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特開2024-159617新規化合物及びウイルスの検出用試薬並びにそれを用いたウイルスの検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024159617
(43)【公開日】2024-11-08
(54)【発明の名称】新規化合物及びウイルスの検出用試薬並びにそれを用いたウイルスの検出方法
(51)【国際特許分類】
C07H 15/26 20060101AFI20241031BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241031BHJP
【ＦＩ】
C07H15/26 CSP
G01N33/569 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024069441
(22)【出願日】2024-04-23
(31)【優先権主張番号】P 2023074720
(32)【優先日】2023-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）集会名 令和５年度 第１回 ＢＶＡ創薬研究会 開催日 ２０２３年５月１８日 （２）集会名 大学見本市２０２３～イノベーション・ジャパン 開催日 ２０２３年８月２４，２５日 （３）発行者名 静岡県立大学 刊行物名 糖鎖科学中部拠点 第１９回「若手の力」フォーラム要旨集、第２頁及び第１２頁 発行日 ２０２３年９月２１日 （４）集会名 糖鎖科学中部拠点 第１９回「若手の力」フォーラム 開催日 ２０２３年９月２１日 （５）集会名 ＢｉｏＪａｐａｎ ２０２３ 開催日 ２０２３年１０月１１～１３日 （６）発行者名 山田 成樹 刊行物名 日本病院薬剤師会東海ブロック・日本薬学会東海支部 合同学術大会２０２３ 講演要旨集、第１９９頁 発行日 ２０２３年１１月１２日 （７）集会名 日本病院薬剤師会東海ブロック・日本薬学会東海支部 合同学術大会２０２３ 開催日 ２０２３年１１月１２日 （８）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４４／ｔｏｐ、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４４／ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ／ｌｉｓｔ 掲載日 ２０２４年３月５日 （９）集会名 日本薬学会第１４４年会 開催日 ２０２４年３月２８～３１日
(71)【出願人】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(71)【出願人】
【識別番号】503420833
【氏名又は名称】学校法人常翔学園
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】高橋 忠伸
(72)【発明者】
【氏名】紅林 佑希
(72)【発明者】
【氏名】成道 豊
(72)【発明者】
【氏名】竹内 英之
(72)【発明者】
【氏名】大坪 忠宗
(72)【発明者】
【氏名】池田 潔
【テーマコード（参考）】
4C057
【Ｆターム（参考）】
4C057AA18
4C057BB02
4C057CC03
4C057DD03
4C057JJ55
4C057JJ57
(57)【要約】 （修正有）
【課題】シアリダーゼを発現するウイルスのウイルス種を区別して検出することのできる検出用試薬を提供する。
【解決手段】本発明は、式（Ｉ）、式（ＩＩＩ）等で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、式（Ｉ）、式（ＩＩＩ）等で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物。
［式（ＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基又はイソプロピル基を示す。］
【化1】
【請求項2】
シアリダーゼ活性を有するウイルス又はウイルスのシアリダーゼの検出用試薬であって、
以下式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする検出用試薬。
［式（ＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基又はイソプロピル基を示す。］
以下式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする検出用試薬。
【化2】
【請求項3】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
前記式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項4】
前記ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスであり、
前記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項5】
前記ウイルスが、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスであり、
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項6】
前記ウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスであり、
前記式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項7】
インフルエンザウイルスの検出方法であって、
請求項３に記載の検出用試薬を検体に添加する工程、及び
前記工程により生じる蛍光物質に基づいて、インフルエンザウイルスの存在の有無を判別することを特徴とする検出方法。
請求項３に記載の検出用試薬を検体に添加する工程、及び
前記工程により生じる蛍光物質に基づいて、インフルエンザウイルスの存在の有無を判別することを特徴とする検出方法。
【請求項8】
インフルエンザウイルスの検出方法であって、
請求項３に記載の検出用試薬を用いて、インフルエンザウイルスの感染細胞を蛍光イメージングすることを特徴とする検出方法。
請求項３に記載の検出用試薬を用いて、インフルエンザウイルスの感染細胞を蛍光イメージングすることを特徴とする検出方法。
【請求項9】
前記ウイルスがムンプスウイルスであり、
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項10】
前記ウイルスがムンプスウイルスであり、
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、ヘプチル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
前記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、ヘプチル基であることを特徴とする、請求項２に記載の検出用試薬。
【請求項11】
ムンプスウイルスの検出方法であって、
請求項９又は１０に記載の検出用試薬を検体に添加する工程、及び
前記工程により生じる蛍光物質に基づいて、ムンプスウイルスの存在の有無を判別することを特徴とする検出方法。
請求項９又は１０に記載の検出用試薬を検体に添加する工程、及び
前記工程により生じる蛍光物質に基づいて、ムンプスウイルスの存在の有無を判別することを特徴とする検出方法。
【請求項12】
ムンプスウイルスの検出方法であって、
請求項９又は１０に記載の検出用試薬を用いて、ムンプスウイルスの感染細胞を蛍光イメージングすることを特徴とする検出方法。
請求項９又は１０に記載の検出用試薬を用いて、ムンプスウイルスの感染細胞を蛍光イメージングすることを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）で表される新規化合物並びにこの化合物を含有する、ウイルス又はウイルスのシアリダーゼの検出用試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザウイルス、ムンプス（おたふく風邪）ウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスは流行性の高いヒト病原ウイルスである。インフルエンザウイルスについては、抗原検査薬による診断が実施されているが、ムンプスウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスについては、現状では、臨床で簡易に利用できる検査薬は導入されていない。
【0003】
また、この種のウイルスの流行状況の把握のため、公的な衛生検査機関では臨床検体からウイルスを分離培養し、ウイルスを同定することが行われている。ウイルスを分離培養する際に、感染細胞の形態変化（ＣＰＥ）はウイルス種の推定に利用される培養確認法の一つであるが、形態変化そのものを明確に観察できないことがある。そのため、ウイルス感染細胞からのウイルス株の単離及びウイルスの同定には、培養上清の赤血球凝集活性によるウイルス培養の確認、遺伝子検査あるいは抗ウイルス抗体を利用したウイルスの同定等の検査が行われており、多数の検体を取り扱う際に、このような検査は大変な労力となっている。
【0004】
他方、本件発明者らは、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルス等のシアリダーゼ活性を有するウイルスを高感度に蛍光検出できる検出用試薬として、以下化学式に示す「ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ」及び「ｍＣ９－ｙｎｅ－ＢＴＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ（ＢＴＰ９－Ｎｅｕ５Ａｃ）」を開発した（非特許文献１及び特許文献１参照）。これらの検出用試薬は、シアリダーゼを発現するウイルス感染細胞を簡単に蛍光イメージングすることができる。
【0005】
【化1】
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第６４９３９６４号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】高橋忠伸・紅林佑希・大坪忠宗・池田潔・南彰・鈴木隆、“シアリダーゼを利用したウイルス感染細胞の蛍光イメージング”、分析化学、２０１６年、第６５巻、第１２号、ｐｐ．６８９－７０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上述したように、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスの感染診断にあたり、臨床で簡易に利用できる検査薬や、衛生検査機関等においては、臨床検体からのウイルス種を簡易に判別したり、ウイルス株を簡易に単離する技術が求められている。
【0009】
他方、非特許文献１及び特許文献１で提案されたウイルス検出用試薬「ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ」及び「ｍＣ９－ｙｎｅ－ＢＴＰ－ＮｅｕＡｃ（ＢＴＰ９－Ｎｅｕ５Ａｃ）」は、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルス等のシアリダーゼを発現するウイルスを高感度に検出するものの、各ウイルス種を区別して判定することはできないという問題があった。
【0010】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、シアリダーゼを発現するウイルスのウイルス種を区別して検出することのできる検出用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、シアリダーゼ基質構造のシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）構造に着目し、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス等の各シアリダーゼの違いを区別して特異的に検出する新規シアル酸誘導体化合物を見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0012】
上記課題を解決する本発明は、以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物であり、式（ＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基又はイソプロピル基を示している。
【0013】
【化2】
【0014】
これら式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物は、シアリダーゼを発現するウイルスの各シアリダーゼの違いを区別して特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、シアリダーゼ活性を有するウイルス種を区別して検出することができる。より具体的には、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスを区別して蛍光検出することができ、Ａ型インフルエンザウイルス、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス、Ａ型若しくはＢ型のインフルエンザウイルス又はムンプスウイルスの存在の有無を判別することができる。これにより、臨床検査薬や、臨床検体からのウイルス種の判別、ウイルスの分離培養及びウイルス株の単離にこの化合物を活用することができる。
【0015】
また、上記課題を解決するため、本発明の検出用試薬は、シアリダーゼ活性を有するウイルス又はウイルスのシアリダーゼの検出用試薬であって、以下の式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、式（ＩＩ）中、Ｒ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基又はイソプロピル基を示している。
【0016】
【化3】
【0017】
上述の化合物は、シアリダーゼを発現するウイルスの各シアリダーゼの違いを区別して特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、シアリダーゼ活性を有するウイルス種及びそのシアリダーゼを区別して検出することができる。より具体的には、Ａ型インフルエンザウイルス、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス、Ａ型若しくはＢ型のインフルエンザウイルス又はムンプスウイルス及びそれらウイルスのシアリダーゼを区別して検出することができる。また、これらの化合物により、ウイルス感染細胞におけるシアリダーゼ活性の存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすることができる。また、ウイルス感染細胞のライブイメージングを行うことができるため、ウイルス感染細胞からのウイルスの分離培養及びウイルス株の単離も容易とすることができる。
【0018】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスがインフルエンザウイルスであり、上述した式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、この式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることも好ましい。式（Ｉ）に係る化合物は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、Ａ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。また、式（ＩＩ）に係る化合物は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスとの違いを区別して、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼを、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼと区別して検出することができる。式（ＩＩＩ）に係る化合物は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス並びにそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0019】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスがＡ型インフルエンザウイルスであり、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することも好ましい。式（Ｉ）に係る化合物は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、Ａ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0020】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスが、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスであり、式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、この式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基であることも好ましい。式（ＩＩ）に係る化合物は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとの違いを区別して、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼを、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルス及びそのシアリダーゼと区別して検出することができる。
【0021】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスであり、式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することも好ましい。式（ＩＩＩ）に係る化合物は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型又はＢ型のシアリダーゼと特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス並びにそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0022】
また、本発明の検出方法は、インフルエンザウイルスの検出方法であって、上述した式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基である検出用試薬を検体に添加する工程、及びこの工程により生じる蛍光物質に基づいて、インフルエンザウイルスの存在の有無を判別する。式（Ｉ）に係る化合物は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］を生じさせる。そのため、Ａ型インフルエンザウイルスを他のウイルス種と区別して検出することができる。式（ＩＩ）に係る化合物は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとの違いを区別して、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせる。そのため、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスを、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスと区別して検出することができる。式（ＩＩＩ）に係る化合物は、Ａ型又はＢ型のインフルエンザウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、Ａ型又はＢ型のインフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせる。そのため、Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルスを他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0023】
また、本発明の検出方法は、インフルエンザウイルスの検出方法であって、上述した式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、該式（ＩＩ）中のＲ１は、イソプロピル基である検出用試薬を用いて、インフルエンザウイルスの感染細胞を蛍光イメージングする。式（Ｉ）に係る化合物は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせるところ、感染細胞中におけるＡ型インフルエンザウイルスの存在部位が、このＢＴＰ３によって組織化学的に蛍光イメージングされる。式（ＩＩ）に係る化合物は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせるところ、感染細胞中におけるＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの存在部位が、このＢＴＰ３によって組織化学的に蛍光イメージングされる。式（ＩＩＩ）に係る化合物は、Ａ型又はＢ型のインフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせるところ、感染細胞中におけるＡ型又はＢ型のインフルエンザウイルスの存在部位が、このＢＴＰ３によって組織化学的に蛍光イメージングされる。
【0024】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスがムンプスウイルスであり、上述した式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、式（ＩＩ）中のＲ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基であることも好ましい。これらの化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、ムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応するシアリダーゼ基質化合物である。そのため、ムンプスウイルス及びそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0025】
また、本発明の検出用試薬は、検出対象のウイルスがムンプスウイルスであり、上述した式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、式（ＩＩ）中のＲ１は、ヘプチル基であることも好ましい。この化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、ムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応すると共に、反応性も高いシアリダーゼ基質化合物である。そのため、ムンプスウイルス及びそのシアリダーゼを、他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0026】
また、本発明の検出方法は、ムンプスウイルスの検出方法であって、上述した式（ＩＩ）で表され、式（ＩＩ）中のＲ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基である化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有する検出用試薬を検体に添加する工程、及びこの工程により生じる蛍光物質に基づいて、ムンプスウイルスの存在の有無を判別する。これらの化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼとその他ウイルス種のシアリダーゼとの違いを区別して、ムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］を生じさせる。そのため、ムンプスウイルスを他のウイルス種と区別して検出することができる。
【0027】
また、本発明の検出方法は、ムンプスウイルスの検出方法であって、上述した式（ＩＩ）で表され、式（ＩＩ）中のＲ１は、炭素数３～９の直鎖アルキル基である化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有する検出用試薬を用いて、ムンプスウイルスの感染細胞を蛍光イメージングする。これらの化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応して蛍光物質であるＢＴＰ３を生じさせるところ、感染細胞中におけるムンプスウイルスの存在部位が、このＢＴＰ３によって組織化学的に蛍光イメージングされる。
【発明の効果】
【0028】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有するウイルスの検出用試薬及びウイルスの検出方法を提供することができる。
（１）本発明に係る化合物を検体に添加することにより、容易に、シアリダーゼ活性を有するウイルス種及びそのシアリダーゼを区別して検出することができる。
（２）化合物自体の合成が比較的容易である。
（３）ウイルス感染細胞におけるウイルスの存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすることができる。
（４）ウイルス感染細胞のライブイメージングを行うことができるため、ウイルス感染細胞からのウイルスの分離培養及びウイルス株の単離が容易である。
（１）本発明に係る化合物を検体に添加することにより、容易に、シアリダーゼ活性を有するウイルス種及びそのシアリダーゼを区別して検出することができる。
（２）化合物自体の合成が比較的容易である。
（３）ウイルス感染細胞におけるウイルスの存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすることができる。
（４）ウイルス感染細胞のライブイメージングを行うことができるため、ウイルス感染細胞からのウイルスの分離培養及びウイルス株の単離が容易である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】実施例１における、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図2】実施例２における、化合物ｂ（２２－００１ａ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）の他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図3】実施例３における、化合物ｂ（２２－００１ａ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）のＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルス又は他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図4】実施例４における、化合物ｂ（２２－００１ａ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による、ウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図5】実施例５における、化合物ｂ（２２－００１ａ）による、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス株の感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図6】実施例６における、化合物ｂ（２２－００１ａ）による、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカスの蛍光イメージング像を示す写真である。
【図7】実施例７における、化合物ｂ（２２－００１ａ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による、ウイルスのフォーカスの蛍光イメージング像を示す写真である。
