンとしては、炭素原子数７～１２のものが好ましく、具体的にはアダマンタン、ノルボルナン、イソボルナン、トリシクロデカン、テトラシクロドデカン等が挙げられる。
【0020】
芳香族炭化水素基としては、炭素原子数６～１５の芳香族炭化水素環から水素原子１個以上を除いた基が好ましく、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン又はフェナントレンから水素原子１個以上を除いた基がより好ましく、ベンゼン、ナフタレン又はアントラセンから水素原子１個以上を除いた基がさらに好ましく、ベンゼン又はナフタレンから水素原子１個以上を除いた基が特に好ましく、ベンゼンから水素原子１個以上を除いた基が最も好ましい。あるいは、芳香族炭化水素基としては、２以上の芳香環を含む芳香族化合物（例えばビフェニル、フルオレン等）から水素原子１個以上を除いた基；炭素原子数６～１５の芳香族炭化水素環から水素原子１個以上を除いた基（アリール基）の水素原子の１つがアルキレン基で置換された基（例えば、ベンジル基、フェネチル基、１－ナフチルメチル基、２－ナフチルメチル基、１－ナフチルエチル基、２－ナフチルエチル基等のアリールアルキル基）等が挙げられる。前記アリール基に結合するアルキレン基の炭素原子数は、１～４であることが好ましく、炭素原子数１～２であることがより好ましく、炭素原子数１であることが特に好ましい。
【0021】
Ｒ２が鎖状の炭化水素基である場合、その鎖状の炭化水素基の有する水素原子の一部又は全部は、ヘテロ原子を含む１価の基で置換されてもよい。前記１価の基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトリル基、チオール基等が挙げられる。Ｒ２が鎖状の炭化水素基である場合、その鎖状の炭化水素基の有するメチレン基は、ヘテロ原子を含む２価の基で置換されてもよい。前記２価の基としては、例えば、カルボニル基、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、アミド基、イミノ基等が挙げられる。
【0022】
Ｒ２が環状の脂肪族炭化水素基である場合、その環状の脂肪族炭化水素基が有する水素原子の一部又は全部は、１価の基で置換されてもよい。前記１価の基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、ニトリル基、チオール基が挙げられる。
【0023】
Ｒ２が環状の脂肪族炭化水素基である場合、その環骨格を構成する炭素原子は、ヘテロ原子を含む２価の基で置換されてもよい。前記２価の基としては、例えば、カルボニル基、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、アミド基、イミノ基、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【0024】
Ｒ２が芳香族炭化水素基である場合、その芳香族炭化水素基が有する水素原子の一部又は全部は、１価の基で置換されてもよい。前記１価の基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、ニトリル基、チオール基が挙げられ、ハロゲン原子、炭素原子数１～３のアルキル基、炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基、炭素原子数１～３のアルコキシ基、又はニトロ基が好ましい。
【0025】
Ｒ２が芳香族炭化水素基である場合、その環骨格を構成する炭素原子は、ヘテロ原子を含む２価の基で置換されてもよい。前記２価の基としては、例えば、カルボニル基、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、アミド基、イミノ基、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。
【0026】
前記一般式（ａ０）で表される化合物は、下記一般式（ａ１）で表される化合物であることが好ましい。
【0027】
【化4】
【0028】
Ｒ１１は、炭素原子数１～３のアルコキシ基又は水素原子である。Ｒ１１としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉｓｏ－プロポキシ基が挙げられ、メトキシ基が好ましい。
【0029】
Ｒ２１は、ハロゲン原子、炭素原子数１～３のアルキル基、炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基、炭素原子数１～３のアルコキシ基、又はニトロ基である。前記一般式（ａ１）で表される化合物の腫瘍細胞同士の接着の抑制能をより高められる観点から、Ｒ２１としては、ハロゲン原子が好ましい。前記一般式（ａ１）で表される化合物の細胞毒性をより低減できる観点から、Ｒ２１は、炭素原子数１～３のアルキル基、炭素原子数１～３のアルコキシ基又はニトロ基が好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子が好ましい。
炭素原子数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉｓｏ－プロピル基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基は、炭素原子数１～３のアルキル基の水素原子の一部または全部がハロゲン原子で置換された基である。炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基としては、メチル基の水素原子の一部または全部がハロゲン原子で置換された基が好ましく、－ＣＨ３の水素原子の全部がハロゲン原子で置換された基がより好ましく、トリフルオロメチル基が更に好ましい。前記ハロゲン化アルキル基におけるハロゲン原子としては、フッ素原子が好ましい。
炭素原子数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉｓｏ－プロポキシ基が挙げられ、メトキシ基、エトキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。
ｎ２は、０～５の整数であり、０～２の整数が好ましい。
Ｒ２１は、ベンゼン環に結合する硫黄原子に対して、オルト位又はパラ位であることが好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子が好ましい。
炭素原子数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉｓｏ－プロピル基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基は、炭素原子数１～３のアルキル基の水素原子の一部または全部がハロゲン原子で置換された基である。炭素原子数１～３のハロゲン化アルキル基としては、メチル基の水素原子の一部または全部がハロゲン原子で置換された基が好ましく、－ＣＨ３の水素原子の全部がハロゲン原子で置換された基がより好ましく、トリフルオロメチル基が更に好ましい。前記ハロゲン化アルキル基におけるハロゲン原子としては、フッ素原子が好ましい。
炭素原子数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉｓｏ－プロポキシ基が挙げられ、メトキシ基、エトキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。
ｎ２は、０～５の整数であり、０～２の整数が好ましい。
Ｒ２１は、ベンゼン環に結合する硫黄原子に対して、オルト位又はパラ位であることが好ましい。
【0030】
前記一般式（ａ１）で表される化合物は、下記式（ａ１－１）～（ａ１－８）のいずれかで表される化合物（以下、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）ともいう）であることが好ましい。
【0031】
【化5】
【0032】
【化6】
【0033】
本実施形態に係る化合物は、ゴルジ体マンノシダーゼの活性を阻害することが可能である。ゴルジ体マンノシダーゼは、ＧＭＩ及びＧＭＩＩに大別される。ヒト細胞のゴルジ体に局在するＧＭＩとしては、Ｍａｎｎｏｓｙｌ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－α－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＡ（ＧＭＩＡ），Ｍａｎｎｏｓｙｌ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－α－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＢ（ＧＭＩＢ），Ｍａｎｎｏｓｙｌｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－α－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＣ（ＧＭＩＣ）が挙げられる。ヒト細胞のゴルジ体に局在するＧＭＩＩとしては、α－Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＩ，Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ａｌｐｈａ ｃｌａｓｓ ２Ａ ｍｅｍｂｅｒ １（ＧＭＩＩ１），α－Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＩ，Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ａｌｐｈａ ｃｌａｓｓ ２Ａ ｍｅｍｂｅｒ ２（ＧＭＩＩ２）の５種類のα－マンノシダーゼが存在する。これらの中でも、本実施形態に係る化合物は、ＧＭＩを阻害することが確認されている。ＧＭＩの阻害により、腫瘍細胞同士の接着を抑制し、腫瘍の固形状の形態を崩壊させることが可能である。
【0034】
以上説明した本実施形態に係る化合物は、腫瘍細胞同士の接着を抑制して、腫瘍の固形状の形態を崩壊させることが可能である。本実施形態に係る化合物がこのような効果を発揮する理由は定かではないが、以下のように推測される。本実施形態に係る化合物は、腫瘍細胞のＧＭＩを阻害することにより、細胞表面に、未成熟なハイマンノース型糖鎖を蓄積させる。その結果、腫瘍細胞同士の接着が抑制され、腫瘍の固形状の形態が崩壊すると考えられる。
本実施形態に係る化合物を固形悪性腫瘍に作用させることにより、腫瘍細胞同士の接着が抑制されて、抗癌剤が腫瘍深部へ送達されやすくなるため、治療に必要な抗癌剤の投与量を低減することが可能である。その結果、投与対象において、抗癌剤による副作用を低減することが可能である
本実施形態に係る化合物を固形悪性腫瘍に作用させることにより、腫瘍細胞同士の接着が抑制されて、抗癌剤が腫瘍深部へ送達されやすくなるため、治療に必要な抗癌剤の投与量を低減することが可能である。その結果、投与対象において、抗癌剤による副作用を低減することが可能である
【0035】
従来報告されていたα－マンノシダーゼ阻害剤（Koyama R et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492.）では、腫瘍崩壊に有効な濃度域と、細胞毒性が発現する濃度域とが近接していることが課題であった。本実施形態に係る化合物は、前記従来のα－マンノシダーゼ阻害剤と比べて細胞毒性が低減されており、腫瘍を崩壊させる濃度域と、細胞毒性濃度域との差が大きい。そのため、本実施形態に係る化合物によれば、細胞毒性を発現しない濃度で、腫瘍を崩壊させることが可能である。したがって、投与対象において、本実施形態に係る化合物による副作用を低減することが可能である。
【0036】
［化合物（ａ０）の製造方法］
本実施形態の化合物は、公知の方法を組み合わせて製造することができ、例えば、下記の製造方法により製造することができる。まず、以下の手順により、原料としてピペロナールを用いて、化合物ｐｒｅ０１～０４を合成する。
本実施形態の化合物は、公知の方法を組み合わせて製造することができ、例えば、下記の製造方法により製造することができる。まず、以下の手順により、原料としてピペロナールを用いて、化合物ｐｒｅ０１～０４を合成する。
【0037】
【化7】
【0038】
窒素雰囲気で、ピペロナールと、シアノ酢酸エチルとを反応させて、化合物ｐｒｅ０１を得る。反応温度条件は、例えば０～１８０℃程度である。反応時間は、例えば３０分～２４時間程度である。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン等が挙げられる。この反応では触媒を用いてもよい。触媒としては、例えば、ピペリジン等が挙げられる。
【0039】
次いで、化合物ｐｒｅ０１と、下記式（ｍＰｈ－１）で表される化合物とを反応させて、化合物ｐｒｅ０２を得る。反応温度条件は、例えば０～１００℃程度である。反応時間は、例えば、５分～３時間程度である。反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン等が挙げられる。
【0040】
【化8】
【0041】
次いで、ナトリウムメトキシドを用いて、化合物ｐｒｅ０２を加水分解反応させて、化合物ｐｒｅ０３を得る。反応温度条件は、例えば０～１００℃程度である。反応時間は、例えば、１０分～２４時間程度である。反応溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール等が挙げられる。
【0042】
次いで、化合物ｐｒｅ０３をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミドに溶解し、カルボキシ基の脱離反応により、化合物ｐｒｅ０４を得る。反応温度条件は、例えば０～２００℃程度である。反応時間は、例えば、１０分～２４時間程度である。
【0043】
次いで、化合物ｐｒｅ０４と、下記式（ＳＣｌ－１）で表される化合物とを反応させて前記式（ａ０）で表される化合物を得る。反応温度条件は、例えば０～２００℃程度である。反応時間は、例えば、１０分～２４時間程度である。この反応では触媒を用いてもよい。触媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）が挙げられる。
【0044】
【化9】
【0045】
上述した化合物（ａ０）の製造方法においては、各反応が終了した後、反応液中の化合物を単離、精製してもよい。単離、精製には、従来公知の方法が利用でき、例えば、濃縮、溶媒抽出、蒸留、結晶化、再結晶、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて用いることができる。
上記のようにして得られる化合物の構造は、１Ｈ－核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル法、１９Ｆ－ＮＭＲスペクトル法、赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル法、質量分析（ＭＳ）法、元素分析法、Ｘ線結晶回折法等の一般的な有機分析法により同定できる。
各工程で用いられる原料は、市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。
上記のようにして得られる化合物の構造は、１Ｈ－核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル法、１９Ｆ－ＮＭＲスペクトル法、赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル法、質量分析（ＭＳ）法、元素分析法、Ｘ線結晶回折法等の一般的な有機分析法により同定できる。
各工程で用いられる原料は、市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。
【0046】
［腫瘍崩壊剤］
一実施形態において、本発明は、前記実施形態に係る化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤を提供する。本明細書において、腫瘍崩壊剤とは、対象となる固形状の腫瘍に作用して、腫瘍の固形状の形態を崩壊させる化合物又は組成物を意味する。
