特開 2024-160237 癌および転移を処置するための低エネルギーの免疫刺激

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024160237

(43)【公開日】2024-11-13

(54)【発明の名称】癌および転移を処置するための低エネルギーの免疫刺激

(51)【国際特許分類】

   A61N 7/00 20060101AFI20241106BHJP

   A61N 7/02 20060101ALI20241106BHJP

   A61B 18/18 20060101ALI20241106BHJP

   A61B 18/12 20060101ALI20241106BHJP

   A61B 17/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61N 5/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61B 8/08 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

A61N7/00

A61N7/02

A61B18/18 100

A61B18/12

A61B17/00 700

A61N5/00

A61B8/08

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024114274

(22)【出願日】2024-07-17

(62)【分割の表示】P 2020544365の分割

【原出願日】2018-11-09

(31)【優先権主張番号】62/584,064

(32)【優先日】2017-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/596,715

(32)【優先日】2017-12-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＪＡＶＡＳＣＲＩＰＴ

２．ＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】512201731

【氏名又は名称】モンテフィオーレ メディカル センター

【氏名又は名称原語表記】ＭＯＮＴＥＦＩＯＲＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＥＮＴＥＲ

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】グハ，チャンダン

(72)【発明者】

【氏名】バリー，ステファン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】低エネルギーの免疫刺激を使用して、癌および転移を処置するためのシステム、デバイス、および方法が開示される。
【解決手段】低エネルギーの免疫刺激は免疫刺激エネルギーを施すことを含む。低エネルギーの免疫刺激は補助療法と組み合わせられ得る。
【選択図】図２５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

音響刺激治療システムであって、前記システムは：
プロセッサーと；
前記プロセッサーにつながれた１つ以上の超音波トランスデューサーであって、前記超音波トランスデューサーは、１つ以上の超音波ビームの周波数波形が、１０～９００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）および少なくとも０．５ｃｍ^３のビーム量を有するように、１つ以上の超音波ビームを生成するように構成される、１つ以上の超音波トランスデューサーと；
前記プロセッサーにつながれたプローブであって、前記プローブは患者をモニタリングするように構成される、プローブと、
を備える、システム。

【請求項2】

前記プロセッサーおよび前記超音波トランスデューサーは、毎秒少なくとも約０．５ｃｍ^３の速度で組織を体積に関して走査するように構成される、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

全組織体積の走査の速度は、毎秒約０．５ｃｍ^３～約５０ｃｍ^３の範囲内である、請求項１または２に記載のシステム。

【請求項4】

組織全体の体積が走査される、請求項２または３に記載のシステム。

【請求項5】

全組織体積は少なくとも約２ｃｍ^３である、請求項２～４のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項6】

全組織体積は約０．５ｃｍ^３～約１０００ｃｍ^３の範囲内である、請求項２～５のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項7】

全組織体積は、約１ｃｍ^３～約５００ｃｍ^３の範囲内である、請求項２～６のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項8】

全組織体積は、約１ｃｍ^３～約２５０ｃｍ^３の範囲内である、請求項２～７のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項9】

強度は、約２０Ｗ／ｃｍ^２～約５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内である、請求項２～８のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項10】

前記プロセッサーは、複数の位置を重複させるための命令で構成される、請求項１～９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項11】

前記プロセッサーは、超音波トランスデューサーが超音波ビームを送信している間に、第１の体積測定領域に対応する第１の位置から第２の体積測定領域に対応する第２の位置に超音波トランスデューサーを移動させるための命令で構成される、請求項１～１０のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項12】

前記１つ以上の超音波トランスデューサーにつながれたリンケージであって、前記プロセッサーは前記リンケージにつながれ、かつ前記１つ以上の超音波トランスデューサーを複数の位置に移動させるための命令で構成される、請求項２～１１のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項13】

前記リンケージは、複数のジョイントを含むロボットアームを備え、前記複数のジョイントの各々は、ジョイントの角度を制御するためにアクチュエーターにつながれ、および、前記プロセッサーは、複数の位置に超音波ビームを向けるために、前記複数のジョイントの複数の角度を決定するための命令で構成される、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記ロボットアームは複数の指を備え、前記複数の指の各々は、その上に取り付けられたトランスデューサーにつながれ、前記複数の指の各々は、標的位置に超音波ビームを向けるために、前記指の上に取り付けられた前記トランスデューサーからの超音波ビームの前記トランスデューサーの角度を制御するように構成される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記プロセッサーは、複数の位置の各々で前記超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、前記複数の位置の各々で前記超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成される、請求項２～１４のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項16】

前記プロセッサーは、複数の位置の各々で前記超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、前記複数の位置の各々で前記超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成され、随意に、ここで、前記複数の位置の各々は、６自由度で前記超音波トランスデューサーを配置するために、三次元の位置および三次元の配向に対応する、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

超音波処置と組み合わせられる補助療法をユーザーが指定するためのユーザー入力であって、ここで、前記プロセッサーは、組織への超音波ビームの処置時間を記録し、前記補助療法のための時間を出力するための命令で構成され、随意に、前記補助療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波療法、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、および高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）からなる群から選択され、ならびに、随意に、出力時間は前記補助療法のための時間枠を含む、請求項１～１６のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項18】

前記プロセッサーは、ユーザーにユーザーインタフェースを提供するための命令で構成され、前記ユーザーインタフェースは、患者の腫瘍の画像および入力処置の位置を含む、請求項１～１７のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項19】

前記プロセッサーは、全組織体積の組織エラストグラフィを実施するように構成される、請求項１～１８のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項20】

前記プロセッサーは、拡散パラメーターを入力として受け取るように構成される、請求項１～１９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項21】

前記プローブはイメージングプローブである、請求項１～２０のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項22】

前記プローブは温度計である、請求項１～２０のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項23】

前記プローブは熱電対である、請求項２２に記載のシステム。

【請求項24】

前記プローブは光ファイバー温度プローブである、請求項２２に記載のシステム。

【請求項25】

前記プロセッサーは温度読み出し値を出すように構成される、請求項２３または２４に記載のシステム。

【請求項26】

前記プロセッサーは温度警報を発するように構成される、請求項２３または２４に記載のシステム。

【請求項27】

前記プローブは、超音波を測定する別個のトランスデューサーを含む、請求項１～２６のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項28】

前記プローブは、エラストグラフィを使用して組織に対する処置効果をモニタリングする、請求項２７に記載のシステム。

【請求項29】

冷却システムをさらに含む、請求項１～２８のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項30】

前記補助療法は放射線療法である、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項31】

前記放射線療法は補助的切除型である、請求項３０に記載のシステム。

【請求項32】

前記補助療法はＩＲＥである、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項33】

ＩＲＥは約３０秒～約１８０秒の期間にわたって施される、請求項３２に記載のシステム。

【請求項34】

前記補助療法はマイクロ波療法である、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項35】

前記マイクロ波療法は、約１秒～約６０秒の期間にわたって施され、パワーは約１Ｗ～約１０Ｗである、請求項３４に記載のシステム。

【請求項36】

前記補助療法はＬＯＦＵである、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項37】

ＬＯＦＵは、約１～１，０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）を有する、請求項３６に記載のシステム。

【請求項38】

前記ＬＯＦＵは約３Ｗ～３２Ｗの音響パワーを有する、請求項３６または３７に記載のシステム。

【請求項39】

前記ＬＯＦＵは約０．５秒～約５秒の期間にわたって施される、請求項３６～３８のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項40】

前記補助療法はＨＩＦＵである、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項41】

前記ＨＩＦＵは約１，０００～２，０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）を有する、請求項４０に記載のシステム。

【請求項42】

前記ＨＩＦＵは、約１Ｗ～２０Ｗの音響パワーを有する、請求項４０または４１に記載のシステム。

【請求項43】

前記ＨＩＦＵは約１秒～約１０秒の期間にわたって施される、請求項４０～４２のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項44】

前記補助療法は化学療法である、請求項１７～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項45】

前記化学療法は化学療法剤を投与することを含む、請求項４４に記載のシステム。

【請求項46】

前記化学療法剤は、プロテアソーム阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、オートファジー阻害剤、ｍＴＯＴ阻害剤、ＰＰＡＲγアゴニスト、Ｃｏｘ－２阻害剤、カルシウムチャネル阻害剤、ＥＲストレス誘導物質、ＣＨＯＰモジュレーター、ヌクレオシドアナログ、ｅＩＦ２αホスファターゼ阻害剤、タンパク質リガンド、あるいはＨＳＰ９０阻害剤である、請求項４５に記載のシステム。

【請求項47】

前記化学療法剤は、ボルテゾミブ、３－メチルアデニン、ポリフェノール（緑茶）エピガロカテキンガレート、ゲニステイン、クルクミン、レスベラトロール、１５，１６－ジヒドロタンジン Ｉ（タンシェンルート）、クロロキン、ラパマイシン、テムシロリムス、４－Ｏ－カルボキシメチルアスコクロリン、セレコキシブ、ベラパミル、リトナビル、３－チア脂肪酸、テトラデシルチオ酢酸、ネルフィナビル、シスプラチン、ゲムシタビン、サルブリナール、シクロヘキシミド、ＴＲＡＩＬ、４－フェニル酪酸、ゲルダナマイシン、１７－アリアミノ－１７－デメトキシ－ゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、１７－ジメチルアミノ－エチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン（１７ＤＭＡＧ）、あるいはバキュオリンである、請求項４６に記載のシステム。

【請求項48】

前記化学療法剤はＨＳＰ９０阻害剤である、請求項４５に記載のシステム。

【請求項49】

前記化学療法剤は、１７－アリアミノ－１７－デメトキシ－ゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）である、請求項４８に記載のシステム。

【請求項50】

前記補助療法は免疫療法である、請求項１～２９のいずれか１つに記載のシステム。

【請求項51】

前記免疫療法は、樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、免疫チェックポイント阻害からなる群から選択される、請求項５０に記載のシステム。

【請求項52】

前記樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、およびＴＮＦ－βからなる群から選択される、樹状細胞標的療法の免疫療法剤を含む、請求項５１に記載のシステム。

【請求項53】

前記エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０、ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択されるＴ細胞標的の免疫療法剤を含む、請求項５１に記載のシステム。

【請求項54】

前記免疫チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、ＩＤＯ阻害剤、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット、およびナボキシモドからなる群から選択される免疫チェックポイントの免疫療法剤を含む、請求項５１に記載のシステム。

【請求項55】

患者を処置する方法であって、前記方法は：
不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、高周波エネルギー、および寒冷療法からなる群から選択される、免疫刺激エネルギーを施す工程と；
樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、免疫チェックポイント阻害からなる群から選択される免疫療法を施す工程と、
を含む、方法。

【請求項56】

前記樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、およびＴＮＦ－βからなる群から選択される樹状細胞標的療法の免疫療法剤を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０ ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択されるＴ細胞標的の免疫療法剤を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記免疫チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、ＩＤＯ阻害剤、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット、およびナボキシモドからなる群から選択される免疫チェックポイントの免疫療法剤を含む、請求項５５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１７年１１月９日出願の米国仮特許出願第６２／５８４，０６４号、および２０１７年１２月８日出願の米国仮特許出願第６２／５９６，７１５号の利益を主張するものであり、参照によって本明細書に組み込まれる。本出願の主題はＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３５４４０に関するものであり、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

＜政府の支援についての声明＞
本発明は、生物工学研究所（ＮＩＢＩＢ）よって与えられたＲＯ１ＥＢ００９０４０の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有している。

【背景技術】

【0003】

癌は、遺伝的に変異した細胞が制御不能に増殖し、栄養素を排出し、および、健康な組織の機能を破壊する疾患である。手術、化学療法、および放射線などの従来の癌処置は、癌細胞とそれが存在する腫瘍を根絶することができるが、癌を十分に抑制するのに役立たない場合がある。癌細胞を探し出して、排除する免疫系の細胞を関わらせる免疫療法の使用が提案されてきたが、このアプローチは、少なくともいくつかの例では、理想的とは言えない結果をもたらし得る。例えば、腫瘍は、免疫療法を回避することができる特権部位である、微小環境を生成することがある。さらに、癌細胞による抗原の提示は、少なくともいくつかの点で理想的とは言えない場合がある。

【0004】

超音波は癌の処置のために他の治療と組み合わせて提案されてきたが、先の超音波の方法および装置は少なくともいくつかの点で理想とは言えない場合がある。例えば、高密度焦点式超音波は、腫瘍を処置するのに理想より時間がかかる可能性があり、および、凝固壊死と呼ばれるプロセスによって腫瘍微小環境を瞬間的に破壊し、それにより、腫瘍における免疫細胞浸潤を防ぎ、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を取り込んで提示する。したがって、癌を処置するための他のタイプの補助的切除型（ｓｕｂ－ａｂｌａｔｉｖｅ）エネルギーを使用することができれば有用である。

【0005】

上記に照らして、癌を処置する改善された方法および装置が必要である。理想的には、方法および装置は、患者の免疫系が癌を処置するためのインサイチュワクチン（ｉｎ ｓｉｔｕ ｖａｃｃｉｎｅ）を生成する、癌に対する免疫応答を生成する。方法および装置は、他の治療と組み合わせた場合に免疫原性応答を生成するように、補助的切除量（ｓｕｂ－ａｂｌａｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）のエネルギーを用いて癌を処置するように構成することができる。

【発明の概要】

【0006】

いくつかの実施形態において、音響刺激治療システムが本明細書に開示され、上記システムは：プロセッサーと；上記プロセッサーにつながれた１つ以上の超音波トランスデューサーであって、上記超音波トランスデューサーは、上記１つ以上の超音波ビームの周波数波形が、１０～９００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）および少なくとも０．５ｃｍ^３のビーム体積を有するように、１つ以上の超音波ビームを生成するように構成される、１つ以上の超音波トランスデューサーと；上記プロセッサーにつながれたプローブであって、上記プローブは患者をモニタリングするように構成される、プローブと、を備える。いくつかの実施形態において、プロセッサーおよび超音波トランスデューサーは、毎秒少なくとも約０．５ｃｍ^３の速度で組織を体積に関して走査するように構成される。いくつかの実施形態において、走査速度は、走査される組織の総体積にして、毎秒約０．５ｃｍ^３～約５０ｃｍ^３の範囲内である。いくつかの実施形態において、組織全体の体積が走査された。いくつかの実施形態において、組織の総体積は少なくとも約２ｃｍ^３である。いくつかの実施形態において、組織の総体積は約０．５ｃｍ^３～約１０００ｃｍ^３の範囲内である。いくつかの実施形態において、組織の総体積は、約１ｃｍ^３～約５００ｃｍ^３の範囲内である。いくつかの実施形態において、組織の総体積が、約１ｃｍ^３～約２５０ｃｍ^３の範囲内である。いくつかの実施形態では、強度は、約２０Ｗ／ｃｍ^２～約５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内である。いくつかの実施形態において、プロセッサーは、複数の位置を重複させるための命令で構成される。いくつかの実施形態において、プロセッサーは、超音波トランスデューサーが超音波ビームを送信している間に、第１の体積領域（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に対応する第１の位置から第２の体積領域に対応する第２の位置に超音波トランスデューサーを移動させるための命令で構成される。いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の超音波トランスデューサーにつながれたリンケージをさらに含み、上記プロセッサーは上記リンケージにつながれ、かつ１つ以上の超音波トランスデューサーを複数の位置に移動させるための命令で構成される。いくつかの実施形態において、リンケージは、複数のジョイントを含むロボットアームを備え、上記複数のジョイント各々は、ジョイントの角度を制御するためにアクチュエーターにつながれ、および、上記プロセッサーは、複数の位置に超音波ビームを向けるために、複数のジョイントの複数の角度を決定するための命令で構成される。いくつかの実施形態において、ロボットアームは、複数の指を備え、複数の指の各々は、その上に取り付けられたトランスデューサーにつながれ、複数の指の各々は、標的位置に超音波ビームを向けるために、上記指上に取り付けられたトランスデューサーからの超音波ビームのトランスデューサーの角度を制御するように構成される。いくつかの実施形態において、上記プロセッサーは、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成される。いくつかの実施形態において、上記プロセッサーは、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成され、任意に、ここで、複数の位置の各々は、６自由度でトランスデューサーを配置するために三次元の位置および三次元の配向に対応する。いくつかの実施形態において、システムは、超音波処置と組み合わせられる補助療法をユーザーが指定するためのユーザー入力さらに含み、ここで、上記プロセッサーは、組織への超音波ビームの処置時間を記録し、補助療法のための時間を出力するための命令で構成され、随意に、補助療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波療法、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、および高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）からなる群から選択され、ならびに、随意に、出力時間は補助療法のための時間枠を含む。いくつかの実施形態において、プロセッサーは、ユーザーにユーザーインタフェースを提供するための命令で構成され、上記ユーザーインタフェースは、患者の腫瘍の画像および入力処置の位置を含む。いくつかの実施形態において、プロセッサーは、全組織体積の組織エラストグラフィ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）を実施するように構成される。いくつかの実施形態において、プロセッサーは、拡散パラメーターを入力として受け取るように構成される。いくつかの実施形態において、プローブはイメージングプローブである。いくつかの実施形態において、プローブは温度計である。いくつかの実施形態において、プローブは熱電対である。いくつかの実施形態において、プローブは光ファイバー温度プローブである。いくつかの実施形態において、プロセッサーは温度読み出し値を出すように構成される。いくつかの実施形態において、プロセッサーは温度警報を発するように構成される。いくつかの実施形態において、プローブは、超音波を測定する別個のトランスデューサーを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、エラストグラフィを使用して組織に対する処置効果をモニタリングする。いくつかの実施形態において、システムは冷却システムをさらに備える。いくつかの実施形態において、補助療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、放射線治療は補助的切除型（ｓｕｂ－ａｂｌａｔｉｖｅ）である。いくつかの実施形態において、補助療法はＩＲＥである。いくつかの実施形態において、ＩＲＥは約３０秒～約１８０秒の期間にわたって施される。いくつかの実施形態において、補助療法はマイクロ波療法である。いくつかの実施形態において、マイクロ波療法は、約１秒～約６０秒の期間にわたって施され、パワーは約１Ｗ～約１０Ｗである。いくつかの実施形態において、補助療法はＬＯＦＵである。いくつかの実施形態において、ＬＯＦＵは、約１～１，０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）を有する。いくつかの実施形態において、ＬＯＦＵは約３Ｗ～３２Ｗの音響パワーを有する。いくつかの実施形態において、ＬＯＦＵは約０．５秒～約５秒の期間にわたって施される。いくつかの実施形態において、補助療法はＨＩＦＵである。いくつかの実施形態において、ＨＩＦＵは約１，０００～２，０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）を有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＦＵは、約１Ｗ～２０Ｗの音響パワーを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＦＵは約１秒～約１０秒の期間にわたって施される。いくつかの実施形態において、補助療法は化学療法である。いくつかの実施形態において、化学療法は化学療法剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、プロテアソーム阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、オートファジー阻害剤、ｍＴＯＴ阻害剤、ＰＰＡＲγアゴニスト、Ｃｏｘ－２阻害剤、カルシウムチャネル阻害剤、ＥＲストレス誘導物質、ＣＨＯＰモジュレーター、ヌクレオシドアナログ、ｅＩＦ２αホスファターゼ阻害剤、タンパク質リガンド、あるいはＨＳＰ９０阻害剤である。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、ボルテゾミブ、３－メチルアデニン、ポリフェノール（緑茶）エピガロカテキンガレート、ゲニステイン、クルクミン、レスベラトロール、１５，１６－ジヒドロタンジン Ｉ（タンシェンルート（Ｔａｎｓｈｅｎ ｒｏｏｔ））、クロロキン、ラパマイシン、テムシロリムス、４－Ｏ－カルボキシメチルアスコクロリン、セレコキシブ、ベラパミル、リトナビル、３－チア脂肪酸、テトラデシルチオ酢酸、ネルフィナビル、シスプラチン、ゲムシタビン、サルブリナール、シクロヘキシミド、ＴＲＡＩＬ、４－フェニル酪酸、ゲルダナマイシン、１７－アリアミノ（ａｌｌｙａｍｉｎｏ）－１７－デメトキシ－ゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、１７－ジメチルアミノ－エチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン（１７ＤＭＡＧ）、あるいはバキュオリン（ｖａｃｕｏｌｉｎ）である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、ＨＳＰ９０阻害剤である。いくつかの実施形態において、化学療法剤は１７－アリアミノ－１７－デメトキシ－ゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）である。いくつかの実施形態において、補助療法は免疫療法である。いくつかの実施形態において、免疫療法は、樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、免疫チェックポイント阻害からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、およびＴＮＦ－βからなる群から選択される樹状細胞標的療法の免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０ ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択されるＴ細胞標的の免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、ＩＤＯ阻害剤、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット（Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）、およびナボキシモド（ｎａｖｏｘｉｍｏｄ）からなる群から選択される免疫チェックポイントの免疫療法剤を含む。

【0007】

いくつかの実施形態において、患者を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は：不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、高周波エネルギー、および寒冷療法からなる群から選択される、免疫刺激エネルギーを施す工程と；樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、免疫チェックポイント阻害からなる群から選択される免疫療法を施す工程と、を含む。いくつかの実施形態において、樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、およびＴＮＦ－βからなる群から選択される樹状細胞標的療法の免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０ ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択されるＴ細胞標的の免疫療法剤を含む。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、ＩＤＯ阻害剤、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット、およびナボキシモドからなる群から選択される免疫チェックポイントの免疫療法剤を含む。

【0008】

＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される出願公開、特許、および特許出願は全て、あたかも個々の出願公開、特許、あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるように同じ程度にまで、参照により本明細書に組込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。

【図1】メラノーマ腫瘍は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産出を抑制する。Ａ－Ｂ：３ｘ１０^５ Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスの腰部の側腹部に投与した。腫瘍を７－８ｍｍ^３のサイズまで成長させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍ＤＬＮと遠位の反対側のＮＤＬＮから単離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の抗体で刺激した。ＩＬ－２およびＩＦＮγをＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍のないマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を対照として用いた。Ｃ－Ｄ：ＯＴＩＩマウスに、記載されているように３ｘ１０^５ Ｂ１６－Ｆｌ－ＯＶＡメラノーマ細胞を投与した。Ｔ細胞をＯＶＡ３２３－３３９ペプチド負荷脾細胞で刺激し、ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｅ－Ｆ：上に記載されているように、Ｂ１６－Ｆ１細胞を用いてＴｙｒｐ１マウス中で腫瘍を誘発した。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の抗体で刺激し、ＩＬ－２ならびにＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。グラフは、４（Ａ－Ｂ）あるいは３（Ｃ－Ｆ）の独立した実験からの平均＋ＳＥＭを示す。結果は各実験につき３－５匹のマウスからの平均＋ＳＥＭとして示される。チューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ）（^＊＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５）を用いたＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。

【図2】ＬＯＦＵを用いるメラノーマ腫瘍の処置は、腫瘍誘発性のＣＤ４＋Ｔ細胞寛容を克服する。Ａ－Ｂ：皮下注射によってＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて腫瘍を誘発した。腰部の側腹部に３ｘ１０^５ Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ細胞を注射した。腫瘍を未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。ＦＵＳ処置の３６時間後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍ＤＬＮあるいはＮＤＬＮから単離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の抗体で刺激した。ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって評価した。結果（総サイトカイン産生、および各群中のＮＤＬＮおよびＤＬＮからのＴ細胞によって産生されたサイトカインレベルの比率）を、１つの条件当たり３つの異なるマウスからの平均＋ＳＥＭとして表示する。処置していないマウスあるいは処置されたマウス中のＤＬＮ Ｔ細胞のサイトカイン産生間の差を両側検定（^＊Ｐ＜０．０５）を使用して分析した。Ｃ：マウスに３ｘ１０^５ Ｂ１６メラノーマ細胞を投与して腫瘍を誘発した。腫瘍の発生後、担癌マウスと腫瘍のない対照マウスのＤＬＮおよびＮＤＬＮから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞から、総ＲＮＡサンプルを抽出した。アネルギーに関連する遺伝子の発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果は、腫瘍がないマウスから単離されたＴ細胞と比較して、担癌マウス中のＤＬＮまたはＮＤＬＮの常在性Ｔ細胞における遺伝子発現の誘発倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）として示される。データは、３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭを表す。Ｄ：Ｔｙｒｐ１マウスにおいてＢ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍を誘発し、その後、未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。様々なアネルギーに関連する遺伝子の発現を、ＤＬＮおよびＮＤＬＮから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞においてＲＴ－ＰＣＲによって測定した。アネルギーに関連する遺伝子の発現は、腫瘍がないＴｙｒｐ１マウスからのＴ細胞中で得られた値を上回る誘発倍率（５つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭ）として表される。

【図3】ＬＯＦＵで処置されたＢ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍からの溶解産物は、アネルギーＴ細胞の反応性低下状態を覆すことができる。Ａ：ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｙｒｐ１マウスの脾臓およびリンパ節から単離し、ＴＨ１細胞に分化した。その後、細胞を未処置のままにするか、あるいは抗ＣＤ３のみで１６時間処置することで、アネルギーを誘発した。その後、細胞をＩＬ－２が厳密には存在しない状態で７２時間静止させ、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の抗体で再度刺激した。ＩＬ－２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は２つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。Ｂ：ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を腫瘍がないＴｙｒｐ１マウスの脾臓から単離した。（Ａ）に記載されるＴｙｒｐ１マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞から生成されたアネルギーＴＨ１細胞を、未処置の、あるいはＬＯＦＵで処置されたＢ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍に由来する樹状細胞および腫瘍溶解産物で共培養した。２４時間後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２について分析した。結果は、各実験で使用される腫瘍溶解産物の３つの独立したセットを用いた２つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。チューキーの検定（^＊＊Ｐ＜０．０１）を用いる分散分析を使用してデータを分析した。

【図4】ＦＵＳ処置は、Ｈｓｐ７０の発現ならびに細胞分布の変化、およびＢ１６－Ｆ１メラノーマ細胞のカルレティキュリンの変化を引き起こす。Ａ：未処置の、およびＬＯＦＵで処置されたＢ１６－Ｆ１メラノーマを有するマウスからの総ＤＬＮ常在細胞を単離させ、ＣＤ１１ｃについて免疫染色することで、樹状細胞をゲートした。その後、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＭＨＣＩＩの表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。適切なアイソタイプ対照を各一次抗体に使用した。代表的なヒストグラムを示す。Ｂ：未処置の、あるいはＬＯＦＵで処置されたマウスから得られたＢ１６腫瘍細胞懸濁液の代表的なＦＡＣＳドットプロットを、生存度マーカー（生／死 Ｍｋ）で染色した。死細胞の相対的な定量化を報告する。ボックスと矢印は死細胞（生／死 ＭＫ＋）を示す。Ｃ：未処置のマウス、あるいはＬＯＦＵで処置されたマウスから単離されたＢ１６－Ｆ１腫瘍組織の蛍光免疫染色。組織切片を抗体で染色して、カルレティキュリンあるいはＨｓｐ７０およびＴＲＰ１を検出した。核をＤＡＰＩで染色した。拡大率６０倍。Ｄ：ＬＯＦＵで処置されたマウスおよび未処置のマウスの腫瘍からの細胞を、ＣＤ４５について、およびＴＲＰ１の発現について染色した。その後、ＣＤ４５－ＴＲＰ１＋Ｂ１６細胞をＨｓｐ７０の発現について分析した。代表的なヒストグラムを示す。ゲートおよび矢印は、分析のために選択された集団を示す。

【図5】メラノーマ腫瘍のＦＵＳ処置は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の樹状細胞媒介性刺激を増強する。Ａ：ＣＤ１１ｃ＋脾臓樹状細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスから精製し、ＯＴ－ＩＩマウスから単離されたレスポンダーナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養した。Ｂ１６－Ｆ１－ＯＶＡメラノーマ腫瘍溶解産物を、未処置の、あるいは、ＬＯＦＵで処置された担癌マウスから調製し、それぞれの培養物に添加することで樹状細胞媒介性Ｔ細胞刺激を駆り立てた。別個のサンプルでは、外因性のＯＶＡ_{３２３－３３９}ペプチドも腫瘍溶解産物と共に加えた。上清を２４時間後に集めて、ＩＬ－２産生をＥＬＩＳＡによって評価した。結果は４つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）と、その後のチューキーの検定で分析した（^＊Ｐ＜０．０５^；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ、有意でない）。Ｂ：Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍を未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。腫瘍ＤＬＮを単離し、Ｔ細胞を枯渇させた。その後、ＤＬＮ細胞をナイーブＴｙｒｐ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養し、インビトロの培養物から得られたＢ１６メラノーマ腫瘍溶解産物で刺激した。上清を２４時間後に集め、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２レベルについて分析した。データは３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示される。未処置のマウスあるいはＬＯＦＵで処置されたマウスからのＤＬＮ細胞を使用する培養物中でのサイトカイン産生間の差を、両側ｔ検定（＊Ｐ＜０．０５）を使用して分析した。

【図6】ＬＯＦＵは、ヒト肝細胞癌細胞株中の構成的ＳＴＡＴ３活性化を阻害する。３つのヒトＨＣＣ細胞株、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＨｕｈ７が、ＳＴＡＴ３の構成的活性化を有することが分かり、ＬＯＦＵは、３つのＨＣＣ細胞株すべてにおいてＳＴＡＴ３活性化を有意に阻害した（Ａ）。これらの３つの細胞株中のＬＯＦＵに対する応答は、異なるパターンを示し、Ｈｅｐ３Ｂは早くも１５分で応答し、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７は１時間で応答した。この結果は、ＳＴＡＴ３非活性化に対するＬＯＦＵの効果をさらに証明し、前立腺癌に加えてＨＣＣにおいてＬＯＦＵを使用するための証拠を提供した。ＬＯＦＵが多くの癌細胞の放射線抵抗性の原因であるＳＴＡＴ３活性をダウンレギュレートすることが示されたため、ＬＯＦＵは癌の放射線治療のための放射線増感剤として役立つ可能性がある。癌細胞を、初めにＬＯＦＵで処置し、１時間後に放射線（５Ｇｙ）に曝した。細胞を９６時間インキュベートし、細胞の合計数をトリパンブルーによって計数した。さらに、クローン形成法（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）を実施し、処置の１０日後にコロニーの数を計数した。ＬＯＦＵおよび放射線のみと比較して、ＬＯＦＵと放射線の組み合わせは、細胞（Ｂ）およびコロニー（Ｄ）の数を減少させた。加えて、ＳＴＡＴ３阻害剤であるＷＰ１０６６をＬＯＦＵ処置前に加えることで、細胞死（Ｃ）の誘発に対して優れた効果が得られた。ＬＯＦＵおよびＷＰ１０６６は細胞増殖に対して同様の効果を示し、それは両方の薬剤によるＳＴＡＴ３阻害における結果と一致していた。

【図7】ＦＵＳとその後の少分割ＩＧＲＴは、Ｔ細胞媒介性の長期の原発腫瘍対照および遠位の転移の減少をもたらした。Ａ：５０ｍｍ^３の皮下背側右後肢腫瘍（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｄｏｒｓａｌ ｒｉｇｈｔ ｈｉｎｄ ｌｉｍｂ ｔｕｍｏｒｓ）を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスを、４つの処置：群未処理、ＬＯＦＵ、少分割ＩＧＲＴ、あるいはＬＯＧＵ＋ＩＧＲＴの１つに分離し、６２日間、または原発性腫瘍が３００ｍｍ^３を超えて成長するまで、腫瘍増殖をモニタリングした。グラフは、２つの代表的な実験（１つの群当たり３～５匹のマウス）の１つからの腫瘍体積の平均±ＳＥＭを示す。データは、一元配置分散分析とその後のボンフェローニ補正検定（２９日目より前）、あるいは両側ステューデントｔ検定（２９日目より後）により分析された。未処置のマウスあるいはＬＯＦＵで処置されたマウスと、ＩＧＲＴあるいはＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴとの間の有意差（＜０．０５をＰとして定義される）は、２５日目以降に生じ、ＩＧＲＴで処置されたマウスとＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴで処置されたマウスとの間の有意差は３５日目以降に生じた。特定の日の腫瘍サイズの分布を示す個々のグラフもＢに示されている。Ａに記載される実験と同様の実験をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで行った。どの時点でも異なる群間で有意差は観察されなかった。Ｃ：１５０ｍｍ^３の体積に達する再発、あるいは膝窩リンパ節または鼠径リンパ節への局所的な転移の進行のいずれかとして定義される、原発腫瘍の進行／再発についてＣ５７Ｂｌ／６マウスをモニタリングした。加えて、自然死した動物は、疾患の再発あるいは進行があったとしてスコアされた。マンテル・コックス検定を用いて無再発生存データを分析した。Ｄ：自然死したか、腫瘍量が非常に多すぎて安楽死を必要としたか、あるいは、２か月間の長い実験の最後に屠殺した動物から肺を収集した。その後、肺転移を測定した。融合してプラークになるか、２５０を超過する小結節を有する肺は、あまりにも数が多すぎて数えることができないと考えられ、２５０の最大値を割り当てられた。各処置群について代表的な検体が示されている。結果は平均±＋ＳＥＭとして示され、１つの群当たりｎ＝３－５匹のマウスで、クラスカル・ウォリス検定で分析し、その後、ダン検定（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔｔｅｓｔ）で分析した。^＊Ｐ＜０．０５．

