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特開2024-159509カシューナッツを検出するためのプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024159509
(43)【公開日】2024-11-08
(54)【発明の名称】カシューナッツを検出するためのプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6895 20180101AFI20241031BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241031BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20241031BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6895 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/29
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024035327
(22)【出願日】2024-03-07
(31)【優先権主張番号】P 2023074463
(32)【優先日】2023-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000111487
【氏名又は名称】ハウス食品グループ本社株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100130443
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 真治
(72)【発明者】
【氏名】久保田 美穂
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 聡
(72)【発明者】
【氏名】恵 千晶
(72)【発明者】
【氏名】田口 大夢
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ04
4B063QQ09
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】カシューナッツを検出するための新たな手段を提供する。
【解決手段】カシューナッツを検出するためのプライマーセットは、塩基配列Ａ１或いはその相同配列又は部分配列を含むプライマーＡ、並びに、塩基配列Ｂ１或いはその相同配列又は部分配列を含むプライマーＢを含み、塩基配列Ａ１及びＢ１が、特定のアミノ酸配列の組み合わせである。
【選択図】図１
【解決手段】カシューナッツを検出するためのプライマーセットは、塩基配列Ａ１或いはその相同配列又は部分配列を含むプライマーＡ、並びに、塩基配列Ｂ１或いはその相同配列又は部分配列を含むプライマーＢを含み、塩基配列Ａ１及びＢ１が、特定のアミノ酸配列の組み合わせである。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カシューナッツを検出するためのプライマーセットであって、
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかである、
プライマーセット。
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかである、
プライマーセット。
【請求項2】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項3】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）である、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項4】
（Ｃ１）塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、
請求項２に記載のプライマーセット。
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、
請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項5】
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項6】
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１７に示す塩基配列である、請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項7】
試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
【請求項8】
試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項４に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出すること
を含む方法。
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、請求項４に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出すること
を含む方法。
【請求項9】
前記試料が飲食品試料である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、飲食品中の食物アレルゲンであるカシューナッツを検出するために利用することができるプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
カシューナッツ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（カシュー、カシューナットノキとも称される）は、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）カシューナッツ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）（アナカルディウム属、カシューナットノキ属とも称される）に属する植物であり、その仁の部分が「カシューナッツ」として木の実として食用される。以下、本明細書において「カシューナッツ」は、木の実として食用される仁の部分を指し、「カシューナッツ植物」は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅを指す。
【0003】
カシューナッツはアレルギーを引き起こす食物アレルゲンの１つであり、患者によっては重篤なアナフィキラシーショック症状を引き起こす場合がある。
【0004】
カシューナッツは現在日本においてアレルゲン表示が推奨されている２０品目の食物アレルゲンの１つである。カシューナッツによるアレルギー発症数は増加傾向にある。木の実類としては、アレルゲン表示の義務があるクルミに次いで、カシューナッツによる重篤症例の報告が多い。このため将来的にはカシューナッツのアレルゲン表示が義務化される可能性がある。
【0005】
非特許文献１では、リアルタイムＰＣＲ法によりカシューナッツを検出するためのプライマー・プローブセットが記載されている。非特許文献１に記載のプライマーセットはカシューのＤＮＡのＩｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）領域を増幅する。非特許文献１には、１ｋｇの小麦粉及びカシューナッツ混合物中に含まれる０．１ｍｇのカシューナッツを検出できたこと、並びに、４８種の植物及び４種の動物を検出しなかったことが記載されている。
【0006】
特許文献１では、ＰＣＲ法によりカシューナッツを検出するためのプライマーセットが記載されている。特許文献１には、前記プライマーセットによる検出感度の下限は、ＰＣＲ反応中のカシューナッツＤＮＡの濃度として１ｐｇ／μＬであったこと、並びに、前記プライマーセットは、カシューナッツ植物の近縁種であるピスタチオ、マンゴー及びピンクペッパーのＤＮＡを増幅しなかったことが記載されている。
【0007】
一方、特許文献２には、飲食品中に含まれるアレルゲンである小麦、そば、落花生を共通のＰＣＲ条件でのリアルタイムＰＣＲ法により検出することができるプライマーセットが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２０１６－１８７３２９号公報
【特許文献2】特開２０１６－１０１１４２号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｌｏｐｅｚ－Ｃａｌｌｅｊａ，Ｉ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ，Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６２（２０１５）２３３－２４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の一以上の実施形態は、新たな、カシューナッツを検出するためのプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本明細書は本発明の以下の一以上の実施形態を開示する。
