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特開2024-160248ケンペロール配糖体化合物を含む皮膚バリア機能回復用化粧料組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024160248

(43)【公開日】2024-11-13

(54)【発明の名称】ケンペロール配糖体化合物を含む皮膚バリア機能回復用化粧料組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 8/60 20060101AFI20241106BHJP

A61K 31/7048 20060101ALI20241106BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20241106BHJP

A61Q 17/00 20060101ALI20241106BHJP

A61Q 19/08 20060101ALI20241106BHJP

A61K 36/82 20060101ALI20241106BHJP

A23L 33/105 20160101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

A61K8/60

A61K31/7048

A61P17/00

A61Q17/00

A61Q19/08

A61K36/82

A23L33/105

【審査請求】有

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024117532

(22)【出願日】2024-07-23

(62)【分割の表示】P 2021110509の分割

【原出願日】2021-07-02

(31)【優先権主張番号】10-2020-0118396

(32)【優先日】2020-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り “Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌｔｒｉ－ａｎｄｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＣａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａｓｅｅｄｃａｋｅａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”，ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ４９５（２０２０），Ｖｏｌ．４９５，１０８１０１公開日：２０２０年７月１４日

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506213681

【氏名又は名称】アモーレパシフィックコーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】１００，Ｈａｎｇａｎｇ－ｄａｅｒｏ，Ｙｏｎｇｓａｎ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コ，ジェヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョ，シヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョンス

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ソンヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョンジュン

(72)【発明者】

【氏名】ペク，フンス

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ウィドン

(57)【要約】（修正有）

【課題】ツバキ種子からオイルを抽出した後に廃棄されるツバキ油粕から抽出されたケンペロール化合物を有効成分として含み、環境にやさしく、且つ副作用が少なくて人体に安全であり且つ皮膚再生などの効果に優れる皮膚保護用組成物を提供すること。
【解決手段】本発明の皮膚保護用組成物は、例えば化学式１で表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む。

【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、皮膚保護用組成物。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【請求項2】

前記ケンペロール配糖体化合物は、ツバキ油粕から抽出されたものである、請求項１に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項3】

前記有効成分の濃度が、当該組成物の全重量を基準にして０．０１～１００μＭである、請求項１又は２に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項4】

前記皮膚保護は、
皮膚しわを改善すること；
皮膚再生を促進すること；
基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制すること；
アトピー性皮膚を改善、予防又は治療すること；
皮膚角質生成周期を調節すること；又は
３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制すること；である、請求項１～３のいずれか一項に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項5】

当該組成物は化粧料組成物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項6】

当該組成物は、アトピー性皮膚炎の改善、予防又は治療用薬学組成物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項7】

前記有効成分の投与量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項６に記載の皮膚保護用組成物。

【請求項8】

当該組成物は食品組成物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の皮膚保護用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書には、人体に安全であり且つ皮膚保護効果に優れるケンペロール配糖体化合物を含む皮膚保護用組成物が開示される。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、人体の一次防御膜であって、体内の諸器官を温度や湿度の変化、紫外線、公害物質などの外部環境の刺激から保護し、体温調節などの生体恒常性の保持にも重要な役割を果たしている。

【0003】

しかし、過度な物理的・化学的刺激やストレス、栄養欠乏などの外部要因や加齢が皮膚の正常機能を低下させ、弾力損失、角質化、しわ生成などの現象を促進させる。このような現象を防止し、より健康で且つ弾力のある皮膚を保持するために、生理活性物質が強化された化粧品を使用することで皮膚の固有機能を保持させ且つ皮膚細胞を活性化させ、皮膚再生を効果的に促進させるための努力がなされてきた。

【0004】

しかしながら、既存の化粧品原料の大半は、その効能が不十分であったり、その効能が強いと皮膚副作用を誘発したりするなどの様々な問題点を持っている。そこで、皮膚に安全且つ効果的に皮膚再生を促進するとともに、皮膚角質生成周期を調節することができる成分についての関心が高まりつつある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】B. C.Liau et al., Development of pressurized hot water extraction for five flavonoid glycosides from defatted Camellia oleifera seeds (byproducts), Industrial Crops and Products 95 (2017) 296-304

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一側面において、ケンペロール配糖体化合物を有効成分として含み、副作用が少なくて人体に安全であり、且つ皮膚保護効果に優れる組成物を提供することを目的とする。

【0007】

本発明の他の一側面において、ツバキ油粕（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａｓｅｅｄｃａｋｅ）から抽出されたケンペロール配糖体化合物を有効成分として含み、ツバキ種子油の抽出後に捨てられる廃資源を活用した皮膚保護用組成物を提供することを目的とする。

【0008】

本発明の他の一側面において、皮膚しわの改善、又は皮膚再生を促進する組成物を提供することを目的とする。

【0009】

本発明の他の一側面において、基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制する組成物を提供することを目的とする。

【0010】

本発明の他の一側面において、アトピー性皮膚を改善するための組成物を提供することを目的とする。

【0011】

本発明の他の一側面において、皮膚角質生成周期を調節し、又は皮膚角質を調節し、又は皮膚角質ターンオーバーを促進し、又は皮膚角質ターンオーバー周期を正常化する組成物を提供することを目的とする。

【0012】

本発明の他の一側面において、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、アトピー性皮膚を改善し、又はアトピー性皮膚炎を改善、予防又は治療する組成物を提供することを目的とする。

【0013】

本発明の他の一側面において、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚角質生成周期を調節し、又は皮膚角質を調節し、又は皮膚角質ターンオーバーを促進し、又は皮膚角質ターンオーバー周期を正常化する組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本明細書では、下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、皮膚保護用組成物を提供する。

【0015】

【化1】

【0016】

【化2】

【0017】

【化3】

【0018】

【化4】

【発明の効果】

【0019】

一側面において、本明細書に開示された皮膚保護用組成物は、ケンペロール配糖体化合物、特に、ケンペロール４－配糖体化合物を有効成分として含み、基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制することで、皮膚しわを改善し、且つ皮膚再生を促進することができる。