【図8】マウスの前立腺癌および乳癌モデルのＬＯＦＵおよびＲＴ処置。ＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）および／または放射線（１０Ｇｙ）を用いた２つの処置を２日実施し、２つの処置の間には２４時間の間隔をあけた（Ａ）。このＬＯＦＵ処置の強度が高いため、２回目の処置前に傷が治癒するのを可能にするために、２つの処置の間に１日の間隔をあけた。この腫瘍については、１０Ｇｙｘ２の放射線量は、完治することなく腫瘍成長を有意に遅らせることができた（８Ｂの上の列）。処置されていないマウスの場合の２５日と比較して、腫瘍が初期体積（Ｖ０）の５倍に達するまでの中位時間は４７日であった。放射線療法前のＬＯＦＵの追加は、処置したマウスの約４６．４％の原発性腫瘍を治癒した（Ｂの上＆Ｃの左）。ＬＯＦＵの追加は、腫瘍表面の大部分を覆ういくつかの軽い皮膚のやけどをもたらした。これらのやけどは、処置後１－２週間以内に自然に治癒した。野生型のマウスにおいて、異種抗原、例えば、この場合ヒトＰＳＡに対する免疫応答を開始する能力は、突然変異負荷が低いものの自己抗原でいっぱいであった、ヒト前立腺癌を模倣しなかった。ＬＯＦＵとＲＴを用いた併用療法を受けた、前立腺癌のヒト疾病を最も良く模倣したモデルであるＰＳＡ－Ｔｇトランスジェニックマウスは、５７．１の原発性腫瘍の減少を示した（Ｂの中央列＆Ｃの中央）。これらの結果は、ＬＯＦＵとＲＴの併用療法がＰＳＡに対する耐性を克服することができるか、あるいは、ＰＳＡに対する耐性を無関係にする（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）のに十分なネオ抗原を生成することできたことを示した。ＬＯＦＵとＴＲの有効性がＴ細胞によって媒介されたことを確認するために、同じ実験を胸腺欠損ヌードマウスにおいて実施した。放射線は原発性腫瘍の腫瘍成長の遅延をもたらしたが、ＬＯＦＵの追加は何の利点をもたらさなかった（Ｂ下の列＆Ｃ右）。これらの結果は、Ｔ細胞は、ＬＯＦＵとＲＴの組み合わせを使用して原発性腫瘍を治癒することが求められることを示す。三種陰性乳癌マウスモデル（４Ｔ１）を使用して、ＬＯＦＵとＲＴの組み合わせ処置の有効性を判定した。２ｘ１０５細胞で腫瘍接種した７日後に、ＬＯＦＵ（５Ｗ、５０％のデューティ比）および／または２０Ｇｙの放射線を３日連続で実施した（図８のＤ）。放射線のみ、およびＬＯＦＵと放射線の併用療法の両方が原発性腫瘍の治癒をもたらしたが、併用療法は原発性腫瘍の治癒までの時間を１週の中位時間だけ有意に速めた。

【図9】ＬＯＦＵはＵＰＲを誘発する。Ａ：ＬＯＦＵは、Ｂｉｐ／Ｇｒｐ７８とＥＤＥＭ ｍＲＮＡの発現を増加させる。ＬＯＦＵで処置されたＲｉｌｌ腫瘍から単離されたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析は、未処置の対照と比較して、Ｂｉｐ／Ｇｒｐ７８の２９．７３±０．５６倍の増加、および、ＥＤＥＭ ｍＲＮＡレベルの９．２７±１．１８倍の増加を示した。Ｂ：ＬＯＦＵは、ＩＲＥ１α ｍＲＮＡの発現を２．８±０．４倍増加させる。リアルタイムＰＣＲ分析は、ＬＯＦＵにより誘発されたＩＲＥ１α発現の増加が１７ＡＡＧ処置により変化しなかったことを示す。Ｃ：ＬＯＦＵは、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡのスプライシングを引き起こした。１７ＡＡＧ処置は、ＸＢＰ１のスプライシングを阻害する。ＸＢＰ１ｓ、ＸＢＰ１ｈ、およびＸＢＰ１ｕは、ＸＢＰ１のスプライシングされた形態、ハイブリッド形態、およびスプライシングされていない形態をそれぞれ示す。Ｄ－Ｇ：ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、ＲＭ１腫瘍細胞の小胞体ストレスを延ばす。ウェスタンブロットおよび棒グラフは、ＥＲＰ７８（Ｄ＆Ｅ）、ＥＲＰ５７（Ｄ＆Ｆ）、およびＥＲｐ４４（Ｄ＆Ｇ）のタンパク質の発現が併用療法群で誘発されたことを示す。

【図10】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、ＵＰＲのアポトーシス促進性の経路を活性化し、腫瘍細胞でアポプトーシスを誘発する。Ａ＆Ｂ：ｐＰＥＲＫ（Ａ）およびｐｅＩＦ２α（Ｂ）のウェスタンブロット。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧはＰＥＲＫ（ｐＰＥＲＫ）のリン酸化によってＰＥＲＫを活性化し、これはさらにｅＩＦ２αリン酸化（ｐｅＩＦ２α）のリン酸化を誘発する。Ｃ：ＣＨＯＰ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析。対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧで処置された群ではＣＨＯＰ転写物の２５±１．３倍の増加があった。Ｄ：ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧで処置された腫瘍から単離されたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲアレイ。ヒートマップ分析は、未処置の対照あるいはＬＯＦＵ群と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置群がアポトーシスの遺伝子の転写物レベルを数倍増加させたことを示した。Ｅ：ＴＵＮＥＬ染色。免疫組織化学的染色は、対照あるいはＬＯＦＵ群と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置群中でｔｕｎｅｌ陽性細胞を優勢的に示した。１７ＡＡＧのみでは、ＬＯＦＵによって増大された腫瘍組織中のアポプトーシスをさらに誘発したことに注意する。

【図11】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置は、ＲＭ１腫瘍細胞中でシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）を阻害する。（Ａ＆Ｂ）免疫ブロット分析は、併用療法群においてＳＭＡマーカーＬＡＭＰ２ａ発現レベルの数倍のダウンレギュレーションを示した。ＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧのいずれかを用いた処置は、ＬＡＭＰ２ａ発現レベルをアップレギュレートする。（Ａ＆Ｃ）ＬＯＦＵと１７ＡＡＧの併用療法は、マクロオートファジーマーカーであるベクリンの発現レベルを変えなかった。

【図12】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後のマウスおよびヒトの前立腺腫瘍の腫瘍成長遅延。Ａ：処置模式図。２週間にわたって投与された５つの画分について、３－４日ごとにＬＯＦＵで触知可能な腫瘍を処置した。動物はこの間に１７ＡＡＧを週に３回受けた。ＬＯＦＵの最後の分画の２４時間後に腫瘍を採取した。Ｂ：ＲＭ１腫瘍。Ｃ５７Ｂｌ６マウスでは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、対照と比較して、ＲＭ１腫瘍の増殖を有意に減少させた（ｐ＜０．００４）。ＬＯＦＵあるいは１７ＡＡＧのいずれかだけでは腫瘍を有意に制御することができなかったことに注意する。ＬＯＦＵは、低用量（体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ）の１７ＡＡＧの効果を感作した。Ｃ：ＰＣ３腫瘍。ＢａｌｂＣ ｎｕ／ｎｕマウスでは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法は、ＰＣ３腫瘍の増殖の有意な減少を示した（ｐ＜０．００７）。

【図13】ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置は、ＲＭ１細胞において前立腺癌幹細胞マーカーの発現を減少させた。単離されたＲＭ１腫瘍細胞のフローサイトメトリーは、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置後にＲＭ１腫瘍細胞上でＳＣＡ１（Ａ＆Ｂ）、ＣＤ４４（Ａ＆Ｃ）、ＣＤ１３３（Ａ＆Ｄ）、およびα２１３１インテグリン（Ａ＆Ｅ）の細胞表面発現の有意な減少を示した。（Ｆ）ｑＲＴ－ＰＣＲアレイとその後のヒートマップ分析は、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ併用療法群が幹細胞転写因子のｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートすることを示した。

【図14】ＬＯＦＵでの前処置と、その後のＨＩＦＵでの処置は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘発した。非切除ＬＯＦＵを用いた前処置により、腫瘍細胞はミスフォールドタンパク質を処理することができ、１日後のＨＩＦＵを用いたその後の処置により、ＤＣの取り込みおよびＴ細胞免疫の誘導のために死腫瘍細胞からＨＳＰペプチド複合体を放出するこができる。触知可能なＯＶＡを発現するＲＭ１－ＯＴ腫瘍は、ＬＯＦＵで、その後、１日あけてＨＩＦＵで順次処置し、動物をＬＯＦＵ処置後３日目、７日目、および１４日目に屠殺した。一方、腫瘍特異的Ｔ細胞応答はＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ処置の１サイクルでは検出されなかったが、３日目にＩＦＮ－γ産生細胞（ＰＭＡおよびイオノマイシンによって刺激された）の総数の適度な増加があり（１１０±５／２．５×１０５細胞ＬＯＦＵならびにＨＩＦＵ対未処置の６６±１６／２．５×１０５細胞、ｐ＜０．０５、図１４のＡ）、これは、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ処置がＴｈ１表現型へと免疫応答を傾ける可能性があることを示した。しかし、ＩＦＮ－γ－分泌細胞の数は、様々な統計的差異なく、７日および１４日で前処理レベルにまで減少した。したがって、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵを用いた腫瘍の反復処置は、定期的な免疫処置のためにＨＳＰおよび腫瘍抗原の放出を促進し、腫瘍特異的免疫応答の誘導のためのワクチン接種スケジュールをシミュレートする。触知可能なＲＭ１－ＯＴ腫瘍は、１日間隔をあけて施された連続するＬＯＦＵおよびＨＩＦＵの毎週サイクルで３回処置し、動物を最後のＨＩＦＵ処置の１週間後に屠殺した。脾細胞中の腫瘍特異的Ｔ細胞の発生頻度をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析し、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞の細胞毒性機能を検出した。ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスからの脾細胞を、照射されたＲＭ１－ＯＴ細胞と共培養すると、ＩＦＮ－γ－分泌ＲＭ１－ＯＴ反応性Ｔ細胞の数が増加した（ＬＯＦＵ＋ＨＩＦＵ後の２．５×１０５脾細胞あたり４３２±６５の細胞対ＨＩＦＵのみの後の２．５×１０５脾細胞あたり１５±６の細胞；１４のＢ）。ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスにおける腫瘍特異的ＩＦＮ－γを放出するＴ細胞の発生頻度は、０．１７±０．０３％であった。これらの腫瘍反応性脾細胞は、これらのペプチドと共培養された場合、ＯＶＡ由来のＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド、ＯＶＡ２５７－２６４（２．５×１０５の総脾細胞あたり１４９±２８の細胞）ならびにＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド、ＯＶＡ３２３－３３９（２．５×１０５の総脾細胞あたり１３２±３２の細胞）の両方を特異的に認識することが分かった。これに対して、ＬＯＦＵのみ、あるいはＨＩＦＵのみのいずれかで処置されたマウスにおいては、有意な免疫応答は検出されなかった（両方の群において２．５×１０５の総脾細胞あたり１５±６の細胞）。これらの結果は、ＬＯＦＵとＨＩＦＵの併用療法が、代理細胞質腫瘍抗原であるＯＶＡに対するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の応答を誘発することができることを示す。ＨＩＦＵ処置のみでは、腫瘍組織内のＨＳＰの細胞死および放出を誘導したが、有意な抗腫瘍細胞性免疫は誘導しなかった。腫瘍特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、照射されたＲＭ１－ＯＴ細胞との培養後の脾細胞における細胞表面ＣＤ１０７ａの存在を測定する、ＣＤ１０７ａ動員アッセイによって評価した。ＣＤ１０７ａは、ＣＴＬによって細胞毒性脱顆粒プロセス中に細胞表面に一時的に動員されるようになる、パーフォリン／グランザイムＢ小胞の膜タンパク質である。ＣＴＬはすべての処置群中に存在したが、腫瘍特異的ＣＤ１０７ａ＋ Ｔ細胞は、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスにおいて最も高かった（ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウル中２７．８８±４．８０％対未処置のマウス中７．５±１．２％、ｐ＜０．０５；１４のＣ）。代理腫瘍抗原（ＯＶＡ）に反応性だったＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を、Ｈ－２ｂ／ＯＶＡ２５７－２６４四量体染色（１４のＤ）によって定量化した。未処置のコホートあるいは単一の処置コホートはごくわずかなＯＶＡ反応性ＣＤ８ Ｔ細胞を有していたが、ＬＯＦＵとＨＩＦＵの処置後にこれらの細胞が増加し（０．１２％のＬＯＦＵ＋ＨＩＦＵ対＜０．０１％の未処置）、さらにインビボの腫瘍特異的Ｔ細胞の存在を確認した。最後に、非切除ＬＯＦＵでの前処置がＨＩＦＵの治療効果を増大させるかどうかを調べるために、腫瘍を有するマウスの処置群間でＨＩＦＵ曝露の時間間隔を同じに保った。様々な群中の腫瘍サイズは、１サイクルの超音波治療法の後に有意な差異はなかったが、２サイクル後に成長遅延が見られた（Ｅ、下のパネル）。予想通りに、未処理の対照（ｐ＞０．０５）と比較して、ＬＯＦＵ処置のみでは腫瘍成長率は変化しなかった。ＬＯＦＵのコホートおよび未処置のコホート（ｐ＜０．０５）と比較して、ＨＩＦＵのみでは腫瘍成長を有意に抑制した。相対的なマウスの写真（Ｅ、上パネル）によって示されるように、ＬＯＦＵでの前処置は、ＨＩＦＵ治療の殺腫瘍性効果を有意に増強した（ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ対ＨＩＦＵ、ｐ＜０．０１；ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ対ＬＯＦＵあるいは無処置（ＮＴ）、ｐ＜０．００１）。

【図15】ＬＯＦＵとＲＴの組み合わせ処置は、腫瘍再負荷のマウスモデルにおいて抗腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞免疫および免疫記憶を増大させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する併用療法の影響を決定するために、ＰＳＡ特異的ＭＨＣクラスＩ五量体を使用した処置の後に腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を分析した。すべての処置群にわたってＰＳＡに特異的な、活性化されたＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋Ｔ細胞が増加し、ＬＯＦＵのみ（０．４９７±０．０６４％）およびＲＴのみ（０．９２３±０．３８７％）の群と比較して、ＬＯＦＵ＋ＲＴは、ＣＤ６２Ｌ－／五量体＋ＣＤ８ Ｔ細胞（１．５５７±０．１２７％）の最も高い割合を有していた（図１５のＡ）。細胞死を示すＬＤＨ放出アッセイにより、併用療法で処置されたＰＳＡ遺伝子導入マウスからの脾細胞が腫瘍中の細胞死を増加させたことも確認した（ＮＴ：４．１８６±３．１％、ＬＯＦＵ：５．１±４．３％、ＲＴ：２．９１±１．７％、ＬＯＦＵ＋ＲＴ：１１．６１３±３．９８％；図１５のＢ）。ＬＯＦＵとＲＴの併用療法が免疫記憶を結果としてもたらすか否かを判定するために、ＬＯＦＵ＋ＲＴ治療後に原発性腫瘍から治癒したマウスを反対側の側腹部上のＴＰＳＡ２３細胞で再負荷し、接種後最大６０日の腫瘍成長プロファイルを測定した。図１５のＣ、Ｄ、およびＥは、各処置群の個々のマウスにおける腫瘍成長を示す。接種後４５日目に、８匹のＰＳＡ遺伝子導入マウスのうち７匹のマウスが有意な成長遅延を示し（ナイーブ：３０７．６ｍｍ^３、ＷＴ：１８４．８ｍｍ^３、ＰＳＡ：１２８．６ｍｍ^３、ｐ＝０．１０）、１匹のマウスのみが腫瘍記憶の完全な欠如を示した。接種後５６日目までに、８匹のＰＳＡ遺伝子導入マウスのうち２匹のマウスでは完全な腫瘍成長阻害があった（図：１５のＥ）。ＷＴマウス中の再負荷応答（図：１５のＤ）異なっており、接種後４３日目に４匹のマウスのうち１匹のみが腫瘍成長阻害を示し、実験の終わりまでその腫瘍阻害応答を持続した。５６日目に、以前治癒した腫瘍のＬＯＦＵ＋ＲＴ処置によって生成された免疫記憶を示すナイーブマウス（図１５のＦ）と比較して、ＬＯＦＵとＲＴの組み合わせによって原発性腫瘍から治癒したＷＴマウスは、５２％の腫瘍成長遅延を有しており、ＬＯＦＵ＋ＲＴの組み合わせによって原発性腫瘍から治癒したＰＳＡ遺伝子導入マウスは７４％の腫瘍成長遅延を有していた。Ｃ５７／ＢＬ６（ＷＴ）およびＰＳＡ遺伝子導入マウス（Ｃ５７／ＢＬ６バックグラウンド）の原発性腫瘍を治癒した両方の群は、再負荷後に腫瘍成長遅延を示したが、ナイーブ群と比較して、ＰＳＡ遺伝子導入マウスのみが腫瘍体積の統計的に有意な減少を示した（ｐ＝０．００４３、マン・ホイットニーのＵ検定）。野生型の再負荷されたマウスと、ナイーブあるいはＰＳＡ遺伝子導入マウスとの再負荷腫瘍体積の間に統計的有意差がなかったが、無処置のマウス（ｐ＝０．０４）と比較して、４匹のマウスのうち１匹のマウスが免疫記憶を示さず、４匹のマウスのうち３匹のマウスが統計的に有意な成長遅延を有していた。これらの実験は、ＬＯＦＵとＲＴの併用療法が原発性腫瘍治癒をもたらすだけではなく、二次腫瘍成長の有意な阻害をもたらす免疫記憶を強化したことを示す。

【図16A】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16B】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16C】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16D】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16E】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16F】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16G】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図16H】ＬＯＦＵによるホルモンベースの化学療法の増強。クローン原性は、癌進行に関して、特に転移の形成を考慮する場合に重要である。クローン原性は、単一の細胞が８つの成功した世代を産生する能力を指す。クローン原性アッセイを、５μＭのアビラテロン（ＡｂＡ）、抗アンドロゲン処置と組み合わせて実施した。ＬＯＦＵのみとアビラテロンのみの間の生存率における有意差は示されなかった（１６Ａ）。しかし、以下の代表的な写真に示されるように、アビラテロン処置下で形成されたコロニーは、ＬｏＦＵ処置で形成されたコロニーより平均して小さかった（１６Ｂ）。併用療法は、個々の処置と比較して、ＴＲＡＭＰＣ２およびＴＰＳＡ２３の細胞株の両方において生存率の有意な減少をもたらした。アビラテロンのみの増殖アッセイあるいはＬＯＦＵと組み合わせた増殖アッセイを、細胞増殖の出力として、クリスタルバイオレットシグナルを用いて、ＴＰＳＡ２３およびその親株細胞ＴＲＡＭＰＣ２上で実施した。低用量のアビラテロン（５μＭ）は、無処置と比較して、インキュベーションから４８時間を超えて両方の細胞株の増殖を大幅に阻害した（ＴＲＡＭＰＣ２：ｐ＝０．０００３；ＴＰＳＡ２３：ｐ＝０．０４；対のない両側Ｔ検定）。高用量のアビラテロン（１０μＭ）は、両方の細胞株の増殖能力を排除した。５μＭのアビラテロンに加えてＬＯＦＵが使用された場合、増殖能力は１０μＭのアビラテロンと同じ程度まで排除された。単独療法（ｐ＜０．００５、対のない両側Ｔ検定）と比較して、増殖能の減少は、ＬＯＦＵと、アビラテロンのいずれかの用量との間で統計的に有意であった。アパルタミド（ＬＯＦＵと結合するアンドロゲン受容体のアンタゴニスト）は、ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞のクローン原性に対して、アビラテロン治療と同様の増強された効果を有した。低用量のアパルタミド（５μＭ）と組み合わせたＬＯＦＵは、アパルタミドまたはＬＯＦＵのみと比べて非常に少ないコロニーをもたらし、アパルタミドの用量を２倍にした有効性と同様であった（１６Ｄ）。高用量のアパルタミド（１０μＭ）はクローン原性の有意な減少をもたらすが、その組み合わせはさらに効果的であった。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。同様の結果が、マウス前立腺癌（１６Ｅ－１６Ｆ）およびヒト乳癌細胞株（１６Ｇ）でも観察された。ＬＯＦＵ、Ａｂａ、および１７ＡＡＧの組み合わせは、多数残存する前立腺癌細胞の減少に対して相乗効果を有していた。レトロゾールおよび４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）は両方とも、エストロゲン受容体を標的とし、乳癌治療に使用される。単独であるいはＬＯＦＵ、レトロゾール、および４－ＨＴと組み合わせて処置される場合、図１６Ｇは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の生存率を伴った。最後に、ＴＰＳＡ２３のインビボのマウスモデルを、３日にわたってＬＯＦＵ（５Ｗ、１００％）を２度施してして処置した。連続１４日間毎日強制経口投与（０．５ｍｇ／マウス／日）によって、アビラテロンを与えた。併用療法は、５匹のうち３匹のマウスで腫瘍成長遅延の有意な減少および処置されたマウスの４０％（５匹のうち２匹）における原発性腫瘍治癒をもたらした（１６Ｈ）。接種後４５日目に、未処置と比較して、ＬｏＦＵのみが６６％の腫瘍成長遅延を有し、ＬＯＦＵとアビラテロンの組み合わせは、未処置あるいはＬＯＦＵのみのいずれかに対して１００％の腫瘍成長遅延をもたらした。

【図17】本発明のいくつかの実施形態によるＡＰＴ装置のブロック図である。

【図18】本発明のいくつかの実施形態によるＡＰＴ装置のブロック図である

【図19】本発明のいくつかの実施形態によるＡＰＴ装置のブロック図である。

【図20】一体型超音波イメージング装置を含む本発明のいくつかの実施形態による、ＡＰＴ装置のブロック図である。

【図21】一体型超音波イメージング装置を含む本発明のいくつかの実施形態による、ＡＰＴ装置のブロック図である。

【図22】一体型超音波イメージング装置を含む本発明のいくつかの実施形態による、ＡＰＴ装置のブロック図である。

【図23】本発明のいくつかの実施形態によるトランスデューサーの斜視図である。

【図24】本発明のいくつかの実施形態による位置決め装置を示す。

【図25】いくつかの実施形態によるロボットアーム上に取り付けられた超音波トランスデューサーを示す。

【図26】いくつかの実施形態による、ＣＴセグメンテーション（画像）を表すグラフィカルユーザインターフェースを示す。

【図27】いくつかの実施形態による、ハードウェアアーキテクチャのブロック図を示す。

【図28】いくつかの実施形態による、ソフトウェアアーキテクチャ処置計画のブロック図を示す。

【図29】いくつかの実施形態による、ソフトウェアアーキテクチャ処置実行のブロック図を示す。

【図30】いくつかの実施形態による、ロボットおよび処置の並進運動を示す。

【図31】いくつかの実施形態による、周囲の組織に対して焦点ゾーンへの照射量を増加させるマルチビーム処置ヘッドを示す。

【図32】いくつかの実施形態による、例示的なデジタル処理デバイスを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）の構成、例えば、補助的切除レベルと比較して、処置ゾーンに低減したレベルのエネルギーを送達する超音波（ＵＳ）療法が本明細書に記載される。超音波は、容易に腫瘍に対しておよび腫瘍全体にわたって浸透することができ、ミリ単位の精密さで位置を突き止め、毒性の外部のオペレーター制御を提供する。いくつかの例では、ＵＳは撮像法として利用されることがある。そのような特性は、他のエネルギーベースのモダリティ、例えば、撮像性能を提供しないＲＦアブレーションおよびエレクトロポレーションと比較することができる。さらに、有利なことに、ＵＳは、通常、全線量を制限する生涯最大耐量（ＭＴＤ）を含む、電離放射線の固有の毒性を含まない。他の例では、ＵＳの毒性は、無毒な画像化とＨＩＦＵの切除毒性（ａｂｌａｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）との間の強度および持続時間を変えることにより調整することができる。これらの処置は、タンパク質の変性、癌細胞内のＥＲプロセスの破壊、ならびに癌細胞上および腫瘍微小環境内の免疫原性ＤＡＭＰの結果として生じる産生と表示を介して部分的に機能する、超音波処置パラメーターおよびレジメンを利用することがある。

【0011】

典型的な実施形態では、特定の病変体積の処置は、１ＭＨｚの常時パワーで、短時間（例えば～１．５秒）間であり、腫瘍組織の温度を約４５°Ｃ未満に上昇させる。処置ゾーンに超音波を集束させるために凹面のトランスデューサーを使用して生成され、本明細書では「低エネルギーの非切除型焦点式超音波」（ＬＯＦＵ）と呼ばれるこの超音波処置は、腫瘍細胞において軽度の機械的かつ熱的なストレスを生成するが、組織を損傷させるキャビテーションおよび凝固壊死を回避する。非切除型の「音波」ストレス応答は腫瘍において誘発され、熱ショックタンパク質を実際に死滅させることなく、その発現を増加させる。ＬＯＦＵは、熱ショックタンパク質を含む免疫調節因子を放出する可能性を有し、腫瘍特異的免疫活性化の誘導に効果的であり得る。マウスＢ１６メラノーマ腫瘍モデルを使用して、ＬＯＦＵ処置が腫瘍により誘発される耐性を逆転させ、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞中のエフェクターサイトカイン産生を増大させ、これが腫瘍細胞による免疫原性分子の放出によって引き起こされるように思われることが開示される。さらに、ＬＯＦＵと切除型の少分割コーンビーム断層撮影法（ＣＴ）の画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）との組み合わせは、原発腫瘍の相乗的な制御をもたらし、さらに免疫適格マウスにおいて自発的な肺転移の減少を引き起こし、無再発生存期間を延長する。加えて、ＬＯＦＵは、化学療法剤に対して癌細胞（実施例における前立腺癌）を感作することが分かった。

【0012】

いくつかの実施形態において、腫瘍焦点エネルギーは、免疫細胞成長因子を含む生物活性剤、およびＰＤ－１軸、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｔｉｅ２、ならびにＳＴＩＮＧ経路を標的とする薬剤と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、エネルギーは、典型的な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で免疫原性パターンを生成することが知られている化学療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、エネルギーは、無細胞タンパク質ネットワーク密度を含む、腫瘍中の物理的障壁を低減する生物活性分子と組み合わせることができる。

【0013】

典型的な実施形態では、ＬＯＦＵ（本明細書で「音響刺激治療」とも呼ばれる）は、処置ゾーンにおいて１０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の音響パワーで超音波を施すこと含み、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって継続的に施され、周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲であり、メカニカルインデックスは４未満である。メカニカルインデックス（ＭＩ）は、ＭＨｚの単位の中心周波数の平方根に対するＭＰａの単位の希薄化圧力（ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）である。施される超音波のエネルギーおよび強度は、主として切除効果あるいは主として診断効果のいずれかを引き起こす超音波のエネルギーと強度との間に位置するように意図される。

【0014】

より詳細に以下に説明されるように、本明細書で議論される様々な処置方法は、処置ゾーンで１０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の音響パワーを生成するトランスデューサーを含む、ＬＯＦＵまたは音響刺激治療装置を使用して施されてもよい。超音波は、０．５～５秒の範囲の時間継続的に施されるか、あるいは１～１００ミリ秒のパルス幅でパルス化され、周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲である。いくつかの実施形態では、周波数は０．０５～５ＭＨｚの範囲である。いくつかの実施形態では、周波数範囲は０．１～２ＭＨｚである。いくつかの実施形態では、処置ゾーンでの任意の超音波ビームの最小直径は、約１ｃｍである。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で１０～１００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で１００～２００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で２００～３００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で３００～４００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で４００～５００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で５００～６００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で６００～７００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で７００～８００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で８００～９００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは、処置の領域で９００～１０００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａで投与される。一実施形態では、超音波は、０．５～１秒の範囲の時間にわたって施される。一実施形態では、超音波は、１～２秒の範囲の時間にわたって施される。一実施形態では、超音波は、２～３秒の範囲の時間にわたって施される。一実施形態では、超音波は、３～４秒の範囲の時間にわたって施される。一実施形態では、超音波は、４～５秒の範囲の時間にわたって施される。一実施形態では、超音波は、０．０１～１ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は１～２ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は２～３ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は３～４ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は４～５ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は５～６ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は６～７ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は７～８ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は８～９ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は９～１０ＭＨｚの周波数で施される。一実施形態では、超音波は１０ＭＨｚより高い周波数で施される。

【0015】

被験体における化学療法の有効性を高めるための方法が提供され、上記方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）および（ｉｉ）ある量の化学療法剤を被験体に投与する工程を含み、ここで、上記化学療法剤は、腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こし、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量は化学療法の有効性を高めるのに十分な量である。

【0016】

被験体のあらかじめ決められた、被験体全体より小さい体積の組織における化学療法の有効性を高める方法がさらに提供され、上記方法は、（ｉ）ある量の化学療法剤を被験体に投与する工程であって、ここで、化学療法剤が腫瘍細胞において小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こす、工程と、（ｉｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体のあらかじめ決められた体積の組織に施す工程とを含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、あらかじめ決められた体積の組織内の化学療法の有効性を高めるのに十分な量である。

【0017】

化学療法剤に耐性のある被験体の腫瘍を処置する方法が提供され、上記方法は：指定された化学療法剤に対して耐性のある腫瘍を有するとの被験体の識別を受け取る工程と、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の指定された化学療法剤を投与する工程とを含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに腫瘍を処置するのに十分な量である。

【0018】

被験体の化学療法抵抗性の腫瘍を処置する方法であって、上記腫瘍は、以前投与された化学療法剤に対して化学療法抵抗性になっている方法がさらに提供され、上記方法は：（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の化学療法剤を被験体に投与する工程を含み、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに化学療法抵抗性の腫瘍を処置するのに十分な量である。

【0019】

方法の実施形態では、化学療法剤は腫瘍細胞中で小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こす。

【0020】

方法の実施形態では、化学療法剤は以前に被験体に複数回投与されており、ここで、腫瘍は化学療法剤の初回投与後に化学療法剤に対して耐性を有すると診断されていた。

【0021】

化学耐性に関する方法の実施形態では、方法は、以前投与された化学療法剤に対して化学療法抵抗性の腫瘍を有するとの被験体の識別を受け取る工程をさらに含み得る。

【0022】

方法の実施形態では、化学療法剤は、腫瘍細胞においてＵＰＲを引き起こす。

【0023】

方法の実施形態では、化学療法剤は、腫瘍細胞においてＥＲストレスを引き起こす。

【0024】

方法の実施形態では、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに、腫瘍細胞のアポプトーシスを誘発するか、あるいは腫瘍細胞のアポプトーシスを増加させるのに十分な量である。

【0025】

方法の実施形態では、投与された化学療法剤のみの量は、有効性の増大がない状態で、腫瘍の処置に関して治療量以下の投与量である。

【0026】

方法の実施形態では、施されたＬＯＦＵは、被験体の腫瘍の位置に向けられる。

【0027】

方法の実施形態では、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）は、化学療法あるいは放射線療法または免疫療法の前、あるいはこれらと同時に、被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、放射線療法が施される前に被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、化学療法が施される前に被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、免疫療法が施される前に被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、放射線療法が施されるのと同時に被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、化学療法が施されるのと同時に被験体に施される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは、免疫療法が施されるのと同時に被験体に施される。

【0028】

方法の実施形態では、化学療法剤はＨＳＰ９０阻害剤である。一実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は１７ＡＡＧ（ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎあるいは１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシナン）である。一実施形態では、化学療法剤はＨＳＰ９０阻害剤である。ＨＳＰ９０阻害剤の一例は、１７ＡＡＧ（タネスピマイシンあるいは１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシナン）である。一実施形態では、化学療法剤はアルキル化薬である。一実施形態では、化学療法剤はトラベクテジンである。一実施形態では、化学療法剤はマスタードガス誘導体である。一実施形態では、化学療法剤は金属塩である。一実施形態では、化学療法剤は植物アルカロイドである。一実施形態では、化学療法剤は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗薬である。一実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤は化学療法剤ＮＳＡＩＤである。一実施形態では、化学療法剤はタモキシフェンである。一実施形態では、化学療法剤は非ステロイド性の抗アンドロゲン（ＮＳＡＡ）である。一実施形態では、化学療法剤はアパルタミドである。一実施形態では、化学療法剤はホルモン療法を含む。一実施形態では、化学療法剤は、本明細書で以下に列挙される様々な抗悪性腫瘍薬の１つである。

【0029】

方法の実施形態では、ＬＯＦＵはトランスデューサーを含む超音波装置から超音波ビームによって送達され、上記装置と被験体は、腫瘍の少なくとも一部がトランスデューサーの焦点に位置するように配置される。方法の実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍の少なくとも一部に送達され、被験体の腫瘍の位置は画像処理技術によってモニタリングされる。方法の一実施形態では、画像処理技術は磁気共鳴撮像である。方法の一実施形態では、画像処理技術はコンピューター断層撮影である。方法の一実施形態では、画像処理技術は超音波画像化である。

【0030】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、１時間未満の期間にわたって腫瘍内の複数の体積に少なくとも一回施される。

【0031】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは非切除である。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、施される組織中でキャビテーションを引き起こさない。

【0032】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵの超音波成分は、０．５ＭＨｚから１．５ＭＨｚの周波数で施される。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは１～３秒間施される。方法の一実施形態では、処置ゾーンにおいて、インサイチュ強度が被験体の１ｍｍ～７５ｍｍの組織深さで２５０Ｗ／ｃｍ^２～７５０Ｗ／ｃｍ^２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。

【0033】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍体積全体にわたって施される。方法の一実施形態では、方法は、腫瘍１ｃｃ当たり３００～３０００ジュールの範囲のエネルギーを腫瘍に送達する。方法の一実施形態では、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は被験体に施されない。一実施形態では、ＨＩＦＵは、約８０°Ｃ以上の焦点ゾーンの組織温度に影響を与える集束超音波である。ＨＩＦＵは、固体の組織への数秒の暴露時間の間に最大で６０～８５°Ｃに温度を上昇させ、および／または、組織中の熱アブレーションを引き起こす。熱アブレーションは、通常、０．８～７ＭＨｚの報告された周波数で１ｋＷ／ｃｍ^２を越えるパワー強度で達成される。他方で、ＬＯＦＵは、例えば、１～３Ｗ／ｃｍ^２のパワー強度と、０．５～３ＭＨｚの周波数で達成可能である（しかし、本明細書の他のＬＯＦＵ範囲を参照）。ＬＯＦＵは、デューティーサイクルの調節により、連続的（１００％ＤＣ）、あるいはパルス状（＜１００％ＤＣ、低密度パルス状超音波またはＬＩＰＵＳと呼ぶ文献もある）の集束超音波であり得る。１０分間の１ＭＨｚおよび１Ｗ／ｃｍ^２での連続的なＬＯＦＵにより、組織において０．１°Ｃ上昇させることができる。筋組織に関するインビボの実験は、１ＭＨｚの周波数の超音波処理が、０．５Ｗ／ｃｍ^２で０．０４°Ｃ／分；１．０Ｗ／ｃｍ^２で０．１６°Ｃ／分；１．５Ｗ／ｃｍ^２で０．３３°Ｃ／分；２．０Ｗ／ｃｍ^２で０．３８°Ｃ／分の速度で温度を増大させることを示す。

