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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024016024
(43)【公開日】2024-02-06
(54)【発明の名称】抗体結合Ｓｉｇｌｅｃ１５及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240130BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240130BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023172391
(22)【出願日】2023-10-03
(62)【分割の表示】P 2022547787の分割
【原出願日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】63/000,566
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】522040148
【氏名又は名称】ビオシオン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン、ミンジウ
(72)【発明者】
【氏名】シア、シュカイ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的化療法に不応答性の癌患者に対する治療的アプローチを提供する。
【解決手段】ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分が、本明細書において提供される。抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び抗体又はその抗原結合部分を発現する方法も提供される。免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びにそれを使用する治療法がさらに提供される。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分が、本明細書において提供される。抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び抗体又はその抗原結合部分を発現する方法も提供される。免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びにそれを使用する治療法がさらに提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＨ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（２）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（３）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）及び３のそれぞれ；（４）配列番号９、１０及び１１のそれぞれ；又は（５）配列番号３３、３４及び３５のそれぞれと、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；及び／又は
ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域であって、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号１２、１３及び１４のそれぞれ；又は（３）配列番号３６、３７及び３８のそれぞれと、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域；を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＨ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（２）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（３）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）及び３のそれぞれ；（４）配列番号９、１０及び１１のそれぞれ；又は（５）配列番号３３、３４及び３５のそれぞれと、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；及び／又は
ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域であって、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号１２、１３及び１４のそれぞれ；又は（３）配列番号３６、３７及び３８のそれぞれと、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域；を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願及び援用
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，５６６号に対する優先権を主張するものである。
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０００，５６６号に対する優先権を主張するものである。
【0002】
上記の出願、及びその中に又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用又は参照される全ての文献（本明細書に引用される全ての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用されるあらゆる文献に記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者の説明書、記載、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施に用いられ得る。より詳細には、全ての参照される文献は、各個々の文献が、具体的に及び個別に、参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。本開示に記載されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日のものであるＧｅｎｂａｎｋ配列とともに、参照により援用される。
【0003】
本開示は、一般に、高い親和性及び機能性でＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する、完全ヒト、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体などの単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。その抗体又は抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及びその抗体又は抗原結合部分を発現するための方法も提供される。本開示はさらに、免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体若しくはその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びに本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体を用いた診断及び治療方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
免疫療法は、癌などの疾患と闘う免疫システムを追加免疫する画期的な治療的アプローチである。それは、多くの適応症に適用可能であり、他の標準治療と比べて高グレードの毒性を低くする。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路が、腫瘍免疫療法において最新のターゲットであり、抗ＰＤ－１抗体Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）及びＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）など、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１のいくつかの阻害剤が臨床的に承認されている。しかしながら、ある患者のサブセットはかかる治療に応答しない。近年の研究によって明らかにされたように、Ｓｉｇｌｅｃ１５標的化は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的化療法に不応答性の癌患者に対する補足的なアプローチであり得る（Ｊｕｎ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５：６５６－６６６）。
【0005】
Ｓｉｇｌｅｃ１５は、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン構造を有するＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーである。それは、２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２との相互作用に必須のリジン残基を有する膜貫通ドメイン、及び細胞質テールを含有する（Ｔａｋａｓｈｉ Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７（８）：８３８－８４６）。
【0006】
Ｓｉｇｌｅｃ１５は、破骨細胞上で発現され、破骨細胞分化及び骨改変において、ある役割を果たす（Ｈｉｒｕｍａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４０９（３）：４２４－４２９；Ｔａｋａｓｈｉ Ａｎｇａｔａ（２０２０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１０）。抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の投与によって、げっ歯類モデルにおいて骨破壊性骨吸収が阻害され、骨質量が増加した（Ｓｔｕｉｂｌｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８９（１０）：６４９８－６５１２；Ｓａｔｏ Ｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｏｎｅ １１６：１７２－１８０）。
【0007】
Ｓｉｇｌｅｃ１５は、腫瘍関連マクロファージ上でも発現し、優先的にシアリルＴｎ（ｓｉａｌｙｌ－Ｔｎ）抗原、腫瘍関連グリカン構造を認識する。シアリルＴｎ／癌細胞系及びＭ－ＣＳＦ誘発ヒトマクロファージ又はＳｉｇｌｅｃ１５＋骨髄性細胞系の共培養によって、上皮間葉転換及び癌細胞の拡散転移を促進するトランスフォーミング増殖因子－βの産生が誘発された（ＴａｋａｍｉｙａＲ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２３（２）：１７８－１８７）。Ｌｉｅｐｉｎｇ Ｃｈｅｎｇらが、最近、Ｓｉｇｌｅｃ１５がさらに、非小細胞肺癌臨床試料において腫瘍細胞及び／又は腫瘍関連ストローマ細胞で発現されることを発見した。彼らは、Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質が、Ｔ細胞増殖及び活性化を抑制し、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体がＴ細胞抑制を復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｅ）し、且つインビボで癌増殖を弱めることも見出した。Ｓｉｇｌｅｃ１５及びＰＤ－Ｌ１は、癌組織において相互に排他的であり、Ｓｉｇｌｅｃ１５は、補足的治療標的としての役割を果たし得て、上記（Ｊｕｎ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）、前出）のように、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断に対して不応性である患者に代替の治療を提供する。ＮＣ３１８、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体は、非小細胞肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸直腸癌、及び乳癌などの進行固形腫瘍を有する患者において臨床的に試験されており、疾患の長期の安定化が患者の５４％で確認され、５．４％で奏効が確認された（ＳｕｎＪ ｅｔ ａｌ．，（２０２１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２７（３）：６８０－６８８）。
【0008】
骨改変、及び腫瘍発生におけるＳｉｇｌｅｃ１５の関与を考慮すると、Ｓｉｇｌｅｃｔ１５は確かに、出現しつつある、有望な治療標的である。向上した薬学的特性を有する抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が必要とされている。
【0009】
本出願におけるいずれかの文書の引用又は同定は、かかる文書が、本発明の先行技術として利用可能であるという承認ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ１５（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５、及びサルＳｉｇｌｅｃ１５）に結合し、且つＳｉｇｌｅｃ１５－ｃｈ５Ｇ９（Ｎｅｘｔｃｕｒｅ）などの先行技術の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体と比較して、より高くないとしても同等の、Ｓｉｇｌｅｃ１５に対する結合親和性／能力、及びＬＲＲＣ４ＣなどのリガンドへのＳｉｇｌｅｃ１５結合に対してブロッキング活性を有する、マウス、キメラ、ヒト若しくはヒト化単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。抗体又はその抗原結合部分は、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）することができる。
【0011】
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質の検出、並びに腫瘍及び骨粗鬆症などのＳｉｇｌｅｃ１５関連疾患の治療及び予防を含む様々な用途に使用され得る。
【0012】
したがって、一態様において本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する、ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（２）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ）及び３のそれぞれ；（３）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）及び３のそれぞれ；（４）配列番号９、１０及び１１のそれぞれ；又は（５）配列番号３３、３４及び３５のそれぞれと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域；及び／又はｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域であって、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号１２、１３及び１４のそれぞれ；又は（３）配列番号３６、３７及び３８のそれぞれと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域を有する、単離モノクローナル抗体（例えば、ヒト、マウス、キメラ又はヒト化抗体）、又はその抗原結合部分に関する。
【0013】
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る、重鎖可変領域と、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含み得る、軽鎖可変領域と、を含み得て、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨ ＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域は、（１）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）、３、４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ）、３、４、５及び６のそれぞれ；（３）配列番号１、２（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）、３、４、５及び６のそれぞれ；（４）配列番号９、１０、１１、１２、１３及び１４のそれぞれ；又は（５）配列番号３３、３４、３５、３６、３７及び３８のそれぞれと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得て、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する。
【0014】
本開示の抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号７（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ；Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ；又はＸ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）、１５、３９、４０又は４１と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得て、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する。配列番号７（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）のアミノ酸配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列によってコードされ得て、配列番号１５のアミノ酸配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0015】
本開示の抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号８、１６、４２又は４３と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得て、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する。配列番号８及び１６のアミノ酸配列は、配列番号２８及び３０のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0016】
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、（１）配列番号７（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｑ）及び８のそれぞれ；（２）配列番号７（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｑ）及び８のそれぞれ；（３）配列番号７（Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝Ｋ）及び８のそれぞれ；（４）配列番号１５及び１６のそれぞれ；（５）配列番号３９及び４２のそれぞれ；（６）配列番号４０及び４２のそれぞれ；又は（７）配列番号４１及び４３のそれぞれと、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得て、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ１５に結合する。
【0017】
本開示の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合によって連結された重鎖と軽鎖を含み得て、重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み得て、軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み得て、重鎖可変領域のＣ末端が重鎖定常領域のＮ末端に連結され、且つ軽鎖可変領域のＣ末端が軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、上述のアミノ酸配列を含み得て、且つ抗体又はその抗原結合部分がＳｉｇｌｅｃ１５に結合する。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域、例えば、例えば配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域であり得る。Ｆｃフラグメントなどの重鎖定常領域は、低減された、又は増強されたＦｃＲ結合親和性を有するように操作され得る。軽鎖定常領域はカッパ（ｋａｐｐａ）定常領域、例えば、例えば配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するヒトカッパ定常領域であり得る。配列番号１７及び１８のアミノ酸配列は、配列番号３１及び３２のヌクレオチド配列によってそれぞれコードされ得る。