【0020】

他の一側面において、本明細書に開示された皮膚保護用組成物は、ケンペロール４－配糖体化合物を有効成分として含み、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制することで、アトピー性皮膚を改善し、又はアトピー性皮膚炎を改善、予防又は治療することができ、且つ皮膚角質生成周期を調節することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明の一実施例に従い老化マーカーＳＡ－ｂｅｔａ－ｇａｌの発現を観察した結果である。

【図2a】本発明の一実施例に係る組成物の３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性抑制効果を示したグラフである。

【図2b】本発明の一実施例に係る組成物の３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性抑制効果を示したグラフである。

【図3】本発明の一実施例に係る組成物の基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現抑制効果を示したグラフである。

【図4】本発明の一実施例に係る組成物がＨ＆Ｅ、Ｋｉ－６７、ＫＲＴ１０、ＦＬＧ、ＩＮＶに及ぼす効果を示したグラフである。

【図5a】本発明の一実施例に係る組成物が表皮厚さ、Ｋｉ－６７に及ぼす効果を示した結果である。

【図5b】本発明の一実施例に係る組成物が表皮厚さ、Ｋｉ－６７に及ぼす効果を示した結果である。

【図6a】本発明の一実施例に係る組成物がＫＲＴ１０に及ぼす効果を示した結果である。

【図6b】本発明の一実施例に係る組成物がＦＬＧに及ぼす効果を示した結果である。

【図6c】本発明の一実施例に係る組成物がＩＮＶに及ぼす効果を示した結果である。

【図7】化学式１～４で表されるケンペロール配糖体化合物の情報を示す図である。

【図8a】ＰＤＫ１ｌの抑制時に再生能力が回復するかに関する実験概略図である。

【図8b】ＰＤＫ１ｌの抑制時に再生能力が回復するかに関する実験概略図である。

【図9a】ＰＤＫ１の抑制による皮膚細胞の機能的回復を示した結果である。

【図9b】ＰＤＫ１の抑制による皮膚細胞の機能的回復を示した結果である。

【図10a】皮膚再生に係るＰＤＫ１の効果を示した結果である。

【図10b】皮膚再生に係るＰＤＫ１の効果を示した結果である。

【図11a】ＰＤＫ１の抑制が皮膚等価物でＳＡＳＰを抑制することを示すグラフである。

【図11b】ＰＤＫ１の抑制が皮膚等価物でＳＡＳＰを抑制することを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本明細書において、ある部分がある構成要素を「含む」としたとき、これは、特に断りのない限り、他の構成要素を除外することではなく、他の構成要素を更に含んでよいことを意味する。

【0023】

以下、本発明を詳しく説明する。

【0024】

本発明の例示的な具現例では、下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、皮膚保護用組成物を提供する。

【0025】

【化5】

【0026】

【化6】

【0027】

【化7】

【0028】

【化8】

【0029】

本明細書において「異性体」は、特に光学異性体（ｏｐｔｉｃａｌｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、本質的に純粋なエナンチオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｅｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ）、本質的に純粋なジアステレオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｅｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）又はそれらの混合物）だけでなく、配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｓｏｍｅｒｓ）（すなわち、１つ以上の化学結合のその角度のみ異なる異性体）、位置異性体（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｓｏｍｅｒｓ）（特に、互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒｓ））、又は幾何異性体（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、シス－トランス異性体）を含む。

【0030】

本明細書において「本質的に純粋な（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｅ）」とは、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーと関連して用いた場合、エナンチオマー又はジアステレオマーを例として挙げることのできる具体的な化合物が約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、又は約９８％以上、さらに好ましくは約９９％以上、最も好ましくは約９９．５％以上（ｗ／ｗ）存在することを意味する。

【0031】

本明細書において「薬学的に許容可能」とは、通常の医薬的服用量（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｄｏｓａｇｅ）で用いる際に相当な毒性効果を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに用いることができるという政府又はこれに準ずる規制機構の承認を受けることができ、又は承認を受け、又は一般的な薬局方に列挙され、又はその他一般的な薬局方に記載されたものと認定されることを意味する。

【0032】

本明細書において「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能であり、親化合物（ｐａｒｅｎｔｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸から形成されるか；又は、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２，２，２］－ｏｃｔ－２－エン－１-カルボン酸、グルコヘプト
ン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸から形成される酸付加塩（ａｃｉｄａｄｄｉｔｉｏｎｓａｌｔ）；又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでよい。
本明細書において「水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）」は、水が結合している化合物を意味し、水と混合物との間に化学的な結合力のない内包化合物を含む広範囲な概念である。
本明細書において「溶媒和物」は、溶質の分子やイオンと溶媒の分子やイオンとの間に生じた高次の化合物を意味する。

【0033】

前記化学式１で表されるケンペロール配糖体化合物のＩＵＰＡＣ名は、ケンペロール－３－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ－３－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）であり、これは常温で薄い黄色の粉末（ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ）で存在していてよい。

【0034】

前記化学式１で表されるケンペロール配糖体化合物の情報は、下記のとおりである。
Ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ；ＵＶ（ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）λ_ｍａｘ 2６６,３４７ｎｍ；［α］^２２ _Ｄ－５７．４（ｃ０．１０）；ＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｍ／ｚ８５９．２５０３［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３７Ｈ_４７Ｏ_２３ ^＋,８５９．２５０８）、８８１．２３２９［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３７Ｈ_４
_６Ｏ_２３Ｎａ^＋、８５９.２３２７）；^１Ｈ－（ＣＤ_３ＯＤ、５００ＭＨｚ）ａｎｄ
^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ、１２５ＭＨｚ）（図７参照）

【0035】

前記化学式２で表されるケンペロール配糖体化合物のＩＵＰＡＣ名は、ケンペロール－３－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ－３－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）であり、これは、常温で薄い黄色の粉末（ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ）で存在していてよい。

