特開 2024-159322 破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法および破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024159322

(43)【公開日】2024-11-08

(54)【発明の名称】破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法および破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/60 20060101AFI20241031BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20241031BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20241031BHJP

   A23L 17/20 20160101ALI20241031BHJP

【ＦＩ】

A61K35/60

A61P19/00

A61P19/10

A23L33/10

A23L17/20

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023075245

(22)【出願日】2023-04-28

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年７月２２日、第３５回日本動物細胞工学会２０２２年度大会のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａａｃｔ．ｏｒｇ／ｊａａｃｔ２０２２／）、において公開

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年７月２６日、第３５回日本動物細胞工学会２０２２年度大会、において公開

(71)【出願人】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(71)【出願人】

【識別番号】590006398

【氏名又は名称】マルトモ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100127579

【弁理士】

【氏名又は名称】平野 泰弘

(74)【代理人】

【識別番号】100203301

【弁理士】

【氏名又は名称】都築 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】菅原 卓也

(72)【発明者】

【氏名】西 甲介

(72)【発明者】

【氏名】石田 萌子

(72)【発明者】

【氏名】松本 淳一

(72)【発明者】

【氏名】土居 幹治

【テーマコード（参考）】

4B018

4B042

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD74

4B018ME05

4B018ME14

4B018MF01

4B042AC04

4B042AD39

4B042AE08

4B042AG27

4B042AH01

4B042AK20

4B042AP07

4B042AP15

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB29

4C087CA06

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZA97

4C087ZC52

(57)【要約】

【課題】日常的に摂取する食品を用いて、安全で簡便な破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法を提供する。
【解決手段】破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法として、煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程とを含む。抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程は、透析工程および限外ろ過工程の少なくとも一方により実施される。分子量１０ｋＤａを超える成分が抽出水から除去されることが好ましい。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、
を含むことを特長とする、破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法。

【請求項2】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、透析工程であり、前記分離膜が、透析膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、請求項１に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法。

【請求項3】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、限外ろ過工程であり、前記分離膜が、限外ろ過膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、請求項１に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法。

【請求項4】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、
を含むことを特長とする、破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法。

【請求項5】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、透析工程であり、前記分離膜が、透析膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、請求項４に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法。

【請求項6】

煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、限外ろ過工程であり、前記分離膜が、限外ろ過膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、請求項４に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法および破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人間や動物の骨は単なる無機物の造形物ではなく、細胞に誘導されて古い骨の成分が新しい骨の成分と置き換わる新陳代謝が起きて、日々変化していく。
具体的には、骨の古い部分が破骨細胞に吸収されて消滅する一方、消滅した部分に骨芽細胞が新たな骨を形成する。この様な骨の吸収と再生を細胞誘導により常時行うことにより、骨の新陳代謝が可能になる。この様な骨の新陳代謝は、通常、骨リモデリングと呼ばれる。

【0003】

また破骨細胞の機能発現メカニズムについての研究も進んでいて、破骨前駆細胞に対して、ＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand の略称。タンパク質の一種）が分化誘導因子として機能することが知られている。
破骨前駆細胞とＲＡＮＫＬが融合することにより、破骨細胞の分化が促進される。

【0004】

上記の破骨前駆細胞の分化促進を背景に、例えば、高齢者の加齢による体調の変化等により、骨に対する破骨細胞と骨芽細胞との活動の連携関係が乱れる場合がある。
具体的には、破骨細胞の活動はそのままでも、骨芽細胞の活動が低下すると、時間と共に骨の成分が破骨細胞により吸収されるため、骨密度の低下につながる。骨密度が低下する骨粗鬆症になれば、骨が折れやすくなる等、日常生活に影響が生じる。
仮に破骨細胞の分化を抑制する新薬が開発されたとしても、生体内反応は複雑に関連しあっているため、他の生体内反応に不具合が生じ、副作用が現れることも懸念される。