【図8】実施例８における、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）、化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）及び化合物ｂ（２２－００１ａ）のＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株）のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図9】実施例８における、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）、化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）及び化合物ｂ（２２－００１ａ）のＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株）のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図10】実施例８における、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）及び化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）のＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株）のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図11】実施例８における、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）及び化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）の他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図12】実施例９における、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による、ウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図13】実施例１０における、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）のＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図14】実施例１１における、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による、ウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図15】実施例１２における、ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図16】実施例１３における、他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフであって、（ａ）化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、（ｂ）化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、（ｃ）化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、（ｄ）化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、（ｅ）化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び（ｆ）化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）の試験結果を示すグラフである。
【図17】実施例１４における、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）及び化合物ａ（陽性対照、ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による、ウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図18】実施例１５における各化合物の（ａ）ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株のシアリダーゼに対する反応性、（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図19】実施例１５における各化合物の（ａ）Ｂ型インフルエンザウイルス Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のシアリダーゼに対する反応性、（ｂ）ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図20】実施例１５における各化合物のヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株のシアリダーゼに対する反応性を示すグラフである。
【図21】実施例１６における、各化合物による（ａ）ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング像、（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図22】実施例１６における、各化合物による（ａ）Ｂ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージング像、（ｂ）ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図23】実施例１６における、各化合物による、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【図24】実施例１７における、各化合物による、ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング像を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下、本発明に係る新規化合物、ウイルスの検出用試薬及びウイルスの検出方法について、詳細に説明する。
【0031】
本発明に係るウイルスの検出用試薬には以下式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸誘導体が含まれている。本発明に係るシアル酸誘導体に係る化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。
【0032】
【化4】
【0033】
上述した化合物を表す式（Ｉ）の化合物名は、以下の通りである。
・式（Ｉ）：５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（Ｉ）：５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
【0034】
また、上述した化合物を表す式（ＩＩ）中、Ｒ１で示される原子又は分子としては、炭素数３～９の直鎖アルキル基又はイソプロピル基が挙げられる。上述の式（ＩＩ）で表される化合物は、具体的には、以下式に示される化合物（１）～（８）である。各式の化合物名は次の通りである。
・式（１）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ブチルアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（２）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ペンタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（３）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ヘキサンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（４）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ヘプタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（５）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－オクタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（６）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ノナンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（７）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－デカンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（８）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－イソブチルアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（１）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ブチルアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（２）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ペンタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（３）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ヘキサンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（４）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ヘプタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（５）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－オクタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（６）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－ノナンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（７）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－デカンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（８）：２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－イソブチルアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
【0035】
【化5】
【0036】
【化6】
【0037】
【化7】
【0038】
【化8】
【0039】
【化9】
【0040】
【化10】
【0041】
【化11】
【0042】
【化12】
【0043】
上述した化合物を表す式（ＩＩＩ）の化合物名は、以下の通りである。
・式（ＩＩＩ）：５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２－メチル－２－エチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
・式（ＩＩＩ）：５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２－メチル－２－エチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸。
【0044】
また、各式で表わされる化合物のうち、Ａ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼの検出用試薬に含有される化合物は、式（Ｉ）に示す、５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸である。
【0045】
式（Ｉ）に示す化合物は、例えば以下式に示す合成経路により合成することができる。一例として、既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）のメタノール溶液にナトリウムメトキシドを加えて反応させ、テトラヒドロキシ体を得た後、得られたテトラヒドロキシ体をアセトンに懸濁し、アセトンジメチルアセタール（ＤＭＰ）とパラトルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）を加えて反応させて以下式に示す化合物Ｙを得る。化合物Ｙにメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応させることで式（Ｉ）に示す化合物を得ることができる。
【0046】
【化13】
【0047】
また、各式で表わされる化合物のうち、Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルス並びにそのシアリダーゼの検出用試薬に含有される化合物は、式（ＩＩＩ）に示す、５－アセトアミド－２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－６－（（２－メチル－２－エチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）（ヒドロキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸である。
【0048】
式（ＩＩＩ）に示す化合物は、例えば以下式に示す合成経路により合成することができる。一例として、既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）のメタノール溶液にナトリウムメトキシドを加えて反応させ、テトラヒドロキシ体を得た後、得られたテトラヒドロキシ体をアセトニトリル（またはＤＭＦ）に溶解し、カンファースルホン酸（ＣＳＡ）を含む、対応するケトン－ケトンジメチルアセタール溶液を加えて反応させ、アセタール体のメチルエステルを得る。得られたメチルエステル体にメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応させることで式（ＩＩＩ）に示す化合物を得ることができる。なお、カンファースルホン酸（ＣＳＡ）を含有する、対応するケトン－ケトンジメチルアセタール溶液は、例えば、以下式に示す対応するケトンとオルトギ酸トリメチルの混合溶液にカンファースルホン酸（ＣＳＡ）を加えることにより、ケトン－ケトンジメチルアセタール－ＣＳＡ溶液として調製され得る。
【0049】
【化14】
【0050】
また、各式で表わされる化合物のうち、ムンプスウイルス又はそのシアリダーゼの検出用試薬に含有される化合物は、式（１）～式（７）に示す化合物であることが好ましく、特異的な検出性に優れると共に検出時における蛍光強度にも優れる観点から、式（２）～式（６）に示す化合物であることがより好ましく、式（５）に示す２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－オクタンアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸が特に好ましい。
【0051】
また、各式で表わされる化合物のうち、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼの検出用試薬に含有される化合物は、式（８）に示す、２－（２－（ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノキシ）－４－ヒドロキシ－５－イソブチルアミド－６－（１，２，３－トリヒドロキシプロピル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸である。
【0052】
式（１）～式（８）に示す化合物は、例えば以下式に示す合成経路により合成することができる。一例として、式（１）に係る化合物は、既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液にＢｏｃ２Ｏ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加えて６０℃で反応させた後、その反応液にＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンを加えて反応させ、化合物Ｚを得る。化合物Ｚにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて脱保護体をＴＦＡ塩として得た後、酢酸エチルに溶解し、水と炭酸水素ナトリウムを加え、反応試薬として酪酸無水物を加えて反応させ、化合物Ｅ（１）を得る。得られた化合物Ｅ（１）にメタノールとナトリウムメトキシドを加えて反応させた後、水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応させることで、化合物（１）を得ることができる。ここで用いた反応試薬の酪酸無水物の替わりに、反応試薬化合物を適宜選択することにより、式（１）に示す化合物と同様にして、式（２）～（８）に示す化合物を得ることができる。
【0053】
【化15】
【0054】
本発明における検出用試薬は、シアリダーゼ活性を有するウイルス又はウイルスのシアリダーゼを検出するための検出用試薬である。シアリダーゼ活性を有するウイルスには、インフルエンザウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス及びセンダイウイルスがあり、これらのウイルスは全て、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属し、それ以外のウイルスはパラミクソウイルス科に属している。本発明における検出用試薬は、このうち、Ａ型インフルエンザウイルス、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス、Ａ型若しくはＢ型のインフルエンザウイルス又はムンプスウイルス及びそれらのシアリダーゼを区別して検出することができる。また、本発明に係る検出用試薬は、ウイルス感染細胞におけるウイルスの存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすることができ、ウイルス感染細胞のライブイメージングを行うことができる。そのため、本発明における検出用試薬は、単なる蛍光測定試薬として用いられるだけでなく、蛍光イメージング剤として用いることができる。
【0055】
また、本発明における検出用試薬には、本発明の作用効果を損なわない範囲において、上述した以外の他の成分が含まれていてもよい。例えば、溶媒、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、無機塩類等が挙げられる。また、本発明に係る検出用試薬は、研究用試薬及び臨床検査薬、臨床分析薬等あらゆる場面で使用され得る。
【0056】
本発明に係る式（Ｉ）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いた、Ａ型インフルエンザウイルス又はＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼの検出方法について説明する。まず、検出用試薬としては、式（Ｉ）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いる。これを検体に添加すると、検体中にＡ型インフルエンザウイルス又はＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼが存在する場合には、式（Ｉ）に示す化合物がそのＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ここで、式（Ｉ）に示す化合物は、Ａ型インフルエンザウイルス以外のウイルスやＡ型インフルエンザウイルス以外のシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、式（Ｉ）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加することにより、蛍光物質であるＢＴＰ３による蛍光が検出された場合には、Ａ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼが存在する旨判別することができる。式（Ｉ）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、懸濁液や培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0057】
また、本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞の蛍光イメージングによる検出方法について説明する。式（Ｉ）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加すると、検体中にＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞が存在する場合には、Ａ型インフルエンザウイルスが発現しているシアリダーゼと式（Ｉ）に示す化合物とが特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ＢＴＰ３は水に不溶性の蛍光物質であり、局所染色性を有している。ここで、式（Ｉ）に示す化合物は、Ａ型インフルエンザウイルス以外のウイルスが発現しているシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、検体中にＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞が含まれている場合には、その感染細胞が存在する部位が組織化学的に蛍光イメージングされる。式（Ｉ）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。さらに、この蛍光イメージングはライブイメージングにて行うことができるため、この蛍光イメージングを利用して、さまざまなウイルス種が混在するような検体についても、Ａ型インフルエンザウイルス株の単離を容易に行うことができる。
【0058】
次に、本発明に係る式（ＩＩＩ）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いた、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス並びにこれらのシアリダーゼの検出方法について説明する。まず、検出用試薬としては、式（ＩＩＩ）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いる。これを検体に添加すると、検体中にＡ型インフルエンザウイルス若しくはＢ型インフルエンザウイルス、またはこれらのインフルエンザウイルスのシアリダーゼが存在する場合には、式（ＩＩＩ）に示す化合物が、そのＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ又はＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ここで、式（ＩＩＩ）に示す化合物は、Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルス以外のウイルスやＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス以外のシアリダーゼとはほとんど反応しない。そのため、式（ＩＩＩ）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加することにより、蛍光物質であるＢＴＰ３による蛍光が検出された場合には、Ａ型インフルエンザウイルス若しくはＢ型インフルエンザウイルス又はこれらのシアリダーゼが存在する旨判別することができる。式（ＩＩＩ）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、懸濁液や培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0059】
また、本発明に係るＡ型又はＢ型インフルエンザウイルスの感染細胞の蛍光イメージングによる検出方法について説明する。式（ＩＩＩ）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加すると、検体中にＡ型又はＢ型のインフルエンザウイルスの感染細胞が存在する場合には、Ａ型又はＢ型のインフルエンザウイルスが発現しているシアリダーゼと式（ＩＩＩ）に示す化合物とが特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ＢＴＰ３は水に不溶性の蛍光物質であり、局所染色性を有している。ここで、式（ＩＩＩ）に示す化合物は、Ａ型又はＢ型のインフルエンザウイルス以外のウイルスが発現しているシアリダーゼとはほとんど反応しない。そのため、検体中にＡ型又はＢ型のインフルエンザウイルスの感染細胞が含まれている場合には、その感染細胞が存在する部位が組織化学的に蛍光イメージングされる。式（ＩＩＩ）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0060】
次に、本発明に係る式（８）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いた、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼの検出方法について説明する。まず、検出用試薬としては、式（８）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いる。これを検体に添加すると、検体中にＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼが存在する場合には、式（８）に示す化合物がそのＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ここで、式（８）に示す化合物は、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、式（８）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加することにより、蛍光物質であるＢＴＰ３による蛍光が検出された場合には、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス又はそのシアリダーゼが存在する旨判別することができる。なお、式（８）に示す化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼ及びヒトパラインフルエンザウイルスのシアリダーゼに対しても若干反応するため、予めＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出可能である式（Ｉ）又は式（ＩＩＩ）に示す化合物を用いてスクリーニングを行った後、その亜型を識別するために、式（８）に示す化合物を用いて検出を行うことが好ましい。式（８）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、懸濁液や培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0061】
また、本発明に係るＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞の蛍光イメージングによる検出方法について説明する。式（８）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加すると、検体中にＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞が存在する場合には、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスが発現しているシアリダーゼと式（８）に示す化合物とが反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ＢＴＰ３は水に不溶性の蛍光物質であり、局所染色性を有している。ここで、式（８）に示す化合物は、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスが発現しているシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、検体中にＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞が含まれている場合には、その感染細胞が存在する部位が組織化学的に蛍光イメージングされる。式（８）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0062】