【0034】

方法の一実施形態では、放射線療法の量とＬＯＦＵの量の効果は、腫瘍を処置する際に相乗的である。

【0035】

方法の一実施形態では、被験体はヒトである。

【0036】

方法の一実施形態では、腫瘍は、前立腺、乳房、鼻咽腔、咽頭、肺、硬骨、脳、唾液腺、胃、食道、精巣、卵巣、子宮、子宮内膜、肝臓、小腸、虫垂、結腸、直腸、膀胱、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、頚部、膣、外陰、前立腺、甲状腺、または皮膚、頭頸部の腫瘍、神経膠腫、あるいは軟部組織肉腫である。方法の一実施形態では、腫瘍は前立腺癌である。

【0037】

方法の一実施形態では、転移は肺転移である。

【0038】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは装置により施され、上記装置は：周波数波形を生成する制御システムと；処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１以上のトランスデューサーと、を含み、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲であり、任意のビームのメカニカルインデックスは４未満である。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．０５～５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の音響出力強度を有する周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．５～１．５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の音響出力強度を有する周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。方法の一実施形態では、各トランスデューサーは、－３ｄＢのビームプロファイル・ウエストが処置ゾーンで５ｍｍ以上となるように、円柱状の超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のビームは処置中に機械的に移動する。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、連続的にあるいは同時に動作し、処置期間中に処置ゾーンで平均空間ピーク２５０Ｗ／ｃｍ^２の超音波を生成するように構成された、２つ以上のトランスデューサーを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、１０ｋＨｚ～３００ｋＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚ～３ＭＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚ３ＭＨｚの周波数で動作し、１つ以上のトランスデューサーは３０～３００ｋＨｚの周波数で動作する。方法の一実施形態では、２つ以上の超音波トランスデューサーは処置ゾーンを通る超音波ビームを生成し、各ビームは１０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。方法の一実施形態では、処置時間は１立方センチメートル腫瘍の当たり５秒未満である。方法の一実施形態では、２つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは５０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。方法の一実施形態では、３つのトランスデューサーは、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成し、各ビームは５０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーン内で互いに実質的に同相である超音波ビームを生成する。方法の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる２つの超音波ビームは、実質的に同相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは７０～１００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１～５秒施される。

【0039】

方法の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる３つの超音波ビームは、実質的に同相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは５０～７０Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１～５秒間施される。方法の一実施形態では、別個のトランスデューサーから生じる超音波ビームはそれぞれ、処置ゾーンで約１００～１０００Ｗ／ｃｍ^２の範囲のＩ_ｓｐｔａを生成する。方法の一実施形態では、少なくとも１つのトランスデューサーは、処置ゾーンよりもサイズが実質的に大きい高強度直径を有する超音波ビームを生成し、処置ゾーンが完全にビーム内にあるように向けられる。方法の一実施形態では、２つ以上の超音波ビームが経路で交差する場合に、集中処置ゾーンが形成され、集中処置ゾーンは、送信されたエネルギー方向に垂直な約１ｃｍ以上であり、さらに、送信された方向に平行に約１ｃｍ以上である。方法の一実施形態では、各トランスデューサーから処置ゾーンに加えられる音圧は０．１～１０ＭＰａである。方法の一実施形態では、集中超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は１～１０００の間である。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーからの超音波は、処置時間の間継続的に施される。方法の一実施形態では、超音波は、１オン時間単位（ｏｎ ｔｉｍｅ ｕｎｉｔｓ）：９オフ時間単位（ｏｆｆ ｔｉｍｅ ｕｎｉｔｓ）の範囲のデューティーサイクルで生成される。方法の一実施形態では、トランスデューサーは、単一周波数トーンあるいは多周波数チャープの超音波を生成するように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは時間内に連続して動作する。方法の一実施形態では、適用の全過程の間に標的組織と標的組織のまわりの所望の周縁部に送達される総エネルギーは、周辺組織に送達される総エネルギーよりも大きい。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波の周波数が適用中に掃引されるように構成される。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは二次元のフェーズドアレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは環状アレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは三次元のフェーズドアレイを含む。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは１つ以上の内視鏡検査装置に組み込まれる。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは磁気共鳴撮像機械に組み込まれる。

【0040】

方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは放射線療法機械に組み込まれる。

【0041】

方法の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に４５°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。

【0042】

方法の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に５０°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。

【0043】

方法の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に５５°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。

【0044】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵおよび放射線療法はシステムによって施され、上記システムは：ＬＯＦＵ装置を備え：上記ＬＯＦＵ装置は、周波数波形を生成する制御システムと；処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲である、１つ以上のトランスデューサーと；放射線療法機械と；第１の量の超音波と第２の量の放射線治療が被験体に施されるように、ＬＯＦＵ装置および放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、ここで、第１の量と第２の量はともに被験体の腫瘍を処置するのに十分な量である、制御システムとを含む。

【0045】

被験体の腫瘍を処置する方法が提供され、上記方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、（ｉｉ）ある量の化学療法あるいはある量の放射線治療あるいはある量の免疫療法を被験体に施す工程を含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに腫瘍を処置するのに十分な量である。

【0046】

方法の実施形態では、ある量のＬＯＦＵとある量の放射線療法が被験体に施される。方法の別の実施形態では、ある量のＬＯＦＵとある量の放射線療法が被験体に施される。方法の別の実施形態では、ある量のＬＯＦＵとある量の免疫療法が被験体に施される。

【0047】

被験体の腫瘍を処置する方法は、（ｉ）ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と（ｉｉ）ある量の標的抗癌治療を被験体に施す工程を含み、ここで、（ｉ）と（ｉｉ）の量はともに腫瘍を処置するのに十分な量である。一実施形態では、標的治療は、Ｈｅｒ２またはＶＥＧＦＲを対象としたｍＡｂを含む。一実施形態では、標的治療はチロシンキナーゼ阻害剤を含む。

【0048】

被験体の腫瘍の転移を阻害する方法がさらに提供され、上記方法は、ある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）と、ある量の放射線治療を、腫瘍を有する被験体に施す工程を含み、ここで、その量はともに被験体の腫瘍の転移を阻害するのに十分な量である。

【0049】

この方法では、放射線治療は切除型の少分割放射線療法であり得る。

【0050】

好ましくは、この方法では、ＬＯＦＵは被験体の腫瘍の位置に向けられる。

【0051】

被験体の腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効量を低減する方法がさらに提供され、上記方法は、腫瘍を処置するために必要とされる抗癌化学療法の有効量を減らすのに十分な量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、抗癌化学療法を受ける被験体に施す工程を含む。

【0052】

方法の各々の実施形態では、ＬＯＦＵは、化学療法または放射線療法あるいは免疫療法の前に、またはこれらと同時に、被験体に施される。

【0053】

一実施形態では、ＬＯＦＵは、放射線療法が施される前に被験体に施される。

【0054】

抗癌化学療法が施される方法において、一実施形態では、抗癌化学療法は、被験体へのＨＳＰ９０阻害剤の投与を含む。ＨＳＰ９０阻害剤は１７ＡＡＧ（タネスピマイシンあるいは１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシナン）であり得る。一実施形態では、化学療法剤はアルキル化薬である。一実施形態では、化学療法剤はトラベクテジンである。一実施形態では、化学療法剤はマスタードガス誘導体である。一実施形態では、化学療法剤は金属塩である。一実施形態では、化学療法剤は植物アルカロイドである。一実施形態では、化学療法剤は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗薬である。一実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤は化学療法剤ＮＳＡＩＤである。一実施形態では、化学療法剤はタモキシフェンである。一実施形態では、化学療法剤は非ステロイド性の抗アンドロゲン（ＮＳＡＡ）である。一実施形態では、化学療法剤はアパルタミドである。一実施形態では、化学療法剤はホルモン療法を含む。一実施形態では、化学療法剤は以下に列挙された様々な抗悪性腫瘍薬の１つである。

【0055】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵはトランスデューサーを含む超音波機械から超音波ビームによって送達され、上記超音波機械と被験体は、腫瘍の少なくとも一部がトランスデューサーの焦点長さに位置するように配置される。

【0056】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍の少なくとも一部に送達され、腫瘍の位置は画像処理技術によってモニタリングされる。磁気共鳴撮像はこうした画像処理技術であり得る。

【0057】

方法では、ＬＯＦＵは、１時間未満の期間にわたって、腫瘍内の複数の点に少なくとも一回施すことが可能である。

【0058】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは非切除である。

【0059】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは０．５ＭＨｚ～１．５ＭＨｚの周波数で施される。

【0060】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは１．５～３秒間施される。

【0061】

方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイチュ強度が２５０Ｗ／ｃｍ^２～７５０Ｗ／ｃｍ^２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイチュ強度が被験体の１ｍｍ～７５ｍｍの組織深さで２５０Ｗ／ｃｍ^２～７５０Ｗ／ｃｍ^２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイチュ強度が被験体の１ｍｍ～７５ｍｍの組織深さで３５０Ｗ／ｃｍ^２～６５０Ｗ／ｃｍ^２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。方法の一実施形態では、超音波ビームの焦点において、インサイチュ強度が被験体の１ｍｍ～７５ｍｍの組織深さで４５０Ｗ／ｃｍ^２～５５０Ｗ／ｃｍ^２となるように、ＬＯＦＵは超音波ビームによって施される。

【0062】

ＬＯＦＵは腫瘍体積全体にわたって施すことが可能であるか、あるいは腫瘍体積の一部に施すことが可能である。好ましい実施形態では、ＬＯＦＵは腫瘍体積全体にわたって施される。

【0063】

方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、腫瘍を介して１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも５００～５０００ジュールのエネルギーを送達する。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも１０００～４０００ジュールのエネルギーを送達する。方法の一実施形態では、ＬＯＦＵは、腫瘍を介して１ｃｃの腫瘍組織当たり少なくとも２０００～３０００ジュールのエネルギーを送達する。一実施形態では、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）は被験体に施されない。一実施形態では、高密度焦点式超音波は被験体に施されていない。一実施形態では、高密度焦点式超音波は腫瘍に施されていない。

【0064】

ＬＯＦＵが抗癌治療前に被験体に施される一実施形態では、ＬＯＦＵが施された後、および抗癌治療が施される前には、高密度焦点式超音波は被験体に施されない。

【0065】

一実施形態では、放射線治療の量とＬＯＦＵの量の抗癌治療効果は相乗的である。

【0066】

一実施形態では、ＬＯＦＵを施すことは、組織／腫瘍の温度を４０°Ｃ～４５°Ｃに上げる。一実施形態では、ＬＯＦＵを施すこと、組織／腫瘍の温度を４０°Ｃ以下まで上げる。一実施形態では、ＬＯＦＵを施すこと、組織／腫瘍の温度を４５°Ｃ以下まで上げる。一実施形態では、ＬＯＦＵを施すこと、組織／腫瘍の温度を５０°Ｃ以下まで上げる。ＨＩＦＵは一般に、組織の温度をこれ以上上げる。

【0067】

一実施形態では、ＬＯＦＵは０．５～３秒間施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１．５～３秒間施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１００％のデューティーサイクルで施される。一実施形態では、ＬＯＦＵは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、あるいは９０％のデューティーサイクルの別の実施形態の１つで施される。

【0068】

被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させる方法が提供され、上記方法は、抗癌治療の前後、あるいはその最中に、被験体の腫瘍をある量の抗癌治療に感作させるのに効果的なある量の低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）を、被験体に施す工程を含む。一実施形態では、抗癌治療は、化学療法、放射線治療、あるいは免疫療法、あるいは標的治療、または手術を含む。一実施形態では、抗癌治療は化学療法を含む。一実施形態では、抗癌治療は免疫療法を含む。一実施形態では、抗癌治療は放射線治療を含む。一実施形態では、抗癌治療は、例えば、腫瘍を切除するための外科手術を含む。上記方法は被験体に抗癌治療を施す工程をさらに含む場合がある。ある量の抗癌治療に腫瘍を感作させることで、腫瘍を処置に対して影響を受けやすくする。例えば、腫瘍体積の減少などの腫瘍処置を測定することができるパラメーターは、感作された腫瘍に施された所定量の抗癌治療薬に対するものの方が、同じあるいは同等の被験体における同等の質量、血管分布、位置、およびタイプの非感作腫瘍に施される同じ量の抗癌治療薬に対するものと比較してより大きい。一実施形態では、ある量の抗癌治療に被験体の腫瘍を感作するのに効果的なＬＯＦＵの量と抗癌治療は、相乗効果がある。

【0069】

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、被験体は哺乳動物である。一実施形態では、被験体はヒトである。

【0070】

方法で言及される腫瘍は、前立腺、乳房、鼻咽腔、咽頭、肺、硬骨、脳、唾液腺、胃、食道、軟組織、精巣、卵巣、子宮、子宮内膜、肝臓、小腸、虫垂、結腸、直腸、膀胱、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、頚部、膣、外陰、前立腺、甲状腺、または皮膚、頭頸部の腫瘍であるか、神経膠腫、あるいは軟組織肉腫であり得る。一実施形態では、腫瘍は前立腺癌である。一実施形態では、腫瘍は軟組織肉腫である。一実施形態では、原発腫瘍が処置される。一実施形態では、二次腫瘍は処置され、および、例えば、転移または再発性腫瘍を含むことがある。一実施形態では、腫瘍の処置は二次腫瘍の可能性を低減する。一実施形態では、転移は１つ以上の肺転移を含む。

【0071】

用語「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、別段の定めがない限り、新生細胞の増殖を指し、前癌性と癌性の細胞および組織を含む。腫瘍は通常病変またはしこりとして現れる。一実施形態では、腫瘍は悪性新生物である。

【0072】

本明細書で使用される場合、「転移する」（あるいは文法的等価物）とは、癌または腫瘍に関して、被験体の１つの臓器あるいは組織から、最初の臓器あるいは組織から空間的に離れた被験体の別の臓器あるいは組織へと、癌あるいは腫瘍が広がることを意味する。

【0073】

本明細書で使用される場合、腫瘍を「処置する」ことは、疾患の１つ以上の症状、例えば、腫瘍そのもの、腫瘍の血管新生、あるいは疾患が特徴付けられる他のパラメーターが、減少し、改善され、阻害され、緩解の状態に置かれ、あるいは緩解の状態で維持されることを意味する。腫瘍を「処置する」ことはさらに、腫瘍の１つ以上の特徴が処置によって除去され、減らされ、あるいは防がれ得ることを意味する。そのような特徴の非限定的な例は、基底膜と近位の細胞外マトリックスの制御されない分解、内皮細胞の遊走、分裂、および新しい機能的な毛細管への組織化、ならびにそのような機能的な毛細管の存続を含んでいる。一実施形態では、腫瘍を処置することは腫瘍のサイズあるいは体積を減らすことを意味する。

【0074】

本明細書で使用される場合、被験体の腫瘍の「転移を阻害する」ことは、転移性疾患を特徴づける１つ以上の症状あるいは１つ以上の他のパラメーターが低減されるか、改善されるか、または阻害されることを意味する。こうしたパラメーターの非限定的な例は、基底膜と近位の細胞外マトリックスの制御されない分解、遠位か局所である第２の部位における、血流またはリンパ管を通る腫瘍細胞の移動、浸潤、調節異常性の癒着ならびに増殖を含む。一実施形態では、転移を処置することは、発生を低減するか、あるいは転移の進行を阻害することを意味する。

【0075】

放射線療法は当該技術分野で周知である。本明細書に包含されるような放射線治療は、身体外部にある機械により送達される医学治療用放射線（体外照射療法）、癌細胞付近の身体に配される放射性物質から送達される医学治療用放射線（体内照射療法）、または全身放射線治療を含む。本明細書に包含されるような放射線療法は、三次元原体照射治療（３ＤＣＲＴ）、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）、体外照射療法（ＥＢＲＴ）、およびトモセラピーを含む。放射線療法はまた、定位手術的照射または体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）の一部であり得る。当該技術分野で既知の任意の粒子ビームによる送達は、例えば、陽子線治療、炭素イオン治療、あるいは、他の荷電粒子ビームも包含する。

【0076】

一実施形態において、放射線療法は、ＣＴ画像により誘導される。一実施形態において、放射線療法は、少分割コーンビームＣＴ画像誘導放射線療法である。本明細書に記載される様々な要素の全ての組み合わせは、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈により明確に否定されていない限り、本発明の範囲内である。

【0077】

本発明に使用され得る化学療法剤は様々である。化学療法剤の例は、次のものを含む：タモキシフェン；アパルタミド；ホルモン療法薬；アルキル化剤（例えば、トラベクチジン（ｔｒａｂｅｃｔｉｄｉｎ）（（１’Ｒ，６Ｒ，６ａＲ，７Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ）－６’，８，１４－トリヒドロキシ－７’，９－ジメトキシ－４，１０，２３－トリメチル－１９－オキソ－３’，４’，６，７，１２，１３，１４，１６－オクタヒドロスピロ［６，１６－（エピチオプロパノ－オキシメタノ）－７，１３－イミノ－６ａＨ－１，３－ジオキソロ［７，８］イソキノ［３，２－ｂ］［３］ベンザゾシン－２０，１’（２’Ｈ）－イソキノリン１－５－イル アセテート））；マスタードガス誘導体（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、およびイホスファミド）；エチレンイミン（例えば、チオテパおよびヘキサメチルメラミン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；ヒドラジンおよびトリアジン（例えば、アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびテモゾロミド）；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）；金属塩（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）；植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、エトポシドおよびテニポシドなどのポドフィロトキシン、イリノテカンおよびトポテカンなどのカンプトテカン類似体（トポイソメラーゼ阻害剤））；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン：ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、およびイダルビシン；クロモマイシン：ダクチノマイシンおよびプリカマイシン；マイトマイシンおよびブレオマイシンなどの様々なもの）；代謝拮抗薬（例えば、葉酸桔抗体：メトトレキサート；ピリミジンアンタゴニスト：５－フルオロウラシル、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリンアンタゴニスト：６－メルカプトプリンおよび６－チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤：クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、およびペントスタチン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン；アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド）；プロテアソーム（ｐｒｏｔｅｓｏｍａｌ）阻害剤；化学療法用のＮＳＡＩＤ；および、その他の抗腫瘍薬（例えば、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤：）ヒドロキシ尿素；副腎皮質ステロイド阻害剤：ミトタン；酵素：アスパラギナーゼとペグアスパラガーゼ；微小管阻害薬（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｇｅｎｔ）：エストラムスチン；レチノイド：ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）。

【0078】

細胞中の小胞体（ＥＲ）ストレスおよび／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を引き起こす化学療法剤が、当該技術分野で知られている。例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）；以前はＰＳ－３４１として知られていた）は、ＥＲストレス応答を誘発する。また、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブは、ＵＰＲを誘発する。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ＥＲストレス応答を誘発する。化学療法用のＮＳＡＩＤ（例えば、インドメタシン、ジクロフェナク、およびセレコキシブ）は、ＥＲストレス応答を誘発することができ、ＵＰＲを誘発することができる。エストロゲン受容体α阻害剤、ＢＨＰＩ（１，３－ジヒドロ－３，３－ビス（４－ヒドロキシフェニル）－７－メチル－２Ｈ－インドール－２－オン）は、ＵＰＲを活性化することができる。白金含有抗癌剤：シスプラチンは、ＥＲストレス応答を誘発すると知られている。薬物のタキサンファミリー：パクリタキセルは、ＥＲストレス応答を誘発すると知られている。ドキソルビシンなどのアントラサイクリンは、ＥＲストレスを誘発すると知られている。シクロホスファミドはＥＲストレスを誘発すると知られている。また、引用により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １２：７０３－７１９ （Ｓｅｐｔ．， ２０１３）の表２も参照されたい。

【0079】

小胞体（ＥＲ）は、分泌された膜結合型タンパク質およびいくつかの小器官標的化タンパク質の合成ならびにフォールディングの部位である。ＥＲは、細胞エネルギーレベル、レドックス状態、またはＣａ^２＋濃度を乱すストレスに対して、非常に敏感である。そのようなストレスは、ＥＲのタンパク質フォールディング能力を低減し、これにより、折り畳まれていないタンパク質の蓄積および凝集、および／または、ＥＲにおける内在および輸送タンパク質の負荷と、その負荷を処理する小器官の能力との間の不均衡を、結果としてもたらす場合がある。この条件は、本明細書および当該技術分野において「ＥＲストレス」と呼ばれる。ＥＲストレス応答は、タンパク質合成の全体的な減衰、および／または、タンパク質フォールディングを増強するＥＲのシャペロン、酵素、および構造成分のアップレギュレーションを介して、折り畳まれていないタンパク質の負荷を軽減することにより、細胞の修復および持続した生存を促進することができる。この応答は総じて、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）と名付けられる。折り畳まれていないタンパク質の蓄積は、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、およびＩＲＥ１からのＧＲＰ７８の解離を引き起こし、それによりＵＰＲを起こす。

【0080】

【表1-1】

【0081】

【表1-2】

【0082】

【表1-3】

【0083】

【表1-4】

【0084】

【表2】

【0085】

ＨＳＰ標的薬剤は、例えば、抗体あるいは標的タンパク質を含むことがある。

【0086】

いくつかの実施形態において、例示的なアゴニスト（活性化抗体）は、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２７、および抗ＯＸ４０である。

【0087】

いくつかの実施形態において、例示的なアンタゴニスト（阻害または遮断抗体）は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＶＩＳＴＡ、および抗ＴＩＭ３である。

【0088】

いくつかの実施形態において、例示的なアジュバントは、ＳＴＩＮＧＬ、ＲＩＧＩヘリックス阻害剤、ＣｐＧオリーブ、およびＴＬＲアゴニストである。

【0089】

いくつかの実施形態において、例示的なサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＩＦＮγである。

【0090】

方法の実施形態において、化学療法剤はＨＳＰ９０阻害剤である。ＨＳＰ９０阻害剤の一例は、１７ＡＡＧ（タネスピマイシンあるいは１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシナン）である。一実施形態では、化学療法剤はアルキル化薬である。一実施形態では、化学療法剤はトラベクテジンである。一実施形態では、化学療法剤はマスタードガス誘導体である。一実施形態では、化学療法剤は金属塩である。一実施形態では、化学療法剤は植物アルカロイドである。一実施形態では、化学療法剤は抗腫瘍抗生物質である。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗薬である。一実施形態では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。一実施形態では、化学療法剤は化学療法剤ＮＳＡＩＤである。一実施形態では、化学療法剤は、上記に列挙された様々な抗悪性腫瘍薬のうちの１つである。

【0091】

本発明により包含される化学療法剤または薬剤の他の非限定的な例は、他に明言されない限り、アントラサイクリン、マイタンシノイド、アルキル化剤、抗代謝物質、植物アルカロイドまたはテルペノイド、および細胞毒性抗生物質を含む。一実施形態において、化学療法剤は、シクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、白金薬剤（シスプラチン）、フルオロウラシル、ビンクリスチン、メトトレキサート、タキソール、エピルビシン、ロイコボリン（フォリン酸）、またはイリノテカンである。

【0092】

本明細書に包含される抗腫瘍免疫療法は、（ｉ）癌に関連する生体分子標的に高親和性で結合する、モノクローナル抗体（裸の抗体、化学複合抗体、放射複合抗体、または毒素複合の抗体、および二重特異性抗体）、その関連する抗原結合性フラグメント、例えば、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントで構成されたフラグメント；（ｉｉ）腫瘍細胞および腫瘍細胞抗原に関して非特異性のもの；抗腫瘍免疫療法、例えば、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、リガンドおよびアゴニスト、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、ＴＮＦ－β、抗Ｔｉｅ２、有機小分子（例えば、１，５００ダルトン以下）あるいはサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合する他の薬物；および、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ならびに、免疫応答を標的とする他の有機小分子、ペプチドおよびアプタマーのいずれかを含むがこれらに限定されないチェックポイントを標的とする物質を含む。一実施形態において、本明細書に使用されるような免疫療法は、細菌ベースの抗癌性免疫療法または抗腫瘍免疫療法を除外する。１つの実施形態において、本明細書に使用されるような免疫療法は、リステリア菌ベースの免疫療法を除外する。

【0093】

一実施形態において、処置の効果の増大は、効果を増大させる方法が適用されない状態で同じ量の処置（例えば、所与の処置用量）で達成された範囲に対する、達成された治療効果の範囲の増大を意味する。

【0094】

音響刺激治療装置がさらに提供され、上記装置は：周波数波形を生成する制御システムと：処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーと、を含み、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲であり、任意のビームのメカニカルインデックスは４未満である。

【0095】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．０５～５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の音響出力強度を有する周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。

【0096】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーの各々は、０．５～１．５ＭＨｚの範囲の中心周波数と、２０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の音響出力強度を有する周波数波形に基づいて超音波ビームを生成するように構成される。

【0097】

装置の一実施形態では、各トランスデューサーは、－３ｄＢのビームプロファイル・ウエストが処置ゾーンで５ｍｍ以上となるように、円柱状の超音波を生成するように構成される。

【0098】

装置の一実施形態では、１つ以上のビームは処置中に機械的に移動する。

【0099】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、連続的にあるいは同時に動作し、処置期間中に処置ゾーンで平均空間ピーク２５０Ｗ／ｃｍ^２未満の超音波を生成するように構成された、２つ以上のトランスデューサーを含む。

【0100】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、１０ｋＨｚ～３００ｋＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。

【0101】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚ～３ＭＨｚの範囲内の周波数を有する超音波を生成するように構成される。

【0102】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、３００ｋＨｚ３ＭＨｚの周波数で動作し、１つ以上のトランスデューサーは３０～３００ｋＨｚの周波数で動作する。

【0103】

装置の一実施形態では、２つ以上の超音波トランスデューサーは処置ゾーンを通る超音波ビームを生成し、各ビームは１０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。

【0104】

装置の一実施形態では、処置時間は１立方センチメートル腫瘍の当たり５秒未満である。

【0105】

装置の一実施形態では、２つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは５０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。

【0106】

装置の一実施形態では、３つのトランスデューサーは、処置ゾーンを通る超音波ビームを生成し、各ビームは５０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。

【0107】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーン内で互いに実質的に同相である超音波ビームを生成する。

【0108】

装置の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる２つの超音波ビームは、実質的に同相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは７０～１００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１～５秒施される。

【0109】

装置の一実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから発せられる３つの超音波ビームは、実質的に同相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは５０～７０Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１～５秒間施される。

【0110】

装置の一実施形態では、別個のトランスデューサーから生じる超音波ビームはそれぞれ、処置ゾーンで約１００～１０００Ｗ／ｃｍ^２の範囲のＩ_ｓｐｔａを生成する。

【0111】

装置の一実施形態では、少なくとも１つのトランスデューサーは、処置ゾーンよりもサイズが実質的に大きい高強度直径を有する超音波ビームを生成し、処置ゾーンが完全にビーム内にあるように向けられる。

【0112】

装置の一実施形態では、２つ以上の超音波ビームが経路で交差する場合に、集中処置ゾーンが形成され、集中処置ゾーンは、送信されたエネルギー方向に垂直な約１ｃｍ以上であり、さらに、送信された方向に平行に約１ｃｍ以上である。

【0113】

装置の一実施形態では、各トランスデューサーから処置ゾーンに加えられる音圧は０．１～１０ＭＰａである。

【0114】

装置の一実施形態では、集中超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は１～１０００の間である。

【0115】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーからの超音波は、処置時間の間継続的に施される。

【0116】

装置の一実施形態では、超音波は、１オン時間単位から、０～９のオフ時間単位までの範囲のデューティーサイクルで生成される。

【0117】

装置の一実施形態では、トランスデューサーは、単一周波数トーンあるいは多周波数チャープの超音波を生成するように構成される。

【0118】

装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは時間内に連続して動作する。

【0119】

装置の一実施形態では、適用の全過程の間に標的組織と標的組織のまわりの所望の周縁部に送達される総エネルギーは、周辺組織に送達される総エネルギーよりも大きい。方法の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは、超音波の周波数が適用中に掃引されるように構成される。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは二次元のフェーズドアレイを含む。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは環状アレイを含む。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは三次元のフェーズドアレイを含む。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは１つ以上の内視鏡検査装置に組み込まれる。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは磁気共鳴撮像機械に組み込まれる。装置の一実施形態では、１つ以上のトランスデューサーは放射線療法機械に組み込まれる。

【0120】

装置の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に４５°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。装置の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に５０°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。

【0121】

装置の一実施形態では、超音波が約２秒以下にわたって処置ゾーンに施される場合、１つ以上のトランスデューサーは、処置ゾーンで到達した最高温度が処置の間に５５°Ｃ未満となるように、超音波を生成するように構成される。

【0122】

システムがさらに提供され、上記システムは：音響刺激治療装置を含み、上記音響刺激治療装置は：周波数波形を生成する制御システムと；処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲である、１つ以上のトランスデューサーと；放射線療法機械と；第１の量の超音波と第２の量の放射線治療が被験体に施されるように、音響刺激治療装置と放射線療法機械を制御するように動作可能に構成された制御システムであって、ここで、第１の量と第２の量はともに被験体の腫瘍を処置するのに十分な量である、制御システムとを含む。

【0123】

システムがされに提供され、上記システムは：音響刺激治療装置を含み、上記音響刺激治療装置は：周波数波形を生成する制御システムと；処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲である、１つ以上のトランスデューサーとを含み、上記音響刺激治療装置は、第１の量の超音波および第２の量の化学療法が被験体に施されるように、化学療法と組み合わせて使用され、ここで、第１および第２の量はともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分な量である。

【0124】

システムがされに提供され、上記システムは：音響刺激治療装置を含み、上記音響刺激治療装置は：周波数波形を生成する制御システムと；処置領域における１～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均音響出力強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の周波数波形に基づいて超音波を生成するように構成された１つ以上のトランスデューサーであって、ここで、超音波は０．５～５秒の範囲の時間にわたって処置ゾーンへと連続的に適用され、および、超音波周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲である、１つ以上のトランスデューサーと；音響刺激治療装置は、第１の量の超音波および第２の量の免疫療法が被験体に施されるように、免疫療法と組み合わせて使用され、ここで、第１および第２の量はともに、被験体の腫瘍を処置するのに十分な量である。

【0125】

＜実施例１＞
Ｂ１６メラノーマ腫瘍は、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの生成を抑制する。メラノーマ細胞がどのようにして、腫瘍により誘発されたエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞応答を調節するのかを判定するために、３つの異なるマウスモデルを使用した。最初に、腰椎の側腹部にＢ１６細胞を皮下注射することにより、Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスにおいてＢ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍を誘発させた。腫瘍を７～８ｍｍの大きさに成長させ、その後、同側の鼠径流入領域リンパ節（ＤＬＮ）と遠位の対側の非流入領域頚リンパ節（ＮＤＬＮ）の両方からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞も、任意の腫瘍を抱いていなかった対照マウスから得た。腫瘍ＤＬＮから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いてエクスビボで刺激された場合、同じマウスの遠位の対側のＮＤＬＮから単離された細胞あるいは対照腫瘍がないマウスのリンパ節から単離された細胞よりも有意に少ないＩＬ－２を生産した。ＩＦＮγについても、類似しているが、あまり明白でない効果が観察された（図１のＡおよびＢ）。

【0126】

これらのデータを確認するために、代理腫瘍抗原としてＯＶＡを発現させるように安定してトランスフェクトされた、Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ細胞株を使用した。これら細胞を、ＯＴ－ＩＩマウス、ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを認識する、トランスジェニックＭＨＣクラスＩＩ制限ＴＣＲを発現するＴ細胞を有するマウスに皮下注射した。記載される通りにこれらのマウスからＴ細胞を採取して、ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを負荷した脾細胞を使用してエキソビボで刺激した。再度生成された同側のＤＬＮからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、対側のＮＤＬＮまたは腫瘍がないマウスからの細胞と比較して、ＩＬ－２およびＩＦＮγの量を著しく減少させた（図１のＣおよびＤ）。

【0127】

これらの結果は、Ｔｙｒｐ１マウスを使用した第３のモデルにおいてさらに確証され、このマウスは、チロシナーゼ関連タンパク質１が不足しており、かつ、この内因性のメラノサイト分化抗原のＴＲＰ－１１１３－１２７ペプチドに特異的なＭＨＣクラスＩＩ制限ＴＣＲを発現するＴ細胞を有している。それらマウスにＢ１６－Ｆ１細胞を注入した。前の２つのモデルのように、同側のＤＬＮから採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの生成は、対側のＮＤＬＮまたは腫瘍がないマウスから採取された細胞と比較して著しく減少した。（図１のＥおよびＦ）。総じて、これらの結果は、メラノーマ腫瘍が、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の低応答性を誘発し、このことは、再刺激後にエフェクターサイトカインを生成する能力の減少を結果としてもたらす。

【0128】

ＬＯＦＵによる原発性Ｂ１６メラノーマの処置は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における腫瘍誘導耐性を克服し：ＨＩＦＵは、腫瘍組織内部で高度の熱量を生成して、凝固壊死を引き起こすことにより、腫瘍アブレーションを優勢的に引き起こすために現在使用されている。ＨＩＦＵは、局所の腫瘍管理を達成するための非常に有効で非侵襲的な切除手順ではあるが、脈管構造と組織の下部構造をほぼ一瞬にして破壊し、それにより、抗原の提示および認識のための樹状細胞および免疫細胞の浸潤を制限する。ＬＯＦＵを施すことが、新しい腫瘍抗原を生成する腫瘍組織内で非致死性の熱的／機械的ストレスを誘発し、および／または、腫瘍の免疫原性を増大させ、かつＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍により誘発された耐性を克服することができる、ストレス誘発性タンパク質の発現を誘発するか否かを調べた。この可能性を調べるために、Ｃ５７Ｂｌ／７Ｊマウスの別個の群上で成長した原発性Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ腫瘍を、未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。ＬＯＦＵ処置の３６時間後、ＤＬＮおよびＮＤＬＮ内在ＣＤ４＋Ｔ細胞を、マウスの両方の群から単離して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いてエキソビボで再刺激した。有意により多く生成された、ＬＯＦＵで処置されたマウスのＤＬＮからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍が未処置のままのマウスの群から得た細胞と比較して、有意により多くのＩＬ－２を生成した。対照的に、対応するＮＤＬＮからのＴ細胞は、処置済みおよび未処置のマウスにおいて同等量のＩＬ－２を生成した（図２のＡ）。これら同じマウスの実験群のＩＦＮγの生成について、類似するがあまり明白でない効果が観察された（図２のＢ）。全体として、これら結果は、Ｂ１６メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置がＣＤ４＋Ｔ細胞を支持して、メラノーマ腫瘍微小環境により誘発される低応答性の状態を克服するように思われ、このことは、活性化の改善と、腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容の減少とを示唆していることを示す。