【0005】

この様な骨密度低下の問題に対応する先行技術が存在する。
例えば、先行技術として、４－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｄ－グルコン酸の一般式で表されるマルトビオン酸、その塩類およびそのラクトンからなる群から選択される少なくとも１つ以上を含み、かつカルシウム成分を含む骨強化促進用抽出物の製造方法が提案されている（特許文献１）。
この先行技術によれば、カルシウム成分として、煮干しが一例として取り上げられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１６－１１７７５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかし、上記の先行技術では、カルシウム成分として煮干し以外にも多数の食品が列挙されていて、どれを摂取すれば、骨の強化がより促進されるのかが分かりにくい。
また上記の先行技術では、煮干しについては骨の強化としてカルシウム成分の供給に着眼点があり、煮干しについてカルシウム成分の供給元以外について何も開示されていない。

【0008】

本発明の目的は、日常的に摂取する食品を用いて、安全で簡便な破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法および破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の課題を解決すべく、本発明者らが鋭意検討した結果、煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程を含む、破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法が、本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち本発明は、
［１］煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、
を含むことを特長とする、破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法を提供するものである。

【0011】

また本発明の一つは、
［２］煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、透析工程であり、前記分離膜が、透析膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、上記［１］に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法を提供するものである。

【0012】

また本発明の一つは、
［３］煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、限外ろ過工程であり、前記分離膜が、限外ろ過膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、上記［１］に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法を提供するものである。

【0013】

また本発明は、
［４］煮干しを液状の水により抽出する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、
を含むことを特長とする、破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法を提供するものである。

【0014】

また本発明の一つは、
［５］煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、透析工程であり、前記分離膜が、透析膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、上記［４］に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法を提供するものである。

【0015】

［６］煮干しを液状の水により抽出する工程と、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程と、前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程と、を含み、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、限外ろ過工程であり、前記分離膜が、限外ろ過膜であり、
前記抽出された水に含まれる成分を分離膜により分離する工程が、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含む、上記［５］に記載の破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0016】

本発明の破骨細胞分化抑制抽出物の製造方法によれば、日常的に摂取する食品を用いて、安全で簡便な破骨細胞分化抑制抽出物および破骨細胞分化抑制抽出物の分離方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、サンプル１を用いた細胞毒性評価試験結果のグラフである。

【図2】図２は、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を指標とした破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。

【図3】図３は、煮干し乾燥粉末を沸騰水と冷水によりそれぞれ抽出した場合の破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。

【図4】図４は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図5】図５は、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図6】図６は、８℃の水で煮干し粉末を抽出した後に、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図7】図７は、１００℃の沸騰水で１０分間煮干し粉末を抽出した後に、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図8】図８は、分画分子量１４ｋＤａの透析膜を使用した場合の破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。

【図9】図９は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図10】図１０は、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図11】図１１は、実施例１の場合で、透析を実施せず、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図12】図１２は、実施例１の場合で透析を実施して、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図13】図１３は、平均分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜を使用した場合の破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。

【図14】図１４は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図15】図１５は、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図16】図１６は、実施例２の場合で、限外ろ過を実施せず、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図17】図１７は、実施例２の場合で限外ろ過で濃縮した成分を用い、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図18】図１８は、実施例２の場合で限外ろ過を実施し、高分子量成分を除去した成分について、分化誘導剤の刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。

【図19】図１９は、煮干し水抽出物を用いた添加時期と効果の関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

最初に本発明に使用する煮干しについて説明する。
本発明に使用する煮干しの原料に特に限定はないが、例えば、カタクチイワシ、マイワシ、ウルメイワシ、キビナゴ、アジ、サバ、アゴ等の一種もしくは二種以上の原料魚が挙げられる。
前記原料魚を用いて煮干しを製造する方法も、公知の方法を用いることができる。例えば、原料魚をそのまま、または、頭部の切断除去、内蔵の分離除去等の工程を経て得られた加工魚を乾燥させる。
そのままの原料魚または加工魚を乾燥させる前に、加熱することもできる。
加熱の方法は、温水で加熱する方法、加熱オーブン内で加熱する方法、マイクロ波・赤外線等の非接触手段を用いて加熱する方法、蒸気で加熱する方法等の一種もしくは二種以上を挙げることができる。