【0018】
特定の実施形態における本開示の抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み得る、又は２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり得て、各重鎖は、上記の重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得て、且つ各軽鎖は、上記の軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得て、その抗体はＳｉｇｌｅｃ１５に結合する。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。他の実施形態における抗体又はその抗原結合部分は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、又はＦａｂ若しくはＦ（ａｂ'）２フラグメントなどの抗体フラグメントであり得る。
【0019】
本開示は、抗体又はその原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分（例えば、第２抗体）に連結された、本開示の抗体又はその原結合部分を含み得る二重特異性分子も提供する。本開示は、細胞毒などの治療薬に連結された、本開示の抗体又はその抗原結合部分を含み得る、抗体－薬物コンジュゲートなどの免疫抱合体も提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であり得る。Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの、抗原キメラ受容体を含み得る免疫細胞も提供される。本開示の抗体又はその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるか、又は腫瘍溶解性ウイルスと共に使用され得る。
【0020】
本開示の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにかかる核酸を含み得る発現ベクター、及びかかる発現ベクターを含み得る宿主細胞も包含される。宿主細胞を使用して本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又はその抗原結合部分を調製する方法であって、（ｉ）宿主細胞において抗体を発現させる工程、及び（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を単離する工程を含み得る方法も提供される。
【0021】
本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含み得る組成物も提供される。特定の実施形態において、組成物はさらに、抗癌剤などの治療薬を含有し得る。
【0022】
さらに別の態様において、本開示は、対象において免疫応答を調節する方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分を、又はその代わりに、対象における免疫応答が調節されるように、対象においてそれを発現させることができる核酸分子を、治療有効量で対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰変異することによって、対象における免疫応答を増強、刺激又は増加する。一部の実施形態において、この方法は、本開示の二重特異性分子、免疫抱合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を担持する腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む。
【0023】
さらに別の態様において、本開示は、対象において骨量減少を阻害する、又は骨量を増加する方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分を、又はその代わりに、それを発現させることができる核酸分子を、治療有効量で対象に投与することを含む方法を提供する。
【0024】
更なる態様において、本開示は、その必要がある対象において腫瘍成長を阻害する方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分を、又はその代わりに、対象においてそれを発現させることができる核酸分子を、治療有効量で対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、その方法は、本開示の二重特異性分子、免疫抱合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を担持する腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む。腫瘍は、固形又は非固形腫瘍であり得る。特定の実施形態において、腫瘍は、限定されないが、非小細胞肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、頭頸部扁平上皮癌、子宮内膜癌、及び扁平上皮癌などの固形腫瘍である。一部の実施形態において、少なくとも１つの更なる抗癌抗体を、本開示の抗体又はその抗原結合部分、例えば抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、及び／又は抗ＲＯＲ１抗体と共に投与することができる。さらに他の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＩＬ－４）、又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、エピルビシン、オキサリプラチン、及び／又は５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの細胞毒性剤であり得る、化学療法薬と共に投与される。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えばマウス、ヒト、キメラ若しくはヒト化抗体又はその抗原結合部分であり得る。
【0025】
本開示の他の特徴及び利点は、限定であると解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。本出願を通して引用される全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【0026】
したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に公知の製品、プロセス、又は方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯの書面による記載及び実施可能要件（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（欧州特許条約（ＥＰＣ）８３条）を満たさない任意の製品、プロセス、又はその製品の作製方法又はその製品の使用方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことがさらに留意され、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に記載された製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明の実施において、５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠していることが有利であり得る。本出願の系統又は任意の他の系統又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の登録特許の主題である任意の実施形態を明確に放棄する全ての権利が、明確に留保される。本明細書に記載されるいずれも、保証として解釈されるべきではない。
【0027】
本開示、特に、特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し、例えば、それらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素を除外することが留意される。
【0028】
例として示されるが、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定することは意図されていない、以下の詳細な説明が、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の結合能力を示す。
【図1B】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｇ７Ｅ８の結合能力を示す。
【図1C】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の結合能力を示す。
【図2A】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞に対する抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の結合能力を示す。
【図2B】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞に対する抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｇ７Ｅ８の結合能力を示す。
【図2C】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞に対する抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の結合能力を示す。
【図3A】間接ＥＬＩＳＡにおける、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の結合能力を示す。
【図3B】間接ＥＬＩＳＡにおける、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｇ７Ｅ８の結合能力を示す。
【図3C】間接ＥＬＩＳＡにおける、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の結合能力を示す。
【図4A】間接ＥＬＩＳＡにおける、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の結合能力を示す。
【図4B】間接ＥＬＩＳＡにおける、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｇ７Ｅ８の結合能力を示す。
【図4C】間接ＥＬＩＳＡにおける、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の結合能力を示す。
【図5A】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロッキングする、抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の能力を示す。
【図5B】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロッキングする、抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８の能力を示す。
【図5C】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロッキングする、抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の能力を示す。
【図6A】競合ＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の能力を示す。
【図6B】競合ＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８の能力を示す。
【図6C】競合ＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の能力を示す。
【図7A】細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける、細胞表面ヒトＬＲＲＣ４Ｃに対してヒトＳｉｇｌｅｃ１５をブロックする、抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１及びＡ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０の能力を示す。
【図7B】細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける、細胞表面ヒトＬＲＲＣ４Ｃに対してヒトＳｉｇｌｅｃ１５をブロックする、抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８の能力を示す。
【図7C】細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける、細胞表面ヒトＬＲＲＣ４Ｃに対してヒトＳｉｇｌｅｃ１５をブロックする、抗体Ａ２Ａ６Ｂ１Ｃ２、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１の能力を示す。
【図8A】抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８及びＡ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９が、細胞ベースの機能アッセイにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ１５誘発ＣＤ８＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図8B】抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８及びＡ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９が、細胞ベースの機能アッセイにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ１５誘発ＣＤ４＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図9】捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の結合能力を示す。
【図10】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞に対する抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の結合能力を示す。
【図11】間接ＥＬＩＳＡにおいて、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の結合能力を示す。
【図12】間接ＥＬＩＳＡにおいて、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の結合能力を示す。
【図13】競合ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロックする、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の能力を示す。
【図14】競合ＥＬＩＳＡにおいて、ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の能力を示す。
【図15A】細胞ベースの機能アッセイにおいて、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、９３．５ｎＭ Ｓｉｇｌｅｃ１５によって誘発されるＣＤ８＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図15B】細胞ベースの機能アッセイにおいて、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、９３．５ｎＭ Ｓｉｇｌｅｃ１５によって誘発されるＣＤ４＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図15C】細胞ベースの機能アッセイにおいて、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、１８６．９ｎＭ Ｓｉｇｌｅｃ１５によって誘発されるＣＤ８＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図15D】細胞ベースの機能アッセイにおいて、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、１８６．９ｎＭ Ｓｉｇｌｅｃ１５によって誘発されるＣＤ４＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図16】捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対するマウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の結合能力を示す。
【図17】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞に対するマウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の結合能力を示す。
【図18】間接ＥＬＩＳＡにおいて、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に対するマウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の結合能力を示す。
【図19】間接ＥＬＩＳＡにおいて、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対するマウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の結合能力を示す。
【図20】競合ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロックする、マウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の能力を示す。
【図21】競合ＥＬＩＳＡにおいて、ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、マウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７の能力を示す。
【図22A】細胞ベースの機能アッセイにおいて、マウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７が、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介ＣＤ８＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【図22B】細胞ベースの機能アッセイにおいて、マウス抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ｈ７が、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介ＣＤ４＋細胞抑制を復帰したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、いくつかの用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【0031】
「Ｓｉｇｌｅｃ１５」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含む。例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的な抗体は、ある場合において、サルなどの、ヒト以外の種に由来するＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示さないことがあり、又は全ての他の種ではなく特定の他の種に由来するＳｉｇｌｅｃ１５と交差反応し得る。
【0032】