【0129】

メラノーマ腫瘍は、タンパク質のセットを産生する遺伝子発現のＮＦＡＴ１依存プログラム誘導することができ、それはＴＣＲシグナル伝達に干渉し、サイトカインの発現を直接阻害し、ＣＤ４＋Ｔ細胞における官能性アネルギーの確立をもたらす。ＬＯＦＵ処置が、アネルギー誘導を妨げることにより腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容を阻害し、ＬＯＦＵでの処置後にＤＬＮ内在ＣＤ４＋Ｔ細胞において観察されたサイトカイン発現の増大の原因となり得る可能性を判定するために、Ｂ１６腫瘍を有するマウスのＤＬＮから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギー関連遺伝子の発現を最初にモニタリングし、同じマウスのＮＤＬＮから採取したＴ細胞における遺伝子の発現と比較した。担癌マウスのＤＬＮからのＴ細胞は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＧｒａｉｌ、Ｃｂｌ－ｂ、およびＩｔｃ、ならびに転写因子Ｅｇｒ２を含む、より高レベルのアネルギー関連遺伝子を発現させた（図２のＣ）。しかし、Ｆｏｘｐ３の発現の差は、担癌マウスのＤＬＮおよびＮＤＬＮ Ｔ細胞の間では観察されず、このことは、調節性Ｔ細胞の存在の増加が、この研究に使用される条件下でＣＤ４＋Ｔ細胞応答の減少に起因する可能性が低いことを示唆している（図２のＣ）。

【0130】

その後、ＬＯＦＵによるＢ１６メラノーマの処置が、Ｔ細胞におけるそれらのアネルギー関連遺伝子の発現に対して効果があるか否かを判定した。内因性の腫瘍抗原により誘発された応答を評価するために、Ｔｙｒｐ１マウス上で成長するＢ１６腫瘍を、未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＤＬＮおよびＮＤＬＮから単離し、様々なアネルギー関連遺伝子の発現を評価した。ＤＬＮ由来のＴ細胞は、Ｇｒａｉｌ、Ｉｔｃｈ、およびＣｂｌｂ、ならびに、転写因子Ｅｇｒ２およびＧｒｇ４、ならびにプロテアーゼＣａｓｐａｓｅ３を含む、分析された７つのアネルギー遺伝子のうち６つのアネルギー遺伝子のアップレギュレーションの程度が様々であることを示した（図２のＤ）。様々なインビトロおよびインビボのＴ細胞アネルギーモデルにおいてもアップレギュレートされる、別の転写因子（Ｉｋａｒｏｓ）は、腫瘍により誘発されたアネルギーのこのメラノーマモデルにおいては有意にアップレギュレートされず、そのレベルは、ＤＬＮおよびＮＤＬＮ由来のＴ細胞の両方においてほぼ同じのままであった（図２のＤ）。興味深いことに、腫瘍をＬＯＦＵで処置すると、ＤＬＮから単離されたＴ細胞におけるそれらの遺伝子のうち５つ（Ｇｒａｉｌ、Ｉｔｃｈ、Ｃｂｌｂ、Ｅｇｒ２、およびＧｒｇ４）の発現はアップレギュレートされず、ＮＤＬＮにおけるこれらの遺伝子の発現に匹敵するレベルを示し（図２のＤ）、このことは、ＬＯＦＵ処置が、腫瘍抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギー誘発性遺伝子の発現の誘発を阻害したことを支持している。

【0131】

ＬＯＦＵで処置されたメラノーマ腫瘍は、アネルギーの腫瘍抗原特異性Ｔ細胞を再活性化することができ：この結果は、腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容がＬＯＦＵ処置後に克服され得ることを支持していた。この観察は、様々なアネルギー関連遺伝子の発現が腫瘍部位のＬＯＦＵ処置後に腫瘍ＤＬＮ由来のＴ細胞において減少し、その一方で、活性化により誘発されたサイトカイン発現が、遠位のＮＤＬＮから単離されたＴ細胞、または対照の腫瘍がないマウスから単離されたＴ細胞において検出されたものに近いレベルにまで回復されたという事実により、実証された。

【0132】

ＬＯＦＵは、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞アネルギーの誘導を妨げるだけでなく、確立されたアネルギーを逆転し、以前に寛容化されたＴ細胞における生産的なエフェクター応答を生成するか否かについて調査した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｙｒｐ１マウスの脾臓とリンパ節から単離し、インビトロでＴＨ１細胞に分化し、かつ、共刺激の無い状態で抗ＣＤ３抗体を用いた部分的な刺激を介してこれらを活性化することにより、アネルギー化した。Ｔ細胞は低応答性になり、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の抗体での再刺激後にＩＬ－２生成の深刻な減少を示した（図３のＡ）。その後、これらアネルギー性細胞を、未処置のメラノーマ腫瘍またはＬＯＦＵで処置されたメラノーマ腫瘍の何れかに由来する溶解物を負荷したＣＤ１１ｃ＋樹状細胞で再活性化させた。未処置のＢ１６－Ｆ１メラノーマ由来の腫瘍溶解物を負荷した樹状細胞で刺激したアネルギー性Ｔｙｒｐ１ Ｔ細胞は、ごく少量のＩＬ－２を生成した。しかし、ＬＯＦＵで処置した腫瘍から調製した腫瘍溶解物を樹状細胞に負荷すると、以前にアネルギー化されたＴ細胞は、未処置の溶解物で活性化されたもの有意により多くのＩＬ－２を生成した（図３のＢ）。これらの結果は、メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置が免疫原分子の生成をもたらし、これにより、樹状細胞が、耐性を破ることができる活性化シグナルを送達することを可能にし、そうでなければ、アネルギー性Ｔ細胞が抗原との再遭遇に対して応答し、かつ生産的な応答を生成することを可能にすることを示す。

【0133】

ＬＯＦＵによるメラノーマの処置は、メラノーマ腫瘍細胞における分子シャペロンカルレティキュリンおよびＨｓｐ７０の発現と細胞内分布の変化を誘発し：樹状細胞によるメラノーマ特異的Ｔ細胞の活性化は、それらの運命を決定するのに重要な事象である。エフェクターＴ細胞応答を誘発することができる優れた抗原提示事象は、寛容原性の刺激を伝える樹状細胞の活性化状態に大きく依存する。結果は、ＬＯＦＵでのメラノーマ腫瘍の処置が、腫瘍により誘発されたＴ細胞寛容の妨害の結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の増大をもたらしたことを示す。このことは、より多くの免疫原性の樹状細胞集団の生成に潜在的に起因し得る。Ｔ細胞へと効率的に提示される抗原の樹状細胞の能力に対するＬＯＦＵの効果を試験するために、担癌マウスのＤＬＮ由来の全細胞を最初に分離し、処置しないか、またはＬＯＦＵで処置し、免疫染色して、フローサイトメトリーによりＣＤ１１ｃ＋樹状細胞集団上でのＢ７．１、Ｂ７．２、およびＭＨＣＩＩの発現を測定した。ＬＯＦＵで処置されたマウスにおけるこれらのタンパク質の発現の著しい増強は、検出されなかった（図４のＡ）。

【0134】

カルレティキュリンおよびＨｓｐ７０を含む分子シャペロンによる腫瘍抗原の輸送も、Ｔ細胞に対する抗原の後の生産的な提示に重要である。インビボおよびインビトロの両方の方法を利用して、未処置のＢ１６メラノーマ腫瘍およびＬＯＦＵで処置されたＢ１６メラノーマ腫瘍における膜のカルレティキュリンおよびＨｓｐ７０を検出した。未処置のままの腫瘍あるいはＬＯＦＵで処置された腫瘍のいずれかを担癌マウスから採取し、単個細胞浮遊液にして、生／死のマーカーで染色して、細胞の生存率を評価した。ＬＯＦＵ処置に応じた細胞の生存率の差異は観察されず、このことは、ＦＵＳの低エネルギー形態が腫瘍細胞死を直接誘発していなかったという考えを支持している（図４のＢ）。Ｂ１６メラノーマ腫瘍を未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵ処置に曝して、腫瘍組織切片をスライド上に置いた。免疫蛍光による後の検出のために、スライドを抗Ｈｓｐ７０抗体または抗カルレティキュリン抗体で染色した。ＬＯＦＵで処置したメラノーマの免疫蛍光分析により、ＬＯＦＵがＨｓｐ７０の発現の増加を誘発したことが確認された（図４のＣ）。興味深いことに、未処置の細胞と比較すると、ＬＯＦＵで処置した細胞も、Ｂ１６細胞上の原形質膜の不連続部位に蓄積するように思われる、カルレティキュリン分布の変化を示した（図４Ｃ）。Ｈｓｐ７０発現の増大も、このタンパク質の膜における存在の増大と相互に関連したか否かを判定するために、非透過性のＣＤ４５－ＴＲＰ－１＋Ｂ１６メラノーマ細胞をＨｓｐ７０について染色し、ＬＯＦＵ処置後の細胞表面発現をＦＡＣＳにより評価した。この分析により、Ｂ１６メラノーマのＬＯＦＵ処置が腫瘍細胞におけるＨｓｐ－７０の膜の存在の増大を引き起こしたことが確認された（図４のＤ）。

【0135】

メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置は、より強力なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するために、樹状細胞を媒介とした腫瘍抗原提示を強化し：腫瘍のＬＯＦＵ処置が、内在する樹状細胞の刺激能の増大を結果としてもたらし得る可能性を判定するために、ＬＯＦＵで処置した腫瘍から調製した溶解物が、抗原特異性Ｔ細胞の増大した刺激を誘発して、より強固なエフェクター応答を引き起こすのか否かを直接試験した。この実験のために、Ｂ１６－Ｆ１－ＯＶＡメラノーマ細胞を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍を誘発した。未処置の腫瘍およびＬＯＦＵで処置された腫瘍から溶解物を調製した。脾臓樹状細胞、およびレスポンダーナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、それぞれＣ５７ＢＬ／６とＯＴ－ＩＩの腫瘍がないマウスから単離して、上述の異なる腫瘍溶解物の存在下で、あるいは不在下で共培養した。腫瘍溶解物を含有するＯＶＡは、レスポンダーＴ細胞を刺激するために腫瘍抗原のソースとして機能し得るが、外因性のＯＶＡ３２３－３３９ペプチドも追加して、全ての条件下でこのペプチドを有する樹状細胞の均一な負荷を確保して、異なる腫瘍溶解物の寛容原性または活性化の性質をより正確に判定した。

【0136】

対照のレスポンダーＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞は、ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを負荷した樹状細胞での活性化後、高レベルのＩＬ－２生成を伴う強力な応答を示した。しかし、外因性のＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを培養物に加えたとしても、未処置の腫瘍から得た溶解物は、ＯＴ－ＩＩ応答を著しく阻害し、結果としてＩＬ－２生成の深刻な減少をもたらした（図５Ａ）。興味深いことに、未処置の溶解物とは反対に、ＬＯＦＵで処置された腫瘍由来の溶解物は、ＯＶＡ３２３－３３９に対するＯＴ－ＩＩ細胞の応答に対する負の効果を持たないだけでなく、外因性のペプチドが無い状態でさえもＯＴ－ＩＩレスポンダーＴ細胞の強力な活性化を誘発することができる（図５のＡ）。これらの結果は、Ｂ１６メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置が、腫瘍内微小環境において通常生じる樹状細胞のＴ細胞刺激能力に対する負の効果を妨げるという観察の更なる支持を広げた。

【0137】

次に、腫瘍ＤＬＮの内在する抗原提示細胞が、メラノーマ腫瘍のＬＯＦＵ処置後の標的Ｔ細胞の活性化において、機能的に更に効果的であるか否かを判定した。その効果に対し、Ｂ１６－Ｆ１メラノーマをＣ５７ＢＬ／６マウスに誘発させ、未処置のままにするか、あるいはＬＯＦＵで処置した。ＤＬＮ細胞懸濁液はＴ細胞が枯渇しており、そのＤＬＮ細胞懸濁液を使用して、腫瘍抗原特異生Ｔ細胞を活性化する能力およびＤＬＮ抗原提示細胞を試験した。したがって、Ｔ細胞が枯渇したＤＬＮ細胞を、ナイーブＴｙｒｐ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＢ１６のインビトロの培養物から調製した溶解物と共に、２４時間共培養した。ＩＬ－２生成をＥＬＩＳＡにより測定し、レスポンダーＴ細胞の刺激をモニタリングした。ＬＯＦＵで処置した腫瘍を有するマウスのＤＬＮから単離した細胞は、未処置のマウスから単離した細胞と比較して、Ｔｙｒｐ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する能力が著しく増大したことを示した。（図５のＢ）。これらのデータは、Ｂ１６メラノーマのＬＯＦＵ処置が、腫瘍抗原レスポンダーＴ細胞の活性化において機能的に更に効果的である抗原提示細胞の生成を結果としてもたらすことを支持している。

【0138】

ＬＯＦＵ、続く少分割ＩＧＲＴによる腫瘍アブレーションの結果、原発性メラノーマ病変のＴ細胞を媒介とした制御の増強をもたらし：ＬＯＦＵ治療が腫瘍免疫原性を調節し、かつ抗腫瘍免疫応答を増強することができるという観察の結果を更に判定するために、原発腫瘍制御を評価する一連のインビボの処置の戦略は、右の背側後肢において皮下に位置する確立されたＢ１６－Ｍ１腫瘍を有するマウス１匹当たり、毎日の１０Ｇｙの少分割ＩＧＲＴから３０Ｇｙの全線量までを使用する腫瘍アブレーションを伴うまたは伴わないＬＯＦＵの組み合わせを用いて実行された。腫瘍体積が～５０ｍｍ^３に到達した時に、全てのマウスで処置を開始した。その後、各群における腫瘍体積を、６２日までの間、週３回測定した（図７のＡ）。未処置のＣ５７ＢＬ／６、またはＬＯＦＵのみで処置されたマウスが、急速な原発腫瘍増殖を経験し続け、処置の１０日以内に≧３００ｍｍ^３の体積に到達し、その時点で、膝下の切断（ＢＫＡ）を行った（図７のＡ）。対照的に、少分割ＩＧＲＴまたはＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群内のマウスは、処置後最大３週間にわたって有意な成長の遅れを経験し、その後、ＩＧＲＴのみで処置されたマウスは原発腫瘍の再成長を示し始め、およそ５週間で≧３００ｍｍ^３の体積に到達した。注目すべきことは、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ群中のマウスは持続した応答を有しており、処置後６週間以上にわたり腫瘍増殖は制限されていた。ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴまたはＩＧＲＴを受ける群における腫瘍体積の減少は、未処置の群またはＬＯＦＵのみの群と比較して、２５日目まで統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。さらに、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群における腫瘍体積の減少は、ＩＧＲＴのみと比較して、３５日目まで統計的に有意であり、実験期間にわたって統計的に有意なままであった（Ｐ＜０．０５）。（図７のＡ）。加えて、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群中のマウスは、ベースライン測定値からの腫瘍の退行を実証し、完全な腫瘍のない応答を、５匹のマウスのうち４匹で確認した。

【0139】

ＬＯＦＵの免疫調整効果を確証するために、同様の実験を、免疫無防備状態のＢＡＬＢ／ｃヌードモデルを使用して行った。これらのマウスにおいて、Ｂ１６－Ｍ１腫瘍は非常に急速に成長し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスよりもおよそ１週間早く≧３００ｍｍ^３に到達する。全体的な処置応答は類似し、未処置およびＬＯＦＵのみは有意な原発性腫瘍制御をもたらさないが、ＩＧＲＴおよびＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴは、原発性腫瘍増殖を遅らせた（図７のＢ）。しかし、ＩＧＲＴとＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ処置の両方において、一次制御は一時的なものであった。実際、ＢＫＡは、ＩＧＲＴ群では処置の開始後２週間未満に必要であり、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの群では３週間未満に必要であった。加えて、免疫無防備状態のマウスにおけるＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴは、ＩＧＲＴのみと比較すると、統計的に有意な原発性腫瘍の制御をもたらさなかった（図７のＢ）。

【0140】

ＬＯＦＵ、その後の少分割ＩＧＲＴの結果、無再発生存期間の延長、および肺転移の減少がもたらされ：データに基づき、ＬＯＦＵで誘発された、増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答は、治療的なＩＧＲＴを増大させる場合があり、局所疾患だけでなく、微視的病変および遠隔転移のより優れた制御を達成する。Ｂ１６－Ｆ１０は、処置されない場合に許容できないサイズへと急速に成長する活動的な細胞株であるため、＞３００ｍｍ^３の原発腫瘍を持つマウスは、ＢＫＡを必要とした。注目すべきことに、ＢＫＡが行われるまでに、原発腫瘍由来の細胞は既に排出膝窩のＬＮへと広がっていた（データは示さず）。その後数週間以内に、排出膝窩（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｐｏｐｌｉｔｅａｌ）のＬＮは急速に成長し、眼に見えて大きくなった一方で、より遠位の鼠径のＬＮは明らかに触知可能となった。腫瘍がこの点に到達すると、不快感を緩和するために実行され得る手順は無く、これらのマウスを屠殺した。結果的に、全生存は、大量の全身腫瘍組織量を有するマウスにおいて十分に査定することができない。それゆえ、２つの他のパラメーター：過度の局所再発の腫瘍負荷を有する、自然死したまたは屠殺した動物が正の事象として記録される、無再発生存期間と；肺転移の進行とを評価することが決定された。

【0141】

ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴの組み合わせは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける何れかのみの処置と比べて、統計的に有意な（Ｐ＝０．０４）無再発生存期間の利点をもたらした（図７のＣ）。特に、Ｃ５７ＢＬ／６ ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴ以外の全ての群において、排出膝窩または鼠径のＬＮへの局所転移は頻繁に、屠殺を用いることを必要とした。さらに、ＬＯＦＵ＋ＩＧＲＴで処置されたマウスは、肺転移の厳密な制御を示したが、他の３つの群においては、比較的小さな局所再発を伴う動物でさえ、圧倒的な肺転移により最終的に死亡した（図７のＤ）。

【0142】

マウス：６－８週齢のＣ５７ＢＬ／６、Ｂ６．Ｃｇ－Ｒａｇ１ ｔｍ１ＭｏｍＴｙｒｐ１Ｂ－ｗＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）９Ｒｅｓｔ／Ｊ （Ｔｙｒｐ１）およびＢ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５Ｃｂｎ／Ｊ （０Ｔ－ＩＩ）のマウス菌株を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＢＡＬＢｃ／ヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒを経由して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。マウスを全て収容し、病原体のない設備で維持した。

【0143】

Ｂ１６細胞株および原発性ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養：Ｂ１６－Ｆ１およびＢ１６－Ｆ１０のメラノーマ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）から購入した。確立された原発腫瘍の外科切除の６週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて生じた転移性クローンを単離し、拡張することにより、Ｂ１６－Ｆ１０（Ｂ１６－Ｍ１）の高度に活動的なサブクローンを生成した。Ｂ１６－ＯＶＡメラノーマ細胞株は、親切にもＥ．Ｍ． Ｌｏｒｄ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）から提供された。Ｂ１６－ＯＶＡ細胞によるＯＶＡの発現を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。全てのメラノーマ細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、および２５０ＩＵのペニシリン／ストレプトマイシンで補われたＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養した。

【0144】

製造業者のプロトコルに従って、抗ＣＤ４結合磁気のＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。本明細書で示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、マウスＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＩＬ－４抗体（クローン１１Ｃ．１１；１０μｇ／ｍｌ）、および１０Ｕ／ｍＬの組み換え型ヒトＩＬ－２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の存在下で、プレート結合（ｐｌａｔｅ－ｂｏｕｎｄ）抗ＣＤ３Σ（クローン２Ｃ１１；０．２５ｇ

【0145】

【数1】

）および抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；０．２５ｇ／ｍＬ）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での活性化によりＴＨ１ヘルパー細胞へと分化し、および、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０

【0146】

【数2】

２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、および必須ビタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）で補われたＤＭＥＭにおいて６日間培養した。

【0147】

腫瘍モデル：ハンクス緩衝塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁した３×１０^５ Ｂ１６－Ｆ１メラノーマ細胞を、マウスの腰椎の側腹部に皮下注射した。右後肢の背部に２×１０^５ Ｂ１６－Ｍ１細胞を注入することにより、足蹠にメラノーマ腫瘍を誘発した。

【0148】

腫瘍成長モニタリング：原発性Ｂ１６－Ｍ１メラノーマの背側の後肢にある腫瘍を、ノギスを用いて週３回測定した。楕円体の式を使用して腫瘍体積を計算した：Ｖ＝（π／６×長さ×幅×高さ）。原発性の背側の後肢にある腫瘍は、３０～５０ｍｍ^３の位相Ｉ体積、９０～１５０ｍｍ^３の位相ＩＩ体積、および３００～５００ｍｍ^３の位相ＩＩＩ体積を有する、ゴルペンツ成長を示す。それゆえ、９０～１５０ｍｍ^３までの腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）を判定することにより処置効果を決定し、ここで、腫瘍は対数期ＩＩである。３００～５００ｍｍ^３に到達する腫瘍は、解剖および血管の制限により位相ＩＩＩに入り始める。結果的に、ＩＡＣＵＣに承認されたプロトコルに従い、≧３００～５００ｍｍ^３の腫瘍を持つマウスに膝下の切断を行った。

【0149】

ＥＬＩＳＡ：１．５～２．５×１０４のＴ細胞を、静止したままにするか、あるいは、抗ＣＤ３Σ＋抗ＣＤ２８抗体、１：５のＴ細胞：脾細胞の比率でＴ細胞が枯渇したＯＶＡペプチド３２３－３３９（ＯＶＡ３２３－３３９）を負荷した脾細胞、または１：３の樹状細胞：Ｔ細胞の比率でＯＶＡ３２３－３３９あるいはメラノーマ腫瘍溶解物を負荷したＣＤ１１ｃ＋精製樹状細胞（ＣＤ１１ｃ－ビーズを使用する；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の何れかで刺激した。培養上清を典型的に、刺激の２４時間後に採取し、ＩＬ－２またはＩＦＮのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。

【0150】

腫瘍溶解物：腫瘍を有するマウスから腫瘍を切除し、１～２ｍｍの片に切断し、４０

【0151】

【数3】

のナイロンメッシュに通した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、無血清ＤＭＥＭの中で再懸濁した。その後、細胞懸濁液を液体窒素中で急速凍結し、３７℃で溶解させることを５サイクル行い、光顕微鏡検査による完全な溶解の目視確認を行った。溶解物を４℃で１５分間、１０，０００ｇで回転させ、細胞破片を有するペレットを廃棄した。精製樹状細胞と共に上清を使用して、Ｔ細胞を刺激した。

【0152】

免疫蛍光染色腫瘍組織を単離し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＯＣＴ化合物（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋した。組織切片（合計）を調製し、５分間アセトンで透過処理し、３０分間ヤギ血清でインキュベートして、非特異性タンパク質間相互作用を遮断した。組織切片を、以下の抗体で夜通しインキュベートした：抗カルレティキュリン（Ｐｉｅｒｃｅ， ＰＡＳ－２５９２２）、抗Ｔｒｐ１（Ａｂｅａｍ， ａｂ３３１２；クローンＴＡ９９）、および抗Ｈｓｐ７０（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢＰ１－７７４５５）。適切な二次抗体を室温で３０分間使用した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して核を検出した。少なくとも１０のフィールド／サンプルを、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１蛍光顕微鏡で盲検的に分析した。

【0153】

集束超音波治療法システム。治療およびイメージングプローブシステム（ＴＩＰＳ， Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ Ｍａｎｏｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を、すべての超音波照射に対して利用した。このシステムは、集束して時空的に制御した超音波エネルギーを伝えることができ、かつ、治療制御作業端末、ＲＦ発生器および制御電子回路、８つの要素球形シェル環状アレイ超音波トランスデューサー（８０ｍｍの曲率半径、８０ｍｍの孔）、ならびに、面内のトランスデューサーの動作および超音波ビーム軸に対し垂直である正確な位置決めを可能にする動作ステージから成る。集束超音波ビームはまた、焦点の電子偏向を使用して面外のおよそ±１５ｍｍで操作され得る。超音波ビームは、薄い（２５ｐｍ）円形のプラスチック膜を介して標的へと垂直に広がり、脱気水により音響結合がもたらされる。治療中、システムは、音響の出力、超音波照射期間、デューティーサイクル、および超音波振動数の調整を可能にする。

【0154】

インビボでの集束超音波（ＦＵＳ）療法。純酸素中の１．５％のイソフルランの１．５リットル／分の連続流でマウスに麻酔をかけた。適切な音響結合を確かなものとするために、癌を有する脚または腰椎側面を慎重に剪毛した。動物が治療のために位置付けられると、脱気水および超音波ゲルを使用して、腫瘍をＴＩＰＳシステムに音響的に（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ）結合した。その後、腫瘍の中央部を、トランスデューサーから８０ｍｍの焦点距離に置いた。腫瘍体積全体にわたって伸長する１ｍｍのグリッドパターンを使用して、超音波照射を腫瘍に送達した。グリッド点の二層（５ｍｍ間隔で置かれた）を各腫瘍に設け、結果として１腫瘍当たりおよそ１６０の離散性病巣および５分の暴露期間をもたらした。超音波トランスデューサーを１．０ＭＨｚで操作することにより、楕円軸に沿って測定されるように、直径およそ１．５ｍｍおよび長さ１２ｍｍ（－６ｄＢの圧力）の楕円焦点をもたらした。腫瘍体積全体にわたって伸長する１ｍｍのグリッドパターンを使用して、超音波照射を腫瘍に送達した。治療前に、腫瘍体積を、特定の処置のグリッドサイズを計算するために測定した。各グリッド点での超音波照射の持続時間は１．５秒であり、その後、トランスデューサーは次のグリッド点上に自動的に位置付けられ、腫瘍体積全体が覆われるまで手順を繰り返した。グリッド点の二層を各腫瘍に設けた。治療用超音波装置を、特定の音響出力／圧力レジメン：音響出力３Ｗ、ピーク負圧＝２．９３ＭＰａ（８０ｍｍの焦点距離）／３．８１ＭＰａ（８５ｍｍの焦点距離）で連続波モードで操作して、非切除性低エネルギーＦＵＳ（ＬＯＦＵ）をもたらした。焦点で結果として生じるインサイチュの強度（Ｉ_ｓｐｔａ）を、組織において４ｍｍの深さで５５０Ｗ／ｃｍ^２となると推測した。腫瘍への総エネルギー堆積はおよそ９００Ｊであった。

【0155】

インビボでの少分割コーンビームＣＴ画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）：３４１秒で１０Ｇｙの線量を標的腫瘍に送達するために、Ｘｓｔｒａｈｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ’ｓ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｌａｔｆｏｒｍ （ＳＡＲＲＰ）を使用して、放射線をすべて送達した。麻酔をかけられた動物を、電動プラットフォームに取り付けられたステージに置き、腫瘍を有する右後肢を、１．５ｃｍの接着プラットフォームまで伸ばし、上げて、固定して、外部からの組織暴露を最小限にした。一旦固定されると、コーンビームＣＴ（ＣＢＣＴ）を実行し、データを、組織セグメンテーション（ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および処置計画のために３ＤＳｌｉｃｅｒで開いた。３０Ｇｙの総少分割線量の場合、３日間連続で１０Ｇｙずつ送達した。併用療法の群において、ＣＢＣＴの２～４時間前にＬＯＦＵを実行した。

【0156】

肺転移の評価：自発的に死亡したか、安楽死させられたか、または８週間の実験の終わりに屠殺された動物から肺を単離した。１ｍＬのＦｅｋｅｔｅの溶液（エタノール、氷酢酸およびホルムアルデヒドベースの漂白定着液）を注入して肺に吹き込んだ。その後、気管をクランプし、肺および心臓全体を一括して取り除き、ＰＢＳで洗浄した。その後、肺をＦｅｋｅｔｅの溶液に入れ、分析前に４８時間漂白した。左肺と、右肺の４葉を分離し、解剖顕微鏡を用いて小結節を計数した。不明瞭なまたは融合した小結節は確実に数えあげることができない；それゆえ、肺を、数が多すぎて計数できないものと標識付けし、２５０の任意の転移数を割り当てた。ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定を使用して、統計分析を行い、続いて多重比較のためのダン検定を行った。

【0157】

無再発生存期間：以下の事象を、我々の無再発生存期間分析においてポジティブ事象としてスコア化した：腫瘍病変の検死確認による自発的な死亡、排出膝窩または鼠径のリンパ節への広範囲な局所転移による安楽死、または広範囲な全身腫瘍負荷を示す瀕死状態による安楽死。以下の非腫瘍依存性死亡を、打ち切りデータとして処理した：切断の２４～４８時間以内の死亡または８週間の実験の終わりでの動物の屠殺。対照のまたは処置された動物の選択的屠殺を防ぐために、動物研究所の獣医が処置群および対照群から盲検化される（ｂｌｉｎｄｅｄ）ように、英数字コードを使用してケージを標識付けした。マンテル・コックス検定を使用して、無再発生存期間を分析し、統計的有意差をＰ＜０．０５として定義した。

【0158】

リアルタイムＰＣＲ：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞から総ＲＮＡを抽出し、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡサンプルを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でレポーター色素としてＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイムＰＣＲにかけた。試験した転写物の発現を、ベータアクチンに正規化した。使用されるプライマーセットは以下である：

【0159】

ａｃｔｉｎｂ：Ｆ－ＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）， Ｒ－ＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；Ｃｂｌｂ：Ｆ－ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）， Ｒ－ＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；Ｇｒａｉｌ：Ｆ－ＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）， Ｒ－ＧＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＴＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；Ｉｋａｒｏｓ：Ｆ－ＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）， Ｒ－ＣＧＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）；カスパーゼ３：Ｆ－ＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＡＴＴＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）， Ｒ－ＣＴＴＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；Ｅｇｒ２：Ｆ－ＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）， Ｒ－ ＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；Ｇｒｇ４：Ｆ－ＴＣＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）， Ｒ－ＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；Ｉｔｃｈ：Ｆ－ＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）， Ｒ－ＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；Ｆｏｘｐ３：Ｆ－ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；Ｒ－ＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。

【0160】

フローサイトメトリー：免疫染色前に、細胞をＦｃブロック（ＣＤ１６／ＣＤ３２）抗体であらかじめブロックした。以下の蛍光色素結合抗体を使用した：抗Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４５の抗体、ならびに、それらそれぞれのアイソタイプ対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗Ｈｓｐ７０（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および抗ＴＲＰ１（Ａｂｃａｍ）。ＵＶ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、死細胞を検出した。免疫染色した細胞を、ＬＳＲ－ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して取得後の分析を行った。

【0161】

＜実施例２＞
低酸素腫瘍微小環境は、酸化小胞体（ＥＲ）ストレスをもたらし、結果として、タンパク質のミスフォールディングおよび小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）につながる。ＵＰＲはいくつかの分子シャペロンを誘発し、それは、ＵＰＲの延長された活性化が細胞死を誘発するが、タンパク質のミスフォールディングを補正し、および癌細胞の生存および殺腫瘍性の治療に対する耐性を改善する、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を含む。ＨＳＰ９０阻害剤、１７ＡＡＧは、前立腺癌（ＰＣ）を含む、様々な固形腫瘍に対する見込みを示した。しかし、１７ＡＡＧの治療量は全身毒性を引き出す。本明細書には新しいパラダイムが開示され、ここで、非切除性および非侵襲性の低エネルギー集束超音波（ＬＯＦＵ）と無毒な低用量の１７ＡＡＧとの併用療法は、マウスおよびヒトのＰＣ異種移植片中の合成致死および有意な殺腫瘍効果を引き起こす。ＬＯＦＵは、細胞死を誘発することなく、腫瘍細胞においてＥＲストレスおよびＵＰＲを誘発する。無毒な用量の１７ＡＡＧによる処置は、ＬＯＦＵ処置したＰＣにおいてＥＲストレスをさらに増加させ、腫瘍においてＵＰＲを細胞保護的な応答からアポトーシス応答に切り替え、結果として、アポトーシスおよび腫瘍増殖遅滞の有意な誘発をもたらした。ＬＯＦＵ誘発性のＥＲストレスは、超音波処置した腫瘍を１７ＡＡＧなどの化学療法剤に対してより感受性にする。ＬＯＦＵ誘発性の化学増感は、腫瘍、例えば、局所に進行したおよび再発性の腫瘍に対して使用することができる新しい治療である。

【0162】

ＬＯＦＵおよび１７ＡＡＧ治療の処置計画および毒性：各グリッド位置について、１００％のデューティーサイクル、３Ｗの音響出力で、および１ＭＨｚの超音波周波数を使用して、ＬＯＦＵを１．５秒間施した。このプロトコルは、２７０Ｗ／ｃｍ^２のおよそのインサイチュでの空間ピーク時間平均音響強度をもたらし、結果として３．２℃の予測された平均の腫瘍内の温度上昇につながった。処置後、脱毛、熱的損傷、または皮膚創傷などの、正常組織毒性の徴候はなかった。マウスにおける前臨床の薬物動態試験は、１７ＡＡＧが広く分布し、広範囲な肝代謝を受けることを示した。１７ＡＡＧの全身投与は、有意な肝毒性に関連することが知られており、これは、トランスアミナーゼおよび胆汁酸の増加、および胆嚢、総胆管、および胃腸管における薬物関連の組織病理学的病変を特徴とする。それゆえ、我々の治療に対して無毒であった１７ＡＡＧの用量を判定した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、１週間に３回、１７ＡＡＧ（２５－７５ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射で処置した。対照マウスに等量のビヒクルＤＭＳＯを注入し、これを、１７ＡＡＧを可溶性にするために使用した。より高用量の１７ＡＡＧ（体重の５０～７５ｍｇ／ｋｇ）処置は、未処置の対照と比較して、有意な腫瘍増殖遅滞を達成した（それぞれ、未処置の腫瘍、１８７９±９８．６５ｍｍ^３対１７ＡＡＧ ７５ｍｇ／ｋｇ体重（ｂ．ｗ．）、４８５±２４．２５ｍｍ^３、ｐ＜０．００３および５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．、９６４ｍｍ^３およびｐ＜０．００７）が、カプラン・マイヤー法は、体重の７５ｍｇ／ｋｇの用量での２１日間の処置後にマウスの５０％の死亡を示した。