【0019】

そのままの原料魚または加工魚を乾燥させる方法に限定はないが、例えば、天日干しにする方法、加熱オーブン内で温風を循環させる方法、加熱オーブン内で加熱しながら減圧する方法、マイクロ波・赤外線等の非接触手段により加熱する方法、マイクロ波・赤外線等の非接触手段により加熱しながら内部空気を循環させるする方法等の一種もしくは二種以上を挙げることができる。
なお、煮干しの製品劣化を防止する目的で、煮干しの製造工程においては、空気以外の、窒素、二酸化炭素等の気体を使用することもできる。

【0020】

また煮干しの製造の際には、塩、旨味調味料等の添加成分を適宜選択して添加することもできる。

【0021】

本発明に使用する煮干しは、市販品を適宜選択して使用することができるが、例えば、原料魚として、カタクチイワシ、マイワシ、ウルメイワシ等のイワシ類を用いることが好ましく、カタクチイワシであればより好ましい。

【0022】

また本発明に使用する煮干しは、５０ｇ当たりのエネルギーが１００～２００ｋｃａｌの範囲であれば好ましい。またタンパク質が２０～４０ｇの範囲であればより好ましい。

【0023】

本発明に使用する煮干しは、抽出効率を上げるため、使用前に粉砕しておくことが好ましい。

【0024】

次に本発明で採用される煮干しを液状の水により抽出する工程について説明する。
前記煮干しを液状の水により抽出する工程で「液状の水」との表現を採用したのは、抽出に使用する水の温度の上限が常圧下の１００℃に限定されず、加圧下に１００℃を超える温度も使用できる趣旨である。
煮干しを液状の水により抽出する温度は、５～１２５℃の範囲であれば好ましい。
また抽出時間が、５分～３０分の範囲であれば好ましい。

【0025】

本発明に使用する水は、純水に限定されず、例えば、上水、工業用水、海水等の一種もしくは二種以上を使用できる。また必要に応じて、例えばエタノール等の水以外の液体、塩、調味料等の添加剤を併用することもできる。

【0026】

煮干しを液状の水により抽出する際には、水と煮干しとを接触させた後、両者を撹拌することが好ましい。撹拌方法としては、例えば、撹拌翼により回転させる方法、容器自体を回転させる方法、容器内部に水蒸気を吹き込む方法等の一種もしくは二種以上を採用できる。

【0027】

次に、煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する工程について説明する。
煮干しと液状の水との懸濁液から抽出水を分離する方法としては、例えば、前記懸濁液を静置して、上澄み液を分離する方法、前記懸濁液を回転させて遠心分離により分離する方法、ろ布、ろ紙等のろ過部材を用いてろ過する方法等の一種もしくは二種以上を採用できる。
上記の方法により、抽出水を分離することができる。

【0028】

次に、前記抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程について説明する。
前記抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程としては、例えば、具体的には、透析工程、限外ろ過工程等の少なくとも一方を挙げることができる。
また本発明に使用する分離膜としては、例えば、透析膜および限外ろ過膜の少なくとも一方を使用することができる。
例えば、前記抽出水を、分離膜を介して水と接触させればよい。
前記抽出液と水とを接触させる方法としては、例えば、分離膜で前記抽出液を包んだ状態で水に浸漬させる方法、分離膜で水を包んだ状態で前記抽出液に浸漬させる方法、分離膜で区画された容器内部の一方に前記抽出液を入れ、他方に水を入れて両者を分離膜を介して接触させる方法、分離膜を筒状に成形し、内部に前記抽出液を移動させつつ、外部を水に浸漬する方法等を挙げることができる。これらの方法は一種もしくは二種以上を適宜選択して採用することができる。

