(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024160189
(43)【公開日】2024-11-13
(54)【発明の名称】治療デバイスキット
(51)【国際特許分類】
A61K 31/704 20060101AFI20241106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
A61K31/704
A61K39/395 T
A61K31/337
A61K31/282
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K9/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021156771
(22)【出願日】2021-09-27
(71)【出願人】
【識別番号】000109543
【氏名又は名称】テルモ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】有馬 大貴
(72)【発明者】
【氏名】野沢 滋典
(72)【発明者】
【氏名】平光 真樹
(72)【発明者】
【氏名】大津 恵子
(72)【発明者】
【氏名】米田 善紀
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB13
4C076CC27
4C076FF12
4C085AA14
4C085AA26
4C085GG02
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086EA10
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206JB16
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZB26
4C206ZC75
(57)【要約】
【課題】より抗腫瘍効果の高い手法を提供することを目的とする。
【解決手段】免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、抗がん剤は、投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキット。
【選択図】図７
【解決手段】免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、抗がん剤は、投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキット。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、
前記抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、
前記抗がん剤を前記投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキット。
前記抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、
前記抗がん剤を前記投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキット。
【請求項2】
前記抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、請求項１に記載の治療デバイスキット。
【請求項3】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の治療デバイスキット。
【請求項4】
前記腫瘍が固形がんである、請求項１～３のいずれか１項に記載の治療デバイスキット。
【請求項5】
前記抗がん剤が、ドキソルビシン、エピルビシン、オキサリプラチン、パクリタキセルおよびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の治療デバイスキット。
【請求項6】
前記投与デバイスが、体外から腫瘍まで穿刺可能な長さの注入針を備える、請求項１～５のいずれか１項に記載の治療デバイスキット。
【請求項7】
前記投与デバイスが、前記注入針を格納する外筒を備える、請求項６に記載の治療デバイスキット。
【請求項8】
前記投与デバイスが前記抗がん剤を投与すると同時に注入圧力を測定および報知する、請求項１～７のいずれか１項に記載の治療デバイスキット。
【請求項9】
前記投与デバイスが注入針の先端あるいは側面に薬液排出孔を持つ、請求項１～８のいずれか１項に記載のデバイスキット。
【請求項10】
前記投与デバイスが、前記注入針内に抗がん剤を安全に充填するための機構を備える、請求項１～９のいずれか１項に記載のデバイスキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療デバイスキットに関する。
【背景技術】
【0002】
がん治療における化学療法で用いられる抗がん剤の投与方法として静脈投与は標準的な投与方法である。しかしながら、抗がん剤の静脈投与は、腫瘍内に到達できる薬剤量が少なく、治療効果が低減する場合があり、また、全身性の副作用が表れるといった問題点がある。
【0003】
一方、免疫系を疾患の治療に応用する、がん免疫療法が注目を集めている。免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。細胞性免疫は、がん細胞の殺傷・排除を行う能力を有しているため、がん免疫療法において重要な働きとなることが判明している。細胞性免疫を構成する細胞の中でも、細胞傷害性Ｔ細胞（以下、単にＣＴＬとも称する）は、がん細胞を殺傷する主な働きを担っている。
【0004】
ＣＴＬの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞やがん細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、ＣＴＬへと分化する。ＣＴＬの誘導は、効果の高いがん免疫療法に必要な要因となっている。
【0005】
例えば、特許文献１では、抗原特異的免疫応答を高めるためのワクチン用アジュバントとしてのＭＨＣクラスＩＩリガンドまたはＭＨＣクラスＩＩ様リガンドが開示されている。
【0006】
一方、異なる免疫システムを利用することで、薬剤の組み合わせによる抗腫瘍効果の増大を期待して、２つの薬剤を組み合わせるがん免疫療法についても検討がなされている。例えば、特許文献２では、ＰＥ３８短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせてなる、腫瘍を治療するための医薬が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特表２００１－５１０８０６号公報
【特許文献2】特表２０１８－５３３６２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記の通り、効率よく抗腫瘍免疫を誘導／活性化し、より抗腫瘍効果の高い手法が求められている。
【0009】
したがって、本発明は、より抗腫瘍効果の高い手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、抗がん剤は、投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキットである。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、より抗腫瘍効果の高い治療デバイスキットを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】マウス薬効評価における各群の腫瘍体積を示すグラフである。
【図2】マウス薬効評価における各群の生存曲線を示す図である。
【図3】フローサイトメトリーにおけるゲーティングフローチャートを示す図である。
【図4】フローサイトメトリーを用いたＣＴＬ活性化評価（マウス）における各群のＴｏｔａｌ．ＣＴＬ数を示すグラフである。
【0013】
【図5】フローサイトメトリーを用いたＣＴＬ活性化評価（マウス）における各群のＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数を示すグラフである。
【図6】フローサイトメトリーを用いたＣＴＬ活性化評価（マウス）における各群のＣＤ６９＋ＣＴＬ数を示すグラフである。
【図7】抗がん剤の投与方法の第１実施形態に使用される投与デバイスを含む治療デバイスキットを示す図である。
【図8】注入針の先端部を示す図である。
【図9】注入針の先端部を示す図である。
【図10】投与デバイスを構成する外筒の構成について示す図である。
【図11】投与デバイスを構成する外筒の構成について示す図である。
【図12】治療デバイスキットを構成する補助具について示す図である。
【図13】治療デバイスキットを構成する補助具について示す図である。
【図14】抗がん剤の投与方法の第２実施形態に使用される内視鏡および投与デバイス等を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【0015】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０℃以上２５℃以下）／相対湿度４０％ＲＨ以上５０％ＲＨ以下の条件で行う。
【0016】
本発明の一態様は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、抗がん剤は、投与デバイスを用いて投与されることで抗腫瘍免疫の活性化を誘導する、治療デバイスキットである。
【0017】
以下、各構成要素を説明する。
【0018】
［免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤」
「免疫原性細胞死」とは、通常、カルレティキュリン、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１に代表されるＤＡＭＰｓの表出または放出を伴う、免疫細胞に非自己として認識されやすい形での細胞死を指す。
「免疫原性細胞死」とは、通常、カルレティキュリン、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１に代表されるＤＡＭＰｓの表出または放出を伴う、免疫細胞に非自己として認識されやすい形での細胞死を指す。
【0019】
免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤（以下、単に抗がん剤とも称する）としては、ドキソルビシン、エピルビシン、オキサリプラチン、パクリタキセルおよびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、ドキソルビシンおよび／またはその薬学的に許容される塩であることがより好ましい。すなわち、本発明の好適な一態様は、ドキソルビシンおよび／またはその薬学的に許容される塩と、ドキソルビシンおよび／またはその薬学的に許容される塩を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットである。ドキソルビシン塩としては、例えば、ドキソルビシン塩酸塩が挙げられる。
【0020】
上記薬学的に許容される塩としては、アミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
【0021】
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、ホウ酸、硝酸および硫酸などの無機酸との塩；ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
【0022】
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミンおよびＮ、Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
【0023】
抗がん剤は、例えば、後述する投与デバイスを用いて投与されることで、抗腫瘍免疫の活性化を誘導する。抗腫瘍免疫の活性化は、例えば、抗がん剤の投与量によっても誘導が制御される。ここで、「抗腫瘍免疫の活性化」とは、具体的には、抗がん剤を投与しないコントロールと比較して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）数が１５０％以上、好ましくは１７０％以上、より好ましくは２００％以上増加していることを指す。また、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）数は、後述の実施例に記載のＴｏｔａｌ．ＣＴＬ数の測定方法により測定することができる。
【0024】
抗がん剤の投与量は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。本実施態様の治療デバイスキットによれば、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤によって、抗腫瘍免疫の活性化を引き起こすことができる。ゆえに、通常の抗がん剤の投与量よりも投与量を低減できることが見込まれる。ヒトにおいて抗がん剤の投与量は、例えば、０．１ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙ以下であり、０．０１～０．１ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙであってもよく、０．０２０～０．０７０ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙであってもよい。なお、全身投与の場合、抗がん剤、例えば、ドキソルビシン塩酸塩は通常、０．２０ｍｇ／Ｋｇ以上の投与を要する。また、抗がん剤の腫瘍体積あたりの投与量は、例えば、腫瘍組織１００ｍｍ３あたり６μｇ以上であり、６０μｇ以下であってもよく、２０μｇ以下であってもよい。
【0025】
１クールあたりの抗がん剤の投与回数も特に制限されず、単回投与であっても、複数回投与であってもよく、例えば１クールあたり１回～３回投与することができる。また、抗がん剤は、１～４週間程度の間隔で反復投与が可能である。さらに、腫瘍が複数ある場合、抗がん剤を複数の腫瘍に投与してもよい。
【0026】
抗がん剤は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる添加剤などとともに組成物を構成してもよい。
【0027】
「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために使用される。
【0028】
製薬上許容されうる添加剤としては、溶媒（例えば生理食塩水、注射用水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％（重量／体積パーセント）含有する食塩水、ＰＢＳおよびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。
【0029】
［投与デバイス］
投与デバイスは、抗がん剤を腫瘍組織に直接投与できれば、具体的な構成は特に限定されないが、以下に２つの投与デバイスについて例示的に説明する。
投与デバイスは、抗がん剤を腫瘍組織に直接投与できれば、具体的な構成は特に限定されないが、以下に２つの投与デバイスについて例示的に説明する。
【0030】
(抗がん剤投与デバイスの第１実施形態)
図７は投与デバイス１００を含む治療デバイスキット１を示す概略図である。治療デバイスキット１は、図７を参照して概説すれば、医療デバイス２００と、投与デバイス１００と、器具３００と、補助具４００と、を含む。以下、詳述する。
図７は投与デバイス１００を含む治療デバイスキット１を示す概略図である。治療デバイスキット１は、図７を参照して概説すれば、医療デバイス２００と、投与デバイス１００と、器具３００と、補助具４００と、を含む。以下、詳述する。
【0031】
(医療デバイス)
医療デバイス２００は、図７に示すように筒部２１０と、押圧部２２０と、シール部材２３０と、接続部材２４０と、を備える。
医療デバイス２００は、図７に示すように筒部２１０と、押圧部２２０と、シール部材２３０と、接続部材２４０と、を備える。
【0032】
筒部２１０は、抗がん剤を収容する半閉空間を設けている。筒部２１０は、円筒等の筒形状に構成しており、筒形状の軸方向における両端に開口部を設けている。一方の開口部（基端側開口部とも呼ぶ）には押圧部２２０を移動可能に配置することができる。他方の開口部（先端側開口部とも呼ぶ）には、接続部材２４０を取り付けることができる。
【0033】
押圧部２２０は、筒部２１０の半閉空間の大きさを増減可能な押し子を含む。押圧部２２０の押し子は、先端側を筒部２１０の半閉空間に収容し、基端側を筒部２１０の外部に配置するように構成している。押圧部２２０の押し子は、筒部２１０の軸方向において筒部２１０に対して相対的に移動することによって薬剤（抗がん剤、以下、薬剤とも称される）が収容される半閉空間の大きさを変えるように構成している。