【0036】

前記化学式２で表されるケンペロール配糖体化合物の情報は、下記のとおりである。
Ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ；ＵＶ（ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）λ_ｍａｘ２６６,
３４７ｎｍ；[α]^２２ _Ｄ－６３．７（ｃ０．１０）；ＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｍ／ｚ８５９．２５０５［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３７Ｈ_４７Ｏ_２３ ⁺、８５９．２５０８）、８８１．２３２５［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３７Ｈ_４
_６Ｏ_２３Ｎａ^＋、８５９．２３２７）；^１Ｈ－（ＣＤ_３ＯＤ、５００ＭＨｚ）ａｎｄ ^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ、１２５ＭＨｚ）（図７参照）

【0037】

前記化学式３で表されるケンペロール配糖体化合物のＩＵＰＡＣ名は、ケンペロール－３－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ－３－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で
あり、これは、常温で薄い黄色の粉末（ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ）で存在していてよい。

【0038】

前記化学式３で表されるケンペロール配糖体化合物の情報は、下記のとおりである。
Ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ；ＵＶ（ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）λ_ｍａｘ２６６、３４７ｎｍ；［α］^２２ _Ｄ－７２．５（ｃ０．２）；ＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｍ／ｚ８８９．２６１６［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３８Ｈ_４９Ｏ_２３ ^＋、８
８９．２６１３）ａｎｄ９１１．２４３２［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒ
Ｃ_３８Ｈ_４８Ｏ_２４Ｎａ^＋、８５９．２３２７）；_１Ｈ－（ＣＤ_３ＯＤ、５００ＭＨｚ）
ａｎｄ ^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ、１２５ＭＨｚ）（図７参照）

【0039】

前記化学式４で表されるケンペロール配糖体化合物のＩＵＰＡＣ名は、ケンペロール－３－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ－３－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－Ｏ－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→６）－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）であり、これは、常温で薄い黄色の粉末（ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ）で存在していてよい。

【0040】

前記化学式４で表されるケンペロール配糖体化合物の情報は、下記のとおりである。
Ｐａｌｅｙｅｌｌｏｗｐｏｗｄｅｒ；ＵＶ（ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）λ_ｍａｘ２６６,
３４７ｎｍ；［α］^２２ _Ｄ－４５．１（ｃ０．１０）；ＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｍ／ｚ８８９．２６１３［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒＣ_３８Ｈ_４９Ｏ_２３ ^＋、
８８９．２６１３）ａｎｄ９１１．２４２３［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ. ｆｏｒ
Ｃ_３８Ｈ_４８Ｏ_２４Ｎａ^＋、８５９．２３２７）；^１Ｈ－（ＣＤ_３ＯＤ、５００ＭＨｚ）ａｎｄ ^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ、１２５ＭＨｚ）（図７参照）

【0041】

本発明の一側面に係る組成物は、ツバキ種子からオイルの抽出後に廃棄されるツバキ油粕（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａｓｅｅｄｃａｋｅ）から抽出されたケンペロール４配糖体化合物（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を有効成分として含み、従来のケンペロール配糖体化合物を有効成分として含む組成物に比べて、顕著に優れる皮膚しわの改善、皮膚再生、アトピー性皮膚炎の改善、予防又は治療、皮膚角質生成周期の調節効果を奏し得る。

【0042】

ツバキ油粕抽出物は、テルペン配糖体、フラボノイド配糖体、糖及びタンパク質からなっている。特に、ツバキ油粕のフラボノイド配糖体は、ケンペロールの４配糖体（化学式１、２、３、４）と３配糖体（下記の化学式５、６、７、８）から構成されており、本発明者らは、ツバキ油粕由来のケンペロール配糖体のうち４配糖体の４種（化学式１、２、３、４）が皮膚保護効果に優れることを確認した。

【0043】

【化9】

【0044】

【化10】

【0045】

【化11】

【0046】

【化12】

【0047】

一具現例において、前記ケンペロール配糖体化合物は、ツバキ油粕から抽出されたものであってよい。

【0048】

具体的に、前記ケンペロール配糖体化合物は、ツバキ種子から圧搾方法にてオイル（油）を搾油後に得られるツバキ油粕を用意し、該ツバキ油粕から７０％エタノールを用いてケンペロール配糖体化合物を抽出することで得られてよい。

【0049】

一具現例において、前記有効成分の濃度が、当該組成物の全重量を基準にして０．０１～１００μＭであってよく、例えば、０．０１μＭ以上、０．１μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、１．５μＭ以上、２μＭ以上、又は２．５μＭ以上であってよく、且つ１００μＭ以下、５０μＭ以下、１０μＭ以下、８μＭ以下、６μＭ以下、又は４μＭ以下であってよい。

【0050】

前記濃度が０．０１μＭ未満であると、皮膚再生の促進、アトピー性皮膚炎の改善、又は皮膚角質生成周期の調節などの皮膚保護効果が微々たるものになることがあり、１００μＭを超えると、細胞毒性が現われることがある。

【0051】

一具現例において、前記組成物は、皮膚しわを改善するためのものであってよい。

【0052】

一具現例において、前記組成物は、皮膚再生を促進するためのものであってよい。

【0053】

一具現例において、前記組成物は、基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制することができる。

【0054】

他の一具現例において、前記組成物は、基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制して、皮膚しわを改善するためのものであってよい。

【0055】

また他の一具現例において、前記組成物は、基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制して、皮膚再生を促進するためのものであってよい。

【0056】

一具現例において、前記組成物は、アトピー性皮膚を改善するためのものであってよい。

【0057】

一具現例において、前記組成物は、皮膚角質生成周期を調節するためのものであってよい。

【0058】

前記皮膚角質生成周期は、表皮細胞のターンオーバー（ｔｕｒｎ－ｏｖｅｒ）周期であると言え、これは角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の皮膚表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の底から皮膚表面の退化した角質細胞（ｃｏｒｎｅｏｃｙｔｅｓ）になるまでの周期を意味する。

【0059】

皮膚細胞のターンオーバー周期は、二つの要素によって決められ得るが、一つは表皮細胞の成長ポテンシャル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を保持してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）の形成効率を測定することであり、もう一つは表皮細胞の分化促進でバリア強化を保持して分化程度を測定することである。本発明の一側面によれば、前記組成物は、ケンペロール４配糖体化合物を有効成分として含み、表皮細胞のコロニー形成を促進し、且つ分化を促進して皮膚角質生成周期又は表皮細胞のターンオーバー周期を短縮することができる。