【0029】

透析工程については、例えば、透析しようとする分離膜の内の液量に対し、５００～２０００倍量の外液（水）に対して、３～５時間透析する。
加えて、同量の外液を交換してさらに６～２４時間、好ましくは８～１４時間透析する。
透析工程は、４～６℃の冷蔵庫内で行うことが好ましい。
透析工程を常圧で行う場合には、分離膜は、透析膜を使用することが好ましい。

【0030】

前記抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程は、例えば、上記の透析工程の場合で、必要に応じて前記抽出液に対して圧力を加えることができる。加える圧力は分離膜の耐圧や分離効率を顧慮して適宜設定される。
圧力を加えてを実施する工程は、通常、限外ろ過工程と呼ばれる。
限外ろ過を実施する際の圧力は、使用する装置やサンプルの量により適宜設定されるが、例えば、０．１～１ＭＰａの範囲である。
限外ろ過に使用する分離膜は、例えば、市販品の限外ろ過膜を適宜選択して使用することができる。

【0031】

本発明では、前記抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程は、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含むことが好ましい。
本発明に使用する分離膜の素材としては、分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去するものであれば好ましく、市販されているものを適宜選択して使用することができる。
また、本発明に使用する分離膜は分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する能力をもてばよく、すべての分子量１４ｋＤａを超える成分を抽出水から除去できなくてもよい。
本発明に使用する分離膜は分子量１４ｋＤａを超える成分を５０％以上除去できるものが好ましく、８０％以上除去できるものであればより好ましい。

【0032】

また本発明では、前記抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程は、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程を含むことが好ましい。
本発明に使用する分離膜の素材としては、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去するものであれば好ましく、市販されているものを適宜選択して使用することができる。また、本発明に使用する分離膜は分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する能力をもてばよく、すべての分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去できなくてもよい。
本発明に使用する分離膜は分子量１０ｋＤａを超える成分を５０％以上除去できるものがより好ましく、８０％以上除去できるものであればさらに好ましい。

【0033】

本発明では、分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程は、圧力を加えることが好ましい。
分子量１０ｋＤａを超える成分を抽出水から除去する工程は、限外ろ過工程であれば、より好ましい。
限外ろ過工程に使用する分離膜は、限外ろ過膜であれば好ましい。

【0034】

次に、分離後の抽出水から水分を蒸発させる工程について説明する。
抽出水に含まれる成分を分離膜により分離する工程後に、水分を蒸発させる方法としては、例えば、分離後の抽出水を加温または沸騰させ、水分を蒸発させる方法、分離後の抽出水を減圧下に加熱する方法、分離後の抽出水を容器に入れ、加熱オーブンで内部空気を循環させながら加熱する方法、分離後の抽出水を容器に入れて天日干しにする方法、分離後の抽出水を凍結乾燥する方法等を挙 げることができる。これらの方法は一種もしくは二種以上を適宜選択して採用することができる。
分離後の抽出水から水分を蒸発させる方法は、凍結乾燥を含むことが好ましい。凍結乾燥の際には、分離後の抽出水を凍らせた後に、凍った状態の分離後の抽出水を装置に入れ、装置内部を減圧する。
凍結乾燥を実施する際の温度はマイナス１９６℃～０℃の範囲であることが好ましい。
また圧力は５Ｔｏｒｒ～７００Ｔｏｒｒの範囲であることがこのましい。また凍結乾燥の時間は３０分間～２４時間の範囲であることが好ましい。