【0034】
押圧部２２０の押し子によって筒部２１０の半閉空間の大きさが減少することによって、半閉空間に収容されていた薬剤は減少した分、注入針１２０の内腔に流通し、患者に投与され得る。なお、押圧部２２０の押し子は、術者が手指等で把持することによって手動で動作させてもよいし、モータとギヤ等の機械要素を適宜組み合わせることによって押し子を動作させてもよい。
【0035】
シール部材２３０は、押圧部２２０の押し子の軸方向における先端部に取り付けるように構成している。シール部材２３０は、筒部２１０の内壁と摺動可能に篏合することによって筒部２１０の半閉空間に収容された薬剤が注入針１２０以外から流通することを防止する。
【0036】
接続部材２４０は、筒部２１０の先端側における開口部に取り付けられる。接続部材２４０は、内部に薬剤を流通できるように中空に構成している。接続部材２４０は、筒部２１０の先端部に取り付けられ、接続部材２４０の内腔は筒部２１０の半閉空間と連通するように構成している。
【0037】
(投与デバイス)
投与デバイス１００は、図７等に示すように内筒１１０と、注入針１２０と、外筒１３０と、検出部１４０と、報知部１５０と、制御部(図示省略)と、を備える。
投与デバイス１００は、図７等に示すように内筒１１０と、注入針１２０と、外筒１３０と、検出部１４０と、報知部１５０と、制御部(図示省略)と、を備える。
【0038】
内筒１１０は、医療デバイス２００と接続され、注入針１２０とともに医療デバイス２００から流通する抗がん剤の送液路を内部に設けている。内筒１１０は、本実施形態において円筒形状の側面において径方向外方に医療デバイス２００との接続部１１１を設けている。また、内筒１１０の内部に設けた送液路の経路には後述する検出部１４０を設けている。
【0039】
注入針１２０は、生体の腫瘍組織に抗がん剤を直接投与できるように構成している。注入針１２０は、細径の中空部材を含み、中空部材の内部に内筒１１０の送液路と連通する送液路を設け、先端に送液路と連通する先端開口部を設けるように構成している。注入針１２０の寸法は、体表から体内に存在する腫瘍に穿刺できるように、投与対象および腫瘍位置によって適宜選択される。対象がヒトである場合、体表から体内に存在する腫瘍に穿刺できるように長手方向の寸法を１５０ｍｍ以上に構成することができる。注入針１２０の寸法は、例えば５０～３００ｍｍであってもよい。
【0040】
図８は注入針１２０において薬剤を吐出する開口部を示す図、図９は注入針１２０の変形例に係る注入針１２０ａにおいて薬剤を吐出する開口部を示す図である。注入針１２０は、本実施形態において抗がん剤を吐出する開口部を図８に示すように長手方向において先端側を向くように設けている。ただし、注入針の開口部はこれに限定されず、上記以外にも図９の注入針１２０ａに示すように長手方向の先端部付近において先端側を向く部位を中実にし、先端部付近から径方向外方に薬剤を吐出する開口部を設け、当該開口部を周方向に複数設けてもよい。径方向に開口部がある形態において、先端は鋭利であってもよい。本発明の一態様は、投与デバイスが注入針の先端あるいは側面に薬液排出孔を持つ。
【0041】
また、注入針１２０は、後述する補助具４００を用いた状態で注入針１２０の送液路の先端まで抗がん剤を流通させる操作(プライミング)を行うことができる。補助具４００については後述する。本発明の他の一態様は、投与デバイスが、注入針内に抗がん剤を安全に充填するための機構を備える。
【0042】
外筒１３０は、内筒１１０の少なくとも一部を格納可能な基部１３１と、注入針１２０の先端部を格納可能な先端部１３２と、を備える。図１０、図１１は外筒１３０の基部１３１および先端部１３２について示す図である。基部１３１と先端部１３２は、本実施形態において注入針１２０の長手方向において連なるように形成している。基部１３１と先端部１３２は図１０に示す二点鎖線Ｌ１によって区別され、基部１３１および先端部１３２は、各々「外筒」と呼ばれ得る。
【0043】
検出部１４０は、内筒１１０の内部に設けた送液路に設けるように構成している。検出部１４０は、注入針１２０によって患部に抗がん剤を投与する際の注入圧力を測定可能なセンサを含む。検出部１４０のセンサは送液路を流通する抗がん剤の圧力を測定できれば特に限定されないが、一例としてダイヤフラム式のセンサを挙げることができる。
【0044】
報知部１５０は、検出部１４０のセンサによって測定された抗がん剤の注入時の圧力を報知可能に構成している。報知部１５０は、検出部１４０のセンサから内筒１１０の基端側を通じて内筒１１０の外部に導出される配線等によって検出部１４０と電気的に接続可能に構成している。
【0045】
報知部１５０は、検出部１４０に係るセンサによる圧力値を使用者に報知できれば具体的な構成は特に限定されないが、一例として数値やグラフなどによって圧力値を映像により表示する液晶ディスプレイや有機ＥＬディスプレイ等を含むようにできる。
【0046】
制御部は、投与デバイス１００において検出部１４０や報知部１５０のような電気的に接続された構成を制御するために設けられる。制御部は、ＣＰＵ、ＧＰＵなどのプロセッサ、ＲＡＭ等の主記憶、ＲＯＭ、ＨＤＤやＳＳＤ等の補助記憶を含むように構成している。制御部は報知部１５０の筐体の内部等に収容できる。
【0047】
（器具）
器具３００は、補助具４００と接続した状態で使用者の操作により補助具４００の筒部４１０の第１半閉空間４１３を負圧にするように構成している（図１２、１３）。器具３００は、図７に示すように筒部３１０と、押圧部材３２０と、シール部材３３０と、接続部材３４０と、を備える。
器具３００は、補助具４００と接続した状態で使用者の操作により補助具４００の筒部４１０の第１半閉空間４１３を負圧にするように構成している（図１２、１３）。器具３００は、図７に示すように筒部３１０と、押圧部材３２０と、シール部材３３０と、接続部材３４０と、を備える。
【0048】
筒部３１０は、医療デバイス２００の筒部２１０と同様であり、押圧部材３２０は押圧部２２０と同様であり、シール部材３３０はシール部材２３０と同様であるため、詳細な説明を省略する。
【0049】
接続部材３４０は、気体等の流体を流通可能なチューブ等の中空部材を備えるように構成している。術者は接続部材３４０の一方を筒部３１０に取り付け、他方を補助具４００の接続部４４０に取り付けた状態で筒部３１０の半閉空間が増加するように押圧部材３２０を移動させる操作を行う。これにより、補助具４００における筒部４１０の第１半閉空間４１３を負圧にすることができる。
【0050】
なお、器具３００は本実施形態において医療デバイス２００と同様の部材を備えるように構成しているが、補助具４００の第１半閉空間４１３を負圧にできれば、具体的な構成は医療デバイス２００と同様の構成に限定されない。
【0051】
(補助具)
図１２、図１３は補助具４００の説明に供する図である。補助具４００は、注入針１２０の送液路に抗がん剤を流通させるプライミングの際に注入針１２０の先端から抗がん剤が外部に漏出することで抗がん剤が医療従事者や患者に飛散することなどを防止する。補助具４００は、図１２等に示すように筒部４１０を備える。補助具４００の筒部４１０は、ストッパー４２０と、弁部材４３０と、接続部４４０と、を備える。
図１２、図１３は補助具４００の説明に供する図である。補助具４００は、注入針１２０の送液路に抗がん剤を流通させるプライミングの際に注入針１２０の先端から抗がん剤が外部に漏出することで抗がん剤が医療従事者や患者に飛散することなどを防止する。補助具４００は、図１２等に示すように筒部４１０を備える。補助具４００の筒部４１０は、ストッパー４２０と、弁部材４３０と、接続部４４０と、を備える。
【0052】
筒部４１０は、抗がん剤が流通可能な中空の注入針１２０の先端部を包囲できるように内部空間を構成する第１半閉空間４１３と第２半閉空間４１４とを設けている。筒部４１０は、第１半閉空間４１３および第２半閉空間４１４を設けた円筒等の筒形状に構成している。ただし、筒部４１０は、プライミング時に薬剤が外部に漏出することを防止できれば、具体的な形状は円筒に限定されず、円筒以外の他の角筒(多角柱)等によって構成してもよい。
【0053】
筒部４１０は、筒形状の軸方向において先端側と基端側の両方に第１半閉空間４１３または第２半閉空間４１４を外部と連通させる開口部を設けている。本明細書では第１半閉空間４１３を外部と連通させる先端側の開口部を第１開口部４１１、第２半閉空間４１４を外部と連通させる基端側の開口部を第２開口部４１２と呼ぶ。第１半閉空間４１３の図１２における注入針１２０の挿入方向の寸法(縦方向の寸法ｄ１)は注入針１２０が挿入時に注入針１２０と対向する壁部４１５に接触しない、または到達しにくい程度に構成できる。また、筒部４１０は透明な材料から構成することによってプライミングの際に第１半閉空間４１３で注入針１２０から抗がん剤が飛散することを目視にて確認し、プライミングの完了を確認しうる。
【0054】
ストッパー４２０は、本実施形態において筒部４１０の内部空間である第２半閉空間４１４に設けられる。ストッパー４２０には投与デバイス１００の注入針１２０を挿通させ、注入針１２０以外の針管の挿通を妨げる第３開口部４２１を設けるように構成している。
【0055】
第３開口部４２１は、筒部４１０の第１半閉空間４１３に進入する方向から軸方向に進むにつれて軸方向に交差する断面の面積が小さくなるように構成している。そのように構成することによって、注入針１２０を第３開口部４２１に挿入しやすくすることができる。第３開口部４２１は、本実施形態において径方向の寸法が段階的に変化する段付き形状を備えるように構成している。ただし、第３開口部は段付き形状に代えて、または段付き形状に加えてテーパー形状を備えるように構成してもよい。
【0056】
弁部材４３０は、筒部４１０の内部空間の軸方向において第２開口部４１２に隣接して設けている。筒部４１０の内部空間は、弁部材４３０によって第１開口部４１１側の第１半閉空間４１３と第２開口部４１２側の第２半閉空間４１４とに分割できる。
【0057】
弁部材４３０は、医療デバイス２００のシール部材２３０を構成する弾性変形可能な弾性部材と同様の部材によって構成できる。弁部材４３０は、筒部４１０の軸方向に交差する断面形状と同様に断面形状を略円形状に構成している。弁部材４３０は、本実施形態においてストッパー４２０に隣接して設けている。
【0058】
弁部材４３０は、本実施形態において図１２等に示すように略中央部において切り込み４３１を設けるように構成している。これにより、注入針１２０の先端部は、図１３に示すように筒部４１０の第２開口部４１２から弁部材４３０を弾性変形させることによって、切り込み４３１から弁部材４３０を挿通して筒部４１０の第１半閉空間４１３に進入させる（挿入する）ことができる。
【0059】
弁部材４３０は、注入針１２０の先端部を第１半閉空間４１３に挿入した状態において注入針１２０を保持する。弁部材４３０は、注入針１２０を挿通させた状態において内部空間における第２開口部４１２の側から抗がん剤の漏出を防止する。
【0060】
弁部材４３０の切り込み４３１は、本実施形態において十字に形成している。ただし、注入針１２０が弁部材を挿通でき、挿通した状態で挿通箇所から抗がん剤が流出しなければ、切り込みの具体的な形状は十字に限定されない。また、注入針１２０を弁部材と密着した状態で注入針１２０の先端部を第１半閉空間４１３に挿入できれば、弁部材には切り込みを設けなくてもよい。
【0061】
接続部４４０は、筒部４１０の軸方向において第１開口部４１１の側に設けている。接続部４４０は、後述するように筒部４１０の第１半閉空間４１３（内部空間）を負圧にする器具３００との接続を可能に構成している。
【0062】
接続部４４０は、第１開口部４１１を設け、第１開口部４１１は筒部４１０の第１半閉空間４１３と連通するように構成している。これにより、接続部４４０に器具３００の接続部材３４０等を取り付けた状態で器具３００を操作することによって、筒部４１０の第１半閉空間４１３を負圧にすることができる。
【0063】
接続部４４０は、本実施形態において筒部４１０と同様に軸線が注入針１２０の挿入方向と平行な中空の円筒形状に構成している。ただし、器具３００と接続した状態で器具３００を操作することによって筒部の第１半閉空間を負圧にできれば、接続部の具体的な形状は上記に限定されず、筒部と同様に多角柱等の他の筒形状によって構成してもよい。補助具４００については、半閉空間４１３を陰圧にする方式に限らず、器具３００を持たず、医療デバイス２００の押し子を動作させ２１０内を陽圧にすることで、４１３内に薬剤を押し出す方式でもよい。
【0064】
なお、治療デバイスキット１を構成する材料は特に限定されない。ただし、材料について例示すれば、内筒１１０、外筒１３０、筒部２１０、筒部４１０、押圧部２２０、押圧部材３２０、接続部材２４０、接続部材３４０等をポリプロピレンやポリエチレンなどのプラスチックによって構成できる。シール部材２３０およびシール部材３３０はブチルゴム、シリコンゴムまたはエラストマー等によって構成できる。注入針１２０はステンレス鋼等によって構成できる。
【0065】
(使用例)
次に本実施形態に係る治療デバイスキット１の使用例について説明する。まず、医師などの術者は、医療デバイス２００の接続部材２４０を投与デバイス１００の接続部１１１に接続し、器具３００の接続部材３４０を補助具４００の接続部４４０に接続する。
次に本実施形態に係る治療デバイスキット１の使用例について説明する。まず、医師などの術者は、医療デバイス２００の接続部材２４０を投与デバイス１００の接続部１１１に接続し、器具３００の接続部材３４０を補助具４００の接続部４４０に接続する。
【0066】
次に、術者は、外筒１３０の先端部１３２から注入針１２０を外部に露出させた状態で投与デバイス１００の注入針１２０の先端部を補助具４００の弁部材４３０の切り込み４３１に差し込み、注入針１２０の先端部を筒部４１０の第１半閉空間４１３に配置する。次に、術者は器具３００の筒部３１０の内部空間が広がるように押圧部材３２０を軸方向に移動させる操作を行う。これにより、補助具４００の第１半閉空間４１３が負圧になる。
【0067】
その結果、医療デバイス２００の筒部２１０の内部空間に収容された抗がん剤の少なくとも一部が筒部２１０の内部空間から注入針１２０の内腔に移動する。術者は、注入針１２０の先端部が筒部４１０の第１半閉空間４１３に配置された状態で筒部２１０内に配置された抗がん剤を注入針１２０の内腔に移動させる操作によって抗がん剤が注入針１２０の先端部から第１半閉空間４１３に出たことを目視にて確認できる(プライミング)。
【0068】
次に、術者は、注入針１２０の先端部を筒部４１０の第１半閉空間４１３から抜去し、注入針１２０を外筒１３０の先端部１３２に収容する。注入針１２０の外表面に抗がん剤が付着した場合、注入針１２０が筒部４１０の第１半閉空間４１３から出る際に注入針１２０を弁部材４３０に接触させながら通過させる。これにより、注入針１２０の外表面に付着した抗がん剤を弁部材４３０に付着させて筒部４１０の第１半閉空間４１３に留めることができる。
【0069】
次に、術者は患者の腹部周辺に小切開部を形成する。そして、術者はエコー下で注入針１２０およびそれを収容している外筒１３０の先端部１３２を経皮的に穿刺し、腫瘍手前までアクセスする。そして、術者は注入針１２０のみを腫瘍内部に穿刺し、筒部２１０の内部空間が減少するように押圧部２２０を筒部２１０に対して軸方向に相対的に移動させて抗がん剤を患部に投与する(図１０参照)。抗がん剤の投与が終了したら、術者は注入針１２０の先端部を外筒１３０の先端部１３２に収容し(図１１参照)、投与デバイス１００を体内から抜去する。なお、治療デバイスキット１は上記において器具３００と補助具４００を含むと説明した。ただし、本明細書において説明する抗がん剤によって高い抗腫瘍効果を発揮できれば、治療デバイスキットには器具３００と補助具４００を含まないものも本発明の一実施形態に含まれる。
【0070】
以上説明したように本実施形態では投与デバイス１００の注入針１２０の長手方向の寸法を５０ｍｍ以上に構成している。そのため、体表から穿刺してアプローチした注入針１２０によって腫瘍に穿刺して抗がん剤を患部に投与することができる。すなわち、本発明の一態様は、投与デバイスが、体外から腫瘍まで穿刺可能な長さの注入針を備える。
【0071】
また、投与デバイス１００は、外筒１３０の先端部１３２が注入針１２０の先端部を格納可能に構成している。このように構成することによって、抗がん剤の患部への投与後に腫瘍に触れた注入針１２０が患部から体表までの経路で生体に触れないようにすることができる。そのため、腫瘍播種や抗がん剤の漏れを防止することができる。すなわち、本発明の一態様は、投与デバイスが、さらに注入針を格納する外筒を備える。
【0072】
また、投与デバイス１００は、注入針１２０の送液路に検出部１４０に係るセンサを配置し、検出部１４０は検出部１４０によって測定された圧力を報知する報知部１５０と電気的に接続するように構成している。これにより、投与デバイス１００によって患部に抗がん剤を投与すると同時に抗がん剤注入時の注入圧力を使用者に報知することができる。すなわち、本発明の一態様は、投与デバイスが抗がん剤を投与すると同時に注入圧力を測定および報知する。