（１）カシューナッツを検出するためのプライマーセットであって、
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかである、
プライマーセット。
（２）前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）である、（２）に記載のプライマーセット。
（４）（Ｃ１）塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、
（２）に記載のプライマーセット。
（５）前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、（４）に記載のプライマーセット。
（６）前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１７に示す塩基配列である、（５）に記載のプライマーセット。
（７）試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、（１）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
（８）試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、（４）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出すること
を含む方法。
（９）前記試料が飲食品試料である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１）カシューナッツを検出するためのプライマーセットであって、
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかである、
プライマーセット。
（２）前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１とが、前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）である、（２）に記載のプライマーセット。
（４）（Ｃ１）塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、
（２）に記載のプライマーセット。
（５）前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である、（４）に記載のプライマーセット。
（６）前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）又は（Ｓ３６）であり、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１７に示す塩基配列である、（５）に記載のプライマーセット。
（７）試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、（１）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含む方法。
（８）試料中のカシューナッツを検出する方法であって、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、（４）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、および、
前記核酸増幅反応による増幅産物と前記プローブＣとの結合を検出すること
を含む方法。
（９）前記試料が飲食品試料である、（７）又は（８）に記載の方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明の一以上の実施形態によれば、新たな、カシューナッツを検出するためのプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
＜１．目的＞
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及びそれを用いた検出方法は、以下の要求を満たすことが望ましい。
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及びそれを用いた検出方法は、以下の要求を満たすことが望ましい。
【0015】
（検出対象）
カシューナッツ植物以外のウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）に属する食用植物としては、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、ピンクペッパー（Ｓｃｈｉｎｕｓ ｍｏｌｌｅ）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）及びスマック（Ｒｈｕｓ ｃｏｒｉａｒｉａ）が一般に認識されている。
カシューナッツ植物以外のウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）に属する食用植物としては、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、ピンクペッパー（Ｓｃｈｉｎｕｓ ｍｏｌｌｅ）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）及びスマック（Ｒｈｕｓ ｃｏｒｉａｒｉａ）が一般に認識されている。
【0016】
そこで本発明の一以上の実施形態は、マンゴー、ピンクペッパー、ピスタチオ及びスマックのＤＮＡを増幅することなく、カシューナッツのＤＮＡを増幅することができるプライマーセット及びそれを用いたカシューナッツの検出方法を提供することを目的とする。カシューナッツの産地としては、原産国であるブラジルのほか、インド、ナイジェリアが挙げられる。
【0017】
（感度）
アレルゲンの検出のためには、１μｇカシューナッツタンパク質／ｇ試料（＝１ｐｐｍ）相当濃度の検出を可能にすることが望ましい。カシューナッツの仁のタンパク質含有量は１９．８ｇ／１００ｇ（食品成分データベース）であるから、１μｇカシューナッツタンパク質／ｇ試料は、５．１μｇカシューナッツ／ｇ試料に相当する。試料及びカシューナッツから同じ収率でＤＮＡが回収できると仮定した場合、５．１μｇカシューナッツ／ｇ試料は、２５０ｆｇカシューナッツＤＮＡ／５０ｎｇ試料ＤＮＡに相当する。
アレルゲンの検出のためには、１μｇカシューナッツタンパク質／ｇ試料（＝１ｐｐｍ）相当濃度の検出を可能にすることが望ましい。カシューナッツの仁のタンパク質含有量は１９．８ｇ／１００ｇ（食品成分データベース）であるから、１μｇカシューナッツタンパク質／ｇ試料は、５．１μｇカシューナッツ／ｇ試料に相当する。試料及びカシューナッツから同じ収率でＤＮＡが回収できると仮定した場合、５．１μｇカシューナッツ／ｇ試料は、２５０ｆｇカシューナッツＤＮＡ／５０ｎｇ試料ＤＮＡに相当する。
【0018】
そこで本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及び検出方法は、２５０ｆｇカシューナッツＤＮＡ／５０ｎｇ試料ＤＮＡの濃度で存在するカシューナッツＤＮＡを増幅できるものであることが望ましい。
【0019】
（頑健性）
飲食品中に含まれる原料由来のＤＮＡは、加工の過程で断片化される可能性がある。このため、核酸増幅反応によりカシューナッツＤＮＡを増幅し、増幅産物の有無を検出する場合、増幅される標的ＤＮＡ断片長は短いほど、加工の影響を受けず安定した検出が可能である。
飲食品中に含まれる原料由来のＤＮＡは、加工の過程で断片化される可能性がある。このため、核酸増幅反応によりカシューナッツＤＮＡを増幅し、増幅産物の有無を検出する場合、増幅される標的ＤＮＡ断片長は短いほど、加工の影響を受けず安定した検出が可能である。
【0020】
そこで本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及び検出方法は、カシューナッツＤＮＡに含まれる１５０ｂｐ以下の断片長の標的配列を増幅できるものであることが好ましい。
【0021】
（従来技術との比較）
非特許文献１及び特許文献１には、カシューナッツに特有のＤＮＡの塩基配列を、所定のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により増幅し、増幅産物の有無を検出する方法が記載されている。しかし、上記の要求を満たす方法は開示されていない。例えば、非特許文献１に記載の方法は、ピスタチオ以外の近縁種に対する検出の有無を確認していないため、カシューナッツの特異的な検出が可能であるか不明である。
非特許文献１及び特許文献１には、カシューナッツに特有のＤＮＡの塩基配列を、所定のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により増幅し、増幅産物の有無を検出する方法が記載されている。しかし、上記の要求を満たす方法は開示されていない。例えば、非特許文献１に記載の方法は、ピスタチオ以外の近縁種に対する検出の有無を確認していないため、カシューナッツの特異的な検出が可能であるか不明である。
【0022】
（ＰＣＲ条件）