「ヒトＳｉｇｌｅｃ１５」という用語は、Ｑ６ＺＭＣ９のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有するヒトＳｉｇｌｅｃ１５のアミノ酸配列などの、ヒトに由来するアミノ酸配列を有するＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質を指す。「サル又はアカゲザルＳｉｇｌｅｃ１５」及び「マウスＳｉｇｌｅｃ１５」という用語はそれぞれ、サル及びマウスＳｉｇｌｅｃ１５配列を指し、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿０２８６９４０６９．１及びＮＰ＿００１０９４５０８．１を有するアミノ酸配列を有するものである。
【0033】
「免疫応答」という用語は、例えば、侵入する病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌細胞の破壊、又はヒトの身体からの排除に対して選択的なダメージをもたらす、或いは自己免疫又は病理学的な炎症、正常なヒト細胞若しくは組織の場合における、上記の細胞又は肝臓によって産生されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を意味する。
【0034】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原－結合部位が通常、免疫グロブリン分子の可変領域内にある、少なくとも１つの抗原－結合部位を介して、Ｓｉｇｌｅｃ１５などの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用されるその用語は、抗体が目的の生物活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、軽鎖抗体（ＬＣＡｂ）、多特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、抗体の抗原－結合部位を含む融合タンパク質、及び抗原－結合部位を含む他のいずれかの改変免疫グロブリン分子（例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン分子）を包含する。抗体としては、限定されないが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューとそれぞれ呼ばれるその重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであることができる。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる既知のサブユニット構造及び三次元立体配置を有する。抗体は、限定されないが、裸抗体であるか、又は毒素及びラジオアイソトープなどの他の分子に結合され得る。別段の指定がない限り、本明細書で使用される「抗体」という用語は、インタクトな抗体の「抗原結合部分」を含む。ＩｇＧは、ジスルフィド結合によって相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含み得る糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域から構成され得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成され得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【0035】
本明細書において使用される際の、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含み得る二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）として作製可能にする合成リンカーによる、組換え方法を用いて結合され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。
【0036】
本明細書において使用される際の「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0037】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0038】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図されない。
【0039】
本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。
【0040】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト源に由来する遺伝物質を、ヒトに由来する遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を指す。又はより一般に、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝物質を、別の種に由来する遺伝物質とともに有する抗体である。
【0041】
本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体形態との類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来する抗体を指す。
【0042】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【0043】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。
【0044】
本明細書において使用される際、「ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する」抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質（場合により、１つ以上の非ヒトに由来するＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質）に結合するが、非Ｓｉｇｌｅｃ１５タンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高い親和性」、すなわち、５．０×１０－９Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０－９Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に結合する。
【0045】
本明細書において使用される際の、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか又は高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０－６Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－５Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－４Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－３Ｍ以上、さらにより好ましくは、１．０×１０－２Ｍ以上のＫＤでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。
【0046】
ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して５．０×１０－９Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、５．０×１０－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは、５．０×１０－１１Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０－６Ｍ以下、より好ましくは、１０－７Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０－８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【0047】
本明細書において使用される際の「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」という用語が、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことが意図される一方、本明細書において使用される際の「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される際の「ＫＤ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、これは、Ｋｄ対Ｋａの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
【0048】
最大半量の有効濃度としても知られている「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間の後の、ベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。
【0049】
半数阻害濃度としても知られている「ＩＣ５０」という用語は、抗体の非存在と比べて５０％だけ特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する抗体の濃度を指す。
【0050】
「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及びは虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマなどの哺乳動物が好ましい。
【0051】
「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病態（癌など）に関連する症状を予防若しくは改善し、及び／又は疾患若しくは病態の重症度を低下させるのに十分な、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、治療される病態に関して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に理解される。
【0052】
本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【0053】
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、Ｓｉｇｌｅｃ１５－ｃｈ５Ｇ９などの上述の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体と比較して、より良くないとしても、同等の結合親和性でヒト又はサルＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
【0054】
更なる機能特性としては、そのリガンドへのＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする能力、及びＳｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰する能力が挙げられる。
【0055】
本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、以下に、及び実施例に記載のように構造的及び化学的に特性決定される。抗体の重／軽鎖可変領域のアミノ酸配列番号を以下の表１にまとめる。抗体の重鎖定常領域は、例えば、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得て、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するヒトカッパ定常領域であり得る。本開示の抗体は、ヒト、マウス、キメラ又はヒト化抗体であり得る。
【0056】
表１中の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定され得る。
【0057】
【表1】
【0058】
ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に結合する他の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び適合させる」ことができる。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）が、混合及び適合される場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列が、構造的に類似のＶＨ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列が、構造的に類似のＶＬ配列で置き換えられる。
【0059】
したがって、一実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＶＬを含み、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＶＬを含み、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
【0060】
別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
【0061】
さらに別の実施形態において、抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、並びに／或いは異なる抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む。
【0062】
さらに、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインは、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、及び複数の抗体が、予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して生成され得ることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号明細書；同第６，９１４，１２８号明細書；同第６，０９０，３８２号明細書；同第６，８１８，２１６号明細書；同第６，１５６，３１３号明細書；同第６，８２７，９２５号明細書；同第５，８３３，９４３号明細書；同第５，７６２，９０５号明細書及び同第５，７６０，１８５号明細書を参照されたい。これらの参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。
【0063】
したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合することが可能である。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ１５との結合について競合し；（ｂ）機能的特性を保持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；及び／又は（ｄ）本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合することが可能である。
【0064】
別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。
【0065】
したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合する。
【0066】
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、上述される以下の機能特性の１つ又は複数、例えばヒトＳｉｇｌｅｃ１５に対する高い親和性結合、及びＳｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰する能力を保持する。
【0067】
様々な実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、ヒト、マウス、ヒト化若しくはキメラ抗体又はその抗原結合部分であることができる。
【0068】
本明細書において使用される際、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響を与えないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、本開示の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体が、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の機能）について試験され得る。
【0069】
本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。
【0070】
特定の実施形態において、ＣＤＲグラフト法は、抗体の可変領域を操作するのに使用され得る。抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。
【0071】
したがって、本開示の別の実施形態は、上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又は上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体が、本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含む一方、それらは、異なるフレームワーク配列を含み得る。
【0072】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで、インターネットで利用可能）、並びにＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（上記に引用される）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６（これらのそれぞれの内容が、参照により本明細書に明示的に援用される）において見出され得る。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出され得る。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）並びに３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂ マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）並びに３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。
【0073】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、上記を参照）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。
【0074】
本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【0075】
別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって、対象とする抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発は、変異を導入するために行われ得、抗体結合に対する効果、又は対象とする他の機能的特性が、当該技術分野において公知のインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野において公知であるように）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは、置換である。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基が改変される。
【0076】
したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
【0077】
本開示の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異（ｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳細には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。
【0078】
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、或いは１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【0079】
フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、又はその代わりに、本開示の抗体は、典型的に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本開示の抗体は、同様に抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために化学修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に結合され得る）又はそのグリコシル化を改変するために修飾され得る。