一実施形態において、本発明は、前記実施形態に係る化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤を提供する。本明細書において、腫瘍崩壊剤とは、対象となる固形状の腫瘍に作用して、腫瘍の固形状の形態を崩壊させる化合物又は組成物を意味する。
【0047】
本明細書において、腫瘍は、良性腫瘍及び悪性腫瘍を包含する。良性腫瘍とは、周囲の組織へ浸潤せず、離れた臓器へ転移しない腫瘍である。悪性腫瘍とは、周囲の組織への浸潤、及び／又は、離れた臓器へ転移が認められる腫瘍である。
本明細書において、腫瘍は、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍を包含する。上皮性腫瘍とは、外界に面した細胞層を構成する上皮細胞が形成する腫瘍である。上皮細胞としては、例えば、皮膚の細胞、消化器、呼吸器、泌尿器、生殖器、乳房等の管腔臓器の表面を覆う細胞が挙げられる。非上皮性腫瘍は、上皮細胞以外の細胞が形成する腫瘍である。非上皮性細胞としては、例えば、筋肉、脂肪、血管、神経組織、骨、軟骨、血液等を構成する細胞が挙げられる。
本明細書において、腫瘍は、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍を包含する。上皮性腫瘍とは、外界に面した細胞層を構成する上皮細胞が形成する腫瘍である。上皮細胞としては、例えば、皮膚の細胞、消化器、呼吸器、泌尿器、生殖器、乳房等の管腔臓器の表面を覆う細胞が挙げられる。非上皮性腫瘍は、上皮細胞以外の細胞が形成する腫瘍である。非上皮性細胞としては、例えば、筋肉、脂肪、血管、神経組織、骨、軟骨、血液等を構成する細胞が挙げられる。
【0048】
腫瘍崩壊剤が対象とする腫瘍は、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれであってもよい。腫瘍崩壊剤が対象とする腫瘍は、上皮性腫瘍又は非上皮性腫瘍のいずれであってもよい。腫瘍崩壊剤が対象とする腫瘍は、固形腫瘍である。固形腫瘍とは、固形状の形態を有する腫瘍であり、血液腫瘍を除く腫瘍を意味する。対象となる固形腫瘍は、固形悪性腫瘍又は良性悪性腫瘍のいずれであってもよく、固形悪性腫瘍であることが好ましく、上皮性の固形悪性腫瘍であることがより好ましい。対象となる上皮性の固形悪性腫瘍としては、例えば、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、悪性黒色腫等が挙げられるが、これらに限定されない。対象となる非上皮性の固形悪性腫瘍としては、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫等が挙げられる。
【0049】
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤が含み得る前記実施形態に係る化合物の塩としては、腫瘍崩壊剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。
これらの中でも、前記実施形態に係る化合物の塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
これらの中でも、前記実施形態に係る化合物の塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【0050】
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤が含み得る前記実施形態に係る化合物又はその塩の溶媒和物としては、腫瘍崩壊剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
前記実施形態に係る化合物又はその塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。
前記実施形態に係る化合物又はその塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。
【0051】
＜その他の成分＞
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤は、前記実施形態に係る化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、腫瘍崩壊剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、角質軟化剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、油性基剤、乳化剤、乳化安定剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、保型剤、潤沢剤等が挙げられる。
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤は、前記実施形態に係る化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、腫瘍崩壊剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、角質軟化剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、油性基剤、乳化剤、乳化安定剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、保型剤、潤沢剤等が挙げられる。
【0052】
＜用途＞
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤の用途は、腫瘍の形態の一部又は全部を崩壊させることを目的としている限り特に限定されず、例えば、腫瘍を治療するための医薬組成物に配合して使用してもよい。
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤の用途は、腫瘍の形態の一部又は全部を崩壊させることを目的としている限り特に限定されず、例えば、腫瘍を治療するための医薬組成物に配合して使用してもよい。
【0053】
＜使用方法及び使用量＞
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤の使用方法及び使用量は、腫瘍崩壊剤が腫瘍に対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤の使用方法及び使用量は、腫瘍崩壊剤が腫瘍に対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
【0054】
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤によれば、対象となる腫瘍において、細胞同士の接着を抑制し、腫瘍の固形状の形態を崩壊させることが可能である。本実施形態に係る腫瘍崩壊剤は、化合物（ａ０）若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴としている。化合物（ａ０）は、従来報告されていたα－マンノシダーゼ阻害剤（Koyama R et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492.）に比べて、細胞毒性が低減されており、細胞毒性発現濃度域よりも低い濃度で腫瘍崩壊を誘導することができる。そのため、腫瘍を有する対象個体に、腫瘍崩壊剤を投与しても、対象個体において、腫瘍崩壊剤による副作用を低減することが可能である。
【0055】
本実施形態に係る腫瘍崩壊剤は、抗癌剤と組み合わせて、固形悪性腫瘍の治療に用いてもよい。本実施形態に係る化合物を固形悪性腫瘍に作用させることにより、抗癌剤が腫瘍深部へ送達されやすくなるため、治療に必要な抗癌剤の投与量を低減することが可能である。その結果、投与対象において、抗癌剤による副作用を低減することが可能である。
【0056】
［医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、前記実施形態に係る腫瘍崩壊剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む。
一実施形態において、本発明は、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、前記実施形態に係る腫瘍崩壊剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む。
【0057】
本実施形態に係る医薬組成物は、上述の腫瘍崩壊剤に加えて、薬学的に許容される担体を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態に係る医薬組成物において、薬学的に許容される担体は、上記実施形態の腫瘍崩壊剤の腫瘍を崩壊させる活性を阻害せず、且つ投与対象に対して実質的な毒性を示さない成分であり得る。
【0058】
薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム－ グリコール－ スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、緩衝液、生理食塩水等の希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられる。
【0059】
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、医薬組成物の製剤は経口剤のために通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等の添加剤を用いて、常法により製造することができる。
使用可能な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、クエン酸、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等が挙げられる。
本実施形態に係る医薬組成物が経口投与されるものである場合、その医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製されたものであってもよい。
使用可能な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、クエン酸、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等が挙げられる。
本実施形態に係る医薬組成物が経口投与されるものである場合、その医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製されたものであってもよい。
【0060】
本実施形態に係る医薬組成物が、非経口投与されるものである場合、前記医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等を含んでもよい。
本実施形態に係る医薬組成物が、非経口投与されるものである場合、前記医薬組成物は、アンプル、バイアル、注射器のカートリッジ等に、単位投与量又は複数回投与量ずつ容器に封入されてもよい。
本実施形態に係る医薬組成物が、非経口投与されるものである場合、前記医薬組成物は、アンプル、バイアル、注射器のカートリッジ等に、単位投与量又は複数回投与量ずつ容器に封入されてもよい。
【0061】
＜対象の疾患＞
本実施形態の医薬組成物は、腫瘍を治療するために用いられる。対象となる腫瘍としては、腫瘍崩壊剤に係る実施形態において上述したものが挙げられ、固形悪性腫瘍が好ましく、上皮性悪性腫瘍がより好ましい。
本実施形態の医薬組成物は、腫瘍を治療するために用いられる。対象となる腫瘍としては、腫瘍崩壊剤に係る実施形態において上述したものが挙げられ、固形悪性腫瘍が好ましく、上皮性悪性腫瘍がより好ましい。
【0062】
＜投与の対象＞
本実施形態にかかる医薬組成物が投与される対象となる生物種としては、腫瘍を形成し得る対象であれば特に限定されないが、例えば、ヒト及びヒト以外の哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等のヒト以外の霊長類等が挙げられる。
本実施形態にかかる医薬組成物が投与される対象となる生物種としては、腫瘍を形成し得る対象であれば特に限定されないが、例えば、ヒト及びヒト以外の哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等のヒト以外の霊長類等が挙げられる。
【0063】
＜投与方法＞
本実施形態に係る医薬組成物の投与方法としては、投与対象において、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に限定されず、非経口投与でもよく、経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。
本実施形態に係る医薬組成物の投与方法としては、投与対象において、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に限定されず、非経口投与でもよく、経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。
【0064】
非経口投与としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔投与、脳室内投与、髄腔内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与等の局所投与等、全身投与が挙げられる。本実施形態の医薬組成物は、対象の癌が存在する部位に対する局所投与が好ましい。
【0065】
＜有効量＞
本実施形態に係る医薬組成物に含まれる、腫瘍崩壊剤の有効量は、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に制限されず、当業者が、適宜設定することができる。
本実施形態に係る医薬組成物に含まれる、腫瘍崩壊剤の有効量は、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に制限されず、当業者が、適宜設定することができる。
【0066】
＜投与量＞
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、投与量は適宜決定されるが、例えば、治療対象の患者当たり、約０．１～２０００ｍｇであってもよく、これを１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよいし、数日置きに投与してもよい。
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、投与量は適宜決定されるが、例えば、治療対象の患者当たり、約０．１～２０００ｍｇであってもよく、これを１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよいし、数日置きに投与してもよい。
【0067】
以上説明した本実施形態に係る医薬組成物は、治療対象の腫瘍細胞同士の接着を抑制することにより、腫瘍の固形状の形態を崩壊させることが可能である。本実施形態に係る医薬組成物は、前述の腫瘍崩壊剤を含有することを特徴としている。前述の腫瘍崩壊剤は、化合物（ａ０）若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。化合物（ａ０）は、従来報告されていたα－マンノシダーゼ阻害剤（Koyama R et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492.）よりも細胞毒性が低減されており、細胞毒性発現濃度域よりも低い濃度で腫瘍崩壊を誘導することができる。そのため、治療対象の個体に、この医薬組成物を投与しても、対象個体において、この医薬組成物による副作用を低減することが可能である。
【0068】
治療対象が固形悪性腫瘍である場合、本実施形態に係る医薬組成物は、抗癌剤と組み合わせて用いられることが好ましい。前記抗癌剤としては、癌の治療に有効である限り特に限定されないが、例えば、癌の治療に用いられる公知の抗癌剤が挙げられる。公知の抗癌剤は、低分子医薬でもよく、抗体医薬でもよく、キメラ抗原受容体Ｔ細胞等の細胞医薬であってもよい。抗癌剤は、治療対象の固形悪性腫瘍の種類に応じて、当該固形悪性腫瘍の治療に通常用いられる抗癌剤を適宜選択することができる。