次に、本発明に係るムンプスウイルス又はムンプスウイルスのシアリダーゼの検出方法について説明する。まず、検出用試薬としては、上述した式（１）～（７）に示す化合物を含有する検出用試薬を用いる。これを検体に添加すると、検体中にムンプスウイルス又はそのシアリダーゼが存在する場合には、式（１）～（７）に示す化合物がムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ここで、式（１）～（７）に示す化合物は、ムンプスウイルス以外のウイルスやムンプスウイルス以外のシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、式（１）～（７）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加することにより、蛍光物質であるＢＴＰ３による蛍光が検出された場合には、ムンプスウイルス又はそのシアリダーゼが存在する旨判別することができる。式（１）～（７）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、懸濁液や培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。
【0063】
また、本発明に係るムンプスウイルスの感染細胞の蛍光イメージングによる検出方法について説明する。式（１）～（７）に示す化合物を含有する検出用試薬を検体に添加すると、検体中にムンプスウイルスの感染細胞が存在する場合には、ムンプスウイルスが発現しているシアリダーゼと式（１）～（７）に示す化合物とが特異的に反応し、蛍光物質であるＢＴＰ３が生じる。ＢＴＰ３は水に不溶性の蛍光物質であり、局所染色性を有している。ここで、式（１）～（７）に示す化合物は、ムンプスウイルス以外のウイルスが発現しているシアリダーゼとは反応せず、蛍光物質は生じない。そのため、検体中にムンプスウイルスの感染細胞が含まれている場合には、その感染細胞が存在する部位が組織化学的に蛍光イメージングされる。式（１）～（７）に示す化合物の反応濃度は、検体及び使用態様によっても異なるが、５μＭ～１００ｍＭとすることが好ましく、１０μＭ～１０ｍＭとすることがより好ましい。また、反応時間としては、化合物の濃度や添加する検体の状態にもよるが、一例として、培養液に添加する場合には、数分～１時間程度が好ましく、５分～３０分程度がより好ましい。また、寒天培地等の検体に添加する場合には、数時間～１日程度が好ましく、３時間～１２時間程度がより好ましい。さらに、この蛍光イメージングはライブイメージングにて行うことができるため、この蛍光イメージングを利用して、さまざまなウイルス種が混在するような検体についても、ムンプスウイルス株の単離を容易に行うことができる。
【0064】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0065】
［実施例１］
１．Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
本実施例では、スクリーニング対象化合物として、公知のシアリダーゼ基質であるＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃのシアル酸構造部分を改変した誘導体を選択した。スクリーニング対象化合物を以下表１に示す。Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物の探索は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の測定試験により行った。具体的には、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとスクリーニング対象化合物とを反応させた際に、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに加水分解されて生じる蛍光物質である、ＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］の蛍光強度を測定することにより行った。試験にあたっては、陽性対照としてＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）を用いた。化合物ａのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃは、東京化成工業株式会社製を用いた。また、以下表１に示すｂ～ｈに示す化合物は、以下のようにして合成した。合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
１．Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
本実施例では、スクリーニング対象化合物として、公知のシアリダーゼ基質であるＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃのシアル酸構造部分を改変した誘導体を選択した。スクリーニング対象化合物を以下表１に示す。Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物の探索は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の測定試験により行った。具体的には、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとスクリーニング対象化合物とを反応させた際に、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに加水分解されて生じる蛍光物質である、ＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］の蛍光強度を測定することにより行った。試験にあたっては、陽性対照としてＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）を用いた。化合物ａのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃは、東京化成工業株式会社製を用いた。また、以下表１に示すｂ～ｈに示す化合物は、以下のようにして合成した。合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
【0066】
【表1】
【0067】
［化合物ｂ（２２－００１ａ）の合成］
化合物ｂは、以下式に基づき、合成した。
化合物ｂは、以下式に基づき、合成した。
【0068】
【化16】
【0069】
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）１４．９３ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５０ｍＬ）に、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、４．０ｍＬ）を加えて室温で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーを確認しながら１時間毎にナトリウムメトキシド（１．５ｍＬ）を２回加えた。原料消失を確認後、酢酸（１．５ｍＬ）を加えて反応を停止した。反応液を減圧濃縮して残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）で精製してテトラヒドロキシ体（６．６８ｇ、収率５７％）を白色固体として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05172, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.05115.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05172, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.05115.
【0070】
引き続いて、得られたテトラヒドロキシ体（６．６８ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）をアセトン（９０ｍＬ）に懸濁し、アセトンジメチルアセタール（ＤＭＰ、６．６８ｍＬ、５．０ｅｑ．）、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、５４９ｍｇ、０．２ｅｑ．）を順次加えて室温で３時間攪拌した。ＤＭＰ（６．６８ｍＬ）、ＰＰＴＳ（５６０ｍｇ）を追加してさらに攪拌し、薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加えて反応を停止した。酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝７：１）で精製して化合物Ｙを白色固体（５．３０ｇ，収率７５％）として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 673.08313; Found: 673.08363, Calcd for C28H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 675.08109; Found: 675.08145.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 673.08313; Found: 673.08363, Calcd for C28H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 675.08109; Found: 675.08145.
【0071】
引き続いて、化合物Ｙ（１６３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）にメタノール（１ｍＬ）、水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｍ、１５０μＬ）を順次加えて室温で一晩攪拌した。反応液に酢酸（１５μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｂ（９３．８ｍｇ、収率５９％）を白色固体として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 659.06748; Found: 659.06992, Calcd for C27H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 661.06544; Found: 661.06630.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 659.06748; Found: 659.06992, Calcd for C27H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 661.06544; Found: 661.06630.
【0072】
［化合物ｃ～ｈの合成］
化合物ｃ～ｈは、以下式に基づき、合成した。なお、以下式において、化合物Ｅｃ及び化合物ｃにおけるＲはイソプロピル基であり、化合物Ｅｄ及び化合物ｄにおけるＲはプロピル基であり、化合物Ｅｅ及び化合物ｅにおけるＲはｔｅｒｔ－ブチル基であり、化合物Ｅｆ及び化合物ｆにおけるＲはメトキシ基であり、化合物Ｅｇ及び化合物ｇにおけるＲはフェニル基であり、化合物Ｅｈ及び化合物ｈにおけるＲはヘプチル基である。
化合物ｃ～ｈは、以下式に基づき、合成した。なお、以下式において、化合物Ｅｃ及び化合物ｃにおけるＲはイソプロピル基であり、化合物Ｅｄ及び化合物ｄにおけるＲはプロピル基であり、化合物Ｅｅ及び化合物ｅにおけるＲはｔｅｒｔ－ブチル基であり、化合物Ｅｆ及び化合物ｆにおけるＲはメトキシ基であり、化合物Ｅｇ及び化合物ｇにおけるＲはフェニル基であり、化合物Ｅｈ及び化合物ｈにおけるＲはヘプチル基である。
【0073】
【化17】
【0074】
［化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）の合成］
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）１５．８４ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５０ｍＬ）にＢｏｃ２Ｏ（６．８７ｇ、１．５ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４９ｍｇ、０．１ｅｑ．）を加えて６０℃で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、放冷した。反応液にＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（４．５ｍＬ、２．０ｅｑ．）を加えて、室温で一晩攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して化合物Ｚを白色泡状物（８．２５ｇ、収率４９％）として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C36H41 79BrN2NaO14S [M+Na]+ 859.13596; Found 859.13463, Calcd for C36H41 81BrN2NaO14S [M+Na]+ 861.13391; Found 861.13193.
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）１５．８４ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１５０ｍＬ）にＢｏｃ２Ｏ（６．８７ｇ、１．５ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４９ｍｇ、０．１ｅｑ．）を加えて６０℃で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、放冷した。反応液にＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン（４．５ｍＬ、２．０ｅｑ．）を加えて、室温で一晩攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して化合物Ｚを白色泡状物（８．２５ｇ、収率４９％）として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C36H41 79BrN2NaO14S [M+Na]+ 859.13596; Found 859.13463, Calcd for C36H41 81BrN2NaO14S [M+Na]+ 861.13391; Found 861.13193.
【0075】
引き続いて、化合物Ｚ（８３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を加えて室温で３０分攪拌した。溶媒を減圧濃縮して脱保護体をＴＦＡ塩として得た。得られた未精製の脱保護体を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解した。原料アミンＴＦＡ塩の酢酸エチル溶液（１０ｍＬ）に水（１０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（８４０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、イソ酪酸無水物（６３μＬ、１．５ｅｑ．）を加えて１４時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して化合物Ｅｃ（２０８ｍｇ）を得た。得られた化合物は精製せずに次の反応に用いた。
【0076】
未精製の化合物Ｅｃ（２００ｍｇ）にメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｃ（１４．２ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C26H30 79BrN2O9S [M+H]+: 625.08554; Found: 625.08823, Calcd for C26H30 81BrN2O9S [M+H]+: 627.08349; Found: 627.08348, Calcd for C26H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 647.06748; Found: 647.06603, Calcd for C26H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 649.06544; Found: 649.06682.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C26H30 79BrN2O9S [M+H]+: 625.08554; Found: 625.08823, Calcd for C26H30 81BrN2O9S [M+H]+: 627.08349; Found: 627.08348, Calcd for C26H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 647.06748; Found: 647.06603, Calcd for C26H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 649.06544; Found: 649.06682.
【0077】
［化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）の合成］
化合物ｄは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに酪酸無水物（６１μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｄ（２３３ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｄ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｄ（２０．７ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C26H30 79BrN2O9S [M+H]+: 625.08554; Found: 625.08433, Calcd for C26H30 81BrN2O9S [M+H]+: 627.08349; Found: 627.08151, Calcd for C26H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 647.06748; Found: 647.06345, Calcd for C26H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 649.06544; Found: 649.06531.
化合物ｄは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに酪酸無水物（６１μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｄ（２３３ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｄ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｄ（２０．７ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C26H30 79BrN2O9S [M+H]+: 625.08554; Found: 625.08433, Calcd for C26H30 81BrN2O9S [M+H]+: 627.08349; Found: 627.08151, Calcd for C26H29 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 647.06748; Found: 647.06345, Calcd for C26H29 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 649.06544; Found: 649.06531.
【0078】
［化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）の合成］
化合物ｅは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ピバロイル（４６μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｅ（１９４ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｅ（１９４ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｅ（２５．６ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H32 79BrN2O9S [M+H]+: 639.10119; Found: 639.09942, Calcd for C27H32 81BrN2O9S [M+H]+: 641.09914; Found: 641.09765.
化合物ｅは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ピバロイル（４６μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｅ（１９４ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｅ（１９４ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｅ（２５．６ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H32 79BrN2O9S [M+H]+: 639.10119; Found: 639.09942, Calcd for C27H32 81BrN2O9S [M+H]+: 641.09914; Found: 641.09765.
【0079】
［化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）の合成］
化合物ｆは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりにクロロギ酸メチル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｆ（１９７ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｆ（１９７ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｆを白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C24H26 79BrN2O10S [M+H]+: 613.04915; Found: 613.05138, Calcd for C24H26 81BrN2O10S [M+H]+: 615.04711; Found: 615.04780, Calcd for C24H25 79BrN2NaO10S [M+Na]+: 635.03110; Found: 635.03255, Calcd for C24H25 81BrN2NaO10S [M+Na]+: 637.02905; Found: 637.02923.
化合物ｆは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりにクロロギ酸メチル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｆ（１９７ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｆ（１９７ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｆを白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C24H26 79BrN2O10S [M+H]+: 613.04915; Found: 613.05138, Calcd for C24H26 81BrN2O10S [M+H]+: 615.04711; Found: 615.04780, Calcd for C24H25 79BrN2NaO10S [M+Na]+: 635.03110; Found: 635.03255, Calcd for C24H25 81BrN2NaO10S [M+Na]+: 637.02905; Found: 637.02923.
【0080】
［化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）の合成］
化合物ｇは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ベンゾイル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｇ（２３５ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｇ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｇを白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 681.05183; Found: 681.05292, Calcd for C29H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 683.04979; Found: 683.04819, Calcd for C29H26 79BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 703.03378; Found: 703.03642, Calcd for C29H26 81BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 705.03173; Found: 705.03320.
化合物ｇは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ベンゾイル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｇ（２３５ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｇ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｇを白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 681.05183; Found: 681.05292, Calcd for C29H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 683.04979; Found: 683.04819, Calcd for C29H26 79BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 703.03378; Found: 703.03642, Calcd for C29H26 81BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 705.03173; Found: 705.03320.
【0081】
［化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）の合成］
化合物ｈは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化オクタノイル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｈ（２５８ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｈ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｈ（２６．５ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C30H37 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 703.13008; Found: 703.12760, Calcd for C30H37 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 705.12804; Found: 705.12621, Calcd for C30H36 79BrN2NaO9S [M-H+2Na]+: 725.11203; Found: 725.10900, Calcd for C30H36 81BrN2NaO9S [M-H+2Na]+: 727.10998; Found: 727.10862.