【0060】

他の一具現例において、前記組成物は、皮膚角質を調節するためのものであってよく、又は皮膚角質ターンオーバーを促進するためのものであってよく、又は皮膚角質ターンオーバー周期を正常化するためのものであってよい。

【0061】

一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制することができる。

【0062】

前記化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物を含む組成物を用いてＰＤＫ１活性を抑制した場合、老化して成長が抑制された細胞が再び成長することができ、また損傷した細胞が回復することができる。

【0063】

言い換えれば、老化したヒト真皮線維芽細胞においてＰＤＫ１の抑制が老化特徴を除去し、且つＮＦ－κＢ及びｍＴＯＲ信号伝達を抑制して、細胞生成周期を回復させて皮膚再生能力を回復又は促進することができる。

【0064】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚しわを改善するためのものであってよい。

【0065】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚再生を促進するためのものであってよい。

【0066】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、アトピー性皮膚を改善し、又はアトピー性皮膚炎を改善、予防又は治療するためのものであってよい。

【0067】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚角質生成周期を調節するためのものであってよい。

【0068】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚角質を調節するためのものであってよい。

【0069】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚角質ターンオーバーを促進するためのものであってよい。

【0070】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚角質ターンオーバー周期を正常化するためのものであってよい。

【0071】

また他の一具現例において、前記組成物は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制して、皮膚バリアを改善するためのものであってよい。
一具現例において、前記組成物は化粧料組成物であってよい。

【0072】

本発明の一実施例に係る化粧料組成物の外形は、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有してよい。これは、局所適用に適したあらゆる剤形として、例えば、溶液、ゲル、固体、練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポーソム）及び非イオン型の小嚢分散剤の形態で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー又はコンシーラースティックの形態で提供されてよい。これらの組成物は当
該分野の通常的な方法によって製造されてよい。また本発明に係る組成物は、泡沫（ｆｏａｍ）の形態で圧縮された推進剤を更に含有したエアロゾル組成物の形態で用いられてもよい。

【0073】

本発明の一実施例に係る化粧料組成物は、その剤形において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、収れん化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、及びボディーエッセンスなどの化粧品に剤形化されてよい。

【0074】

本発明の一実施例に係る剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカンド、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられてよい。

【0075】

本発明の一実施例に係る剤形がパウダー又はスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、又はポリアミドパウダーが用いられてよく、特にスプレーの場合は、更に、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでよい。

【0076】

本発明の一実施例に係る剤形が溶液又は乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレ
ングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。

【0077】

本発明の一実施例に係る剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガカントなどが用いられてよい。

【0078】

本発明の一実施例に係る剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられてよい。

【0079】

本発明の一実施例に係る化粧料組成物には、前記有効成分の他、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分が更に含まれてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質、及び海草エキスからなる群より選択された成分を含んでよい。

【0080】

本発明の一実施例に係る化粧料組成物には、更に、前記機能性添加物と共に必要に応じて一般的な化粧料組成物に含まれる成分を配合してもよい。その他含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
さらに、本発明の一実施例に係る組成物は、皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤は
、外皮に塗布されるものであればいずれも含み得る組成物の総称であって、多様な剤形の化粧品、医薬品がこれに含まれ得る。

【0081】

一具現例において、前記組成物は、アトピー性皮膚炎の改善、予防又は治療用薬学組成物であってよい。

【0082】

本発明の一実施例に係る薬学組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、並びにその他治療的に有用な物質を更に含有してよく、通常的な方法に従い多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化してよい。

【0083】

前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがあり、これらの剤形は、有効成分の他、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有してよい。錠剤は、更に、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリジンといった結合剤を含有してよく、場合に応じて、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有してよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されてよい。また、前記非経口投与の形態としては、経皮投与型剤形であってよく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに制限されるものではない。

【0084】

本発明の一実施例に係る薬学組成物は、非経口、直腸、局所、経皮、皮下などに投与されてよい。

【0085】

前記有効成分の投与量の決定は、通常の技術者の水準内にあり、薬物の１日投与量は、投与しようとする対象の肥満進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因に応じて異なり得るが、成人を基準としたとき、一般的には、前記組成物０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日であってよく、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１ｍｇ／Ｋｇ／日以上、１．３ｍｇ／Ｋｇ／日以上、１．５ｍｇ／Ｋｇ／日以上、１．７ｍｇ／Ｋｇ／日以上、２ｍｇ／Ｋｇ／日以上、又は２．２ｍｇ／Ｋｇ／日以上であってよく、且つ１００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５０ｍｇ／ｋｇ／日以下、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下、７ｍｇ／ｋｇ／日以下、５ｍｇ／ｋｇ／日以下、３ｍｇ／ｋｇ／日以下、又は２．５ｍｇ／ｋｇ／日以下であってよく、好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇを１日１～３回分割して投与してよく、前記投与量は如何なる方法であっても本発明の範囲を限定するものではない。

【0086】

一具現例において、前記組成物は食品組成物であってよい。

【0087】

本発明の一実施例に係る食品組成物は、液状又は固体状態の剤形であってよく、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸剤、顆粒剤、飲料（ドリンク剤）、ダイエットバー、チョコレート、キャラメル剤形、又はお菓子類の剤形であってよく、その剤形が特に限定されるものではない。本発明の食品組成物は、前記有効成分の他、必要に応じて賦形剤、糖類、香料、色素、油脂類、タンパク質などを適宜含有してよい。
本発明のまた他の例示的な具現例において、下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又は
その溶媒和物有効成分として含む組成物を、これを必要とする対象に有効量で投与することを含む、皮膚を保護する方法を提供する。

【0088】

【化13】

【0089】

【化14】

【0090】

【化15】

【0091】

【化16】

【0092】

本発明のまた他の例示的な具現例において、皮膚保護用組成物を製造するための、下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の用途を提供する。

【0093】

【化17】

【0094】

【化18】

【0095】

【化19】

【0096】

【化20】

【0097】

本発明のまた他の例示的な具現例において、皮膚を保護するための下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の非治療的用途を提供する。