【0163】

無毒であると分かった１７ＡＡＧの低用量は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて２５ｍｇ／ｋｇおよびＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて１４ｍｇ／ｋｇであった。したがって、これらの用量レベルを現在の試験のために選択した。その目的は、治療量以下であるが、無毒である２つの治療を組み合わせて、その組み合わせが治療的であり得るかどうかを検査することであった。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用処置はＥＲストレスを増幅させる：ＥＲにおけるミスフォールドタンパク質の蓄積は、タンパク質のミスフォールディングの補正を助けるシャペロンタンパク質の誘導でストレス応答を誘発する。ＥＲストレスのレベルを検出するために、ＥＲシャペロン、ＥＲｐ４４、ＥＲｐ５７、およびＥＲｐ７２の発現レベルを、異なる処置群間で定量化した。ＥＲｐ４４は、酸化タンパク質フォールディングが原因である。ＥＲｐ５７はＥＲ常在性チオールジスルフィドオキシドレダクターゼであるが、Ｅｒｐ７２はジスルフィドイソメラーゼである。これらのすべてのタンパク質は、ＥＲのタンパク質フォールディングの機構に関与する。イムノブロット解析は、処置を受けなかったあるいはＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧのみを受けた動物からの腫瘍組織と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧとの併用療法後に腫瘍組織におけるＥＲｐ７８（ｐ＜０．０３、図９のＤおよびＥ）、ＥＲｐ４４（ｐ＜０．０５、図９のＤおよびＧ）、およびＥＲｐ５７（ｐ＜０．０４、図９のＤおよびＦ）のタンパク質レベルの発現の有意な増加を実証した。これは、ＨＳＰ９０の１７ＡＡＧ媒介性の阻害が、ＥＲにおいてアンフォールドタンパク質負荷を増大し、それによって、ＥＲストレスを延長させ得ることを示唆している。

【0164】

ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、ＵＰＲのアポトーシス促進性の経路を活性化し、マウスおよびヒトの前立腺癌組織中のアポトーシスを誘発する：ＥＲストレスは、ＵＰＲの３つの群を同時に活性化し、それによって、拮抗性の細胞保護的なおよびアポトーシスのシグナルを同時に生成する。細胞の運命は、ＥＲストレスを低下させて、それによって、ＵＰＲを減弱する、そのタンパク質補正機構の能力に左右される。ＥＲストレスが持続する場合、細胞保護的な経路は、最終的に、細胞死を引き起こすＰＥＲＫ媒介性のアポトーシス経路の慢性の活性化で圧倒される（ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｅｄ）。

【0165】

Ｔｈｒ９８ＯでのＰＥＲＫのリン酸化が、その活性化状態に対するマーカーとして機能するため、イムノブロット解析を実行し、１７ＡＡＧでの処置後の腫瘍組織におけるｐＰＥＲＫレベルの有意な増加を示したことが示された（図１０のＡ）。リン酸化されたＰＥＲＫレベルは、未処置の腫瘍およびＬＯＦＵ処置した腫瘍中には存在しなかった。しかし、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法は、ＰＥＲＫリン酸化の最も高いレベルを示した（図１０のＡ）。延長されたＰＥＲＫ活性化が、セリン５１で翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を介するＥＲストレスに応じてタンパク質合成を減弱するため、リン酸化されたｅＩＦ２αのレベルを判定した。１７ＡＡＧでのＲＭ１腫瘍の処置は、未処置の対照の基礎レベルを超えるｅＩＦ２αのリン酸化を誘発した。ＬＯＦＵ処置は、結果として、リン酸化されたｅＩＦ２αレベルのわずかな低下をもたらした。しかし、リン酸化されたｅＩＦ２αの最も高いレベルが、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧでの併用療法を受けた腫瘍において見られ（図１０のＢ）、これは、他の群と比較した、これらの腫瘍におけるＰＥＲＫリン酸化の最も高い活性化を実証している。

【0166】

リン酸化されたｅＩＦ２αは、生存促進および抗アポトーシスのタンパク質を含む、ほとんどの細胞タンパク質の翻訳を減少させるが、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）などの、アポトーシス促進遺伝子の転写を誘発する原因である転写因子、ＡＴＦ４の翻訳を増加させ、それによって、ミスフォールドタンパク質が修復されずＥＲストレスが持続する場合にプログラム細胞死に対して細胞を調製する。ＬＯＦＵ処置は、未処置の対照に対してＣＨＯＰレベル（１．６±０．７倍）を誘発しなかった。対照的に、１７ＡＡＧ単独による処置は、１４．８±２倍までＣＨＯＰ転写レベルを誘発し、これはさらに、未処置の対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法の群において２５±１．３倍まで（ｐ＜０．００６）増加した（図１０のＣ）。

【0167】

下流のアポトーシス遺伝子がＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法によるＣＨＯＰ誘発後に発現されたかどうかを検査するために、マウスのＵＰＲ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ａｒｒａｙを、様々な処置群の腫瘍組織から単離された総ＲＮＡ上で使用した。Ｈｅａｔｍａｐ解析は、Ｂａｘ、Ｖｃｐ、Ｐｄｉａ３、Ａｒｍｅｔ、Ｄｄｉｔ３、Ｍａｐｋ８、Ｍａｐｋ９、およびＭａｐｋ１０などの、アポトーシス促進性の標的遺伝子が、未処置の対照と比較して、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧによる併用療法後に数倍誘発されたことを実証した（図１０のＤ）。ＬＯＦＵ単独または１７ＡＡＧ単独による処置でアポトーシス促進性の遺伝子の最小の誘発が生じた。この結果は、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法が、ＰＥＲＫを活性化し、ＣＨＯＰを誘発し、およびＵＰＲのアポトーシス促進性の経路をスイッチオンすることを示す。実際には、ＴＵＮＥＬ染色は、ＬＯＦＵが未処置の対照にわたって最小のアポトーシスを誘発することを実証した。１７ＡＡＧによる処置は、前立腺腫瘍において有意なアポトーシスを誘発し、これは、ＬＯＦＵによってさらに増加された（ｐ＜０．００４）（図８のＥ）。したがって、ＨＳＰ９０の１７ＡＡＧ媒介性の阻害およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用によるＣＨＯＰの活性化は、前立腺腫瘍のアポトーシス細胞死をスイッチオンした。ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧは、腫瘍細胞においてシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）を阻害する。

【0168】

ミスフォールドタンパク質の分解は、プロテオソーム経路およびオートファジーによって媒介される。オートファジーは、文脈依存的な役割において腫瘍形成プロセスに関係しており、ここで、それは、アミノ酸および他の必須栄養素を栄養不足である低酸素の腫瘍の代謝経路に提供する場合がある。実際には、ＣＭＡ活性の増加は、種々様々なヒト腫瘍において見られ、ＣＭＡは腫瘍細胞の生存、増殖、および転移に関係している。それゆえ、オートファジーに関与する２つの重要なタンパク質、即ち、マクロオートファジーのマーカーであるＢｅｃｌｉｎ、および様々な処置コホートの腫瘍組織におけるＣＭＡのマーカーであるＬＡＭＰ－２Ａリソソーム受容体のレベルを定量化した。図１０に示されるように、ベクリンレベルは、ＬＯＦＵまたは１７ＡＡＧ、あるいは併用療法では変化しないままであり（図９のＡおよびＣ）、これは、マクロオートファジーが超音波療法で変更されなかったことを示している。しかし、ＬＯＦＵ単独または１７ＡＡＧ単独では、ＬＡＭＰ－２Ａの発現を誘発し（図１１のＡおよびＢ）、これは、ＥＲにおいてミスフォールドタンパク質の負荷を増加させる治療後のＣＭＡの代償的増加を示している。興味深いことに、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの組み合わせは、これらの腫瘍中に見られた基礎レベルより下のＬＡＭＰ－２Ａのレベルを阻害した。これは、併用療法が、腫瘍細胞の増殖を低減し、ＣＭＡを抑制しながらＥＲストレスを増大させることによってアポトーシスを誘発することを示唆している。

【0169】

ＬＯＦＵは、ヒトおよびマウスの前立腺癌移植片を無毒な低用量の１７ＡＡＧに感作する：ＬＯＦＵ単独または低用量の１７ＡＡＧ（２５ｍｇ／ｋｇ体重）単独による処置は、正常組織の毒作用を示さなかったが、腫瘍増殖の阻害に失敗した。しかし、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧの併用療法は、マウスＲＭ１腫瘍の増殖を低減した（図１０のＢ）。平均の推測される腫瘍増殖は、対照群と比較して、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧおよびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧコホートにおいて５％（ｐ＜０．０００１）、９％（ｐ＜０．０００１）、および１１％（ｐ＜０．０００１）遅い。対照、ＬＯＦＵ、およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧにおいて腫瘍サイズ２０００ｍｍ^３を達成するまでの中位時間は、それぞれ、１８、２２、および４２日であった。１７ＡＡＧ群における動物はすべて、２６～３０日の時間間隔内でそのサイズを達成した。

【0170】

無毒な低用量の１７ＡＡＧ（体重の１４ｍｇ／ｋｇ）と一緒にＬＯＦＵを適用することで、ＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウス中のヒトＰＣ３腫瘍において、類似した程度の化学増感が観察され、即時の有害な副作用なしで有意な腫瘍増殖遅滞（ｐ＜０．００７）が達成された（図５のＣ）。

【0171】

ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ処置は、腫瘍組織において前立腺癌幹細胞集団を減少させる：ＰＣ幹／前駆集団に対するＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧ誘発性のＥＲストレスの効果を、ＰＣ幹／前駆細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析によって評価した。細胞表面ＳＣＡ１（図１３のＡおよびＢ）（ｐ＜０．００４）、ＣＤ４４（図１３のＡおよびＣ）（ｐ＜０．００３）、ＣＤ１３３（図１３のＡおよびＤ）（ｐ＜０．００７）、およびα２β１インテグリン（ｐ＜０．００５）（図１１のＡおよびＥ）を発現する細胞のパーセンテージは、対照または単一処置のコホートと比較して、併用療法の群において有意に低下した。これらのすべてのマーカーの平均の蛍光強度（ＭＦ１）は、すべての３つの群において変更されないままであった。幹細胞転写因子のｑＲＴ－ＰＣＲアレイは、ＴＩｘ３、Ｈｏｘａｌｌ、Ｐｃｎａ、Ｇｌｉ２、Ｒｕｎｘｌ、Ｆｏｘａ２、Ｓｐ１、Ｔｂｘ５、ＨｏｘａｌＯ、Ｎｆａｔｃｌ、Ｇａｔａ６、およびＮｏｔｃｈ２のｍＲＮＡレベルの増加（＞２倍）を実証し（図１３のＦ）、これは、ＬＯＦＵがＰＣ幹細胞転写シグナル伝達を誘発することを示している。１７ＡＡＧによる処置はまた、ＬＯＦＵ処置した腫瘍中に存在するＦｏｘＰｌ、Ｎｒｆ２ｆ、およびＰｏｕ５ｆｌなどの、いくつかの転写因子ｍＲＮＡの発現を増大させた。しかし、ＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧで処置した腫瘍は、これらの遺伝子の発現をダウンレギュレートし、これは、併用療法によるＥＲストレスの最大化が、腫瘍中のＰＣ幹／前駆細胞集団を減少させるかもしれないことを示唆している。

【0172】

この結果は、ＬＯＦＵと化学療法の併用療法が、腫瘍中のアポトーシス促進性の遺伝子の発現を再プログラムし、腫瘍異種移植片中の広範なアポトーシスを誘発し、結果として、マウスおよびヒトのＰＣ腫瘍の有意な腫瘍増殖遅滞をもたらすことを実証している。いくつかの実施形態では、ＬＯＦＵは化学療法に対する耐性を改善することができ、化学増感を達成することができる。

【0173】

動物：５～６週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６（ＮＣＩ－Ｆｏｒｔ Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，ＭＤ，ＵＳＡ）マウスおよび胸腺欠損ヌード（ＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）マウスを、自由に維持し、すべての試験を、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのガイドラインおよびプロトコルの下で実行した。

【0174】

＜腫瘍モデルおよび処置＞
Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂＣｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に、それぞれ、１×１０^５ＲＭ－１（マウス前立腺癌細胞株）および１×１０^６ＰＣ３（ヒト前立腺癌細胞株）の細胞を皮下注射した。およそ１０日後、腫瘍が触知可能になる（直径３～５ｍｍ）と、ＬＯＦＵ処置を開始した。マウスを、処置を受けない群、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）、および１７ＡＡＧ＋ＬＯＦＵを受ける群の４つの群（ｎ＝５／群）に分けた。２週間にわたって投与された５つの画分について３～４日ごとにＬＯＦＵで明白な腫瘍を処置した。動物はこの間に１７ＡＡＧを１週間３回受け取った。腫瘍体積の測定を、全身毒性の徴候（倦怠感および下痢）の同時の物理的評価とともに、ノギスを使用して週２回実行した。

【0175】

＜実施例３＞

【0176】

高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、高周波アブレーション（ＲＦＡ）、および寒冷療法などの切除手順は、場合によっては、樹状細胞（ＤＣ）および免疫系の他のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の取り込みに利用可能となり得る、腫瘍由来のタンパク質を放出する可能性を有する。臨床のＨＩＦＵは、焦点で数分内に９５～１００°Ｃに達する高温を使用し、これにより、腫瘍細胞を即座に殺し、組織構造および血管系を破壊する。これにより、ＨＩＦＵで処置された腫瘍中の免疫細胞の浸潤を妨げることができる。腫瘍細胞には熱応力に反応し、かつ免疫活性化のためのＨＳＰなどのストレスタンパク質を引き起こす時間がない。ＨＩＦＵ誘導性の凝固壊死は、大量の変性腫瘍のタンパク質を放出することができるが、抗原負荷からの抗原耐性を誘導する可能性があり、および変性細胞タンパク質は、Ｔ細胞活性化のために、さらなる抗原処理およびＤＣによる交差提示を必要とする。細胞を殺さずに、４２～４５°Ｃに温度を上昇させることによって音波ストレスを誘導する、低エネルギー焦点式超音波（ＬＯＦＵ）での腫瘍の前処置は、細胞質のタンパク質変性、小胞体（ＥＲ）ストレス、および、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）などの分子シャペロンの発現の増大を結果としてもたらすことができる。抗原処理機構は、最終的には、ミスフォールドタンパク質を、Ｔ細胞認識のために細胞表面ＭＨＣの上で提示される抗原ペプチドとして処理する。１～２日後の、ＬＯＦＵで処置された腫瘍の後のＨＩＦＵへの曝露は、腫瘍細胞死、および細胞外区画と血流へのＨＳＰ腫瘍ペプチド複合体の放出、自己インサイチュの腫瘍ワクチン接種を結果としてもたらす。したがって、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵの連続する適用は、ＤＣ活性化のための腫瘍抗原および内因性の「危険」シグナルのソースを提供し、これにより、局所的および全身性疾患の両方を制御するための治療用超音波の有効性を増強する、腫瘍特異的全身免疫応答を誘導する。

【0177】

３つのヒト前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５、ＰＣ３、およびＬＮＣａｐ）、２つのマウス前立腺癌細胞株（ＲＭ－１およびＴｒａｍｐ－Ｃ１）、ならびにマウスモデルを、ＨＩＦＵとＬＯＦＵの併用療法の有効性について試験した。ＨＳＰの誘導をＥＬＩＳＡ、免疫蛍光染色、およびフローサイトメトリーで測定した。細胞増殖および数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。

【0178】

非切除ＬＯＦＵを用いた前処置により、腫瘍細胞はミスフォールドタンパク質を処理することができ、１日後のＨＩＦＵを用いたその後の処置により、ＤＣの取り込みおよびＴ細胞免疫の誘導のために死腫瘍細胞からＨＳＰペプチド複合体を放出するこができる。触知可能なＯＶＡを発現するＲＭ１－ＯＴ腫瘍は、ＬＯＦＵで、その後１日あけてＨＩＦＵで順次処置し、動物をＬＯＦＵ処置後３日目、７日目、および１４日目に屠殺した。一方、腫瘍特異的Ｔ細胞応答はＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ処置の１サイクルでは検出されなかったが、３日目にＩＦＮ－γ－産生細胞（ＰＭＡおよびイオノマイシンによって刺激された）の総数の適度な増加があり（１１０±５／２．５×１０５細胞ＬＯＦＵならびにＨＩＦＵ対未処置の６６±１６／２．５×１０５細胞、ｐ＜０．０５、図１４のＡ）、これは、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ処置がＴｈ１表現型へと免疫応答を傾ける可能性があることを示した。しかし、ＩＦＮγ－分泌細胞の数は、様々な群間で統計的差異なしに、７日および１４日で前処理レベルにまで減少した（データは示さず）。したがって、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵを用いた腫瘍の反復処置は、定期的な免疫処置のためにＨＳＰおよび腫瘍抗原の放出を促進し、腫瘍特異的免疫応答の誘導のためのワクチン接種スケジュールをシミュレートすることが可能であった。

【0179】

触知可能なＲＭ１－ＯＴ腫瘍は、１日間隔をあけて施された連続するＬＯＦＵおよびＨＩＦＵの毎週サイクルで３回処置し、動物を最後のＨＩＦＵ処置の１週間後に屠殺した。脾細胞中の腫瘍特異的Ｔ細胞の発生頻度をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析し、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞の細胞毒性機能を検出した。ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスからの脾細胞を、照射されたＲＭ１－ＯＴ細胞と共培養すると、ＩＦＮ－γ－分泌ＲＭ１－ＯＴ反応性Ｔ細胞の数が増加した（ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ後の２．５×１０５脾細胞あたり４３２±６５の細胞対ＨＩＦＵのみの後の２．５×１０５脾細胞あたり１５±６の細胞；図１４のＢ）。ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスにおける腫瘍特異的ＩＦＮ－□－を放出するＴ細胞の発生頻度は、０．１７±０．０３％であった。これらの腫瘍反応性脾細胞は、これらのペプチドと共培養された場合、ＯＶＡ由来のＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド、ＯＶＡ２５７－２６４（２．５×１０５の総脾細胞あたり１４９±２８の細胞）ならびにＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド、ＯＶＡ３２３－３３９（２．５×１０５の総脾細胞あたり１３２±３２の細胞）の両方を特異的に認識することが分かった。これに対して、ＬＯＦＵのみ、あるいはＨＩＦＵのみのいずれかで処置されたマウスにおいては、有意な免疫応答は検出されなかった（両方の群において２．５×１０５の総脾細胞あたり１５±６の細胞）。これらの結果は、ＬＯＦＵ＋ＨＩＦＵの併用療法が、代理細胞質腫瘍抗原であるＯＶＡに対するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の応答を誘発することができることを示す。ＨＩＦＵ処置のみでは、腫瘍組織内のＨＳＰの細胞死および放出を誘導したが、有意な抗腫瘍細胞性免疫は誘導しなかった。

【0180】

腫瘍特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、照射されたＲＭ１－ＯＴ細胞との培養後の脾細胞における細胞表面ＣＤ１０７ａの存在を測定する、ＣＤ１０７ａ動員アッセイによって評価した。ＣＤ１０７ａは、ＣＴＬによって細胞毒性脱顆粒プロセス中に細胞表面に一時的に動員されるようになる、パーフォリン／グランザイムＢ小胞の膜タンパク質である。ＣＴＬはすべての処置群中に存在したが、腫瘍特異的ＣＤ１０７ａ＋ Ｔ細胞は、ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウスにおいて最も高かった（ＬＯＦＵおよびＨＩＦＵで処置されたマウル中２７．８８±４．８０％対未処置のマウス中７．５±１．２％、ｐ＜０．０５；図１４のＣ）。代理腫瘍抗原（ＯＶＡ）に反応性だったＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を、Ｈ－２ｂ／ＯＶＡ２５７－２６４四量体染色（図１４のＤ）によって定量化した。未処置のコホートあるいは単一の処置コホートはごくわずかなＯＶＡ反応性ＣＤ８ Ｔ細胞を有していたが、ＬＯＦＵとＨＩＦＵの処置後にこれらの細胞が増加し（０．１２％のＬＯＦＵおよびＨＩＦＵ対＜０．０１％の未処置）、さらにインビボの腫瘍特異的Ｔ細胞の存在を確認した。

【0181】

最後に、非切除ＬＯＦＵでの前処置がＨＩＦＵの治療効果を増強するか否かを調べるために、マウスモデルの腫瘍体積を複数の日にわたって測定した（図１４のＥ）。ＨＩＦＵ曝露のための時間間隔を処置群間で同じに保った。様々な群中の腫瘍サイズは、１サイクルの超音波治療法の後に有意な差異はなかったが、２サイクル後に成長遅延が見られた。未処理の対照（ｐ＞０．０５）と比較して、ＬＯＦＵ処置のみでは腫瘍成長率は変化しなかった。ＬＯＦＵのコホートおよび未処置のコホート（ｐ＜０．０５）と比較して、ＨＩＦＵのみでは腫瘍成長を有意に抑制した。ＬＯＦＵを用いる前処置は、相対的なマウスの写真（図１４のＥ、上パネル）によって示されるような、ＨＩＦＵ治療の腫瘍破壊性の効果を増強した（ＬＯＦＵとＨＩＦＵ対ＨＩＦＵ、ｐ＜０．０１；ＬＯＦＵとＨＩＦＵ対ＬＯＦＵあるいは無処置（ＮＴ）、ｐ＜０．００１）。

【0182】

ＬＯＦＵシステム：治療およびイメージングプローブシステム（ＴＩＰＳ， Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ Ｍａｎｏｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を、すべての超音波照射に対して利用した。上記システムは、８要素の球殻環状アレイトランスデューサー（８－ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｓｈｅｌｌ ａｎｎｕｌａｒ ａｒｒａｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（８０ｍｍの曲率半径、８０ｍｍの開口部）、ならびにトランスデューサーの移動および正確な位置決めを可能にする移動ステージを含む。トランスデューサーは１．０ＭＨｚで操作され、結果として、直径およそ１．５ｍｍおよび長さ１２ｍｍ（－６ｄＢの圧力）の焦点がもたらされた。

【0183】

ＬＯＦＵ処置プロトコル：処置日に、ケタミンおよびキシラジン（１００ ｌ／マウスに対して７：１ｍｇ／ｍｌ、腹腔内（ｉ．ｐ．））で動物に麻酔をかけた。治療のために位置付けられると、腫瘍を脱気水および超音波ゲルを使用してＴＩＰＳシステムに音響的に結合した。

【0184】

超音波照射パラメーターは以下の通りであった：０．５ｄＢ ｃｍ－１ ＭＨｚ－１の減衰係数を想定して、組織中の３ｍｍの超音波処理深さで２７０Ｗ／ｃｍ^２のおよそのインサイチュでの空間ピーク時間平均強度（Ｉ_ｓｐｔａ）をもたらす、３Ｗの音響出力および１００％のデューティーサイクル。超音波照射を、腫瘍体積全体にわたって伸長する２ｍｍのグリッドパターンを使用して、腫瘍に送達した。ＬＯＦＵ前に、腫瘍体積を、特定の処置のグリッドサイズを計算するために測定した。各グリッド点でのＬＯＦＵ照射の持続時間は１．５秒であり、その後、トランスデューサーを次のグリッド点上に自動的に位置付け、腫瘍体積全体が覆われるまで手順を繰り返した。これは、腫瘍への不均一なエネルギー送達をもたらした。

【0185】

インビトロでの温度上昇予測：侵襲性の手段による腫瘍内の温度の予測は、併用処置の治療効果を不必要に変調する可能性がある。それゆえ、上記のセットアップおよび治療プロトコルを使用して腫瘍内の温度上昇を予測するために、超音波照射を、組織模倣ファントム内の６ｍｍ×６ｍｍの領域内で実行し、そこに、Ｔ型熱電対（直径２００ｐｍ）を３ｍｍの深さで埋め込んだ。これらのインビトロでの照射を５回繰り返し、結果を平均した。

【0186】

インサイチュでのアポトーシスの検出：アポトーシス細胞を、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介ジゴキシゲニン標識したｄＵＴＰニック末端標識）染色を行うことによってインサイチュで検出した。簡潔には、パラフィン包埋切片を、脱パラフィンし、段階的なアルコールによって再水和し、ＡｐｏｐＴａｇキット（Ｉｎｔｒｅｇｅｎ Ｃｏ， Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， ＧＡ， ＵＳＡ）を使用して染色した。腫瘍細胞におけるアポトーシス率を、各高倍率視野におけるアポトーシス細胞のパーセントをカウントすることによって定量化した。

【0187】

イムノブロット解析：ＬＯＦＵの２４時間後に、腫瘍細胞を採取し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、ＴＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を使用して溶解した。細胞溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにさらし、フッ化ポリビニリデン膜に移し、ＰＥＲＫ、ｐＰＥＲＫ、ｅＩＦ２、ｐｅＩＦ２、ＥＲｐ７２、ＥＲｐ４４、ＥＲｐ５７、Ｂｅｃｌｉｎ（細胞シグナル伝達、Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）、Ｌａｍｐ２ａ（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）に対する一次抗体、および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でイムノブロットした。ブロットを、ＥＣＬキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）を使用して発展させた。各ブロットの免疫反応性バンドのデンシトメトリー分析を撮影し、その後、画像をデジタル化し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用することによって分析した。

【0188】

ＵＰＲ標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析。ＬＯＦＵ処置の２４時間後に、ＲＭ１腫瘍細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， ＵＳＡ）から１％のβメルカプトエタノールと混合されたＲＬＴ緩衝液を使用して溶解した。

【0189】

オンカラムＤＮＡ消化を有するＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉキットのためのＱｉａｇｅｎのプロトコルを使用して、腫瘍溶解物からＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルを、さらなる使用前に－８０℃で保存した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して、単離したＲＮＡをｃＤＮＡ合成にさらした。ＸＢＰ１ ＲＮＡのスプライシングを、以下のプライマー対５’－ＡＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）および５’－ＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を使用して検出した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ， ＰＡ， ＵＳＡ）。標準のＡＢｇｅｎｅプロトコルに従って、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＱＰＣＲ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ （ＡＢｇｅｎｅ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）を使用して、Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）においてリアルタイムＰＣＲを実行した。プライマー増幅の特異性を確認するために、ＰＣＲの終わりに融解曲線を生成し、同じプライマー対を含有している異なるサンプルは、一致するアンプリコン融解温度を示した。

【0190】

リアルタイムＰＣＲのために使用されるプライマーは、ＧＲＰ７８ ５’ＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）および５’ＴＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；ＥＤＥＭ ５’ ＴＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）３および５’ ＴＴＧＡＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を含んでいた（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｑＲＴ－ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ実験をすべて、３回繰り返した。アポトーシス遺伝子および幹細胞転写因子に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲアレイを、製造業者のプロトコルに従って、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＣＲアレイシステム（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ， ＵＳＡ）によって実行した。要するに、ＲＴ^２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製された総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、その後、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰＣＲアレイキットを使用して、ＰＣＲアレイを実行した。ＳＡ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのウェブベースのＰＣＲアレイデータ解析ソフトウェアによって、データを解析した。

【0191】

フローサイトメトリー解析：様々なコホートにおいて、ＬＯＦＵ、１７ＡＡＧ、およびＬＯＦＵ＋１７ＡＡＧにより、側腹部腫瘍を処置した。処置の２４時間後に、腫瘍細胞を、コラゲナーゼ消化によって分離し、前立腺癌幹細胞マーカー、ＳＣＡ１、ＣＤ４４、およびＣＤ１３３の発現のためにフローサイトメトリーによって分析した。ＦＩＴＣと結合した抗ＳＣＡ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅと結合した抗ＣＤ１３３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）、およびＰＥと結合した抗ＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）で、単離した腫瘍細胞を染色した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、データ取得を実行し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．７．１（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）ソフトウェアによって分析した。

【0192】

カプラン・マイヤー法：異なる処置群におけるマウス生存／死亡率を、Ｓｉｇｍａ－ＰｌｏｔおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ ｆｏｒ ＯＳ Ｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して放射線量に応じたカプラン・マイヤー法によって分析した。

【0193】

統計分析：デジタル画像に関して、サンプリング領域を、データ定量化のためのデジタル取得に対してランダムに選択した。デジタル画像データを、あらゆる処置に関して盲検方法で評価した。両側ステューデントｔ検定を使用して、代表的な平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を有する実験コホート間の有意差（ｐ＜０．０５）を判定した。

【0194】

＜実施例４＞

【0195】

図１７は、本発明の典型的な実施形態による、参照符号（１）によって全般的に指定された、音響刺激治療（ＡＰＴ）装置を示す。ＡＰＴ装置（１）は、電源（図示せず）によって動力を供給され、制御システム（１０）、増幅器（１２）、整合変成器（１４）およびトランスデューサー（１６）を備える。処置を提供するために、超音波トランスデューサー（１６）は、患者の身体（１０００）の領域の近くまたはその領域内に位置付けられ得る。臨床医は、制御システム（１０）で関数発生器を使用して、トランスデューサー（１６）によって送達される超音波パルスの周波数および持続時間に対する適切な調節を行うことができる。超音波トランスデューサー（１６）が励起されると、トランスデューサー素子の伝達面は、超音波トランスデューサー（１６）を囲む体液中に圧力波を生成する。圧力波は、その後、患者の身体（１０００）内の流体および組織に伝播し、最終的に標的部位に達し、それによって、標的組織に対する非切除の音波ストレスを引き起こす。本明細書でさらに詳細に説明されるように、組織に送達された音波ストレスは、多くの治療用途を有し得、癌処置の場合には、例えば、腫瘍中の癌細胞のそのようなストレスは、結果として免疫原性の調節、放射線増感、および化学増感につながり得る。超音波トランスデューサー（１６）は、さらなる処置のために患者の身体の隣接領域に再配置されてもよい。

【0196】

整合変成器（１４）は、電源と超音波トランスデューサーとの間にインピーダンス変換を提供する。

【0197】

増幅器（１２）は、制御システム（１０）の出力信号に基づいてトランスデューサー（１６）を駆動させるためのトランスデューサー駆動信号を生成する。典型的な実施形態では、増幅器（１２）は、スイッチド共振型電力増幅器（ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｐｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）であり得、その一例は、米国特許第７，３９６，３３６号に開示され、その内容は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、低インピーダンス超音波駆動トランスデューサーシステムが使用され得る。

【0198】

トランスデューサー（１６）は、処置ゾーンにおいて１０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の音響出力を生成する。超音波は、０．５秒から５秒までの範囲内の時間にわたって継続的に適用され、ここで周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲内である。いくつかの実施形態では、処置ゾーンでの任意の超音波ビームの最小直径は、約１ｃｍである。

【0199】

図１７は、本発明の典型的な実施形態による、参照符号（１）によって全般的に指定された、音響刺激治療（ＡＰＴ）装置を示す。ＡＰＴ装置（１）は、電源（図示せず）によって動力を供給され、制御システム（１０）、増幅器（１２）、整合変成器（１４）、および超音波トランスデューサー（１６）を備える。処置を提供するために、超音波トランスデューサー（１６）は、患者の身体（１０００）の領域の近くまたはその領域内に位置付けられ得る。臨床医は、制御システム（１０）で関数発生器を使用して、トランスデューサー（１６）によって送達される超音波パルスの周波数および持続時間に対する適切な調節を行うことができる。超音波トランスデューサー（１６）が励起されるときに、トランスデューサー素子の伝達面は、超音波トランスデューサー（１６）を囲む体液中に圧力波を生成する。圧力波は、その後、患者の身体（１０００）内の流体および組織に伝播し、最終的に標的部位に達し、それによって、標的組織に対する非切除の音波ストレスを引き起こす。本明細書でさらに詳細に説明されるように、組織に送達された音波ストレスは、多くの治療用途を有し得、癌処置の場合には、例えば、腫瘍中のそのようなストレスは、結果として癌細胞の免疫原性の調節、放射線増感、および化学増感につながり得る。超音波トランスデューサー（１６）は、さらなる処置のために患者の身体の隣接領域に再配置されてもよい。

【0200】

整合変成器（１４）は、電源と超音波トランスデューサー（１６）との間にインピーダンス変換を提供する。

【0201】

増幅器（１２）は、制御システム（１０）の出力信号に基づいてトランスデューサー（１６）を駆動させるためのトランスデューサー駆動信号を生成する。典型的な実施形態では、増幅器（１２）は、スイッチド共振型電力増幅器（ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｐｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）であり得、その一例は、米国特許第７，３９６，３３６号に開示され、その内容は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、低インピーダンス超音波駆動トランスデューサーシステムが使用され得る。

【0202】

トランスデューサー（１６）は、処置ゾーンにおいて１０～１０００Ｗ／ｃｍ^２の空間ピーク時間平均強度（Ｉ_ｓｐｔａ）の音響出力を生成する。超音波は、０．５秒から５秒までの範囲内の時間にわたって継続的に適用され、ここで周波数は０．０１～１０ＭＨｚの範囲内である。いくつかの実施形態では、処置ゾーンでの任意の超音波ビームの最小直径は、約１ｃｍである。

【0203】

図１７に示される実施形態では、ＡＰＴ装置（１）によって生成された超音波の周波数は、約１０ｋＨｚ～約３００ｋＨｚまでの範囲内である。しかし、本発明によるＡＰＴ装置は、例えば、約３００ｋＨｚ～約３ＭＨｚの範囲内の周波数などの、より高い周波数を生成し得る。

【0204】

図１８に示されるように、参照符号（１００）によって全般的に指定された、そのようなＡＰＴ装置の一実施形態は、制御システム（１１０）、増幅器（１１２）、整合変成器（１４）、およびトランスデューサー（１１６）を含み得、そのような構成要素は、図１７に関して記載された機能および構造と同じ機能および構造を有する。実施形態では、トランスデューサー（１１６）は、別のタイプのエネルギーを音響エネルギーに変換する単一または複数の要素で構成された平面または凹面のピストン式トランスデューサーであってもよい。

【0205】

図１９に示されるように、ＡＰＴ装置（１）およびＡＰＴ装置（１００）は、参照符号（２００）によって全般的に指定された単一のシステムへと統合されて、効果の改善および／またはより低い全体的なエネルギー入力をもたらし得る。総合システム（２００）は、ＡＰＴ処置のための集束された（ｆｏｃｕｓｅｄ）低周波および平行にされた（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）高周波ビームを提供する。いくつかの実施形態では、低周波超音波は、所与の周波数または周波数の範囲を達成可能であるものに従って実質的に集束され、中間周波数は平行にされる。いくつかの実施形態では、低周波数を生成するために使用されるトランスデューサーは凹面であり、中間周波数を生成するために使用されるトランスデューサーは平面である。