化合物ｈは、次のようにして合成した。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化オクタノイル（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｈ（２５８ｍｇ）を得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。未精製の化合物Ｅｈ（２００ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．２ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（２００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｈ（２６．５ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C30H37 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 703.13008; Found: 703.12760, Calcd for C30H37 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 705.12804; Found: 705.12621, Calcd for C30H36 79BrN2NaO9S [M-H+2Na]+: 725.11203; Found: 725.10900, Calcd for C30H36 81BrN2NaO9S [M-H+2Na]+: 727.10998; Found: 727.10862.
【0082】
［Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の測定］
Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の測定は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを発現する、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）発現細胞を調製し、そのＮＡ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の測定は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを発現する、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）発現細胞を調製し、そのＮＡ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
【0083】
細胞は、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｄ－ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。また、プラスミドは、ｐＣＡＧＧＳベクターにＡ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド、ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡを用いた。化合物ａ（陽性対照）及びスクリーニング対象のｂ～ｈの各化合物は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）でそれぞれ溶解して１００ｍＭ濃度の溶液とし、－３０℃で保存した。
【0084】
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養して７０％コンフルエントの状態とした。トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従い、上述したプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡ（Ａ型インフルエンザウイルス：Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株由来）を２．５μｇ／ウェルを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。培地を除去後、リン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ、１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２、以下ＰＢＳと称する）を各ウェルに１ｍＬずつ添加し、細胞を懸濁したのち遠心分離（４℃、８００×ｇ、１０分間）して上清を除去した。遠心分離により沈降した細胞を１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁してＮＡ発現細胞懸濁液とした。
【0085】
９６ウェルの黒色プレートの各ウェルに、上述のようにして調製したＮＡ発現細胞懸濁液５０μＬを加えて３７℃で５分間静置した。各化合物ａ～ｈを１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）で１００μＭに希釈して、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、その上清５０μＬを各ウェルに添加し、ウェル中のＮＡ発現細胞懸濁液と混合した（各化合物の終濃度は５０μＭ）。混合後、３７℃で２０分間反応させた。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社製）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離したＢＴＰ３の励起波長３７２ｎｍ、測定波長５２６ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３７２ｎｍ／５２６ｎｍ）における蛍光強度を独立して３回測定した。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において各化合物による蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値を使用して、陽性対照として用いた化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による蛍光強度を１００％とした時の相対蛍光強度の平均値±標準誤差で示した。
【0086】
結果を図１に示す。図１の横軸は化合物Ｎｏ．を、縦軸は相対シアリダーゼ活性を示す。本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高い基質化合物として、化合物ｂ（２２－００１ａ）を見出した。この化合物ｂ（２２－００１ａ）のシアリダーゼ活性は、陽性対照として用いたＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）のシアリダーゼ活性の約７割程度を有しており、ウイルス検出用試薬、特に蛍光イメージング剤として適用され得る蛍光強度も十分に有していた。
【0087】
［実施例２］
２．他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例１において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高く、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物として見出された化合物ｂ（２２－００１ａ）について、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても同様の反応性を有する化合物であるのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂを添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス（以下「ＭｕＶ」ともいう）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（以下「ｈＰＩＶ３」ともいう）Ｃ２４３株、ニューカッスル病ウイルス（以下「ＮＤＶ」ともいう）Ｄ２６株、実施例１でも用いたＡ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＡＶ」ともいう）Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
２．他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例１において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高く、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物として見出された化合物ｂ（２２－００１ａ）について、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても同様の反応性を有する化合物であるのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂを添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス（以下「ＭｕＶ」ともいう）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（以下「ｈＰＩＶ３」ともいう）Ｃ２４３株、ニューカッスル病ウイルス（以下「ＮＤＶ」ともいう）Ｄ２６株、実施例１でも用いたＡ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＡＶ」ともいう）Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
【0088】
・ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ３ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＮＤＶ－Ｄ２６ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＮＤＶ Ｄ２６株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド（実施例１で用いたものと同じ）。
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ３ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＮＤＶ－Ｄ２６ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＮＤＶ Ｄ２６株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド（実施例１で用いたものと同じ）。
【0089】
実施例１のシアリダーゼ活性試験において使用したプラスミドを、上述した４種のプラスミドにそれぞれ替えた以外は、実施例１と同様にして各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製した。実施例１と同様の材料及び方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞に化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）又は化合物ｂ（２２－００１ａ）を添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において各化合物による蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値の平均値±標準誤差で示した。
【0090】
また、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞に替えて、アルスロバクター属細菌のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼを用いて、化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）又は化合物ｂ（２２－００１ａ）を添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼ（品番：１０２６９６１１００１、メルク株式会社製）は１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）で０．１Ｕ／ｍＬに調製して使用した。化合物ａ又はｂを添加後、３７℃で２０分間反応させた際の蛍光強度を測定した。
【0091】
結果を図２のグラフに示す。図２の横軸は各シアリダーゼの由来ウイルス名又は細菌名を、縦軸はシアリダーゼ活性を示す。白色のカラムは陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）、黒色のカラムは化合物ｂ（２２－００１ａ）の結果である。この結果によれば、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、すべてのウイルス種及びアルスロバクター由来のシアリダーゼと反応するシアリダーゼ基質であるのに対し、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに特異的に反応するシアリダーゼ基質であることがわかった。このことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する特異性に優れた基質化合物であり、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出してＡ型インフルエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であること、及びＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応することにより、十分な蛍光強度の蛍光物質を生じさせる化合物であることが明らかとなった。
【0092】
［実施例３］
３．ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルス又は他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例２において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが明らかとなった化合物ｂ（２２－００１ａ）について、ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルスやＢ型インフルエンザウイルスを含めた他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を調べた。なお、本実施例では、反応液中の化合物ｂの終濃度を２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭとし、濃度依存的な反応性がみられるかどうかについても調べた。具体的には、上述した実施例２と同様に、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂを添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。本実施例では、ウイルス種として、実施例１，２でも用いたＡ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＡＶ」ともいう）Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＢＶ」ともいう）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ムンプスウイルス（以下「ＭｕＶ」ともいう）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（以下「ｈＰＩＶ１」ともいう）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（以下「ｈＰＩＶ３」ともいう）Ｃ２４３株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
３．ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルス又は他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例２において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが明らかとなった化合物ｂ（２２－００１ａ）について、ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルスやＢ型インフルエンザウイルスを含めた他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性を調べた。なお、本実施例では、反応液中の化合物ｂの終濃度を２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭとし、濃度依存的な反応性がみられるかどうかについても調べた。具体的には、上述した実施例２と同様に、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｂを添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。本実施例では、ウイルス種として、実施例１，２でも用いたＡ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＡＶ」ともいう）Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス（以下「ＩＢＶ」ともいう）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ムンプスウイルス（以下「ＭｕＶ」ともいう）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（以下「ｈＰＩＶ１」ともいう）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（以下「ｈＰＩＶ３」ともいう）Ｃ２４３株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
【0093】
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド（実施例１，２で用いたものと同じ）。
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド（実施例２で用いたものと同じ）
【0094】
細胞は、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｄ－ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養して８０～９０％コンフルエントの状態とした。トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従い、上述した各プラスミド２．５μｇ／ウェルを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間培養した。培地を除去後、リン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ、１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２、以下ＰＢＳと称する）を各ウェルに１ｍＬずつ添加し、細胞を懸濁したのち遠心分離（４℃、１０００×ｇ、１０分間）して上清を除去した。遠心分離により沈降した細胞を１００ｍＭ 酢酸緩衝液（測定対象のシアリダーゼがＩＡＶ及びＩＢＶの場合にはｐＨ６．０、ＭｕＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３の場合にはｐＨ４．５）に懸濁してウイルス種毎のＮＡ発現細胞懸濁液とした。
【0095】
化合物ｂは、予め１００ｍＭ濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させておいたストック溶液を用い、１００ｍＭ 酢酸緩衝液（測定対象のシアリダーゼがＩＡＶ及びＩＢＶの場合にはｐＨ６．０、ＭｕＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３の場合にはｐＨ４．５）を用いて、その濃度が１ｍＭとなるように希釈した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、その上清を回収し、化合物ｂの終濃度が２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭとなるように段階希釈した。氷上で９６ウェルの黒色プレートの各ウェルに、上述のようにして調製したＮＡ発現細胞懸濁液４０μＬと化合物ｂの希釈液１０μＬ（化合物ｂの終濃度：２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭ）を加えて５秒間プレートミキサーにかけた後、３７℃で２０分間反応させた。反応終了時、氷上で１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．７）を５０μＬ／ウェルで添加した。また、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）についても、化合物ｂと同様の操作を行った。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社製）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離したＢＴＰ３の励起波長３７２ｎｍ、測定波長５２６ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３７２ｎｍ／５２６ｎｍ）における蛍光強度を独立して３回測定した。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において化合物ｂによる蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値の平均値±標準誤差で示した。
【0096】
結果を図３のグラフに示す。図３の横軸は化合物ｂ及び陽性対照である化合物ａの濃度を示す。白色のカラムは陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）、黒色のカラムは化合物ｂ（２２－００１ａ）の結果である。この結果によれば、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのうち、ＮＡ亜型がＮ１及びＮ２のいずれのタイプのシアリダーゼにも反応するが、Ｂ型インフルエンザウイルスをはじめ、他のウイルス種のシアリダーゼには全く反応しないことがわかった。また、化合物ｂのＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性は濃度依存的であることがわかった。これらのことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する特異性に優れた基質化合物であり、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出してＡ型インフルエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であること、及びＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと特異的に反応することにより、十分な蛍光強度の蛍光物質を生じさせる化合物であることが明らかとなった。
【0097】
［実施例４］
４．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（１）
実施例２及び３において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが確認された化合物ｂ（２２－００１ａ）を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｂがＡ型インフルエンザウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（以下「ｈＰＩＶ１」ともいう）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株、ニューカッスル病ウイルス Ｄ２６株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
４．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（１）
実施例２及び３において、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが確認された化合物ｂ（２２－００１ａ）を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｂがＡ型インフルエンザウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（以下「ｈＰＩＶ１」ともいう）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株、ニューカッスル病ウイルス Ｄ２６株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0098】
宿主細胞には、ＩＡＶに対してはイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ＭｕＶに対してはアフリカミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ＮＤＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３に対してはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。各細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（Minimum essential medium）を用い、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0099】