抗癌剤の投与量は、癌の治療に有効である限り特に限定されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
抗癌剤の投与量は、癌の治療に有効である限り特に限定されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
【0069】
本実施形態に係る医薬組成物が抗癌剤と組み合わせて用いられる場合、抗癌剤を投与する前に、その医薬組成物を治療対象に投与してもよいし、あるいは、抗癌剤と医薬組成物を同時に治療対象に投与してもよい。本実施形態に係る医薬組成物を投与対象が有する癌に作用させることにより、抗癌剤が癌の深部へ送達されやすくなるため、治療に必要な抗癌剤の投与量を低減することが可能である。その結果、投与対象において、抗癌剤による副作用を低減することが可能である。
【0070】
［その他の実施形態］
その他の実施形態としては、例えば、上記実施形態の腫瘍崩壊剤の有効量を、治療を必要とする腫瘍を有する対象に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法が挙げられる。
本実施形態において、治療対象としては、ヒト及びヒト以外の哺乳動物が挙げられる。
腫瘍としては、［腫瘍崩壊剤］において上述したものが挙げられる。
本実施形態に係る腫瘍の治療方法は、上記実施形態の腫瘍崩壊剤及び抗癌剤の有効量を、治療を必要とする固形悪性腫瘍を有する対象に投与する工程を含む、固形悪性腫瘍の治療方法であってもよい。
本実施形態において、有効量は、［医薬組成物］において、上述した量であってもよく、当業者が適宜設定することができる。腫瘍崩壊剤の投与方法としては、［医薬組成物］において上述した投与方法であってもよい。
その他の実施形態としては、例えば、上記実施形態の腫瘍崩壊剤の有効量を、治療を必要とする腫瘍を有する対象に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法が挙げられる。
本実施形態において、治療対象としては、ヒト及びヒト以外の哺乳動物が挙げられる。
腫瘍としては、［腫瘍崩壊剤］において上述したものが挙げられる。
本実施形態に係る腫瘍の治療方法は、上記実施形態の腫瘍崩壊剤及び抗癌剤の有効量を、治療を必要とする固形悪性腫瘍を有する対象に投与する工程を含む、固形悪性腫瘍の治療方法であってもよい。
本実施形態において、有効量は、［医薬組成物］において、上述した量であってもよく、当業者が適宜設定することができる。腫瘍崩壊剤の投与方法としては、［医薬組成物］において上述した投与方法であってもよい。
【0071】
また、その他の実施形態としては、例えば、腫瘍の治療用医薬組成物を製造するための前記実施形態の腫瘍崩壊剤の使用が挙げられる。
腫瘍としては、［腫瘍崩壊剤］において上述したものが挙げられる。
腫瘍としては、［腫瘍崩壊剤］において上述したものが挙げられる。
【実施例0072】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0073】
＜化合物の製造例＞
まず、以下の手順により、原料としてピペロナールを用いて、下記の化合物ｐｒｅ１～４を合成した。
化合物ｐｒｅ１： Ｅｔｈｙｌ ３－（１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｙａｎｏ－２－ｐｒｏｐｅｎｏａｔｅ
化合物ｐｒｅ２： Ｅｔｈｙｌ α－ｃｙａｎｏ－β－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ
化合物ｐｒｅ３： α－Ｃｙａｎｏ－β－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄ
化合物ｐｒｅ４： β－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ
まず、以下の手順により、原料としてピペロナールを用いて、下記の化合物ｐｒｅ１～４を合成した。
化合物ｐｒｅ１： Ｅｔｈｙｌ ３－（１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｃｙａｎｏ－２－ｐｒｏｐｅｎｏａｔｅ
化合物ｐｒｅ２： Ｅｔｈｙｌ α－ｃｙａｎｏ－β－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ
化合物ｐｒｅ３： α－Ｃｙａｎｏ－β－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄ
化合物ｐｒｅ４： β－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ－５－ｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ
【0074】
【化10】
【0075】
窒素雰囲気でピペロナール（Ｗａｋｏ，１６５－０２７８２，３．００ｇ，１９．９９ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（Ｗａｋｏ，２０２－１７９１１，１００ｍＬ）に溶解し、シアノ酢酸エチル（ＴＣＩ，Ｃ０４４１，２．３ｍＬ，２０．９９ｍｍｏｌ）、ピペリジン（ＴＣＩ，Ｐ０４５３，２００μＬ，１．９９ｍｍｏｌ）の順に加え、１４０℃の油浴で１時間３０分間加熱還流を行った。その後溶媒を留去し、真空乾燥を行った。得られた反応生成物に９９．５％エタノールを５ｍＬ加え、熱再結晶を行い、桐山ろ過により黄色の結晶である化合物ｐｒｅ１（４．５５ｇ，収率９２．８％）を得た。
【0076】
窒素雰囲気下で化合物ｐｒｅ１（２．２２ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（４５ｍＬ）に溶解し、０．５Ｍ ４－メトキシフェニルマグネシウムブロミドＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，４７０２６０－１００ＭＬ，２８ｍＬ，１３．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。反応液に１．２Ｍ 塩酸１６ｍＬを加え、反応を停止した。反応停止後の溶液をジエチルエーテル７０ｍＬと１．２Ｍ 塩酸７０ｍＬが入った分液ロートに加え、生成物の抽出を行った。得られた有機層を飽和食塩水７０ｍＬで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去後、真空乾燥を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝１５／１）により精製し、化合物ｐｒｅ２（３．３１ｇ）を定量的に得た。
【0077】
化合物ｐｒｅ２（３．３１ｇ，９．３７ｍｍｏｌ）を特級メタノール（Ｗａｋｏ，１３１－０１８２６，１６４ｍＬ）に溶解し、純水３３ｍＬ、２８％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（Ｗａｋｏ，１９７－０２４６３，４ｍＬ）の順に加え、室温で１時間４０分間撹拌した。その後、ＤＯＷＥＸ５０Ｗ－Ｘ８（Ｗａｋｏ，３２８－９７５８５、Ｈ＋ｆｏｒｍ）を加えて撹拌し、中和を行った。反応液のｐＨはｐＨ試験紙によりｐＨ７となったことを確認した。その後、綿栓ろ過によりＤＯＷＥＸ５０Ｗ－Ｘ８を取り除き、溶媒を留去後、真空乾燥を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール／トリフルオロ酢酸＝８／１／０．１）により精製し、化合物ｐｒｅ３（２．８３ｇ，収率９２．９％）を得た。
【0078】
化合物ｐｒｅ３（２．４５ｇ，７．５２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ，Ｗａｋｏ，０４２－０２５４１，２０ｍＬ）に溶解し、１４０℃の油浴で２時間加熱還流を行った。反応液をジエチルエーテル４００ｍＬと純水４００ｍＬが入った分液ロートに加え、生成物の抽出を行った。得られた有機層を４００ｍＬの飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去後に真空乾燥を行い、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝５／２）により精製し、化合物ｐｒｅ４（１．８０ｇ，収率８０．２％）を得た。
【0079】
［製造例１：化合物（ａ１－１）の製造］
窒素雰囲気下で化合物ｐｒｅ４（１４６．３ｍｇ，０．５１８ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，Ｗａｋｏ，２０５－１７９０１，１０ｍＬ）に溶解し、水素化リチウムアルミニウム（Ｗａｋｏ，１２０－０１０９１，５１．０ｍｇ，１．０３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、飽和無水硫酸ナトリウム水溶液をパスツールピペットで１１滴加え、セライトろ過を行った。ろ液の溶媒をロータリーエバポレーターにて留去し、真空乾燥を行った。得られた生成物全量を脱水ジクロロメタン（Ｗａｋｏ，０４２－３１２３１，１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ，ＴＣＩ，Ｄ１５９９，２７０μＬ，１．５５４ｍｍｏｌ）とＢｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，１０８１３８－５Ｇ，１００μＬ，０．７７７ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間３０分間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝５／３）により精製した。得られた生成物を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝８／１）に供し、化合物（ａ１－１）（１１４．１ｍｇ，収率５１．８％）を得た。
窒素雰囲気下で化合物ｐｒｅ４（１４６．３ｍｇ，０．５１８ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，Ｗａｋｏ，２０５－１７９０１，１０ｍＬ）に溶解し、水素化リチウムアルミニウム（Ｗａｋｏ，１２０－０１０９１，５１．０ｍｇ，１．０３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、飽和無水硫酸ナトリウム水溶液をパスツールピペットで１１滴加え、セライトろ過を行った。ろ液の溶媒をロータリーエバポレーターにて留去し、真空乾燥を行った。得られた生成物全量を脱水ジクロロメタン（Ｗａｋｏ，０４２－３１２３１，１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ，ＴＣＩ，Ｄ１５９９，２７０μＬ，１．５５４ｍｍｏｌ）とＢｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，１０８１３８－５Ｇ，１００μＬ，０．７７７ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間３０分間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝５／３）により精製した。得られた生成物を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝８／１）に供し、化合物（ａ１－１）（１１４．１ｍｇ，収率５１．８％）を得た。
【0080】
【化11】
【0081】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－１）についての測定結果を以下に示す。本明細書において、ＤＵＩＳ－ＭＳはＤｕａｌ Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを意味し、ＨＲＭＳはＨｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを意味する。
【0082】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１２（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０，８．３ａｎｄ１４．８Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．８９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０ａｎｄ１３．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７６（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．８０（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．８９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ２．０Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．７９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０３（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．８ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．９４（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．８，３．０ａｎｄ９．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．５８（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ４ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．７２（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ９．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0083】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．６０（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．６５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４７．０２（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２４（－ＯＣＨ３），１００．９２（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．９６（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．１９（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．００（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．４９（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．２１（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．４３（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２９．２４（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３２．６５（Ｃ４ｉｎｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３５．７６，１３７．９６，１３９．７８，１４６．０１，１４７．８１，１５８．１２．