【0206】

図２０～２２に示されるように、ＡＰＴ装置（１）、（１００）、（２００）は、参照符号（３００）によって全般的に指定される超音波モニタリングシステムと協働し得る。超音波モニタリングシステム（３００）は、電源（図示せず）によって動力を供給され得、制御システム（３１０）、増幅器（３１２）、およびパルス受信システム（３１４）を備える。超音波モニタリングシステム（３００）は標的組織をモニタリングし、および／またはＡＰＴ処置前、ＡＰＴ処置中、および／またはＡＰＴ処置後の標的組織の画像化を提供するために使用することができ、特に、パルス受信システム（３１４）は、標的組織内から反射された、あるいは標的組織によってまたは標的組織内から生成された圧力波を受信するトランスデューサーを備えている場合があり、および、増幅器（３１２）は受信した圧力波に対応する電気信号を生成する。制御システム（３１０）は、処置状態および／または他のパラメーターを判定するために臨床医によって使用され得る電気信号に基づいて出力を生成する。超音波モニタリングシステム（３００）は、ＡＰＴ装置（１）、（１００）、（２００）とは別の構成要素として示されるが、モニタリングおよびＡＰＴ送達が、単一システムによって実行され得ることが認識されるべきである。

【0207】

いくつかの実施形態では、超音波モニタリングシステム（３００）は、処置される組織の場所に関する情報を提供するために使用される。１つ以上の非治療的な超音波送信および受信のサブシステムが、ＡＰＴ処置および組織に対する処置の効果をモニタリングするために使用されてもよい。

【0208】

いくつかの実施形態では、放射線療法を計画するために収集および使用されるデータも、超音波処置を計画するために少なくとも部分的に使用される。いくつかの実施形態では、ＡＰＴ処置の計画またはＡＰＴ処置のために収集されたデータは、放射線療法の計画に使用される。いくつかの実施形態では、放射線療法の計画のために収集されたデータは、ＡＰＴ処置の計画のために使用される。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＡＰＴ処置の間に収集されたデータは、放射線療法の計画に使用される。

【0210】

いくつかの実施形態では、より高い周波数で実行される超音波イメージングによって部分的に特定された特定の場所を処置するために、超音波がより低い周波数で施される。

【0211】

ＡＰＴ処置の間に組織中のパワー蓄積（ｐｏｗｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）をモニタリングするために、様々な超音波ベースのイメージングおよびモニタリングのモダリティが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組織温度は、音響手段によってモニタリングされ得る。

【0212】

いくつかの実施形態では、処置をモニタリングするために、超音波エラストグラフィが使用される。いくつかの実施形態では、処置をモニタリングするために、ハーモニックイメージングが使用される。いくつかの実施形態では、熱ひずみが測定される。いくつかの実施形態では、システムは、組織のひずみ（ｓｔｒａｉｎ）を測定するために使用される、１つ以上の超音波送信および受信のトランスデューサーサブシステムで構成される。処置用の超音波ビームを所望の組織に向けるために、および、いくつかの実施形態においては処置用のトランスデューサーに十分な処置パワーを施す前に、組織のひずみ情報が使用されてもよい。例えば、一実施形態では、パワーが、計画された処置パワーの１０～５０％で処置用のトランスデューサーの１つ以上に１～３秒間適用され、標的組織のひずみが超音波フィードバックを使用して測定される。ＡＰＴトランスデューサーの処置強度、適用時間、あるいはその両方を調節することができ、あるいは、トランスデューサーを物理的または電子的に再配置するか、あるいはひずみイメージングに基づいて標的組織に効果的に方向付けることができる。いくつかの実施形態では、処置のために計画された全パワーが１つ以上のトランスデューサーから施されるが、その時間は、所望の標的化が確認されるまでのひずみの測定期間中の治療効果に使用される時間よりも短い。

【0213】

いくつかの実施形態では、処置をモニタリングするために検温が使用される。患者の表面あるいは患者内の温度は、限定されないが、熱電対、光ファイバープローブ、特定のＭＲＩパルスシーケンス、および超音波熱ひずみイメージングを含む様々な方法を使用して測定されてもよい。

【0214】

ＡＰＴシステム（１）、（１００）、（２００）の各トランスデューサーは、単一のトランスデューサーまたは一連の複数のトランスデューサーであってもよい。図２３は、本発明の典型的な実施形態による、参照符号（４００）によって全般的に指定されたトランスデューサーの斜視図である。トランスデューサー（４００）は、一連のトランスデューサー素子（４０２）を含む。任意の数のトランスデューサー素子（４０２）が、方位軸に沿って連続して配されてもよい。トランスデューサー素子（４０２）は、バッキングブロック（ｂａｃｋｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）（４０４）上で支持される。周知のように、信号リードは、各トランスデューサー素子（４０２）の電極と連結し、回路網を送受信する。トランスデューサー素子（４０２）は、送信回路網によって提供された電気信号を圧力波に変換する。

【0215】

いくつかの中間周波数の実施形態（約３００ｋＨｚ～約３ＭＨｚ）において、２つ以上の超音波トランスデューサーは、本明細書では交差ゾーンとして示される処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、１０～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。実施形態では、２つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、２０～２００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。実施形態では、３つのトランスデューサーは、処置ゾーン内で交差する超音波ビームを生成し、各ビームは、２０～３００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンにＩ_ｓｐｔａを有する。

【0216】

いくつかの実施形態では、複数のビームが、互いに実質的に同位相である。いくつかの実施形態では、別々の超音波トランスデューサーから放射される２つの超音波ビームは、実質的に同相であり、処置ゾーン内で交差し、各ビームは２０～１００Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンで音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は連続して１～５秒にわたって施される。いくつかの実施形態では、別の超音波トランスデューサーから放射される３つの超音波ビームは、実質的に同じ周波数および同位相であり、処置ゾーン内で交差し、および各ビームは、５０～７０Ｗ／ｃｍ^２の範囲で交差ゾーンに音響パワー空間ピーク強度を有し、超音波は継続的に１～５秒施される。

【0217】

いくつかの実施形態では、別個のトランスデューサーまたはトランスデューサー素子から生じるビームはそれぞれ、処置ゾーン中でおよそ３００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａを生成する。いくつかの実施形態では、別個のトランスデューサーまたはトランスデューサー素子から生じるビームはそれぞれ、処置ゾーン中で１０～１００Ｗ／ｃｍ^２のＩ_ｓｐｔａを生成する。

【0218】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトランスデューサーの直径、およびこのトランスデューサーから放射される超音波ビームは、処置ゾーンより実質的に大きい。より小さなトランスデューサーと組み合わせた、そのような大きなトランスデューサーの１つ以上の使用は、有効かつ、より速い処置を達成しながら、それほど正確でない高パワーの、大量のビームの照準を好都合に可能にする。

【0219】

いくつかの実施形態では、２つ以上のビームが互いに交差する、集中的な処置ゾーンが形成され、集中的な処置ゾーンは、送信されたエネルギーの方向に対して垂直で約１ｃｍ以上であり、送信された方向に対して平行で約１ｃｍ以上でもある。

【0220】

いくつかの実施形態では、各トランスデューサーから処置ゾーンに適用された音圧は、０．１～１０ＭＰａである。

【0221】

いくつかの実施形態では、集中的な超音波処置ゾーンを提供するトランスデューサーの数は、１から１０００の間である。

【0222】

いくつかの実施形態では、１つ以上の中央周波数が、約１００ｋＨｚ～２０ＭＨｚに範囲の中央周波数による処置の間に利用される。

【0223】

いくつかの実施形態では、所与のトランスデューサーからの超音波は、継続的に施される。いくつかの実施形態では、所与のトランスデューサーから放射される超音波は、デューティーサイクルとして知られているオン時間単位およびオフ時間単位を繰り返すパルスで施される。デューティーサイクルは、１オン時間単位から９オフ時間単位までの範囲であり得る。

【0224】

いくつかの実施形態では、トランスデューサーは、単一周波音または多周波数チャープを送信する。

【0225】

いくつかの実施形態では、トランスデューサーは、適用の全経過の間に標的組織に送達された総エネルギーが、周囲組織への総エネルギーより大きくなるように、連続して操作される。

【0226】

いくつかの実施形態では、周波数は適用中に掃引され、部分的にトランスデューサーの近くのゾーンにおいて不必要に高強度のゾーンを減少させる。

【0227】

いくつかの実施形態では、処置ヘッドを含むトランスデューサーは、機械的に振動される。

【0228】

いくつかの実施形態では、トランスデューサーは、二次元フェーズドアレイ、環状アレイおよび／または三次元フェーズドアレイで構成される。

【0229】

いくつかの実施形態では、１つ以上の超音波トランスデューサーは、１つ以上の内視鏡装置に組み込まれる。

【0230】

本明細書に開示されたＡＰＴ処置システムは、体温上昇および切除熱治療（ａｂｌａｔｉｖｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）に共通の熱注入（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｏｓｉｎｇ）スキームと比較して、温熱量が少ない。いくつかの実施形態では、処置ゾーンにおいて達した最高温度は、約２秒以下続く処置の間、約４５°Ｃ以下である。いくつかの実施形態では、処置ゾーンにおいて達した最高温度は、約３秒以下続く処置の間、４５°Ｃ以下である。いくつかの実施形態では、処置ゾーンにおいて達した最高温度は、約２秒以下続く処置の間、５０°Ｃ以下である。いくつかの実施形態では、処置ゾーンにおいて達した最高温度は、約３秒以下続く処置の間、５０°Ｃ以下である。

【0231】

温熱量を考慮すると、治療効果が熱的機構によって部分的に得られることが予期される。理論によって縛られたくないが、熱効果と結び付けられた機械的効果は、開示されたデバイス、システムおよび方法を使用して、処置の効果の観察を部分的に説明し得る。

【0232】

いくつかの実施形態では、接触媒質が、トランスデューサーと患者の身体との間で使用されて、超音波が効率的に送信され、いくつかの実施形態では、トランスデューサーと処置ゾーンとの間の所望の距離が提供される。いくつかの実施形態では、接触媒質を循環して、処置の間にトランスデューサーまたは患者の身体、あるいはその両方を冷却する。超音波を送信する、間隔を提供する、および患者およびシステムコンポーネントを冷却する目的のために、別の流体が使用されてもよい。

【0233】

理論によって縛られないが、本明細書に記載されるシステムを使用するＡＰＴ処置は、細胞間、および細胞とマトリックスタンパク質との間の相互作用を促進することができる。癌細胞と免疫細胞との間の相互作用、および免疫細胞間、例えば、Ｔ細胞とＤＣとの間の相互作用。

【0234】

いくつかの実施形態では、ＡＰＴ処置は、タンパク質複合体、例えば、タンパク質フォールディング複合体を破壊する可能性がある。

【0235】

複数のモダリティによる処置から恩恵を得る疾患、標的とされた処置ゾーン全体の浸透およびこれらのゾーン内の病変を有する患者のために、各モダリティの適用の緩和ならびに短期間の処置が望まれる。

【0236】

本発明の典型的な実施形態によるＡＰＴ処置装置およびＡＰＴ処置モダリティの様々な他の態様が、ここで記載される：

【0237】

＜位置決め装置＞
いくつかの実施形態では、トランスデューサーアプリケーターは、臨床医または介護者によって携帯され得るように設計されている。いくつかの実施形態では、アプリケーターは、図２４に示される位置決め装置（５００）などの、機械的位置決め装置に取り付けられる。位置決め装置（５００）は、手動で操作されるか、またはロボット制御され得る。本実施形態では、位置決め装置（５００）は、トランスデューサーが移動する円弧状のレールであり、特に、トランスデューサーは、順にレールに載せられるケーブル駆動の運び台に取り付けられてもよい。トランスデューサーが三次元で位置決めされ得るように、レール自体は回転可能であってもよい。位置決め装置（５００）は、患者がトランスデューサーの下に、およびその標的範囲内に収まることができるように十分に大規模であり得る。図２４は、レール上に位置決めされた１つのトランスデューサーのみを示すが、１つを超えるトランスデューサーがレール上に配されること、および／または１つ以上の他のトランスデューサーを支持する他のレールが設けられてもよいことが認識されるべきである。いくつかの実施形態では、時にヘキサポッドと呼ばれる、スチュワートプラットホームが、位置決め装置において使用されてもよい。処置パラメーターを設定し、位置決め装置を操作するために、コンピュータープログラミングが使用されてもよい。

【0238】

＜機器および患者の冷却＞
いくつかの実施形態では、処置システムは、超音波エネルギーまたは他のエネルギーに暴露された皮膚を冷却するための患者冷却機構を含む。

【0239】

【表3】

【0240】

＜音響刺激システム＞
いくつかの実施形態において、音響刺激治療（ＡＰＴ）は、現在の治療を非常に効果的なインサイチュワクチンへと変える可能性を有している。例えば、少分割放射線治療とＡＰの組み合わせは、Ｔ細胞寛容を逆転し、例えば、動物またはヒトのメラノーマモデルの肺へのメラノーマの転移および患者の癌を除去することができる。動物モデルはイヌあるいはマウスの動物モデルであり得、ヒトも同様に処置することができる。いくつかの例では、ＡＰＴを放射線療法（ＲＴ）と組み合わせて、全体の毒性を低減し、電離放射線量を低減し、ＲＴのみで達成できるものとは異なり、より強力な特有の免疫原性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の損傷パターンを生成する。いくつかの例では、ＴＭＥ治療が達成され、転移および血管性ニッチが修飾され得る。併用効果メカニズムは解明される可能性があるが、治療は、腫瘍細胞ＥＲストレス誘導（主にＡＰ）、ＤＡＭＰ（ＡＰとＲＴ）、およびＲＯＳ＆ＤＮＡ損傷（主にＲＴ）による細胞のレベルでの損傷誘発性再プログラムから始まる。ＤＣ活性化、移入リンパ節（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）、細胞傷害性Ｔ細胞活性化、および腫瘍床への遊走移動が後に続くことがある。

【0241】

細胞のレベルでの損傷誘発性再プログラミングは、非切除エネルギー処置などのエネルギー処置を用いた多くの方法で引き起こされる場合がある。表３に示されるエネルギーの各々は、細胞のレベルでの再プログラミングを誘発するために使用することができ、この処置は、表２に示される処置のいずれか、およびそれらの組み合わせと組み合わせることができる。例えば、樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、または免疫チェックポイント阻害は、不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、高周波エネルギー、あるいは寒冷療法、およびそれらの組み合わせと組み合わせることができる。

【0242】

樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、リガンドおよびアゴニスト、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、ＴＮＦ－βからなる群から選択される材料を含み得る。

【0243】

エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０ ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択される材料を含み得る。

【0244】

免疫チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、およびＩＤＯ阻害剤（例えば、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット、ナボキシモド）からなる群から選択される材料を含む。

【0245】

いくつかの実施形態において、音響刺激（ＡＰ）システムは、様々な超音波電界を生成するように構成される。可能性のある関連する特徴は、広い横方向フィールドの次元、低い強度、および複数の周波数で構成される。ＡＰ－１システムは、０．１～４ＭＨｚの範囲で最大１６のトランスデューサー素子を用いて１～４の周波数を送達するように設定可能な４つのチャンネルユニットを備える。他の例では、ＡＰ－１システムは２つのトランスデューサーを備える場合がある。二重周波数構成は、１ＭＨｚ以上で作動する１つのトランスデューサーと２５０ｋＨｚで作動する１つのトランデューサーで使用され得る。強度は、処置ゾーンにおいて１００～５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内であり得る。ＡＰシステムは、マウス腫瘍モデルあるいは他のモダリティ、例えば、ヒト患者の腫瘍の処置体積上で使用する５～１５ｍｍの横ビームを含み得る。対照処置体積は、様々な周波数あるいは非干渉性の非切除超音波（ＵＳ）電界と重複することがある。ＡＰシステムは１つのチャネル当たり１～４つのトランスデューサーを使用するように構成され得る。処置時間は１処置体積当たり１～３秒で構成されてもよく、腫瘍を処置するために複数の体積が走査される。いくつかの例では、大量のビーム交差焦点領域によって、全体の処置時間を短縮することができる。例えば、横１．２ｃｍ×縦２．０ｃｍの楕円体は、１．５ｃｃの体積の処置ゾーンをもたらすことができる。別の例では、１１０ｃｃ（直径～６ｃｍ）の腫瘍を約２２０秒で処置することができる。

【0246】

図２５は実施形態による音響刺激（ＡＰ）システムを示す。ＡＰシステムはユーザーインタフェース、例えば、ラップトップコンピュータなどのコンピューターにつながれたコンピューターディスプレイを備える。ラップトップコンピュータはコントローラーにつなぐことができる。コントローラーはロボットアームなどのリンケージにつなぐことができる。本明細書に記載されている１つ以上の超音波トランスデューサーは、患者上で超音波トランスデューサーの配置を制御するために、ロボットアームなどのリンケージの端部に取り付けることができる。

【0247】

ＡＰシステムは、ヒトおよび大型模動物実験の臨床処置用に構成することができ、ＣＴベースの処置計画を組み込むことができる。例えば、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）は、図２５の音響刺激システムのディスプレイ上に提供され得る。図２６は、イヌ軟組織肉腫などの軟組織肉腫用のＣＴベースの処置計画を示す。ＡＰシステムは、ロボットアームなどのリンケージに取り付けることができるＵＳエラストグラフィベースの処置モニタリングを備える。例えば、照射量モニタリングフィードバック制御システムは、特に、非切除ＡＰ処置用に設計されてもよい。処置温度は熱ひずみイメージングを使用して分析することができ、例えば、５０°Ｃ未満に維持することができる。切除を必要としない処置の性質は、位置合わせおよび堆積においてそれほど高い精度を必要としない場合がある。単純化されたハードウェア設計により、実質的に低コストの製品とユーザーフレンドリーな設計を作ることができる。

【0248】

ＡＰシステムは、固体表面あるいは最大８ｃｍの深さの悪性腫瘍（放射線療法の初期の過程の候補であるか、従来の療法にもかかわらず再発性あるいは進行性である）の処置で使用するために構成され得る。ユニットでは、特定の所望の周波数および本明細書に記載される時空間的パラメーターを有するＵＳエネルギーを病変に向けて、病変環境を調節することができる。癌の場合には、定位放射線治療（ＳＲＴ）と組み合わせた、および／または、場合によっては、他のモダリティ―と組み合わせた音響刺激治療（ＡＰＴ）は、抗腫瘍成分および自然免疫および適応免疫系の機能を活性化することができ、最終的に癌関連機能障害を緩和することができる。ＡＰＴの利点は、速く、非侵襲性で、無輸血で、播種性疾患に対して有力なインサイチュワクチンを生成するために患者の腫瘍を利用する「ポイント・オン・クリック（ｐｏｉｎｔ ｏｎ ｃｌｉｃｋ）」を含む。本明細書に記載されるシステムは、所望の強度、周波数、および焦点サイズのパラメーターで超音波を送達することができ、マウス癌モデルあるいは他の処置モダリティ試験、例えば、大型動物およびヒトに使用されている。

【0249】

いくつかの実施形態において、プロトタイプユニットを構築することができ、ならびに、ベンチテスト、毒性試験、および腫瘍の処置を、コンパニオンアニマルまたはヒトの癌患者に使用することができる。コンパニオンアニマルはイヌであり得る。処置計画に使用されるユニットおよびＣＴセグメンテーションデータを表示するＧＵＩの概念図が図２６で見られる（処置台はシステムの一部ではない）。

【0250】

いくつかの実施形態において、音響刺激処置システムは、超音波処置サブシステム、ロボットサブシステム、および超音波診断サブシステムを備え得る。超音波処置サブシステムは、横方向に約１０ｍｍ、軸方向次元に２０ｍｍの処置ゾーンを生成するために、発電機電子機器およびトランスデューサーを備え得る。２つの異なる周波数で超音波を生成する少なくとも２つの異なるトランスデューサー素子が存在し、１つは約４００ｋＨｚ未満の低周波数であり、もう１つは約４００ｋＨｚより大きい高周波数である。いくつかの例では、処置ビームの処置ゾーンは、処置される典型的な腫瘍よりも小さな体積を生成し、さらに処置ゾーン外の健康な組織の曝露を管理するので、コンピューター制御された電動ロボットサブシステムを使用することができる。

【0251】

超音波診断サブシステムは、処置生成に使用されるものとは別個のトランスデューサー「プローブ」で構成されてもよい。他の例では、そのようなサブシステムは、処置ヘッドを配置し、エラストグラフィを使用して使用組織に対する処置効果をモニタリングすることができる。他の例では、ＣＴ ＤＩＣＯＭデータは処置計画用にセグメント化することができる。

【0252】

ハードウェアおよびソフトウェアのアーキテクチャが図２７および２８で提供される。図２９に示されるように、サブシステムは、超音波治療法を提供する位置走査ロボット、処置計画のための超音波診断画像分析アルゴリズム、処置内動作追跡および処置内照射量送達確認／測定を含み得る。超音波エラストグラフィを使用する処置変調は、システムアーキテクチャに統合することができる。特定のソフトウェアタスク、例えば、ＵＳ処置のベンチテストおよび熱ひずみペックルトラッキングサブシステム、ロボット位置合わせと音響刺激処置システムソフトへの移動のための統合コード、ＣＴセグメンテーションベースの処置計画を使用した処置アルゴリズムの設計およびコード化、すべての音響刺激処置システムソフトウェアモジュールを作業システムに統合、超音波ペックルトラッキングシステム閉ループアルゴリズムの統合、ひずみイメージングの空間分解能および温度感度の定義、腫瘍の局所処置を組み込んだ深層学習アルゴリズムの開発、が設計され得る。他の例では、（ｉ）処置計画とモニタリングで使用するための３Ｄ超音波画像の構築とセグメンテーション、（ｉｉ）腫瘍血管系イメージング、ならびに（ｉｉｉ）イメージング、腫瘍生検、液体生検、音響刺激処置システムデータを含むバイオマーカーデータを、処置コース中の適応処置計画に組み合わせる機械学習アルゴリズムの開発、などのコンポーネントが生成され得る。

【0253】

いくつかの実施形態において、音響刺激処置システムユニットは、以下の一般的な動作環境を含み、本明細書に記載される他のコンポーネントで説明することができる。音響刺激処置システムは、体表面の約１０センチメートル以内の望まれない組織を処置する場合がある。標的とされた組織は、望まれない組織ならびに望まれない組織を囲むマージンを含み得る。音響刺激処置システムは、超音波を生成する電源およびコントローラー、照射用器具、ならびに照射用器具を配置し、移動させるための電動ロボットを備える場合がある。音響刺激処置システムは、手術を実施することができるスタンド・アローン・システムを備えることができ、必要なディスプレイ、オペレーター制御、超音波送達システムを含み得る。いくつかの例では、音響刺激処置システムユニットは、集中型電子制御システムを備えることができ、医師が処置を制御することができる。音響刺激処置システムは、皮膚などの患者の健康な組織の安全温度を維持しながら、処置を施すことができるコントローラー手段を備え得る。温度モニタリングソフトウェアは、処置の全体にわたって各温度プローブの熱記録を記録することができる。ＧＵＩおよびソフトウェアは、患者情報、処置計画情報、処置パラメーターを入力し、手術を追跡するために使用することができる。当業者に知られているように、患者に接触する材料はすべて確立された生体適合性を有し得る。

【0254】

いくつかの実施形態において、音響刺激処置システムユニットは、超音波処置サブシステム、超音波アプリケーター、中央カート、ロボットサブシステム、照射用器具、および超音波診断サブシステムを備え得る。超音波生成サブシステムは、強度、周波数、およびデューティーを含む所望のフィールドパラメータをもたらすのに適切な超音波信号発生およびパワーを備える。いくつかの実施形態において、音響刺激処置システムの構成要素は、中央カートによって輸送されるか、あるいは患者テーブルに取り付けられてもよい。中央カートは、輸送を容易にするための車輪を含むことがある。車輪はカートが手術中に誤って動くのを防ぐために固定され得る。カートは、操作を容易にするために四輪操舵を含む場合がある。他の例では、カートは容易に転倒することができない。上記システムは、最小１２フィートの病院グレードの電源コードを装備している場合がある。電源は、電力スキームを切り替えることなく、ケーブルを切り替えることにより様々な標準電圧のある国々で使用することができる。カートは、電源コードをカートの背面またはカート内に保管する手段を提供する。ユニットはさらに支持アームを含むことがある。支持アームは支持を提供し、ロボットを患者の近くに必要に応じて配置することができる。支持アームはすべての必要な電気および水路ならびに接続を含み得る。他の例では、支持アームは、処置ヘッドの最も低い面を、例えば、床から８０～１６０ｃｍの間に調整して、処置台に配置された患者を処置することができるように垂直高さ調整を含み得る。いくつかの例では、支持アームは旋回キャスター上にあり、処置台に近づけ、遠ざけるように操縦することができる。

【0255】

他の実施形態では、ユニットはロボットアームなどのリンケージを備え得る。ロボットアームは、照射用器具の支持重量を含む場合もある。ロボットアームは、超音波処置ビームの焦点領域が希望どおりに動かされ、配置されることを可能にし得る。ロボットアームは、任意の直線方向に１００ｍｍ／秒の速さで移動することができる。いくつかの実施形態では、ユニットは照射用器具を備え得る。照射用器具は、標的とされた組織を処置するために、照射用器具の適切な位置決めのための手段を提供することができる。いくつかの例では、照射用器具は、ＣＴまたは超音波イメージングによって確認されるように、組織が不必要に移動するように過度に患者の組織を圧縮しない場合がある。処置ヘッドは、１つ以上のＵＳ処置トランスデューサーを含有していてもよい。標的とされた組織が連続３秒間５５°Ｃを超えないように、照射用器具は超音波を施すことができる。所望の処置ゾーンの外の組織が連続３秒間の４５°Ｃを超えないように、照射用器具は超音波を施すことができる。患者に接する可能性のある照射用器具の表面はすべて、生体適合性材料で製造することができる。超音波伝達材料は、照射用器具と皮膚との間に設けられてもよい。上記材料は、皮膚温度が１分間に４３°Ｃを超えないように、必要に応じて皮膚を冷却するように機能することができる。照射用器具は、特定の解剖学的構造および身体の一部、例えば、ヒトの乳房、ヒトの前立腺、ヒトのアプリケーターおよび首の処置を支持するように、人間工学的に設計され得る。照射用器具内のトランスデューサーは、最低１０分間１００％のデューティーで作動することができ、このサイクルを最低１０００回繰り返すことができる。照射用器具は液冷することができる。他の例では、脱気水が供給された照射用器具は水ベースであり得る。照射用器具の全重量は、例えば、１ｋｇを超えない場合がある。他の実施形態では、ユニットは電源を含むことがある。電源はＲＦ電源を含むことがある。ＲＦ電源は外部制御用の入力バスを有していてもよい。デューティーサイクルは０．０５～１．０に調整可能であり得る。パルス幅は１マイクロセカンド～１ミリセカンドに調整可能であり得る。

【0256】

いくつかの実施形態において、ユニットは温度測定制御回路を含むことがある。上記制御回路は、各チャネルの過熱または「警報」出力機能を有する光ファイバーあるいは熱電対温度プローブの読み出しが含まれる場合がある。上記制御回路は、重要な構成要素の温度をモニタリングするための温度プローブを備えることができる。上記制御回路は、表面温度をモニタリングし、患者の快適さを保証する温度プローブを備えることができる。上記制御回路は、組織の過熱を防止するために、超音波強度が高い領域で患者に挿入するための温度プローブを備えることができる。上記制御回路は、そのフィールドマップとの関係が文書化および較正され、かつ処置前に処置領域のＡＭＦ振幅をモニタリングするために使用することができる場所でＡＭＦ振幅をモニタリングするために、少なくとも１つの較正された交流磁場（ＡＭＦ）プローブを備えることができる。上記制御回路は、ＡＭＦプローブの電圧出力を受け入れるための回路を備えることができ、「警報」ポイントの指定を可能にし、プリセット値を超えたときに「警報」信号を出力する。上記制御回路は、すべての温度およびＡＭＦ振幅の「警報」出力をモニタリングし、適切な信号をＲＦ電源に送信して処置を短縮するＣＰＵを備えることができる。他の実施形態では、ユニットは温度測定システムを備え得る。温度測定システムは、各チャネルの過剰温度あるいは「警報」出力機能を備えた光ファイバーの温度プローブコントローラーを含むことができる。システムコントローラーは、所定条件が満たされる場合に、論理信号を送信するための出力バスを含むことがある。温度測定システムは、腫瘍周囲の温度に基づいてＡＭＦ振幅を制御するための出力を提供することができる。２つの温度プローブが処置に使用されてもよい。プローブは、例えば、皮下針の形態で、標的組織ならびに周囲組織に与えられ得る。温度プローブの表面組織は触ると滑らかであり得る。温度プローブの接続ワイヤは、ねじれ抵抗およびねじれのない５”の半径を有する場合がある。温度プローブは、４８°Ｃで温度耐久性を有してもよく、完全なフレックスにより定値が歪むことはない。温度プローブは、保護のために、滅菌適性ポーチ（例えば、Ｔｙｖｅｋバッグ）で包装され得る。温度プローブは、２つの完全な滅菌サイクルで検証できる場合がある。温度プローブは生体適合性要件を満たさなければならない。他の実施形態では、ユニットは冷却システムを含み得る。冷却システムは、標的組織に直接隣接して冷却を方向づける手段を有する場合がある。患者の表面温度は４３°Ｃ以下に維持され得る。患者の冷却システムの接触部分は生体適合性要件を満たさなければならない。冷却システムは非金属材料で構築することができる。

【0257】

いくつかの実施形態において、ユニットは、患者に超音波を送達する照射用器具を含み得る。いくつかの構成では、照射用器具は処置ヘッドであり得る超音波トランスデューサーは、処置トランスデューサーからの超音波の交差を生成するようにアプリケーターに取り付けられてもよい。超音波トランスデューサーは、１つの低周波数のトランスデューサー（＜４００ｋＨｚ）および／または１つの高周波数のトランスデューサー（＞４００ｋＨｚ）を含むことがある。いくつかの実施形態において、アプリケーターは１つのＵＳ画像イメージングプローブを含み得る。アプリケーターは、任意の身体部分を処置するために配置するのに十分に小さいが、所望の患者処置ゾーンでのビームの交差を可能にするために十分に大きいサイズであり得る。最大寸法は直径１５０ｍｍ×長さ１５０ｍｍであり得る。最大重量は１０００グラムであり得る。いくつかの実施形態において、患者の人間工学的考察は、コンパニオンアニマルおよびヒト、ならびに解剖学的位置を含み得る。アプリケーターは、表在性腫瘍について患者の体表面温度制御を妨害および促進してはならない。４５°Ｃの最大表面温度が３秒間適用され得る。トランスデューサー冷却およびトランスデューサーと患者の接触媒質は、音響透過性ゲルの水であり得る。トランスデューサーから患者までの音響インピーダンスの整合は、水で満たされ、再循環され、脱気された（＜２ｐｐｍのＯ_２）ボーラス／カップリングコーンを含み得る。患者の体から出る超音波と吸音材との結合を利用することができる。

【0258】

いくつかの実施形態において、超音波処置パワーサブシステムは、マルチビームトランスデューサアレイに電力を供給するための複数のチャネルを備えた電源を含み得る。サブシステムはさらに、１０８～１３２ＶＡＣ、４８～６６Ｈｚの有用性要求を備えた超音波発生器－コントローラーユニットを含み得る。電源／発電機から個々のトランスデューサー／トランスデューサー要素までの最大の電力出力は、１００Ｗ／チャネルであってもよい。超音波処置パワーサブシステムは、超音波供給業者と協力して決定される特定の設定を含むことがある。いくつかの例では、処置される解剖学的構造によっては、１０ｍｍの横方向寸法と、最大焦点距離が出口平面から２０～１２０ｍｍのビームが望ましい場合がある。他の例では、アレイ設計およびビーム特性は、処置アルゴリズムに対して指定され得る。

【0259】

いくつかの実施形態において、画像誘導処置計画およびモニタリング中に、ＣＴを音響刺激処置システム前に使用して、病変および周囲組織を画像化することができる。後のシステムでは、１つ以上の診断プローブを使用した超音波イメージングを使用することができる。セグメンテーションソフトウェアおよびユーザーＧＵＩ要件は、ＬＯＦＵセグメンテーションの基礎となり得るオープンソースセグメンテーションのプラットフォームとして３ＤＳｌｉｃｅｒを含み得る。処置計画中に、作業照射量および安全仕様は、処置ゾーン（病変＋マージン１０ｍｍ）を介した１～５秒間、１００～５００Ｗ／ｃｍ^２のＵＳ、処置ゾーンの外の軟組織体積に適用された５０Ｊ未満のエネルギー、および処置ゾーンの外の骨体積に適用された５０Ｊ未満のエネルギーを含む。基準（Ｆｉｄｕｃｉａｌｓ）は、照射用器具の位置決めに使用されるＲＴに使用され得る。超音波の照射量のモニタリング中、組織に対する効果は、Ｂモードペックルトラッキングおよびエラストグラフィ方法を使用して決定されてもよい。

【0260】

他の例では、ロボットの処置ヘッドの動きを定義するアルゴリズムを使用して、処置時間を短くし、健康な組織を回避するように最適化することができる。いくつかの実施形態において、処置ヘッドのロボットの位置決めと走査は、ロボットは位置および（１）処置ヘッドビームの焦点処置ゾーンより大きい病変を処置し、（２）ヘッドビーム焦点処置ゾーンより大きい病変を処置し、（２）健康な組織の露出を低減するためのロボット制御の位置および動きを含み得る。仕様書には、幅１ｃｍ、長さ１．５ｃｍの焦点ゾーン（－３ ｄＢ）を有する腫瘍の連続運動または０．１～１ｃｍのステップで走査すること、あらゆる方向に最大１００ｍｍ／秒の走査速度、および＋／－０．１ｍｍの位置決め精度が含まれ得る。処置ヘッドは、体表面に平行で、深さ１０ｃｍ（体表面に垂直）の任意の寸法で１０ｃｍの病変サイズを処置することができる。処置ヘッドは、最大３６０度の回転、ならびに所望の焦点の処置体積の範囲外における、および健康な組織における照射量を減らすために部分的に使用される回転を含み得る。組織の位置は患者の処置ベッド上で処置され得る。最大ペイロードは、≧２ｋｇであり得る。検討中のロボットアーキテクチャは、主に、回転ヘッド、スチュワートプラットホーム、および検討中のＣアーム回転を備えた６ＤｏＦアームである。選択は、仕様、機能、およびコスト分析に基づき得る。６ＤＯＦは、基部が垂直面に取り付けられている場合に、Ｃアームモーションを可能にすることができ、推奨される実装の形態であり得る。いくつかの例では、ロボットは、手術用アーム（ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｒｍ）または他の手動で操作される装置に取り付けられてもよく、それにより、オペレーターがロボットを処置される組織の近くに望み通りに配置することができる。ロボット運動アルゴリズムを最適化して、処置時間を最小限に抑え、健康な組織への曝露を安全なレベルに制限することができる。視覚ガイドおよびと基準位置合わせ（ｆｉｄｕｃｉａｌ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が、処置の準備の際の処置ヘッドの位置決めに使用されてもよい。