細胞を４８ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウイルスが２００フォーカス形成ユニット（以下ＦＦＵ）／ウェルとなるように、各ウイルス－無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、以下ＳＦＭ）の懸濁液を２００μＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、対応する宿主細胞にウイルスを感染させた。２００μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、２００μＬ／ウェルのＳＦＭに置換して、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。なお、ＩＡＶ、ＭｕＶ及びＮＤＶ感染細胞は２４時間、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３感染細胞は４８時間培養した。
【0100】
観察当日、化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）又は化合物ｂ（２２－００１ａ）をＳＦＭで５０μＭに希釈した。なお、ＭｕＶ感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としては各化合物を１００μＭに希釈し、ｈＰＩＶ１感染細胞及びｈＰＩＶ３感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としてはＳＦＭを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に用事調製した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収して、非特異的に切断された蛍光物質を分離した。各感染細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、化合物ａ又は化合物ｂ含有ＳＦＭ上清を２００μＬ／ウェルずつ添加して３７℃で３０分間反応させた。各感染細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳに置換して、蛍光顕微鏡（型番：ＢＺ－Ｘ７００、株式会社キーエンス製）でＢＴＰ特注フィルター（励起波長：３６０／４０ｎｍ、吸収波長：５２５／５０ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００ｎｍ）を用いて蛍光像を観察した。結果を図４に示す。
【0101】
この結果によれば、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染細胞を組織化学的に蛍光イメージングできることが示された。また、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、すべてのウイルス種の感染細胞について、蛍光イメージングすることができるのに対し、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染細胞のみを蛍光イメージングした。このことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスを特異的に蛍光イメージングすることができる化合物であること、Ａ型インフルエンザウイルスの感染細胞を特異的に検出し、Ａ型インフルエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。
【0102】
［実施例５］
５．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（２）
本実施例では、インフルエンザウイルスとして、実施例４で用いたウイルス株を含めた複数の異なるＡ型インフルエンザウイルス株とＢ型インフルエンザウイルス株とを用い、これらインフルエンザウイルス株の感染細胞に対する蛍光イメージングを行った。本実施例では、亜型又は宿主が異なるＩＡＶ株として、１９６８年パンデミック株であるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ＨＫ）／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株（実施例４で用いたものと同じ）、広く使用される実験株であるＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、２００９年新型パンデミック株であるＡ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３０／２００９ Ｈ１Ｎ１株及び鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｄｕｃｋ／ＨＫ／３１３／４／１９７８ Ｈ５Ｎ３株と、Ｂ型インフルエンザウイルス株としてＢ／Ｌｅｅ／１９４０株と、を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
５．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（２）
本実施例では、インフルエンザウイルスとして、実施例４で用いたウイルス株を含めた複数の異なるＡ型インフルエンザウイルス株とＢ型インフルエンザウイルス株とを用い、これらインフルエンザウイルス株の感染細胞に対する蛍光イメージングを行った。本実施例では、亜型又は宿主が異なるＩＡＶ株として、１９６８年パンデミック株であるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ＨＫ）／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株（実施例４で用いたものと同じ）、広く使用される実験株であるＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、２００９年新型パンデミック株であるＡ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３０／２００９ Ｈ１Ｎ１株及び鳥インフルエンザウイルスであるＡ／ｄｕｃｋ／ＨＫ／３１３／４／１９７８ Ｈ５Ｎ３株と、Ｂ型インフルエンザウイルス株としてＢ／Ｌｅｅ／１９４０株と、を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0103】
実施例４のウイルス感染細胞の調製において、使用したウイルスを上述した５種のウイルスに替えた以外は、実施例４と同様にしてイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞を宿主細胞に用いて、ＩＡＶ感染細胞及びＩＢＶ感染細胞を調製した。実施例４と同様の材料及び方法により、化合物ｂ（２２－００１ａ）による各種ウイルスの蛍光イメージングを行った。結果を図５に示す。
【0104】
この結果によれば、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、いずれのＡ型インフルエンザウイルス株の感染細胞についても、蛍光イメージング可能であった。他方、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染細胞については、蛍光は全く観察されなかった。このことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの特定株に限定されることなく、Ａ型インフルエンザウイルスであれば、亜型や宿主が異なるものであっても、蛍光イメージングが可能であり、Ａ型インフルエンザウイルスの存在の有無を検出できることが示された。さらに、化合物ｂは同じインフルエンザウイルスであっても、Ａ型インフルエンザウイルスのみを蛍光イメージングすることから、化合物ｂを検出用試薬として用いることにより、Ａ型インフルエンザウイルスとＢ型インフルエンザウイルスの識別が可能であることが明らかとなった。
【0105】
［実施例６］
６．Ａ型インフルエンザウイルス株の単離の検討（１）
本実施例では、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカス（ウイルス感染細胞集団）を蛍光イメージングすることによる、ウイルス株の単離方法について検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株、ｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株、ＮＤＶ Ｄ２６株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
６．Ａ型インフルエンザウイルス株の単離の検討（１）
本実施例では、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカス（ウイルス感染細胞集団）を蛍光イメージングすることによる、ウイルス株の単離方法について検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株、ｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株、ＮＤＶ Ｄ２６株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0106】
宿主細胞には、ＩＡＶに対してはイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ＭｕＶに対してはアフリカミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ＮＤＶ及びｈＰＩＶ３に対してはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。各細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0107】
各細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、コンフルエントの状態にまで培養した。各細胞を２ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウイルスが１０００ＦＦＵ／ウェル、１００ＦＦＵ／ウェル又は１０ＦＦＵ／ウェルとなるように、各ウイルス－ＳＦＭの懸濁液を１ｍＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、対応する宿主細胞にウイルスを感染させた。他方、未感染細胞のウェルにはＳＦＭを１ｍＬ／ウェル添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置した。細胞を２ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、２μｇ／ｍＬのアセチル化トリプシンを含有した０．８％寒天（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）－ＳＦＭ懸濁液４ｍＬ／ウェルで置換し、寒天培地が固化後、５％ＣＯ２、３７℃で９６時間培養した。寒天培地上に２ｍＭの化合物ｂ（２２－００１ａ）含有ＳＦＭを２００μＬ／ウェルで添加して、ＩＡＶ感染細胞、ＭｕＶ感染細胞及びＮＤＶ感染細胞は３７℃で４時間、ｈＰＩＶ３感染細胞は３７℃で６時間反応させた。トランスイルミネーター上で３６５ｎｍの紫外線を照射して、フォーカスを蛍光イメージングした。結果を図６に示す。
【0108】
この結果によれば、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカスを特異的に蛍光イメージングできることが示された。このうち、ウイルス感染価が１０ＦＦＵ／ｍＬの寒天培地からはウイルス株を単離可能な独立したフォーカスが蛍光イメージングされた。そこで、図６中の白矢印で示す蛍光化フォーカスをピックアップして新しい宿主細胞に感染させたところ、このウイルス株を単離することができた。このことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）は、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカスをライブイメージングすることができ、ライブイメージングされたフォーカスをピックアップすることにより、ウイルス株を容易に単離することができることが明らかとなった。
【0109】
［実施例７］
７．Ａ型インフルエンザウイルス株の単離の検討（２）
上述した実施例６の結果を踏まえ、本実施例では、異なるウイルス種が混在する検体であっても、Ａ型インフルエンザウイルスを単離できるかどうかについて検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株とｈＰＩＶ１ Ｃ３５株とを選択し、ＩＡＶ感染細胞、ｈＰＩＶ１感染細胞及びＩＡＶとｈＰＩＶ１の両方を感染させた細胞を調製した。
７．Ａ型インフルエンザウイルス株の単離の検討（２）
上述した実施例６の結果を踏まえ、本実施例では、異なるウイルス種が混在する検体であっても、Ａ型インフルエンザウイルスを単離できるかどうかについて検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株とｈＰＩＶ１ Ｃ３５株とを選択し、ＩＡＶ感染細胞、ｈＰＩＶ１感染細胞及びＩＡＶとｈＰＩＶ１の両方を感染させた細胞を調製した。
【0110】
宿主細胞にはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、コンフルエントの状態にまで培養した。細胞を２ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、ＩＡＶとｈＰＩＶ１がそれぞれ１０ＦＦＵ／ウェル、または各ウイルスのみで１０ＦＦＵ／ウェルとなるように、各ウイルス－ＳＦＭの懸濁液を２ｍＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞にウイルスを感染させた。細胞を２ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、２μｇ／ｍＬのアセチル化トリプシンを含有した０．８％寒天－ＳＦＭ懸濁液４ｍＬ／ウェルで置換し、寒天培地が固化後、５％ＣＯ２、３７℃で９６時間培養した。寒天培地上に、１ｍＭの化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）含有ＳＦＭを２００μＬ／ウェル又は２ｍＭの化合物ｂ（２２－００１ａ）含有ＳＦＭを２００μＬ／ウェルで添加して、３７℃で７時間反応させた。なお、化合物ｂは３７℃、４時間の反応時間でＩＡＶのフォーカスを蛍光イメージング可能であるが（実施例６参照）、陽性対照として使用した化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）によるｈＰＩＶ１のフォーカスの蛍光イメージングに７時間を要したため、反応時間を７時間に統一した。反応７時間後、トランスイルミネーター上で３６５ｎｍの紫外線を照射して、ウイルスのフォーカスを蛍光イメージングした。結果を図７に示す。
【0111】
この結果によれば、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、ＩＡＶのフォーカスもｈＰＩＶ１のフォーカスも蛍光イメージングするのに対し、化合物ｂはＩＡＶのフォーカスのみを蛍光イメージングすることが示された。このうち、ＩＡＶとｈＰＩＶ１との両方のウイルスに感染した細胞（ＩＡＶ＋ｈＰＩＶ）において、化合物ｂにより蛍光イメージングされた蛍光化フォーカスをピックアップして新しい宿主細胞に感染させたところ、ＩＡＶ株を単離することができた。このことから、化合物ｂ（２２－００１ａ）によれば、異なるウイルス種が混在した検体であっても、Ａ型インフルエンザウイルスのフォーカスのみをライブイメージングすることができ、ウイルス種が混在する検体からＡ型インフルエンザウイルス株のみを選択的に単離できることが明らかとなった。
【0112】
［実施例８］
８．インフルエンザウイルス等のシアリダーゼに対する化合物ｂ（２２－００１ａ）誘導体の反応性の検討
上述した実施例１～７において、化合物ｂ（２２－００１ａ）がＡ型インフルエンザウイルスを特異的に検出できることが示されたことから、本実施例では、化合物ｂの誘導体を作成し、その誘導体のインフルエンザウイルス等のシアリダーゼに対する反応性及び特異性を検討した。本検討において用いた化合物を以下表２に示す。表２に示す化合物のうち、化合物ｋと化合物l（エル）が化合物ｂの誘導体として新たに作成した化合物である。なお、以下表２に示す化合物ｂは実施例１で合成したものを用いた。
８．インフルエンザウイルス等のシアリダーゼに対する化合物ｂ（２２－００１ａ）誘導体の反応性の検討
上述した実施例１～７において、化合物ｂ（２２－００１ａ）がＡ型インフルエンザウイルスを特異的に検出できることが示されたことから、本実施例では、化合物ｂの誘導体を作成し、その誘導体のインフルエンザウイルス等のシアリダーゼに対する反応性及び特異性を検討した。本検討において用いた化合物を以下表２に示す。表２に示す化合物のうち、化合物ｋと化合物l（エル）が化合物ｂの誘導体として新たに作成した化合物である。なお、以下表２に示す化合物ｂは実施例１で合成したものを用いた。
【0113】
【表2】
【0114】
表２に示す化合物ｋ（２３－１３９ｂ）及び化合物l（２３－１３６ｂ４）は、以下式に基づいて合成した。合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
【0115】
【化18】
【0116】
［化合物ｋ（２３－１３９ｂ）の合成］
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）１４．９３ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５０ｍＬ）に、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、４．０ｍＬ）を加えて室温で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーを確認しながら１時間毎にナトリウムメトキシド（１．５ｍＬ）を２回加えた。原料消失を確認後、酢酸（１．５ｍＬ）を加えて反応を停止した。反応液を減圧濃縮して残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）で精製してテトラヒドロキシ体である化合物Ｙ（６．６８ｇ、収率５７％）を白色固体として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05172, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.05115.
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）１４．９３ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５０ｍＬ）に、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、４．０ｍＬ）を加えて室温で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーを確認しながら１時間毎にナトリウムメトキシド（１．５ｍＬ）を２回加えた。原料消失を確認後、酢酸（１．５ｍＬ）を加えて反応を停止した。反応液を減圧濃縮して残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）で精製してテトラヒドロキシ体である化合物Ｙ（６．６８ｇ、収率５７％）を白色固体として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05172, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.05115.
【0117】
引き続いて、２－ブタノン（３ｍＬ）、オルトギ酸トリメチル（１ｍＬ）、カンファースルホン酸（ＣＳＡ；７６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）の溶液を７０℃で１７時間攪拌して２－ブタノンジメチルアセタール溶液を調製した。得られた溶液（２ｍＬ）を、化合物Ｙ（６１２ｍｇ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液に加えた。反応をＴＬＣで追跡し、２時間後にパラトルエンスルホン酸一水和物（１００ｍｇ）を追加してさらに３０分攪拌した。重曹水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出して、有機層を水で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥材を濾別して溶媒を減圧留去してメチルエステル中間体を得た。得られたメチルエステル中間体をメタノール（２ｍＬ）に溶解して水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｍ、１．４ｍＬ）を加えて１５時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製して化合物ｋ（２３５ｍｇ，収率３６％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H32 79BrN2O9S [M+H]+: 651.10119; Found: 651.09970, Calcd for C28H32 81BrN2O9S [M+H]+: 653.09914; Found: 653.09785, Calcd for C28H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 673.08313; Found: 673.08028, Calcd for C28H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 675.08109; Found: 675.07871.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H32 79BrN2O9S [M+H]+: 651.10119; Found: 651.09970, Calcd for C28H32 81BrN2O9S [M+H]+: 653.09914; Found: 653.09785, Calcd for C28H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 673.08313; Found: 673.08028, Calcd for C28H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 675.08109; Found: 675.07871.
【0118】
［化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）の合成］
化合物ｌは、上述した化合物ｋの合成方法と同様の方法により、次のようにして合成した。上記式のうち、テトラヒドロキシ体である化合物Ｙからの合成経路において、３－プロパノン（３ｍＬ）、オルトギ酸トリメチル（１ｍＬ）、カンファースルホン酸（ＣＳＡ；７６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）の溶液を７０℃で１７時間攪拌して３－プロパノンジメチルアセタール溶液を調製した。得られた溶液（２ｍＬ）を、化合物Ｙ（６１２ｍｇ）のアセトニトリル（２ｍＬ）溶液に加えて１．５時間攪拌した。トリエチルアミン（５００μＬ）を加えて反応を停止し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にメタノール（２ｍＬ）と水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｍ、１．４ｍＬ）を加えて１９時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製して化合物ｌ（１１３ｍｇ，収率１７％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H34 79BrN2O9S [M+H]+: 665.11684; Found: 665.11673, Calcd for C29H34 81BrN2O9S [M+H]+: 667.11479; Found: 667.11515, Calcd for C29H33 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 687.09878; Found: 687.10009, Calcd for C29H33 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 689.09674; Found: 689.09816.
化合物ｌは、上述した化合物ｋの合成方法と同様の方法により、次のようにして合成した。上記式のうち、テトラヒドロキシ体である化合物Ｙからの合成経路において、３－プロパノン（３ｍＬ）、オルトギ酸トリメチル（１ｍＬ）、カンファースルホン酸（ＣＳＡ；７６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）の溶液を７０℃で１７時間攪拌して３－プロパノンジメチルアセタール溶液を調製した。得られた溶液（２ｍＬ）を、化合物Ｙ（６１２ｍｇ）のアセトニトリル（２ｍＬ）溶液に加えて１．５時間攪拌した。トリエチルアミン（５００μＬ）を加えて反応を停止し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にメタノール（２ｍＬ）と水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｍ、１．４ｍＬ）を加えて１９時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製して化合物ｌ（１１３ｍｇ，収率１７％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H34 79BrN2O9S [M+H]+: 665.11684; Found: 665.11673, Calcd for C29H34 81BrN2O9S [M+H]+: 667.11479; Found: 667.11515, Calcd for C29H33 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 687.09878; Found: 687.10009, Calcd for C29H33 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 689.09674; Found: 689.09816.