【0084】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝４４８［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４２４［ＭＨ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２２ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４２４．１２２４，ｆｏｕｎｄ：４２４．１２２１（ｅｒｒｏｒ０．７１ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２２ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４２４．１２２４，ｆｏｕｎｄ：４２４．１２２１（ｅｒｒｏｒ０．７１ｐｐｍ）．
【0085】
［製造例２：化合物（ａ１－２）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－２）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－２）を合成した。
【0086】
【化12】
【0087】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－２）についての測定結果を以下に示す。
【0088】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１３（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５，７．０ａｎｄ１５．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．９２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８ａｎｄ１３．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７８（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．７９（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．４０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５８（ｓ，１Ｈ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．４６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0089】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．５９（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），４１．７５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），４７．０２（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５５．２６（－ＯＣＨ３），１００．９６（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．９０（Ｃ２－ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．２４（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．０５（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．４４（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．４０（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．５４（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２９．３９（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３５．６５，１３７．８７，１３８．３２，１３９．１６，１４６．０８，１４７．８６，１５８．１９．
【0090】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝４８２［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４５８［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２１ＣｌＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４５８．０８３４，ｆｏｕｎｄ：４５８．０８３２（ｅｒｒｏｒ０．４４ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２１ＣｌＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４５８．０８３４，ｆｏｕｎｄ：４５８．０８３２（ｅｒｒｏｒ０．４４ｐｐｍ）．
【0091】
［製造例３：化合物（ａ１－３）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－３）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－３）を合成した。
【0092】
【化13】
【0093】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－３）についての測定結果を以下に示す。
【0094】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１２（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０，８．３，ａｎｄ１４．８Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．８９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０ａｎｄ１３．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７６（ｓ，３Ｈ，＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），３．８０（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．８７（ｓ，３Ｈ，－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），４．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．８９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ２．０Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．７９（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｏｆ＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），７．０３（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．８ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｏｆ＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），６．９４（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．８，３．０ａｎｄ９．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），７．７２（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３）．
【0095】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．６０（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．６５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４７．０２（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２４（＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），５５．６０（－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），１００．９２（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．９６（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．１９（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．００（Ｃ３ａｎｄＣ５ｏｆ＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），１１４．２１，（Ｃ３ａｎｄＣ５，－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），１２０．４９（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．４３（Ｃ２ａｎｄＣ６ｏｆ＞ＣＨ（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），１２９．２４（Ｃ２ａｎｄＣ６，－ＳＯ２（Ｃ６Ｈ４）ＯＣＨ３），１３１．３７，１３５．８４，１３８．０４，１４６．００，１４７．８２，１５８．１４，１６２．８７．
【0096】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝４７８［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４５４［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２４ＮＯ６Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４５４．１３３０，ｆｏｕｎｄ：４５４．１３２８（ｅｒｒｏｒ０．４４ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２４ＮＯ６Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４５４．１３３０，ｆｏｕｎｄ：４５４．１３２８（ｅｒｒｏｒ０．４４ｐｐｍ）．
【0097】
［製造例４：化合物（ａ１－４）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅをｐ－Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－４）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅをｐ－Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－４）を合成した。
【0098】
【化14】
【0099】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－４）についての測定結果を以下に示す。
【0100】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８ａｎｄ１４．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）．２．９０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．５ａｎｄ１３．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７６（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．８０（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．８９（ｓ，２Ｈ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．０ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．２８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎｔｏｌｙｌｇｒｏｕｐ），７．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎｔｏｌｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0101】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２１．５２（－ＣＨ３），３５．６５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．７０（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４７．０１（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２４（－ＯＣＨ３），１００．９２（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．９６（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．１９（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．００（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．４９（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２７．１２（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎｔｏｌｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．４４（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２９．６９（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎｔｏｌｙｌｇｒｏｕｐ），１３５．８３，１３６．８７，１３８．０５，１４３．４３，１４６．００，１４７．８２，１５８．１５．
【0102】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝４６２［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４３８［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２４ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４３８．１３８０７，ｆｏｕｎｄ：４３８．１３７８５（ｅｒｒｏｒ０．５０ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２４ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４３８．１３８０７，ｆｏｕｎｄ：４３８．１３７８５（ｅｒｒｏｒ０．５０ｐｐｍ）．
【0103】