【0080】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される、例えば、増加又は減少されるように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は抗体の安定性を増大若しくは低下させるために変化される。
【0081】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を減少させるように変異される。より詳細には、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が、天然Ｆｃ－ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
【0082】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するために改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位をなくし、それによって、その部位におけるグリコシル化をなくすように行われ得る。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。
【0083】
それに加えて又はその代わりに、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用され、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現される抗体が、それらの炭水化物においてフコースを欠くようになっている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株を、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって生成した（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号明細書及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、このような細胞株において発現される抗体が、α－１，６結合関連酵素を減少させるか又は除去することによって低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。また、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を有さない、フコースのＮ－アセチルグルコサミンへの付加に対して低い酵素活性を有する細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）が記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を低下させ、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、国際公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、ニワトリ卵において産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１号に対応する米国特許出願に開示されている。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照）。或いは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断され得；例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。
【0084】
本開示によって想定される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本明細書において使用される際、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、欧州特許第１５４ ３１６号明細書及び欧州特許第０ ４０１ ３８４号明細書を参照されたい。
【0085】
本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。
【0086】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかにおける１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性又は改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。ある場合には、可変領域グリコシル化を含まない抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。
【0087】
好ましい実施形態において、抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において起こり得、結合をポリペプチド鎖に導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。
【0088】
各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲内の特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的に、７～９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的に、６～８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体が、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常範囲内のｐＩ値を有する抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、又は荷電表面残基を変異させることによって達成され得る。
【0089】
別の態様において、本開示は、本開示の抗体の、重鎖及び／又は軽鎖可変領域、或いはＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。その核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製された場合に、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」核酸である。本開示の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得て、イントロン配列を含有しても、又はしていなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【0090】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体について、このような抗体をコードする核酸が、遺伝子ライブラリーから回収され得る。
【0091】
本開示の好ましい核酸分子は、Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ配列、又はＣＤＲをコードする核酸分子を含む。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。この文脈において使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することが意図される。
【0092】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【0093】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。
【0094】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨ及びＶＬ配列が、フレキシブルリンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。
【0095】
本開示のモノクローナル抗（ｍＡｂｓ）体は、トランスジェニックマウスのプラットフォーム（例えば、ＣＡＭｏｕｓｅＨＧ，Ｂ０００．６０．０１Ｔ（Ｇ１５），ＨＧ５０４２，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＣａｍａｂＢｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）を用いて、完全ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスを標的抗原、つまりＳｉｇｌｅｃ１５、特にヒトＳｉｇｌｅｃ１５で免疫化することによって産生され得る。Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法に従って、免疫化トランスジェニックマウスからの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」をプレートに分配し、融合の７～１０日後に、生存しているハイブリドーマコロニーを顕微鏡で観察する。例えば、２週間後、各ウェルからの上清を抗原結合テストにかけることができ、目的の抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングして、細胞系のクローン性を確実にし、次いでモノクローナル抗体を精製した。
【0096】
本開示の抗体は、当技術分野でよく知られている他の方法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス若しくは発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術によっても作製することができる。
【0097】
本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。
【0098】
「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。さらにまた、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーター系などの異なる源に由来する配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【0099】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域は、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を生成するために使用される。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。
【0100】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書及び同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ－宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【0101】
軽鎖及び重鎖の発現のため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態が、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれにおいても本開示の抗体を発現させることが理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。
【0102】
本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用について、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。
【0103】
本開示の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；国際公開第０２／０９６９１０号；国際公開第０７／０３８，６５８号；国際公開第０７／０５１，０８１号；国際公開第０７／０５９，４０４号；国際公開第０８／０８３，３１２号；及び国際公開第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；同第２００６／０００４０８１号明細書；及び同第２００６／０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。
【0104】
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。
【0105】
二重特異性分子は、多くの異なるフォーマット及びサイズであり得る。サイズスペクトルの一方の側では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持している。他方の側では、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ'ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子組換え、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記に引用される）；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、並びにそれらの中に引用される参照文献を参照されたい。
【0106】
優先的に癌細胞を感染させ及び死滅させる、腫瘍溶解性ウイルスも、本明細書において提供される。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。
【0107】
抗Ｓｉｇｌｅｃ１５ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗Ｓｉｇｌｅｃ１５ ｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む。
【0108】
抗Ｓｉｇｌｅｃ１５ ＣＡＲは、（ａ）抗Ｓｉｇｌｅｃ１５ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【0109】
ＣＡＲは、新生受容体を小胞体に指向する、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるシグナルペプチド、及び受容体を結合のためにより多く利用できるようにする、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるヒンジペプチドを含有し得る。ＣＡＲは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。主に使用される、最も有効な主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζ細胞質ドメインであり、そのリン酸化が、Ｔ細胞活性化をもたらす。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来し得る。
【0110】
ＣＡＲは、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を促進する因子、例えば、サイトカイン、及び共刺激リガンドをさらに追加し得る。
【0111】
本明細書において提供されるＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞も提供される。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。
【0112】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本開示の１つ以上の抗体又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞を含み得る医薬組成物を提供する。抗体又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞は、組成物が、２つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含むとき、別々に投与され得る。組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に有効な成分、例えば、別の抗体又は薬剤、例えば、抗腫瘍薬を任意に含有し得る。
【0113】
医薬組成物は、あらゆる賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散若しくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組合せを含む。好適な賦形剤の選択及び使用が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に教示されている。
【0114】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性にし得る他の天然条件からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される際の「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外並びに胸骨内注射及び注入を含む。或いは、本開示の抗体は、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所的に投与され得る。
【0115】
医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散体の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の高い薬物濃度に好適な規則的な構造で製剤化され得る。
【0116】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法に応じて変化し、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１％～約９９％の有効成分、好ましくは、約０．１％～約７０％、最も好ましくは、約１％～約３０％の有効成分の範囲である。
【0117】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、経時的に数回の分割投与で投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるとき比例的に減少若しくは増加され得る。投与の容易性及び投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効成分を含有する。或いは、抗体は、あまり頻繁でない投与が必要とされる場合、徐放性製剤として投与され得る。
【0118】
組成物の投与のため、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【0119】
本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、若しくはその抗原結合部分、又は二重特異性分子（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体の「治療上有効な投薬量」によって、好ましくは、疾患症状の重症度が低下し、及び疾患症状がない期間の頻度及び長さが増加し、又は疾患罹患による身体障害若しくは能力障害が予防される。例えば、腫瘍を有する対象の治療について、「治療有効投与量」は、好ましくは、非治療対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療用抗体は、腫瘍サイズを減少させるか、又は典型的にヒトであるか又は別の哺乳動物であり得る対象において症状を改善することができる。
【0120】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【0121】
治療用組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；及び同第４，５９６，５５６号明細書）；（２）微小注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）；（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）；（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号明細書及び同第４，４４７，２２４号明細書）；並びに（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号明細書及び同第４，４７５，１９６号明細書）（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）によって投与され得る。
【0122】