【0119】
［各種ウイルスのシアリダーゼに対する反応性の検討］
実施例３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）、化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）及び化合物ｂ（２２－００１ａ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルスにはＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株の４種類を選択した。また、ＩＡＶ以外のウイルス種として、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（ｈＰＩＶ１）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（ｈＰＩＶ３）Ｃ２４３株を選択した。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現のためのプラスミドは以下のものを用いた。
実施例３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｋ（２３－１３９ｂ）、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）、化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）及び化合物ｂ（２２－００１ａ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルスにはＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株の４種類を選択した。また、ＩＡＶ以外のウイルス種として、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（ｈＰＩＶ１）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（ｈＰＩＶ３）Ｃ２４３株を選択した。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現のためのプラスミドは以下のものを用いた。
【0120】
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
【0121】
ＮＡ発現細胞懸濁液に添加する化合物を化合物ｋ（２３－１３９ｂ）及び化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）に替えた以外は、実施例３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ活性を測定した。また、なお、本実施例では、反応液中の各化合物の終濃度を２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭとし、濃度依存的な反応性がみられるかどうかについても調べた。
【0122】
結果を図８～図１１のグラフに示す。各グラフの縦軸はシアリダーゼ活性を示す蛍光強度であり、横軸は添加した化合物の終濃度（μＭ）である。これらの結果によれば、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）は、Ａ型インフルエンザウイルスであるＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株のシアリダーゼとすべて反応するシアリダーゼ基質であることがわかった（図８及び図１０）。また、上述した実施例３において、化合物ｂはＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとは反応しないことが明らかとなっているが、化合物ｋは、図９に示すように、Ｂ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼとも反応するシアリダーゼ基質であることが明らかとなった。さらに、化合物ｋは、ムンプスウイルスのシアリダーゼとはわずかに反応するものの、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型及び３型のシアリダーゼとは反応しなかった（図１１）。他方、化合物ｌ（２３－１３６ｂ４）は、各種ウイルスのシアリダーゼとほとんど反応せず、シアリダーゼ基質として認識されないことがわかった。これらのことから、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する特異性に優れた基質化合物であり、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出して、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。
【0123】
［実施例９］
９．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（３）
本実施例では、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス感染細胞及びＢ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｋがＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）には、Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）にはＢ／Ｌｅｅ／１９４０株を用いた。また、他のウイルス種には、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（ｈＰＩＶ１）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（ｈＰＩＶ３）Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
９．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（３）
本実施例では、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス感染細胞及びＢ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｋがＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）には、Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株及びＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）にはＢ／Ｌｅｅ／１９４０株を用いた。また、他のウイルス種には、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）１３Ｖ１６５Ｅ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型（ｈＰＩＶ１）Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型（ｈＰＩＶ３）Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0124】
宿主細胞には、ＩＡＶ及びＩＢＶに対してはイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ＭｕＶに対してはアフリカミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３に対してはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。各細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（Minimum essential medium）を用い、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0125】
細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し（１００μＬ／ウェル）、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウイルスが１００フォーカス形成ユニット（以下ＦＦＵ）／ウェルとなるように、各ウイルス－無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、以下ＳＦＭ）の懸濁液を５０μＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、対応する宿主細胞にウイルスを感染させた。５０μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、５０μＬ／ウェルのＳＦＭに置換して、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。なお、ＩＡＶ、ＩＢＶ及びＭｕＶ感染細胞は２４時間、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３感染細胞は４８時間培養した。
【0126】
観察直前に、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）又は陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）をＳＦＭ（ｐＨ７．４）で２００μＭに希釈した。なお、ｈＰＩＶ１感染細胞及びｈＰＩＶ３感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としてはＳＦＭを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に用事調製した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収して、非特異的に切断された蛍光物質を分離した。氷上で各感染細胞上のＳＦＭを除去し、２００μＭの化合物ｋ又は化合物ａ含有ＳＦＭ上清に置換して３７℃で２０分間反応させた。反応終了時に、氷上で化合物ｋ又は化合物ａ含有ＳＦＭ上清を除去し、各感染細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、５０μＬ／ウェルのＳＦＭに置換した。蛍光顕微鏡（型番：ＢＺ－Ｘ７００、株式会社キーエンス製）でＢＴＰ特注フィルター（励起波長：３６０／４０ｎｍ、吸収波長：５２５／５０ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００ｎｍ）を用いて蛍光像を観察した（対物レンズ２０倍、撮影設定は高感度モード・露光時間１／４秒）。結果を図１２に示す。
【0127】
この結果によれば、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染細胞を組織化学的に蛍光イメージングできることが示された。また、化合物ｋはＢ型インフルエンザウイルスの感染細胞においても明らかな蛍光が観察され、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染細胞に対しても、組織化学的に蛍光イメージングできることが示された。また、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、すべてのウイルス種の感染細胞について、蛍光イメージングすることができるのに対し、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの感染細胞のみを蛍光イメージングした。このことから、化合物ｋ（２３－１３９ｂ）は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスを特異的に蛍光イメージングすることができる化合物であること、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの感染細胞を特異的に検出し、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。
【0128】
［実施例１０］
１０．ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを識別可能な化合物の検討
Ａ型インフルエンザウイルスは、１６種のヘマグルチニン（ＨＡ）と９種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の組み合わせによって亜型に分類される。このうち、ヒトに感染するＡ型インフルエンザウイルスのＮＡ亜型は主にＮ１とＮ２であるため、両者を識別できる検出用試薬が望まれている。そこで、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ亜型のうち、Ｎ１とＮ２を識別可能な化合物について検討を行った。本検討において用いた化合物を以下表３に示す。なお、以下表３に示す化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）及び化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）は実施例１で合成したものを用いた。
１０．ＮＡ亜型が異なるＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを識別可能な化合物の検討
Ａ型インフルエンザウイルスは、１６種のヘマグルチニン（ＨＡ）と９種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の組み合わせによって亜型に分類される。このうち、ヒトに感染するＡ型インフルエンザウイルスのＮＡ亜型は主にＮ１とＮ２であるため、両者を識別できる検出用試薬が望まれている。そこで、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＡ亜型のうち、Ｎ１とＮ２を識別可能な化合物について検討を行った。本検討において用いた化合物を以下表３に示す。なお、以下表３に示す化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）及び化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）は実施例１で合成したものを用いた。
【0129】
【表3】
【0130】
［各種ウイルスのシアリダーゼに対する反応性の検討］
実施例３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）及び化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスにはＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株とＡ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株を用いた。また、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスにはＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を用いた。また、ＩＡＶ以外のウイルス種として、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株を選択した。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現のためのプラスミドは以下のものを用いた。
実施例３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）及び化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスにはＡ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株とＡ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株を用いた。また、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスにはＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を用いた。また、ＩＡＶ以外のウイルス種として、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株を選択した。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現のためのプラスミドは以下のものを用いた。
【0131】
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／ＰＲ／８／１９３４ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
【0132】
ＮＡ発現細胞懸濁液に添加する化合物を、表３に示す各化合物に替えた以外は、実施例８と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ活性を測定した。
【0133】
結果を図１３のグラフに示す。各グラフの縦軸はシアリダーゼ活性を示す蛍光強度であり、横軸は添加した各化合物の終濃度（μＭ）である。これらの結果によれば、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼには反応するが、Ｎ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼには反応が著しく弱くなり、Ｂ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼには全く反応しないことがわかった。他方、化合物ｅ（２２－００２ｂ＿ｔ）と化合物ｇ（２２－００５ｂ＿ｂ）は、いずれのインフルエンザウイルスのシアリダーゼにも反応せず、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）は化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）と同様にすべての種類のインフルエンザウイルスのシアリダーゼと反応した。このことから、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと、Ｎ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを識別できる化合物であることが示された。なお、後述する実施例１３の結果（図１６）にも示されるように、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）は、ＭｕＶのシアリダーゼ及びｈＰＩＶのシアリダーゼに対しても反応するため、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出することはできないが、Ａ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できる化合物ｂ（２２－００１ａ）や化合物ｋ（２３－１３９ｂ）を用いてスクリーニングを行った後、そのＮＡ亜型を識別するために、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）を用いて検出を行うことが好ましい。
【0134】
［実施例１１］
１１．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（４）
本実施例では、実施例１０において、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを識別できる化合物であることが確認された化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）を用いて、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞とＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。本実施例では、ウイルス種として、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスには、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株を、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスには、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を用い、これらウイルスの感染細胞を調製した。
１１．ウイルス感染細胞の蛍光イメージング（４）
本実施例では、実施例１０において、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼと、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼを識別できる化合物であることが確認された化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）を用いて、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞とＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。本実施例では、ウイルス種として、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスには、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株を、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスには、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１ Ｈ３Ｎ２株を用い、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0135】
実施例９のウイルス感染細胞の調製において、使用したウイルスを上述した２種のＡ型インフルエンザウイルスに替えた以外は、実施例９と同様にしてＡ型インフルエンザウイルス感染細胞を調製した。実施例９と同様の材料及び方法により、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）と化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）によるＮＡ亜型がＮ１又はＮ２のＡ型インフルエンザウイルスの蛍光イメージングをそれぞれ行った。結果を図１４に示す。
【0136】
この結果によれば、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞に対しては組織化学的に蛍光イメージングしたが、ＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞に対しては蛍光イメージングしないことが示された。このことから、実施例１０で検討したＡ型インフルエンザウイルスのシアリダーゼに対する反応性の結果と、本実施例で検討したＡ型インフルエンザウイルス感染細胞の蛍光イメージングの結果は一致することが明らかとなった。これらのことから、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）は、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスを蛍光イメージングすることができる化合物であること、ＮＡ亜型がＮ１のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞とＮＡ亜型がＮ２のＡ型インフルエンザウイルスの感染細胞を識別できる化合物であることが明らかとなった。
【0137】
［実施例１２］
１２．ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
本実施例では、スクリーニング対象化合物として、公知のシアリダーゼ基質であるＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃのシアル酸構造部分を改変した誘導体を選択した。ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物の探索は、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性の測定試験により行った。具体的には、ムンプスウイルスのシアリダーゼとスクリーニング対象化合物とを反応させた際に、ムンプスウイルスのシアリダーゼに加水分解されて生じる蛍光物質である、ＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］の蛍光強度を測定することにより行った。試験にあたっては、陽性対照としてＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）を用いた。スクリーニング対象化合物を以下表４に示す。化合物ａのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃは、東京化成工業株式会社製を用いた。また、以下表４に示すｂ～ｄ、ｆ～ｈに示す化合物は、実施例１で合成したものを用いた。
１２．ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
本実施例では、スクリーニング対象化合物として、公知のシアリダーゼ基質であるＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃのシアル酸構造部分を改変した誘導体を選択した。ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物の探索は、ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性の測定試験により行った。具体的には、ムンプスウイルスのシアリダーゼとスクリーニング対象化合物とを反応させた際に、ムンプスウイルスのシアリダーゼに加水分解されて生じる蛍光物質である、ＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］の蛍光強度を測定することにより行った。試験にあたっては、陽性対照としてＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）を用いた。スクリーニング対象化合物を以下表４に示す。化合物ａのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃは、東京化成工業株式会社製を用いた。また、以下表４に示すｂ～ｄ、ｆ～ｈに示す化合物は、実施例１で合成したものを用いた。
【0138】
【表4】
【0139】
［ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性の測定］
ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性の測定は、ムンプスウイルスのシアリダーゼを発現する、ムンプスウイルスのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）発現細胞を調製し、そのＨＮ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性の測定は、ムンプスウイルスのシアリダーゼを発現する、ムンプスウイルスのヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）発現細胞を調製し、そのＨＮ発現細胞に各化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することによって行った。測定方法は具体的には次の通りである。
【0140】
細胞は、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｄ－ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。また、プラスミドは、ｐＣＡＧＧＳベクターにムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド、ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶＨＮを用いた。化合物ａ（陽性対照）及びスクリーニング対象のｂ～ｄ、ｆ～ｈの各化合物は、ＤＭＳＯでそれぞれ溶解して１００ｍＭ濃度の溶液とし、－３０℃で保存した。
【0141】
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養して７０％コンフルエントの状態とした。トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従い、上述したプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶＨＮ（ムンプスウイルス：１３Ｖ１６５Ｅ２株由来）を２．５μｇ／ウェルを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。培地を除去後、ＰＢＳを各ウェルに１ｍＬずつ添加し、細胞を懸濁したのち遠心分離（４℃、８００×ｇ、１０分間）して上清を除去した。遠心分離により沈降した細胞を１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁してＨＮ発現細胞懸濁液とした。
【0142】
９６ウェルの黒色プレートの各ウェルに、上述のようにして調製したＨＮ発現細胞懸濁液５０μＬを加えて３７℃で５分間静置した。各化合物を１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で１００μＭに希釈して、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、その上清５０μＬを各ウェルに添加し、ウェル中のＨＮ発現細胞懸濁液と混合した（各化合物の終濃度は５０μＭ）。混合後、３７℃で２０分間反応させた。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社製）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離したＢＴＰ３の励起波長３７２ｎｍ、測定波長５２６ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３７２ｎｍ／５２６ｎｍ）における蛍光強度を独立して３回測定した。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において各化合物による蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値を使用して、陽性対照として用いた化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）による蛍光強度を１００％とした時の相対蛍光強度の平均値±標準誤差で示した。
【0143】
結果を図１５に示す。図１５の横軸は化合物Ｎｏ．を、縦軸は相対シアリダーゼ活性を示す。本発明者らは、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高い基質化合物として、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）及び化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）を見出した。これらの化合物のシアリダーゼ活性は陽性対照として用いたＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ（化合物ａ）のシアリダーゼ活性の約３～５割程度を有しており、ウイルス検出用試薬、特に蛍光イメージング剤として適用され得る蛍光強度も十分に有していた。
【0144】
［実施例１３］
１３．他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例１２において、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高く、ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物として見出された化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）及び化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）について、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても同様の反応性を有する化合物であるのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞にこれらの化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。また、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）の誘導体として、以下式に示される化合物ｉ及び化合物ｊについても同様の試験を行った。なお、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）は、次のようにして合成した。また、合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
１３．他のウイルス種のシアリダーゼに対する反応性の検討
実施例１２において、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する反応性が高く、ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出することができる化合物として見出された化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）及び化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）について、他のウイルス種のシアリダーゼに対しても同様の反応性を有する化合物であるのかどうか確認する試験を行った。具体的には、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞にこれらの化合物を添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで検討した。また、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）の誘導体として、以下式に示される化合物ｉ及び化合物ｊについても同様の試験を行った。なお、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）は、次のようにして合成した。また、合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
【0145】
【化19】
【0146】
［化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）の合成］
化合物ｉは、実施例１において上述した化合物ｃの合成方法に基づいて合成した。なお、化合物ｃの合成方法に係る式において、化合物Ｅｉ及び化合物ｉにおけるＲはペンチル基である。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化カプロイル（１３７μＬ）を用い、反応スケールを半分にした以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｉを得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C37H43 79BrN2O13S [M+H]+: 857.15669; Found: 857.15601, Calcd for C37H43 81BrN2O13S [M+H]+: 859.15464; Found: 859.15630.