［製造例５：化合物（ａ１－５）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－５）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－５）を合成した。
【0104】
【化15】
【0105】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－５）についての測定結果を以下に示す。
【0106】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１６（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．３，７．３ａｎｄ１４．８Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．９４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．０ａｎｄ１３．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７７（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．８０（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．４１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．８１（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．６ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０４（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．６ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ５ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８ａｎｄ８．３Ｈｚ，Ｈ６ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0107】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．５６（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．８５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４７．０４（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２６（－ＯＣＨ３），１００．９９（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．８６（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．２７（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．０９（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．４０（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２６．１３（Ｃ２ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．３７（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２９．０６（Ｃ６ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３１．１４（Ｃ５ｉｎ３，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３３．７５，１３５．５３，１３７．５０，１３７．７８，１３９．６２，１４６．１３，１４７．９０，１５８．２４．
【0108】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝５１６［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４９２［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２０Ｃｌ２ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４９２．０４４４７，ｆｏｕｎｄ：４９２．０４４２５（ｅｒｒｏｒ０．４５ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２０Ｃｌ２ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４９２．０４４４７，ｆｏｕｎｄ：４９２．０４４２５（ｅｒｒｏｒ０．４５ｐｐｍ）．
【0109】
［製造例６：化合物（ａ１－６）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－６）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－６）を合成した。
【0110】
【化16】
【0111】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－６）についての測定結果を以下に示す。
【0112】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０，７．３，ａｎｄ１５．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．９６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０ａｎｄ１３．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７７（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．９０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．３ａｎｄ２．８Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．８０（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ４ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0113】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．６４（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．８５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４７．０３（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２５（－ＯＣＨ３），１００．９７（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．８７（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．２５（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．０７（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．４１（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２３．２１（ｄ，１Ｃ，Ｊ＝２７０．６Ｈｚ），Ｃ４ｉｎ４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２６．２８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２７．５７（Ｃ６ｉｎ４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．３７（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３４．３７（ｑ，１Ｃ，Ｊ＝３３．０Ｈｚ，－（Ｃ６Ｈ４）ＣＦ３），１３５．５７，１３１７．７８，１４３．４７，１４６．１３，１４７．８９，１５８．２３．
【0114】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝５１６［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；４９２［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２１Ｆ３ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４９２．１０９８，ｆｏｕｎｄ：４９２．１０９５（ｅｒｒｏｒ０．６１ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２１Ｆ３ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４９２．１０９８，ｆｏｕｎｄ：４９２．１０９５（ｅｒｒｏｒ０．６１ｐｐｍ）．
【0115】
［製造例７：化合物（ａ１－７）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－７）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、（ａ１－７）を合成した。
【0116】
【化17】
【0117】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１６（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．１，６．９，ａｎｄ１４．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．９８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８ａｎｄ１３．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７７（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．７９（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３ａｎｄ１６．３Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．５６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．９０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．８ａｎｄ３．３Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．８０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０３（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．３ａｎｄ８．５Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．３２（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．２ａｎｄ９．３Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．９６（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０ａｎｄ９．０Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0118】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．５３（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．８５（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４６．９４（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２５（－ＯＣＨ３），１０１．０１（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．７９（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．２７（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．０３（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．３５（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２４．３７（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．２７（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．３２（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３５．４４，１３７．６０，１４５．５６，１４６．１１，１４７．８５，１４９．９６，１５８．２０．
【0119】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝４６９［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２１Ｎ２Ｏ７Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４６９．１０７５，ｆｏｕｎｄ：４６９．１０７２（ｅｒｒｏｒ０．６４ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２３Ｈ２１Ｎ２Ｏ７Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：４６９．１０７５，ｆｏｕｎｄ：４６９．１０７２（ｅｒｒｏｒ０．６４ｐｐｍ）．
【0120】
［製造例８：化合物（ａ１－８）の製造］
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｃｈｌｏｒｏ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－８）を合成した。
Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅを４－Ｃｈｌｏｒｏ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅに変更した以外は、製造例１と同様にして、化合物（ａ１－８）を合成した。
【0121】
【化18】
【0122】
１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＵＩＳ－ＭＳ、ＨＲＭＳによる、化合物（ａ１－８）についての測定結果を以下に示す。
【0123】