【0098】

【化21】

【0099】

【化22】

【0100】

【化23】

【0101】

【化24】

【0102】

本発明のまた他の例示的な具現例において、アトピー性皮膚炎の改善、予防又は治療に用いるための下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を提供する。

【0103】

【化25】

【0104】

【化26】

【0105】

【化27】

【0106】

【化28】

【0107】

以下、下記の実施例を通じて本発明をより具体的に説明する。なお、下記の実施例は本発明についての理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がこれらに限定されるものではない。

【0108】

実施例
実験に用いたツバキ油粕は、済州島ツバキ村のツバキ種子から圧搾方法にてオイル（油）の生産後に得たものである。ツバキ油粕から７０％エタノールを用いて抽出物を製造し、ツバキ油粕抽出物がテルペン配糖体、フラボノイド配糖体、糖及びタンパク質からなることを確認した。特にツバキ油粕のフラボノイド配糖体は、ケンペロールの４配糖体（化学式１～４）と３配糖体（化学式５～８）から構成されており、本明細書ではツバキ油粕のケンペロール配糖体のうち４配糖体の４種（化学式１～４）の皮膚抗老化及び再生効果に優れることを確認した。

【0109】

１）ツバキ油粕ケンペロール配糖体分画の精製
低温搾油してオイルを除去したツバキ油粕１ｋｇに７０％エタノール８ｋｇを入れ、加温抽出機を用いて６０℃で８時間抽出した。フィルタープレスでろ過して得た抽出物を５０～６０℃で回転減圧濃縮機にて固形分が約５０％になるまで減圧濃縮して、２００ｇの濃縮液を得た。該濃縮液を固形分１０％になるように精製水で希釈した。
この溶液をイオン交換樹脂（ＨＰ－２０）２Ｌが充填されたガラス管コラムにローディングした後、精製水１０Ｌで洗浄して不純物及び糖成分を除去した。次いで、順次、３０％エタノール１０Ｌを流し込み、溶出液を減圧濃縮し、凍結乾燥して、ツバキケンペロール配糖体分画パウダー約２０ｇを得た。

【0110】

２）ツバキ油粕のケンペロール４配糖体及び３配糖体の精製
ツバキケンペロール配糖体分画の各成分は、ＨＰＬＣの結果、溶出時間の差が非常に小さくて分取用ＨＰＬＣを用いて分離した。使用溶媒条件は水とアセトニトリル、メタノールの混合溶媒を用い、これらの溶媒の濃度勾配又は一定の比率の混合液を用い、その結果、化学式１～４（４配糖体）及び５～８（３配糖体）のケンペロール配糖体化合物の成分を分離した。

【0111】

試験例
統計
下記のすべての実験における試料間の統計的有意性はｓｔｕｄｅｎｔｔ－ｔｅｓｔを用い、ｐ－ｖａｌｕｅ値が０．０５以下の場合に統計的に有意であると分析した。（*ｐ
＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）

【0112】

試験例１：老化マーカーＳＡ－ｂｅｔａｇａｌ発現程度の確認
*細胞株及び培養
（１）老化した皮膚細胞の培養
ヒト真皮線維芽細胞のｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０％ウシ血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ１２１０－００３８）で培養し、培養はいずれも３７℃、５％ＣＯ_２培養器で行った。継代の数が６～９の細胞を若い細胞とし、これを１：５継代培養して３７回継代し、老化した真皮線維芽細胞を得た。

【0113】

（２）老化マーカーＳＡ－ｂｅｔａｇａｌ発現活性の分析
前記（１）の老化した皮膚細胞に、ＤＭＳＯ、化学式１、２、３、４、５、６、７、８で表される化合物と、下記の化学式９、１０で表されるケンペロール３－Ｏ－β－ルチノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ３－Ｏ－β－ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ）（化学式９）、ケンペロール７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ７－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（化学式１０）３μＭをそれぞれ７日間処理した。

【0114】

【化29】

【0115】

【化30】

【0116】

８日目にＰＢＳで洗浄し、細胞老化分析キット（ＣｅｌｌｕｌａｒＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＡｓｓａｙｋｉｔ）（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ,Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から提供された固定液と染色液で３７℃で１６時間染色した。翌日にＰＢＳで洗浄し、２０％グリセロール溶液で覆って顕微鏡にて緑色に染色された細胞の数を測定した後、老化マーカーのＳＡ－ｂｅｔａ－Ｇａｌ発現程度を評価し、その結果を下記の表１、図１に示した。

【0117】

【表1】

【0118】

*細胞生存力の分析（Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙ）
１．ＨＤＦ（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分注し、細胞培養条件で４８時間培養した。
２．ＦＢＳを含有していないＤＭＥＭ培地に試験物質を濃度別に希釈してから細胞に処理して４８時間培養した。
３．ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）で洗浄し、１０％ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ溶液を含む培養培地に取り替えて１時間にかけて細胞培養条件で培養した後、ＥＬＩＳＡｒｅａｄｅｒ（ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏ）にて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0119】

前記表１を参照すると、本発明の化学式１－４の化合物が対照群又は比較例化合物（化学式５－８）と比べて、約５０％の水準で老化マーカーのＳＡ－ｂｅｔａの発現を抑制させたことを確認することができる。

【0120】

また、図１を参照すると、本発明の化学式１－４の化合物が培養された細胞で老化マーカーのＳＡ－ｂｅｔａｇａｌが顕著に低減したことを目視で確認することができる。

【0121】

試験例２：ＰＤＫ１の分析
３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性は、組換え精製ＰＤＫ１酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｕｒｉｆｉｅｄＰＤＫ１ｅｎｚｙｍｅ）とＡＤＰ－Ｇｌｏ＋ＰＤＫ１キナーゼ酵素システム（ＰＤＫ１ＫｉｎａｓｅＥｎｚｙｍｅＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて測定した。基材（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＴＰ、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）混合物の分注後、試験物質（１、３、１０μＭ）を各ウェル（ｗｅｌｌ）に分注した。その直後にＰＤＫ１を分注して６０分間反応させた。反応後、ＡＤＰ－ｇｌｏを入れ、常温で４０分インキュベーション（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、キナーゼ探知バッファー（ｋｉｎａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を入れて３０分の反応後に発光リーダー（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅａｄｅｒ）（ＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒ２、ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）にて測定した。その結果を図２ａ及び２ｂに示した。