化合物ｉは、実施例１において上述した化合物ｃの合成方法に基づいて合成した。なお、化合物ｃの合成方法に係る式において、化合物Ｅｉ及び化合物ｉにおけるＲはペンチル基である。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化カプロイル（１３７μＬ）を用い、反応スケールを半分にした以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｉを得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C37H43 79BrN2O13S [M+H]+: 857.15669; Found: 857.15601, Calcd for C37H43 81BrN2O13S [M+H]+: 859.15464; Found: 859.15630.
【0147】
未精製の化合物Ｅｉをメタノール（０．５ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．２５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．１ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（１００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｉ（２２．９ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H32 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 697.08073; Found: 697.08042, Calcd for C28H32 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 699.07868; Found: 699.07863.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C28H32 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 697.08073; Found: 697.08042, Calcd for C28H32 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 699.07868; Found: 699.07863.
【0148】
［化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）の合成］
化合物ｊは、実施例１において上述した化合物ｃの合成方法に基づいて合成した。なお、化合物ｃの合成方法に係る式において、化合物Ｅｊ及び化合物ｊにおけるＲはヘキシル基である。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ヘプタノイル（１５５μＬ）を用い、反応スケールを半分にした以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｊを得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C38H45 79BrN2O13S [M+H]+: 871.17234; Found: 871.17366, Calcd for C38H45 81BrN2O13S [M+H]+: 873.17029; Found: 873.17027.
化合物ｊは、実施例１において上述した化合物ｃの合成方法に基づいて合成した。なお、化合物ｃの合成方法に係る式において、化合物Ｅｊ及び化合物ｊにおけるＲはヘキシル基である。上述した化合物ｃの合成方法における、化合物Ｅｃの合成経路中で用いたイソ酪酸無水物の代わりに塩化ヘプタノイル（１５５μＬ）を用い、反応スケールを半分にした以外は、化合物ｃの合成方法と同様の材料及び反応を行って化合物Ｅｊを得た。得られた化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C38H45 79BrN2O13S [M+H]+: 871.17234; Found: 871.17366, Calcd for C38H45 81BrN2O13S [M+H]+: 873.17029; Found: 873.17027.
【0149】
未精製の化合物Ｅｊの半量をメタノール（０．５ｍＬ）、ナトリウムメトキシド溶液（５Ｍ ｉｎ ＭｅＯＨ、０．２５ｍＬ）を順次加えて２０分攪拌した。続いて水酸化ナトリウム水溶液（５Ｍ、０．１ｍＬ）を加えて一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、酢酸（１００μＬ）を加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフィーで精製して化合物ｊ（１３．０ｍｇ）を白色粉末として得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H34 79BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 711.09638; Found: 711.09579, Calcd for C29H34 81BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 713.09433; Found: 713.09398.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C29H34 79BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 711.09638; Found: 711.09579, Calcd for C29H34 81BrN2Na2O9S [M-H+2Na]+: 713.09433; Found: 713.09398.
【0150】
［各種ウイルスのシアリダーゼ活性の測定］
本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
【0151】
・ｐＣＡＧＧＳ－ＭｕＶＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ３ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド。
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ１ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド。
・ｐＣＡＧＧＳ－ＨＫ６８ＮＡ：ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ３ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド。
・ｐＣＡＧＧＳ－ｈＰＩＶ１ＨＮ：ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド。
【0152】
実施例１２のシアリダーゼ活性試験において使用したプラスミドを、上述した４種のプラスミドにそれぞれ替えた以外は、実施例１２と同様にして各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製した。そして、実施例１２と同様の材料及び方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞に陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）、化合物ｆ（２２－００５ｂ＿ｃ）、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）又は化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）を添加した際のシアリダーゼ活性を測定した。なお、ｈＰＩＶ１のシアリダーゼに対する試験は、化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）についてのみ行った。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において各化合物による蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値の平均値±標準誤差で示した。
【0153】
結果を図１６のグラフに示す。各図の横軸は各シアリダーゼの由来ウイルス名を、縦軸はシアリダーゼ活性を示す。白色のカラムは陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）、黒色のカラムは各化合物の結果である。この結果によれば、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、すべてのウイルス種のシアリダーゼと反応するシアリダーゼ基質であるのに対し、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）はムンプスウイルスのシアリダーゼに特異的に反応するシアリダーゼ基質であることがわかった。なお、化合物ｃ（２２－００２ｂ＿ｉ）はムンプスウイルスよりもヒトパラインフルエンザウイルス１型のシアリダーゼに対する反応性が高かった。このことから、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）は、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する特異性に優れた基質化合物であり、ムンプスウイルスのシアリダーゼを特異的に検出してムンプスウイルスの存在の有無を判別できる化合物であること、及びムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応することにより、十分な蛍光強度の蛍光物質を生じさせる化合物であることが明らかとなった。また、これらの化合物のうち、特に化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）は、ムンプスウイルスのシアリダーゼの特異的な検出作用に優れると共に、シアリダーゼ検出時における蛍光強度にも優れることがわかった。
【0154】
［実施例１４］
１４．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（１）
実施例１３において、ムンプスウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが確認された化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）を用いて、ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｈがムンプスウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
１４．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（１）
実施例１３において、ムンプスウイルスのシアリダーゼを特異的に検出できることが確認された化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）を用いて、ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、化合物ｈがムンプスウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８ Ｈ３Ｎ２株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0155】
宿主細胞には、ＩＡＶに対してはイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ＭｕＶに対してはアフリカミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３に対してはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。各細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（Minimum essential medium）で５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0156】
細胞を４８ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウイルスが２００フォーカス形成ユニット（以下ＦＦＵ）／ウェルとなるように、各ウイルス－無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、以下ＳＦＭ）の懸濁液を２００μＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、対応する宿主細胞にウイルスを感染させた。２００μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、２００μＬ／ウェルのＳＦＭに置換して、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。なお、ＩＡＶ及びＭｕＶ感染細胞は２４時間、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３感染細胞は４８時間培養した。
【0157】
観察当日、化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）又は化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）をＳＦＭで５０μＭに希釈した。なお、ＭｕＶ感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としては各化合物を１００μＭに希釈し、ｈＰＩＶ１感染細胞及びｈＰＩＶ３感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としてはＳＦＭを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に用事調製した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収して、非特異的に切断された蛍光物質を分離した。各感染細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、化合物ａ又は化合物ｈ含有ＳＦＭ上清を２００μＬ／ウェルずつ添加して３７℃で３０分間反応させた。各感染細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳに置換して、蛍光顕微鏡（型番：ＢＺ－Ｘ７００、株式会社キーエンス製）でＢＴＰ特注フィルター（励起波長：３６０／４０ｎｍ、吸収波長：５２５／５０ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００ｎｍ）を用いて蛍光像を観察した。結果を図１７に示す。
【0158】
この結果によれば、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）は、ムンプスウイルスの感染細胞を組織化学的に蛍光イメージングできることが示された。また、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、すべてのウイルス種の感染細胞について、蛍光イメージングすることができるのに対し、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）は、ムンプスウイルスの感染細胞のみを蛍光イメージングした。このことから、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）は、ムンプスウイルスを特異的に蛍光イメージングすることができる化合物であること、ムンプスウイルスの感染細胞を特異的に検出し、ムンプスウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。
【0159】
［実施例１５］
１５．ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
上述した実施例１３において、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）がムンプスウイルスを特異的に検出できることが示されたことから、本実施例では、これらの化合物の誘導体、すなわち、シアル酸骨格のＣ５位Ｎ―アセチル基を直鎖アルキル基とした化合物を作成し、その誘導体のムンプスウイルスのシアリダーゼに対する特異性を検討した。本検討において用いた化合物を以下表５に示す。表５に示す化合物のうち、化合物ｍ、ｎ、ｏ及びｐが新たに作成した化合物である。なお、以下表５に示す化合物ｄ、ｈ、ｉ及びｊは実施例１及び実施例１３で合成したものを用いた。
１５．ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出する化合物のスクリーニング
上述した実施例１３において、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）及び化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）がムンプスウイルスを特異的に検出できることが示されたことから、本実施例では、これらの化合物の誘導体、すなわち、シアル酸骨格のＣ５位Ｎ―アセチル基を直鎖アルキル基とした化合物を作成し、その誘導体のムンプスウイルスのシアリダーゼに対する特異性を検討した。本検討において用いた化合物を以下表５に示す。表５に示す化合物のうち、化合物ｍ、ｎ、ｏ及びｐが新たに作成した化合物である。なお、以下表５に示す化合物ｄ、ｈ、ｉ及びｊは実施例１及び実施例１３で合成したものを用いた。
【0160】
【表5】
【0161】
化合物ｍ（２２－１１４ａ＿３）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）及び化合物ｐ（２２－１１４ａ＿１２）は、以下式に基づいて合成した。合成により得た化合物（中間体を含む）が目的物であることは、高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）にて確認を行った。高分解能質量分析は、日本電子株式会社製のＡｃｃｕＴＯＦ（ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ）を用い、ＥＳ（エレクトロスプレーイオン源）を接続してポジティブモードで測定した。
【0162】
【化20】
【0163】
［化合物ｍ（２２－１１４ａ＿３）の合成］
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）のテトラヒドロフラン溶液にＢｏｃ２Ｏ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加えて６０℃で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、放冷した。反応液にＮ，Ｎ－ジエチルエチレンジアミンを加えて、室温で一晩攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して化合物Ｚを白色泡状物として得た。化合物Ｚ（２．４５ｇ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を加えて、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧留去して得られた残渣に１，４－ジオキサンと塩酸を加えて凍結乾燥して脱保護体の塩酸塩である化合物Ａを得た。
既知化合物Ｘ（PLOS ONE、２０１４年、第９巻、第１号、ｅ８１９４１参照）のテトラヒドロフラン溶液にＢｏｃ２Ｏ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加えて６０℃で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、放冷した。反応液にＮ，Ｎ－ジエチルエチレンジアミンを加えて、室温で一晩攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（３回）、飽和食塩水（１回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して化合物Ｚを白色泡状物として得た。化合物Ｚ（２．４５ｇ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を加えて、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧留去して得られた残渣に１，４－ジオキサンと塩酸を加えて凍結乾燥して脱保護体の塩酸塩である化合物Ａを得た。
【0164】
化合物ＡのＴＨＦ溶液（２２５μｍｏｌ／２ｍＬ）にトリエチルアミン（３００μＬ）を加え、続いてプロピオン酸無水物（１２０μＬ）を加えて２２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で１回、重曹水溶液で１回、水で１回、飽和食塩水で１回、順次洗浄して硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別して、溶媒を減圧留去して得られた残渣にナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．２５Ｍ、４ｍＬ）を加えて１．５時間攪拌した後、弱酸性陽イオン交換樹脂０．６ｇ（型番：ＦＰＣ３５００、オルガノ株式会社）を加えて反応を停止した。樹脂を濾別して溶媒を減圧留去してテトラオール体を得た。得られたテトラオール体（１６９μｍｏｌ）にメタノール（１ｍＬ）、水（４００μＬ）、ナトリウムメトキシドメタノール溶液（５Ｍ、２００μＬ）を順次加えて１７時間攪拌した。酢酸を加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーで精製して目的物（６０．６ｍｇ，４段階収率５７％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05009, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.04874.
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C25H27 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 633.05183; Found: 633.05009, Calcd for C25H27 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 635.04979; Found: 635.04874.
【0165】
［化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）の合成］
化合物ｎは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えて吉草酸クロリド（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｎ（７０．９ｍｇ、４段階収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 661.08313; Found: 661.08218, Calcd for C27H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 663.08109; Found: 663.08082.
化合物ｎは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えて吉草酸クロリド（１００μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｎ（７０．９ｍｇ、４段階収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C27H31 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 661.08313; Found: 661.08218, Calcd for C27H31 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 663.08109; Found: 663.08082.