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．１７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０ａｎｄ１３．５Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），２．９４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３ａｎｄ１３．８Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），３．７７（ｓ，３Ｈ，－ＯＣＨ３），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，－ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－），５．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，－ＯＣＨ２Ｏ－），６．５９（ｓ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），６．８０（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５ａｎｄ９．５Ｈｚ，Ｈ３ａｎｄＨ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．０４（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．８ａｎｄ８．８Ｈｚ，Ｈ２ａｎｄＨ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），７．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０ａｎｄ８．０Ｈｚ，Ｈ６ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ２ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）．
【0124】
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３５．５２（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４１．８６（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），４６．９７（－ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ－），５５．２３（－ＯＣＨ３），１００．９９（－ＯＣＨ２Ｏ－），１０７．８０（Ｃ２ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１０８．２５（Ｃ５ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１１４．０３（Ｃ３ａｎｄＣ５ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２０．３５（Ｃ６ｉｎｐｉｐｅｒｏｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２１．９４（ｄ，１Ｃ，Ｊ＝２７１．８Ｈｚ，－ＣＦ３），１２６．３９（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｃ２ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ）１２６．４７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｃ３ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２８．３３（Ｃ２ａｎｄＣ６ｉｎ４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１２９．３１（ｑ，Ｊ＝３２．３Ｈｚ，Ｃ４ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３１．２６（Ｃ６ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３２．４１（Ｃ５ｉｎ３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｇｒｏｕｐ），１３１．２６，１３５．４４，１３７．７０，１３９．０５，１５８．１９．
【0125】
ＤＵＩＳ－ＭＳ：（ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ）；ｍ／ｚ＝５５０［Ｍ＋Ｎａ］＋，（ｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｄｅ）；５２６［Ｍ－Ｈ］－．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２０ＣｌＦ３ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：５２６．０７０８，ｆｏｕｎｄ：５２６．０７０６（ｅｒｒｏｒ０．３８ｐｐｍ）．
ＨＲＭＳ：（ＥＳＩｎｅｇａｔｉｖｅ）；ｍ／ｚｃａｌｃ’ｄｆｏｒＣ２４Ｈ２０ＣｌＦ３ＮＯ５Ｓ［Ｍ－Ｈ］－：５２６．０７０８，ｆｏｕｎｄ：５２６．０７０６（ｅｒｒｏｒ０．３８ｐｐｍ）．
【0126】
［比較例の化合物］
比較例の化合物として、化合物（ｂ－１）を用意した。化合物（ｂ－１）は、Ｋｏｙａｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．（Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492）において、α－マンノシダーゼ阻害剤として報告されたＡＲ５２５である。ＡＲ５２５は、Ｋｏｙａｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．において、α－マンノシダーゼ阻害剤として報告された化合物の中で、高いα－マンノシダーゼ阻害活性を示した化合物である。
比較例の化合物として、化合物（ｂ－１）を用意した。化合物（ｂ－１）は、Ｋｏｙａｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．（Bioorganic & Medicinal Chemistry, June 2020, Vol. 28, no. 11, 115492）において、α－マンノシダーゼ阻害剤として報告されたＡＲ５２５である。ＡＲ５２５は、Ｋｏｙａｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．において、α－マンノシダーゼ阻害剤として報告された化合物の中で、高いα－マンノシダーゼ阻害活性を示した化合物である。
【0127】
【化19】
【0128】
＜材料と方法＞
実験例では、以下の細胞及び試薬を用いた。
ヒト卵巣癌由来細胞として、ＯＶＣＡＲ－３（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ２１３５）を用いた。
細胞培養用ウシ胎児血清として、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｓｏｕｔｈ（ＦＢＳ，ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｓ１８１０－５００）を用いた。
抗生物質として、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）（富士フィルム和光純薬株式会社（以下、Ｗａｋｏ），１６８－２３１９１）を用いた。
抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５００ｍＬ，Ｒ８７５８）にＦＢＳを加えて作製した。
抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５００ｍＬ，Ｒ８７５８）に、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）を加えて作製した。得られた培地中の抗生物質の最終濃度は、ペニシリンＧが１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン硫酸塩が１００μｇ／ｍＬであった。
細胞剥離液（ＰＥＴ）は、１×ＰＢＳに０．５ｗ／ｖ％Ｔｒｙｐｓｉｎ－５．３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ・４ＮａＳｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔＰｈｅｎｏｌＲｅｄ（×１０）（Ｗａｋｏ，２０８－１７２５１）を添加して作製した。
実験例では、以下の細胞及び試薬を用いた。
ヒト卵巣癌由来細胞として、ＯＶＣＡＲ－３（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ２１３５）を用いた。
細胞培養用ウシ胎児血清として、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｓｏｕｔｈ（ＦＢＳ，ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｓ１８１０－５００）を用いた。
抗生物質として、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）（富士フィルム和光純薬株式会社（以下、Ｗａｋｏ），１６８－２３１９１）を用いた。
抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５００ｍＬ，Ｒ８７５８）にＦＢＳを加えて作製した。
抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５００ｍＬ，Ｒ８７５８）に、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）を加えて作製した。得られた培地中の抗生物質の最終濃度は、ペニシリンＧが１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン硫酸塩が１００μｇ／ｍＬであった。
細胞剥離液（ＰＥＴ）は、１×ＰＢＳに０．５ｗ／ｖ％Ｔｒｙｐｓｉｎ－５．３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ・４ＮａＳｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔＰｈｅｎｏｌＲｅｄ（×１０）（Ｗａｋｏ，２０８－１７２５１）を添加して作製した。
【0129】
細胞密度は、以下に示す方法により測定した。
細胞懸濁液１０μＬを分取し、パラフィルム上でトリパンブルー細胞染色液（ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅＳｔａｉｎ（０．４％）ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔ１０２８２）１０μＬと混和させた後、１０μＬ分取し細胞数カウント用スライド（ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０２８３）へ供し、カウンテス（ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭＩＩ自動セルカウンター，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＡＭＱＡＸ１０００）により、細胞数と細胞生存率を確認した。
細胞懸濁液１０μＬを分取し、パラフィルム上でトリパンブルー細胞染色液（ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅＳｔａｉｎ（０．４％）ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔ１０２８２）１０μＬと混和させた後、１０μＬ分取し細胞数カウント用スライド（ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０２８３）へ供し、カウンテス（ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭＩＩ自動セルカウンター，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＡＭＱＡＸ１０００）により、細胞数と細胞生存率を確認した。
【0130】
［実験例１］
（細胞毒性評価）
以下に示す手順により、単層培養ヒト卵巣がん由来細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞）を用いて、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）及び化合物（ｂ－１）の細胞毒性を評価した。
（細胞毒性評価）
以下に示す手順により、単層培養ヒト卵巣がん由来細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞）を用いて、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）及び化合物（ｂ－１）の細胞毒性を評価した。
【0131】
ＤＭＳＯを用いて、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）（それぞれ５ｍＭ）、化合物（ｂ－１）（５ｍＭ）を準備した。次いで、以下の手順により、ＯＶＣＡＲ－３細胞を９６ウェルプレートに播種した。
【0132】
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。２５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）２ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴ２ｍＬを加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体４ｍＬを１５ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した（ｓｏｆｔｂｒａｋｅを使用）。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５３０７２）の各ウェルへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０４個となるように、細胞懸濁液１００μＬを加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５３０７２）の各ウェルへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０４個となるように、細胞懸濁液１００μＬを加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
【0133】
準備した化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）（それぞれ５ｍＭ）、化合物（ｂ－１）（５ｍＭ）を、抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて希釈した。この時、ＫＩＦの最終濃度は１０μＭであり、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）及び化合物（ｂ－１）の最終濃度はそれぞれ５０μＭであった。
次いで、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）及び化合物（ｂ－１）の溶液を１００μＬずつ加えた。
次いで、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）及び化合物（ｂ－１）の溶液を１００μＬずつ加えた。
【0134】
次いで、細胞の呼吸量を測定するＷＳＴ－８法に基づき、以下に示す手順により、細胞毒性の評価を行った。細胞毒性評価にはＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８，Ｗａｋｏ，３４３－０７６２３）を用いた。