【0035】

上記の工程により、破骨細胞分化抑制抽出物を製造でき、破骨細胞分化抑制抽出物を煮干しから分離できる。

【0036】

次に実施例により、本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の内容に限定されるものではない。

【0037】

［予備実験１］
市販の煮干し乾燥粉末（マルトモ社製）２．０ｇを用いて、全体で０．１ｇ／ｍＬとなるように蒸留水に懸濁させた。次に温度を８℃に保ち、２４時間撹拌抽出した。次に遠心分離により上清を回収した。この上清の温度を－８０℃に下げて凍結し、４８時間凍結乾燥を実施し、灰色の粉末状の乾燥抽出物１を得た。
次に、この乾燥抽出物をα－ＭＥＭ培地（シグマ社製）に、２５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、フィルター滅菌したものをサンプル１とした。フィルターは、ザルトリウス社製（ミニザルト０．２２ μｍ）を使用した。

【0038】

次に破骨前駆細胞として、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞（American Type Culture Collectionの米国生物資源バンクより入手）を用い、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（シグマ社製）添加したα－ＭＥＭ培地（シグマ社製）で、温度３７℃、湿度１００％で２日間前培養した後、破骨細胞への分化を誘導するためＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand：富士フイルム和光社製）を添加した１０％ＦＢＳ-α－ＭＥＭ培地で、温度３７℃、湿度１００％で５日間培養した。これをサンプル２とした。

【0039】

次に生細胞数を測定し、細胞増殖の誘導または阻害を研究するための比色アッセイキットとして、ＷＳＴ－８（ナカライテスク社製）を使用し、細胞毒性を測定した。
マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を受けて破骨細胞へと分化誘導されると、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を高発現する。この特性を利用しＴＲＡＰの発現を指標として、破骨細胞分化抑制効果を測定した。

【0040】

サンプル１を９６穴培養プレート（ベクトンデッキンソン社製）の各穴に５０ μＬずつ添加した。ブランンクとコントロールにα－ＭＥＭ培地を５０μＬ加えた。その後、２０% ＦＢＳ‐α‐ＭＥＭ培地を用いてサンプル２の細胞を１．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したものをブランンクの穴に５０μＬずつ加えた。残りのサンプル２の細胞懸濁液にＲＡＮＫＬを終濃度１５０ ｎｇ／ｍＬになるように加え良く混和した後、残りの穴に５０μＬずつ播種した。５日間培養した後、９６穴プレート内の培地を除去し、TRAP staining reagentを５０μＬずつ各穴に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。

【0041】

４時間後、上清を除去し、１００ μＬの蒸留水で洗浄した。各穴に２００ μＬずつ蒸留水を添加して染色を終了し、細胞の観察および写真撮影を行った。その後、各穴に１００ μＬのＤＭＳＯ（シグマ社製）を加え、１５分振とうして色素を溶出させた。１５分後、ｉＭＡＲＫマイクロプレートリーダー（バイオラド社製）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。

【0042】

なお、実験に使用したTRAP staining reagentは次の通りである。
４ｍＬのTRAP bufferに２０Ｌの２% naphthol AS-MX phosphate溶液（シグマ社製）と４０ μＬの６％ Fast Red Violet LB salt溶液（シグマ社製）を加えたものである。以下の場合も同様である。

【0043】

サンプル１の培地への添加濃度は、培地中終濃度で３．１ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬになるようにそれぞれ調製した。
実験にはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ実験法（アプライドバイオシステムズ社製、ＳｔｅｏＯｎｅＰｌｕｓ）を採用した。結果を下記の図１および図２に示す。

【0044】

図１は、サンプル１を用いた細胞毒性評価試験結果のグラフである。
細胞毒性評価試験には、市販の細胞毒性アッセイキット（Cell Counting Kit-8、同仁化学研究所社）を使用した。
図１のグラフでは、縦軸が、細胞の相対的な生存率（％）を示し、横軸が、サンプル１の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
図１の参照符号１は、サンプル１の培地への添加濃度であり、培地中終濃度を基準に０．８ｍｇ／ｍＬであることを示す。同様に、参照符号２は１．６ｍｇ／ｍＬ、参照符号３は３．１ｍｇ／ｍＬを示す。
参照符号４は、比較参照のためのサンプル１を培地に添加しない場合を示す。
図１に示される様に、サンプル１の濃度が３．１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度では毒性を示さないことが確認された。