特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体が、血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、リポソーム中で製剤化され得、これらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を促進するための標的分子をさらに含み得る。例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；同第５，４１６，０１６号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。
【0123】
本開示の組成物は、例えば癌及び骨粗鬆症の治療を含む、インビトロ及びインビボでの多くの有用性を有する。ヒト対象に抗体を投与して、例えば、インビボにて腫瘍成長を阻害し、又は骨量減少を阻害することができる。
【0124】
Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰し、且つ癌細胞の増殖及び生存を阻害する、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は抗原結合部分の能力を仮定すると、本開示は、対象において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍成長が対象において阻害されるように、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の組成物によって治療することができる腫瘍の非制限的な例としては、限定されないが、非小細胞肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、頭頸部扁平上皮癌、子宮内膜癌、及び扁平上皮癌が挙げられる。さらに、本開示の抗体を用いてその成長が阻害され得る、不応性又は再発性悪性疾患が挙げられる。
【0125】
別の態様において、本開示は、骨量減少を阻害するか、又は骨量を増加する方法であって、本開示の抗体、又はその抗原結合部分を有効量で対象に投与することを含む方法を提供する。
【0126】
別の態様において、本開示は、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、若しくはその抗原結合部分、又は二重特異性分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体が、対象において腫瘍成長の阻害に有効である、１種又は複数種の更なる抗体と同時投与される、併用治療方法を提供する。一実施形態において、本開示は、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体（又はその抗原結合部分、又はＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）と、１種又は複数種の更なる抗体、例えば抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体と、を対象に投与することを含む、腫瘍成長を対象において阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0127】
Ｓｉｇｌｅｃ１５シグナル伝達活性化はまた、標準的な癌治療とさらに組み合わされ得る。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ１５シグナル伝達阻害は、ＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－１遮断及びさらに化学療法レジメンと組み合わされ得る。例えば、細胞毒性剤であり得る化学療法剤が、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体とともに投与され得る。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、及び５－ＦＵが、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５療法を受けている患者に投与される。
【0128】
任意に、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５及び１つ以上のさらなる抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－１抗体）の組合せは、免疫原、例えば、癌性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子を含む）、並びに免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞とさらに組み合わされ得る（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８）。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼ、又はサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。
【0129】
抗Ｓｉｇｌｅｃ１５療法と組み合わされ得る他の療法としては、限定はされないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）投与、放射線、外科手術、又はホルモン遮断が挙げられる。
【0130】
別の態様において、本開示は、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、若しくはその抗原結合部分、又は二重特異性分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体が、骨量減少の阻害に有効である、１種又は複数種の更なる作用剤（ａｇｅｎｔ）と同時投与される、併用治療の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体（若しくはその抗原結合部分、又はＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）と、骨粗鬆症治療用の１種又は複数種の更なる抗体、例えば抗抗ＲＡＮＫＬ抗体、及び抗ＩＬ－１１抗体と、を対象に投与することを含む、骨量減少を対象において阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0131】
本明細書において説明される治療剤の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物と同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組合せは、連続して投与され得る。
【0132】
さらに、組合せ治療の２つ以上の用量が、連続して投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になり得るか又は同じ順序に保持され得、連続投与は、同時投与と組み合わされ得、又はそれらの任意の組合せである。
【0133】
本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【実施例0134】
実施例１ ハイブリドーマ技術を用いたヒト抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体の産生
免疫化
トランスジェニックマウスプラットフォームＣＡＭｏｕｓｅＨＧ（ＨＧ５０４２，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＣＡＭＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）を使用して、完全ヒト抗体を生成した。Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法に従って、トランスジェニックマウスを免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有する自家製の組換えヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列）を免疫原として使用し、自家製カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２１に記載のアミノ酸配列）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために５０μｇのヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．５～０．６７ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で５０μｇの抗原を、１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて３～４回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。
免疫化
トランスジェニックマウスプラットフォームＣＡＭｏｕｓｅＨＧ（ＨＧ５０４２，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＣＡＭＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）を使用して、完全ヒト抗体を生成した。Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法に従って、トランスジェニックマウスを免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有する自家製の組換えヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列）を免疫原として使用し、自家製カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２１に記載のアミノ酸配列）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために５０μｇのヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．５～０．６７ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で５０μｇの抗原を、１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて３～４回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。
【0135】
ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、組換えカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質を使用して、各ウェルからの上清を間接ＥＬＩＳＡにかけた。次いで、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質に結合した陽性ハイブリドーマスクリーニング抗体を選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマコロニーを、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合のその活性についてさらに試験した。高特異性カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５結合及びＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃブロッキング活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限界希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。簡潔には、５～１０カラム体積でＰＢＳ緩衝液を用いて、タンパク質Ａセファロースカラム（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＡ０２７３）を洗浄した。ハイブリドーマモノクローンの細胞上清をカラムに通し、次いで、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳ緩衝液を使用してカラムを洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌチューブに収集した。免疫グロブリンを含有する画分をプールし、４℃にてＰＢＳ中で一晩透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、組換えカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質を使用して、各ウェルからの上清を間接ＥＬＩＳＡにかけた。次いで、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質に結合した陽性ハイブリドーマスクリーニング抗体を選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマコロニーを、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合のその活性についてさらに試験した。高特異性カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５結合及びＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃブロッキング活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限界希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。簡潔には、５～１０カラム体積でＰＢＳ緩衝液を用いて、タンパク質Ａセファロースカラム（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＡ０２７３）を洗浄した。ハイブリドーマモノクローンの細胞上清をカラムに通し、次いで、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳ緩衝液を使用してカラムを洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌチューブに収集した。免疫グロブリンを含有する画分をプールし、４℃にてＰＢＳ中で一晩透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。
【0136】
実施例２ ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴を用いた、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体の結合親和性の決定
実施例１で作製された、精製抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、結合親和性及び結合速度について特性決定した。
実施例１で作製された、精製抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、結合親和性及び結合速度について特性決定した。
【0137】
簡潔には、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９、ヒト抗体捕捉キット）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって提供される標準的なアミンカップリングキットを用いて、第一級アミンを介して、ＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストラン被覆チップ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）に共有結合した。バイオセンサー表面上の未反応部分を、エタノールアミンでブロックした。次いで、濃度１３．３ｎＭの本開示の精製抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体及び１３．３ｎＭの抗Ｓｉｇｌｅｃ１５ベンチマーク（ＢＭとも呼ばれるｃｈ５Ｇ１２、米国特許出願公開第２０１９／０２０２９１２号明細書参照、配列番号２４及び２５のそれぞれに記載の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列）をそれぞれ、流量１０μＬ／分にてチップ上に流した。次いで、段階希釈された組換えヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（自家製、配列番号２０に記載のアミノ酸配列）又はカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（自家製、配列番号２１に記載のアミノ酸配列）、８０ｎＭで開始するＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の２倍段階稀釈溶液をそれぞれ、流量３０μＬ／分でチップ上に流した。抗原－抗体結合キネティクスを２分間にわたって追跡し、解離キネティクスを１０分間追跡した。結合及び解離曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄ値を決定し、以下の表２にまとめた。
【0138】
【表2】
【0139】
本開示のすべての抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマークと比較して、同等又は高い結合親和性で、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５及びカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合した。抗体Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９及びＡ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９は最も高い結合親和性を示した。
【0140】
実施例３ 抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のＳｉｇｌｅｃ１５結合活性
捕捉ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び間接ＥＬＩＳＡによって、Ｓｉｇｌｅｃ１５に対する結合活性について、本開示の抗体をさらに試験した。
捕捉ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び間接ＥＬＩＳＡによって、Ｓｉｇｌｅｃ１５に対する結合活性について、本開示の抗体をさらに試験した。
【0141】
３．１ 捕捉ＥＬＩＳＡ
簡潔には、９６ウェルプレートを、３７℃にて２時間、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）１００μｌで被覆した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）でプレートを１回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂乳）２００μｌで４℃にて一晩ブロックした。プレートを４回洗浄した。本開示の１００μｌ段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、ベンチマーク及びｈＩｇＧ（静脈内注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）、６６．７ｎＭで開始するＰＢＳＴ中の２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳中の５倍希釈液と共に、３７℃で４０分間インキュベートし、次に再び４回洗浄した。捕捉抗体を含有するプレートを、１００μｌのビオチン標識ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２０を有する自家製、ＰＢＳＴ中の２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳中で１４５ｎｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中で１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）と共に、３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、プレートを、ＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００２）１００μｌ／ウェルと共にインキュベートした。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４５０μｌ／ウェルを用いて、室温にて４分で反応を停止し、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取り、次いでＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