【0261】

いくつかの実施形態において、ハードウェアコンポーネントは、以下ものを含み、本明細書に記載される他のコンポーネントで説明することができる。コンピューターコントローラーは、ＳＤＤを搭載したＤｅｌｌ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ７５１０コアｉ７ ８ｇｂ ＲＡＭおよびウィンドウ１０を実行しているラップトップであり得る。コンピューターは、超音波およびロボットハードウェアに十分なパフォーマンスおよび接続ポートを提供する。超音波診断／診断プローブは、Ｉｎｔｅｒｓｏｎ高性能ＵＳＢ接続リニアプローブおよびウィンドウ対応のハードウェアで構成される。いくつかの例では、１０ｃｍの走査深さのリニアプローブが選択され得る。さらに、ＬＯＦＵの照射量をモニタリングするために開発する予定の超音波ひずみイメージングに非常に有用なＲＦデータへのアクセスが許可される場合がある。２つのプローブは２つの別個のシステムで使用することができる。位置決めおよび走査用のロボットは、複数の市販の６ＤＯＦアームを備えており、臨床用途のための所望の動作範囲、ペイロード要件、位置決め精度を満たし得る。超音波処置サブシステムは、専用のトランスデューサー発電システム、および信号発生器ならびにＲＦ増幅器の特定の組み合わせのアセンブリを含むことができる。サブシステムは、トランスデューサーパワーエレクトロニクス、信号発生器および増幅器、ＡＷＧ発電機、ならびにＤＤＳを備え、Ｂ＆Ｋ ＰｒｅｃｉｓｉｏｎはＣＥマークＩＥＣ ６０６０１認定信号発生器を製造する。ユニットは、少なくとも２つの増幅器（各トランスデューサーに対して１つ）を含んでもよい。線形増幅器は、Ｅ＆Ｉが提供するクラスａ／ｂ広帯域モジュラーユニットを備え、チューニングは不要である。これは、特定のイメージングプローブの使用など、さまざまなトランスデューサーを使用できるモジュラーシステムにおいて重要である。ハードウェアコストがＥ＆Ｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎに比べてはるかに低くなる可能性があるため、Ａｐｅｘのオペアンプベースの構成が好ましい場合もある。この例では、ＤＣ電源および他の要件が評価され、統合され得る。

【0262】

統合された超音波発電システムは、ＢｉｏＳｏｎｏおよびＳｏｎｉｃ Ｃｏｎｃｅｐｔｓのユニットを備えていてもよい。システムは、ＡＰ－１ユニットで４チャネル、７５ワット／ｃｈ ＵＳ発生装置を提供することができる。他の例では、所望の電圧および周波数の仕様を備えた専用の２チャネルシステムを使用することができる。いくつかの例では、カスタムボードを使用することもあり、事前のエンジニアリングが必要になることもあるが、特注であり、サイズが小さく、コストが実質的に低いため、最終的には好ましい選択であり得る。精密音響は、圧電セラミックで構成される高出力トランスデューサーを備え、表面腫瘍の処置に有用な短い焦点領域で２００ｋＨｚ以上で使用することができる。照射用器具補助コンポーネントは、水結合脱気（ｗａｔｅｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｄｅｇａｓｓｉｎｇ）トランスデューサーシステム、水結合温度制御（ｗａｔｅｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、処置ヘッドハウジングおよび取り付け部品、患者固有のトランスデューサーフレームおよび結合装置、電気配線、水配管、ならびにハーネス部品を含む。いくつかの実施形態において、システムの他の構成要素は、熱電対、水脱気システム、およびシステム構成要素の電気的特徴付けのための電力計ならびにオシロスコープを含み得る。

【0263】

いくつかの実施形態において、ソフトウェアは、画像誘導処置計のための画医用イメージングおよびソフトウェアシステム統合、処置モジュール、システム構成要素の制御、および研究プロトタイプにおけるＧＵＩインターフェースを含み得る。アーキテクチャはジュール式であり、これにより、サブシステムと特定のファームウェアを迅速に統合することができる。ソースの管理はコードを管理するために使用することができる。主な処置計画インターフェースは、カスタマイズされた３ＤＳｌｉｃｅｒ用途に組み込まれることがある。処置モジュールはロボット位置決めシステム、治療用トランスデューサー、および熱電対入力を制御することができる。ＵＳ処置モニタリングについては、ＰＬＵＳライブラリは、診断超音波プローブと相互作用することができ、オペレーティングシステム環境およびＶｉｓｕａｌ Ｓｔｕｄｉｏ ２０１３などの設計ソフトウェアを使用できる。１つの、ＵＳＢインターフェースを備えた７．５ＭＨｚ、１０ｃｍの走査深度のリニアプローブを使用することができる。Ｉｎｆｅｒｎｏは、Ｃ＃；Ｃ＋＋で記載された既存のＳｌｉｃｅｒのコードベースで書かれたＳＤＫを提供することができ、およびＳＤＫのＣ＋＋ラッパーが記載されている場合がある。

【0264】

いくつかの実施形態において、音響刺激処置システムユニットのための処置アルゴリズム開発は、以下のように実装することができ、本明細書に記載される他の構成要素で説明することができる。ＣＴセグメンテーションを使用した処置計画から生成されるラスタースキャンパターン（ｒａｓｔｅｒ ｓｃａｎ ｐａｔｔｅｒｎ）が使用され得る。ラスタースキャンは、２～３秒の超音波を受けるなどの、超音波電界パターンによって定義される各処置体積で実施することができる、ＬＯＦＵは、実質的に非切除であり、および５０°Ｃ未満の温度を生成するように意図される場合がある。診断用超音波は、照射量の送達を確認し、および組織に対する照射量の効果を調べるために、処置の送達中に使用することができる。各ラスター位置で、低い「スカウト（ｓｃｏｕｔ）」照射量、例えば、予想される処置の照射量の３０％を最初に適用し、熱的および機械的応答を評価する。超音波ベースのモニタリングを実行できるさまざまなエラストグラフィ測定の中でも、熱ひずみイメージング（ＴＳＩ）として識別されるスペックルトラッキング方法を、ＬＯＦＵ照射量モニタリングについて最初に調べることができる。管理下のスカウト照射量の温度効果により、処置アルゴリズムを使用して、処置パワーを調整することができる。

【0265】

いくつかの実施形態において、プロトタイプユニットは、イヌまたは計画されている他の癌処置モダリティ、およびＦＤＡに提出されたそのデータの使用、ならびに初期の実現可能性試験に適した、無駄のない標的品質システム下で設計され得る。音響刺激処置システムユニットは、製造され、ベンチテストされ、およびインビボの試験の準備ができていることが予想され得る。さらに、３つのユニットは、第１のユニットの使用に部分的に基づいて、第１のプロトタイプから修正されて生成されてもよい。ユニットは、コンパニオンアニマル癌患者の処置における使用、およびＦＤＡに提出されたイヌの臨床試験から得られたデータの使用に適している場合がある。加えて、リスク分析、ソフトウェアアーキテクチャの評価、イヌおよびヒトの試験のプロトタイプを完了するためのエンジニアリングタスク、トランスデューサー、アンプ、位置決めロボットの選択および調達、照射用器具の設計および製造、カートの仕様／設計の調達（ロボットの取り付け構成要素を含む）、 水脱気システムの選択、およびソフトウェアアーキテクチャの開発が、ユニットには伴う場合がある。

【0266】

インビボの動物試験のためのプロトタイプについて言及されるが、本明細書に記載されるシステムはヒト患者を処置するために使用することができる。

【0267】

ＡＰユニットは、音響刺激処置システムユニットで使用することができる周波数の組み合わせを含み得る。プロトタイプは、様々なトランスデューサーの統合を容易にすることができるモジュール設計を含み得る。ＡＰシステムは、約１００ｋＨｚ～４Ｍｚの範囲の様々な周波数で作動する最大で約３０、最大で約２５、最大で約２０、最大で約１５、最大で約１０、あるいは最大で約５つのトランスデューサーを含み得る。ＡＰシステムは、低周波数成分および高周波数成分の同時の使用などの、マルチ周波数動作を含むことがある。マルチ周波数動作は、所望の音響刺激効果を達成するためのパワー要求の削減を含む、複数の利点を結果としてもたらすことができ、フィールド特異的な免疫原性パターンを生成することができる。１回の処置体積が増大することで、ＡＰＴを生成するのに必要な電界強度の低減を達成することができる。

【0268】

処置ヘッド内の２つ以上のトランスデューサー素子の形状、サイズ、および配向を使用して、直径約６～１０ミリメートルとビーム軸に沿った１０～２０ｍｍの焦点処置ゾーンを形成することができる。各焦点ゾーンについて、トランスデューサーを１～５秒間作動して、４０°Ｃ～５０°Ｃの範囲の組織温度を生成することができる。位置決めおよび走査ロボットを、音響刺激処置システムの超音波領域の焦点ゾーンより広い腫瘍の処置に使用することができる。いくつかの例では、病変および周辺にわたって焦点ゾーンの走査を可能にするロボットのサブシステムが、音響刺激処置システム装置へ組み込まれてもよい。ロボットのサブシステムは４～６の自由度（ＤｏＦ）のロボットアームを含み得る。

【0269】

図３０は、イヌなどの哺乳動物の軟部肉腫に典型的である、代表的な大きな表面腫瘍を処置するための所望の運動および６ＤｏＦのロボットを示す。その運動は、並進運動、回転運動、およびその組み合わせを含み得る。ロボットは、健康な組織への曝露を低減するように環状あるいは他のパターンの処置ヘッドを回転させることができる。図３０は、いくつかの実施形態によるそのようなロボットアームを示す。いくつかの例では、ロボットは、ロボットの評価のために１回のショットで処置することができない大きな腫瘍を処置するために使用され得る。診断用超音波を、病変マッピングおよび処置計画プロセスで使用して、位置の検証、および、例えば、ＣＴデータを使用しない処置計画を行うことができる。ＵＳ画像セグメンテーション中に、精密ロボットが提供されてもよく、処置超音波トランスデューサーを備えるアームに取り付けられてもよい。走査型超音波プローブからの２Ｄから３Ｄへの再構成は、共通の基準系に対して各２Ｄ ｓｌｉｃｅの正確な位置および配向を知ることから利益を得ることができる。ロボットは数ミリメートル程度の誤差を取り除くように調整される場合がある。ロボットは、５ミクロンの位置精度を有し、高精度であり得る。ロボットの一部はアルミニウムの単一部品から精密機械加工されており、すべての距離および角度が正確に分かっており、ならびに音響刺激処置システムへの統合が予定されているため、ロボットは調整を必要としない場合がある。ロボットは、マルチビーム処置ヘッドをさらに含むことがあり、これは、図３１に示されるように、回転すると周囲組織に対して集点ゾーンへの照射量を増加させる。トランスデューサーは同じまたは異なる周波数であり得る。ロボットアームは手首および指を備えていてもよく、複数のトランスデューサーの各々の配向および位置を制御するために、各指の端部にトランスデューサーが取り付けられている。

【0270】

＜超音波診断および処置モニタリングサブシステム＞
いくつかの実施形態において、リアルタイムでの処置モニタリングおよび温度測定は、熱電対プローブを使用する腫瘍内温度測定、ＵＳ誘導イメージングまたはＭＲＩ誘導イメージング、ならびに熱ひずみイメージングを含む、様々な方法を使用して達成することができる。診断用超音波プローブおよびひずみイメージングは、組織における超音波吸収を定量化することにより、処置されている所望の体積の有用な検証をもたらすために使用でき、かつ処置用照射量をモニタリングおよび調整する手段としても使用できる。腫瘍の範囲を調べて、温度が上昇したひずみを較正し、および有効性があるひずみイメージングを相関させることができる。したがって、腫瘍の流動性、血管分布、および突然変異負荷の関数としてのひずみに対する超音波の効果を決定することができる。

【0271】

超音波ひずみイメージング法はさらに、超音波処置の非観血的モニタリングを可能にする。組織は、超音波によって生成された圧縮および希薄化圧力波に対して減衰振動子として応答することができる。ＡＰは、組織の性質を調べるための特有の時空間的超音波強度および周波数プロファイルを提供することができる。いくつかの例では、ＡＰ処置前、ＡＰ処置中、およびＡＰ処置後のエラストグラフィベースの評価は、イメージング、処置計画、処置モニタリング、ならびに腫瘍環境のバイオマーカーの識別に特有の機会を提供する場合がある。超音波で誘導された超音波治療法は、治療モダリティの直接のモニタリングを提供することがある。他の例では、ＵＳベースの腫瘍の特性付けは、生検の頻度と数を減らし、生検と血液検査で得られる情報を増やすことができる。熱的切除ＨＩＦＵ処置のモニタリングに使用されるＭＲＩと比較すると、ＵＳで誘導されたＵＳ処置は、はるかに安価な設備およびより小規模のインフラを必要とし、かつ患者により迅速に施すことができる。

【0272】

いくつかの例では、７．５ＭＨｚ、１０ｃｍの走査深度のリニアプローブを、構築された音響刺激処置システム、例えば、ロボットアーム上に統合することができ、および、スペックルトラッキング実験を実施することができる。他の例では、ＬＯＦＵ処置で誘発される温度変化は、局所的な熱ひずみを測定することによって決定することができる。局所的な熱ひずみは、温度に基づく音速の変動によって引き起こされた公称ひずみである可能性がある。温度変化を決定することにより、１つ以上の個別の点しか得られない、組織に埋め込まれた１つ以上の侵襲性熱電対とは対照的に、処置領域全体の温度マップを非侵襲的に生成することができる。熱ひずみは、生のＲＦデータをスペックルの変位を追跡することにより評価され得る。熱ひずみイメージング設計を、ロックマッチングアルゴリズムを使用して初期化して、ＲＦデータのフレーム間の運動を計算することができる。現時点での画像の各ブロックについては、アルゴリズムは周囲の近傍を検索して、最も一致するブロックを探すことができる。ブロックとその最大の一致の間のベクターは、そのようなブロックの変位を提供できる。正規化された相互相関を類似性メトリックとして使用してもよい。反復性ベイズの正則化補間（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）は、理想的な変位を特定して、変位画像のノイズを低減するためのサブサンプル精度を提供することができる。組織の熱性質に基づいて熱ひずみを計算するために変位を使用してもよい。測定方法は最大５０°Ｃまで有効であり、これは、ＨＩＦＵには適切ではないが、組織の熱膨張が熱ひずみを圧倒することができる音響刺激用途において、温度上昇に有利に適合する。処置の適用による温度変化（５～１５°Ｃ）は、有用な熱ひずみ画像（１～２％の全ひずみ）を生成するのに十分であり得る。局所組織の温度変化による生の超音波（高周波）信号を追跡するために使用される、正規化された相互相関の実施を決定することができる。一致するカーネルと検索領域との間の二次元の正規化された相関は、局所的に一致するメトリック画像を形成することができる。そのような一致するメトリック画像におけるピーク値を使用して、局所的信号変位を決定することができる。ＵＳパワーシステムを統合することができ、および、処置モニタリングをゲルファントムにおいて開発することができる。

【0273】

＜制御システム＞
本明細書で使用される制御システムは、本明細書に記載されるシステムの実施形態の構成要素であり、本明細書に記載されるシステムの実施形態の特定の機能を作動させるように構成される。制御システムはプロセッサーを備える。

【0274】

＜音響刺激処置システム装置の前臨床の試験＞
本明細書で提供される教示に基づいて、当業者は、動物実験を行い、本明細書に記載されるヒトを処置するシステムを開発することができる。

【0275】

いくつかの例では、臨床開発の時間が短縮され、免疫療法装置は、動物およびヒトの特定の癌を処置するために迅速かつ広く商業化される可能性がある。軟部織肉腫は、イヌではヒトの約５倍多く発生し、イヌの手足の簡単にアクセスできる表面的な場所で発生する可能性がある。

【0276】

いくつかの例では、ネオアジュバントは、免疫応答の正体暴露（ｄｅｂｕｎｋｉｎｇ）および活性化を含む場合がある。処置後の切除は、ＴＭＥに対する処置効果の早期の直接評価を提供することができる。ＴＭＥエンジニアリングが主要な戦略であるため、ネオアジュバントの使用は、局所効果の確立において、およびこれらの効果が全身的な免疫応答を生成することができるか否かの判定において特に有益であり得る。ネオアジュバント処置、生検、血液サンプル、ならびにそこから得られたデータは、他の適応症、および外科的切除なしの肉眼的疾患（ｇｒｏｓｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の処置での使用を促進するために使用できる。乳腺腫瘍摘出術前のネオアジュバント体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）レジメンを使用して、乳腺腫瘍を処置することができる。第１の方法は、自然発生的な原発性癌において免疫調節効果を生み出すためのＬＯＦＵ照射量の最適化を含み得る。腫瘍は、限局性の非転移性軟部肉腫、メラノーマ、および乳房腫瘍からなる群から選択され得る。１照射量レベル当たり６の患者を用いて、ＬＯＦＵの３つの照射量レベルを試験することができる。免疫表現型を決定してＴＭＥにおけるＬＯＦＵの免疫調節効果を決定するために、ＬＯＦＵ前およびＬＯＦＵ後の腫瘍組織サンプルを採取する場合があり、全身の変化を評価するために血液サンプルを採取する場合がある。この方法は、生検原発性腫瘍および血液と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の採取、外部ＬＯＦＵ処置、生検または原発腫瘍および排出リンパ節の生検あるいは切除、ＬＯＦＵ処置前後のＰＢＭＣの採取、ならびに患者のための標準的なケア療法からなる群から選択することができる 。方法の読み出しは、ＬＯＦＵの前後の組織の免疫表現型を決定することを含み得る。サンプルは、腫瘍とｄＬＮのサンプルの免疫組織化学／免疫蛍光検査法（ＩＨＣ／ＩＦ）、腫瘍とＰＢＭＣのサンプルのフローサイトメトリー、および腫瘍サンプルのＲＮＡＳｅｑを含み得る。腫瘍とｄＬＮのサンプルのＩＨＣ／ＩＦは、ヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３、およびＨＬＡ－ＤＲなどの基準的な既知のマーカーから選択され得る。腫瘍とＰＢＭＣのサンプルのフローサイトメトリーは、Ｔ細胞活性化マーカー（サイトカイン産生）、樹状細胞（活性化マーカー）、および骨髄性細胞ならびにマクロファージから選択され得る。ＲＮＡＳｅｑは１つ以上の腫瘍成分上で実施され得、Ｔ細胞活性化特性、ＩＦＮ、ＩＳＧ、アネルギー遺伝子、ＨＳＰとシャペロン、および免疫抑制遺伝子から選択され得る。

【0277】

第２の方法は、自然発生的な原発性癌において免疫調節効果を生み出すための放射線療法および免疫療法と組み合わせたＬＯＦＵの最適化を含み得る。腫瘍型は、限局性の非転移性軟部肉腫、メラノーマ、および乳房腫瘍からなる群から選択され得る。ＬＯＦＵおよび少分割ＲＴ、ＬＯＦＵおよび免疫療法（ｅｇ抗ＰＤ－（Ｌ）１））、少分割ＲＴ（ＨｙＲＴ）および免疫療法、ならびにＬＯＦＵおよび少分割ＲＴおよび免疫療法、ならびに免疫療法（抗－ＰＤ－１あるいは抗－ＰＤ－Ｌ１）を使用して、４つのレジメンおよび６の患者を試験することができる。レジメン前および／またはレジメン後に、免疫表現型を決定してＴＭＥにおけるＬＯＦＵの免疫調節効果および体循環を決定するために、ＬＯＦＵ腫瘍組織生検サンプルを採取してもよい。使用される方法は、ＰＢＭＣ、ＬＯＦＵ、および／またはＲＴ介入の収集を伴う生検原発腫瘍および排出リンパ節、ＰＢＭＣの収集を伴う原発腫瘍および排出リンパ節の生検または切除、ならびに標準的なケア療法からなる群から選択され得る。読み出しは、ＬＯＦＵ前および／またはＬＯＦＵ後の組織の免疫表現型を決定することであり得る。

【0278】

いくつかの実施形態において、処置は、免疫系を活性化する外科的切除前の、ＨｙＲＴ、およびＨｙＲＴと音響刺激処置システムのネオアジュバントの組み合わせであり得る。ＨｙＲＴは３ｘ１０Ｇｙであり得る。他の例では、プロセスは、二重周波数ＬＯＦＵおよびＨｙＲＴの使用により、ＬＯＦＵならびに１０Ｇｙの３倍の照射量を含むことがある。そのような処置の出力は切除組織の組織学的およびフローサイトメトリー、例えば、腫瘍浸潤リンパ球や骨髄細胞、ＤＡＭＰマーカーとエキソソーム、生存率、局所再発、ＣＴによる遠隔転移－肺検査、好中球／リンパ球比率の血液の分析、免疫学的応答（サイトカイン（ＩＦＮ－γ））、ｔｉｍｐａｎｉｓｔ ＴＢＤでのＩｍｍｕｎｏＳＥＱ ＴＣＲディープシーケンスによるＴ細胞受容体多様性プロファイリングによる評価が含まれ得る。

【0279】

＜ヒト臨床開発＞
超音波およびマルチパラメトリックＭＲＩは、画像で誘導された病期および処置を提供することができ、増加した精度で、ＵＲおよびＴＲエネルギーをＰＣ病変に局所化できるようにする。

【0280】

＜特定の適応症のための装置設計：＞
いくつかの例では、深さに関する腫瘍の大きさと位置、近接する臓器、ならびに超音波エネルギーを吸収および反射する骨とガス体と体輪郭を妨げる、感受性の処置誘発性の毒性を含む他の組織に基づいて様々な腫瘍を処置するために、ＡＰ装置の処置ヘッドおよびロボットの仕様を変更することができる。音響刺激処置システムは、軟部組織肉腫などの様々な癌を処置するために使用することができる。照射用器具内で独立して移動可能なトランスデューサーを備えた処置ヘッドの設計は、患者の前立腺癌および経会陰処置（ｔｒａｎｓｐｅｒｉｎｅａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に使用することができる。ヘッド内の独立したトランスデューサーの動きは、所定の処置を処置するためにロボットによる処置ヘッド全体のより少ない動きを必要とする場合があり、経会陰用途に有用であるように見える場合がある。音響刺激処置システムは、メラノーマ腫瘍の処置で使用することができる。診断用および照射用器具は乳癌の処置のための利用されることがある。最後に、ＡＰおよびＲＴ処置を同時に施すことができるように、超音波および電子放射線を含む組み合わせた機器。

【0281】

＜マウスモデルにおける超音波処置パラメーターおよびレジメンの最適化＞
本明細書に記載されている音響刺激ユニットは、多くの方法で構成することができ、および、超音波を首尾一貫してまたは支離滅裂に送達することができる４つのチャネルを備えた、電源を備えることができる。ＡＰユニットは、１００ｋＨｚ～４ＭＨｚの周波数を生成するように構成することができ、かつ、２つの高出力トランスデューサーから同時に超音波を送信するように構成することができ、その１つは４００ｋＨｚ前後で動作する。いくつかの例では、ＡＰユニットは、走査ロボット（例えば、２ ＤｏＦ）で増強して、より大きな腫瘍を処置し、関節運動を使用してより大きな処置体積を走査することができる。他の例では、多周波数ＡＰは、放射線療法（ＲＴ）と組み合わせて、（ｉ）ＭＨＣペプチド・ディスプレイＴ細胞活性化およびＴ細胞アネルギーの逆転への実証されたリンクを有する癌細胞ストレス、（ｉｉ）腫瘍血管系腫瘍潅流への変化、ならびに（ｉｉｉ）ＣＴＬで媒介した急性および記憶応答を駆動する腫瘍環境の再プログラムを誘導することができる。いくつかの実施形態において、併用処置は、適切なタイミングのシーケンスおよび照射量のパラメーターを伴う超音波またはＲＴ、ならびに生物活性化学または免疫チェックポイントを含み得る。試験は、ＡＰとＲＴの併用療法において使用される、超音波周波数とＲＴ照射量のタイミングおよび強度の影響を解明するために行なわれてもよい。

【0282】

＜併用療法シーケンス＞
いくつかの実施形態において、安全で、免疫原性があり、放射線腫瘍施設および患者のコンプライアンスでの使用を容易にするＡＰおよびＲＴの投与シーケンスを利用することができる。癌抗原特異的全身性ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介性免疫応答を生成するための、有効な手段が生み出され得る。ＬＯＦＵは、高線量放射線の約２～４時間にネオアジュバントとして与えられ得る。タイミングは、ＬＯＦＵとＲＴ機器の別個の位置に関連するロジスティクスの結果であり得る。さらに、実施形態に関連する研究は、ＬＯＦＵがＬＯＦＵ処置の約２～６時間後にＳＴＡＴ３リン酸化を低減できることを示唆している。いくつかの例では、ＲＴおよび化学療法によって誘発されたＳＴＡＴ３リン酸化は、Ｎｆ－ＫＢならびにＩＬ－６産生などの多数の生存関数を調節することができる。低ＳＴＡＴ３活性化のＬＯＦＵ後の過渡期中に施されるＲＴは、放射線障害を増加させる可能性がある。処置に関連する免疫原性パターンを解明および最適化する際に、さまざまな併用処置後のＩＬ－６／ＳＴＡＴ３およびＮｆ－ｋＢ経路を特徴付け、それに応じて補助的切除処置を計画することができる。

【0283】

組み合わせたＡＰとＲＴの治療については、麻酔時間および総処置時間を短縮するために、放射線療法の前またはその後の数分でＡＰ処置を施すことが有利な場合がある。放射線の近くに施される音響刺激が、ＡＰとＲＴが数時間離れている照射量レジメンと同等であるか、あるいはそれ以上の効果と治療指数を有している否かを判定することができる。ＤＡＭＰパターンの変化、ＲＯＳ損傷、他のストレスマーカー、および腫瘍免疫細胞の生息するもの（ｄｅｎｉｚｅｎｓ）を調べることができる。最初に、最初の臨床試験で５日間にわたって与えられたＡＰＴおよびＲＴの照射量の１～３回の処置が実施され得る。特定の低分割ＲＴスキームと同様に、局所投与を５日以内に完了して、免疫系を効果的に刺激することができる。

【0284】

癌免疫のサイクル概念によって示された局所的毒性処置と腫瘍抗原特異的ＣＴＬの到着との間の、５日の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）エンジニアリング・ウィンドウ中の、ＲＴとＡＰの適用のタイミングおよびシーケンス、ならびに処置間のＲＴとＡＰの照射量変調が決定され得る。開発カテゴリーは（ｉ）ＵＳとＲＴの強度および配列、ならびに（ｉｉ）生物活性の組み合わせを含み得る。

【0285】

＜エネルギー処置への材料の組み込み：ＡＭＰ＞
いくつかの実施形態において、音響の増幅および微粒子（ＡＭＰ）をＡＰレジメンに組み込んで、腫瘍局在免疫原性損傷（ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄａｍａｇｅ）を増大させ、その後、生物活性剤を送達することができる。いくつかの例では、ＡＭＰを、特定のサイズ、組成物、構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ）、および安定性に作り上げることができる。ＡＭＰを、腫瘍を有するマウスモデルにおいて、ＤＣおよび腫瘍抗原特定のエフェクターＴ細胞応答の活性化の有効性に関して試験することができる。ＡＭＰ剤は、静脈内（ＩＶ）および壁内（ＩＴ）投与経路で調べることができる。いくつかの例では、ＡＭＰは、現在ＡＭＰなしで利用されているものと本質的に同じＡＰパワーシーケンスで開発される場合がある。他の例では、粒子は、ＡＰＴで現在使用されているものと比較して、最大で約１０倍低いパワーでエネルギーを変換するように製剤化されてもよい。その結果、表現型の異質な癌細胞集団に対して効果的な、強固な先天性および適応性のある応答を生み出す癌特異的免疫原性パターンが生成される可能性がある。そのようなパターンは、ＤＡＭＰＳ生成、腫瘍脈管構造の刺激、およびＳＴＡＴ３リン酸化の減少からなる群から選択される１つ以上の構成要素を使用して、放射線相乗作用によって生成される。いくつかの実施形態において、ＡＭＰを利用するＡＰ処置を、ＲＴと組み合わせることができる。他の例では、放射線増感剤をＡＭＰ粒子へ取り込むことができる。

【0286】

ＡＰ多周波数構造装置は、大量の機械的および熱的ストレスを変化させるように設計される場合がある。超音波周波数が低下すると、粒子および周囲組織の両方で機械的破壊が増大する可能性がある。いくつかの例では、低周波数のＵＳ下で破裂する小さな粒子を含む、粒子径の非感受性が生成されることがある。材料および製作方法：粒子径は、当業者に知られているように、ナノ液滴の製剤に対応し得る。粒子は、例えば、直径２００ｎｍおよびマイクロバブル（１～３ミクロン）未満のエコー源性リポソームを含むことがある。

【0287】

＜粒子投与後のＡＰ適用タイミング＞
ＡＭＰのＩＶ注入直後および最大２４時間後に超音波適用を利用できる。ＡＭＰを生物活性剤の投与と組み合わせて使用すると、粒子を形成して、超音波エネルギーを腫瘍血管および血管周囲の空間に集中させ、そのような空間を機械的に破壊することができる。

【0288】

粒子は、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、およびペルフルオロオクチルブロマイド（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）（パーフルブロン）を含むことからなる群から選択されるパーフルオロ化分子を含むことがある。ペルフルブロンは、ＣＴ、ＭＲＩ、および超音波モダリティにわたってコントラストを提供することがある。リン脂質を含む様々な脂質を使用することができる。セラミドを組み込んだナノリポソームをＲＴ誘発性のセラミド産生として使用することができ、その後の癌細胞のアポトーシスおよび腫瘍脈管構造は、放射線の抗癌メカニズムと関連している可能性がある。製剤は、受動キャビテーション検出（ＰＣＤ）を使用して、細胞の生存率およびアッセイ、およびＤＡＭＰＳシグナル伝達アッセイで試験されてもよい。粒子製剤能力は、腫瘍標的化分子を用いた生物活性負荷および表面機能化の基礎として決定されることがある。

【0289】

＜エネルギー処置への材料組み込み：生物活性剤＞
いくつかの実施形態において、マルチモーダル処置（ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）は、強力な免疫原性パターンおよびプロセスが生じる腫瘍局所化処置を使用して、強力な腫瘍特異的ＣＴＬ媒介性応答を誘発するために開発され得る。生物活性剤は、ＰＤ－（Ｌ）１軸遮断薬を含む免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、ならびにおよび自然免疫系および適応免疫系の構成要素を活性化するか、そうでなければそれらに関与するものからなる群から選択され得る。ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＤ２７アゴニスト抗体、およびＦＬＴ３Ｌは、ＲＴと組み合わせて、バイモーダル（ｂｉｍｏｄａｌ）およびトリモーダル（ｔｒｉｍｏｄａｌ）の組み合わせで使用することができる。小分子免疫モジュレーターは、例えば、ＳＴＩＮＧアクチベーター、およびＴＬＲのアゴニストからなる群から選択され得る。その作用メカニズムが癌細胞に実質的に向けられる化学療法剤および標的療法剤は、免疫原性パターンを生成することができ、自然免疫および適応免疫細胞と直接相互作用することができる。いくつかの実施形態において、薬剤は、全身性抗癌免疫応答を促進するために選択され得る。薬剤は、ＰＡＲＰ阻害剤またはエピジェネティック・モジュレーターであってもよい。投与レジメンを決定し、処置された腫瘍において完全な原発性腫瘍退縮をもたらし、ＣＤ８＋ Ｔ細胞アネルギーを逆転させ、腫瘍成長を妨害するのに有効な免疫記憶をもたらす処置を特定することができる。部分的にＤＡＭＰによって、ＡＰＴ、ＲＴおよび生物活性剤の組み合わせによって、免疫原性のトリモーダル誘導を決定することができる。

【0290】

＜ＳＴＩＮＧアゴニスト＞
細胞質ゾル中のＤＮＡの存在は、病巣細胞、そうでなければ損傷細胞の指標になり得る。環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、環状ＤＮＡのＤＮＡセンサー環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）センシングによって、および細菌によって生成され得る。インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、ＣＤＡによって活性化され、および１型インターフェロンの産生を引き起こすＥＲ膜貫通タンパク質である。いくつかの例では、炎症は、ＣＴＬ活性化およびＮＫ細胞の細胞毒性の増加を含む、１型ＩＦＮを含むことがある。ＲＴは、ＡＰＣにおける環状ＤＮＡセンシングＳＴＩＮＧ経路により部分的に効果的であり得る。他の例では、１型インターフェロンの局所炎症は、ＡＰ処置によって生成されたパターン、および放射線を含む抗原放出処置と組み合わせて効果的であり得る。放射線治療メカニズムと一部重複するが、ＳＴＩＮＧは、放射線およびＡＰと組み合わせることができる。ＳＴＩＮＧアゴニストは５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）であり得る。いくつかの例では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、全身毒性を回避するために局所的に投与することができる。

【0291】

いくつかの例では、ＡＭＰをＡＰレジメンに組み込んで、腫瘍局在免疫原性損傷を増加させ、続いて、生物活性剤を送達することができる。ＡＭＰは、特定のサイズ、組成、構造に作られ、ＤＣ、腫瘍を有する動物またはヒトモデルにおける腫瘍抗原特異的エフェクターＴ細胞応答の活性化の有効性のために設計される場合がある。

【0292】

エネルギーベースの治療法と製薬およびバイオテクノロジー材料との組み合わせは、癌患者の処置に使用することができる。「エネルギー刺激免疫」を含むこれらの併用処置は、さまざまな癌に対処することができ、最初に所定の生理活性物質の臨床使用によって導かれる。生物活性は、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－（Ｌ）１軸、骨髄性成長因子Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ２７、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、骨髄性細胞を調節する薬剤、例えば、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、環状ＤＮＡセンシング経路ＳＴＩＮＧアゴニストを含む炎症性損傷／危険センシング薬剤（ｄａｎｇｅｒ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、ならびに、シャペロン、ＰＤＩ、カルネキシン、カルレティキュリン、ＣＤ７４、Ｈｓｐ５４、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７２、ＢｉＰ、Ｈｓｐ９０、Ｇｐ９６、クラスタリン、およびＣＤ４７を含む他の細胞表面タンパク質からなる群から選択され得る。メカニズムは、細胞プロセスを妨害し、ＵＰＲを誘発するＡＰＴの能力に一部由来する可能性があり、これは、ＲＴとＡＰの相乗効果も一部説明することができる。したがって、免疫チェックポイント阻害剤に加えて、処置に使用される治療剤は、ＰＡＲＰ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される薬剤を含み得る。