【0045】

図２は、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を指標とした破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。
図２のグラフでは、縦軸が、破骨前駆細胞の相対的な分化率（％）を示し、横軸が、サンプル１の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
図２における参照符号１～４は、図１の場合と同様である。図２の参照符号５は、比較参照用のためのサンプル１を使用しなかった場合の分化誘導前のＲＡＷ２６４細胞の場合を示す。
図２に示される様に、サンプル１は分化を有意に阻害することが確認された。

【0046】

［予備実験２］
上記の予備実験１の場合で、市販の煮干し乾燥粉末を用いた液体の水による抽出工程について、水の温度を常圧沸騰の１００℃とし、１００℃の温度に達してから１０分間抽出操作を行った。
結果を図３に示す。

【0047】

図３は、煮干し乾燥粉末を沸騰水（１００℃）と冷水（８℃）により抽出した場合の破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を指標とした破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。
図３の参照符号６は、煮干し乾燥粉末を冷水で抽出した場合で、サンプル１の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図３の参照符号７は、煮干し乾燥粉末を冷水で抽出した場合で、サンプル１の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図３の参照符号８は、煮干し乾燥粉末を沸騰水で抽出した場合で、サンプル１の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図３の参照符号９は、煮干し乾燥粉末を沸騰水で抽出した場合で、サンプル１の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図３の参照符号１０は、サンプル１を添加しなかった場合を示す。
図３の参照符号１１は、比較参照用のためのサンプル１を使用しなかった場合の分化誘導前のＲＡＷ２６４細胞の場合を示す。

【0048】

図４は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。また図５は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
分化が進むと、色の濃い領域が顕微鏡写真に現れる。

【0049】

図４も図５も、比較参照のためのものであり、煮干しに由来する成分は添加されていない。
また図６は、予備実験１に従い、８℃の水で煮干し粉末を抽出した後に、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
また図７は、予備実験２に従い、１００℃の沸騰水で１０分間煮干し粉末を抽出した後に、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
図６および図７から明らかな様に、煮干し乾燥粉末に含まれる活性物質は、熱に安定であることが示された。

【実施例0050】

２．０ｇの煮干し乾燥粉末（マルトモ社製）を０．１ｇ／ｍＬとなるように蒸留水に懸濁し、８℃で２４時間攪拌抽出した。抽出液を回転数２０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。得られた上清を分画分子量１４ｋＤａの透析膜（富士フイルム和光社製）に内包し、温度４℃、２０時間の条件で蒸留水５Ｌに浸漬し、低分子量成分を除去した。
次に、この透析液の温度を‐８０℃に下げて凍結させ、４８時間凍結乾燥を実施し、灰色の粉末状の乾燥抽出物２を得た。

【0051】

次に、この乾燥抽出物２をα－ＭＥＭ培地（シグマ社製）に、２５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、フィルター滅菌したものをサンプル３とした。フィルターは、ザルトリウス社製（ミニザルト０．２２ μｍ）を使用した。

【0052】

マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を受けて破骨細胞へと分化誘導されると、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を高発現する。この特性を利用しＴＲＡＰの発現を指標として、破骨細胞分化抑制効果を測定した。