簡潔には、９６ウェルプレートを、３７℃にて２時間、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）１００μｌで被覆した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）でプレートを１回洗浄し、次に、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂乳）２００μｌで４℃にて一晩ブロックした。プレートを４回洗浄した。本開示の１００μｌ段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、ベンチマーク及びｈＩｇＧ（静脈内注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）、６６．７ｎＭで開始するＰＢＳＴ中の２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳中の５倍希釈液と共に、３７℃で４０分間インキュベートし、次に再び４回洗浄した。捕捉抗体を含有するプレートを、１００μｌのビオチン標識ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２０を有する自家製、ＰＢＳＴ中の２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳中で１４５ｎｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中で１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）と共に、３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、プレートを、ＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００２）１００μｌ／ウェルと共にインキュベートした。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４５０μｌ／ウェルを用いて、室温にて４分で反応を停止し、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取り、次いでＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
【0142】
３．２ 細胞ベースの結合ＦＡＣＳ
自家製の、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ６ＺＭＣ９のアミノ酸残基Ｍｅｔ１－Ｐｒｏ３２８）を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、細胞膜上で細胞表面Ｓｉｇｌｅｃ１５への抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の結合活性を試験した。リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間にヒトＳｉｇｌｅｃ１５コード配列が挿入されたｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミドを、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７３）にトランスフェクトすることによって、ヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を作製した。ヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。９６ウェルプレート中の細胞２×１０５個／ウェルを、氷上で４０分間にわたって、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００μＬ段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（６６．６７ｎＭで開始して、５倍段階稀釈）中でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的１００μＬ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１５－０９８）を添加した。暗所にて４℃で４０分間インキュベーションした後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて、蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
自家製の、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ６ＺＭＣ９のアミノ酸残基Ｍｅｔ１－Ｐｒｏ３２８）を発現するヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、細胞膜上で細胞表面Ｓｉｇｌｅｃ１５への抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の結合活性を試験した。リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間にヒトＳｉｇｌｅｃ１５コード配列が挿入されたｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミドを、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７３）にトランスフェクトすることによって、ヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を作製した。ヒト－ｓｉｇｌｅｃ１５－２Ｄ３－１Ｅ１細胞を細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。９６ウェルプレート中の細胞２×１０５個／ウェルを、氷上で４０分間にわたって、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００μＬ段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（６６．６７ｎＭで開始して、５倍段階稀釈）中でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的１００μＬ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１５－０９８）を添加した。暗所にて４℃で４０分間インキュベーションした後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて、蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
【0143】
３．３ 間接ＥＬＩＳＡ
カニクイザル又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質への抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の交差反応を測定した。簡潔には、９６ウェルマイクロプレートを、３７℃で２時間にわたって、１００μｌの、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２１を有する自家製の）２μｇ／ｍｌ、又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２２を有する自家製の）２μｇ／ｍｌで被覆した。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次いで４℃で一晩、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳）２００μｌ／ウェルでブロックした。プレートを４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、本開示の段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（６６．７ｎＭで開始し、２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳でＰＢＳＴ中５倍希釈）１００μｌと共にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを再び、４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７、１００μｌ／ウェル）と共にインキュベートした。最後の洗浄後、プレートをＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００２）１００μｌ／ウェルと共にインキュベートした。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４５０μｌを使用して室温で４分後に反応を停止し、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、ＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
カニクイザル又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質への抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の交差反応を測定した。簡潔には、９６ウェルマイクロプレートを、３７℃で２時間にわたって、１００μｌの、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２１を有する自家製の）２μｇ／ｍｌ、又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２２を有する自家製の）２μｇ／ｍｌで被覆した。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次いで４℃で一晩、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳）２００μｌ／ウェルでブロックした。プレートを４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、本開示の段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（６６．７ｎＭで開始し、２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳でＰＢＳＴ中５倍希釈）１００μｌと共にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを再び、４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７、１００μｌ／ウェル）と共にインキュベートした。最後の洗浄後、プレートをＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００２）１００μｌ／ウェルと共にインキュベートした。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４５０μｌを使用して室温で４分後に反応を停止し、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、ＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
【0144】
３つのアッセイの結果を図１Ａ～１Ｃから４Ａ～４Ｃに示した。
【0145】
図１Ａ～１Ｃから、Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１を除いて、本開示のすべての抗体が、ベンチマークよりも低いＥＣ５０及び高いＢｍａｘ（最大結合）で、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合したことが分かる。
【0146】
図２Ａ～２Ｃに示されるように、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１は、ベンチマークと比較して高いＢｍａｘで（低いＥＣ５０で）、より効率的に細胞表面ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に結合した。
【0147】
図３Ａ～３Ｃから、本開示の抗体の大部分が、ベンチマークと比較して、同様な結合活性でカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に結合したことが示された。本開示のごく数種の抗体が、図４Ａ～４Ｃに示すように、マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する同様な、又はより良い結合活性を示した。例えば、抗体Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９及びＡ２Ａ１Ｄ２Ｆ１は、ベンチマークよりも高いＢｍａｘを示した。
【0148】
実施例４ Ｓｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ又はＳｉｇｌｅｃ１５－ベンチマーク結合に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のブロッキング活性
４．１ リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
Ｓｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロックする、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の活性を競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。ＬＲＲＣ４Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ１５のリガンドであり、癌細胞によって発現され得る（国際公開第２０１８／０５７７５３号）。簡潔には、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９のアミノ酸配列を有する自家製）１００μｌを９６ウェルマイクロプレート上に、３７℃で２時間にわたって、炭酸／重炭酸緩衝液中で２μｇ／ｍＬにて被覆した。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、４℃で一晩、ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳）でブロックした。次いで、洗浄緩衝液を用いて、プレートを４回洗浄した。
４．１ リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
Ｓｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロックする、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の活性を競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。ＬＲＲＣ４Ｃは、Ｓｉｇｌｅｃ１５のリガンドであり、癌細胞によって発現され得る（国際公開第２０１８／０５７７５３号）。簡潔には、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９のアミノ酸配列を有する自家製）１００μｌを９６ウェルマイクロプレート上に、３７℃で２時間にわたって、炭酸／重炭酸緩衝液中で２μｇ／ｍＬにて被覆した。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、４℃で一晩、ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳）でブロックした。次いで、洗浄緩衝液を用いて、プレートを４回洗浄した。
【0149】
２．５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中の段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（５倍連続稀釈で６６．６７ｎＭで開始）を、Ｓｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃ結合プレートに１００μｌ／ウェルで添加し、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質と共に３７℃で４０分間インキュベートした。洗浄緩衝液を用いて、プレートを再び４回洗浄し、次いでビオチン標識ヒトＬＲＲＣ４Ｃ－Ｆｃタンパク質（配列番号２３を有する自家製）２９０ｎｇ／ｍｌを添加し、それと共に、１００μｌ／ウェルにて３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。その後、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ５０値を報告した。
【0150】
４．２ ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ
ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔には、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬにて９６ウェルマイクロプレート上にベンチマークを１００μ／ウェルで被覆し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄し、４℃で一晩、ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳でブロックした。翌日、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照を４倍連続稀釈にて８０ｎＭで開始して、ビオチン標識ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９を有する自家製タンパク質、２．５％の無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中に３７ｎｇ／ｍｌ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートした。プレートを４回洗浄した後、抗体／Ｓｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃ混合物を１００μｌ／ウェルにてベンチマーク被覆プレートに添加した。３７℃で４０分間インキュベートした後、プレートを再び、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。次に、プレートに、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ１００μｌ／ウェルを加え、３７℃で４０分間インキュベートした。洗浄緩衝液を用いて、プレートを再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を報告した。
ベンチマーク－ヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックする、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔には、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬにて９６ウェルマイクロプレート上にベンチマークを１００μ／ウェルで被覆し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄し、４℃で一晩、ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳でブロックした。翌日、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照を４倍連続稀釈にて８０ｎＭで開始して、ビオチン標識ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９を有する自家製タンパク質、２．５％の無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中に３７ｎｇ／ｍｌ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートした。プレートを４回洗浄した後、抗体／Ｓｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃ混合物を１００μｌ／ウェルにてベンチマーク被覆プレートに添加した。３７℃で４０分間インキュベートした後、プレートを再び、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。次に、プレートに、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ１００μｌ／ウェルを加え、３７℃で４０分間インキュベートした。洗浄緩衝液を用いて、プレートを再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を報告した。