特許文献２では、小麦、そば及び落花生のＤＮＡを、共通のＰＣＲ条件（具体的には実施例に示す条件１）によるリアルタイムＰＣＲ法により検出することが記載されている。特許文献２に記載の小麦、そば及び落花生のＤＮＡを増幅するための共通のＰＣＲ条件は、サイクル数が比較的短い。カシューナッツＤＮＡを、特許文献２に記載の前記ＰＣＲ条件により増幅することができれば、ユーザーにとって簡便な操作で、カシューナッツ、小麦、そば及び落花生のＤＮＡの有無を検出することが可能になる。
特許文献２では、小麦、そば及び落花生のＤＮＡを、共通のＰＣＲ条件（具体的には実施例に示す条件１）によるリアルタイムＰＣＲ法により検出することが記載されている。特許文献２に記載の小麦、そば及び落花生のＤＮＡを増幅するための共通のＰＣＲ条件は、サイクル数が比較的短い。カシューナッツＤＮＡを、特許文献２に記載の前記ＰＣＲ条件により増幅することができれば、ユーザーにとって簡便な操作で、カシューナッツ、小麦、そば及び落花生のＤＮＡの有無を検出することが可能になる。
【0023】
そこで本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセット及び検出方法は、カシューナッツのＤＮＡを、特許文献２に記載の小麦、そば及び落花生のＤＮＡを増幅するための共通のＰＣＲ条件により増幅できるものであることが更に望ましい。
【0024】
＜２．カシューナッツを検出するためのプライマーセット＞
本発明の一以上の実施形態に係る、カシューナッツを検出するためのプライマーセットは、
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかであることを特徴とする。
本発明の一以上の実施形態に係る、カシューナッツを検出するためのプライマーセットは、
（Ａ１）塩基配列Ａ１、
（Ａ２）前記塩基配列Ａ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である塩基配列Ａ２、及び
（Ａ３）前記塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ａ３
から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＡ、並びに、
（Ｂ１）塩基配列Ｂ１、
（Ｂ２）前記塩基配列Ｂ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｂ２、及び
（Ｂ３）前記塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｂ３
から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むオリゴヌクレオチドを含むプライマーＢ
を含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、下記の組み合わせ：
（Ｓ１３）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列である、
（Ｓ１４）前記塩基配列Ａ１が配列番号３に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２５）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ２６）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ２７）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ２９）前記塩基配列Ａ１が配列番号５に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
（Ｓ３０）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である、
（Ｓ３１）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１０に示す塩基配列である、
（Ｓ３２）前記塩基配列Ａ１が配列番号６に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３５）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列である、
（Ｓ３６）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１２に示す塩基配列である、
（Ｓ３７）前記塩基配列Ａ１が配列番号７に示す塩基配列であり、且つ、前記塩基配列Ｂ１が配列番号１３に示す塩基配列である、
のいずれかであることを特徴とする。
【0025】
本実施形態に係るプライマーセットは、カシューナッツに由来するＤＮＡ、より詳細にはリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）－１領域にある一部の領域を増幅することができるように設計されている。なお、カシューナッツ植物のリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ－１及びＩＴＳ－２を含むＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＢ０７１６９０．１（配列番号１８）及びＫＦ６６４１９２．１（配列番号１９）として公開されている。
【0026】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ１３）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の９０ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0027】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ１４）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の１３１ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0028】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ２５）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の６７ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0029】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ２６）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の９１ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0030】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ２７）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の１１９ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0031】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ２９）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の１４５ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0032】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３０）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の５４ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0033】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３１）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の７８ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0034】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３２）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の１０６ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0035】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３５）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の５８ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0036】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３６）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の７６ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0037】