【0053】

サンプル３を９６穴培養プレート（ベクトンデッキンソン社製）の各穴に５０ μＬずつ添加した。ブランンクとコントロールにα-ＭＥＭ培地を５０ μＬ加えた。その後、２０% ＦＢＳ-ＭＥＭ-αを用いて細胞を１．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したものをブランンクの穴に５０ μＬずつ加えた。残りの細胞懸濁液にＲＡＮＫＬを終濃度１５０ ｎｇ／ｍＬになるように加え良く混和した後、残りの穴に５０ μＬずつ播種した。５日間培養した後、９６穴プレート内の培地を除去し、TRAP staining reagentを５０ μＬずつ各穴に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。後、上清を除去し、１００ μＬの蒸留水で洗浄した。各穴に２００ μＬずつ蒸留水を添加して染色を終了し、細胞の観察および写真撮影を行った。その後、各穴に１００ μＬのＤＭＳＯ（シグマ社製）を加え、１５分振とうして色素を溶出させた。１５分後、ｉＭＡＲＫマイクロプレートリーダー（バイオラド社製）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。
サンプル３の培地への添加濃度は、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬになるように調製した。

【0054】

図８は、分画分子量１４ｋＤａの透析膜を使用した場合の破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を指標とした破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。
図８の参照符号１２は、透析を実施した場合で、サンプル３の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図８の参照符号１３は、透析を実施した場合で、サンプル３の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図８の参照符号１４は、透析を実施しない場合で、サンプル３の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図８の参照符号１５は、透析を実施しない場合で、サンプル３の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図８の参照符号１６は、サンプル３を添加しなかった場合を示す。
図８の参照符号１７は、比較参照用のためのサンプル３を使用しなかった場合の分化誘導前のＲＡＷ２６４細胞の場合を示す。

【0055】

図９は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。また図１０は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
図９も図１０も、比較参照のためのものであり、煮干しに由来する成分は添加されていない。
また図１１は、実施例１の場合で、透析を実施せず、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
また図１２は、実施例１の場合で透析を実施して、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
図１１および１２では、乾燥抽出物２を、培地中の終濃度が１．６ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを使用した。

【0056】

図８に示される通り、分画分子量１４ｋＤａの透析膜を使用して、分画分子量１４ｋＤａを通過しない乾燥抽出物２を使用した場合、乾燥抽出物２の水溶液が１ｍｇ／ｍＬ以上の範囲で破骨細胞の分化抑制のあることが確認できた。
乾燥抽出物２の水溶液の濃度は、１．０～３．０ ｍｇ／ｍＬの範囲であれば好ましい。

【実施例0057】

２．０ｇの煮干し乾燥粉末を０．１ ｇ／ｍＬとなるように蒸留水に懸濁し、８℃で２４時間攪拌抽出した。抽出液を２０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。得られた上清を画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜（メルクミリポア社製）を用いて、室温で５時間限外ろ過し、高分子量成分を除去した。

【0058】

次に、この透析液の温度を－８０℃に下げて凍結させ、４８時間凍結乾燥を実施し、灰色の粉末状の乾燥抽出物３を得た。

【0059】

次に、この乾燥抽出物３をα－ＭＥＭ培地（シグマ社製）に、２５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、フィルター滅菌したものをサンプル４とした。フィルターは、ザルトリウス社製（ミニザルト０．２２ μｍ）を使用した。

【0060】

マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を受けて破骨細胞へと分化誘導されると、破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を高発現する。この特性を利用しＴＲＡＰの発現を指標として、破骨細胞分化抑制効果を測定した。

【0061】

サンプル４を９６穴培養プレート（ベクトンデッキンソン社製）の各穴に５０μＬずつ添加した。ブランンクとコントロールにα-ＭＥＭ培地を５０μＬ加えた。その後、２０% ＦＢＳ-ＭＥＭ-αを用いて細胞を１．４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したものをブランンクの穴に５０μＬずつ加えた。残りの細胞懸濁液にＲＡＮＫＬを終濃度１５０ ｎｇ／ｍＬになるように加え良く混和した後、残りの穴に５０μＬずつ播種した。５日間培養した後、９６穴プレート内の培地を除去し、TRAP staining reagentを５０ Ｌずつ各穴に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。後、上清を除去し、１００μＬの蒸留水で洗浄した。各穴に２００μＬずつ蒸留水を添加して染色を終了し、細胞の観察および写真撮影を行った。その後、各穴に１００ μＬのＤＭＳＯ（シグマ社製）を加え、１５分振とうして色素を溶出させた。１５分後、ｉＭＡＲＫマイクロプレートリーダー（バイオラド社製）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。
サンプル４の培地への添加濃度は、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬになるように調製した。