【0151】
４．３ 細胞ベースのリガンドブロッキングＦＡＣＳ
細胞表面ＬＲＲＣ４ＣへのＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質の結合をブロックする、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の活性を、自家製ＬＲＲＣ４Ｃ－３Ｆ１２－１Ｂ９細胞を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。簡潔には、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間に挿入されたヒトＬＲＲＣ４Ｃ（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ９ＨＣＪ２のアミノ酸残基Ｍｅｔ１－ｌｌｅ６４０）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミド構築物でＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７３）にトランスフェクトした。その後の細胞ベースリガンドブロッキンアッセイのために、ＬＲＲＣ４Ｃ－３Ｆ１２－１Ｂ９と名付けられた安定細胞を選択した。
細胞表面ＬＲＲＣ４ＣへのＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質の結合をブロックする、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の活性を、自家製ＬＲＲＣ４Ｃ－３Ｆ１２－１Ｂ９細胞を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。簡潔には、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書に従って、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間に挿入されたヒトＬＲＲＣ４Ｃ（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ９ＨＣＪ２のアミノ酸残基Ｍｅｔ１－ｌｌｅ６４０）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミド構築物でＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５７３）にトランスフェクトした。その後の細胞ベースリガンドブロッキンアッセイのために、ＬＲＲＣ４Ｃ－３Ｆ１２－１Ｂ９と名付けられた安定細胞を選択した。
【0152】
簡潔には、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照を、６６．６７ｎＭで開始して５倍段階希釈で、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－マウスＦｃタンパク質（配列番号２６を有する自家製、ＦＡＣＳ緩衝液中で８μｇ／ｍｌ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートした。次いで、ＬＲＲＣ４Ｃ－３Ｆ１２－１Ｂ９細胞を細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＡＣＳ緩衝液）含有するＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、９６ウェルプレートにおける１×１０５細胞／ウェルを抗体／Ｓｉｇｌｅｃ１５－マウスＦｃ混合物１００μＬ中で４℃にて４０分間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いでＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）１００μＬ／ウェル（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１１６－１４６）を添加し、暗所にて４℃で４０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて、蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を報告した。
【0153】
３つのアッセイの結果は図５Ａ～５Ｃから７Ａ～７Ｃであった。
【0154】
本開示のすべての抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ヒトＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロッキングすることができ、且つそのブロッキング活性は、ベンチマークと同様な、又はベンチマークより低いことが、図５Ａ～５Ｃから分かる。
【0155】
図６Ａ～６Ｃから、抗体Ａ１Ｅ７Ｇ５Ｄ１、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８、Ａ２Ｇ４Ｃ８Ｇ７及びＡ２Ｈ５Ｆ１Ａ１が、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ベンチマーク結合をブロックすることができることが示され、ベンチマークが結合した同じ又は類似のエピトープにそれらが結合したことが示唆される。抗体Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１、Ａ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ６Ｂ１Ｃ２は、ベンチマークへのヒトＳｉｇｌｅｃ１５結合をブロックすることができず、Ａ１Ｃ８Ｃ６Ｈ１、Ａ１Ｄ１Ｂ７Ｈ９、Ａ１Ｄ５Ｅ２Ｈ１、Ａ１Ｄ１１Ａ７Ｈ１０、Ａ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９、Ａ２Ａ１Ｄ２Ｆ１及びＡ２Ａ６Ｂ１Ｃ２は、ベンチマークと比べて異なるエピトープに結合し得ることが示唆される。
【0156】
さらに、図７Ａ～７Ｃに示されるように、本開示のすべての抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体は、ベンチマークと同様な、又は低いブロッキング活性で、マウスＦｃを有する細胞表面ヒトＬＲＲＣ４ＣへのヒトＳｉｇｌｅｃ１５の結合をブロッキングすることができた。
【0157】
実施例５ 抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の熱安定性
抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体をその熱安定性についても試験した。簡潔には、タンパク質の熱シフトアッセイを用いて、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙキット（Ｂｉｏｔｉｕｍ、カタログ番号３３０２２－Ｔ）を用いてＴｍ（融解温度）を決定した。次いで、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍し、室温に到達させた。色素を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、２００倍色素５μＬをＰＢＳ９５μＬに添加することによって、１０倍色素を調製した。１０倍色素２μＬ及び抗体１０μｇを添加し、２０μＬの総反応体積になるまでＰＢＳを添加した。色素及び抗体を含むチューブを、短時間にわたって回転させ、表３のパラメータを有する融解曲線プログラムを用いて設定されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ）に入れた。
抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体をその熱安定性についても試験した。簡潔には、タンパク質の熱シフトアッセイを用いて、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙキット（Ｂｉｏｔｉｕｍ、カタログ番号３３０２２－Ｔ）を用いてＴｍ（融解温度）を決定した。次いで、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍し、室温に到達させた。色素を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、２００倍色素５μＬをＰＢＳ９５μＬに添加することによって、１０倍色素を調製した。１０倍色素２μＬ及び抗体１０μｇを添加し、２０μＬの総反応体積になるまでＰＢＳを添加した。色素及び抗体を含むチューブを、短時間にわたって回転させ、表３のパラメータを有する融解曲線プログラムを用いて設定されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ）に入れた。
【0158】
【表3】
【0159】
【表4】
【0160】
本開示の抗体の融解温度を表４に示し、本開示の抗体はおそらく、ヒトの身体において安定であると示唆された。
【0161】
実施例６ Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰させた抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体
ＤＰＢＳ中で抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）５０ｎｇ／ｍＬ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号１６－００３７－８５）を９６ウェルマイクロプレート上に１００μｌ／ウェルにて４℃で一晩被覆した。翌日に、未結合の抗ＣＤ３モノクローナル抗体を、ＰＢＭＣ添加直前に吸引した。
ＤＰＢＳ中で抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）５０ｎｇ／ｍＬ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号１６－００３７－８５）を９６ウェルマイクロプレート上に１００μｌ／ウェルにて４℃で一晩被覆した。翌日に、未結合の抗ＣＤ３モノクローナル抗体を、ＰＢＭＣ添加直前に吸引した。
【0162】
１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）で健康なヒトドナーからの総ＰＢＭＣを洗浄し、２００ｇにて１５分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、ＰＢＭＣ細胞を０．５μＭ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ１１５７）にて氷上で２０分間標識化し、最終細胞密度は１×１０６細胞／ｍＬであった。１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０の４倍体積を細胞に添加し、室温にて５分間インキュベートした。プレートを３００ｇで１０分間遠心し、１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地に密度６×１０６細胞／ｍＬにて細胞を再懸濁した。一方、本開示の段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で４倍希釈、１２０μｇ／ｍｌで開始）をヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９の自家製、１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で４０μｇ／ｍｌ）と体積比１：１で混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＭＢＣ細胞を含有する培地５０μＬと抗体／Ｓｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃ ５０μｌの混合物を抗ＣＤ３結合プレートに添加し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて３日間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、細胞を数回ピペットで取り、Ｕ字形プレートに移した。Ｕ字形プレートを遠心し、上清を除去した。次いで、ＨＦＣＲ５０μｌ／ウェル（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０希釈、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ、カタログ番号４２２３０２）と共に、暗所で細胞を４℃で１５分間インキュベートした。細胞を抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．、カタログ番号３５７４１０）及び抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．、カタログ番号３０１０６６）蛍光ｍＡｂｓ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０希釈）で４℃にて３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２００μＬ／ウェル）中で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２００μＬ／ウェル）に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて、蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ５０値を報告した。
【0163】
その結果を図８Ａ及び８Ｂに示した。
【0164】
抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８及びＡ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９は、ベンチマークと比較して高いＥＣ５０で、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞抑制を復帰させることができたことが分かる。注目すべきことには、高い用量の抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８は、Ｔ細胞抑制の復帰においてベンチマークよりも効果的であり、その結果、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖パーセンテージが高くなった。
【0165】
実施例７ 抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のシークエンシング
２つの抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８及びＡ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９をシークエンシングし、完全重鎖及び軽鎖可変領域配列及び定常領域配列を得た。重鎖及び軽鎖可変領域の配列番号を表１に示し、データベースにおける配列アライメントによって、重鎖／軽鎖のアイソタイプを決定した。
２つの抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８及びＡ１Ｅ１０Ｇ７Ｈ９をシークエンシングし、完全重鎖及び軽鎖可変領域配列及び定常領域配列を得た。重鎖及び軽鎖可変領域の配列番号を表１に示し、データベースにおける配列アライメントによって、重鎖／軽鎖のアイソタイプを決定した。
【0166】
実施例８ 抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８の遺伝子操作
例えば、抗体の産生、安定性、安全性及び／又は有効性に悪影響を及ぼし得るＣＤＲ領域における特定のアミノ酸残基の脱アミド及び異性化などの翻訳後修飾を避ける、又は低減するために、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８（以降で、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１とも呼ばれる）がさらに、重鎖ＣＤＲ２領域において修飾された。合計２つの修飾バリアント、つまりＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が得られ、そのＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域配列番号を表１に示した。
例えば、抗体の産生、安定性、安全性及び／又は有効性に悪影響を及ぼし得るＣＤＲ領域における特定のアミノ酸残基の脱アミド及び異性化などの翻訳後修飾を避ける、又は低減するために、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８（以降で、Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－１とも呼ばれる）がさらに、重鎖ＣＤＲ２領域において修飾された。合計２つの修飾バリアント、つまりＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が得られ、そのＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域配列番号を表１に示した。
【0167】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１７）に連結されたＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２又はＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３の重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクター、及びヒトカッパ軽鎖定常領域（配列番号１８）に連結された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクターを、ＰＥＩ １ｍｇ／ｍＬで、軽鎖：重鎖構築物の比率１．１：１で、２９３Ｆ懸濁液細胞培養物５０ｍｌ中で一過性にトランスフェクトした。
【0168】
実施例９ 修飾Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８バリアントの特性決定
修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３を上述のように精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、細胞ベース結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベース機能性アッセイにおいて、修正が加えられた、又は修正なしの上述の実施例のプロトコル、及び以下に記載のプロトコルにも従って試験した。
修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３を上述のように精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、細胞ベース結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベース機能性アッセイにおいて、修正が加えられた、又は修正なしの上述の実施例のプロトコル、及び以下に記載のプロトコルにも従って試験した。
【0169】
マウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する修飾Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８バリアント結合親和性を測定するＢｉａｃｏｒｅ試験に対して、マウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（配列番号２２を有する自家製）を使用した。
【0170】