【0073】
本発明の一態様は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、抗がん剤は、体外から腫瘍まで穿刺可能な長さの注入針を備える投与デバイスを用いて投与される。
【0074】
本発明の一態様は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、投与デバイスが抗がん剤を投与すると同時に注入圧力を測定および報知する。
【0075】
本発明の一態様は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、投与デバイスが注入針の先端あるいは側面に薬液排出孔を持つ。
【0076】
本発明の一態様は、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤と、抗がん剤を直接腫瘍組織に投与可能な投与デバイスと、を有する治療デバイスキットであって、投与デバイスが注入針内に抗がん剤を安全に充填するための機構を備える。
【0077】
(抗がん剤投与方法の第２実施形態)
図１４から図１６は上述した投与デバイス１００を用いた抗がん剤投与の別の形態について説明する図である。抗がん剤の投与方法は第１実施形態以外に以下のように構成することも可能である。
図１４から図１６は上述した投与デバイス１００を用いた抗がん剤投与の別の形態について説明する図である。抗がん剤の投与方法は第１実施形態以外に以下のように構成することも可能である。
【0078】
図１４において抗がん剤は、上述した治療デバイスキット１を使用し、内視鏡を併用して患部に穿刺を行い、抗がん剤を患部に投与する。内視鏡は、図１４に示すようにビデオシステム本体１０と、ビデオスコープ２０と、を備える。本実施形態にて使用する内視鏡は公知のものを使用できるため、以下では内視鏡の中でも投与デバイス１００の注入針１２０に関連する部分を中心に説明する。
【0079】
ビデオシステム本体１０は、ビデオスコープ２０によって撮像された情報を記録やモニター(ディスプレイ)に表示する処理を行う。
【0080】
ビデオスコープ２０は、操作部３０と、挿入部４０と、を備える。挿入部４０は長尺部材を含み、内部に複数のルーメンを設けるように構成している。挿入部４０は、図１５に示すように撮像ルーメン４１、照射ルーメン４２、流体流通ルーメン４３および処置具挿通ルーメン４４を含む。
【0081】
撮像ルーメン４１はＣＣＤカメラ等の体内の画像を取得するデバイスを設置するルーメンとして設けている。照射ルーメン４２は、体内の撮像箇所を鮮明に撮像できるようにライト等の照明器具を設置するルーメンとして設けている。流体流通ルーメン４３は、必要に応じて水や空気などの流体を流通させるルーメンとして設けている。処置具挿通ルーメン４４は、鉗子等の処置具を基端側から挿入し、長尺部材の先端側から露出させて種々の処置を行うために処置具を設置するルーメンとして構成している。
【0082】
本実施形態において処置具挿通ルーメン４４には、治療デバイスキット１を構成する投与デバイス１００の注入針１２０を挿通させることができる。
【0083】
内視鏡を用いた抗がん剤の投与では、術者は第１実施形態と同様にプライミングを実施後、注入針１２０の先端部を補助具４００から抜去する。そして、術者は内視鏡の挿入部４０の先端を操作部３０によって患部まで運ぶ操作を行う。その後、術者は処置具挿通ルーメン４４に注入針１２０を挿通させて、図１６に示すように注入針１２０の先端部から患部に抗がん剤を投与する。
【0084】
これにより、腫瘍周辺の患部の様子を内視鏡によって確認した状態で図１６に示すように内視鏡の処置具挿通ルーメン４４に挿通させた注入針１２０によって患部に抗がん剤を投与することができる。
【0085】
［腫瘍組織］
抗がん剤が直接投与される腫瘍組織としては、がん組織が挙げられる。すなわち、本態様の治療デバイスキットは、がん治療または予防のための治療デバイスキットでありうる。投与デバイスが腫瘍に直接アクセスしやすく、抗がん剤を投与しやすいことから、腫瘍は固形がんであることが好ましい。固形がんとしては、肝細胞がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、乳がん、食道がん、胃がん、胆管がん、膵臓がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、頭頸部がん（例えば、口腔がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、唾液腺がんおよび舌がん）、腎細胞がん（例えば、淡明細胞型腎細胞がん）、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がんおよび卵巣明細胞腺がん）、鼻咽頭がん、子宮がん（例えば、子宮頸がんおよび子宮体がん）、肛門がん（例えば、肛門管がん）、食道胃接合部がん、尿路上皮がん（例えば、膀胱がん、上部尿路がん、尿管がん、腎盂がんおよび尿道がん）、前立腺がん、卵管がん、原発性腹膜がん、悪性胸膜中皮腫、胆嚢がん、胆道がん、皮膚がん（例えば、ブドウ膜悪性黒色腫およびメルケル細胞がん）、精巣がん（胚細胞腫瘍）、膣がん、外陰部がん、陰茎がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、脊椎腫瘍、神経芽細胞腫、髄芽腫、眼網膜芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、脳腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、神経膠芽腫および神経膠肉腫）および髄膜腫）および扁平上皮がんなどが挙げられる。一態様として、腫瘍は、乳がんや肝細胞がん、また肝転移した大腸がんなども含む。
抗がん剤が直接投与される腫瘍組織としては、がん組織が挙げられる。すなわち、本態様の治療デバイスキットは、がん治療または予防のための治療デバイスキットでありうる。投与デバイスが腫瘍に直接アクセスしやすく、抗がん剤を投与しやすいことから、腫瘍は固形がんであることが好ましい。固形がんとしては、肝細胞がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、乳がん、食道がん、胃がん、胆管がん、膵臓がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、頭頸部がん（例えば、口腔がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、唾液腺がんおよび舌がん）、腎細胞がん（例えば、淡明細胞型腎細胞がん）、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がんおよび卵巣明細胞腺がん）、鼻咽頭がん、子宮がん（例えば、子宮頸がんおよび子宮体がん）、肛門がん（例えば、肛門管がん）、食道胃接合部がん、尿路上皮がん（例えば、膀胱がん、上部尿路がん、尿管がん、腎盂がんおよび尿道がん）、前立腺がん、卵管がん、原発性腹膜がん、悪性胸膜中皮腫、胆嚢がん、胆道がん、皮膚がん（例えば、ブドウ膜悪性黒色腫およびメルケル細胞がん）、精巣がん（胚細胞腫瘍）、膣がん、外陰部がん、陰茎がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、脊椎腫瘍、神経芽細胞腫、髄芽腫、眼網膜芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、脳腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、神経膠芽腫および神経膠肉腫）および髄膜腫）および扁平上皮がんなどが挙げられる。一態様として、腫瘍は、乳がんや肝細胞がん、また肝転移した大腸がんなども含む。
【0086】
［免疫チェックポイント阻害剤］
本発明の好適な一態様は、抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されることで、抗腫瘍効果が一層高いものとなる。
本発明の好適な一態様は、抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されることで、抗腫瘍効果が一層高いものとなる。
【0087】
Ｔ細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現しているリガンドと相互作用する。Ｔ細胞はＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体－リガンドの相互作用によりＴ細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には共刺激性のものと抑制性のものがあり、両者のバランスによってＴ細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。
【0088】
がん細胞は、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現し、該受容体を利用して細胞傷害性Ｔ細胞による破壊から逃避している。
【0089】
免疫チェックポイント阻害剤は、受容体またはリガンドの免疫チェックポイントの働きを阻害するものであり、例えば、抑制性の受容体に対するアンタゴニストや、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストが挙げられる。
【0090】
「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体－リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体－リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。
【0091】
抑制性の免疫チェックポイントに対するアンタゴニストとしては、抑制性の免疫チェックポイント分子（抑制性の受容体又は該受容体のリガンド）と結合するアンタゴニスト性抗体、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等が挙げられる。
【0092】
抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニストとしては、具体的には、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体などが挙げられる。
【0093】
抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドに対するアンタゴニストとしては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗ＨＶＥＭ抗体などが挙げられる。
【0094】
中でも、抗がん剤との併用による抗腫瘍効果が高いことから、免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることがより好ましく、抗ＰＤ－１抗体であることがさらに好ましい。
【0095】
抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２などの抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体、断片抗体（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片）などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。抗原への特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
【0096】
モノクローナル抗体やポリクローナル抗体は従来公知の方法を参酌して作製することができる。
【0097】
抗体は市販品を用いてもよい。
【0098】
免疫チェックポイント阻害剤の投与方法は、抗がん剤と同一経路であっても異なる経路であってもよい。免疫チェックポイント阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。中でも、腫瘍組織内だけでなく腫瘍所属リンパ節内での作用も期待されることから、免疫チェックポイント阻害剤の投与方法としては、腹腔内注射、または静脈内注射であることが好ましく、全身へ作用する静脈内注射であることがより好ましい。
【0099】
抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、抗がん剤を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後に抗がん剤を投与してもよい。
【0100】
免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体－リガンドに作用し、効果を得るものである。Ｔ細胞を誘導した後に免疫チェックポイント阻害剤を投与することで、抗腫瘍効果の増大がより発揮されると考えられることから、抗がん剤を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。このため、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与されることが好ましい。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
【0101】
抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤の製剤としては、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物（単一の製剤）、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせ（薬剤キット）などが挙げられる。好適な形態は、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせである。すなわち、本態様においては、抗がん剤と、投与デバイスと、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた治療デバイスキットであることが好ましい。また、当該薬剤キットにおいては、抗がん剤、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、抗がん剤を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後に抗がん剤を投与してもよい。抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、抗がん剤を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。かような態様により、顕著な抗腫瘍効果を得ることができる。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。また、当該治療デバイスキットは、がん治療または予防のための治療デバイスキットであることが好ましい。
【0102】
抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を併用投与する場合の投与形態としては、それぞれに適した投与経路、投与頻度及び投与量を採用する限りは特に限定されず、例えば、（１）抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物、即ち、単一の製剤としての投与、（２）抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与等が挙げられる。投与する薬剤はこの２剤のみに限らず、さらにその他の薬剤を加えてもよい。
【0103】
併用投与における好ましい投与形態としては、抗がん剤を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与する方法である。
【0104】
本発明の他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤の有効量を投与デバイスを用いて、直接腫瘍組織に投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。また、他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、免疫原性細胞死を引き起こす抗がん剤の有効量を投与デバイスを用いて、直接腫瘍組織に投与すること、および免疫チェックポイント阻害剤の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。特に疾患ががんであることが好ましい。
【0105】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【0106】