【0122】

図２ａ及び２ｂを参照すると、比較例である化学式５～８の化合物（２ａ）に比べて、本発明の化学式１～４の化合物（２ｂ）のＰＤＫ活性抑制効果のほうが遥かに優れていることを確認することができる。具体的に、図２ａを参照すると、対照群であるＤＭＳＯに比べて、化学式５～８の化合物の場合、ＰＤＫ１活性が全く抑制できず、むしろ促進させる様態をみせたが、図２ｂを参照すると、本発明の化学式１～４の化合物は、対照群であるＤＭＳＯに比べて、顕著にＰＤＫ１活性を抑制することを確認することができる。また、ケンペロール４配糖体化合物（化学式１～４）のうちＯＨが更にくっ付いている場合、同一の濃度でより高い効果を示すことを確認することができる。

【0123】

試験例３：ＭＭＰ－１ＥＬＩＳＡ分析
ＨＤＦ細胞を２４ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分注し、細胞培養条件で２４時間培養した。次いで、ＦＢＳを含有していないＤＭＥＭ培地に試験物質を希釈してから細胞に処理して４８時間培養した。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）で洗浄した後、ＤＰＢＳを入れた状態で１５ｍＪ／ｃｍ^２の光量でＵＶＢ（１５ｍＪ／ｃｍ^２）の照射後に試験物質（２μＭ又は３μＭ）が希釈されたＤＭＥＭ培地に取り替えてから４８時間培養した。次いで、上層液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収去し、ＨｕｍａｎＴｏｔａｌＭＭＰ－１ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＭＭＰ－１の量を測定した。その結果を図３に示した。

【0124】

図３を参照すると、本発明のケンペロール４配糖体化合物（化学式１、３、４）のＭＭＰ－１発現抑制がケンペロール３配糖体化合物（化学式５、７）及びレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ、Ｒａ）などの対照群に比べて優れることを確認することができる。

【0125】

試験例４：皮膚バリア改善の確認
１）３Ｄ器官型皮膚表皮（３Ｄｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃｓｋｉｎｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）
ヒト表皮モデル（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍｉｓｍｏｄｅｌｓ）（ＥｐｉｄｅｒｍＴＭＥＰＩ－２０１；ＭａｔＴｅｋｃｏｒｐｏｒｔａｔｉｏｎ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を若い人（２１歳、２１Ｙと表示）及び老人（５８歳、５８Ｙと表示）に該当する人からそれぞれ購入し、これらのうち老人に該当するヒト表皮モデルに化学式で表されるケンペロールの４配糖体を３μＭずつ４日間処理した。１０％中性バッファーホルマリン（ｎｅｕｔｒａｌｂｕｆｆｅｒｅｄｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定してからパラフィンブロックを製造した。

【0126】

２）皮膚バリアマーカーの確認
ａｎｔｉ－ＫＲＴ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ａｎｔｉ－ＦＬＧ（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌＣＯ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ、及びａｎｔｉ－Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ）抗体で反応させた後、顕微鏡で各抗体発現を分析した。具体的に、若いドナー（ｄｏｎｏｒ）（Ｙｏｕｎｇ２１Ｙ）由来の表皮組織と老人のドナー（ｄｏｎｏｒ）（Ｏｌｄ５８Ｙ）由来の表皮組織に薬物を処理した後、提示した抗体にて染色し定量化した。その結果を図４、図５ａ～５ｂ及び図６ａ～６ｃに示し、５ａ～５ｂ及び図６ａ～６ｃは、図４の結果を定量化したものである。

【0127】

これを参照すると、若い人の表皮組織に比べて老人の表皮組織は表皮の厚さが減少し（図５ａ）、バリア機能（ＫＲＴ１０－図６ａ、ＦＬＧ－図６ｂ、ＩＮＶ－図６ｃ）が弱化し、再生能力マーカー（ＫＩ６７－図５ｂ）の発現に劣ることを確認した。なお、老人の表皮組織に化学式１で表される化合物を処理した場合、すべての項目で若い人の表皮組織と類似の程度に表皮厚さ、バリア機能及び再生能力マーカー発現効果が回復する結果を示した。

【0128】

試験例５：ＰＤＫ１抑制時の再生能力回復
調節信号ネットワークを分析してＰＤＫ１が老化線維芽細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を静止線維芽細胞（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）に切り換えできる抑制剤標的であることを予測した（図８ａ）。この予測を検証するために、ＰＤＫ１抑制剤に露出されたＮＨＤＦ（ｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）（図８ｂ）で実験を行い、これは、細胞老化の特徴を除去
し成長因子に対する反応で細胞の増殖を回復させることを確認し、２次元カルチャーと３次元皮膚同等モデルで皮膚再生能力を回復したことを確認した。

【0129】

総合的に、ＰＤＫ１抑制が老化の表現型を維持する核心過程である細胞成長とＳＡＳＰをいずれも減少させ、細胞成長に関連したＰＤＫ１、ＡＫＴ、ＩＫＢＫＢ及びＰＴＥＮから構成された主な陽性フィードバックルーフを非活性化することを確認した。信号伝達の結果的な変化は静止表現型（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を復元する。

【0130】

下記の実験においてヒト真皮線維芽細胞である正常ヒト真皮線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ
ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０％ウシ血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ１２１０－００３８）で培養し、培養はいずれも３７℃、５％ＣＯ_２培養器で行った。継代の数が６～９である細胞を若い細胞とし、これを１：５継代培養して３７回継代し、老化した真皮線維芽細胞を得た。

【0131】

１）傷治癒分析によって分析されたＰＤＫ１抑制による皮膚細胞の機能的回復
先ず、ＰＤＫ１抑制又はｍＴＯＲ及びＮＦ－κＢの二重抑制によって老化の特徴低減だけでなく真正な再生能力が達成できたか否かを確認するために、２次元傷治療と３次元皮膚再生のための逆転した細胞の能力を調べた。