前記塩基配列Ａ１と前記塩基配列Ｂ１との組み合わせが前記（Ｓ３７）である本実施形態に係るプライマーセットを用い、カシューナッツ由来ＤＮＡの核酸増幅反応を行うと、ＩＴＳ－１領域の８４ｂｐの領域を含むＤＮＡ断片が増幅産物として生成する。
【0038】
いずれも増幅産物の断片長が１５０ｂｐよりも顕著に短いため、飲食品の加工の影響を受けにくい頑健性の高い検出が可能である。
【0039】
本実施形態に係るプライマーセットによれば、カシューナッツを特異的に高感度で検出することができる。
【0040】
前記（Ａ２）及び（Ｂ２）並びに後述する（Ｃ２）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３－４１０， １９９０を参照されたい。
【0041】
前記（Ａ２）及び（Ｂ２）において、同一性は、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【0042】
続いて、プライマーＡ及びプライマーＢのより好ましい実施形態について説明する。
【0043】
プライマーＡにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ａ１、塩基配列Ａ２及び塩基配列Ａ３から選択される塩基配列Ａを３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ａの５’末端側に付加された他の塩基配列を更に含んでいてもよいし、塩基配列Ａのみからなるものであってもよい。プライマーＡにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下、より好ましくは１８塩基以下である。塩基配列Ａの５’末端側に付加された他の塩基配列の塩基数は、例えば１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下である。
【0044】
プライマーＡは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、前記オリゴヌクレオチドに標識物質、タグ等の他の要素が連結されたものであってもよい。前記他の要素は前記オリゴヌクレオチドのどの位置に連結されていてもよいが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されていることが特に好ましい。
【0045】
塩基配列Ａ１は、配列番号３に示す塩基配列、配列番号５に示す塩基配列、配列番号６に示す塩基配列又は配列番号７に示す塩基配列のいずれかである。
【0046】
塩基配列Ａ２は、塩基配列Ａ１と、８０％以上１００％未満の同一性を有する。同一性のより好ましい範囲は記述の通りである。塩基配列Ａ２は、塩基配列Ａ１に、好ましくは１、２又は３塩基、より好ましくは１又は２塩基、特に好ましくは１塩基の、置換、欠失又は付加された塩基配列である。更に、塩基配列Ａ２は、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡ（ＮＡは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ａ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＡの部分塩基配列と同一である。ここでＮＡは１以上であればよいが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは５以上、より好ましくは８以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、より好ましくは１３以上である。ＮＡはさらに、塩基配列Ａ１の塩基数をＭＡとしたとき、好ましくはＭＡ－１以下、より好ましくはＭＡ－２以下、より好ましくはＭＡ－３以下、より好ましくはＭＡ－５以下、より好ましくはＭＡ－８以下であることができる。
【0047】
塩基配列Ａ３は、塩基配列Ａ１又はＡ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１３塩基以上、より好ましくは１４塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ａ３は、塩基配列Ａ１又はＡ２の部分塩基配列であるため、塩基配列Ａ３の塩基数は、塩基配列Ａ１又はＡ２の塩基数よりも１塩基以上小さい。
【0048】
塩基配列Ａは、より好ましくは、塩基配列Ａ１及び塩基配列Ａ２から選択される。
【0049】
プライマーＢにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ｂ１、塩基配列Ｂ２及び塩基配列Ｂ３から選択される塩基配列Ｂを３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ｂの５’末端側に付加された他の塩基配列を更に含んでいてもよいし、塩基配列Ｂのみからなるものであってもよい。プライマーＢにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３５塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２７塩基以下である。塩基配列Ｂの５’末端側に付加された他の塩基配列の塩基数は、例えば１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下である。
【0050】
プライマーＢは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、前記オリゴヌクレオチドに標識物質、タグ等の他の要素が連結されたものであってもよい。前記他の要素は前記オリゴヌクレオチドのどの位置に連結されていてもよいが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されていることが特に好ましい。
【0051】
塩基配列Ｂ１は、配列番号８に示す塩基配列、配列番号９に示す塩基配列、配列番号１０に示す塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列及び配列番号１３に示す塩基配列から、塩基配列Ａ１との組み合わせが、前記の組み合わせ（Ｓ１３）、（Ｓ１４）、（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３０）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）のいずれかであるように選択される。
【0052】
塩基配列Ｂ２は、塩基配列Ｂ１と、８０％以上１００％未満の同一性を有する。同一性のより好ましい範囲は記述の通りである。塩基配列Ｂ２は、塩基配列Ｂ１に、好ましくは１、２又は３塩基、より好ましくは１又は２塩基、特に好ましくは１塩基の、置換、欠失又は付加された塩基配列である。更に、塩基配列Ｂ２は、３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢ（ＮＢは１以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｂ１のうち３’末端塩基から連続した塩基数ＮＢの部分塩基配列と同一である。ここでＮＢは１以上であればよいが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは５以上、より好ましくは８以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、より好ましくは１３以上である。ＮＢはさらに、塩基配列Ｂ１の塩基数をＭＢとしたとき、好ましくはＭＢ－１以下、より好ましくはＭＢ－２以下、より好ましくはＭＢ－３以下、より好ましくはＭＢ－５以下、より好ましくはＭＢ－８以下であることができる。
【0053】
塩基配列Ｂ１が配列番号８に示す塩基配列又は配列番号１０に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｂ３は、塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｂ１が配列番号９に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｂ３は、塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１８塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｂ１が配列番号１１に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列又は配列番号１３に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｂ３は、塩基配列Ｂ１又はＢ２のうち３’末端塩基から連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２２塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｂ３は、塩基配列Ｂ１又はＢ２の部分塩基配列であるため、塩基配列Ｂ３の塩基数は、塩基配列Ｂ１又はＢ２の塩基数よりも１塩基以上小さい。
【0054】