また、抗がん剤と、免疫チェックポイント阻害剤と、を時間差をおいて投与する場合、抗腫瘍効果を増強するに足る間隔で薬剤を投与することが必要である。具体的な投与間隔は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【0107】
また、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤は、一定のサイクルで投与してもよい。投与サイクルとしては、併用に適するように投与サイクルを適宜調整することが好ましい。具体的な、投与頻度、投与量、点滴投与時間、投与サイクル等は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【0108】
免疫チェックポイント阻害剤の単独投与については、従来公知であり、例えば、２～３ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙの範囲で、１日１回から数回投与される。
【0109】
抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤を併用して用いる場合は、通常投与される投与経路により、通常単独で投与される場合と同じ投与量若しくはそれより低用量（例えば、単独で投与した場合の最高投与量の０．１０～０．９９倍）に設定することができる。
【0110】
免疫チェックポイント阻害剤および抗がん剤の投与量の重量（ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙ）比についても、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【実施例0111】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いる場合があるが、特に断りがない限り、「重量部」あるいは「重量％」を表す。また、特記しない限り、各操作は、室温（２５℃）で行われる。
【0112】
［１．マウス薬効評価］
Ａ：材料
１．被験物質
以下の表１に記載の被験物質および溶媒を用いた。
Ａ：材料
１．被験物質
以下の表１に記載の被験物質および溶媒を用いた。
【0113】
【表1】
【0114】
＜被験物質投与液の調製＞
・Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（αＰＤ－１）投与液調製（１００μｇ／２００μＬ／ｈｅａｄ）
αＰＤ－１（７．２４ｍｇ／ｍＬ）溶液を０．８８ｍＬとり１１．８ｍＬのＰＢＳに加え混和し、０．５ｍｇ／ｍＬとした。
・Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（以下、単にＤｏｘとも称する）投与液調製
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液：アドリアシン注用１０（１バイアル中に日局ドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ（力価）を含有）のバイアルに生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）１．０ｍＬを注入し粉末を溶解した。
・Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（αＰＤ－１）投与液調製（１００μｇ／２００μＬ／ｈｅａｄ）
αＰＤ－１（７．２４ｍｇ／ｍＬ）溶液を０．８８ｍＬとり１１．８ｍＬのＰＢＳに加え混和し、０．５ｍｇ／ｍＬとした。
・Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（以下、単にＤｏｘとも称する）投与液調製
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液：アドリアシン注用１０（１バイアル中に日局ドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ（力価）を含有）のバイアルに生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）１．０ｍＬを注入し粉末を溶解した。
【0115】
＜腫瘍内投与溶液の調製＞
全例の体重を２０ｇと仮定し、前述の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の濃度に段階的に希釈した。
・１ｍｇ／ｋｇ（０．０２０ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ１．０ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液を０．５ｍＬとり４．５ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．３ｍｇ／ｋｇ（０．００６ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ０．３ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１．０ｍｇ／ｍＬ溶液を１．５ｍＬとり３．５ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．１ｍｇ／ｋｇ（０．００２ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ０．１ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ０．３ｍｇ／ｍＬ溶液を１．０ｍＬとり２．０ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
全例の体重を２０ｇと仮定し、前述の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の濃度に段階的に希釈した。
・１ｍｇ／ｋｇ（０．０２０ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ１．０ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液を０．５ｍＬとり４．５ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．３ｍｇ／ｋｇ（０．００６ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ０．３ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１．０ｍｇ／ｍＬ溶液を１．５ｍＬとり３．５ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．１ｍｇ／ｋｇ（０．００２ｍｇ／２０μＬ／ｓｉｔｅ，Ｄｏｘ０．１ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ０．３ｍｇ／ｍＬ溶液を１．０ｍＬとり２．０ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
【0116】
＜静脈内投与溶液の調製＞
前述の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の濃度に段階希釈した。
・１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ，Ｄｏｘ０．２ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液を０．３ｍＬとり１４．７ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．３ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ，Ｄｏｘ０．０６ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ０．２ｍｇ／ｍＬ溶液を３ｍＬとり７ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
前述の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の濃度に段階希釈した。
・１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ，Ｄｏｘ０．２ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ１０ｍｇ／ｍＬ溶液を０．３ｍＬとり１４．７ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
・０．３ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ，Ｄｏｘ０．０６ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｏｘ０．２ｍｇ／ｍＬ溶液を３ｍＬとり７ｍＬの生理食塩水に加え混和した。
【0117】
２．使用動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（導入時：６週齢、日本チャールス・リバー株式会社）２１６匹を用いた。微生物統御ＳＰＦのマウスを使用した。
雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（導入時：６週齢、日本チャールス・リバー株式会社）２１６匹を用いた。微生物統御ＳＰＦのマウスを使用した。
【0118】
３．使用薬物及び試薬
細胞培養に必要な血清はＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．２６１４０－０７９、５６℃３０ｍｉｎ非働化済）を使用した。ＲＰＭＩ－１６４０（型番；Ａ１０４９１－０１）、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（型番；２５２００－０５６）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（型番；１５１４０－１２２）、ＰＢＳ（型番；１４１９０－１４４）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より、イソフルラン吸入麻酔液はマイラン製薬株式会社より購入し、使用した。
細胞培養に必要な血清はＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．２６１４０－０７９、５６℃３０ｍｉｎ非働化済）を使用した。ＲＰＭＩ－１６４０（型番；Ａ１０４９１－０１）、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（型番；２５２００－０５６）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（型番；１５１４０－１２２）、ＰＢＳ（型番；１４１９０－１４４）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より、イソフルラン吸入麻酔液はマイラン製薬株式会社より購入し、使用した。
【0119】
Ｂ．実験方法
１．群構成
２１６匹に癌細胞移植を行い、移植日をＤａｙ０としてＤａｙ８以降、下記の群構成（計１３０匹）で実施した。ＰＢＳあるいはαＰＤ－１を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）し、ＳａｌｉｎｅあるいはＤｏｘは静脈内投与（ｉ．ｖ．）あるいは腫瘍内投与（ｉ．ｔ．）した。投与はＤａｙ８、１１および１４の計３回実施した。
１．群構成
２１６匹に癌細胞移植を行い、移植日をＤａｙ０としてＤａｙ８以降、下記の群構成（計１３０匹）で実施した。ＰＢＳあるいはαＰＤ－１を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）し、ＳａｌｉｎｅあるいはＤｏｘは静脈内投与（ｉ．ｖ．）あるいは腫瘍内投与（ｉ．ｔ．）した。投与はＤａｙ８、１１および１４の計３回実施した。
【0120】
【数1】
【0121】
２．細胞培養
凍結細胞（ＣＴ２６．ＷＴ，ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２６３８）を約３７℃の温浴中で融解し、３７℃に加温した培養液（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＲＰＭＩ－１６４０）に入れた。その後、ＫＵＢＯＴＡ テーブルトップ冷却遠心機２８１０（ＳＮシャープＪ９０１２４－Ａ０００）を用いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、室温）した。上清を捨て、培養液を加えピペッティングでよく細胞を懸濁した。培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度の環境条件下で培養した。継代は７０～９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で行った。培養フラスコから培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離した。培養液を加え遠心操作にて上清を捨て、細胞を培養液にて適宜希釈を行い培養した。細胞は必要細胞数に達するように調節して継代培養を行い、必要細胞数に達した後に移植に用いた。
凍結細胞（ＣＴ２６．ＷＴ，ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－２６３８）を約３７℃の温浴中で融解し、３７℃に加温した培養液（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＲＰＭＩ－１６４０）に入れた。その後、ＫＵＢＯＴＡ テーブルトップ冷却遠心機２８１０（ＳＮシャープＪ９０１２４－Ａ０００）を用いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、室温）した。上清を捨て、培養液を加えピペッティングでよく細胞を懸濁した。培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度の環境条件下で培養した。継代は７０～９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で行った。培養フラスコから培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離した。培養液を加え遠心操作にて上清を捨て、細胞を培養液にて適宜希釈を行い培養した。細胞は必要細胞数に達するように調節して継代培養を行い、必要細胞数に達した後に移植に用いた。
【0122】
３．癌細胞移植
培養した細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡで剥離した。前述の遠心機を用いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去後、ＰＢＳで再懸濁した。トリパンブルー色素排除法により懸濁液中の生細胞数を算出した。その値をもとに冷蔵したＰＢＳで希釈し、最終細胞懸濁液（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。調製した最終細胞懸濁液は移植直前まで氷上で保存した。体重を測定した動物（７週齢）２１６匹にイソフルラン麻酔下（導入時：２．０－２．５％，維持：１．５－２．０％，キャリアガス：室内空気）で、調製したＣＴ２６．ＷＴ細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／ｈｅａｄ）を２３Ｇ×１’’の注射針（テルモ注射針、ＮＮ－２３２５Ｒ）を装着したツベルクリン用１ｍＬシリンジ（テルモシリンジ，ＳＳ－０１Ｔ）で右背部皮下に移植した。
培養した細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡで剥離した。前述の遠心機を用いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去後、ＰＢＳで再懸濁した。トリパンブルー色素排除法により懸濁液中の生細胞数を算出した。その値をもとに冷蔵したＰＢＳで希釈し、最終細胞懸濁液（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。調製した最終細胞懸濁液は移植直前まで氷上で保存した。体重を測定した動物（７週齢）２１６匹にイソフルラン麻酔下（導入時：２．０－２．５％，維持：１．５－２．０％，キャリアガス：室内空気）で、調製したＣＴ２６．ＷＴ細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／ｈｅａｄ）を２３Ｇ×１’’の注射針（テルモ注射針、ＮＮ－２３２５Ｒ）を装着したツベルクリン用１ｍＬシリンジ（テルモシリンジ，ＳＳ－０１Ｔ）で右背部皮下に移植した。
【0123】
４．群分け