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した後、ＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１０μＬずつ加えた。ＣＯ２インキュベーター内に移して３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。そしてマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，２００９－２３１－００００４９６）で６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出することにより、細胞毒性を評価した。結果を表１に示す。
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した後、ＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１０μＬずつ加えた。ＣＯ２インキュベーター内に移して３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。そしてマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，２００９－２３１－００００４９６）で６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出することにより、細胞毒性を評価した。結果を表１に示す。
【0135】
【表1】
【0136】
化合物（ｂ－１）を細胞に曝露した後の細胞生存率は１．２％であった。化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）を細胞に２４時間曝露した後の細胞生存率は５２～１００％であった。化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）は、化合物（ｂ－１）よりも、細胞毒性が顕著に低いことが確認された。
【0137】
［実験例２］
（ＧＭ阻害活性評価）
以下の手順により、ＧＭＩ阻害剤であるキフネンシン（ＫＩＦ）及びデオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ）、ＧＭＩＩ阻害剤であるスワインソニン（ＳＷＡ）及びマンノスタチン（ＭａｎＡ）、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）を接触させた細胞について、蛍光標識コンカナバリン（Ｃｏｎ－Ａ）及び蛍光標識スノードロップレクチン（ＳＤＬ）を用いて、細胞におけるＨＭ型糖鎖の局在を観察した。
（ＧＭ阻害活性評価）
以下の手順により、ＧＭＩ阻害剤であるキフネンシン（ＫＩＦ）及びデオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ）、ＧＭＩＩ阻害剤であるスワインソニン（ＳＷＡ）及びマンノスタチン（ＭａｎＡ）、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）を接触させた細胞について、蛍光標識コンカナバリン（Ｃｏｎ－Ａ）及び蛍光標識スノードロップレクチン（ＳＤＬ）を用いて、細胞におけるＨＭ型糖鎖の局在を観察した。
【0138】
Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ ｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｃｏｎ－Ａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃ１１２５２）をＰＢＳに溶解させて、Ｃｏｎ－Ａ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ 溶液（２５μｇ／ｍＬ）を得た。５ｍｇ／ｍＬ ＳＤＬ ＦＩＴＣ溶液（ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＦＬ－１１８１）をＰＢＳで希釈して、ＳＤＬ ＦＩＴＣ溶液（２５μｇ／ｍＬ）を得た。
【0139】
ＯＶＣＡＲ－３細胞を７５ｃｍ２のフラスコで３－４日間培養した。フラスコ内の培地を抜き、３７度に温めた１×ＰＢＳ（－）６ｍＬで３回洗浄した。３７度に温めたＰＥＴ６ｍＬで細胞を速やかにはがした。３７度に温めた抗生物質不含ＲＰＭＩ培地を６ｍＬ加えた。細胞懸濁液を１５ｍＬ容チューブに移し、遠心（室温、３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。上清を除き、３７度に温めた抗生物質不含ＲＰＭＩ培地を１ｍＬ入れて懸濁し、カウンテスで懸濁液中の生細胞数を測定し、細胞密度を調整した。
６ウェルプレート（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製、ＳＩＡＬ０５１６）にポリリジンコートカバーガラス（松浪硝子工業株式会社、Ｃ１２１０）を１枚ずつ各ウェル入れた。次いで、６ウェルプレートへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が９．０×１０４個（ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように細胞懸濁液を１ｍＬずつ加えた。次いで、６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養した。
６ウェルプレート（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製、ＳＩＡＬ０５１６）にポリリジンコートカバーガラス（松浪硝子工業株式会社、Ｃ１２１０）を１枚ずつ各ウェル入れた。次いで、６ウェルプレートへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が９．０×１０４個（ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように細胞懸濁液を１ｍＬずつ加えた。次いで、６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養した。
【0140】
７２時間培養後、６ウェルプレートのウェル内の培地をアスピレーターで除去し、各ウェルに３７度に温めた抗生物質不含培地を１ｍＬずつ加えた。終濃度が１００μＭとなるように、ＫＩＦ，ＤＭＪ，ＳＷＡ又はＭａｎＡ溶液をそれぞれ各ウェルに添加した。また、終濃度が２５μＭとなるように、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）をそれぞれ各ウェルに添加した。
【0141】
次いで、ＣＯ２インキュベーター内で７２時間培養した後、ウェルの培地をアスピレーターで除去し、ＰＢＳで洗浄した。すべてのウェルのカバーガラスの細胞を培養した面を上にして、ＰＢＳ１ｍＬが入ったフラットシャーレ（ＡＳＯＮＥ、１－４５６４－０１、ＦＳ－３０、φ３２×１５ｍｍ）６枚に移した。シャーレに－２０℃に冷却したメタノール（Ｗａｋｏ、１３１－０１８２６）－アセトン（Ｗａｋｏ、０１６－００３４６）（１：１）混液１ｍＬを加え－２０℃で２０分間静置した。シャーレのメタノール－アセトン混液をパスツールピペットで除去し後、ＰＢＳで洗浄した。
【0142】
シャーレに２５μｇ／ｍＬ ＣｏｎＡ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８溶液、又は、２５μｇ／ｍＬ ＳＤＬ ＦＩＴＣを１ｍＬずつ加え、室温で１５分間静置した。次いで、シャーレ内の各溶液をアスピレーターで除去した後、ＰＢＳで洗浄した。
【0143】
封入剤（ｉｂｉｄｉＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ，Ｎｏ．５０００１）を１滴滴下したスライドガラス（松浪硝子工業株式会社、Ｓ０３１７）上に、カバーグラスの細胞播種面を下にして載せ、硬質トップコート（コージー本舗、ネイリスト、ＪＡＮ：４９７２９１５０６８２９０）を用いて、カバーガラスをスライドガラス上に固定し、５分間風乾した。
【0144】
共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８ ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ、Ｌｅｉｃａ社）を用いて、得られた蛍光染色細胞の蛍光観察を行った。結果を図１、２に示す。
【0145】
ネガティブコントロールであるＤＭＳＯ処理細胞のＣｏｎ－Ａ染色では、ゴルジ体が染色された。ＤＭＳＯ処理細胞のＳＤＬ染色では、ゴルジ体がわずかに染色された。
【0146】
ＧＭＩ阻害剤であるＫＩＦ及びＤＭＪ処理細胞のＣｏｎ－Ａ染色では、ゴルジ体に加えて、細胞質及び細胞表面の細胞全体が染色された。ＫＩＦ及びＤＭＪ処理細胞のＳＤＬ染色では、ゴルジ体に粒状感を伴った染色が確認された。
【0147】
ＧＭＩＩ阻害剤であるＳＷＡ及びＭａｎＡ処理細胞のＣｏｎ－Ａ染色では、核周辺に粒状感のある染色が確認され、細胞質及び細胞表面の細胞全体が染色された。
ＳＷＡ及びＭａｎＡ処理細胞のＳＤＬ染色では、ゴルジ体に加えて、細胞質を含め細胞全体に粒状感を伴う染色が確認された。
ＳＷＡ及びＭａｎＡ処理細胞のＳＤＬ染色では、ゴルジ体に加えて、細胞質を含め細胞全体に粒状感を伴う染色が確認された。
【0148】
化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）のいずれかを接触させた細胞のＣｏｎ－Ａ染色では、既知のＧＭＩ阻害剤と同様に、ゴルジ体に加えて、細胞質及び細胞表面の細胞全体が染色された。この結果は、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）がＧＭＩを阻害することを示唆している。
化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）のいずれかを接触させた細胞のＳＤＬ染色では、既知のＧＭＩ阻害剤を用いた場合よりも広範囲で染色が認められるか、あるいは、ＧＭＩＩ阻害剤を用いた場合と同様の染色が認められた。この結果は、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）がＧＭＩＩを阻害することを示唆している。
化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）のいずれかを接触させた細胞のＳＤＬ染色では、既知のＧＭＩ阻害剤を用いた場合よりも広範囲で染色が認められるか、あるいは、ＧＭＩＩ阻害剤を用いた場合と同様の染色が認められた。この結果は、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）がＧＭＩＩを阻害することを示唆している。
【0149】
［実験例３］
（スフェロイド崩壊活性評価）
以下に示す手順により、ＧＭＩ阻害剤であるＫＩＦ及びＤＭＪ、ＧＭＩＩ阻害剤であるＳＷＡ及びＭａｎＡ、並びに、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）について、スフェロイド（ＳＰＨ）の崩壊活性を評価した。
（スフェロイド崩壊活性評価）
以下に示す手順により、ＧＭＩ阻害剤であるＫＩＦ及びＤＭＪ、ＧＭＩＩ阻害剤であるＳＷＡ及びＭａｎＡ、並びに、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）について、スフェロイド（ＳＰＨ）の崩壊活性を評価した。
【0150】
まず、ＤＭＳＯを用いて、ＫＩＦ（２ｍＭ）、ＤＭＪ（２０ｍＭ）、ＳＷＡ（２０ｍＭ）、ＭａｎＡ（２０ｍＭ）、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）（それぞれ５ｍＭ）を準備した。
次いで、次の手順により、アガロース添加プレートを作製した。アガロース（ロンザ株式会社，５００７１）６０ｍｇを薬包紙に量り取り、安全キャビネット内で５０ｍＬ容チューブに加え、ＰＢＳ（－）８ｍＬを加えた。この５０ｍＬ容チューブを水の入った２５０ｍＬ容ビーカーに入れ、電子レンジで１０秒間加熱し、取り出して攪拌する操作をアガロースがＰＢＳに溶解し透明になるまで繰り返し、０．７５％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を作製した。その溶液を安全キャビネット内にてリザーバーに分注し、８ｃｈピペットで９６ウェルプレートへ５０μＬずつ加え、アガロースが固まるまで静置した。
次いで、次の手順により、アガロース添加プレートを作製した。アガロース（ロンザ株式会社，５００７１）６０ｍｇを薬包紙に量り取り、安全キャビネット内で５０ｍＬ容チューブに加え、ＰＢＳ（－）８ｍＬを加えた。この５０ｍＬ容チューブを水の入った２５０ｍＬ容ビーカーに入れ、電子レンジで１０秒間加熱し、取り出して攪拌する操作をアガロースがＰＢＳに溶解し透明になるまで繰り返し、０．７５％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を作製した。その溶液を安全キャビネット内にてリザーバーに分注し、８ｃｈピペットで９６ウェルプレートへ５０μＬずつ加え、アガロースが固まるまで静置した。
【0151】
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２５ｃｍ２または７５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。２５ｃｍ２または７５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）２ｍＬまたは６ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴ２ｍＬまたは６ｍＬを加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬまたは６ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体４ｍＬまたは１２ｍＬを１５ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５３０７２）の各ウェルへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が５．０×１０３個となるように、細胞懸濁液を１５ｍＬ容チューブへ調製した。
【0152】
準備したＫＩＦ（２ｍＭ）、ＤＭＪ（２０ｍＭ）、ＳＷＡ（２０ｍＭ）、ＭａｎＡ（２０ｍＭ）、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）（それぞれ５ｍＭ）、ネガティブコントロールのＤＭＳＯを４．５μＬずつ分取し、細胞懸濁液９００μＬに加え、転倒撹拌した。このとき、最終濃度はそれぞれ、ＫＩＦは１０μＭ、ＤＭＪ、ＳＷＡ及びＭａｎＡは１００μＭ、化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）は２５μＭであった。
化合物を添加した細胞懸濁液をアガロース添加プレートへ１５０μＬずつ加えた。
その後ＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、１、３日間培養後の細胞の形態を倒立顕微鏡により観察し、その写真を撮影した。さらに、培養３日目のスフェロイドの倒立顕微鏡による観察および写真撮影後、各ウェルの培地をマイクロピペット（ＮＩＣＨＩＲＹＯ，ＮｉｃｈｉｐｅｔＰｒｅｍｉｕｍＬＴ，００－ＮＬＴ－２００）のメモリを１００μＬにあわせ、３秒に１回程度の頻度で優しく１０回ピペッティングを行い、５分間静置した。その後、倒立顕微鏡により細胞の形態を観察し、その写真を撮影した。
化合物を添加した細胞懸濁液をアガロース添加プレートへ１５０μＬずつ加えた。
その後ＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、１、３日間培養後の細胞の形態を倒立顕微鏡により観察し、その写真を撮影した。さらに、培養３日目のスフェロイドの倒立顕微鏡による観察および写真撮影後、各ウェルの培地をマイクロピペット（ＮＩＣＨＩＲＹＯ，ＮｉｃｈｉｐｅｔＰｒｅｍｉｕｍＬＴ，００－ＮＬＴ－２００）のメモリを１００μＬにあわせ、３秒に１回程度の頻度で優しく１０回ピペッティングを行い、５分間静置した。その後、倒立顕微鏡により細胞の形態を観察し、その写真を撮影した。
【0153】