塩基配列Ｂは、より好ましくは、塩基配列Ｂ１及び塩基配列Ｂ２から選択される。
【0055】
上記のプライマーＡ及びプライマーＢを含むカシューナッツを検出するためのプライマーセットには、更にプローブを含めることができる。プローブはプライマーＡ及びプライマーＢを用いた核酸増幅反応により増幅された増幅産物中の標的配列の少なくとも一部の領域にストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）ことができるオリゴヌクレオチドを含むものであればよい。
【0056】
プローブは、オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、オリゴヌクレオチドに蛍光物質（例えば、ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ＨＥＸＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＰＥＴ等）及び／又は消光物質（クエンチャー）（例えば、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、ＭＧＢ、ＢＨＱ（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）ＴＭ、ＢＢＱ（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）ＴＭ等）で標識されていてもよい。このように標識されたプローブはＴａｑＭａｎＴＭプローブとも称される。好ましくは、オリゴヌクレオチドの一方の端に蛍光物質が連結され他方の端に消光物質が連結される。
【0057】
本実施形態に係るプライマーセットは、より好ましくは、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、前記組み合わせ（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）であり、
プローブとして、（Ｃ１）塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である。
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が、前記組み合わせ（Ｓ２５）、（Ｓ２６）、（Ｓ２７）、（Ｓ２９）、（Ｓ３１）、（Ｓ３２）、（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）であり、
プローブとして、（Ｃ１）塩基配列Ｃ１、
（Ｃ２）前記塩基配列Ｃ１と８０％以上１００％未満の同一性を有し、且つ、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である塩基配列Ｃ２、
（Ｃ３）前記塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上の部分塩基配列である塩基配列Ｃ３、及び、
（Ｃ４）前記塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列Ｃ４
から選択される塩基配列Ｃを含むオリゴヌクレオチドを含むプローブＣを更に含み、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２５）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２６）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４又は１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ２９）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１４、１５、１６又は１７に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３１）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３２）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１５又は１６に示す塩基配列であり、
前記塩基配列Ａ１及び前記塩基配列Ｂ１が前記組み合わせ（Ｓ３５）、（Ｓ３６）又は（Ｓ３７）である場合に、前記塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である。
【0058】
プローブＣにおけるオリゴヌクレオチドは、塩基配列Ｃ１、塩基配列Ｃ２、塩基配列Ｃ３及び塩基配列Ｃ４から選択される塩基配列Ｃを少なくとも一部に含むものであればよく、塩基配列Ｃの３’末端側及び／又は５’末端側（好ましくは５’末端側のみ）に付加された他の塩基配列を更に含んでいてもよいし、塩基配列Ｃのみからなるものであってもよい。プローブＣにおけるオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常は３５塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下であり、より好ましくは２０塩基以下である。塩基配列Ｃの３’末端側及び／又は５’末端側に付加された他の塩基配列の塩基数は、合計で、例えば１０以下、好ましくは５以下、より好ましくは３以下である。プローブＣは、前記オリゴヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドに、前記蛍光物質及び／又は前記消光物質が連結されたものである。
【0059】
塩基配列Ｃ２は、塩基配列Ｃ１と、８０％以上１００％未満の同一性を有する。同一性のより好ましい範囲は記述の通りである。塩基配列Ｃ２は、塩基配列Ｃ１に、好ましくは１、２又は３塩基、より好ましくは１又は２塩基、特に好ましくは１塩基の、置換、欠失又は付加された塩基配列である。更に、塩基配列Ｃ２は、連続した塩基数ＮＣ（ＮＣは３以上の整数）の部分塩基配列が、前記塩基配列Ｃ１のうち連続した塩基数ＮＣの部分塩基配列と同一である。ここでＮＣは３以上であればよいが、好ましくは４以上、より好ましくは５以上、より好ましくは８以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、より好ましくは１３以上である。ＮＣはさらに、塩基配列Ｃ１の塩基数をＭＣとしたとき、好ましくはＭＣ－１以下、より好ましくはＭＣ－２以下、より好ましくはＭＣ－３以下、より好ましくはＭＣ－５以下、より好ましくはＭＣ－８以下であることができる。
【0060】
塩基配列Ｃ１が配列番号１４に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ１が配列番号１５に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ１が配列番号１６又は１７に示す塩基配列である場合、塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１又はＣ２のうち連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１４塩基以上の部分塩基配列である。塩基配列Ｃ３は、塩基配列Ｃ１又はＣ２の部分塩基配列であるため、塩基配列Ｃ３の塩基数は、塩基配列Ｃ１又はＣ２の塩基数よりも１塩基以上小さい。
【0061】
塩基配列Ｃ４は、塩基配列Ｃ１、Ｃ２又はＣ３と相補的な塩基配列である。
【0062】
塩基配列Ｃは、より好ましくは、塩基配列Ｃ１、塩基配列Ｃ２及び塩基配列Ｃ３から選択され、特に好ましくは、塩基配列Ｃ１及び塩基配列Ｃ２から選択される。
【0063】
上記のプライマーＡ、プライマーＢ及び／又はプローブに含まれるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することができる。
【0064】
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは上記の各要素が、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、また一回の使用及び使用量ごとに容器に収容されていてもよい。あるいは、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。上記の各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
【0065】
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、ｄＮＴＰミックス、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、塩化マグネシウム、及び使用説明書より選択される一以上の要素を更に含むことができる。
【0066】
本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、食物アレルゲンを検出するための一以上の別のプライマーセットと組み合わせて、食物アレルゲン検出用キットとしてもよい。
【0067】