【0132】

具体的な実験方法は下記のとおりである。

【0133】

若いＮＨＤＦは老化条件や薬物治療を受けていない。若いＮＨＤＦは培養がＰＤＬ１２で約８０％の合流に達したときに分析された。残りのＮＨＤＦはドキソルビシン（１００ｎｇ／ｍｌ）とＩＧＦ－１（１００ｎｇ／ｍｌ）に７日間露出させて老化を誘導した。薬物処理条件の場合、老化細胞をＤＭＳＯ、ラパマイシン（１００ｎＭ）、ラパマイシンとＪＳＨ（２．５μＭ）又はＢＸ７９５（１００ｎＭ）で７日間更に処理した。条件培地処理（ＢＸ７９５＋ＣＭ（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ））のために、細胞をドキソルビシン及びＩＧＦ－１の存在の下で、７日間成長させた後、ドキソルビシン、ＩＧＦ－１及びＢＸ７９５の追加の存在の下で、７日継代培養した後、老化細胞から抽出した調節培地とともに３日間更に培養した。

【0134】

図９ａ～９ｂを参照すると、それぞれ次のとおりである：（図９ａ）傷後０時間及び９６時間の代表的なイメージであって、破線が傷部位を示す。スケールバー＝２００μｍ。（図９ｂ）スクラッチ傷分析によるマイグレイション領域の定量化分析。平均（Ｍｅａｎ）±ＳＤ（ｎ＝３）、分散の一方向分析によってＤＭＳＯ対照群老化細胞と比較して***
Ｐ＜０．００１。

【0135】

ＰＤＫ１抑制又はｍＴＯＲ及びＮＦ－κＢの二重抑制（ｍＴＯＲ単一抑制ではない）により、ＮＨＤＦ単一層のスクラッチ傷の治療が促進された（図９ａ～９ｂ）。

【0136】

２）皮膚再生に対するＰＤＫ１の効果
３Ｄ皮膚モデル（皮膚等価物）として、若いＮＨＤＦ（ＰＤＬ１２）、又はドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）とＩＧＦ－１又は繰り返しのメッキ（複製老化、ＰＤＬ５７）によって老化に誘導された老化ＮＨＤＦを準備し、これらをＤＭＳＯ又はＢＸ７９５に露出させた。それぞれ処理された含量は次のとおりである：ドキソルビシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ－１（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＸ－７９５（１００ｎＭ）

【0137】

図１０ａ～１０ｂを参照すると、それぞれ次のとおりである：（１０ａ）皮膚等価モデ
ルセクションはコラーゲン繊維を検出するためにヘマトキシリン及びエオシン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）又はマッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ）で染色された。表示されたタンパク質は免疫組織染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって検出された。結果は３つの代表実験から得たものである。スケールバー＝５０μｍ。

【0138】

具体的に、実験方法は次のとおりである。

【0139】

パラフィンサンプルはキシレンで脱蝋され、下降するエタノールにて再水和された（各溶液当たり３分）。エピトープ（Ｅｐｉｔｏｐｅ）回収は、ＣｉｔｒａｔｅＢｕｆｆｅｒｐＨ６．０ＡｎｔｉｇｅｎＲｅｔｒｉｅｖｅｒ（６４１４２；ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を用いて１２１℃で１０分間行い、スライドはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する前に冷却した。しかる後、セクションを水／１％Ｈ_２Ｏ_２と共に３０分間培養して、内在性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、水とＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間濯ぎ、４℃で一晩中次の１次抗体に露出する前にＰＢＳ／１０％ヤギ血清（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に２０分間培養した。１次抗体は次のとおりである；ａｎｔｉ－ＫＲＴ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ａｎｔｉ－ＦＬＧ（Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ＭＭＰ－１（Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ）。

【0140】

サンプルを１０分間水で完全に洗浄し、更に５分間ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で徹底的に洗浄した後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ－ホースラディッシュペルオキシダーゼ－標識されたポリマー抗マウス抗体（Ｋ４００１；Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と共に３０分間培養した。しかる後、サンプルを液体ＤＡＢ＋ＳｕｂｓｔｒａｔｅＣｈｒｏｍｏｇｅｎＳｙｓｔｅｍ（Ｋ３４６８；Ｄａｋｏ）で培養する前に、水とＰＢＳで３～５分間洗浄した。前記反応を水道水で濯いで中断し、セクションをＭａｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで３～５分間対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）し、水道水で１分間濯ぎ、Ｓｃｏｔｔ’ｓｂｌｕｉｎｇｗａｔｅｒで２分間濯いだ。

【0141】

最後に、セクションは等級が指定されたエタノールで脱水され、キシレンで除去され、Ｃｙｔｏｓｅａｌ６０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に装着された。Ｍａｓｓｏｎ’ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色は市販中のキット（ＢＢＣＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて行われた。免疫蛍光染色のためにＤａｋｏ標的回収溶液（Ｄａｋｏ）でスライドを２０分間沸かして抗原回収を行った。非特異的染色は１０％ロバ血清及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳで３０分間培養してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。組織セクションを、４℃で一晩中ＤａｋｏＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ）でＣＯＬ１７Ａ１（Ａｂｃａｍ）及びＬａｍｉｎｉｎ５（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に培養した後、室温で２時間、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）と結合された適切な２次抗体と共に培養した。ＰＢＳで洗浄した後、核対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）のために、４’,６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（４’,６－ｄｉａｍｉｄｉｎｅ－２’－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙ
ｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を追加した。カバースリップは蛍光性封入剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を用いてガラススライドに装着された。

【0142】

図１０ｂの左側の上から順に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて皮膚厚さの定量化／ＭＭＰ１の定量化／マッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色で検出されたパン－コラーゲン（ｐａｎ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）繊維の定量化（Ｃｏｌｌａｇｅｎｆｉｂｅｒ）／Ｋｉ－６７陽性細胞の定量化／ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて表皮厚さの定量化／ケラチン１０の定量化／。フィラグリンの定量化／ＣＯＬ１７Ａ１の定量化／Ｌａｍｉｎｉｎ５の定量化／ＥＬＩＳＡによって定量化された培養培地に分泌されたタイプＩプロコラーゲンタンパク質の定量化。図１０ｂのデータは、３つの独立サンプルから得た３つの独立フィールドの平均（Ｍｅａｎ）±ＳＤで表示される。分散の一方向分析によってＤＭＳＯ対照群老化細胞と比較して***Ｐ＜０．００１。