結果を図３に示す。図３中、ＳＰＨの崩壊活性は、ＫＩＦを基準として崩壊度の度合いを＋で表した。崩壊が確認できなかった阻害剤は「ｎｏｎｅ」、ＫＩＦと同程度の崩壊を示した阻害剤は「＋」、ＫＩＦよりも崩壊し、ＳＰＨの周囲に細胞が散らばっているのを確認できた阻害剤は「＋＋」、細胞接着が弱まっており、ＳＰＨの原型をとどめていなかった阻害剤は「＋＋＋」で表した。図３中、「ＰＴ後」は、培養３日目のスフェロイドをピペッティングした後の観察結果を意味する。
【0154】
その結果、ＧＭＩ阻害剤であるＫＩＦ及びＤＭＪではＳＰＨ崩壊活性が認められたが、ＧＭＩＩ阻害剤であるＳＷＡ及びＭａｎＡではＳＰＨ崩壊活性が認められなかった。化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）はＫＩＦよりも強いＳＰＨ崩壊活性を示すことが確認され、化合物（ａ１－８）はＫＩＦと同程度のＳＰＨ崩壊活性を示すことが確認された。化合物（ａ１－１）～（ａ１－８）は、ＧＭＩを阻害することにより、ＳＰＨを崩壊させることが示唆された。
【0155】
［実験例４］
（薬剤耐性の回避の評価）
以下に示す手順により、単層培養ＯＶＣＡＲ－３細胞とＯＶＣＡＲ－３細胞オルガノイドについて、抗癌剤であるドキソルビシン（ＤＯＸ）の効果を比較した。さらに、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）について、細胞オルガノイドにおける薬剤耐性の回避を評価した。
（薬剤耐性の回避の評価）
以下に示す手順により、単層培養ＯＶＣＡＲ－３細胞とＯＶＣＡＲ－３細胞オルガノイドについて、抗癌剤であるドキソルビシン（ＤＯＸ）の効果を比較した。さらに、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）について、細胞オルガノイドにおける薬剤耐性の回避を評価した。
【0156】
単層培養ＯＶＣＡＲ－３細胞に対する、ＤＯＸの効果は、次のように評価した。
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。２５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）２ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴ２ｍＬを加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体４ｍＬを１５ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５３０７２）の各ウェルへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０４個となるように、細胞懸濁液１００μＬを加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。２５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）２ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴ２ｍＬを加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体４ｍＬを１５ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５３０７２）の各ウェルへ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０４個となるように、細胞懸濁液１００μＬを加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
【0157】
ＤＭＳＯを用いて、ＤＯＸ溶液（０．０２，０．１，０．２，１，２ｍＭ）を準備した。準備した各濃度のＤＯＸ溶液を抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０で希釈した。ＤＯＸの最終濃度は、０．１，０．５，１，５，１０μＭであった。
次いで、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を１００μＬずつ加えた。
次いで、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を１００μＬずつ加えた。
【0158】
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養した後、ＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１０μＬずつ加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。そしてマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，２００９－２３１－００００４９６）で６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出した。
【0159】
算出した細胞生存率から、単層培養ＯＶＣＡＲ－３細胞におけるＤＯＸの５０％ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＣＣ５０）は０．３３μＭであることが確認された。
【0160】
以下に示す手順により、ＯＶＣＡＲ－３細胞オルガノイドを作製した。
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２個の７５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。７５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）６ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴを６ｍＬ加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地６ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体２４ｍＬを５０ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。Ｃｅｌｌｂｅｄ９６ウェルプレート（日本バイリーン株式会社，ＣＢ－９６ＷＴ１）へ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０５個（ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように細胞懸濁液を２００μＬずつ加えた。
ＯＶＣＡＲ－３細胞を２個の７５ｃｍ２フラスコで７日間培養した。７５ｃｍ２フラスコから抗生物質含有１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地をアスピレーターで除去した後、３７℃に温めたＰＢＳ（－）６ｍＬで３回洗浄した。そこへ、３７℃に温めたＰＥＴを６ｍＬ加え、５分静置し、軽く振盪し細胞を剥離した。得られた液体に抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地６ｍＬを加え、ＰＥＴ中のトリプシンを失活させた。得られた液体２４ｍＬを５０ｍＬ容チューブに全量移し、３，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離した。その後、上清を除去し、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを加えて懸濁し、細胞懸濁液とした。
得られた細胞懸濁液の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をカウンテスにより測定し、細胞密度を調整した。Ｃｅｌｌｂｅｄ９６ウェルプレート（日本バイリーン株式会社，ＣＢ－９６ＷＴ１）へ、１ウェルあたりＯＶＣＡＲ－３細胞が１．０×１０５個（ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように細胞懸濁液を２００μＬずつ加えた。
【0161】
次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日おき（培養２・４日目）に培地交換をしつつ６日間培養し、ＯＶＣＡＲ－３細胞オルガノイドを作製した。なお、培地交換の際は、ウェルの底面に接着されているＣｅｌｌｂｅｄをアスピレーターまたはピペットのチップの先で傷つけないようにチップの先をウェルの壁面に沿わせ、底面のＣｅｌｌｂｅｄ内の溶液を吸い過ぎ乾燥しないようにしながら、吸引力の弱い卓上アスピレーター（ＢＩＯＳＡＮＬＴＤ．，ＢＳ－０４０１０８－ＡＡＫ）にて培地を除去した後に培地を添加した。
【0162】
ＤＭＳＯを用いて、ＤＯＸ溶液（０．０２，０．１，０．２，１，２ｍＭ）を準備した。準備した各濃度のＤＯＸ溶液を抗生物質不含１０％ＦＢＳで希釈した。ＤＯＸの最終濃度は、０．１，０．５，１，５，１０μＭであった。
培養開始から６日目に、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を２００μＬずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間、培養した。
培養開始から６日目に、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を２００μＬずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間、培養した。
【0163】
ＣＣＫ－８溶液と抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を混合し、ＷＳＴ－８溶液（ＣＣＫ－８溶液：抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地＝１：９）を調製した。ＤＯＸ投与から７２時間後に、アスピレーターで９６ウェルプレートの各ウェル内の培地を除去し、ＷＳＴ－８溶液を各ウェルに２００μＬずつ加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。
培養上清を９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２６０８６０）へ１００μＬずつ分取し、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，２００９－２３１－００００４９６）で６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出した。
培養上清を９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２６０８６０）へ１００μＬずつ分取し、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，２００９－２３１－００００４９６）で６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出した。
【0164】
算出した細胞生存率から、ＯＶＣＡＲ－３細胞オルガノイドにおける、ＤＯＸのＣＣ５０は４．５３μＭであることが確認された。
【0165】
ＤＭＳＯを用いて、ＤＯＸ溶液（０．０４，０．２，０．４，２，４ｍＭ）、ＫＩＦ（４ｍＭ）、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）（１０ｍＭ）を準備し、これらを抗生物質不含１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０で希釈した。
各溶液中、ＤＯＸの最終濃度は、０．１，０．５，１，５，１０μＭであった。各溶液は、ＫＩＦ（最終濃度１０μＭ）、あるいは、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）（最終濃度２５μＭ）のいずれかを含有するように調製した。
培養開始から６日目に、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を２００μＬずつ加えた。３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下で７２時間、培養した。
各溶液中、ＤＯＸの最終濃度は、０．１，０．５，１，５，１０μＭであった。各溶液は、ＫＩＦ（最終濃度１０μＭ）、あるいは、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）（最終濃度２５μＭ）のいずれかを含有するように調製した。
培養開始から６日目に、９６ウェルプレートの各ウェル内の培地をアスピレーターで除去した後、各ウェルに、希釈した各ＤＯＸ溶液を２００μＬずつ加えた。３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下で７２時間、培養した。
【0166】
ＤＯＸ並びにＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）の投与から７２時間後に、アスピレーターで９６ウェルプレートの各ウェル内の培地を除去し、ＷＳＴ－８溶液を各ウェルに２００μＬずつ加えた。次いで、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内に移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。
培養上清を９６ウェルプレートへ１００μＬずつ分取し、マイクロプレートリーダーで６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出した。さらに、抗癌剤ＤＯＸの削減率を以下の式により算出した。結果を表２に示す。
（抗癌剤ＤＯＸの削減率）＝１００－（ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与した場合のＣＣ５０）／（ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与しない場合のＣＣ５０）
ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与しない場合のＣＣ５０は、４．５３μＭである。
培養上清を９６ウェルプレートへ１００μＬずつ分取し、マイクロプレートリーダーで６５０ｎｍの吸光度をリファレンス波長とし、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定値に基づき、細胞生存率を算出した。さらに、抗癌剤ＤＯＸの削減率を以下の式により算出した。結果を表２に示す。
（抗癌剤ＤＯＸの削減率）＝１００－（ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与した場合のＣＣ５０）／（ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与しない場合のＣＣ５０）
ＫＩＦ又は化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を投与しない場合のＣＣ５０は、４．５３μＭである。
【0167】
【表2】
【0168】
化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を用いた場合、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を用いない場合に比べて、ＣＣ５０が低減できることが明らかになった。また、化合物（ａ１－１）～（ａ１－７）を用いた場合、ＤＯＸの使用量を２３～５７％削減しても、同等の効果が得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0169】
本発明によれば、腫瘍細胞同士の接着を抑制でき、細胞毒性が低減された化合物、その化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、腫瘍崩壊剤、及び、その腫瘍崩壊剤を含む医薬組成物を提供することができる。
本発明は、癌の治療に好適に利用可能である。
本発明は、癌の治療に好適に利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