Ｔ細胞抑制の復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）試験において、本開示のＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８バリアント又は対照濃度４８μｇ／ｍを、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９、１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で２０μｇ／ｍｌ）と１：１体積比で混合し、濃度１２０μｇ／ｍｌの本開示のＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８バリアント又は対照を、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で４０μｇ／ｍｌ）と１：１体積比で混合した。
【0171】
Ｂｉａｃｏｒｅ試験結果を表５－１及び５－２にまとめた。他のアッセイの結果を図９～１４及び１５Ａ～１５Ｄに示した。
【0172】
【表5】
【0173】
【表6】
【0174】
表５－１及び５－２に示すように、修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、ベンチマークよりも高い結合親和性で、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５及びカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合した。抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３は、ベンチマークよりもマウスＳｉｇｌｅｃ１５に対する高い結合親和性も示した。抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２は、ベンチマークと比較してマウスＳｉｇｌｅｃ１５に対して同等の結合親和性を示した。
【0175】
図９及び１０に示すように、ベンチマークよりも修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３に、より効率的に、又はより高いＢｍａｘでヒトＳｉｇｌｅｃ１５に結合し、図１３に示すように、ベンチマークよりも効率的にＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ結合を阻害した。さらに、図１１及び１２によれば、修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３は、ベンチマークよりもカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５及びマウスＳｉｇｌｅｃ１５に効率的に結合した。
【0176】
図１４に示すように、修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３は、ベンチマーク－Ｓｉｇｌｅｃ１５結合をブロックすることができ、修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３がベンチマークに対して同様なエピトープに結合したことが示された。
【0177】
図１５Ａ～１５Ｄに示すように、細胞ベースの機能性アッセイにおいて、修飾バリアントＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３が、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞抑制を復帰し、ベンチマークと比べて、同様な、又は高い細胞増殖パーセンテージが得られた。注目すべきことには、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質が比較的低い用量で使用された場合に、抗体Ａ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－２及びＡ２Ａ５Ｃ７Ｅ８－３は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞抑制の復帰においてベンチマークよりも有効であった。
【0178】
実施例１０ ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体の産生
免疫化、ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
以下の修正を加えた実施例１におけるプロトコルに従って、マウスの免疫化、ハイブリドーマ融合及びスクリーニングを実施した。詳細には、正常なマウスを使用し、免疫化投与量は、一次免疫化のために組換えヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質５０μｇ／マウス／注射を含有し、追加免疫のためにヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質２５μｇ／マウス／注射を含有した。濃度範囲０．２５～０．６７ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ又は生理食塩水中で抗原を調製した。合計で５０又は２５μｇの抗原を１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて３～４回追加接種した。自家製のヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質を使用して、融合細胞培養上清を間接ＥＬＩＳＡにかけた。ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質に結合する陽性ハイブリドーマスクリーニング抗体を選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマを、細胞ベース結合ＦＡＣＳ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びリガンドブロッキングＥＬＩＳＡにもかけた。高特異性ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合、マウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合及びヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃブロッキング活性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限界希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。
免疫化、ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
以下の修正を加えた実施例１におけるプロトコルに従って、マウスの免疫化、ハイブリドーマ融合及びスクリーニングを実施した。詳細には、正常なマウスを使用し、免疫化投与量は、一次免疫化のために組換えヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質５０μｇ／マウス／注射を含有し、追加免疫のためにヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質２５μｇ／マウス／注射を含有した。濃度範囲０．２５～０．６７ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ又は生理食塩水中で抗原を調製した。合計で５０又は２５μｇの抗原を１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて３～４回追加接種した。自家製のヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質を使用して、融合細胞培養上清を間接ＥＬＩＳＡにかけた。ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質に結合する陽性ハイブリドーマスクリーニング抗体を選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマを、細胞ベース結合ＦＡＣＳ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びリガンドブロッキングＥＬＩＳＡにもかけた。高特異性ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合、マウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓ結合及びヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃブロッキング活性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限界希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。
【0179】
実施例１１ ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴を用いたマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体の結合親和性の決定
実施例１０で生成された精製マウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、その結合親和性及び結合速度について特性決定した。
実施例１０で生成された精製マウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、その結合親和性及び結合速度について特性決定した。
【0180】
簡潔には、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８、マウス抗体捕捉キット）が、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって提供される標準的なアミンカップリングキットを用いて、第一級アミンを介して、ＣＭ５チップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販のカルボキシメチルデキストラン被覆チップ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）に共有結合された。バイオセンサー表面上の未反応部位をエタノールアミンでブロックした。濃度１３．３ｎＭの本開示の精製マウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体をそれぞれ、流量１０μＬ／分でチップ上に流した。次いで、段階希釈ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（自家製、配列番号２０に記載のアミノ酸配列）、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（自家製、配列番号２１に記載のアミノ酸配列）、又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５－ｈｉｓタンパク質（自家製、配列番号２２に記載のアミノ酸配列）（８０ｎＭで開始してＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅによって提供された）中で２倍希釈）を流量３０μＬ／分でチップ上に流した。抗原－抗体結合キネティクスを２分間にわたって追跡し、解離キネティクスを１０分間追跡した。結合及び解離曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄ値を決定し、以下の表６－１及び６－２にまとめた。
【0181】
【表7】
【0182】
【表8】
【0183】
本開示のすべてのマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、高い結合親和性でヒトＳｉｇｌｅｃ１５、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５及びマウスＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合した。
【0184】
実施例１２ マウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５モノクローナル抗体の結合活性
捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５及びマウスＳｉｇｌｅｃ１５に対するマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の結合活性をさらに決定した。
捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５、カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５及びマウスＳｉｇｌｅｃ１５に対するマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体の結合活性をさらに決定した。
【0185】
ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－００５－０７２）をＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ'）２フラグメント特異的の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用したことを除いては、実施例３のプロトコルに従って、捕捉ＥＬＩＳＡを行った。その結果を図１６に示した。
【0186】
９６ウェルプレートにおける１．５×１０５細胞／ウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液中の段階希釈抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照（６６．６７ｎＭで開始し、５倍段階稀釈）１００μＬ中で４０分間氷上にてインキュベートし、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－１１６－１４６）１００μＬを細胞に添加したことを除いては、実施例３のプロトコルに従って、細胞ベースＦＡＣＳを行った。その結果を図１７に示した。
【0187】
ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３５－０７１）をＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的の代わりに１００μｌ／ウェルで使用したことを除いては、実施例３のプロトコルに従って、間接ＥＥＬＩＳＡを行った。その結果を図１８及び１９に示した。
【0188】
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマーク（ＢＭとも呼ばれるｃｈ５Ｇ１２、米国特許出願公開第２０１９／０２０２９１２号明細書参照、配列番号２４及び２５にそれぞれ記載の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列）と比較して、高いＢｍａｘ（最大結合）及び低いＥＣ５０でヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合したことが図１６から分かり、より多くのヒトＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に、より効率的に結合したことが示唆される。図１７によれば、本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体は、ＦＡＣＳ試験において、少し活性が劣るが細胞表面ヒトＳｉｇｌｅｃ１５に特異的に結合した。
【0189】
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマークよりも高い結合活性でカニクイザルＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的に結合することが図１８から示され、本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマークと比べて少し低い結合活性でマウスＳｉｇｌｅｃ１５タンパク質に特異的に結合することが図１９から示された。
【0190】
実施例１３ Ｓｉｇｌｅｃ１５－ＬＲＲＣ４Ｃ又はＳｉｇｌｅｃ１５－ベンチマーク結合に対するマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体のブロッキング活性
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体を、上述のプロトコルに従ってリガンドブロッキングＥＬＩＳＡ及びベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおいても試験した。その結果を図２０及び２１に示した。
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体を、上述のプロトコルに従ってリガンドブロッキングＥＬＩＳＡ及びベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおいても試験した。その結果を図２０及び２１に示した。
【0191】
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ヒトＬＲＲＣ４Ｃ結合をブロッキングすることができ、且つそのブロッキング活性がベンチマークよりも少し高いことが図２０から分かる。
【0192】
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－ベンチマーク結合をブロックすることができることが図２１に示され、本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマークが結合したのと同様なエピトープに結合し得ることが示唆される。
【0193】
実施例１４ Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰変異させたマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体
以下に記載の修正及びプロトコルも加えて、上記の実施例のプロトコルに従って、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰する生物活性について、本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体をさらに試験した。
以下に記載の修正及びプロトコルも加えて、上記の実施例のプロトコルに従って、Ｓｉｇｌｅｃ１５媒介Ｔ細胞抑制を復帰する生物活性について、本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体をさらに試験した。
【0194】
Ｔ細胞抑制の復帰変異試験において、濃度４００μｇ／ｍｌの本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体又は対照を、ヒトＳｉｇｌｅｃ１５－Ｆｃタンパク質（配列番号１９、１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ－１６４０媒体中に４０μｇ／ｍｌ）と体積比１：１で混合した。その結果を図２２Ａ及び２２Ｂに示した。
【0195】
本開示のマウス抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体が、ベンチマークと比較して低い、又は同様なＥＣ５０でＳｉｇｌｅｃ１５媒介ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞抑制を復帰させることができ、且つ高用量の本開示の抗体での処置によって、細胞増殖パーセンテージがかなり高くなったことが分かる。
【0196】
次いで、本開示のマウス抗体をシークエンシングし、重鎖／軽鎖可変領域の配列番号を表１にまとめた。興味深いことに、３つの抗体Ｂ２Ｄ７Ｈ７Ａ３Ｃ１、Ｂ２Ｇ１２Ｈ３Ｅ８及びＢ２Ｈ２Ｈ１Ａ７が同じ重鎖／軽鎖ＣＤＲ配列を有した。
【0197】
本開示は、１つ以上の実施形態とともに上述されているが、本開示が、それらの実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、説明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る際、全ての代替例、修飾、及び均等物を包含することが意図される。本明細書に引用される全ての参照文献は、全体が参照によりさらに援用される。
【0198】
本出願中の配列が、以下に要約される。
【0199】
【表9】
【0200】
【表10】
【0201】
【表11】
【0202】
【表12】
【0203】
【表13】
【0204】
本発明の好ましい実施形態を詳細に記述しているが、その多くの明らかな変形形態が、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく可能であるため、上記のパラグラフによって定義される本発明は、上記の明細書に記載の特定の詳細に限定されないことを理解されたい。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【配列表】
【外国語明細書】