【0143】

ＰＤＫ１抑制は、ＭＭＰ１の増加、コラーゲン繊維の減少、プロコラーゲン分泌の減少によって立証された、複製老化及び化学的に誘導された老化に関連した真皮老化を逆転させた（図１０ａ～１０ｂ）。表皮恒常性の場合、角質細胞の増殖と分化との間の均衡は真皮線維芽細胞によって調節される。

【0144】

したがって、ＰＤＫ１の抑制による老化真皮線維芽細胞の逆転が角質細胞の増殖と分化に影響を及ぼすか否かを調べた。ＢＸ－７９５は、腫瘍細胞でＰＤＫ１／Ａｋｔ信号伝達を遮断し、培養又は誘導されたアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）で多様な腫瘍細胞株の足場依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｒｏｗｔｈ）を抑制する強力なＰＤＫ１抑制剤である。調べの結果、Ｋｉ－６７増殖マーカーはＰＤＫ１抑制剤として広く知られたＢＸ７９５で処理された皮膚等価物（図１０ａ～１０ｂ）の表皮で著しく上昇し、老化－誘発されたＮＤＨＦにおいて皮膚等価物で表皮厚さを保存したケラチノサイトの増殖能力が増加したことを示した（図１０ａ～１０ｂ）。

【0145】

また、角質細胞分化マーカー（ケラチン１０及びフィラグリン）と真皮表皮接合部（ＣＯＬ１７Ａ１及びラミニン５）の基底膜マーカーに対する染色強度を比較した結果、ＰＤＫ１抑制は、老化ＮＨＤＦの皮膚等価物から発見される斯様な角質細胞分化マーカー及び真皮表皮接合の成分の減少された豊富さを回復させた（図１０ａ）。

【0146】

２次元老化ＮＨＤＦ（図９ａ～９ｂ）に対する観察と同様、ＢＸ７９５で処理された二つの類型の老化ＮＨＤＦにて用意された皮膚等価物から抽出した条件培地には、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）－処理皮膚等価物からの条件培地よりも、ＧＲＯ、ＧＲＯα、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１～３及びＲＡＮＴＥＳが少なく含有されるように準備した（図１１ａ～１１ｂ）。

【0147】

具体的に、実験方法は次のとおりである。

【0148】

ＰＤＫ１抑制は皮膚等価物でＳＡＳＰを抑制する。３Ｄ皮膚モデル（皮膚等価物）は、若いＮＨＤＦ（ＰＤＬ１２）、又はドキソルビシンとＩＧＦ－１又は繰り返しのメッキ（複製老化、ＰＤＬ５７）によって老化に誘導された老化ＮＨＤＦにて用意し、これらをＤＭＳＯ又はＢＸ７９５に露出させた。それぞれ処理された含量は次のとおりである：ドキソルビシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ－１（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＸ－７９５（１００ｎＭ）。

【0149】

ＢＸ７９５を用い又は用いずに処理された化学的－誘導又は複製老化ＮＨＤＦの皮膚等価物からの条件培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ、ＣＭ）をサイトカイン抗体アレイで測定し、各膜の内部陽性対照群として正規化した。（図１１ａ）ＢＸ７９５を用い又は用いずに処理された化学的誘導されたＮＨＤＦｓからの皮膚等価物のサイトカインアレイで測定された分泌タンパク質。（図１１ｂ）ＢＸ７９５で処理され又は処理され
ていない複製老化ＮＨＤＦｓから皮膚等価物のサイトカインアレイで測定された分泌タンパク質。分散の一方向分析によってＤＭＳＯ対照群老化細胞と比較して平均±ＳＤ（ｎ＝３）、***Ｐ＜０．００１。

【0150】

全体的に、このような発見は、ＰＤＫ１抑制が老化真皮線維芽細胞を静止線維芽細胞に切り換えて表皮再生を向上させ且つ皮膚厚さを保存して老化に関連した皮膚悪化を制限することを示すことである。

【0151】

具体例
具体例１：下記の化学式１～４のいずれか一つで表されるケンペロール配糖体化合物、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、皮膚保護用組成物。

【0152】

【化31】

【0153】

【化32】

【0154】

【化33】

【0155】

【化34】

【0156】

具体例２：具体例１において、
前記ケンペロール配糖体化合物は、ツバキ油粕から抽出されたものである、皮膚保護用組成物。

【0157】

具体例３：具体例１又は２において、
前記有効成分の濃度が、当該組成物の全重量を基準にして０．０１～１００μＭである、皮膚保護用組成物。

【0158】

具体例４：具体例１～３のいずれか一つにおいて、
前記皮膚保護は、
皮膚しわを改善すること；
皮膚再生を促進すること；
基質メタロプロテアーゼ－１（ＭａｔｒｉｘＭａｔａｌｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－１、ＭＭＰ－１）の発現を抑制すること；
アトピー性皮膚炎を改善、予防又は治療すること；
皮膚角質生成周期を調節すること；又は
３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（３－Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１、ＰＤＫ１）の活性を抑制すること；である、皮膚保護用組成物。

【0159】

具体例５：具体例１～４のいずれか一つにおいて、
当該組成物は化粧料組成物である、皮膚保護用組成物。

【0160】

具体例６：具体例１～４のいずれか一つにおいて、
当該組成物は、アトピー性皮膚炎改善、予防又は治療用薬学組成物である、皮膚保護用組成物。

【0161】

具体例７：具体例１～６のいずれか一つにおいて、
前記有効成分の投与量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ／日である、皮膚保護用組成物。

【0162】

具体例８：具体例１～４のいずれか一つにおいて、
当該組成物は食品組成物である、皮膚保護用組成物。

【図1】