【0062】

図１３は、平均分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜を使用した場合の破骨細胞マーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を指標とした破骨細胞分化抑制効果を示すグラフである。
図１３の参照符号１８は、限外ろ過を実施した場合の限外ろ過膜を通過しない成分で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号１９は、限外ろ過を実施した場合の限外ろ過膜を通過しない成分で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号２０は、限外ろ過を実施しない場合で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号２１は、限外ろ過を実施しない場合で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号２２は、限外ろ過を実施した場合の限外ろ過膜を通過した場合で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で０．８ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号２３は、限外ろ過を実施した場合の限外ろ過膜を通過した場合で、サンプル４の培地への添加濃度が、培地中終濃度で１．６ｍｇ／ｍＬの場合を示す。
図１３の参照符号２４は、サンプル４を添加しなかった場合を示す。
図１３の参照符号２５は、比較参照用のためのサンプル４を使用しなかった場合の分化誘導前のＲＡＷ２６４細胞の場合を示す。

【0063】

図１４は、分化誘導前のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。また図１５は、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
図１４も図１５も、比較参照のためのものであり、煮干しに由来する成分は添加されていない。
また図１６は、実施例２の場合で、限外ろ過を実施せず、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
また図１７は、実施例２の場合で限外ろ過で濃縮した成分を用い、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
また図１８は、実施例２の場合で限外ろ過を実施し、高分子量成分を除去した成分について、分化誘導剤としてのＲＡＮＫＬの刺激を５日間受けた後のマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
図１６～１８では、乾燥抽出物３を、培地中の終濃度が１．６ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを使用した。

【0064】

図１３に示される通り、平均分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、平均分画分子量１０ｋＤａを通過した乾燥抽出物３を使用した場合、乾燥抽出物３の水溶液が１ｍｇ／ｍＬ以上の範囲で破骨細胞の分化抑制のあることが確認できた。
乾燥抽出物３の水溶液の濃度は、１．０～３．０ｍｇ／ｍＬの範囲であれば好ましい。

【0065】

実施例１と実施例２との結果から、分離操作より、高分子成分と低分子量成分の双方に破骨細胞の分化抑制のあることがあることから、二種以上の因子が破骨細胞の分化抑制に関与していることが示唆された。
中でも、低分子量成分が高分子成分と比較して、より破骨細胞の分化抑制のあることを明らかにすることができた。

【0066】

［参考例１］
破骨細胞への分化誘導において、どの段階で煮干し水抽出物が破骨細胞に対する分化抑制効果を示すのかを明らかにするために、乾燥抽出物１を、培地中の終濃度が１．６ｍｇ／ｍＬになるように調製したもの用いて、サンプル添加のタイミングの違いによる破骨細胞分化抑制効果を評価した。
実験は、実施例１の場合と同様に行った。
図１９は、煮干し水抽出物を用いた添加時期と効果の関係を示すグラフである。
図１９の参照符号２６は分化誘導開始後０日目を示す。図１９の参照符号２７は分化誘導開始後１日目を示す。図１９の参照符号２８は分化誘導開始後２日目を示す。図１９の参照符号２９は分化誘導開始後３日目を示す。図１９の参照符号３０は分化誘導開始後４日目を示す。また、図１９の参照符号３１は、乾燥抽出物１を使用しなかった場合を示す。

【0067】

図１９に示される様に、分化誘導と開始と同時に作用させた場合は分化抑制効果が認められるものの、分化誘導開始後１日目以降に作用させても破骨細胞の分化を抑制しないことが確認された。