【0166】
［化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）の合成］
化合物ｏは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えてカプリン酸クロリド（１７０μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｏ（７０．９ｍｇ、４段階収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C32H42 79BrN2O9S [M+H]+: 709.17944; Found: 709.17697, Calcd for C32H42 81BrN2O9S [M+H]+: 711.177139; Found: 711.17742, Calcd for C32H41 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 731.16138; Found: 731.16402, Calcd for C32H41 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 733.15934; Found: 733.15820.
化合物ｏは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えてカプリン酸クロリド（１７０μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｏ（７０．９ｍｇ、４段階収率６４％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C32H42 79BrN2O9S [M+H]+: 709.17944; Found: 709.17697, Calcd for C32H42 81BrN2O9S [M+H]+: 711.177139; Found: 711.17742, Calcd for C32H41 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 731.16138; Found: 731.16402, Calcd for C32H41 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 733.15934; Found: 733.15820.
【0167】
［化合物ｐ（２２－１１４ａ＿１２）の合成］
化合物ｐは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えてラウリン酸クロリド（１７０μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｐ（２５．０ｍｇ、４段階収率２０％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C34H46 79BrN2O9S [M+H]+: 737.21074; Found: 737.20932, Calcd for C34H46 81BrN2O9S [M+H]+: 739.20869; Found: 739.21024, Calcd for C34H45 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 759.19268; Found: 759.19594, Calcd for C34H45 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 761.19064; Found: 761.19039.
化合物ｐは、次のようにして合成した。上述した化合物ｍの合成方法において、プロピオン酸無水物に替えてラウリン酸クロリド（１７０μＬ）を用いた以外は、化合物ｍの合成方法と同様の材料及び反応を行い、目的物である化合物ｐ（２５．０ｍｇ、４段階収率２０％）を無色アモルファスとして得た。
HRMS (ESI-TOF) Calcd for C34H46 79BrN2O9S [M+H]+: 737.21074; Found: 737.20932, Calcd for C34H46 81BrN2O9S [M+H]+: 739.20869; Found: 739.21024, Calcd for C34H45 79BrN2NaO9S [M+Na]+: 759.19268; Found: 759.19594, Calcd for C34H45 81BrN2NaO9S [M+Na]+: 761.19064; Found: 761.19039.
【0168】
［各種ウイルスのシアリダーゼに対する反応性の検討］
実施例１３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｍ（２２－１１４ａ＿３）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）、化合物ｐ（２２－１１４ａ＿１２）及び化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
実施例１３と同様の方法により、各種ウイルスのシアリダーゼ発現細胞を調製し、そのシアリダーゼ発現細胞に化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｍ（２２－１１４ａ＿３）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）、化合物ｐ（２２－１１４ａ＿１２）及び化合物ａ（陽性対照；ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）をそれぞれ添加した際のシアリダーゼ活性を測定することで反応性を検討した。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらのシアリダーゼ発現細胞を調製した。具体的には、プラスミドは以下のものを用いた。
【0169】
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＭｕＶ １３Ｖ１６５Ｅ２株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＡＶ Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにＩＢＶ Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ１ Ｃ３５株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
・ｐＣＡＧＧＳベクターにｈＰＩＶ３ Ｃ２４３株のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）配列を組み込んだプラスミド
【0170】
細胞は、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養には、Ｄ－ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified essential medium）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃で培養した。まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養して８０～９０％コンフルエントの状態とした。トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従い、上述した各プラスミド２．５μｇ／ウェルを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間培養した。培地を除去後、リン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ、１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２、以下ＰＢＳと称する）を各ウェルに１ｍＬずつ添加し、細胞を懸濁したのち遠心分離（４℃、１０００×ｇ、１０分間）して上清を除去した。遠心分離により沈降した細胞を１００ｍＭ 酢酸緩衝液（測定対象のシアリダーゼがＩＡＶ及びＩＢＶの場合にはｐＨ６．０、ＭｕＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３の場合にはｐＨ４．５）に懸濁してウイルス種毎のＮＡ発現細胞懸濁液とした。
【0171】
各化合物は、予め１００ｍＭ濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させておいたストック溶液を用い、１００ｍＭ 酢酸緩衝液（測定対象のシアリダーゼがＩＡＶ及びＩＢＶの場合にはｐＨ６．０、ＭｕＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３の場合にはｐＨ４．５）を用いて、その濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ希釈した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、その上清を回収し、添加する化合物の終濃度が２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭとなるように段階希釈した。氷上で９６ウェルの黒色プレートの各ウェルに、上述のようにして調製したＮＡ発現細胞懸濁液４０μＬと化合物の希釈液１０μＬ（化合物の終濃度：２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び２００μＭ）を加えて５秒間プレートミキサーにかけた後、３７℃で２０分間反応させた。反応終了時、氷上で１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．７）を５０μＬ／ウェルで添加した。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社製）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離したＢＴＰ３の励起波長３７２ｎｍ、測定波長５２６ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３７２ｎｍ／５２６ｎｍ）における蛍光強度を独立して３回測定した。Ｂｌａｎｋは、空プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ・ＭＣＳをトランスフェクションした細胞における蛍光強度とした。シアリダーゼ活性は、独立した３回の測定において各化合物による蛍光強度からＢｌａｎｋを差し引いた値の平均値±標準誤差で示した。
【0172】
結果を図１８～図２０のグラフに示す。各グラフの縦軸はシアリダーゼ活性を示す蛍光強度であり、横軸は添加した化合物の終濃度（μＭ）である。これらの結果によれば、シアル酸骨格のＣ５位Ｎ―アセチル基を直鎖アルキル基とした化合物のうち、直鎖アルキル基の炭素鎖の炭素数によって、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する反応性が変化することが明らかとなった（図１８（ａ））。より具体的には、図１８（ａ）に示すように、化合物のＣ５位直鎖アルキル基の炭素数が多くなるほど（化合物ｍの炭素数は３、化合物ｄの炭素数は４、化合物ｎの炭素数は５、化合物ｉの炭素数は６、化合物ｊの炭素数は７、化合物ｈの炭素数は８、化合物ｏの炭素数１０、化合物ｐの炭素数１２）、ムンプスウイルスのシアリダーゼに対する反応性は低下する傾向がみられたが、炭素数８の化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）では反応性は上昇した。また、図１８（ｂ）、図１９及び図２０に示すように、化合物ｍ（２２－１１４ａ＿３：炭素数３）は、いずれのウイルスのシアリダーゼに対しても高い反応性を示した。これらのことから、化合物のＣ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物がムンプスウイルスのシアリダーゼに対する特異性を有する基質化合物であり、このうち、化合物のＣ５位直鎖アルキル基の炭素数が５～１０の化合物、すなわち、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）が特に優れた特異性を有する基質化合物であり、ムンプスウイルスのシアリダーゼを特異的に検出して、ムンプスエンザウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。また、これらのＣ５位直鎖アルキル基の炭素数が５～１０の化合物は、ムンプスウイルスのシアリダーゼと特異的に反応することにより、十分な蛍光強度の蛍光物質が生じていることから、ムンプスウイルスのシアリダーゼの特異的な検出作用に優れると共に、シアリダーゼ検出時における蛍光強度にも優れることがわかった。
【0173】
［実施例１６］
１６．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（２）
実施例１５において、ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出できることが確認された、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）を用いて、ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、これらの化合物がムンプスウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
１６．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（２）
実施例１５において、ムンプスウイルスのシアリダーゼを検出できることが確認された、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）、化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）を用いて、ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージングを行った。また、これらの化合物がムンプスウイルス以外のウイルス種の感染細胞には蛍光イメージングしないことを確認するため、他のウイルス種の感染細胞についても同様の試験を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株、Ａ型インフルエンザウイルス Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／７３８／２００８ Ｈ１Ｎ１株、Ｂ型インフルエンザウイルス Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０株、ヒトパラインフルエンザウイルス血清１型 Ｃ３５株及びヒトパラインフルエンザウイルス血清３型 Ｃ２４３株を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0174】
宿主細胞には、ＭｕＶに対してはアフリカミドリザル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ＩＡＶ及びＩＢＶに対してはイヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３に対してはアカゲザル腎由来ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いた。各細胞の培養には、５％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地（Minimum essential medium）を用い、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0175】
細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し（１００μＬ／ウェル）、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養してコンフルエントの状態にした。細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、各ウイルスが１００フォーカス形成ユニット（以下ＦＦＵ）／ウェルとなるように、各ウイルス－無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、以下ＳＦＭ）の懸濁液を５０μＬ／ウェルで添加して、５％ＣＯ２、３７℃で１時間静置し、対応する宿主細胞にウイルスを感染させた。５０μＬ／ウェルのＰＢＳで細胞を洗浄後、５０μＬ／ウェルのＳＦＭに置換して、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。なお、ＩＡＶ及びＩＢＶ感染細胞は２４時間、ＭｕＶ、ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３の感染細胞は４８時間培養した。
【0176】
観察直前に、陽性対照である化合物ａ（ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃ）又は各化合物をＳＦＭ（ｐＨ７．４）で２００μＭに希釈した。なお、ｈＰＩＶ１感染細胞及びｈＰＩＶ３感染細胞への添加用ＳＦＭ希釈液としてはＳＦＭを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．５に用事調製した。これを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収して、非特異的に切断された蛍光物質を分離した。氷上で各感染細胞上のＳＦＭを除去し、２００μＭの各化合物含有ＳＦＭ上清に置換して３７℃で２０分間反応させた。反応終了時に、氷上で各化合物含有ＳＦＭ上清を除去し、各感染細胞を５０μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄後、５０μＬ／ウェルのＳＦＭに置換した。蛍光顕微鏡（型番：ＢＺ－Ｘ７００、株式会社キーエンス製）でＢＴＰ特注フィルター（励起波長：３６０／４０ｎｍ、吸収波長：５２５／５０ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００ｎｍ）を用いて蛍光像を観察した（対物レンズ２０倍、撮影設定は高感度モード・露光時間１／４秒）。結果を図２１～２３に示す。
【0177】
この結果によれば、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）及び化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）は、ムンプスウイルスの感染細胞を組織化学的に蛍光イメージングできることが示された（図２１（ａ））。このうち、炭素数が４の化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）は若干ではあるが、ｈＰＩＶ３及びｈＰＩＶ１感染細胞についても蛍光を示すことがわかった。他方、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が５～１０の化合物は、ムンプスウイルスの感染細胞のみを蛍光イメージングした。このことから、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が５～１０の化合物、すなわち、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）及び化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）は、ムンプスウイルスを特異的に蛍光イメージングすることができる化合物であること、ムンプスウイルスの感染細胞を特異的に検出し、ムンプスウイルスの存在の有無を判別できる化合物であることが明らかとなった。
【0178】
［実施例１７］
１７．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（３）
本実施例では、上述した実施例で用いたムンプスウイルス株とは異なるムンプスウイルス株についても、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物（化合物ｄ、ｎ、ｉ、ｊ、ｈ及びｏ）が蛍光イメージング可能かどうか、検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株（静岡市環境保健研究所で２０１３年に分離された株）のほか、ムンプスウイルス Ｔｏｒｉｉ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８８０；日本で１９６９年に分離された株）、ムンプスウイルス ｌｏｗａ．ＵＳ／２００６株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８９９；米国アイオワ州で２００６年に分離された株）を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
１７．ムンプスウイルス感染細胞の蛍光イメージング（３）
本実施例では、上述した実施例で用いたムンプスウイルス株とは異なるムンプスウイルス株についても、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物（化合物ｄ、ｎ、ｉ、ｊ、ｈ及びｏ）が蛍光イメージング可能かどうか、検討を行った。本実施例では、ウイルス種として、ムンプスウイルス １３Ｖ１６５Ｅ２株（静岡市環境保健研究所で２０１３年に分離された株）のほか、ムンプスウイルス Ｔｏｒｉｉ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８８０；日本で１９６９年に分離された株）、ムンプスウイルス ｌｏｗａ．ＵＳ／２００６株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８９９；米国アイオワ州で２００６年に分離された株）を選択し、これらウイルスの感染細胞を調製した。
【0179】
実施例１６のウイルス感染細胞の調製において、使用したウイルスを上述した３種のムンプスウイルスに替えた以外は、実施例１６と同様にしてムンプスウイルス感染細胞を調製した。実施例１６と同様の材料及び方法により、各化合物によるムンプスウイルスの蛍光イメージングを行った。結果を図２４に示す。
【0180】
この結果によれば、Ｃ５位直鎖アルキル基の炭素数が４～１０の化合物である、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）及び化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）は、ムンプスウイルスの１３Ｖ１６５Ｅ２株、Ｔｏｒｉｉ株及びｌｏｗａ株の感染細胞に対しても、組織化学的に蛍光イメージングできることが示された。これらのことから、化合物ｄ（２２－００２ｂ＿４）、化合物ｎ（２２－１１４ａ＿５）、化合物ｉ（２２－００５ｂ＿６）、化合物ｊ（２２－００５ｂ＿７）、化合物ｈ（２２－００５ｂ＿８）及び化合物ｏ（２２－１１４ａ＿１０）は、ムンプスウイルス株に限定されることなく、ムンプスウイルスを蛍光イメージングできることがわかった。
【0181】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0182】
本発明は、ウイルスの検出用試薬及びこれを用いたウイルスの検出方法を提供するものであり、ウイルス研究及びウイルス診断、医療等の分野の産業において幅広く役立つものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