移植日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ８の腫瘍体積が約４１ｍｍ３から約１４５ｍｍ３の動物を選抜し、「Ｂ．１．」に記載の群構成に各群の腫瘍体積の平均値が均一になるように群分けを行った。群分け時、腫瘍体積の小さすぎるもの、大きすぎるもの、腫瘍が２つに分かれているもの、あるいは腫瘍の形が扁平な個体は群分け除外動物とした。
移植日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ８の腫瘍体積が約４１ｍｍ３から約１４５ｍｍ３の動物を選抜し、「Ｂ．１．」に記載の群構成に各群の腫瘍体積の平均値が均一になるように群分けを行った。群分け時、腫瘍体積の小さすぎるもの、大きすぎるもの、腫瘍が２つに分かれているもの、あるいは腫瘍の形が扁平な個体は群分け除外動物とした。
【0124】
５．腫瘍径測定
Ｄａｙ８（群分け日）よりＤａｙ２６（薬剤投与開始１８日後）まで２日おきに腫瘍の短径および長径を測定し、下記の式から腫瘍体積を求めた。
Ｄａｙ８（群分け日）よりＤａｙ２６（薬剤投与開始１８日後）まで２日おきに腫瘍の短径および長径を測定し、下記の式から腫瘍体積を求めた。
【0125】
腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×Ｌ×Ｗ×Ｗ
Ｌ：腫瘍長径（ｍｍ），Ｗ：腫瘍短径（ｍｍ）。
Ｌ：腫瘍長径（ｍｍ），Ｗ：腫瘍短径（ｍｍ）。
【0126】
６．被験物質の投与
ＰＢＳあるいはαＰＤ－１は２００μＬ／ｈｅａｄにて腹腔内投与し、投与残余液は廃棄した。腹腔内投与には、２６Ｇ×１／２’’の注射針（テルモ注射針，ＮＮ－２６１３Ｓ）を装着したツベルクリン用１ｍＬシリンジ（テルモシリンジ，ＳＳ－０１Ｔ）を使用した。ＳａｌｉｎｅあるいはＤｏｘは尾静脈内投与または腫瘍内投与した。尾静脈内投与では直近の体重値を基に５ｍＬ／ｋｇで投与し、腫瘍内投与では、体重を２０ｇと仮定し２０μＬ／ｓｉｔｅを投与した。尾静脈内投与には針植え込み式シリンジ（２７Ｇ×１／２’’、ＦＮシリンジ、ＳＳ－０１０Ｆ２７１３）を使用し、腫瘍内投与には針植え込み式シリンジ（２９Ｇ×１／２’’、ＦＮシリンジ、ＳＳ－０１０Ｆ２９１３）を使用した。いずれのＶｅｈｉｃｌｅあるいは被験物質とも投与はＤａｙ８、１１及び１４の計３回実施した。また、５，７，９，１１，１３群においては、αＰＤ－１の投与はＤｏｘ投与後１時間以上空けた後に実施した。
ＰＢＳあるいはαＰＤ－１は２００μＬ／ｈｅａｄにて腹腔内投与し、投与残余液は廃棄した。腹腔内投与には、２６Ｇ×１／２’’の注射針（テルモ注射針，ＮＮ－２６１３Ｓ）を装着したツベルクリン用１ｍＬシリンジ（テルモシリンジ，ＳＳ－０１Ｔ）を使用した。ＳａｌｉｎｅあるいはＤｏｘは尾静脈内投与または腫瘍内投与した。尾静脈内投与では直近の体重値を基に５ｍＬ／ｋｇで投与し、腫瘍内投与では、体重を２０ｇと仮定し２０μＬ／ｓｉｔｅを投与した。尾静脈内投与には針植え込み式シリンジ（２７Ｇ×１／２’’、ＦＮシリンジ、ＳＳ－０１０Ｆ２７１３）を使用し、腫瘍内投与には針植え込み式シリンジ（２９Ｇ×１／２’’、ＦＮシリンジ、ＳＳ－０１０Ｆ２９１３）を使用した。いずれのＶｅｈｉｃｌｅあるいは被験物質とも投与はＤａｙ８、１１及び１４の計３回実施した。また、５，７，９，１１，１３群においては、αＰＤ－１の投与はＤｏｘ投与後１時間以上空けた後に実施した。
【0127】
７．一般状態の観察及び腫瘍表面の状態観察
一般状態は動物導入日から最終腫瘍径測定日まで１日１回、腫瘍表面の状態は移植翌日（Ｄａｙ１）から最終腫瘍径測定日（Ｄａｙ２６）まで１日１回観察した。
一般状態は動物導入日から最終腫瘍径測定日まで１日１回、腫瘍表面の状態は移植翌日（Ｄａｙ１）から最終腫瘍径測定日（Ｄａｙ２６）まで１日１回観察した。
【0128】
８．データ解析
統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ （Ｖｅｒｓｉｏｎ８．３．０，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬＬＣ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を用いて、グラフ化および統計解析を行った。
統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ （Ｖｅｒｓｉｏｎ８．３．０，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬＬＣ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を用いて、グラフ化および統計解析を行った。
【0129】
各群の腫瘍体積の結果はＤａｙ２０時点の値を採用し、１群「Ｓａｌｉｎｅ ｉ．ｖ．＋ＰＢＳ ｉ．ｐ．」のＮｏ．３および１３群「αＰＤ－１ １００ μｇ／ｈｅａｄ ｉ．ｐ．」のＮｏ．４の個体はＤａｙ１７時点で人道的エンドポイントに達したため除外し、各群の平均値および標準誤差（Ｍｅａｎ ± Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ）を示した。結果を下記表２および図１に示す。
【0130】
【表2】
【0131】
また、以下の群において、Ｄａｙ２０時点でのαＰＤ－１（ｉ．ｐ．）の併用効果の検証、Ｄｏｘの投与ルートによる薬効差の検証を目的とし、Ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ（ｖ．ｓ． ＊；Ｐ＜０．０５， ＊＊；Ｐ＜０．０１， ＊＊＊；Ｐ＜０．００１）を用いて有意差検定を実施した。
【0132】
結果は以下の通りであった。
【0133】
【表3】
【0134】
また、人道的エンドポイント（腫瘍体積が体重の１０％を超えた時点に達した時点）を死亡と仮定し、１、４、５、６、１１、１２、１３群について生存曲線を前述のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いて図示した。結果を図２に示す。
【0135】
以上の結果より、ドキソルビシンを腫瘍組織に直接投与した群では、高い抗腫瘍効果を有することが理解される。また、免疫チェックポイント阻害剤を併用することで、さらに高い抗腫瘍効果が得られることがわかる。特にドキソルビシン１ｍｇ／ｋｇと免疫チェックポイント阻害剤の併用投与においては、特に抗腫瘍効果が高く、単独では抗腫瘍効果が見られない投与量での免疫チェックポイント阻害剤投与で、抗がん剤の腫瘍内投与単独と比較して抗腫瘍効果の増強が見られたことから、抗がん剤および免疫チェックポイント阻害剤、各単独の相乗的効果となっている。免疫療法においては、作用機序の異なる薬剤を併用したとしても必ずしも抗腫瘍効果の増強が得られるとは限らない。このような事情を考慮すると、組み合わせによる相乗効果は驚くべき結果であると言える。
【0136】
［２．ラットＰＫ試験］
Ａ．実験方法
１．使用動物
動物種：ラット，系統：Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ），性別：雌，週齢：５週齢，微生物統御：ＳＰＦ
２．使用試薬
Ａ．実験方法
１．使用動物
動物種：ラット，系統：Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ），性別：雌，週齢：５週齢，微生物統御：ＳＰＦ
２．使用試薬
【0137】
【表4】
【0138】
【表5】
【0139】
５．群構成
群構成は腫瘍内投与群及び静脈内投与群の２群とした。
群構成は腫瘍内投与群及び静脈内投与群の２群とした。
【0140】
６．移植用細胞調製
１３７６２－ＭＡＴ－ＢＩＩＩ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６６６，ｌｏｔ．７０００３５３３）ストック細胞を液体窒素タンクから取り出し３７℃の温浴にて溶解した。溶解したら直ちに，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬの入ったチューブに移した。ＫＵＢＯＴＡテーブルトップ冷却遠心機５５００遠心（１０００ｒｐｍ，５分，室温）により上清を除去しＤＭＥＭ培地 ５ｍＬに再懸濁した。ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ添加済みのＴ７５フラスコに細胞懸濁液を加えＣＯ２インキュベータ（３７℃，５％ＣＯ２，以下同）に入れた。
１３７６２－ＭＡＴ－ＢＩＩＩ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６６６，ｌｏｔ．７０００３５３３）ストック細胞を液体窒素タンクから取り出し３７℃の温浴にて溶解した。溶解したら直ちに，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬの入ったチューブに移した。ＫＵＢＯＴＡテーブルトップ冷却遠心機５５００遠心（１０００ｒｐｍ，５分，室温）により上清を除去しＤＭＥＭ培地 ５ｍＬに再懸濁した。ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ添加済みのＴ７５フラスコに細胞懸濁液を加えＣＯ２インキュベータ（３７℃，５％ＣＯ２，以下同）に入れた。
【0141】
３日後、Ｔ７５フラスコより培地とともに細胞を５０ｍＬチューブに回収し、ＤＭＥＭ培地約１０ｍＬを用いて残りの細胞を５０ｍＬチューブに回収した。前述の遠心機を用いて遠心後（１０００ｒｐｍ，５分，室温）、上清を除去した。ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え再懸濁し血球計算盤を用いて計測した結果、約２．３×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を得た。細胞数は１０ｍＬ ＤＭＥＭ培地を入れたＴ７５フラスコ１枚に１ｍＬ加えＣＯ２インキュベータに入れた。翌日、Ｔ７５フラスコから培地とともに回収した。全量約３５ｍＬのうち２ｍＬをとり、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加えたＴ７５フラスコ１枚に移した。
【0142】
４日後、１枚のＴ７５フラスコより培地とともに細胞を回収した。さらにＤＭＥＭ培地約５ｍＬをＴ７５フラスコに加え残りの細胞を回収した（２回）。前述の遠心機を用いて遠心後（１０００ｒｐｍ，５分，室温）、上清を除去しＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え再懸濁し約３．７×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を得た。このうち約１ｍＬずつをＴ７５フラスコ（ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ入り）２枚に加えＣＯ２インキュベータに入れた。
【0143】
３日後、２枚のＴ７５フラスコより培地とともに細胞を回収した。さらにＤＭＥＭ培地約５ｍＬを各Ｔ７５フラスコに加え残りの細胞を回収した（２回）。前述の遠心機を用いて遠心後（１０００ｒｐｍ，５分，室温）、上清を除去しＤＭＥＭ培地２０ｍＬを加え再懸濁し約３．３×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を得た。このうち約０．６ｍＬずつをＴ７５フラスコ（ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ入り）１５枚に加えＣＯ２インキュベータに入れた。
【0144】
３日後に１５枚のＴ７５フラスコより培地とともに細胞を回収した。さらにＤＭＥＭ培地約５ｍＬを各Ｔ７５フラスコに加え残りの細胞を回収した（２回）。前述の遠心機を用いて遠心後（１０００ｒｐｍ，５分，室温）上清を除去しＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え再懸濁し約３．１×１０７個／ｍＬの細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液８ｍＬをとり前述の遠心機を用いて遠心後（１０００ｒｐｍ，５分，室温）、上清を除去しＰＢＳ６ｍＬを加え再懸濁し約４×１０７個／ｍＬの細胞懸濁液を得た。
【0145】
８．細胞移植
側腹部皮膚をつまみ、１３７６２－ＭＡＴ－ＢＩＩＩ細胞を一匹につき一箇所、一箇所あたり約４×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ 皮下移植した。
側腹部皮膚をつまみ、１３７６２－ＭＡＴ－ＢＩＩＩ細胞を一匹につき一箇所、一箇所あたり約４×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ 皮下移植した。
【0146】
９．腫瘍径計測・群分け
細胞移植後４、７、９日目に細胞移植時と同様の麻酔下で、側腹部に形成された腫瘍サイズをノギスを用いて、長径および短径を一個体につき一回計測した。腫瘍サイズについては長径×（短径）２÷２の式により算出した。９日目の腫瘍サイズをもとに大きい方から順に静脈内投与群及び腫瘍内投与群にそれぞれ２匹および３匹選定した。
細胞移植後４、７、９日目に細胞移植時と同様の麻酔下で、側腹部に形成された腫瘍サイズをノギスを用いて、長径および短径を一個体につき一回計測した。腫瘍サイズについては長径×（短径）２÷２の式により算出した。９日目の腫瘍サイズをもとに大きい方から順に静脈内投与群及び腫瘍内投与群にそれぞれ２匹および３匹選定した。
【0147】
１０．薬物投与
薬物調製：アドリアシン注用１０の２バイアルにそれぞれ生理食塩水１ｍＬを加え溶解し合わせて約２ｍＬのドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ／ｍＬ溶液を１．６ｍＬとり生理食塩水６．４ｍＬを加えドキソルビシン塩酸塩２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。体重を２００ｇと仮定して１ｍｇ／ｋｇの投与量となるように全個体についてドキソルビシン塩酸塩として０．２ｍｇ（薬液量０．１ｍＬ）投与した。
薬物調製：アドリアシン注用１０の２バイアルにそれぞれ生理食塩水１ｍＬを加え溶解し合わせて約２ｍＬのドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ドキソルビシン塩酸塩１０ｍｇ／ｍＬ溶液を１．６ｍＬとり生理食塩水６．４ｍＬを加えドキソルビシン塩酸塩２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。体重を２００ｇと仮定して１ｍｇ／ｋｇの投与量となるように全個体についてドキソルビシン塩酸塩として０．２ｍｇ（薬液量０．１ｍＬ）投与した。
【0148】
薬物投与：投与は、細胞移植時と同様の麻酔下に実施した。
【0149】
＜腫瘍内投与＞
（１）ドキソルビシン塩酸塩（２ｍｇ／ｍＬ）を充填したシリンジをシリンジポンプ（ＴＥ－３６１、テルモ株式会社）にセットし延長チューブを接続した。遠位端に三方活栓を接続しマノメータ及び延長チューブを接続した。
（２）延長チューブの遠位端に投与用注射針を接続した。投与前にライン内を薬液で満たした。
（３）腫瘍周辺に超音波プローブを当て、腫瘍の位置を確認後、注射針（２２Ｇ）を穿刺し腫瘍内中央付近に針先があることを確認した。
（４）投与ライン内の圧力をモニターしながら、薬液をシリンジポンプで０．１ｍＬ／分で１分間投与した。投与開始から３０分後まで穿刺したままライン内圧力のモニターを行った。投与開始３０分後に注射針を抜去した。
（５）採血は薬物投与前、薬物投与開始後５、１５、３０、６０分に頚静脈よりヘパリンナトリウム１μＬを添加した１ｍＬシリンジを用いて０．５ｍＬずつ採血した（ヘパリンナトリウム終濃度５単位／ｍＬ）。
（６）６０分後の採血終了後直ちに腹部大動脈を切開し安楽死処置をとった。
（７）腫瘍を取り出し重量を計測した。また，採取した血液は遠心分離し（１８００ｇ，１０分，４℃），血漿を約０．２ｍＬ採取した。腫瘍組織及び血漿は送付まで超低温フリーザーで凍結保存した。
（１）ドキソルビシン塩酸塩（２ｍｇ／ｍＬ）を充填したシリンジをシリンジポンプ（ＴＥ－３６１、テルモ株式会社）にセットし延長チューブを接続した。遠位端に三方活栓を接続しマノメータ及び延長チューブを接続した。
（２）延長チューブの遠位端に投与用注射針を接続した。投与前にライン内を薬液で満たした。
（３）腫瘍周辺に超音波プローブを当て、腫瘍の位置を確認後、注射針（２２Ｇ）を穿刺し腫瘍内中央付近に針先があることを確認した。
（４）投与ライン内の圧力をモニターしながら、薬液をシリンジポンプで０．１ｍＬ／分で１分間投与した。投与開始から３０分後まで穿刺したままライン内圧力のモニターを行った。投与開始３０分後に注射針を抜去した。
（５）採血は薬物投与前、薬物投与開始後５、１５、３０、６０分に頚静脈よりヘパリンナトリウム１μＬを添加した１ｍＬシリンジを用いて０．５ｍＬずつ採血した（ヘパリンナトリウム終濃度５単位／ｍＬ）。
（６）６０分後の採血終了後直ちに腹部大動脈を切開し安楽死処置をとった。
（７）腫瘍を取り出し重量を計測した。また，採取した血液は遠心分離し（１８００ｇ，１０分，４℃），血漿を約０．２ｍＬ採取した。腫瘍組織及び血漿は送付まで超低温フリーザーで凍結保存した。