前記食物アレルゲンを検出するための一以上の別のプライマーセットとしては、小麦、そば、落花生、クルミ等の食物アレルゲンを検出するための一以上のプライマーセットが挙げられる。小麦を検出するためのプライマーセット、そばを検出するためのプライマーセット、及び／又は落花生を検出するためのプライマーセットとしては、特許文献２（特開２０１６－１０１１４２号公報）に記載のプライマーセットが好ましい。クルミを検出するためのプライマーセットとしては特開２０２１－１８５８２０号公報に記載のプライマーセットが好ましい。本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットは、小麦、そば、落花生及びクルミを検出するための共通の条件でのＰＣＲ法によりカシューナッツＤＮＡの増幅と検出が可能である。このため、本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを用いることによって、小麦及、そば、落花生及び／又はクルミ検出用のＰＣＲ条件下にて、カシューナッツの検出を行うことが可能である。このため、小麦、そば、落花生、クルミ及びカシューナッツの検出を、同一条件下にて同時に進めることができ、分析の手間を少なくすることができる。
【0068】
＜３．試料中のカシューナッツを検出する方法＞
本発明の一以上の実施形態に係る、試料中のカシューナッツを検出する方法は、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、カシューナッツを検出するための前記プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含むことを特徴とする。
本発明の一以上の実施形態に係る、試料中のカシューナッツを検出する方法は、
前記試料に由来するＤＮＡを鋳型とし、カシューナッツを検出するための前記プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応による増幅産物を検出すること
を含むことを特徴とする。
【0069】
前記試料は、好ましくは飲食品試料である。飲食品試料とは、飲食品組成物、飲食品組成物の原料、加工途中の飲食品原料、或いは、これらの処理物（例えば抽出物、粉砕物、溶解物）等を含む試料であってよい。このカシューナッツの検出方法で得られた結果は、アレルギー表示の正しさの確認や、アレルギー表示をするべきか否かの判断材料に用いることができる。
【0070】
試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、及びそれらの組合せを用いて行うことができる。また、市販のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ＫｉｔやＧｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ ２０／Ｇ、ＤＮｅａｓｙ ｍｅｒｉｃｏｎ Ｆｏｏｄ Ｋｉｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ）、ＧＭ ｑｕｉｃｋｅｒ ４（ニッポンジーン）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。
【0071】
抽出されたＤＮＡの濃度および精製度は、分光光度計を用いて波長２３０、２６０、及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより評価することができる。
例えば抽出されたＤＮＡの濃度は、下記式を用いて算出することができる。
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）＝波長２６０ｎｍにおける吸光度×５０
例えば抽出されたＤＮＡの濃度は、下記式を用いて算出することができる。
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）＝波長２６０ｎｍにおける吸光度×５０
【0072】
ＤＮＡの精製度は、核酸増幅反応が良好に行われるべく２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８～２．０であることが好ましい。
【0073】
さらに、抽出されたＤＮＡについて、植物又は動物が共通に持つ内在性遺伝子に対するプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物が得られることを確認してもよい。
【0074】
試料から抽出されたＤＮＡは、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に記載されるＤＮＡの調製方法に基づいて適宜濃度を調整することができる。濃度調整したＤＮＡは、適宜鋳型ＤＮＡとして利用することができる。好ましくは５～５００ｎｇとなる量にて、より好ましくは５０ｎｇとなる量にて鋳型ＤＮＡとして利用する（この量は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」にて特定される量である）。
【0075】
核酸増幅反応は、耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよいし、鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよい。ポリメラーゼは好ましくはＤＮＡポリメラーゼである。
【0076】
ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が挙げられる。
【0077】
ＰＣＲ法は、例えばＳａｉｋｉ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４（１９８５）や植物細胞工学別冊、植物のＰＣＲ実験プロトコル、島本功・佐々木卓治監修（１９９５年）等に記載されている通常の方法に基づいて行うことができる。ＰＣＲ条件（変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度及び時間、ならびにサイクル数等）、ＰＣＲ反応液の組成（緩衝液の種類、プライマー濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類や濃度、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等）は、前記プライマーセットを用いたＰＣＲにおいて高感度でＰＣＲ増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等がほぼ最適化されたＰＣＲ用マスターミックス等が市販されており、これらを利用してもよい。
【0078】
前記ＰＣＲ法として、定性ＰＣＲ法を利用することができる。定性ＰＣＲ法においては、試料から抽出されたＤＮＡ中に含まれるカシューナッツＤＮＡを、プライマーＡ及びプライマーＢを含む前記プライマーセットを利用するＰＣＲにより増幅し、それを電気泳動により分離、染色することで検出することができる。
【0079】
プライマーＡ及びプライマーＢを含む前記プライマーセットを用いた場合には、増幅産物の有無を指標として、カシューナッツの混入を検出することができる。所定の増幅産物が検出されれば、試料にカシューナッツが混入していると判定することができ、前記増幅産物が検出されなければ、試料にカシューナッツが混入していないと判定することができる。
【0080】
前記プライマーセットを用いることにより高感度でのカシューナッツの検出が可能である。
【0081】
前記プライマーセットは、好ましくは、プローブを更に含み、より好ましくは前記プローブＣを含む。増幅産物の検出を、増幅産物とプローブとの結合を検出することにより行うことができる。プローブを用いる検出方法としては、後述するＴａｑＭａｎＴＭ法によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。
【0082】
前記ＰＣＲ法として、リアルタイムＰＣＲ法を利用することができる。
【0083】
リアルタイムＰＣＲ法は、インターカレーター法及びＴａｑＭａｎＴＭ法のいずれも用いることができるが、好ましくはＴａｑＭａｎＴＭ法を利用する。
【0084】
インターカレーター法では、蛍光を発する化合物（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等）をＰＣＲ反応液に含むことにより、これが増幅されたＤＮＡに結合する。これに励起光を照射することにより蛍光を発し、この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。
【0085】
一方、ＴａｑＭａｎＴＭ法では、蛍光物質で標識されたプローブ（ＴａｑＭａｎＴＭプローブ）をＰＣＲ反応液に含むことにより、これがアニーリングステップで増幅されたＤＮＡ中の標的配列に結合（ハイブリダイズ）する。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡに結合（ハイブリダイズ）したプローブが分解され、その際、蛍光物質がプローブから遊離し蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。リアルタイムＰＣＲを行う装置は特に限定されず、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ライフテクノロジーズ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）等、リアルタイムＰＣＲを可能とする様々な機種を用いることができ、特に限定はされない。