【0293】

＜デジタル処理装置＞
いくつかの実施例では、本明細書に記載されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、デジタル処理装置、あるいはその使用を含む。さらなる実施形態では、デジタル処理装置は、装置の機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）、汎用グラフィック処理装置（ＧＰＧＰＵ）、あるいはフィールドプログラマブルゲートアレイを備える。さらなる実施形態では、デジタル処理装置は、実行可能な命令を行うように構成された操作オペレーティングシステムをさらに備える。いくつかの実施形態では、デジタル処理装置はコンピュータネットワークに随意に接続される。さらなる実施形態では、デジタル処理装置は、ワールドワイドウェブにアクセスするようにインターネットに随意に接続される。さらなる実施形態では、デジタル処理装置は、クラウド・コンピューティング・インフラストラクチャーに随意に接続される。他の実施形態では、デジタル処理装置は、イントラネットに随意に接続される。他の実施形態では、デジタル処理装置は、データ記憶装置に随意に接続される。

【0294】

本明細書に開示される記載によれば、適切なデジタル加工装置は、非限定的な例として、サーバー・コンピューター、デスクトップ・コンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノート型コンピューター、サブノート型コンピューター、ネットブックコンピューター、ネットパッドコンピューター、セット・トップ・コンピューター、ハンドヘルドコンピュータ、インターネット・アプライアンス、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、携帯情報端末、ビデオゲーム機および車両を備える。当業者は、多くのスマートフォンが、本明細書に記載されるシステムでの使用に適していることを認識するであろう。当業者は、随意のコンピュータネットワーク接続を有する、選択されたテレビ、ビデオプレーヤー、およびデジタル音楽プレーヤーが、本明細書に記載されるシステムにおける使用に適していることを認識するであろう。適切なタブレットコンピュータは、当業者に既知のブックレット、スレート、および変換可能な構成を有するものを含む。

【0295】

いくつかの実施形態では、デジタル処理デバイスは実行命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを備える。オペレーティングシステムは、例えば、装置のハードウェアを制御し、アプリケーションの遂行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適切なサーバーオペレーティングシステムは、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤＲ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍｚｃ ＯＳ Ｘ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者は、適切なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムは、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸのようなオペレーティングシステムを含むことを認識するであろう。いくつかの実施形態において、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者は、適切なモバイルスマートフォンのオペレーティングシステムは、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）を含むことも認識する。当業者は、適切なメディアストリーミングデバイスのオペレーティングシステムは、非限定的な例として、Ａｐｐｌｅ ＴＶ（登録商標）、Ｒｏｋｕ（登録商標）、Ｂｏｘｅｅ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ ＴＶ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｈｒｏｍｅｃａｓｔ（登録商標）、Ａｍａｚｏｎ Ｆｉｒｅ（登録商標）、およびＳａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＨｏｍｅＳｙｎｃ（登録商標）を含むことも認識する。当業者はまた、適切なビデオゲームコンソールのオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｓｏｎｙ（登録商標）ＰＳ３（登録商標）、Ｓｏｎｙ（登録商標）ＰＳ４（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｘｂｏｘ ３６０（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｘｂｏｘ Ｏｎｅ、Ｎｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）Ｗｉｉ（登録商標）、Ｎｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）Ｗｉｉ Ｕ（登録商標）、およびＯｕｙａ（登録商標）を含み得ることを認識する。

【0296】

いくつかの実施形態では、デバイスは記憶デバイスおよび／またはメモリデバイスを備える。記憶装置および／またはメモリ装置は、一時的または永久的にデータまたはプログラムを記憶するために使用される１つ以上の物理的な機器である。いくつかの実施形態において、装置は揮発性メモリであり、記憶した情報を維持するための電力を必要とする。いくつかの実施形態において、上記デバイスは不揮発性メモリであり、デジタル処理デバイスに電力が供給されないときに、記憶した情報を保持する。更なる実施形態において、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態において、装置は、非限定的な例として、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ装置、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスク欲動、およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置を含む記憶装置である。さらなる実施形態において、記憶装置および／またはメモリ装置は、本明細書に開示されるものなどの装置の組み合わせである。

【0297】

いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ユーザーに視覚情報を送信するためのディスプレイを備える。いくつかの実施形態において、ディスプレイはブラウン管（ＣＲＴ）である。いくつかの実施形態において、ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる実施形態において、ディスプレイは薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ－ＬＣＤ）である。いくつかの実施形態において、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々なさらなる実施形態において、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブ－マトリクスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブ－マトリクスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）のディスプレイである。いくつかの実施形態において、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の実施形態において、ディスプレイはビデオプロジェクターである。またさらなる実施形態において、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどの装置の組み合わせである。

【0298】

いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ユーザーから情報を受信するための入力デバイスを備える。いくつかの実施形態において、入力装置はキーボードである。いくつかの実施形態において、入力装置は、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、またはスタイラスを含むポインティング装置である。いくつかの実施形態において、入力装置はタッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態において、入力装置は、声または他の音入力を捕らえるマイクロホンである。他の実施形態では、入力装置は、動作入力または視覚入力を捕らえるためのビデオカメラあるいは他のセンサーである。さらなる実施形態において、入力装置はＫｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐ Ｍｏｔｉｏｎなどである。またさらなる実施形態において、入力装置は本明細書に開示されるものなどの装置の組み合わせである。

【0299】

特定の実施形態では、図３２を参照すると、例示的なデジタル処理装置（１０１）は、本明細書に記載されているエネルギー刺激装置を操作するようにプログラムされるか、そうでなければ構成される。デジタル処理装置（１６０１）は、本開示のエネルギー刺激装置の様々な態様、例えば、処理工程を実施、を調整することができる。この実施形態では、デジタル処理装置（１６０１）は、シングルコアまたはマルチコア処理装置であり得る中央処理装置（ＣＰＵ、また本明細書の「処理装置」および「コンピューター処理装置」）（１６０５）、または並列処理のための多数の処理装置を備える。デジタル処理装置（１６０１）は、メモリまたは記憶場所（１６１０）（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置（１６１５）（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース（１６２０）（例えば、ネットワークアダプタ）、およびキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺機器（１６２５）も備える。メモリ（１６１０）、記憶装置（１６１５）、インターフェース（１６２０）、および周辺機器（１６２５）は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ（１６０５）と通信する。記憶装置（１６１５）は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータレポジトリ）であり得る。デジタル処理装置（１６０１）は、通信インターフェイス（１６２０）を用いて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）（１６３０）に動作できるように接続される。ネットワーク（１３０）は、インターネットおよび／またはエクストラネット、インターネットと通信状態にあるイントラネットおよび／またはエクストラネットであり得る。場合によって、ネットワーク（１６３０）は、電気通信および／またはデータのネットワークである。ネットワーク（１６３０）は、１つ以上のコンピューターサーバーを含むことができ、これはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる。ネットワーク（１６３０）は、場合によってはデジタル処理装置（１６０１）の助けにより、ピアツーピア・ネットワークを実施することができ、これは、デジタル処理装置（１６０１）に連結されたデバイスが、クライアントまたはサーバーとして動くことを可能にし得る。

【0300】

図３２を続けて参照すると、ＣＰＵ（１６０５）は、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る一連の機械読み取り可能な命令を実行する。この命令は、メモリ（１６１０）などのメモリ位置に保存され得る。この命令は、ＣＰＵ（１６０５）に向けることができ、これは後に、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ（１６０５）をプログラムするか、そうでなければ構成することができる。ＣＰＵ（１６０５）によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含む。ＣＰＵ（１６０５）は集積回路などの回路の一部であり得る。デジタル処理装置（１０１）の１つ以上の他のコンポーネントを回路に含めることができる。ある場合では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）である。

【0301】

引き続き図３２を参照すると、記憶装置（１６１５）は、ドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置（１６１５）は、ユーザーデータ、例えば、ユーザーのプレファレンスおよびユーザーのプログラムを記憶することができる。いくつかの実施形態では、デジタル処理装置（１６０１）は、イントラネットまたはインターネットを介して通信するリモートサーバーに位置するなど、外部の１つ以上の付加的なデータ記憶装置を備える。

【0302】

図３２を引き続き参照すると、デジタル処理装置（１６０１）は、ネットワーク（１６３０）を介して１以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、デジタル処理装置（１６０１）はユーザーのリモートコンピュータシステムと通信するころができる。リモートコンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（例えば、持ち運び可能なＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ－ｅｎａｂｌｅｄデバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末を含む。

【0303】

本明細書に記載される方法は、デジタル処理装置（１６０１）の電子記憶装置の場所、例えば、メモリ（１６１０）または電子記憶装置（１６１５）などに記憶された機械（例えば、コンピュータープロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ（１６０５）により実行され得る。場合によっては、コードは、記憶装置（１６１５）から検索され、かつプロセッサ（１６０５）による即時のアクセスのためにメモリ（１６１０）に保存することができる。いくつかの状況において、電子記憶装置（１６１５）は除外することができ、機械実行可能命令がメモリ（１６１０）に保存される。

【0304】

＜非一時的なコンピューター読み取り可能な記憶媒体＞
いくつかの実施例では、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、随意にネットワーク化されたデジタル処理装置のオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含む、プログラムでエンコードされた１つ以上の非一時的なコンピューター可読記憶媒体を含む。さらなる実施形態において、コンピューター可読記憶媒体はデジタル処理装置の有形成分である。またさらなる実施形態では、コンピューター読み取り可能な記憶媒体は、デジタル処理装置から随意に取り外し可能である。いくつかの実施形態において、コンピューター可読記憶媒体は、限定されないが、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、固体記憶装置、磁気円盤、磁気テープドライブ、光ディスク欲動、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む。いくつかの場合において、プログラムおよび命令は、永続的に、ほぼ永続的に、半永続的に、または非一時的に、媒体上でコードされる。

【0305】

＜コンピュータープログラム＞
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、少なくとも１つのコンピュータープログラム、あるいはその使用を含む。コンピュータープログラムは、デジタル処理装置のＣＰＵで実行可能であり、特別なタスクを実行するために書きこまれた、一連の命令を含む。コンピューター可読命令は、特定のタスクを行うか、または特定の抽出データタイプを実行する、機能、オブジェクト、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）、データ構造などのプログラムモジュールとして実行されることもある。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、コンピュータープログラムが様々な言語の様々なバージョンで書かれ得ることを認識する。

【0306】

コンピューター可読命令の機能性は、様々な環境において望ましいものとして組み合わせられるか、または分布されてもよい。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは１つの連続した命令を含む。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは複数の連続した命令を含む。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、１つの場所から提供される。他の実施形態において、コンピュータープログラムは複数の場所から提供される。様々な実施形態において、コンピュータープログラムは、１以上のソフトウェアモジュールを含む。様々な実施形態において、コンピュータープログラムは、一部または全体として、１つ以上のウェブアプリケーション、１つ以上のモバイルアプリケーション、１つ以上のスタンドアロンアプリケーション、１つ以上のウェブブラウザプラグイン、拡張、アドイン、またはアドオン、あるいはこれらの組み合わせを含む。

【0307】

＜ウェブアプリケーション＞
いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムはウェブアプリケーションを備える。本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、ウェブアプリケーションが、様々な実施形態において、１以上のソフトウェアフレームワークおよび１以上のデータベースシステムを利用することを認識する。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）．ＮＥＴまたはＲｕｂｙ ｏｎ Ｒａｉｌｓ（ＲｏＲ）などのソフトウェアフレームワーク上で作成される。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、非限定的な例として、リレーショナルの、非リレーショナルの、オブジェクト指向の、結合性の、および、ＸＭＬのデータベースシステムを含む、１つ以上のデータベースシステムを利用する。更なる実施形態において、適切なリレーショナルデータベースシステムは、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＳＱＬ Ｓｅｒｖｅｒ、ｍｙＳＱＬ（商標）、およびＯｒａｃｌｅ（登録商標）を含む。当業者は、ウェブアプリケーションが、様々な実施形態において、１以上の言語の１以上のバージョンで書かれることを認識する。ウェブアプリケーションは、１以上のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアント側スクリプト言語、サーバー側コード化言語、データベース照会言語、またはそれらの組み合わせで書かれてもよい。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、ハイパーテキストマークアップ言語（ＨＴＭＬ）、拡張可能ハイパーテキストマークアップ言語（ＸＨＴＭＬ）、または拡張可能マークアップ言語（ＸＭＬ）などのマークアップ言語である程度までは書かれている。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、カスケーディング・スタイル・シート（ＣＳＳ）などのプレゼンテーション定義言語である程度までは書かれている。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ ａｎｄ ＸＭＬ（ＡＪＡＸ）、Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ａｃｔｉｏｎｓｃｒｉｐｔ、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、またはＳｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）などのクライアント側スクリプトで、ある程度書かれる。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、Ａｃｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＡＳＰ）、ＣｏｌｄＦｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（商標）、ＪａｖａＳｅｒｖｅｒ Ｐａｇｅｓ（ＪＳＰ）、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰＨＰ）、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｒｕｂｙ、Ｔｃｌ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、ＷｅｂＤＮＡ（登録商標）、またはＧｒｏｏｖｙなどのサーバー側コード化言語で、ある程度書かれる。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションは、構造化クエリ言語言葉（ＳＱＬ）などのデータベースクエリ言語である程度までは書かれている。いくつかの実施形態において、ウェブアプリケーションは、ＩＢＭＲ Ｌｏｔｕｓ Ｄｏｍｉｎｏ（登録商標）などの企業サーバー製品を統合する。いくつかの実施形態では、ウェブアプリケーションはメディアプレイヤー要素を含んでいる。様々なさらなる実施形態において、メディアプレイヤー要素は、限定されないが、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）、ＨＴＭＬ ５、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ｊａｖａ（登録商標）、およびＵｎｉｔｙ（登録商標）を含む、多くの適切なマルチメディア技術の１以上を利用する。

【0308】

＜モバイルアプリケーション＞
いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムは、モバイルデジタル処理装置に提供されるモバイルアプリケーションを含む。いくつかの実施形態では、モバイルアプリケーションは製造時にモバイルデジタル処理装置に提供される。他の実施形態では、モバイルアプリケーションは、本明細書に記載されるコンピュータネットワークによってモバイルデジタル処理装置に提供される。

【0309】

本明細書に提供される開示を考慮して、モバイルアプリケーションは、当該技術分野において既知のハードウェア、言語、開発環境を使用して、当業者に既知の技術によって作成される。当業者は、モバイルアプリケーションが複数の言語で書かれることを認識する。適切なプログラミング言語は、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、オブジェクティブ－Ｃ、Ｊａｖａ（商標）、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、パスカル、オブジェクトパスカル、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｒｕｂｙ、ＶＢ．ＮＥＴ、ＷＭＬ、およびＣＳＳを含むまたは含まないＸＨＴＭＬ／ＨＴＭＬ、あるいはこれらの組み合わせを含む。

【0310】

適切なモバイルアプリケーションの開発環境は、いくつかのソースから利用可能である。市販で入手可能な開発環境は、非限定的な例として、ＡｉｒｐｌａｙＳＤＫ、ａｌｃｈｅＭｏ、Ａｐｐｃｅｌｅｒａｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｌｓｉｕｓ、Ｂｅｄｒｏｃｋ、Ｆｌａｓｈ Ｌｉｔｅ、．ＮＥＴ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｒｈｏｍｏｂｉｌｅ、およびＷｏｒｋＬｉｇｈｔ Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍを含む。他の開発環境が無料で利用可能であり、非限定的な例として、Ｌａｚａｒｕｓ、ＭｏｂｉＦｌｅｘ、ＭｏＳｙｎｃ、およびＰｈｏｎｅｇａｐを含む。また、モバイルデバイスのメーカーは、非限定的な例として、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）およびｉＰａｄ（登録商標）（ｉＯＳ）ＳＤＫ、Ａｎｄｒｏｉｄ（商標）ＳＤＫ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ＳＤＫ、ＢＲＥＷ ＳＤＫ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＯＳ ＳＤＫ、Ｓｙｍｂｉａｎ ＳＤＫ、ｗｅｂＯＳ ＳＤＫ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ ＳＤＫを含む、ソフトウェア開発キットを流通させている。

【0311】

当業者は、様々な商用のフォーラムが、限定されないが、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ａｐｐ Ｓｔｏｒｅ、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標） Ｐｌａｙ、Ｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＷｅｂＳｔｏｒｅ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ａｐｐ Ｗｏｒｌｄ、Ｐａｌｍ ｄｅｖｉｃｅｓのＡｐｐ Ｓｔｏｒｅ、ｗｅｂＯＳのＡｐｐ Ｃａｔａｌｏｇ、ＭｏｂｉｌｅのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）デバイスのＯｖｉ Ｓｔｏｒｅ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ａｐｐｓ、およびＮｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）ＤＳｉ Ｓｈｏｐを含む、モバイルアプリケーションの流通に利用可能であることを認識する。

【0312】

＜スタンドアロンアプリケーション＞
いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムは、既存プロセスに対するアドオンでない、例えばプラグインでない、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムであるスタンドアロンアプリケーションを含む。当業者は、スタンドアロンアプリケーションがしばしばコンパイルされることを認識するであろう。コンパイラは、プログラミング言語で書かれたソースコードをアセンブリ言語または機械コードのようなバイナリオブジェクトコードに変換するコンピュータープログラムである。適切なコンパイルされたプログラミング言語は、非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、オブジェクティブ－Ｃ、ＣＯＢＯＬ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｊａｖａ（商標）、リスプ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、およびＶＢ．ＮＥＴ、またはこれらの組み合わせを含む。コンパイルは実行可能プログラムを作成するために少なくとも部分的に行われることが多い。いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムは１つ以上の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含んでいる。

【0313】

＜ウェブブラウザプラグイン＞
いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、ウェブブラウザのプラグイン（例えば、伸長機能など）を含む。コンピューティングでは、プラグインは、より大きなソフトウェアアプリケーションに具体的な機能性を加える１つ以上のソフトウェアコンポーネントである。第三者の開発者がアプリケーションを拡張する能力を作成する、容易に新しい特徴を加えるサポートを行う、およびアプリケーションのサイズを縮小することができるように、ソフトウェアアプリケーションのメーカーは、プラグインをサポートする。サポートされている場合、プラグインは、ソフトウェアアプリケーションの機能性のカスタマイズを可能にする。例えば、プラグインは、一般に、ビデオを再生する、対話機能を作成する、ウイルスをスキャンする、および特定のファイルタイプを表示するために、ウェブブラウザで使用される。当業者は、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ｐｌａｙｅｒ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）、およびＡｐｐｌｅ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）を含む、様々なウェブブラウザのプラグインに精通している。いくつかの実施形態では、ツールバーは、１つ以上のウェブブラウザ拡張機能、アドイン、またはアドオンを含む。いくつかの実施形態では、ツールバーは、１つ以上のエクスプローラバー、ツールバンド、またはデスクバンドを含む。

【0314】

本明細書で提供される開示に照らして、当業者は、非限定的な例として、Ｃ＋＋、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｊａｖａ（商標）、ＰＨＰ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、およびＶＢ．ＮＥＴ、またはそれらの組み合わせを含む、様々なプログラミング言語でのプラグインの開発を可能にするいくつかのプラグインフレームワークが利用可能であることを認識するだろう。

【0315】

ウェブブラウザ（インターネットブラウザとも呼ばれる）は、ワールドワイドウェブ上の情報資源を検索する、表示する、およびトラバースする（ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ）ための、ネットワーク接続したデジタル処理デバイスとの使用のために設計された、ソフトウェアアプリケーションである。適切なウェブブラウザは、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）、Ｍｏｚｉｌｌａ（登録商標）Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍｅ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｓａｆａｒｉ（登録商標）、Ｏｐｅｒａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）Ｏｐｅｒａ（登録商標）、およびＫＤＥ Ｋｏｎｑｕｅｒｏｒを含む。いくつかの実施形態では、ウェブブラウザは、モバイルのウェブブラウザである。モバイルのウェブブラウザ（マイクロブラウザ、ミニブラウザ、およびワイヤレスブラウザ）は、限定しない例として、ハンドヘルドコンピュータ、タブレットコンピュータ、ネットブックコンピューター、サブノートブックコンピュータ、スマートフォン、ニュージックプレーヤー、携帯情報端末（ＰＤＡ）およびハンドヘルドビデオゲームシステムを含む、モバイルのデジタル処理装置上の使用のために設計されている。適切なモバイルウェブブラウザは、限定されないが、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）ブラウザ、ＲＩＭ ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ブラウザ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｓａｆａｒｉ（登録商標）、Ｐａｌｍ（登録商標）Ｂｌａｚｅｒ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）Ｂｒｏｗｓｅｒ、携帯用のＭｏｚｉｌｌａ（登録商標）Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ、Ａｍａｚｏｎ（登録商標）Ｋｉｎｄｌｅ（登録商標）Ｂａｓｉｃ Ｗｅｂ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）ブラウザ、Ｏｐｅｒａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）Ｏｐｅｒａ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ、およびＳｏｎｙ（登録商標）ＰＳＰ（商標）ブラウザを含む。

【0316】

＜ソフトウェアモジュール＞
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、ソフトウェア、サーバー、および／またはデータベースモジュール、あるいはこれらの使用を含む。本明細書で提供される開示を考慮して、ソフトウェアモジュールは、当該技術分野で既知のマシン、ソフトウェア、および言語を使用する、当業者に既知の技術によって作り出される。本明細書に開示されるソフトウェアモジュールは多数の方法で実装される。様々な実施形態において、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。更に様々な実施形態において、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、コードの複数のセクション、複数のプログラムミングオブジェクト、複数のプログラムミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態において、１以上のソフトウェアモジュールは、限定されないが、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、および独立型アプリケーションを含む。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは、１つのコンピュータープログラムまたはアプリケーション中にある。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、１より多くのコンピュータープログラムまたはアプリケーション中にある。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは１つのマシン上でホストされる（ｈｏｓｔｅｄ）。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは１より多くのマシン上でホストされる。さらなる実施形態において、ソフトウェアモジュールは、クラウドコンピューティングプラットフォーム上でホストされる。いくつかの実施形態において、ソフトウェアモジュールは１つの位置にある１つ以上のマシン上でホストされる。他の実施形態において、ソフトウェアモジュールは、１より多くの位置にある１つ以上のマシン上でホストされる。
＜データベース＞
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のプラットフォーム、システム、媒体、および方法は、１つ以上のデータベース、またはその使用を含む。本明細書で提供される本開示を考慮して、当業者は、多くのデータベースが情報の保管と検索に適していることを認識するであろう。様々な実施形態において、適切なデータベースは、限定されないが、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向型データベース、オブジェクトデータベース、実体関連モデルデータベース、連想データベース、およびＸＭＬデータベースを含む。さらなる非限定的な例としては、ＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、ＭｙＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、ＤＢ２、およびＳｙｂａｓｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、データベースはインターネットを利用したものである。さらなる実施形態では、データベースはウェブを利用したものである。またさらなる実施形態では、データベースはクラウドコンピューティングを利用したものである。他の実施形態では、データベースは１つ以上のローカルコンピュータ記憶装置を利用したものである。

【0317】

＜実施例５＞
パイロット有効性実験では、通常、コホートまでｎ＝３５／を使用する。出力およびエンドポイントは、腫瘍サイズ（一元配置分散分析）、生存率（カプラン・マイヤー、ログランク検定）、および肺転移数（ｍｅｔ ｃｏｕｎｔ ｉｎ ｌｕｎｇ）を含む。さらに、腫瘍進行のモニタリングは、ＩＲ－７８３色素、およびＩＶＩＳ機器ならびにＰＥＴ ＳＰＥＣＴ：Ｉｎｖｅｏｎ（商標）のマルチモーダルのＰＥＴ・ＳＰＥＣＴ・ＣＴプラットフォーム上でのＮＩＲイメージングを含む、様々な画像化手法を使用して、非侵襲的に分析され得る。

【0318】

最終的な実験は、１つのコホート当たり８～１２匹の動物を含む；３匹を、組織学のために処置の２４時間後に屠殺し、３匹を腫瘍免疫性アッセイのためにＲｘの１週後に屠殺し、疾患進行を調査するために５匹を６０日間追跡した。

【0319】

マウス癌モデルは、Ｃ５７ｂｌｃｋ６、ＧＥＭ、ならびにＢａｌｂ／ｃマウスそれぞれに、接種を受けて発生するＢ１６Ｆ１０ｍ１メラノーマ、ＴＰＳＡ２３前立腺、および４Ｔ１乳房マウス腫瘍細胞を含む。Ｂ１６Ｆ１０と４Ｔ１の両方は非常に速く転移することができるが、よりゆっくり転移するモデルも利用することができる。

【0320】

超音波およびＲＴの装置は、全ＲＯＩを処置する目的で、接種腫瘍、ならびに正常組織の直接周辺と関心領域（ＲｏＩ）に向けられたＡＰＴおよびＲＴを含む。複数のトランスデューサーで構成された超音波システムは、１Ｍｈｚおよび２５０ｋＨｚで１００～１０，０００Ｗ／ｃｍ^２を送達することができる。通常、超音波処置は、処置された断面当たり５０～１５０Ｗ／ｃｍ^２で１～５秒間施される。

【0321】

Ｘｓｔｒａｈｌ Ｌｉｍｉｔｅｄの小動物放射線研究プラットフォーム（ＳＡＲＲＰ）を使用して、放射線を送達した。ＳＡＲＲＰユニットは、ＣＴ走査および組織セグメンテーションならびに処置計画機能を有している。生存率、原発性腫瘍サイズ、および肺転移数は、可能性のあるエンドポイントである。

【0322】

出力は、癌細胞のＥＭＴ状態（ビメンチン染色）、循環腫瘍細胞の定量化、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、および腫瘍環境における間質細胞（溶解物の免疫組織化学的検査およびＦＡＣＳ）、細胞間、細胞表面、およびアップレギュレートされたＥＲストレスマーカーのエキソソーム定量化、シャペロンカルレティキュリン、ＨＳＰ７０とＨＳＰ９０、ＢｉＰ；ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１；低酸素ＨＩＦ－１α、ならびに損傷レスポンダーＳＴＡＴ３、Ｎｆ－κＢ（ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫組織化学的検査）を含む。出力はさらに、ＲＴに関して、活性酸素種（ＲＯＳ）と窒素種（ＲＮＳ）損傷ＤＮＡの生成、腫瘍細胞抗原性の増大と、抗原およびＤＣ活性化ＤＮＡの放出の増大を含むことがある。したがって、迅速かつ感受性の蛍光アッセイであるＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）インビトロのＲＯＳ／ＲＮＳアッセイキットを使用することにより、様々な時点で処置された腫瘍でＲＯＳとＲＮＳの産生を測定する。

【0323】

腫瘍で処置されたサンプルからＲＮＡを単離し、完全なＲＮＡ－ｓｅｑ解析あるいはＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイを含む装置を使用して分析することによるＥＲストレス調節因子は、小胞体中のミスフォールドタンパク質の蓄積および小胞体ストレス応答に含まれる調節因子（つまりＣａｌｒ、Ｅｒｏ１Ｉｂ、Ｐｐｉａ、Ｓｃａｐ）を認識し、応答する３７０の鍵遺伝子の検出を提供する。

【0324】

血液アッセイは、ＣＢＣおよび好中球対リンパ球の比率を含むことができる。処置の前後に採取された血清を、ＥＬＩＳｐｏｔを使用してサイトカインについて、場合によっては、ケモカイン、Ｔｈ１とＴｈ２サイトカイン、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＮＦβ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＴＧＦβ、メタロプロテアーゼ、および成長因子を含む、最大９７の様々な標的を検出するさらに詳述されたサイトカインマウス膜抗体アレイについて分析することができる。ＬＮおよび脾細胞はＩＮＦγおよびＩＬ２であってもよく、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が腫瘍溶解物にさらされている。記憶Ｔ細胞集団が正当化される場合、原発腫瘍細胞の消失の少なくとも３０日後に、左側腹部への接種が起こり、腫瘍の成長およびエフェクターメモリーＴ細胞を定量化することがきる。データはすべて未処置の腫瘍サンプルと比較することができる。

【0325】

本明細書に記載されているようなシステムは多くの方法で構成することができ、複数の位置へのビームの走査により低い強度に焦点を置いた超音波を用いる全身スキャンを例えば実施するように構成することができる。

【0326】

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示されかつ記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

【0327】

＜例示的な実施形態＞
１．患者の免疫系を刺激するための超音波システムであって、上記システムは：プローブであって、少なくとも０．５ｃｍ^３のビーム体積と、１０Ｗ／ｃｍ^２～９００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内のビーム体積内の強度とを含む超音波ビームを生成するように構成された超音波トランスデューサーを含むプローブと；超音波トランスデューサーにつながれたプロセッサーであって、プロセッサー構成命令は、ビームを用いて複数の位置で患者を処置する、プロセッサーと、を備える。２．プロセッサーおよび超音波トランスデューサーは、少なくとも約２ｃｍ^３の全組織体積にわたって、毎秒少なくとも約０．５ｃｍ^３の速度で組織を体積に関して走査するように構成され、随意に、ここで、走査速度は、走査される組織の総体積にして、毎秒約０．５ｃｍ^３～約５０ｃｍ^３の範囲内であり、随意に、組織の総体積は約２ｃｍ^３～約１０００ｃｍ^３の範囲内であり、および随意に、組織の総体積は約４ｃｍ^３～約５００ｃｍ^３の範囲内であり、ならびに随意に、体積の全体は上記範囲内の強度を用いて走査されている、実施形態１に記載のシステム。３．ビーム体積は０．５ｃｍ^３～１０００ｃｍ^３の範囲内であり、および随意に、ビーム体積は１ｃｍ^３～５００ｃｍ^３の範囲、ならびに随意に、約２ｃｍ^３～約２５０ｃｍ^３の範囲内である、実施形態１に記載のシステム。４．強度は、約２０Ｗ／ｃｍ^２～約５００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内である、実施形態１に記載のシステム。５．超音波トランスデューサーにつながれたリンケージを含み、上記プロセッサーは、上記リンケージにつながれ、および組織の複数の体積領域を処置するためにトランスデューサーを複数の位置に移動させるための命令で構成され、複数の体積領域の各々は、少なくとも０．５ｃｍ^３と、１０Ｗ／ｃｍ^２～９００Ｗ／ｃｍ^２の範囲内の強度とを含む、実施形態１に記載のシステム。６．プロセッサーは、複数の体積領域を重複させるための命令で構成される、実施形態５に記載のシステム。７．プロセッサーは、超音波トランスデューサーが超音波ビームを送信している間に、第１の体積領域に対応する第１の位置から第２の体積領域に対応する第２の位置に超音波トランスデューサーを移動させるための命令で構成される、実施形態５に記載のシステム。８．リンケージは、複数のジョイントを含むロボットアームを備え、上記複数のジョイント各々は、ジョイントの角度を制御するためにアクチュエーターにつながれ、および、プロセッサーは、複数の位置に超音波ビームを向けるために、複数のジョイントの複数の角度を決定するための命令で構成される、実施形態５に記載のシステム。９．プロセッサーは、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成される、実施形態５に記載のシステム。１０．プロセッサーは、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーを患者の皮膚の表面と位置合わせするために、複数の位置の各々で超音波トランスデューサーの配向を制御するように構成され、任意に、ここで、複数の位置の各々は、６自由度で超音波トランスデューサーを配置するために三次元の位置および三次元の配向に対応する、実施形態９に記載のシステム。１１．ロボットアームは、複数の指を備え、前記超音波トランスデューサーは複数のトランスデューサーを含み、複数の指の各々は、その上に取り付けられたトランスデューサーにつながれ、複数の指の各々は、標的位置に超音波ビームを向けるために、指上に取り付けられたトランスデューサーからの超音波ビームのトランスデューサーの角度を制御するように構成される、実施形態５に記載のシステム。１２．超音波処置と組み合わせられる補助療法をユーザーが指定するためのユーザー入力さらに含み、ここで、プロセッサーは、組織への超音波ビームの処置時間を記録し、補助療法のための時間を出力するための命令で構成され、随意に、ここで、補助療法は、放射線療法、化学療法、および免疫療法からなる群から選択され、ならびに、随意に、出力時間は補助療法のための時間枠を含む、実施形態１のシステム。１３．プロセッサーは、ユーザーにユーザーインタフェースを提供するための命令で構成され、上記ユーザーインタフェースは、患者の腫瘍の画像および入力処置の位置を含む、実施形態１に記載のシステム。１４．プロセッサーは、全組織体積の組織エラストグラフィを実施するように構成される、実施形態１に記載のシステム。１５．プロセッサーは、拡散パラメーターを入力として受け取るように構成される、実施形態１に記載のシステム。１６．患者を処置する方法であって、上記方法は：不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、マイクロ波、低密度焦点式超音波（ＬＯＦＵ）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、高周波エネルギー、および寒冷療法からなる群から選択される、免疫刺激エネルギーを施す工程と；樹状細胞標的療法、エフェクターＴ細胞標的、免疫チェックポイント阻害からなる群から選択される免疫療法を施す工程と、を含む、方法。１７．樹状細胞標的療法は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、リガンドおよびアゴニスト、ＲＩＧ１ヘリカーゼアクチベーター、抗ＣＤ４０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＩＮＦ－α、ＴＮＦ－βからなる群から選択される、実施形態１６に記載の方法。１８．エフェクターＴ細胞標的は、抗ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ、抗ｆｏｘｐ４０ ＴＧＦ－β阻害剤、抗ＣＤ１３７、Ｔ細胞活性化のための人工の免疫シナプス、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２７、および抗ＧＤ２からなる群から選択される、実施形態１６に記載の方法。１９．チェックポイント阻害は、抗ＣＴＬ４、抗ＰＤ１、抗ＶＩＳＴＡ、ｔｉｍ３、ＩＤＯ阻害剤、ノルハルマン、ロスマリン酸、ＣＯＸ－２阻害剤、１－メチルトリプトファン、エパカドスタット、およびナボキシモドからなる群から選択される、実施形態１６に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【手続補正書】

【提出日】2024-08-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書及び図面に記載の発明。

【外国語明細書】