【0150】
＜静脈内投与＞
（１）ドキソルビシン塩酸塩（２ｍｇ／ｍＬ）を充填したシリンジをシリンジポンプにセットし２７Ｇ翼状針を接続した。
（２）投与前にライン内を薬液で満たした。
（３）翼状針を尾静脈に穿刺し薬液をシリンジポンプで０．１ｍＬ／分で１分間投与した。
（１）ドキソルビシン塩酸塩（２ｍｇ／ｍＬ）を充填したシリンジをシリンジポンプにセットし２７Ｇ翼状針を接続した。
（２）投与前にライン内を薬液で満たした。
（３）翼状針を尾静脈に穿刺し薬液をシリンジポンプで０．１ｍＬ／分で１分間投与した。
【0151】
血漿採取、安楽死処置及びサンプル処理は腫瘍内投与時（５）、（６）及び（７）と同様に行った。
【0152】
１１．ドキソルビシン塩酸塩濃度測定
＜試薬＞
標準物質はＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（製品番号：Ｄ１５１５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いた。内標準物質はＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（製品番号：３０４５０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いた。
＜試薬＞
標準物質はＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（製品番号：Ｄ１５１５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いた。内標準物質はＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（製品番号：３０４５０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）を用いた。
【0153】
＜標準液の調製＞
標準原液はＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １．０７ｍｇ（ドキソルビシンとして１．００ｍｇ，補正係数：１．０７）を正確に秤量し，メタノールに溶解して１００μｇ／ｍＬとし、内標準原液はＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １．０ｍｇを正確に秤量し，メタノールに溶解して１００μｇ／ｍＬとした。標準溶液は標準原液をメタノールで適宜希釈して，１０．０～１００００ｎｇ／ｍＬに用時調製した。内標準溶液はメタノールで適宜希釈して２００ｎｇ／ｍＬに用時調製した。
標準原液はＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １．０７ｍｇ（ドキソルビシンとして１．００ｍｇ，補正係数：１．０７）を正確に秤量し，メタノールに溶解して１００μｇ／ｍＬとし、内標準原液はＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ １．０ｍｇを正確に秤量し，メタノールに溶解して１００μｇ／ｍＬとした。標準溶液は標準原液をメタノールで適宜希釈して，１０．０～１００００ｎｇ／ｍＬに用時調製した。内標準溶液はメタノールで適宜希釈して２００ｎｇ／ｍＬに用時調製した。
【0154】
＜前処理＞
血漿中ドキソルビシン濃度測定
測定試料は室温で融解して撹拌後、遠心分離（２０００×ｇ，４℃，５分間）した上清２０μＬをミクロテストチューブに採取して実験に使用した。メタノールで除タンパク処理を行い、遠心分離後に上清をガラス試験管に移し替え、窒素気流下で濃縮乾固した。残渣に０．１％ギ酸－アセトニトリル（７０：３０，ｖ／ｖ）を加えて再溶解し、実測試料を作製した。
血漿中ドキソルビシン濃度測定
測定試料は室温で融解して撹拌後、遠心分離（２０００×ｇ，４℃，５分間）した上清２０μＬをミクロテストチューブに採取して実験に使用した。メタノールで除タンパク処理を行い、遠心分離後に上清をガラス試験管に移し替え、窒素気流下で濃縮乾固した。残渣に０．１％ギ酸－アセトニトリル（７０：３０，ｖ／ｖ）を加えて再溶解し、実測試料を作製した。
【0155】
組織中ドキソルビシン濃度測定
ラット組織全重量に対して５倍量のメタノールを加えて破砕し、ホモジネートを調製した。使用時には組織ホモジネートを遠心分離（２０００×ｇ，４℃，５分間）した上清２０μＬをミクロテストチューブに採取して前処理に使用した。メタノールで除タンパク処理を行い、遠心分離後に上清をガラス試験管に移し替え、窒素気流下で濃縮乾固した。残渣に０．１％ギ酸－アセトニトリル（７０：３０，ｖ／ｖ）を加えて再溶解し、実測試料を作製した。
ラット組織全重量に対して５倍量のメタノールを加えて破砕し、ホモジネートを調製した。使用時には組織ホモジネートを遠心分離（２０００×ｇ，４℃，５分間）した上清２０μＬをミクロテストチューブに採取して前処理に使用した。メタノールで除タンパク処理を行い、遠心分離後に上清をガラス試験管に移し替え、窒素気流下で濃縮乾固した。残渣に０．１％ギ酸－アセトニトリル（７０：３０，ｖ／ｖ）を加えて再溶解し、実測試料を作製した。
【0156】
測定
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置にはＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）及びトリプル四重極型質量分析装置ＡＰＩ５０００（Ｓｃｉｅｘ）を用いた．データ処理ソフトはＡｎａｌｙｓｔ ｖｅｒ．１．５．１を使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定は以下の条件設定で実施した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置にはＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）及びトリプル四重極型質量分析装置ＡＰＩ５０００（Ｓｃｉｅｘ）を用いた．データ処理ソフトはＡｎａｌｙｓｔ ｖｅｒ．１．５．１を使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定は以下の条件設定で実施した。
【0157】
定量下限
血漿：１０．０ｎｇ／ｍＬ（定量下限未満は「＜１０．０」とする）
組織：６０．０ｎｇ／ｇ（定量下限未満は「＜６０．０」とする）
血漿：１０．０ｎｇ／ｍＬ（定量下限未満は「＜１０．０」とする）
組織：６０．０ｎｇ／ｇ（定量下限未満は「＜６０．０」とする）
【0158】
【表6】
【0159】
【表7】
【0160】
８．データ処理
データ処理にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を用いた。
データ処理にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を用いた。
【0161】
９．結果
【0162】
【表8】
【0163】
【表9】
【0164】
上記結果より、腫瘍内へのデバイスによる直接投与により、腫瘍内ドキソルビシン濃度が高いにもかかわらず、血漿中のドキソルビシン濃度が低いことがわかる。これにより、デバイスによる腫瘍内への直接投与は、高い抗腫瘍効果とともに全身性の副作用を低減できることが期待される。
【0165】
［３．フローサイトメトリーを用いたＣＴＬ活性化評価（マウス）］
Ａ．材料
１．細胞・動物実験
＜細胞＞
・ＣＴ２６．ＷＴ（ＡＴＣＣ）：Ｃａｔ． ＣＲＬ－２６３８， Ｌｏｔ． ７００１６７８８ ／ ＡＴＣＣ
＜動物＞
・ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ ｍｏｕｓｅ， ｆｅｍａｌｅ， ６ ｗｅｅｋｓ入荷， ９０匹：日本チャールス・リバー株式会社（使用開始は７ ｗｅｅｋｓ）。微生物統御ＳＰＦのマウスを使用した。
Ａ．材料
１．細胞・動物実験
＜細胞＞
・ＣＴ２６．ＷＴ（ＡＴＣＣ）：Ｃａｔ． ＣＲＬ－２６３８， Ｌｏｔ． ７００１６７８８ ／ ＡＴＣＣ
＜動物＞
・ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ ｍｏｕｓｅ， ｆｅｍａｌｅ， ６ ｗｅｅｋｓ入荷， ９０匹：日本チャールス・リバー株式会社（使用開始は７ ｗｅｅｋｓ）。微生物統御ＳＰＦのマウスを使用した。
【0166】
＜試薬＞
【0167】
【表10】
【0168】
【表11】
【0169】
Ｂ．実験方法
１．細胞・動物実験
１．１．細胞培養
１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＲＰＭＩを培地として調製した（以下、培地とする）。凍結ＣＴ２６．ＷＴ細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ２）を３７℃で融解し、室温に戻した培地に添加し、混合した。その後、フロア型冷却遠心機（Ｓ７００ＦＲ、久保田製作所）を用いて遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）し、上清を捨てた。そこへ、培地を加えピペッティングでよく細胞を懸濁した。培養フラスコに移し、３７℃、５％ ＣＯ２濃度の環境条件下で培養した。細胞培養の開始から、継代は３日後（Ｐａｓｓａｇｅ ３）、５日後（Ｐａｓｓａｇｅ ４）、７日後（Ｐａｓｓａｇｅ ５）に行った。培養フラスコから継代培地を除去し、洗浄後、Ｔｒｙｐｓｉｎで細胞を剥離し、培地を加えＴｒｙｐｓｉｎの活性を止め、適宜培地で希釈して分散し、細胞を増殖させた。なお、細胞のカウントにはトリパンブルー色素排除法およびＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを使用し、測定結果の生細胞数をもとに適宜希釈した。
１．細胞・動物実験
１．１．細胞培養
１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＲＰＭＩを培地として調製した（以下、培地とする）。凍結ＣＴ２６．ＷＴ細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ２）を３７℃で融解し、室温に戻した培地に添加し、混合した。その後、フロア型冷却遠心機（Ｓ７００ＦＲ、久保田製作所）を用いて遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）し、上清を捨てた。そこへ、培地を加えピペッティングでよく細胞を懸濁した。培養フラスコに移し、３７℃、５％ ＣＯ２濃度の環境条件下で培養した。細胞培養の開始から、継代は３日後（Ｐａｓｓａｇｅ ３）、５日後（Ｐａｓｓａｇｅ ４）、７日後（Ｐａｓｓａｇｅ ５）に行った。培養フラスコから継代培地を除去し、洗浄後、Ｔｒｙｐｓｉｎで細胞を剥離し、培地を加えＴｒｙｐｓｉｎの活性を止め、適宜培地で希釈して分散し、細胞を増殖させた。なお、細胞のカウントにはトリパンブルー色素排除法およびＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを使用し、測定結果の生細胞数をもとに適宜希釈した。
【0170】
１．２．細胞移植
継代培養した細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ５）を前述の遠心機を用いて遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）し、上清を除去後、培地で再懸濁し、継代の際の細胞カウント同様の方法で懸濁液中の生細胞数を算出した。その値をもとに細胞懸濁液を分取し、前述の遠心機を用いて遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）後、ＰＢＳに置換し、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度になるように細胞懸濁液を調製した。９０匹の動物にイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）で、移植部位（右下腹部）を毛刈りし、調製したＣＴ２６．ＷＴ細胞を２９Ｇ ＦＮシリンジで右側腹部（前肢と後肢の間）の皮下に移植した（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｍｏｕｓｅ）。移植日をＤａｙ０と定義した。
継代培養した細胞（Ｐａｓｓａｇｅ ５）を前述の遠心機を用いて遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）し、上清を除去後、培地で再懸濁し、継代の際の細胞カウント同様の方法で懸濁液中の生細胞数を算出した。その値をもとに細胞懸濁液を分取し、前述の遠心機を用いて遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）後、ＰＢＳに置換し、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度になるように細胞懸濁液を調製した。９０匹の動物にイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）で、移植部位（右下腹部）を毛刈りし、調製したＣＴ２６．ＷＴ細胞を２９Ｇ ＦＮシリンジで右側腹部（前肢と後肢の間）の皮下に移植した（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｍｏｕｓｅ）。移植日をＤａｙ０と定義した。
【0171】
１．３．腫瘍径測定
群分け日（Ｄａｙ８）の腫瘍短径および長径を測定し、下記の式から腫瘍体積を求めた。
群分け日（Ｄａｙ８）の腫瘍短径および長径を測定し、下記の式から腫瘍体積を求めた。
【0172】
腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×Ｌ×Ｗ×Ｗ
Ｌ：腫瘍長径（ｍｍ）、Ｗ：腫瘍短径（ｍｍ）
１．４．群分け
Ｄａｙ８の腫瘍体積をもとに群分けを実施した。この際、腫瘍が「いびつな形をしている個体」を除いた上で、腫瘍体積の最も小さいものから４２匹除外した。担癌した９０匹のうちの４８匹を以下の群構成に腫瘍体積の平均値が均一になるように群分けを実施した。
Ｌ：腫瘍長径（ｍｍ）、Ｗ：腫瘍短径（ｍｍ）
１．４．群分け
Ｄａｙ８の腫瘍体積をもとに群分けを実施した。この際、腫瘍が「いびつな形をしている個体」を除いた上で、腫瘍体積の最も小さいものから４２匹除外した。担癌した９０匹のうちの４８匹を以下の群構成に腫瘍体積の平均値が均一になるように群分けを実施した。
【0173】
【表12】
【0174】
１．５．被験物質投与液の調製
＜Ｄｏｘ投与液調製＞
Ｄｏｘ １０ｍｇ／ｍＬ：アドリアシン注用１０のバイアルにＳａｌｉｎｅ１．０ｍＬを注入し粉末を溶解し、ストック溶液とした。
＜Ｄｏｘ投与液調製＞
Ｄｏｘ １０ｍｇ／ｍＬ：アドリアシン注用１０のバイアルにＳａｌｉｎｅ１．０ｍＬを注入し粉末を溶解し、ストック溶液とした。
【0175】
＜ｉ．ｔ．（腫瘍内投与）投与液＞
群分け時の２群および３群の平均体重（２１ｇ）をもとに以下の表１３に従って前述の１０ｇ／ｍＬストック溶液を９．５倍希釈し、Ｄｏｘ １ｍｇ／ｋｇのｉ．ｔ．投与液とした。
群分け時の２群および３群の平均体重（２１ｇ）をもとに以下の表１３に従って前述の１０ｇ／ｍＬストック溶液を９．５倍希釈し、Ｄｏｘ １ｍｇ／ｋｇのｉ．ｔ．投与液とした。
【0176】
【表13】
【0177】
＜ｉ．ｖ．（尾静脈内投与）投与液＞
以下の表１４に従って前述の１０ｍｇ／ｍＬストック溶液を１００倍希釈し、Ｄｏｘ １ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与液とした。
以下の表１４に従って前述の１０ｍｇ／ｍＬストック溶液を１００倍希釈し、Ｄｏｘ １ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与液とした。
【0178】
【表14】
【0179】
＜αＰＤ－１抗体（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ）投与液調製＞
１００μｇ／２００μＬ／ｈｅａｄになるようにαＰＤ－１ストック溶液（７．２４ｍｇ／ｍＬ）を０．５０ｍＬとり６．７４ｍＬのＰＢＳに加え混和し、αＰＤ－１抗体投与液（０．５ｍｇ／ｍＬ）とした。
１００μｇ／２００μＬ／ｈｅａｄになるようにαＰＤ－１ストック溶液（７．２４ｍｇ／ｍＬ）を０．５０ｍＬとり６．７４ｍＬのＰＢＳに加え混和し、αＰＤ－１抗体投与液（０．５ｍｇ／ｍＬ）とした。
【0180】
１．６．投与
群分け当日のＤａｙ８に前述の群構成に従い、１、２、３、６群はイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）でＳａｌｉｎｅまたはＤｏｘを２９Ｇ ＦＮシリンジを用いて２０μＬ／ｈｅａｄで腫瘍内投与（ｉ．ｔ．）した。４、５群は覚醒下でＤｏｘを各個体の体重をもとに１０ｍＬ／ｋｇで投与量を算出し、２７Ｇ注射針および１ｍＬテルモシリンジを用いて尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。