【0086】
リアルタイムＰＣＲ法においては、試料から抽出されたＤＮＡ中に含まれるカシューナッツＤＮＡを、前記プライマーセットを利用するＰＣＲにより増幅し、上記のとおり、蛍光強度を測定することによりＰＣＲ増幅産物の生成量を測定し、増幅曲線を得る。次に、蛍光シグナルが有意に増加したサイクル数（Ｃｑ値）を指標とするか、または蛍光シグナルがサイクル数に対して指数関係にある領域で、蛍光量増加（ΔＲｎ）の適当な閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定し、適当なサイクル数条件下にて、増幅曲線と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が交わるサイクル数（Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ））を指標とすることで、カシューナッツの混入有無を検出することができる。すなわち、適当なサイクル数条件下にて、蛍光シグナルの有意な増加が見られるか、または増幅曲線と閾値が交わる場合には、試料中にカシューナッツが混入していることを示し、一方、蛍光シグナルの有意な増加が見られないか、または増幅曲線と閾値が交わらない場合には、試料中にカシューナッツが混入していないことを示す。
【0087】
前記プライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法と、特許文献２に記載の小麦検出用プライマーセット、そば検出用プライマーセット、落花生検出用プライマーセット、及び／又は、特開２０２１－１８５８２０号公報に記載のクルミ検出用プライマーセットを使用する定性ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法とは、同一の条件下でも、いずれも目的とする感度を維持しつつ、目的とする配列でのみ標的増幅産物が得られる。このため、本発明のカシューナッツの検出方法は、特許文献２記載の小麦の検出方法、そばの検出方法、落花生の検出方法、及び／又は、特開２０２１－１８５８２０号公報に記載のクルミ検出方法と、同一の条件下にて同時に行うことができ、試料中の食物アレルゲンを、迅速かつ効率的に検出することができる。
【0088】
以下、実施例に基づいて本発明の具体的な実施形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例0089】
本発明の好ましい実施形態を実験結果に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。
【0090】
＜プライマー設計＞
カシューナッツ植物（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）に由来するリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ－１及びＩＴＳ－２を含むＤＮＡである、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＢ０７１６９０．１（配列番号１８）及びＫＦ６６４１９２．１（配列番号１９）に共通する、ＩＴＳ－１の塩基配列上に、５’側の塩基を起点に増幅するフォワードプライマーを７つ、３’側を起点に増幅するリバースプライマーを６つ設計した（表１）。
カシューナッツ植物（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）に由来するリボゾームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ－１及びＩＴＳ－２を含むＤＮＡである、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＢ０７１６９０．１（配列番号１８）及びＫＦ６６４１９２．１（配列番号１９）に共通する、ＩＴＳ－１の塩基配列上に、５’側の塩基を起点に増幅するフォワードプライマーを７つ、３’側を起点に増幅するリバースプライマーを６つ設計した（表１）。
【0091】
各プライマーは、表２に示す基準に従い設計した。
【0092】
【表1】
【0093】
【表2】
【0094】
表１に記したフォワードプライマーとリバースプライマーの中で、プライミング可能な組み合わせは表３に示すセット番号Ｓ１～Ｓ３７の３７組であった。
【0095】
【表3】
【0096】
表３のプライマーセットに対して、下記の選抜１～選抜５の評価を行い、カシューナッツの検出に適したプライマーセットを選抜した。
【0097】
選抜１：ソフトウェアによるプライマーセットの選抜
ソフトウェアを用いて高評価のプライマーセットを選抜した。具体的には、前記３７組のプライマーセット及びカシューナッツＤＮＡの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＢ０７１６９０．１（配列番号１８）及びＫＦ６６４１９２．１（配列番号１９））をＰｒｉｍｅｒ３(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)にインプットし、下記表に示す基準により評価した。
ソフトウェアを用いて高評価のプライマーセットを選抜した。具体的には、前記３７組のプライマーセット及びカシューナッツＤＮＡの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＢ０７１６９０．１（配列番号１８）及びＫＦ６６４１９２．１（配列番号１９））をＰｒｉｍｅｒ３(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)にインプットし、下記表に示す基準により評価した。
【0098】
【表4】
【0099】
表４の基準を満たしたプライマーセットは、下記表に示す２１組であった。
【0100】
【表5】
【0101】
選抜２：アニーリング温度６４℃のＰＣＲによる選抜
表５に示す２１組のプライマーセットがカシューナッツＤＮＡと実際にプライミングするかを確認するため、ＰＣＲを行った。その際、鋳型ＤＮＡとプライミングしやすくなるよう、アニーリング温度を目標とする６８℃よりも低い６４℃に設定した。
表５に示す２１組のプライマーセットがカシューナッツＤＮＡと実際にプライミングするかを確認するため、ＰＣＲを行った。その際、鋳型ＤＮＡとプライミングしやすくなるよう、アニーリング温度を目標とする６８℃よりも低い６４℃に設定した。
【0102】
＜ＰＣＲ条件１＞
ＰＣＲ反応液は、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに、鋳型ＤＮＡとして５０ｎｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表６に示す温度条件によるＰＣＲに供した。なお、カシューナッツ抽出ＤＮＡは、カシューナッツを粉砕し、ＧＭ ｑｕｉｃｋｅｒ４（ニッポンジーン）を用いて抽出し、ＴＥバッファーで溶出して得た。得られたカシューナッツ抽出液の濃度を分光光度計で測定し、ＴＥバッファーで２０ｎｇ／μＬになるよう調製した。
ＰＣＲ反応液は、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに、鋳型ＤＮＡとして５０ｎｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表６に示す温度条件によるＰＣＲに供した。なお、カシューナッツ抽出ＤＮＡは、カシューナッツを粉砕し、ＧＭ ｑｕｉｃｋｅｒ４（ニッポンジーン）を用いて抽出し、ＴＥバッファーで溶出して得た。得られたカシューナッツ抽出液の濃度を分光光度計で測定し、ＴＥバッファーで２０ｎｇ／μＬになるよう調製した。
【0103】
【表6】
【0104】
＜ＰＣＲ条件１＞のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標）（島津製作所）を用いて解析した。目的とする断片長の増幅産物の濃度が１０ｎｇ／μＬ以上であることの基準を満たすプライマーセットは下記表に示す１７組であった。
【0105】
【表7】
【0106】
選抜３：アニーリング温度６８℃のＰＣＲによる選抜
これまでに出願人が開発し公定法に採用された、アレルゲン（小麦、そば、落花生）を検出する特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法ではいずれもアニーリング温度が６８℃である。
これまでに出願人が開発し公定法に採用された、アレルゲン（小麦、そば、落花生）を検出する特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法ではいずれもアニーリング温度が６８℃である。
【0107】
そこで表７で示す１７組のプライマーセットが、それらと同じアニーリング温度でカシューナッツＤＮＡと実際にプライミングするかを確認するため、アニーリング温度を６８℃に設定してＰＣＲを行った。
【0108】
＜ＰＣＲ条件２＞
ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲ条件１と同様に、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに、ＰＣＲの鋳型として５０ｎｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表８に示す温度条件によるＰＣＲに供した。
ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲ条件１と同様に、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに、ＰＣＲの鋳型として５０ｎｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表８に示す温度条件によるＰＣＲに供した。
【0109】
【表8】
【0110】
＜ＰＣＲ条件２＞で増幅したＰＣＲ産物をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標）（島津製作所）で解析し、バンドを確認した。目的とする断片長の増幅産物の濃度が１０ｎｇ／μＬ以上であることの基準を満たすプライマーセットは下記表に示す１５組であった。
【0111】
【表9】
【0112】
選抜４：カシューナッツ植物の近縁種ＤＮＡを用いたＰＣＲによる選抜
表９に示す１５組のプライマーセットの中で、カシューナッツ植物の近縁種ＤＮＡと誤ってプライミングしないものを選抜するために、＜ＰＣＲ条件２＞を用いて、近縁種ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。カシューナッツ植物の近縁種としては、カシューナッツ植物と同じウルシ科の食品であるマンゴー、ピスタチオ、ピンクペッパー、スマックが知られている。本実験では、それらのうちマンゴー、ピスタチオ、ピンクペッパーの抽出ＤＮＡ ５０ｎｇをＰＣＲの鋳型とした。抽出方法は＜ＰＣＲ条件１＞でのＰＣＲに用いたカシューナッツ抽出ＤＮＡの抽出方法と同様である。＜ＰＣＲ条件２＞で増幅したＰＣＲ産物をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標）（島津製作所）で解析した。前記１５組のプライマーセットのうち、近縁種ＤＮＡを鋳型とした場合には目的とする断片長の増幅産物が検出されないことの基準を満たすプライマーセットは下記表に示す１２組であった（図１のレーン３、４及び５参照）。
表９に示す１５組のプライマーセットの中で、カシューナッツ植物の近縁種ＤＮＡと誤ってプライミングしないものを選抜するために、＜ＰＣＲ条件２＞を用いて、近縁種ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。カシューナッツ植物の近縁種としては、カシューナッツ植物と同じウルシ科の食品であるマンゴー、ピスタチオ、ピンクペッパー、スマックが知られている。本実験では、それらのうちマンゴー、ピスタチオ、ピンクペッパーの抽出ＤＮＡ ５０ｎｇをＰＣＲの鋳型とした。抽出方法は＜ＰＣＲ条件１＞でのＰＣＲに用いたカシューナッツ抽出ＤＮＡの抽出方法と同様である。＜ＰＣＲ条件２＞で増幅したＰＣＲ産物をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（登録商標）（島津製作所）で解析した。前記１５組のプライマーセットのうち、近縁種ＤＮＡを鋳型とした場合には目的とする断片長の増幅産物が検出されないことの基準を満たすプライマーセットは下記表に示す１２組であった（図１のレーン３、４及び５参照）。
【0113】
【表10】
【0114】
選抜５：カシューナッツＤＮＡ量５ｐｇにおけるＰＣＲによる選抜
表１０に示す１２組のプライマーセットの中で、カシューナッツＤＮＡ量が微量でも検出できるものを選抜するため、５ｐｇ、５００ｐｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡをＰＣＲの鋳型に用いて、＜ＰＣＲ条件２＞でＰＣＲを行った。カシューナッツ抽出ＤＮＡ量が５ｐｇ、５００ｐｇのどちらでも目的とする断片長に増幅産物を確認できるという基準を、表１０に示すすべてのプライマーセットが満たした（図１のレーン１及び２参照）。
表１０に示す１２組のプライマーセットの中で、カシューナッツＤＮＡ量が微量でも検出できるものを選抜するため、５ｐｇ、５００ｐｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡをＰＣＲの鋳型に用いて、＜ＰＣＲ条件２＞でＰＣＲを行った。カシューナッツ抽出ＤＮＡ量が５ｐｇ、５００ｐｇのどちらでも目的とする断片長に増幅産物を確認できるという基準を、表１０に示すすべてのプライマーセットが満たした（図１のレーン１及び２参照）。
【0115】
以上の５段階のプライマーの選抜のまとめを下記表に示す。
【0116】
【表11】
【0117】
＜プローブの設計＞
上記の選抜１～５により選抜された１２組のプライマーセットに対して、一般的にプローブを設計するときに用いられる下記表に示す基準に従いプローブを設計した。
上記の選抜１～５により選抜された１２組のプライマーセットに対して、一般的にプローブを設計するときに用いられる下記表に示す基準に従いプローブを設計した。
【0118】
【表12】
【0119】
上記の基準を満たすプローブのうち、前記１２組のプライマーセットと組み合わせたプローブを下記表に示す。プライマーセットＳ１３、Ｓ１４及びＳ３０については基準を満たすプローブを設計することができなかった。下記表には示していないが、プライマーセットＳ２６とプローブＰ２（配列番号１５）との組み合わせ、プライマーセットＳ２７とプローブＰ２（配列番号１５）又はＰ３（配列番号１６）との組み合わせ、プライマーセットＳ２９とプローブＰ２（配列番号１５）、Ｐ３（配列番号１６）又はＰ４（配列番号１７）との組み合わせ、プライマーセットＳ３２とプローブＰ３（配列番号１６）との組み合わせ、並びに、プライマーセットＳ３５、Ｓ３６又はＳ３７とプローブＰ３（配列番号１６）との組み合わせも、リアルタイムＰＣＲに使用可能である。
【0120】
【表13】
【0121】
リアルタイムＰＣＲにおける増幅効率および近縁種ＤＮＡを用いた特異性の評価
上記のプライマーセット及びプローブの組み合わせを用いてリアルタイムＰＣＲを以下の条件で行った。装置はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いた。増幅効率を求めるため、反応液中のカシューナッツ抽出ＤＮＡ量を５０ｐｇ，５ｐｇ，５００ｆｇ，５０ｆｇに設定した。増幅効率の計算式は、下記（１）であり、増幅効率が２の場合にＰＣＲが最適に行われると考えられる。Ｓｌｏｐｅの定義は後述する。
上記のプライマーセット及びプローブの組み合わせを用いてリアルタイムＰＣＲを以下の条件で行った。装置はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いた。増幅効率を求めるため、反応液中のカシューナッツ抽出ＤＮＡ量を５０ｐｇ，５ｐｇ，５００ｆｇ，５０ｆｇに設定した。増幅効率の計算式は、下記（１）であり、増幅効率が２の場合にＰＣＲが最適に行われると考えられる。Ｓｌｏｐｅの定義は後述する。
【0122】
【数1】
【0123】
＜ＰＣＲ条件３＞
ＰＣＲ反応液は、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、０．１μＭプローブ、並びに、ＰＣＲの鋳型として５０ｐｇ，５ｐｇ，５００ｆｇ又は５０ｆｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡまたは５０ｎｇのスマック抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表１４に示す温度条件によるＰＣＲに供した。スマック抽出ＤＮＡは、カシューナッツ抽出ＤＮＡと同様の方法で抽出した。
ＰＣＲ反応液は、１× ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．２μＭフォワードプライマー及びリバースプライマー、０．１μＭプローブ、並びに、ＰＣＲの鋳型として５０ｐｇ，５ｐｇ，５００ｆｇ又は５０ｆｇのカシューナッツ抽出ＤＮＡまたは５０ｎｇのスマック抽出ＤＮＡを含み、全量２５μＬとなるように作製し、以下の表１４に示す温度条件によるＰＣＲに供した。スマック抽出ＤＮＡは、カシューナッツ抽出ＤＮＡと同様の方法で抽出した。
【0124】
【表14】
【0125】
上記のプライマーセットとプローブとの組み合わせを用いたリアルタイムＰＣＲで測定されたＣｑ値、及び、Ｃｑ値とＤＮＡ量から計算した増幅効率を下記表に示す。ｓｌｏｐｅは、各サンプルのＤＮＡ量（ｆｇ）の常用対数を横軸、Ｃｑ値を縦軸としてプロットしたときの、近似直線の傾きを指す。
【0126】
【表15】
【0127】
プライマーセットとプローブとの組み合わせとしてＳ２５（Ｆ５－Ｒ２）／Ｐ１、Ｓ２６（Ｆ５－Ｒ３）／Ｐ１を用いたリアルタイムＰＣＲでは、鋳型となるカシューナッツＤＮＡ量が５００ｆｇ以上の場合にＣｑ値が検出された。プライマーセットとプローブの他の組み合わせを用いた場合にはカシューナッツＤＮＡ量が５０ｆｇの場合でもＣｑ値が検出された。なかでも、Ｓ３５（Ｆ７－Ｒ４）／Ｐ４、Ｓ３６（Ｆ７－Ｒ５）／Ｐ４、又は、Ｓ３７（Ｆ７－Ｒ６）／Ｐ４を用いたリアルタイムＰＣＲはＣｑ値が小さいためより好ましく、特に、Ｓ３５（Ｆ７－Ｒ４）／Ｐ４、又は、Ｓ３６（Ｆ７－Ｒ５）／Ｐ４を用いた場合に増幅効率が２により近いため更に好ましいことが確認された。
【0128】
更に、どのプライマーセットとプローブとの組合せを用いた場合でも、５０ｎｇのスマック抽出ＤＮＡを含む反応液中では、目的とする断片長の増幅産物が得られなかった。
【図1】
【配列表】