群分け当日のＤａｙ８に前述の群構成に従い、１、２、３、６群はイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）でＳａｌｉｎｅまたはＤｏｘを２９Ｇ ＦＮシリンジを用いて２０μＬ／ｈｅａｄで腫瘍内投与（ｉ．ｔ．）した。４、５群は覚醒下でＤｏｘを各個体の体重をもとに１０ｍＬ／ｋｇで投与量を算出し、２７Ｇ注射針および１ｍＬテルモシリンジを用いて尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。
【0181】
ＳａｌｉｎｅおよびＤｏｘ投与後にＰＢＳまたはαＰＤ－１抗体を覚醒下でトップ二段針および１ｍＬテルモシリンジを用いて２００μＬ／ｈｅａｄで腹腔内投与した。
【0182】
１．７．腫瘍近傍のリンパ節の採材
薬剤投与３日後のＤａｙ１１にイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）で放血により安楽死させ、皮下腫瘍近傍の鼠経リンパ節および腋窩リンパ節の２カ所を採材した。
薬剤投与３日後のＤａｙ１１にイソフルラン麻酔下（導入麻酔：２．０－３．０％、維持麻酔：２．０％）で放血により安楽死させ、皮下腫瘍近傍の鼠経リンパ節および腋窩リンパ節の２カ所を採材した。
【0183】
２．フローサイトメトリー
２．１．リンパ節からの細胞単離
採材したリンパ節をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ培地５００μＬを添加したチューブに入れ、バイオマッシャーＩＩを用いてすり潰した。すり潰したリンパ節をナイロンメッシュに通し、２５ｍＬチューブに回収した。ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ培地１ｍＬで再度バイオマッシャーＩＩ内のチューブを共洗し、ナイロンメッシュに通し、２５ｍＬチューブに回収した。回収したチューブを４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐした。血液の混入を認めたサンプルは、溶血剤（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬを添加し、懸濁させた後、１～２ｍｉｎ室温で静置した（尚、血液の混入のないサンプルはこの操作は行わなかった）。ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ９ｍＬを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐした。溶血残りがないことを確認し、ＰＢＥ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＢＳＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＝２０：１）を１５ｍＬ添加し、混和した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐし、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ２ｍＬ添加した。このサンプルをセルストレーナーに通し、２５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞液から３０μＬを１．５ｍＬチューブに分注し、１：１でトリパンブルーと混ぜ合わせ、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを用いて細胞数をカウントした。カウントした細胞数をもとに、５ｍＬラウンドチューブに３．０×１０６ｃｅｌｌｓの細胞懸濁液を分注した（全量で３．０×１０６ ｃｅｌｌｓに満たないものは全量使用した）。
２．１．リンパ節からの細胞単離
採材したリンパ節をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ培地５００μＬを添加したチューブに入れ、バイオマッシャーＩＩを用いてすり潰した。すり潰したリンパ節をナイロンメッシュに通し、２５ｍＬチューブに回収した。ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ培地１ｍＬで再度バイオマッシャーＩＩ内のチューブを共洗し、ナイロンメッシュに通し、２５ｍＬチューブに回収した。回収したチューブを４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐした。血液の混入を認めたサンプルは、溶血剤（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬを添加し、懸濁させた後、１～２ｍｉｎ室温で静置した（尚、血液の混入のないサンプルはこの操作は行わなかった）。ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ９ｍＬを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐした。溶血残りがないことを確認し、ＰＢＥ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＢＳＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＝２０：１）を１５ｍＬ添加し、混和した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、タッピングで細胞をほぐし、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ２ｍＬ添加した。このサンプルをセルストレーナーに通し、２５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞液から３０μＬを１．５ｍＬチューブに分注し、１：１でトリパンブルーと混ぜ合わせ、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを用いて細胞数をカウントした。カウントした細胞数をもとに、５ｍＬラウンドチューブに３．０×１０６ｃｅｌｌｓの細胞懸濁液を分注した（全量で３．０×１０６ ｃｅｌｌｓに満たないものは全量使用した）。
【0184】
２．２．リンパ節の単離細胞染色（死細胞染色・ブロッキング・テトラマー染色・抗体染色）
＜死細胞染色＞
細胞を添加したラウンドチューブにＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを１ｍＬ添加し、混和した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、ＰＢＳ １ｍＬ添加した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、希釈した死細胞染色液（１００倍希釈したＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）を１００μＬ添加し、軽くボルテックスで混和し、室温，遮光，２０ｍｉｎ静置した。静置後、２ｍＬのＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐした。
＜死細胞染色＞
細胞を添加したラウンドチューブにＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを１ｍＬ添加し、混和した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、ＰＢＳ １ｍＬ添加した。４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、希釈した死細胞染色液（１００倍希釈したＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）を１００μＬ添加し、軽くボルテックスで混和し、室温，遮光，２０ｍｉｎ静置した。静置後、２ｍＬのＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐした。
【0185】
＜ブロッキング＞
死細胞染色および洗浄後のラウンドチューブにブロッキング液（３倍希釈したＣｌｅａｒ Ｂａｃｋ）を２５μＬずつ添加し、緩やかにボルテックスし、混和した。混和後、４℃，遮光，５ｍｉｎ静置した。
死細胞染色および洗浄後のラウンドチューブにブロッキング液（３倍希釈したＣｌｅａｒ Ｂａｃｋ）を２５μＬずつ添加し、緩やかにボルテックスし、混和した。混和後、４℃，遮光，５ｍｉｎ静置した。
【0186】
＜テトラマー染色＞
ＡＨ－１テトラマー染色用カクテル（１本あたりＡＰＣ－ＡＨ－１ｔｅｔｒａｍｅｒ；５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；２０μＬ）を調製し、ブロッキング反応後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。尚、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｌｌ）およびＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＨ－１ｔｅｔｒａｍｅｒ，ＣＤ６９）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＡＰＣ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｔｅｔｒａｍｅｒ；５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；２０μＬ）を調製し、ブロッキング反応後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。テトラマー添加後に軽くボルテックスし、４℃，遮光，４０ｍｉｎ静置した。
ＡＨ－１テトラマー染色用カクテル（１本あたりＡＰＣ－ＡＨ－１ｔｅｔｒａｍｅｒ；５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；２０μＬ）を調製し、ブロッキング反応後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。尚、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｌｌ）およびＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＨ－１ｔｅｔｒａｍｅｒ，ＣＤ６９）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＡＰＣ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｔｅｔｒａｍｅｒ；５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；２０μＬ）を調製し、ブロッキング反応後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。テトラマー添加後に軽くボルテックスし、４℃，遮光，４０ｍｉｎ静置した。
【0187】
＜抗体染色＞
抗体染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－ＣＤ４５抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－ＣＤ３抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ４抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－ＣＤ８抗体；１０μＬ，ＰＥ－ＣＤ６９抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を調製し、テトラマー染色後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。尚、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｌｌ）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；１０μＬ，ＰＥ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を添加し、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ，ＣＤ６９）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－ＣＤ４５抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－ＣＤ３抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ４抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－ＣＤ８抗体；１０μＬ，ＰＥ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を添加した。抗体染色用カクテル添加後に軽くボルテックスし、４℃，遮光，２０ｍｉｎ静置した。
抗体染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－ＣＤ４５抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－ＣＤ３抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ４抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－ＣＤ８抗体；１０μＬ，ＰＥ－ＣＤ６９抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を調製し、テトラマー染色後のラウンドチューブに２５μＬ添加した。尚、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｌｌ）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；１０μＬ，ＰＥ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を添加し、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ，ＣＤ６９）にはＩｓｏｔｙｐｅテトラマー染色用カクテル（１本あたり ＰｅｒＣＰ－ＣＤ４５抗体；２．５μＬ，ＰＥ－Ｃｙ７－ＣＤ３抗体；２．５μＬ，ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ４抗体；２．５μＬ，ＦＩＴＣ－ＣＤ８抗体；１０μＬ，ＰＥ－Ｉｓｏｔｙｐｅ抗体；２．５μＬ，Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ；５μＬ）を添加した。抗体染色用カクテル添加後に軽くボルテックスし、４℃，遮光，２０ｍｉｎ静置した。
【0188】
抗体染色後のラウンドチューブに２ｍＬのＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後のラウンドチューブに４％のパラホルムアルデヒド溶液を１００μＬずつ添加し、４℃，遮光，１５ｍｉｎ静置した。反応後、２ｍＬのＰＥＢ ｂｕｆｆｅｒを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐした。そこへ１ｍＬのＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、４００×ｇ，４℃，５ｍｉｎで遠心後、上清をデカントし、ボルテックスで軽く細胞をほぐし、３５０μＬのＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒを添加した。このサンプルをセルストレーナー（３５μｍ）付き５ｍＬチューブに通し、測定用サンプルとした。４℃で静置し、翌日、測定に用いた。
【0189】
２．３．フローサイトメトリーを用いた測定
フローサイトメトリーＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（ベックマン・コールター社製）にて、測定を実施した。その際の取り込み細胞数はＬｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ２００，０００個（２×１０５ｃｅｌｌｓ）とし、可能な限り取り込んだ。測定および解析にはＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ 搭載のＣｙｔｏＥｘｐａｒｔソフトウェア Ｖｅｒｓｉｏｎ２．４（ベックマン・コールター社製）を使用した。
フローサイトメトリーＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（ベックマン・コールター社製）にて、測定を実施した。その際の取り込み細胞数はＬｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ２００，０００個（２×１０５ｃｅｌｌｓ）とし、可能な限り取り込んだ。測定および解析にはＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ 搭載のＣｙｔｏＥｘｐａｒｔソフトウェア Ｖｅｒｓｉｏｎ２．４（ベックマン・コールター社製）を使用した。
【0190】
ゲーティングは以下の通りで実施した（図３）。
（１）Ａｌｌ ＥｖｅｎｔｓからＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａプロットを展開し、細胞集団を選択した。
（２）細胞集団からＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ／ＦＳＣ－Ａプロットを展開し、死細胞集団（Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ陽性細胞）を取り除いたＬｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓを選択した。
（３）Ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓからＣＤ４５／ＳＳＣ－Ａを展開し、ＣＤ４５＋集団を選択した。
（４）ＣＤ４５＋集団からＣＤ３／ＳＳＣ－Ａを展開し、ＣＤ３＋集団を選択した。
（５）ＣＤ３＋細胞集団からＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａを展開し、ダブレットを取り除き、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ １集団を選択した。
（６）Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ １集団からＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ａを展開し、ダブレットを取り除き、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ２集団を選択した。
（７）Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ２集団からＣＤ８／ＣＤ４を展開し、ＣＤ８＋細胞をＴｏｔａｌ． ＣＴＬ、ＣＤ４＋細胞をＨｅｌｐｅｒ Ｔ細胞とした。
（８）Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬからＣＤ８／ＣＤ６９で展開し、ＣＤ６９＋細胞をＣＤ６９＋ＣＴＬ（活性化ＣＴＬ）とした。
（９）Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬからＣＤ８／ＡＨ－１ Ｔｅｔｒａｍｅｒで展開し、ＡＨ－１ Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋細胞をＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ（癌抗原特異的ＣＴＬ）とした。
（１）Ａｌｌ ＥｖｅｎｔｓからＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａプロットを展開し、細胞集団を選択した。
（２）細胞集団からＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ／ＦＳＣ－Ａプロットを展開し、死細胞集団（Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ陽性細胞）を取り除いたＬｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓを選択した。
（３）Ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓからＣＤ４５／ＳＳＣ－Ａを展開し、ＣＤ４５＋集団を選択した。
（４）ＣＤ４５＋集団からＣＤ３／ＳＳＣ－Ａを展開し、ＣＤ３＋集団を選択した。
（５）ＣＤ３＋細胞集団からＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａを展開し、ダブレットを取り除き、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ １集団を選択した。
（６）Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ １集団からＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ａを展開し、ダブレットを取り除き、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ２集団を選択した。
（７）Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ２集団からＣＤ８／ＣＤ４を展開し、ＣＤ８＋細胞をＴｏｔａｌ． ＣＴＬ、ＣＤ４＋細胞をＨｅｌｐｅｒ Ｔ細胞とした。
（８）Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬからＣＤ８／ＣＤ６９で展開し、ＣＤ６９＋細胞をＣＤ６９＋ＣＴＬ（活性化ＣＴＬ）とした。
（９）Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬからＣＤ８／ＡＨ－１ Ｔｅｔｒａｍｅｒで展開し、ＡＨ－１ Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋細胞をＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ（癌抗原特異的ＣＴＬ）とした。
【0191】
ＣＤ６９＋細胞とＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬは細胞数が少ないことからＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ， ＣＤ６９）のデータより陰性領域と陽性領域の境界を決定した。
【0192】
２．４．各細胞群の細胞数の算出
ゲーティングした以下の各細胞群の割合（％）を個体ごとに以下の計算式で算出した。
Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ｃｅｌｌ数×１００
ＣＤ６９＋ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数×１００
ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ＋ ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数×１００
また、組織中の各細胞群の細胞数を、２．１の細胞単離後のＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを用いて細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を算出した値と、フローサイトメトリー測定時の各細胞群の割合（％）から細胞群の細胞数（＃）の結果を用いて以下の計算式で算出した。
組織中の全細胞数（＃）＝細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）×細胞含むＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ全量（ｍＬ）＊
生細胞数（＃）＝全細胞数（＃）×生細胞率（％）／１００
ＣＤ４５＋細胞数（＃）＝生細胞数（＃）×ＣＤ４５＋細胞率（％）／１００
ＣＤ３＋細胞（ダブレット除去前）数（＃）＝ＣＤ４５＋細胞数（＃）×ＣＤ３＋細胞率（％）／１００
ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）数（＃）＝ＣＤ３＋細胞（ダブレット除去前）数（＃）×ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）率（％）／１００
Ｔ ｃｅｌｌ数（＃）＝ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）数（＃）×ＣＤ３＋細胞（ＳＳＣダブレット除去）率（％）／１００
Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｃｅｌｌ数（＃）×ＣＤ８＋細胞率（％）／１００
ＣＤ６９＋ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）×ＣＤ６９＋細胞率（％）／１００
ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）×ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ＋細胞率（％）／１００
＊「細胞を含むＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ量（ｍＬ）」は、細胞数カウント前の遠心・上清デカント後にセルストレーナーに通したＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒの添加量として計算した（リンパ節：２ｍＬ）。
ゲーティングした以下の各細胞群の割合（％）を個体ごとに以下の計算式で算出した。
Ｔｏｔａｌ． ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ｃｅｌｌ数×１００
ＣＤ６９＋ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数×１００
ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ（％）：ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ＋ ｃｅｌｌ数（＃）／ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｃｅｌｌ数×１００
また、組織中の各細胞群の細胞数を、２．１の細胞単離後のＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩを用いて細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を算出した値と、フローサイトメトリー測定時の各細胞群の割合（％）から細胞群の細胞数（＃）の結果を用いて以下の計算式で算出した。
組織中の全細胞数（＃）＝細胞濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）×細胞含むＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ全量（ｍＬ）＊
生細胞数（＃）＝全細胞数（＃）×生細胞率（％）／１００
ＣＤ４５＋細胞数（＃）＝生細胞数（＃）×ＣＤ４５＋細胞率（％）／１００
ＣＤ３＋細胞（ダブレット除去前）数（＃）＝ＣＤ４５＋細胞数（＃）×ＣＤ３＋細胞率（％）／１００
ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）数（＃）＝ＣＤ３＋細胞（ダブレット除去前）数（＃）×ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）率（％）／１００
Ｔ ｃｅｌｌ数（＃）＝ＣＤ３＋細胞（ＦＳＣダブレット除去）数（＃）×ＣＤ３＋細胞（ＳＳＣダブレット除去）率（％）／１００
Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｃｅｌｌ数（＃）×ＣＤ８＋細胞率（％）／１００
ＣＤ６９＋ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）×ＣＤ６９＋細胞率（％）／１００
ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数（＃）＝Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数（＃）×ＡＨ－１ ｔｅｔｒａｍｅｒ＋細胞率（％）／１００
＊「細胞を含むＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ量（ｍＬ）」は、細胞数カウント前の遠心・上清デカント後にセルストレーナーに通したＳｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒの添加量として計算した（リンパ節：２ｍＬ）。
【0193】
２．４．グラフ化および統計解析
各群の細胞数を解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ８）を用いてグラフ化し、細胞数について各群の平均値および標準誤差（Ｍｅａｎ±Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ）を示した。各細胞群でＶｅｈｉｃｌｅ群に対して抗腫瘍免疫の活性化が認められるかを検証するため、Ｖｅｈｉｃｌｅ群を対照群とし、すべての群で細胞数の増加率を算出した。結果を表１５に示す。
各群の細胞数を解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ８）を用いてグラフ化し、細胞数について各群の平均値および標準誤差（Ｍｅａｎ±Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ）を示した。各細胞群でＶｅｈｉｃｌｅ群に対して抗腫瘍免疫の活性化が認められるかを検証するため、Ｖｅｈｉｃｌｅ群を対照群とし、すべての群で細胞数の増加率を算出した。結果を表１５に示す。
【0194】
２．５．結果
各群の細胞群の細胞数について各群の平均値および標準誤差を図４～図６に示す。図４は、Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数、図５は、ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数、図６は、ＣＤ６９＋ＣＴＬ数を示す。ここで、Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数は、ＣＴＬの総数を、ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数は、腫瘍を特異的に認識するＣＴＬを、ＣＤ６９＋ＣＴＬ数は、活性化状態にあるＣＴＬを、意味する。
各群の細胞群の細胞数について各群の平均値および標準誤差を図４～図６に示す。図４は、Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数、図５は、ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数、図６は、ＣＤ６９＋ＣＴＬ数を示す。ここで、Ｔｏｔａｌ．ＣＴＬ数は、ＣＴＬの総数を、ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ数は、腫瘍を特異的に認識するＣＴＬを、ＣＤ６９＋ＣＴＬ数は、活性化状態にあるＣＴＬを、意味する。
【0195】
また、各群におけるＴｏｔａｌ．ＣＴＬ、ＡＨ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ、ＣＤ６９＋ ＣＴＬのコントロールに対する増加率を下記表１５に示す。
【0196】
【表15-1】
【0197】
【表15-2】
【0198】
【表15-3】
【0199】
ドキソルビシンを直接腫瘍組織に投与した系では、静脈投与するより強く抗腫瘍免疫が誘導されていることが理解される。さらに、免疫チェックポイント阻害剤を併用した場合に、抗腫瘍免疫誘導の増強が起こることがわかる。静脈投与においては、併用効果が全くみられないことから、このような併用効果は必ずしも予測可能ではない。免疫チェックポイント阻害剤の併用による抗腫瘍免疫誘導の増強は、上記記述したような抗腫瘍効果の相乗効果に寄与しているものと推察される。
【0200】
本実施例において投与デバイスは、投与デバイスの欄で記載した各投与デバイスを用いることができる。
【符号の説明】
【0201】
１ 治療デバイスキット、
１００ 投与デバイス、
１２０、１２０ａ 注入針、
１３０ 外筒、
１４０ 検出部、
１５０ 報知部。
１００ 投与デバイス、
１２０、１２０ａ 注入針、
１３０ 外筒、
１４０ 検出部、
１５０ 報知部。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
